DE102011100450B4

DE102011100450B4 - Apparat zum Sprühen von Zellen, Herstellung des Apparates, Methode zum Sprühen mit dem Apparat und eine Zellsuspension gesprüht mit dem Apparat

Info

Publication number: DE102011100450B4
Application number: DE102011100450A
Authority: DE
Inventors: Patentinhaber gleich
Original assignee: Individual
Current assignee: Renovacare Sciences Corp
Priority date: 2011-04-27
Filing date: 2011-04-27
Publication date: 2013-07-25
Anticipated expiration: 2031-04-28
Also published as: US10376658B2; US20170196679A1; US20130060335A1; DE102011100450A1; DE102011100450B8; US11135380B2; US20200061311A1; US9505000B2

Abstract

Die Erfindung beschreibt eine Methode und einen Apparat geeignet zur Erzeugung einer Zellsprühsuspension mit lebenden Zellen, die entwickelte gesprühte Zellpreparation, und Anwendungen. Das Sprühen erfolgt im Gegensatz zu herkömmlichen Sprühköpfen durch eine Einwegkanüle welch in einen luftführenden Schlauch eingeführt ist, hierdurch erfolgt lediglich eine zellschonende feinen Vertropfung. Durch ausschließliche Verwendung von Luer-Lock Einwegartikeln aus der klinischen Praxis ist die Biokompatibilität und einfache Anwendung gewährleistet. In der Anwendung der Methode und/oder bei der Benutzung des Apparates, werden Zellen in einer Lösung suspendiert und mit dem Apparat durch sprühen über dem Transplantationsgebiet des Empfängers verteilt.

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die dargestellte Erfindung bezieht sich auf eine Zellverteilungstechnik, insbesondere auf einen Apparat zum Sprühen einer Zellsuspension und Distribution dieser Zellsuspension auf eine Fläche, z. B. in der Biomedizinischen Forschung.
HINTERGRUND
Das Sprühen von Zellen ist für die Distribution von Zellsuspension auf eine Fläche z. B. in der biomedizinischen Forschung oder auf eine Gewebewunde von Interesse. Dies kann z. B. in der Chirurgie angewendet werden zur Regeneration von traumatisiertem Gewebe.
Für Fachkundige qualifiziert in der Behandlung von Hautwunden gibt es viele Behandlungsmethoden. Zum Beispiel, Hautlappentransplantationen zum Zweck der Wiederherstellung von Hautdefekten. Im Allgemeinen sind diese Art von Transplantaten nach deren Empfänger-Spender Verhältnis charakterisiert. Die klinisch am häufigsten angewandte Transplantation ist die autologe Transplantation wobei Haut von einem Bereich des Körpers entnommen wird und auf einem anderen Bereich des Körpers des selben Patienten appliziert wird. Das transplantierte Gewebe entwickelt dann neu Blutversorgung und wächst am zugrunde liegenden Gewebe an. Mehrere Varianten der Hauttransplantation werden derzeitig angewandt, einschließlich Spalthaut-, Vollhaut- und Mikrotransplantation. Jede dieser Transplantationsmethoden muss mit einer bestimmten Technik vorbereitet werden und hat ihre inhärent Vorteile und Nachteile.
Spalthauttransplantationen erfordern oft beachtliches Geschick, Zeit und teure Geräte. Weiterhin sind die Spender-Wundbereiche, so groß wie die Empfängerfläche schmerzhaft, resultieren in Narbenbildung und sind medizinisch limitiert in der Fläche. Obgleich Spalthauttransplantationen erfolgreicher sein können als Vollhauttransplantationen, sind diese gewöhnlich kosmetisch weniger attraktiv.
Vollhauttransplantationen erfordern weniger Expertise und teure Geräte und sind kosmetisch attraktiver als Spaltthauttransplantationen. Vollhauttransplantationen wachsen allerdings schlechter an als Spalthauttransplantationen.
Mikrotransplantationen sind einfacher zu erzielen und erfordern keine speziellen Gerätschaften, wobei die kosmetischen Ergebnisse nicht so vorteilhaft sind wie die anderer Methoden da die Narbenbildung oft nicht akzeptabel ist. Die Mikrotransplantation ist zur verbreiteten Heilungsmethode für großflächige Wundabdeckung geworden und beinhaltet das Abschneiden mehrerer sehr kleiner Hautstücke von der Spenderstelle die dann auf einen Verband gelegt werden welcher wiederum auf die wunde gelegt wird.
Eine Alternative zu Spalthauttransplantation ist die Bildung einer Blase unter Saugwirkung an einer gesunden Spenderstelle mit anschließender Ablösung/Abhebung der Haut oberhalb der Blase und sofortiger Transplantation der abgehobenen Haut auf das betroffene Empfängergebiet. Die Methode der Blasenbildung zur Heilung von Wunden wird seit 1960 angewandt. Die Blasen werden mit einem Sauggerät, z. B. Dermavac. T M., mit einem Saugdruck von circa 250–300 mmHg über eine Dauer von 1–2 Stunden gebildet. Die Blasen werden dann abgehoben und auf die zu behandelnde Wunde gelegt. Die Heilungsdauer beträgt circa 10–14 Tage. Diese Methode hat einige Nachteile wie die lange Zeitdauer die benötigt wird um das Transplantat vorzubereiten und die Möglichkeit, daß das Transplantationsgebiet nicht repigmentiert; oder auch ungleichmäßige Repigmentierung an den Rändern des Transplantationsgebietes.
