DE102015003440A1

DE102015003440A1 - Verfahren zur MALDI-MSI Analytik von Objekten, insbesondere biologischen Gewebeproben, und Target zur Analytik sowie dessen Herstellung

Info

Publication number: DE102015003440A1
Application number: DE102015003440.5A
Authority: DE
Inventors: Ulrich S. Schubert; Annett Urbanek
Original assignee: Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Current assignee: Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Priority date: 2015-03-16
Filing date: 2015-03-16
Publication date: 2016-09-22
Also published as: WO2016146255A1

Abstract

Aufgabe war es, bei der MALDI-MSI-Analytik eines Objektes eine oder mehrere Analytklassen möglichst umfangreich, mit geringem Verfahrensaufwand und geringer Applikationsdauer zu untersuchen, ohne die Signalqualität hinsichtlich Intensität, Lokalisation und Differenzierbarkeit zu beeinträchtigen und ohne die Färbemöglichkeit für einem optischen Scan des Gewebeschnittes zu vermindern, wobei eine exakte histomorphologische Vergleichbarkeit für eine lokalisationsbezogene Auswertung analyseübergreifend ermöglicht werden soll. Erfindungsgemäß wird ein Target (1), auf dem das zu untersuchende Objekt aufzubringen ist, mit mehreren unterschiedlichen Matrixrastern (2, 3) jeweils im Versatz zueinander beschichtet. Für jedes Matrixraster (2, 3) wird zumindest ein Analyseraster jeweils separat vermessen. Die separat vermessenen analyserasterspezifischen Datensätze werden in ihrer Gesamtheit sowie mit objektdeckungsgleichem Positionsbezug ausgewertet.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur MALDI-Untersuchung von Objekten, mit welchem diese Objekte, insbesondere biologische Gewebeproben, hinsichtlich ihrer stofflichen Zusammensetzung analysiert werden können. Die Erfindung beinhaltet auch ein spezielles Target zur Durchführung dieser MALDI-Untersuchungen sowie dessen Herstellung.
Die MALDI-MSI Analyse ermöglicht die Untersuchung von Objektoberflächen, insbesondere Gewebeschnitten, hinsichtlich der Zusammensetzung und Lokalisierung von verschiedenen Analyten, wie z. B. Proteinen, Peptiden, Lipiden oder Metaboliten. Dabei wird eine sog. Matrixsubstanz verwendet, welche eine Energiedesorption während des gepulsten Laserbeschusses bei der Messung ermöglicht. Die Laserenergie wird dadurch auf die Analyten des zu messenden Objektes übertragen und regt diese zur Ionisierung an.
Die freigesetzten Ionen werden entlang eines Flugrohres beschleunigt und die Flugzeit mittels eines Detektors gemessen. Entsprechend der Molekülgröße und des Ladungszustandes weisen die Ionen eine unterschiedliche Flugzeit auf; dieses Messergebnis wird mittels einer Kalibration durch „Molekülmasse pro Ladung” (m/z) ersetzt. Das Ergebnis für jeden Messpunkt der Objektoberfläche kann in einem Spektrum dargestellt werden, wobei Signalintensität gegen m/z aufgetragen wird. Ebenso können die einzelnen Signale in ihrer flächigen Verteilung auf der gemessenen Oberfläche bildhaft dargestellt und dadurch in Bezug zu ihrer Lokalisation evaluiert werden.
Mit dieser Methode können z. B. Charakterisierungs-, Tumormarker- und Interaktionsstudien durchgeführt werden.
Bei der MALDI-MSI ist die Matrixapplikation auf das zu analysierende Objekt ein wichtiger Schritt, von dem die Qualität der Analyse in nicht unerheblichem Maße anhängt (Basak Kükrer Kaletas, Ingrid M. van der Wiel, Jonathan Stauber, Lennard J. Dekker, Coskun Güzel, Johan M. Kros, Theo M. Luider and Ron M. A. Heeren: Sample preparation issues for tissue imaging by imaging MS. Proteomics, 9, 2009, 2622–2633).
Eine weitverbreitete Applikationstechnik ist das Aufbringen einer homogenen Matrixschicht auf den Gewebeschnitt durch ein feines Versprühen bzw. Vernebeln der Matrixlösung (Benjamin Balluff, Cedrik Schöne, Heinz Höfler, Axel Walch: MALDI imaging mass spectrometry for direct tissue analysis: technological advancements and recent applications, Histochem Cell Biol, 136, 2011, 227–244; Kristina Schwamborn, Richard M. Caprioli: Mqolecular imaging by mass spectrometry – looking beyond classical histology, Nature Reviews Cancer 10, 2010, 639–346; Kamila Chughtai, Ron M. A. Heeren: Mass Spectrometric Imaging for biomedical tissue analysis, Chem Rev. 110, 2010, 3237–3277). Dabei wird der ganze Gewebeschnitt flächig homogen von einer Matrix bedeckt.
Da die verschiedenen möglichen MALDI-Matrices jeweils analytklassenspezifisch sind bzw. auch innerhalb einer Analytklasse unterschiedliche Matrixaffinitäten möglich sind, können mit einer Matrix nur die entsprechend affinen Analyten untersucht werden, die Informationen über weitere, nichtkompatible Analyten bleiben verborgen. Auch der Zusatz von Additiven zur Matrix kann das Ansprechen der Analyten auf eine Matrix beeinflussen (Rian L. Griffiths, Josephine Bunch: A survey of useful salt additives in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and tandem mass spectrometry of lipids: introducing nitrates for improved analysis, Rapid Commun. Mass Spectrom. 26, 2012, 1557–1566).