Eine Variante zu den oben beschriebenen Transplantationsmethoden ist die Maschenmethode, „mesh-grafting” welche eine Form des Spalthaut- oder Vollhautverfahrens darstellt bei der parallele Reihen von Schlitzen in das zu behandelnde Gewebe geschnitten werden. Einige Vorteile der Maschenmethode beinhalten: bessere Abdeckung der betroffenen Fläche, Abfluss von Blut und Serum von unterhalb des Wundbereiches, und erhöhte Anpassung des Transplantates an Unebenheiten im Wundbereich/Empfängergebiet. Diese Methode ist sehr erfolgreich mit hohen Anwachsraten nach der Applikation der Transplantate auf gesundes Gewebe.
In der Entwicklung der Transplantationsmethoden wird die Größe der transplantierten Gewebestücke immer kleiner und die Fläche die vom Spenderareal entnommen wird ebenfalls. Eine weitere Methode zur Gewinnung von Gewebe ist die in vitro Kultur von epidermalen Zellen als Zell-sheet. Ein kultiviertes autologes Epitelzelltransplantat wird in konfluent gewachsenen Zellverbänden bereitgestellt (sheet). Diese sind eine wichtige Ergänzung in der Abdeckung von Brandwunden und anderen Verletzung bei welchen große Flächen des Körpers Haut verloren sind.
Es gibt weltweit viele Zentren mit Einrichtungen zur Generierung von Gewebekulturen deren Ziel die Produktion von autologen Epitheltransplantaten für breite Anwendungsmöglichkeiten ist (Navarro et al., J. Burn Care & Rehab., 2000, 21(6): 513–518 und Johnen et al., Burns, 2006, 32(2): 194–200). Eine der bekannten Firmen welche einen solchen Service anbieten ist Genzyme, Boston, USA. Die Anwendung der Zelltransplantate liegt in der Fähigkeit von Zellen konfluente Zellverbände zu erzielen die als sogenanntes Zellsheet zur Transplantation geeignet sind. Diese Methode umgeht viele Nachteile der zuvor beschriebnen Behandlungsmethoden. Zum Beispiel, die Reduktion des Bedarfes für Spenderhaut. Allerdings wachsen diese Zellverbände langsam und brauchen viel Zeit zur Zellkultur, was oft die Vorbereitungszeit für die zu behandelnde Wundfläche des Empfängers überschreitet.
Navarro et al. (J. Burn Care & Rehab., 2000, 21(6): 513–518) und Wood et al. (J Burn Care Rehab, 2003, 13(1): 154–7) beschreiben als Alternative die Anwendung von einzelnen Zellen suspendiert in einer Lösung die über der Wunde verteilt werden, und damit die Zellverbände vermeiden. Die Zellsuspension kann via Pipette, Eintropfen, Injektionsspritze oder ähnlichen Instrumenten in kleinen Mengen über das Transplantationsgebiet verteilt werden. Als bevorzugte Methode wird eine handbetriebene Sprühtechnik beschrieben, wie sie von Avita, Australien als „ReCell Kit” angeboten wird.
Die Sprühtechnik adressiert einige der oben erwähnten Probleme in diesem Bereich. Eine handbetriebene Sprühmethode und zur Zellverteilung wird allerdings nicht in kontrollierter Weise ausgeführt und resultiert in ungleichmäßiger Zelldistribution.
Die vorliegende Erfindung beschreibt einen Apparat, eine Herstellungsmethode des Apparates, eine Methode der Distribution einer Zellsuspension und die Anwendung der Methode bzw. des Apparates, sowie die Zellsuspension, die mit dem Verfahren erzeugt wird. Wobei angestrebt ist, einige der Nachteile die mit der Anwendung von kultivierten Zellverbänden verbunden sind zu adressieren. Dabei wird konsequent die Entwicklung immer kleinerer Gewebsstücke bis auf einzelne Zellen fortgeführt, und das Ziel, die Spenderareale zu reduzieren erreicht.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt einen Apparat, die Herstellung des Apparates, einen Methode zum Sprühen, und ein Verfahren dar welche geeignet sind eine Sprühverteilung lebender Zellen auf eine Fläche zu ermöglichen. Aus der Anwendung der Methode ergibt sich eine spezifische Zellpopulation. In der Anwendung der Methode und/oder des Apparates, werden Zellen in einer Lösung verteilt und mit dem Apparat zur Distribution der Zellsuspension über das zu verteilende Areal gesprüht. Das Sprühen erfolgt im Gegensatz zu herkömmlichen Sprühköpfen durch eine Einwegkanüle welch in einen luftführenden Schlauch eingeführt ist, hierdurch erfolgt lediglich eine zellschonende feinen Vertropfung. Durch ausschließliche Verwendung von Luer-Lock Einwegartikeln aus der klinischen Praxis ist die Biokompatibilität und einfache Anwendung gewährleistet.
Entsprechend der Erfindung liegt ein Verfahren und ein Apparat vor zum Sprühen einer Zellsuspension durch einen kontrollierten Sprühkopf, welche geeignet sind Hautzellen zu verteilen. Folgenden Schritte werden beschrieben: (a) Nutzung einer Gewebeprobe welche Zellen enthält und mindestens eine physische und/oder chemische dissoziierende Fähigkeit zur Dissoziierung der Zellen aus dem Gewebeverband hat; (b) Zellen die zum Sprühen geeignet sind werden in einer physiologischen Kochsalzlösung suspendiert; (c) die hergestellte Zellsuspension wird gefiltert um größere Zellverbände abzutrennen; und d) das Sprühen der Zellsuspension durch einen Sprühkopf gemäß der vorliegenden Erfindung.