Eine umfassende Untersuchung einer Analytklasse oder über alle Analytklassen hinweg ist mit dieser Methode an einem Objekt nicht durchführbar.
Um dennoch einer umfassenderen MALDI-MSI Analytik nachzugehen, sind folgende Möglichkeiten beschrieben worden (1–3):

1. Bei der konsekutiven Methode (Rory T. Steven, Josephine Bunch: Repeat MALDI-MS imaging of a single tissue section using multiple matrices and tissue washes, Anal. Bioanal. Chem., 405, 2013. 4719–4728) wird ein Gewebeschnitt mehrmals hintereinander analysiert mit wiederholter Matrixapplikation und Gewebewaschschritten zur Matrixentfernung. Dabei kann durch die intensive Gewebebehandlung der Gewebeschnitt Schaden nehmen, es kann zu Analytverlust und verminderten Signalintensitäten kommen und die Analyten können durch die Waschschritte delokalisieren.
2. Bei der Analyse an Parallelschnitten (Markus Stoeckli, Dieter Staab, Alain Schweitzer: Compound and metabolite distribution measured by MALDI mass spectrometric imaging in whole-body tissue sections, International Journal of Mass Spectrometry, 260, 2007, 195–202) werden benachbarte Gewebeschnitte für die Analyse mittels verschiedener Matrices verwendet und die Ergebnisse miteinander verglichen. Dabei ist allerdings die unterschiedliche Schnitttiefe der Parallelschnitte zu bedenken. Durch die sich verändernde Gewebemorphologie in tieferen Gewebeschichten können Parallelschnitte nicht vollkommen identisch sein. Ebenso durch ein ungleiches Strecken der durch den Schneideakt gestauchten Schnitte beim manuellen Aufziehen auf das Target können Streckungsunterschiede an Parallelschnitten entstehen. Ein deckungsgleiches Übereinanderlegen für Vergleichszwecke ist dadurch erschwert oder unmöglich und ein exakt deckungsgleicher Matrix-übergreifender Vergleich der histomorphologischen Signallokalisationen verhindert. Ebenso sind die für diese Analyse verwendeten Parallelschnitte folglich nicht für ein mögliches 3-dimensionales MALDI-Imaging verfügbar (Herbert Thiele, Peter Maass: 2D and 3D MALDI-imaging: Conceptual strategies for visualization and data mining; Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Proteins and Proteomics, 1844, 2014, 117–137).
3. Mittels Verwendung von Matrixmischungen (Sabrina Laugesen, Peter Roepstorff: Combination of two matrices results in improved performance of maldi ms for peptide mass mapping and protein analysis, American Society for Mass Spectrometry 14. 2003, 992–1002) sollen Matrixkonditionen geschaffen werden, die für mehrere Analytklassen zugleich passend sind und in nur einer Analyse alle affinen Analytklassen der beigemischten Matrices aufzeigen. Allerdings können bei dieser Methode nicht unterschiedliche Analyten mit zufällig gleichem m/z Wert unterschieden werden, selbst wenn sie eine unterschiedliche Lokalisation im Gewebe aufweisen. Die Qualität der Informationen ist dementsprechend durch Informationsverlust bei spektraler Signalüberlagerung verringert. Die Differenzierbarkeit ist eingeschränkt.

Ebenso wurden bereits weitere Möglichkeiten der Matrixapplikation gezeigt (4–5):

4. Neben der homogenen Applikation wurde auch ein punktförmiges Auftragen der Matrix im Punktraster durch Aufspotten oder Aufdrucken beschrieben (Kamila Chughtai, Ron M. A. Heeren: Mass Spectrometric Imaging for biomedical tissue analysis, Chem Rev. 110, 2010, 3237–3277; Dodge L. Baluya, Timothy J. Garrett, Richard A. Yost: Automated MALDI Matrix Deposition Method with Inkjet Printing for Imaging Mass Spectrometry, Anal. Chem. 79, 2007, 6862–6867; Joseph T. Delaney, Annett Urbanek, Liane Wehder, Jolke Perelaer, Anna C. Crecelius, Ferdinand von Eggeling, Ulrich S. Schubert: Combinatorial optimization of multiple MALDI matrices an a single tissue sample using inkjet printing, ACS Combinatorial Science 13, 2011 218–222; Hans-Rudolf Aerni, Dale S. Cornett, Richard M. Caprioli: Automated Acoustic Matrix Deposition for MALDI Sample Preparation, Anal. Chem. 78, 2006, 827–834; Pierre Chaurand, Jeremy L. Norris, D. Shannon Cornett, James A. Mobley, Richard M. Caprioli: New Developments in Profiling and Imaging of Proteins from Tissue Sections by MALDI Mass Spectrometry, J. Proteome Res 5, 2006, 2889–2900). Dabei gilt es, eine ausreichende räumliche Auflösung des Punktrasters zu erreichen, die der angestrebten Messauflösung entspricht. Bei kleineren Printpunkten in einer höheren Rasterauflösung durch entsprechend kleine Tropfen (H. Y. Gan, X. Shan, T. Eriksson, B. K. KLok, Y. C. Lam: Reduction of droplet volume by controlling actuating waveforms in inkjet printing for micro-pattern formation, J. Micromech. Microeng 19, 2009, 055010–055018) sind allerdings mehrere Auftragungsepisoden übereinander notwendig, um eine für die Analyse ausreichende Matrixmenge aufzubringen. Die entsprechend verlängerte Auftragungszeit wirkt sich negativ auf die Erhaltung der sensiblen Analyten bis zur Analyse aus. Vor allem Proteine sind sehr leicht zersetzend, eine zeitaufwendige Applikation kann zu einer schlechteren Ergebnisqualität durch degradierte Analyten führen
5. Eine Alternative zum Aufbringen der Matrix auf den Gewebeschnitt wurde durch eine umgekehrte Applikation des Gewebes auf ein bereits mit einer homogenen Matrixschicht versehenes Target beschrieben (Kerni J. Grove, Sara L. Frappier, Richard M. Caprioli: Matrix Pre-Coated MALDI MS Targets for Small Molecule Imaging in Tissues, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 22, 2011, 192–195; Junhai Yang, Richard M. Caprioli: Matrix pre-coated targets for high throughput MALDI imaging of proteins, Journal of Mass Spectrometry 49, 2014, 417–422). Die vorweg beschriebenen Problematiken (1–3) konnten durch diese Methode auch nicht gelöst werden. Zu diesen homogen vorbeschichteten Matrixtargets konnte ferner keine Möglichkeit einer an die Analyse anschließenden H&E-Gewebefärbung des analysierten Gewebes gezeigt werden. Die Färbung muss mit einer vollständigen Matrixentfernung eingeleitet werden, um die Färbbarkeit des Gewebes zu gewährleisten. Dabei darf das Gewebe nicht vom Target abgelöst werden, was bei einer kompakten Matrixschicht unter dem Gewebe unmöglich scheint. Ein H&E-Bild des analysierten Gewebes ist jedoch für eine lokalisationsbezogene Auswertung mit histomorphologischem Bezug unerlässlich (Julien Franck, Karim Arafah, Mohamed Elayed, David Bonnel, Daniele Vergara, Amélie Jacquet, Denis Vinatier, Maxence Wisztorski, Robert Day, Isabelle Fournier and Michel Salzet: MALDI Imaging Mass Spectrometry, Molecular & Cellular Proteomics 8, 2009, 2023–2033).

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, bei der MALDI-MSI-Analytik eines Objektes eine oder mehrere Analytklassen möglichst umfangreich, mit geringem Verfahrensaufwand und geringer Applikationsdauer zu untersuchen, ohne die Signalqualität hinsichtlich Intensität, Lokalisation und Differenzierbarkeit zu beeinträchtigen und ohne die Färbemöglichkeit für einem optischen Scan des Gewebeschnittes zu vermindern, wobei eine exakte histo-morphologische Vergleichbarkeit für eine lokalisationsbezogene Auswertung analyseübergreifend ermöglicht werden soll.
Diese Aufgabe wird bei einem Verfahren zur MALDI-MSI-Untersuchung von Objekten, insbesondere biologischen Gewebeproben, bei dem das zu untersuchende Objekt auf ein beschichtetes Target aufgebracht und einer gepulsten Laserstrahlung ausgesetzt wird, wobei durch die Beschichtung des Targets bei der Laserbestrahlung eine Energiedesorption bewirkt wird, durch welche die Energie der Laserstrahlung durch das Objekt aufgenommen sowie dessen zu analysierende Bestandteile zur Ionisierung angeregt werden, und bei dem die durch die Laserbestrahlung freigesetzten Ionen des Objektes durch angelegte Spannung beschleunigt, in ihrer Flugbahn, beispielsweise einem Flugrohr, nach Größe und Ladung aufgetrennt, und deren Flugzeiten gemessen sowie hinsichtlich ihrer Moleküleigenschaften zur Charakterisierung und Bestimmung der biologisch-chemischen Zusammensetzung des Objektes ausgewertet werden, dadurch gelöst, dass das Target mit mehreren unterschiedlichen Matrixrastern jeweils im geometrischen Versatz zueinander zuerst beschichtet, danach das zu analysierende Objekt darauf aufgebracht und direkt anschließend die Analyse durchgeführt wird, bei der für jedes Matrixraster zumindest ein Analyseraster jeweils separat vermessen wird. Diese separat gemessenen analyserasterspezifischen Datensätze werden in ihrer komplementären Gesamtheit sowie mit objektdeckungsgleichem Positionsbezug ausgewertet.
Ein Target zur MALDI-MSI-Untersuchung von Objekten, insbesondere biologischen Gewebeproben, besteht zu diesem Zweck aus einem Träger, beispielsweise aus einem Glasobjektträger, mit elektrisch leitender Oberfläche, auf welcher mehrere unterschiedliche Matrixraster jeweils im Versatz zueinander als Beschichtung aufgebracht sind.
In den Unteransprüchen sind sowohl zu dem Verfahren als auch zu dem Target vorteilhafte Ausführungen genannt.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt unterschiedliche komplementäre Analysen an demselben Objekt und ermöglicht somit eine umfangreichere und hochwertigere Gesamtanalyse mit qualitativ und quantitativ gehaltvollerer Beurteilungs- und Auswertungsmöglichkeit der Ergebnisse, als es durch bekannte Methoden möglich ist. Es werden durch die Verwendung mehrerer Matrices verschiedene Matrixaffinitäten der Analyten abgedeckt und somit die Quantität der durch die Gesamtanalyse erfassten Analytklassen und die Quantität und Signalqualität der erfassten Analyten innerhalb einer Analytklasse erhöht.