Entsprechend der Erfindung liegt ein elektrisch kontrollierter Apparat vor als Gerät zur Verteilung geweberegenerierender Zellen auf eine Wundfläche unter Nutzung eines elektronisch kontrolliertem Gas-/Luftstromes und einer Spritzenpumpe mit einer Spritze für eine Zellsuspension. Das Sprühen wird durch eine Hohlnadel aus der Spritze ermöglicht welche die Zellsuspension enthält, wobei die Hohlnadel bzw. Kanüle in einen sterilen Schlauch eingeführt wird der das Gas von einem Kompressor and der Kanüle entlang leitet. Durch die konstante Bereitstellung eines Gasstroms und gleichzeitiger Applikation eines Vortriebes der Suspension durch die Kanüle werden Suspensionstropfen erzeugt die einzelne Zellen in einen Sprühstrahl austropfen überführt. Entsprechend der Erfindung wird eine Zellsuspension bereitgestellt welche entsprechend der beschriebenen Methode hergestellt ist. Für klinische Anwendungen ist es bevorzugt, daß die Zellen in der Zellsuspension aus autologen Zellen bestehen (welche z. B. von einem Patienten via Autograft isoliert wurden), oder Progenitorzellen.
Weiter Aspekte und Vorteile der Erfindung werden in der folgenden Beschreibung der Abbildungen erläutert.
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 vergleicht zwei Anwendungsmethoden mit Hautzellen am Patienten. Die Anwendung der Methode und/oder des Gerätes welches in dem vorliegenden Text beschrieben ist, das Sprühen von einzelnen Hautzellen auf eine Hautwunde ist dargestellt. Dies wird mit der kommerziellen medizinischen Behandlungsmethode mit Hautzellen unter Verwendung konfluent gewachsener Keratinozytenverbände (Zellsheets)verglichen. Die Verwendung gesprühter Zellen ermöglicht die Verwendung von weniger Zellen, während gleichzeitig eine größere Wundfläche behandelt werden kann. Blasenbildung wird durch die Anwendung einzelner Zellen ohne die Bildung eines geschlossenen Verbandes (Sheet) vermieden. Die Verringerung der Zellzahl erlaubt eine frühere (bzw. sofortige) Behandlungszeit nach Zellisolierung durch das Vermeiden einer in vitro Zellexpansion zur Generierung der Verbände (Sheets). Das Vermeiden der Kultur vermeidet ebenso eine in vitro Differenzierung der Zellen in der Kulturphase und demzufolge mehr Keratinozytenprogenitoren in der Zellsuspension verwendet.
2 stellt ein Beispiel einer Anordnung einer Injektionsspritze für eine Zellsuspension auf einem Sprühgerät mit einem Spritzenmotor und einer Leitung für Gas/Luft. Das Prinzip des Aufbaus auf dem Sprühkopf ist in 3 illustriert.
3 zeigt ein Beispiel des Aufbaus eines Luftschlauchs mit Injektionskanüle auf dem Sprühkopf eines Zellsprühgerätes, wie dargestellt in 2.
ZEICHNUNGEN
1A–C: Darstellung einer Zellsprühtransplantation mit einzelnen Zellen im Vergleich zur Transplantation von Hautzellverbänden. A) Problem der Blasenbildung unter den Hautbahnen. B) Größere Oberflächenabdeckung durch Sprühen anstelle der Verwendung von Zell-sheets.
C) Vermeidung der Gefahr der Blasenbildung nach dem Sprühen.
2: Beispiel des Aufbaues einer Spritze auf einem Sprühgerät mit einem Spritzenmotor und einer Gas-/Luftleitung.
3: Beispiel des Aufbaus eines Luftschlauchs mit einer Suspensionskanüle auf dem Sprühkopf eines Zellsprühgerätes, wie dargestellt in 2.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung stellt eine neue Methode und ein Gerät bzw. Verfahren dar, welches geeignet ist zur Produktion einer transplantierbaren Zellsuspension aus lebendem Gewebe. Bei der Anwendung der Methode und/oder des Gerätes können Zellpräparate von unterschiedlicher Herkunft angewendet werden. Dies beinhaltet Progenitorpräparate aber auch autologe Zellen vom Patienten, wozu Spendergewebe gewonnen wird und gewebedissoziierende Mitteln ausgesetzt wird. Zellen welche zur Verteilung auf einer Fläche geeignet sind, werden in eine Lösung aufgenommen welche zur sofortigen Verteilung geeignet ist, wie z. B. physiologische Kochsalzlösung oder Ringer-Lactatlösung.
Die vorliegende Erfindung hat viele Vorteile gegenüber vorausgehender Stand der Technik welche nachfolgend beschrieben sind.

1. Die Erfindung stellt eine zeitlich effiziente Methode dar zur Bereitstellung einer Zellsprühtransplantation. Die Zellen werden fein und gleichmäßig über einer Wunde verteilt und die Anwendung von Zellverbänden wird vermieden. Gleichzeitig werden nicht so feine Sprühnebel produziert wir mit herkömmlichen Spritzköpfen, was eine schonender Zellverteilung ermöglicht. Dies ist durch kontrollierte Bereitstellung von Zellsuspensionen aus einer Kanüle in einen Luftstraom erreichbar, mit einem elektronisch kontrollierten Apparat welcher ein gleichmäßigeres Sprühen von Zellen ermöglicht als mit mechanischen handbetriebenen Methoden aus dem Stand der Technik bekannt.