Auf den bisher gebräuchlichen aber zeitintensiven Arbeitsschritt der Matrixapplikation auf das Objekt kann durch die Verwendung von mit Matrix vorbeschichteten Targets verzichtet werden, wodurch sich die Applikationsdauer bis zur Analyse erheblich verkürzt und sensible Analyten besser für die Analyse erhalten bleiben. Die beschichteten Targets können auf Vorrat bereitgehalten werden und ermöglichen damit bei Bedarf einen schnellen und hohen Durchsatz von Objektanalysen. Die Herstellung von matrixbeschichteten Targets kann gesammelt und auf Vorrat erfolgen. Die beschichteten Targets können dann bei Bedarf an die Verwender verteilt werden. Entsprechend kann auf Instrumente zur Matrixapplikation am Analyseort verzichtet werden.
Da geeignete Forschungsobjekte, z. B. spezielle Tumore, oft nur in geringer Menge zur Verfügung stehen und demzufolge höchst sparsam verwendet werden müssen, sollten Präparationsfehler zwingend vermieden werden. Beim vorgeschlagenen Verfahren kann ein Verlust des Objektes durch eine fehlgeschlagene Matrixapplikation ausgeschlossen werden, da eine Prüfung der Matrixapplikation auf Qualität des vorbeschichteten Trägers noch vor Aufbringung des Objektes möglich ist; eine gelungene Matrixapplikation wird damit bereits vor der Applikation des wertvollen Objektes sichergestellt.
Im Vergleich zu bisher beschriebenen Methoden von komplementären Analysen können beim erfindungsgemäßen Verfahren ein Signalintensitätsverlust und eine diffuse Signalverstreuung durch den Verzicht auf Waschschritte vermieden werden. Für alle komplementären Analysen bleiben die Analyten in ursprünglicher Quantität und Lokalisation erhalten.
Bei der bekannten Methode mit Verwendung von verschiedenen Matrices in einer Matrixmischung zur Erhöhung des Affinitätsumfanges in einer einzelnen Analyse, sind Analyten mit gleicher Flugzeit und entsprechend spektraler Signalüberlagerung nur als ein singuläres Signal darstellbar. Es kann dabei nicht ohne weiteres aufgezeigt werden, ob es sich möglicherweise um verschiedene Analyten handelt, die eine unterschiedliche Signalverteilung im Objekt aufweisen, was in vielen Fällen keine sofortige eindeutige Analyse zulässt. Durch die Verwendung von verschiedenen Matrices in separaten Analysen können mit der hier beschriebenen Methode Signale mit gleicher Flugzeit, die aber unterschiedliche Matrixaffinität aufweisen, durch die Erfassung in separaten matrixspezifischen Datensätzen mit möglicherweise unterschiedlicher bildhafter Signalverteilung unterschieden werden. Die Differenzierbarkeit der Signale ist somit, gegenüber der Verwendung von Matrixmischungen in nur einer Analyse, wesentlich erhöht.
In einigen bekannten Methoden wird für die Auswertung mittels Overlay ein optischer Scan eines parallel gewonnenen Gewebeschnittes herangezogen, der von einer angrenzenden Schicht im Gewebe gewonnen wird. Eine unterschiedliche Schnittebene im Gewebe bringt allerdings eine veränderte Morphologie mit sich, das jeweils individuelle Aufbringen der Gewebeschnitte auf einen Träger kann Unterschiede durch das Aufschmelzen und Strecken zur Folge haben. Ein exaktes bildhaftes Überlagern im Overlay ist somit erschwert oder nicht möglich und ein eindeutiger Rückschluss von Signallokalisationen auf morphologische Strukturen wäre möglicherweise fehlerhaft. Die Verwendung eines optischen Scans des vermessenen Objektes ist somit sehr wichtig, um Fehler in der Auswertung zu vermeiden.
Bei der bekannten Methode mit homogen vorbeschichteten Matrixtargets konnte bisher keine an die Analyse anschließende Färbung am vermessenen Objekt gezeigt werden, da vor einer Gewebefärbung die Matrixschicht unter dem Objekt vollständig entfernt werden muss und dies bei der homogenen Beschichtung ein Ablösen des Objektes durch entsprechende Waschschritte mit sich ziehen würde. Beim erfindungsgemäßen Verfahren mit einem punktuell matrixbeschichteten Target lässt sich die Matrix unter dem Objekt durch Waschschritte entfernen, da das Objekt durch Laserbeschuss der Rasterpunkte an genau diesen Stellen leicht porös wird. Dementsprechend können die Matrixpunkte durch diese porösen Stellen herausgelöst werden; durch matrixfreie Stellen zwischen den Rasterpunkten bleibt das Objekt am Target haften. Somit kann das Präparat danach einer Färbung unterzogen werden, beispielsweise einer histologischen Übersichtsfärbung von organischem Gewebe mit Hämatoxylen-Eosin. Damit kann anschließend ein optischer Scan des vermessenen Objektes zur Erstellung eines Overlays mit den bildhaften Signalverteilungen erzeugt werden, welcher für eine Beurteilung und Auswertung eines damit erzeugbaren Overlays mit exaktem histo-morphologischem Bezug für alle komplementären Analysen eines Objektes in ihrer Gesamtheit notwendig ist. Die Beurteilung der Lokalisation der Signale, die den unterschiedlichen komplementären Analysen im Objekt entstammen, in Verbindung zu den histo-morphologischen Strukturen der entsprechenden Region im Objekt, erlaubt Rückschlüsse bezüglich Charakterisierungsstudien, Biomarkersuche, Tumorforschung, Interaktionsstudien etc. in weit besserer Qualität und Quantität als es durch bekannte Methoden möglich ist. Eine mögliche Qualitätssicherung der beschichteten Targets, die hohe Informationsausbeute und die schnelle und einfache Anwendung machen diese Methode des MALDI Imaging für einen Einsatz in der klinisch-histo-pathologischen Routinediagnostik attraktiv.
Darüber hinaus bleiben die Parallelschnitte für weitere Anwendungen verfügbar, beispielsweise für ein mögliches 3D-Imaging auf Basis der hier beschriebenen Methode, welches diesen bereits enormen Informationsgehalt zusätzlich um die Signalverteilungen in der 3. Dimension des Objektes erweitert. Der mögliche hohe Durchsatz bei der Verwendung von beschichteten Targets vereinfacht und beschleunigt die Durchführung eines 3D MALDI-Imaging bei gleichzeitig gestiegenem Informationsgehalt, was einem raschen Voranschreiten in Forschungsfragen entgegenkommt.
Die Erfindung soll nachstehend anhand von in der Zeichnung dargestellten Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.
Es zeigen:
1: Aufbringen verschiedener Matrixraster als gemeinsames Raster mit Versatz auf ein Target
2: Applikation eines zu analysierenden Gewebeschnitts auf das mit Matrixraster versehene Target
3: Separate MSI Analyse der verschiedenen Matrixraster
4: Objektdeckungsgleiche Übereinanderlegung von Objektscan und bildhaften Darstellungen diverser Signalverteilungen
5: Schema eines Matrixrasters mit 4 verschiedenen Matrices im Versatz
6: von links nach rechts: zeitverzögerte Screenshots der Tropfenejektion durch einen 3-fach-Puls an einer Tintenstrahl-Druckdüse
7: Schema einer möglichen Architektur eines Mehrfachpulses
8: optischer Scan (Ausschnitt) eines durch Tintenstrahl-Druck mit zwei Matrixrastern als Punktraster im Versatz bedruckten Targets
9: Durchschnittsspektrum einer Kaninchenniere, analysiert an einem DHB(2,5-Dihydroxybenzoic acid)-Matrixraster im reflective positiv Ionen Modus
10: Durchschnittsspektrum einer Kaninchenniere, analysiert an einem 9-AA(9-Aminoacridine)-Matrixraster im reflective negativ Ionen Modus
Für die Herstellung eines beschichteten Targets für die Multiplex MALDI-MSI Analyse wird ein Target 1 mit leitender Oberfläche, beispielsweise ein mit Indium-Zinn-Oxid beschichteter Glass-Slide, mit verschiedenen Matrixrastern 2, 3 im geometrisch versetzten Raster per Tintenstrahl-Printing bedruckt (vgl. 1 und 8). Es entsteht das bedrucktes Target 1 mit einer gemeinsamen Matrixbeschichtung 4 aus beiden ursprünglichen Matrixrastern 2, 3 (siehe 1).
Auf diese Matrixbeschichtung 4 des bedruckten Targets 1 wird ein Gewebeschnitt 5 als durch MALDI-MSI zu untersuchendes Objekt appliziert, symbolisiert durch einen Pfeil 6 in 2, woraus das Target 1 mit der Matrixbeschichtung 4 und dem darauf aufgebrachten Untersuchungsobjekt (Gewebeabschnitt 5) resultiert.
Um die Arthaftung der Matrixraster 2, 3 auf dem Target 1 zu verbessern, kann auch vorab eine haftungsfördernde Schicht auf das Target 1 aufgebracht werden, beispielsweise durch eine Bedampfung mit Goldpartikeln (aus Übersichtsgründen nicht in der Zeichnung dargestellt).
Zur Herstellung des Targets 1 mit der Matrixbeschichtung 4 können die Matrixraster 2, 3 mittels Inkjet-Druck in Form von Printpunkten 22, 23 als Punktraster (8) aufgebracht werden. Die notwendige kleine Tropfengröße wird unter Verwendung der bereits bekannten Mehrfachpuls-Technologie zur Reduzierung der Tropfengröße in Kombination mit der Verwendung von gekühlten Printköpfen zur Tropfenstabilisierung niederviskoser Flüssigkeiten (aus Übersichtsgründen nicht in der Zeichnung dargestellt) ermöglicht. Bei der Mehrfachpulstechnologie wird jede Tropfenejektion durch zwei oder mehr aufeinanderfolgende Spannungspulse pro Frequenzintervall (vgl. 7) in einer Inkjet-Printdüse 18 eines Printkopfes ausgelöst. Eine entsprechende Architektur des Mehrfachpulses (vgl. 7) erzeugt eine Abfolge von Über- bzw. Unterdruck-Zuständen innerhalb eines Frequenzintervalls in einem Innenraum 19 der Inkjet-Printdüse 18, welche die bei der Tropfenejektion aus der Inkjet-Printdüse 18 ausgetretene Flüssigkeit in zwei Teile trennt und unter Zurücksaugung eines zurückgehaltenen Tropfenteiles 20 folglich einen größenreduzierten Tropfen (Printtropfen 21) aus der Inkjet-Printdüse 18 entlässt. Das Resultat der Verwendung eines Mehrfachpulses (vgl. 6) ist die Ejektion eines kleineren Printtropfens 21 gegenüber einer Ejektion durch einen Einzelpuls. Für eine erfolgreiche Tropfenreduzierung ist eine sensible Anpassung der Mehrfachpulsarchitektur bezüglich Pulsanzahl, Pulspolarität, Stärke der Pulsspannung V, Pulslänge P. Verzögerung D und Frequenz der Tropfenejektion notwendig (vgl. 7). Diese Architektur des Mehrfachpulses hängt unter anderem von der zu druckenden Lösung, dem verwendeten Printkopf und den Umgebungskonditionen, wie beispielsweise der Temperatur, ab.