2. Eine Methode und ein Apparat werden beschrieben welche die Bildung von Blasen unter Zellsheets vermeidet die mit der Anwendung konventioneller Methoden verbunden sind.
3. Das Verfahren fördert schnelle Zellabdeckung von Gewebswunden, Gewebetrauma/verletzungen und Spendergebieten. Es ermöglicht die Verkleinerung der Zellspendergebiete – das Spendergebiet der Biopsie ist erheblich kleiner als das für Spalthaut und verringert den Bedarf für Spalthautspendergebiete; verbessert die Expansionsrate der Zellabdeckung; verbessert den Heilungsprozess kleiner Brandwunden; ist nützlich für kleine Gebiete von Hautrekonstruktion, wie Narbenbildung; und verbessert die Narbenqualität.
4. Die Apparatur ermöglicht die Behandlung verschiedener Funktionsstörungen der Haut bzw. Hautkrankheiten. Zum Beispiel ist es verwendbar zur Erneuerung der Dermis und Epidermis nach Hautverlust, Repigmentierung und Pigmentanpassung von betroffenen Hautgebieten, Behandlung von Brandwunden, Leukoderma, Vitiligo, Piebaldism, Narbenbehandlung (zum Beispiel nach Inkorrekter Wundheilung, untauglicher Narbenrichtung oder Narbenverzerrung durch Wundkontraktion, Aknenarben), Oberflächenerneuerung nach kosmetischer Dermabrasion, Oberflächenerneuerung nach Laserbehandlung und in Verbindung mit Hautrekonstruktion. Weiterhin kann die Appartur zur Zellersatztherapie angewendet werden, wie zum Beispiel Nervenzellersatztherapie, Epitelzellersatztherapie (wie Urothelium, Mundschleimhaut und Epithelium der Atemwege), Endothelzellersatztherpie und knochenbildende Vorläuferzellersatztherapie. Das Gerät kann auch zur Stimulation von Geweberegeneration nach chirurgisch erzeugten Wunden verwendet werden.
5. Das Verfahren ermöglicht die Herstellung einer Suspension von verschiedenen Zellen in einem Verhältnis vergleichbar mit dem vorhanden Gewebe in situ. Das heißt, auf Grund der Herstellungsmethode werden alle Zellen der Zellsuspension, wie Basalkeratinozyten, Langerhanszellen, Fibroblasten und Melatinozyten werden in Suspension überführt. Dies steht im Vergleich zu Zell-sheets aus üblichen Kulturmethoden fuer Keratinozyten, wo nach selektive Zellkultur ein Verlust der weiteren Zelltypen der Haut resultieren kann. Die Verwendung aller Hautzelltypen hat den Vorteil der verbesserten Repigmentierung der Haut nach einer Hauttransplantation.
6. Das Gerät ermöglicht durch Anwendung eines „intra-operativen” Verfahrens, direkt im Operationsraum bei der Gewebeentnahme einen schnelleren Heilungsprozess – wodurch zusätzliches Trauma für Patienten während der medizinischen Versorgung unter der 2–3 Wochen Wartezeit auf Zell-sheets reduziert wird.

Die Erfindung bezieht sich auf mindestens zwei unterschiedlichen Zellquellen, geeignet in der Oberflächenbehandlung und Regeneration von zerstörtem/verletzem Gewebe: (i) nicht autologe Zellen, einschließlich Progenitorzellen, und (ii) autologe Zellen, einschließlich patienteneigene Progenitorzellen.
Die Erfindung ermöglicht eine Methode zur Herstellung einer autologen Zellsuspension. Entsprechend der Methode wird einem Patienten Gewebe entnommen nach dem Stand der Technik. Die bevorzugte Methode dafür ist durch Entnahme via Gewebebiopsie. Bei der Gewebeentnahme muss die Tiefe und Oberflächenumfang der Entnahmestelle berücksichtigt werden. Die Tiefe und Oberflächenumfang der Entnahmestelle beeinflusst mit wie viel Aufwand die Behandlung durchgeführt werden kann und wie sich der Patient von dem Eingriff erholt. In der am Meisten bevorzugten Form der Erfindung sollte die Größe des Spendergebietes der Größe des Empfängergebietes angemessen sein, z. B. Post-aurikulär für Kopf und Hals, Schenkel für untere Gliedmassen, innerer Oberarm für obere Gliedmassen, Handfläche für die Fußsohle und umgekehrt.
Sowie dem Patienten eine Biopsie entnommen wurde, wird die Gewebeprobe mechanischen und/oder chemischen Dissoziationsmethoden nach dem Stand der Technik ausgesetzt die in der Lage sind die zellularen Schichten der Gewebeprobe zu trennen und eine Einzelzellsuspension zu erzeugen.
Methoden zur Dissoziation von Zellularen Schichten im Gewebe sind gut bekannt, siehe Johnen et al., Burns, 2006, 32(2): 194–200. So wird die Dissoziation entweder via mechanischer oder chemischer Trennung vorgenommen. Mechanische Trennung kann z. B. durch Schaben der Gewebeprobe mit dem Skalpell, zerkleinern des Gewebes, zerschneiden der Gewebelagen, oder Perfusion des Gewebes vorgenommen werden. Chemische Dissoziation kann z. B. via Verdauung des Gewebes durch Enzyme wie z. B. Trypsin, Dispase, Collagenase, Trypsin-EDTA, Thermolysin, Pronase, Hyluronidase, Elastase, Papain und Pancreatin vorgenommen werden.