Häufig verwendete Matrices für MALDI-MSI sind löslich in niederviskosen Flüssigkeiten (wie Acetonitril, Ethanol, Methanol oder Mischungen von diesen mit Wasser) und werden in solchen gelöst für MALDI-MSI verwendet. Die Niederviskosität der Lösungen kann beim Inkjet-Druck allerdings eine Gasblasenbildung in der Printdüse verursachen, welche die Tropfenbildung verhindert und/oder ein unkoordiniertes Versprühen der Matrixlösung verursacht. Diese Gasblasenbildung bei niederviskösen Flüssigkeiten kann durch die Verwendung eines gekühlten Printkopfes vermindert oder verhindert werden. Dafür kann ein mit einem Peltier-Element ummantelter Printkopf verwendet werden (nicht in der Zeichnung dargestellt). Dieser bewirkt ein gezieltes Herabkühlen der Printlösung beim Durchlaufen der Zuführungsleitung vor Eintritt in die Printdüse und setzt dadurch die Neigung der Lösung zur Verdampfung und Kavitation herab.
Für das Aufdrucken eines Matrixrasters in hoher Auflösung werden kleinstmögliche einzelne Printtropfen in einem Punktraster auf das Target aufgesetzt und eingetrocknet. Um eine ausreichende Matrixmenge auf jeden Rasterpunkt zu applizieren, ohne die Rasterpunkte in ihrer Fläche stark zu vergrößern, wird dieses Auftragen und Eintrocknen einzelner Tropfen pro Punkt in mehreren Episoden nacheinander wiederholt. Mehrere Matrixraster werden im geometrischen Versatz zueinander auf das Target 1 aufgedruckt. Der jeweilige Versatz der Matrixraster untereinander wird unter anderem entsprechend der Anzahl der im Versatz zu applizierenden Matrixraster, der gewünschten Lagebeziehung der verschiedenen Rasterpunkte (nicht überlappend, teilweise überlappend oder gänzlich überlappend), der Rasterpunktgrößen und der nach Bedarf zu belassenden matrixfreien Flächen zwischen den Matrixrastern festgelegt (1 und 5).
Als oder anstelle der besagten Matrixraster 2, 3 können je nach den durchzuführenden komplementären Analysen auch Matrixraster mit zusätzlichen Additiven und/oder Matrixgemischen und/oder weiteren Substanzen für andere Analysen, beispielsweise Trypsin für Protein-Verdauexperimente, verwendet werden. Ebenso kann ein Freiflächenraster zwischen den Matrixrastern 2, 3 auf dem Target 1 belassen werden, welches für matrixfreie Analysen herangezogen werden kann.
Es besteht grundsätzlich die Möglichkeit, beliebig viele Matrixraster in geometrischem Versatz auf ein Target aufzubringen, beispielsweise vier Matrixraster ohne Überlaqppung mit matrixfreiem Zwischenareal, wie schematisch abgebildet in 5 (vgl. auch 1 mit den beiden Matrixrastern 2, 3).
Das mit einer Matrixbeschichtung 4 versehene Target 1 kann vor der Aufbringung des Objektes (Gewebeschnitt 5) mit einer möglichen Schutzschicht (aus Übersichtsgründen nicht in der Zeichnung dargestellt) überzogen werden, welche die Matrixbeschichtung 4 bis zur Applikation des Gewebeschnittes 5 vor mechanischen Einflüssen, wie Kratzern oder Abrieb, bewahrt. Diese Schutzschicht kann entweder eine Charakteristik aufweisen, die für die folgende Applikation und Analyse keinen oder einen positiven Einfluss hat und somit nicht entfernt werden muss, oder sie besitzt eine negativ beeinflussende Charakteristik, die allerdings vor der fortführenden Applikation eine schonende Entfernung der Schutzschicht erlaubt und somit keinen negativen Einfluss mehr besitzt. Eine zu entfernende Schutzschicht kann einen zusätzlichen Schutz vor Verschmutzung oder Licht darstellen.
Nach dem Aufbringen der Matrixraster 2, 3 auf das Target 1 (vgl. 1) wird entsprechend 2 das zu untersuchende Objekt (Gewebeschnitt 5) darüber aufgebracht. Das kann beispielsweise ein Gefrierschnitt eines biologisch-organischen Gewebes sein. Dafür wird von einem tiefgefrorenen organischen Gewebestück im Cryomikrotom ein dünner, gefrorener Gewebeschnitt hergestellt und im Anschluss auf das beschichtete Target durch Erwärmung aufgeschmolzen.
Direkt danach kann das beschichtete Target 1 mit dem aufgebrachten Objekt (Gewebeschnitt 5) der Analyse unterzogen werden, sofern nicht im Folgenden genannte mögliche zusätzliche (optionale) Verfahrensschritte angewendet werden. Vor dem Aufbringen des besagten Objektes auf den Träger 1 mit der Matrixbeschichtung 4 kann diese Matrixbeschichtung einem Aktivierungsschritt unterzogen werden, beispielsweise einer Umwandlung der Matrix zu einer ionischen Flüssigkeit durch Bedampfung mit organischem Diisopropylethylamine (DIEA). Damit kann die Co-Kristallisierung zwischen der Matrixbeschichtung 4 und den zu analysierenden Substanzen des Objektes (Gewebeschnitt 5) gefördert werden. Ebenso kann vor der Analyse, nach Aufbringung des zu untersuchenden Objektes auf das Target 1 ein co-kristallisierungsfördernder Arbeitsschritt, wie ein Benebeln mit Lösungsmittel, durchgeführt werden. In Abhängigkeit des Analyten ist eine gute Co-Kristallisierung Voraussetzung für eine gute Ionisierung während der Analyse.
Bei der MALDI-MSI Analyse werden in an sich bekannter Weise mit gepulstem Laserbeschuss Punktmessungen auf der zu analysierenden Fläche in Form von Analyserastern durchgeführt und zunächst als Durchschnittsspektren dargestellt (Durchschnittsspektrum 9, 10 der Matrixbeschichtung 4 aus den Matrixrastern 2, 3; vgl. auch Durchschnittsspektren 9 und 10). Die einzelnen Signale dieser Spektren, beispielsweise die mit einem Stern zur Ursprungserkennung markierten Durchschnittsspektren 9, 10 (vgl. 3), können dann als bildhafte Verteilung 11, 12 (vgl. 4) dargestellt werden. Dabei wird für jeden Messpunkt die Intensität des Signals als Farbpunkt entsprechend einer Farbverlaufsskala in einer bildhaften Darstellung des vermessenen Objektes abgebildet, und veranschaulicht somit die flächige Signalverteilung und Signalstärke.
Der Laserfocus kann dabei auf den erforderlichen Durchmesser entsprechend den Rasterpunkten des jeweiligen Matrixrasters 2 bzw. 3 angepasst werden. Ein Analyseraster kann genau mittig auf die Rasterpunkte des betreffenden Matrixrasters 2 bzw. 3 festgelegt werden. Aber auch ein dezentraler Beschuss der Rasterpunkte ist möglich, um beispielsweise den überlappenden Bereich verschiedenartiger Rasterpunkte unterschiedlicher Matrixraster 2, 3 für eine Analyse heranzuziehen. Ebenso könnten mehrere Analyseraster auf einem Matrixraster 2 bzw. 3 jeweils dezentral, mit kleinerem Laserfocus und nicht-überlappender Position festgelegt werden, um ein Matrixraster 2 bzw. 3 für verschiedene Analysemessungen zu nutzen. Auch möglicherweise matrixfrei belassene Areale zwischen den Matrixrastern 2, 3 können für ein Analyseraster genutzt werden. Jedes gewünschte Analyseraster kann mit individuellen Messkonditionen, wie Laserenergie, Polarisation, Messmodus (linear/Reflektion), zu erfassender Massenbereich, Detektorsensitivität und spektraler Auflösung, analysiert werden. Jedes Analyseraster wird bei der Analysemessung als separater Datensatz erfasst (vgl. 3). Aus den somit jeweils aus den Matrixrastern 2, 3 separat erfassten Datensätzen, jeweils dargestellt durch die Durchschnittsspektren 9 bzw. 10 (siehe auch 9 und 10), können die einzelnen Signale dieser Spektren, beispielsweise die mit einem Stern markierten Signale in Durchschnittsspektrum 9, 10 (vgl. 3), dann als bildhafte Verteilung 11, 12 (vgl. wiederum 4) dargestellt werden.
Dabei wird für jeden Messpunkt die Intensität des einzelnen Signals als Farbpunkt entsprechend einer Farbverlaufsskala in einer bildhaften Darstellung des vermessenen Objektes abgebildet, und veranschaulicht somit die flächige Signalverteilung mit Signalstärke. Anschließend werden die Signalverteilungen dieser einzelnen Datensätze objektdeckungsgleich übereinandergelegt dargestellt, um alle Signalinformationen aus den unterschiedlichen Analysen an dem auszuwertenden Objekt (Gewebeschnitt 5) komplementär in ihrer Gesamtheit für die Auswertung heranziehen zu können. Ein optischer Scan 13 des Objektes (Gewebeschnitt 5), beispielsweise der Scan eines im Anschluss an die Analyse hämatoxylen-eosin-gefärbten Gewebeschnittes, kann mit den Darstellungen der als interessant ermittelten bildhaften Signalverteilungen 11, 12 der einzelnen aus den Matrixrastern 2, 3 der Matrixbeschichtung 4 gewonnenen Datensätze ebenso objektdeckungsgleich zu einem Overlay 17 übereinandergelegt werden, symbolisiert durch Pfeile 14, 15 und 16, (vgl. 4).
Das ermöglicht eine umfassende Beurteilung mit exaktem Positionsbezug zu den histomorphologischen Strukturen im optischen Scan 13 des Objektes (Gewebeschnitt 5) für alle komplementären Analysen eines Objektes in ihrer Gesamtheit (vgl. 4).