Nicht-enzymatische Lösungen zur Zersetzung von Gewebe, wie z. B. EDTA, können auch angewendet werden. Bevorzugt wird das Gewebe dissoziiert indem die Gewebeprobe in eine vorgewärmte Enzymlösung gelegt wird die genügend Enzym enthält um die zellulären Lagen aufzulösen.
Nachdem die Gewebeprobe für eine angemessenen Zeit in der Enzymlösung eingetaucht wurde, werden die Zellen entnommen und mit einer Lösung gewaschen.
Die Mischung der Lösung welche in der Methode verwendet wird, sollte ggf. geeignet sein die Wirkung von Enzymen durch Verdünnung oder Neutralisierung erheblich zu beseitigen. Die Lösung welche in der Methode angewendet wird ist bevorzugterweise (i) mindestens frei von xenogenetischem Serum, (ii) geeignet die Viabilitaet der Zellen zu erhalten bis sie am Patienten angewendet werden, und (iii) geeignet zur direkten Anwendung am Patienten zum Zwecke einer Gewebetransplantation.
Nach beschriebener Anwendung sind die zellulären Schichten der Gewebeprobe getrennt und das Suspendieren der Zellen in einer Nährlösung ist ermöglicht. Die Dermis und Epidermis der genommenen Hautprobe können dabei getrennt werden um die dermalen und epithelialen Verbindungen beider Hautschichten freizulegen und somit die Zellen beider Schichten separat zu isolieren.
Zur Anwendung werden geeignete Zellen von den getrennten Hautschichten mittels einer in diesem Fachgebiet bekannten Technik suspendiert. Geeignete Zellen die innerhalb der dermalen und epithelialen Verbindungen liegen beinhalten Basalkeratinozyten, Keratinozyten, Langerhanszellen, Fibroblasten, mesenchymale Stammzellen und Melanozyten. Die Methoden, einschliesslich die Anwendung am Patienten, sind bekannt, wobei jedoch deutlich unterschiedliche Sprühverfahren und Sprühgeräte eingesetzt werden können (Gerlach et al., J Artif Org, 2011 Mar, 34(3): 271–9, Wood et al., J Burn Care Rehab, 2003, 13(1): 154–7) Gleichzeitig bietet die Erfindung eine Methode und Apparatur zur Anwendung einer nicht-autologen Zellsuspension. Zur Bereitstellung von Zellen jeglicher Herkunft werden die Zellen in einer geeigneten Lösung suspendiert. Die Lösung kann aus jeder beliebigen physiologischen Kombination bestehen von einer einfachen Salzlösung zu einer komplexeren Puffer- und/oder Nährlösung. Bevorzugte Nährlösungen basieren auf Ringer-Laktat Lösungen, einschließlich Hartmanns Lösung, Dialyselösung, und peripheren intervenösen Nährlösungen.
Die Zellsuspension wird dann, gemäß Beschreibung im Patentanspruch, durch Anwendung des Apparates verteilt. Bevozugterweise wird die Zellsuspension gefiltert um besonders große Ansammlungen von Zellaggregaten zu vermeiden, entweder vor der Anwendung der Suspension mit dem Sprühgerät oder durch einen Filter im Sprühgerät.
Vor der Anwendung mit dem Sprühgerät oder sofort nach dem Filtern kann die Zelldichte verdünnt werden, je nach dem Verwendungszweck der Anwendung.
Entsprechend der Erfindung, hergestellt durch die hier beschrieben Methode, wird eine gesprühte wässrige Zellsuspension in physiologische Lösung bereitgestellt welche zur Geweberegeneration geeignet ist. Ein wichtiger Vorteil der Erfindung ist die gleichmäßige Verteilung der Zellen auf eine Wundfläche.
Ein wichtiger Aspekt in der Anwendung einer solchen Zellsuspension in der Transplantationstechnik ist, daß eine größere Wundfläche schneller behandelt werden kann als mit in vitro Zellexpansion, da eine in situ Vermehrung der Zellen in der Wunde erfolgen kann. Die Anzahl und Konzentration der Zellen welche auf dem Transplantationsgebiet versprüht wird, kann durch Modifizieren der Konzentration der Zellsuspension eingestellt werden.
Gemäß eines weiteren Aspekts der Erfindung liegt eine Apparatur vor zum Sprühen der Zellen eines Patienten mit einer Gewebstransplantation. Mit dieser Apparatur wird die, gemäß der Erfindung hergestellte Zellsuspension, auf dem Transplantationsgebiet verteilt.
Die Suspension wird aus einer Spritze durch eine Kanüle in einen Luftstromschlauch gesprüht welche die Zellsuspension in kleine durch Luft übertragene Tröpfchen transformiert und auf die Sprühfläche verteilt. Durch Einstellen des Luftstromes und des Flüssigkeitsstromes kann die Sprühverteilung an unterschiedliche Zellen und Gewebebehandlungen eingestellt werden.
Gemäß der Erfindung wird ein elektronisch kontrollierter Apparat beschrieben welcher eine Sprühfunktion durch eine Einwegmaterialsprühkopfverbindung von Kanüle und Luftschlauch enthält. Bevorzugterweise ermöglicht der Apparat eine Zellverteilung mittels 0.5–60 ml steriler Zellsuspension durch den Sprühkopf. Bevorzugterweise überführt der Apparat die Zellsuspension von einer sterilisierbaren Einwegspritze medizinischer Qualität, einschließlich 0.5–60 ml Luer-lock Spritzen, in eine sterile Hohlnadel medizinischer Qualität. Wobei die Nadel bevorzugterweise in einen medizinischen Einwegschlauch eingesteckt ist. Die Bedienung des Apparats basiert bevorzugterweise auf die Erzeugung von sterilisierter Druckluft für den Schlauch in der Sprühkopfverbindung und durch den elektrisch betriebenen Kolben der sterilen Spritze welche beforzugterweise eine Luer-Lock Spritze ist, welche die Zellsuspension enthält. Der Apparat bietet bevorzugterweise konstante Energieaufbringung über eine Dauer von 0.5–10 ± 1.0 Minuten für eine einzige Sprühung, oder mehrere Sprühung, und erzeugt Suspensionstropfen mit den Zellen im Bereich von 30–500 + 200 Mikrometer. Der Apparat kann Mittel bereitstellen zur Messung oder Kontrolle von Parametern wie Fluss, Druck, Volumen und/oder Temperatur.
Bevorzugterweise transportiert der Apparat die Zellsuspension aus einem sterilisierbaren Behälter medizinischer Qualität in einen sterilisierbaren Sprühkopf via Einwegfilter, der geeignet ist große zelluläre Ansammlungen von der Zellsuspension abzusondern. Jeder medizinische übliche Filter der in der Lage ist große zelluläre Ansammlungen von der Zellsuspension abzusondern kann verwendet werden. In einer bevorzugten Form der Erfindung bietet der Filter eine Absonderung von Aggregaten aus 5–100 Zellen, vorzugsweise 20–60 Zellen. Der Apparat kann auch mehrere Spritzen/Lösungen/Suspensionen parallel bereithalten/verarbeiten Der Apparat kann ein erstes und zweites Element beinhalten wobei: (1) das erste Element die Stromversorgung, Gas-/Luftverorgung und elektrische Bedienungselemente beinhaltet, und (2) das zweite Element einen sterilisierbaren Sprühkopf und Behälter mit der Zellsuspension beinhaltet. In diesem Falle sind beide Elemente durch eine Kabel-Gasleitung verbunden, wobei die Leitung und der Sprühkopf sterilisiert werden kann oder mit einem sterilen Folienschlauch abgedeckt werden kann, sowie geeignete Verbindungen zu Element (1) und (2) hat.
Der Apparat kann ein erstes und zweites Element beinhalten wobei beide Elemente electronisch drahtlos miteinander verbunden sind, z. B. zum Zwecke des Datenaustausches, einschließlich Blue Tooth Technologie, und um Bedienungselemente mit dem ersten und zweiten Element zu verbinden.
Der Apparat mit den Funktionen zu (1) und (2) kann weiterhin eine Batterie oder Akkumulator aufweisen zur einfachen Anwendung in Operationssälen. In diesem bevorzugten Fall, beinhaltet er Apparat ein einzelnes komplett tragbares Gerät.
Nachdem die Zellsuspension auf das Transplantationsgebiet gesprüht wurde, kann die Wunde mit einem Wundverband abgedeckt werden. Bevorzugterweise wird die Wunde nachfolgend mit üblichen Protokollen der Wundheilung behandelt.
BEISPIEL
Soweit nicht anderweitig angegeben, wurden alle Materialien von Biochrom AG, Berlin, Deutschland erworben. Medium wurde mit Antibiotika (Penicillin/Streptomycin, 120 μg/ml) und Antimykotika (Amphotericin B, 2.5 μg/ml) versetzt. Nach Erhalt der Einverständniserklärung des Spenders, wurde dem Spender eine 1 cm² große Hautbiopsie entnommen und in 2 mm² große Stücke geschnitten. Die Methode ist im Detail beschrieben, siehe Johnen et al., Burns, 2006, 32(2): 194–200. Vor der Trennung von Dermis und Epidermis wurden die Hautstücke bei 37° in eine 0.4% Dispase Lösung (Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Deutschland) mit DMEM Medium gelegt. Die abgetrennte Dermis und Epidermis wurden jeweils mit 0.05% Trypsin/0.02% EDTA-Lösung für 5 Minuten inkubiert. Die Suspensionen einzelner Zellen wurden gewaschen und gemischt. Sie enthielt Basalkeratinozyten und Dermalfibroblasten/mesenchymale Progenitorzellen. Die Suspension wurde in einer gewöhnlichen Kulturflasche mit serumfreien Medium (Epilife, TEBU, Offenbach, Germany) in Kultur gesetzt. Die Zellen wurden mit einer Zelldichte von 10⁴ pro cm² bei 37C° in feuchter Atmosphäre mit 5% CO₂ mittels eines CO₂-Inkubators (Heraeus BB 6060, Kendro, Langensebold, Germany) inkubiert. Nach Erreichen von 80% Konfluenz, wurden die Zellen getrennt mittels Trypsination und in eine Spritze des hierin beschriebenen Sprühgerät Prototyps aufgenommen. Die Zellen wurden mit einer Dichte von 10⁴ pro cm² in eine gewöhnliche Kulturschale ohne Medium gesprüht. Zur Kontrolle wurden, nach pipettieren in eine mit Medium gefüllte Kulturflasche, Zellen mit der gleichen Dichte aus der gleichen Suspension unter den oben beschrieben Kulturbedingungen kultiviert. Die Zellmorphologie wurde mit Lichtmikroskopie (Zeiss, Axiovert 25) überwacht. Gesprühte und nicht gesprühte Zellen zeigten ähnliche morphologische Erscheinungen unter Licht- und Phasenkontrastmikroskopie, sie zeigten weiterhin ein vergleichbares Folgekulturverhalten.