Bezugszeichenliste

1: Target
2, 3: Matrixraster
4: Matrixbeschichtung
5: Gewebeschnitt
6, 7, 8: Pfeil
9, 10: Durchschnittsspektrum
11, 12: bildhafte Signalverteilung
13: optischer Scan des Objektes
14, 15, 16: Pfeil
17: Overlay
18: Inkjet-Printdüse eines Printkopfes
19: Innenraum der Printdüse
20: zurückgehaltener Tropfenteil
21: Printtropfen
22: Printpunkt eines 9-AA Matrixrasters
23: Printpunkt eines DHB Matrixrasters
V1, V2, V3: Pulsspannung
P1, P2, P3: Pulslänge
D1, D2, D3: Verzögerung

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Zitierte Nicht-Patentliteratur

Basak Kükrer Kaletas, Ingrid M. van der Wiel, Jonathan Stauber, Lennard J. Dekker, Coskun Güzel, Johan M. Kros, Theo M. Luider and Ron M. A. Heeren: Sample preparation issues for tissue imaging by imaging MS. Proteomics, 9, 2009, 2622–2633 [0005]
Benjamin Balluff, Cedrik Schöne, Heinz Höfler, Axel Walch: MALDI imaging mass spectrometry for direct tissue analysis: technological advancements and recent applications, Histochem Cell Biol, 136, 2011, 227–244 [0006]
Kristina Schwamborn, Richard M. Caprioli: Mqolecular imaging by mass spectrometry – looking beyond classical histology, Nature Reviews Cancer 10, 2010, 639–346 [0006]
Kamila Chughtai, Ron M. A. Heeren: Mass Spectrometric Imaging for biomedical tissue analysis, Chem Rev. 110, 2010, 3237–3277 [0006]
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Claims

Verfahren zur MALDI-MSI-Untersuchung von Objekten, insbesondere biologischen Gewebeproben, bei dem das zu untersuchende Objekt auf ein beschichtetes Target aufgebracht und einer gepulsten Laserstrahlung ausgesetzt wird, wobei durch die Beschichtung des Targets bei der Laserbestrahlung eine Energiedesorption bewirkt wird, durch welche die Energie der Laserstrahlung durch das Objekt aufgenommen sowie dessen zu analysierende Bestandteile zur Ionisierung angeregt werden, und bei dem die durch die Laserbestrahlung freigesetzten Ionen des Objektes durch angelegte Spannung beschleunigt, in ihrer Flugbahn nach Größe und Ladung aufgetrennt, und deren Flugzeiten gemessen sowie hinsichtlich ihrer Moleküleigenschaften zur Charakterisierung und Bestimmung der biologisch-chemischen Zusammensetzung des Objektes ausgewertet werden, dadurch gekennzeichnet, dass das Target mit mehreren unterschiedlichen Matrixrastern jeweils im geometrischen Versatz zueinander zuerst beschichtet, danach das zu untersuchende Objekt auf die Matrixraster aufgebracht und direkt anschließend die MALDI-MSI-Untersuchung durchgeführt wird, bei der für jedes Matrixraster zumindest ein Analyseraster jeweils separat vermessen wird, und dass diese separat gemessenen analyserasterspezifischen Datensätze in ihrer Gesamtheit sowie mit objektdeckungsgleichem Positionsbezug ausgewertet werden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Target mit sich gegenseitig überlappenden Matrixrastern und/oder mit Freiflächen zwischen den Matrixrasterpositionen beschichtet wird.
Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass auf dem Target unabhängig von der Form und Lage der Matrixraster zusätzlich zu den Matrixrastern, in von diesen gegenseitig überlappten Bereichen und/oder in Freiflächen zwischen den Matrixrastern zusätzliche Analyseraster für die Laserbestrahlung und Flugzeitmessung der freigesetzten Ionen festgelegt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass beispielsweise zur Verbesserung der Ionisierung Matrixraster mit zusätzlichen Additiven und/oder Matrixgemischen und/oder weiteren Substanzen für andere Analysen verwendet werden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die analyserasterspezifischen Datensätze mit objektdeckungsgleichem Positionsbezug rechentechnisch ausgewertet werden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das beschichtete Target vor Aufbringung des zu untersuchenden Objektes zum Zweck einer geförderten Co-Kristallisierung zwischen den Objektmolekülen und den Matrixsubstanzen mit einem Aktivierungsschritt, wie einer Umwandlung der Matrix zur ionischen Flüssigkeit durch Bedampfung mit organischem Diisopropylethylamine (DIEA), und/oder nach Aufbringung des zu untersuchenden Objektes mit einem co-kristallisierungsfördernden Arbeitsschritt, wie ein Benebeln mit Lösungsmittel, behandelt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass für die Auswertung der Datensätze mit objektdeckungsgleichem Positionsbezug auch ein optischer Objektscan objektdeckungsgleich zur Positionsbeurteilung einbezogen wird.
Target zur MALDI-MSI-Untersuchung von Objekten, insbesondere biologischen Gewebeproben, bestehend aus einem Träger (1) mit elektrisch leitender Oberfläche, auf welcher mehrere unterschiedliche Matrixraster (2, 3) jeweils im Versatz zueinander als Beschichtung aufgebracht sind.
Target gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die unterschiedlichen Matrixraster (2, 3) aneinander angrenzend, gegenseitig überlappend und/oder mit Freiflächen zwischen den Matrixrasterpositionen auf der Targetoberfläche angeordnet sind.
Target gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger (1) aus Glas oder einem anderen optisch durchlässigem Material mit elektrisch leitender Oberfläche, insbesondere einer elektrisch leitenden Oberflächenbeschichtung in Form einer Indium-Zinn-Oxid (ITO) Beschichtung, besteht.
Target gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger (1) unter der Matrixbeschichtung (4) eine haftungsfördernde Beschichtung insbesondere aus Gold, aufweist.
Target gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrixraster (2, 3) Additive und/oder Matrixgemische, sonstige Stoffe oder Stoffgemische zur Verbesserung der MALDI-MSI-Untersuchung und/oder für weitere Analyseverfahren enthalten.
Target gemäß Anspruch 8, gekennzeichnet durch eine Schutzschicht für die auf die Trägeroberfläche als Beschichtung aufgebrachten Stoffe oder Stoffgemische.
Verfahren zur Herstellung des Targets gemäß Ansprüchen 8 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrixraster (2, 3) jeweils durch Inkjet-Druck in Tropfenform mit Mehrfachpulstechnologie zur Reduzierung der Tropfengröße sowie mit gekühlten Printköpfen zur Tropfenstabilisierung niederviskoser Flüssigkeiten auf die Trägeroberfläche aufgebracht werden.