Claims

Apparatur zum Sprühen biologisch kompatibler Flüssigkeiten, biologisch kompatibler Suspensionen, und biologisch kompatibler Zellsuspensionen einschließlich Stammzellsuspensionen, modifizierte Zellsuspensionen, Zellsuspensionen zur Wundregeneration, Zellsuspensionen für dermale Zellen, Zellsuspensionen für Epithelzellen, Zellsuspensionen für dermale und epitheliale Zellen, welche eine kontinuierlich Sprühapplikation über eine Zeit von 0.5–10 Minuten, vorzugsweise 1–2 Minuten in einem einzelnen Sprühvorgang und/oder mehreren Sprühvorgängen bereitstellt, während Flüssigkeits-/Suspensionstropfen zwischen 10–500 Mikrometern erzeugt werden, wobei die Apparatur eine Hohlnadel/Kanüle eine hohle Nadel zur Ausscheidung von Flüssigkeiten/Suspensionen aufweist, welche – am Ausgang eines biokompatiblen Behälters angeschlossen ist und einen Flüssigkeits-/Suspensionsstrahl zur Spitze der Nadel liefert, – mit der Spitze in einen biokompatiblen Schlauch eingeführt wird welcher einen Gas- und/oder Luftstrom zum Ende des Schlauchs liefert in dem sich die Spitze der Spritze befindet, wobei – die Nadel ein inneres Lumen von 25 G bis 34 G aufweist und – die Nadel in den Schlauch eingeführt wird so dass die Nadelspitze innerhalb +/–3 Millimeter vor dem Schlauchende endet – die Nadelspitze innerhalb des Schlauches mindestens 2–100 Millimeter parallel zum Schlauch läuft, so dass die Nadelspitze mittig im Ende des Schlauchlumen angelegt ist, – der Schlauch einen inneren Durchmesser von 1.5–0.2 Millimeter aufweist, – der Schlauch am Punkt des Nadeleinschusses gebeugt ist mit einem Radius welcher den seitlichen Gasstrom nicht behindert in eine Winkel von 1–170 Grad, wobei ein Nadeleinschuss einfacher ermöglicht wird, – der Gasstrom typischerweise ein steril gefilterter Luftstrom ist, während das Gerät – einen Flüssigkeits-/Suspensionsstrahl von 1–200 ml/min, – via des Schlauches einen Gasstrom von 100–3000 ml/min erbringt, während der Gastrom – durch eine Pumpe bzw. einen Kompressor im Gerät oder in einem separaten Gehäuse welches durch einen Schlauch am Gerät angeschlossen, – als sterile Luft oder vor dem Eintritt in die Nadel mit einem sterilen Filter sterilfiltriert ist, während der Flüssigkeits-/Suspensionsstrahl durch einen komprimierbaren Behälter, einschließlich einer Injektionsspritze mit einem Kolben, welche an einem Bedienungselement angeschlossen ist, einschließlich einer pneumatischen Gas- oder hydraulischen Flüssigmembran, oder an einen mechanischen/elektronischen Schieber, welcher den Kolben der Injektionsnadel andrückt zur Herstellung des Flüssigkeits/Suspensionsflusses, während das Gerät als einzelnes, handgehaltenes und wahlweise batteriebetriebenes Gerät, oder als Gerät mit mindestens zwei Komponenten mit einer hand gehaltenen Sprühvorrichtung und einem Aufsatzelement einschließlich elektrischer Stromversorgung welche durch pneumatische/hydraulische/elektrische Leitungen verbunden sind, dargestellt werden kann, während die oben charakterisierte Nadel-/Schlauch/Bedienungsparameterkonfiguration einen homogenen und andauernden Sprühstrahl erzeugt welcher durch den Fluss des flüssigen Mediums aus der Spitze und aus dem spezifischen gasförmigen Medium aus dem Schlauch, welches weniger schädlich für die Zellsuspension ist als typische Zellsprühdüsen welche Öffnungen weit unterhalb und Turbulenzen und weit über der dargestellten Konfiguration aufweisen; während entweder alle handgehaltenen Teile des Apparates vor Gebrauch sterilisiert werden, oder nur die Teile welche Gas und Flüssigkeit/Suspension enthalten vor Gebrauch sterilisiert werden, oder alle Flüssigkeits-/Gastransportierende Teile separat sterilisiert übergeben werden und steril vor Gebrauch zusammengesetzt werden.
Apparatur gemäß Patentanspruch 1, zur Verwendung von sterilen medizinischen Einweginjektionsspritzen, einschließlich solchen mit Luer-lock Verbindungen, sterilen medizinischen Einwegschläuchen, einschließlich solchen mit Luer-lock Verbindungen, sterilen medizinischen Gassterilfiltern, einschließlich solchen mit Luer-lock Verbindungen, sterilen medizinischen Suspensionsfiltern, einschließlich solchen mit Luer-lock Verbindungen, sterilen medizinischen Injektionsnadeln, einschließlich solchen mit Luer-lock Verbindungen, während entweder alle handgehaltenen nicht Einwegteile des Apparatur vorsterilisiert sind und alle wegwerfbaren sterilen Teile in steriler Weise auf dem handgehaltenen Teil direkt vor Gebrauch zusammengesetzt werden, oder alle sterilen Einwegteile direkt vor Gebrauch auf dem hand gehaltenen Gerät in steriler Weise zusammengesetzt werden nachdem das Gerät mit einem sterilen Plastikschlauch/-folie abgedeckt wurde.
Apparatur gemäß Anspruch 1 und 2 welcher eine Lösung als flüssige, in einer physiologischen Komposition enthaltende Elektrolyte einsetzt, einschließlich Ringer-Laktat artige Lösungen, einschließlich Hartman's Lösung.
Apparatur gemäß Anspruch 1, 2, 3, welche die Zellsuspension von einem medizinischen sterilisierbaren Behälter, einschließlich Luer-lock Spritzen, zu dem sterilisierbaren Sprühkopf, einschliesslich Luer-Lock Kanülen, via eines Einwegfilters überträgt, bevorzugterweise ein Einwegfilter welcher geeignet ist große Zellansammlungen mit einer Ausgrenzung von ungefähr 1–100 Zellen zurückzuhalten.
Apparatur gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4 welche ein erstes und ein zweites Element enthält und geeignete Verbindungen zu den Komponenten (i) und (ii) hat, worin: (i) das erste Element die Stromversorgung, Gas-/Luftversorgung und elektrische Steuerungen enthält, und (ii) das zweite Element den Sprühkopf und den Behälter mit der Zellsuspension beinhaltet; worin beide Elemente durch Kabel und/oder Schlauch verbunden sind; worin das zweite Element und die Verbindung zwischen beiden Elementen sterilisiert werden kann oder mit einer sterilen Operationsschlauchfolie abgedeckt werden kann; worin beide Optionen wahlweise drahtlos zum elektronischen Datenaustausch miteinander verbunden können, einschließlich Blue Tooth Technologie.
Apparatur gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4, 5 zum Einsatz von mindestens zwei nacheinander angewandten Behältern/Injektionsspritzen für dermale Zellen/Progenitorzellen gefolgt von epidermalen Zellen/Progenitorzellen.
Apparatur gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4, 5, 6 zum Einsatz von mindestens zwei parallel angelegten Behältern/Injektionsspritzen welche verschiedene Zellen enthalten, einschließlich dermale Zellen/Progenitorzellen und epidermale Zellen/Progenitorzellen.
Apparatur gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4, 5, 6, oder 7 zum Einsatz von einem angewendeten Behälter/Injektionsspritze welcher eine Zellmischung enthält, einschließlich dermalen Zellen/Progenitor und Epidermzellen/-progenitorzellen.
Apparatur gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, oder 8 welche Sensoren zur Messung von Fluss und/oder Druck, und/oder Temperatur, und wahlweise Rückinformationssteuerungen zur Steuerung von Fluss und/oder Druck, und/oder Temperatur.
Apparatur gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, oder 9 welche batteriebetrieben ist.
Ein Gerät gemäß Ansprüchen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, oder 10 welches vollkommen mechanisch betrieben ist, einschließlich externer Druckluft/Gas-zufuhr mit Druckminderer und -kontrolle, und/oder mechanisch betriebener Spritzenfunktion, und/oder manueller Spritzenfunktion.
Methode zur Nutzung des Gerätes und der Methode gemäß der Ansprüche 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder 11 zur Produktion einer autologen Zellsuspension für einen Patienten welcher eine Zelltransplantation benötigt, welche die folgenden Schritte beinhaltet: (a) Herstellen einer Zellsuspension; und (b) Anwenden der Zellsuspension auf das betroffene Gebiet am Patienten welches eine Zelltransplantation benötigt, in einer Weise welche das gleichmäßige Sprühen einer Zellsuspension auf ein Transplantationsgebiet fördert.
Methode zur Nutzung des Gerätes und der Methoden gemäß der Ansprüche 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder 11 zur Anwendung einer Zellsuspension für einen Patienten welcher eine Zelltransplantation benötigt, wobei die Anwendung der Suspension auf das betroffene Gebiet in einer Weise erfolgt welche das gleichmäßige Sprühen einer Zellsuspension erlaubt.
Methode zur Nutzung des Gerätes und der Methoden gemäß der Ansprüche 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 oder 13 zur Beschichtung einer künstlichen Oberfläche oder einer Oberfläche aus Biomaterial für den kommerziellen Gebrauch oder die Forschung gemäß mindestens eines der obengenannten Ansprüche, wobei besagte Methode die folgenden Schritte beinhaltet: (a) Herstellen einer Zellsuspension, und (b) Anwenden der Zellsuspension direkt auf die künstliche Oberfläche oder Biomaterial welche eine mit Zellen beschichtete Oberfläche benötigen in einer Weise welche das gleichmäßige Sprühen einer Zellsuspension fördert.
Anwendung eines Gerätes und Methoden gemäß der Ansprüche 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 oder 14 zur Zellsprühanwendung in der biomedizinischen Forschung und/oder Medizin.
Eine Zellsuspension hergestellt mittels des Gerätes und der Methoden gemäß Ansprüchen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 und/oder 14.
Eine Zellsuspension hergestellt mittels des Gerätes und der Methoden gemäß der Ansprüche 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 und/oder 14, einschließlich von in vitro expandierten oder nicht kultivierten autologen Zell-/Progenitorzellpreparation, und/oder von in vitro expandierten Progenitorzellen.
Herstellung und Anwendung einer Zellsuspension mittels des Gerätes und der Methoden gemäß Ansprüchen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 und/oder 14, einschließlich von in vitro expandierten und/oder nicht kultivierten autologen mesenchymalen adulten Progenitorzellen und adulten Basalkeratinozyten bzw. Progenitorzellpreparationen.
Herstellung und Anwendung einer Zellsuspension mittels des Gerätes und der Methoden gemäß der Ansprüche 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 und/oder 14, einschließlich von in vitro expandierten oder nicht kultivierten autologen Basalkeratinozyten bzw. Progenitorzellpreparationen in Kombination mit nicht-autologen kultivierten mesenchymalen Progenitorzellpreparationen.