DE102007008484A1

DE102007008484A1 - Pharmazeutische Zubereitung zur Bekämpfung von Metastasen

Info

Publication number: DE102007008484A1
Application number: DE102007008484A
Authority: DE
Inventors: Reinhard Zeisig; Iduna Fichtner; Jane Wenzel; Christian Nowak
Original assignee: EPO EXPERIMENTELLE PHARMAKOLOG; Epo Experimentelle Pharmakologie & Onkologie Berlin-Buch GmbH
Current assignee: EPO EXPERIMENTELLE PHARMAKOLOGIE & ONKOLOGIE B, DE; Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
Priority date: 2007-02-19
Filing date: 2007-02-19
Publication date: 2008-08-21
Also published as: WO2008101469A2; WO2008101469A3

Abstract

Die Erfindung betrifft neuartige pharmazeutische Zubereitungen auf Liposomenbasis und deren Verwendung zur Herstellung von Arzneimitteln zur Bekämpfung von Metastasen. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin und die pharmazeutische Industrie. Erfindungsgemäß umfassen diese Zubereitungen, neben eventuellen zusätzlichen Stoffen, mindestens eine Substanz mit Antitumorwirkung und mindestens eine Substanz mit gerinnungshemmender Wirkung. Insbesondere sind die liposomalen Formulierungen aus Basislipiden und gegebenenfalls weiteren Bestandteilen, wie Helferlipiden, Membranstabilisatoren und Ladungsträgern, aufgebaut und können zur Verbesserung ihrer Wirksamkeit eine modifizierte Oberfläche enthalten.

Description

Die Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zubereitung zur Bekämpfung von Metastasen auf Liposomenbasis. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin und die pharmazeutische Industrie.
Ursache für eine immer noch hohe Mortalitätsrate bei Tumorerkrankungen ist – trotz verbesserter Früherkennung und Therapie des Primärtumors – die Metastasierung, die mit lokaler chirurgischer oder strahlentherapeutischer Behandlung kaum, und mit systemischer Chemotherapie nur bedingt zu beeinflussen ist. Der Erfolg einer Tumortherapie hängt damit wesentlich von einer umfassenden Prävention der Metastasenbildung, die durch zirkulierende Tumorzellen ausgelöst wird, ab.
Metastasierung kann über zwei Prozesse ablaufen. Zum einen durchläuft eine einzelne zirkulierende Tumorzelle eine komplexe Kaskade aus verschiedenen, kausal sich bedingenden Adhäsionsprozessen, bevor eine Festsetzung in einem distanten Gewebe stattfinden kann¹. Der initiale Schritt der Adhäsion wird durch den endothelialen Rezeptor E-Selektin vermittelt, der die auf verschiedenen metastasierenden Krebszellen vorkommenden Kohlenhydrat-Liganden Sialyl Lewis^x (sLe^x) und Sialyl Lewis^a (sLe^a) erkennt. Über Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen kommt es zu einer schwach affinen Bindung der Tumorzelle an das Endothel als Voraussetzung für die sich anschließenden Schritte („Entlangrollen” an der Membran, Freisetzung weiterer Mediatoren, feste Adhäsion und Invasion ins umliegende Gewebe). Schließlich nistet sich die Tumorzelle im Sekundärgewebe ein, initiiert die Bildung eines neovaskulären Blutsystems und proliferiert².
Neben diesem, für einzelne zirkulierende Zellen beschriebenen Mechanismus hat zum anderen die spontane Bildung von Tumorzellmikrothromben Relevanz für das Metastasierungsgeschehen³. Insbesondere in engen Kapillarsystemen (Lunge, Lymphknoten) können diese Komplexe dazu beitragen, dass es zu einer lokalen Anreicherung der Tumorzellen kommt, aus der es wiederum durch einzelne Zellen zur Metastaseneinnistung kommt⁴. Darüber hinaus haben mehrere Studien gezeigt, dass sich insbesondere aktivierte Thrombozyten an Tumorzellen anlagern und so zur Abschirmung von Immunreaktionen und zur Bildung von Mikrothromben beitragen⁵. Als Möglichkeit für eine Blockade der Metastasierungskaskade bieten sich verschiedene Targets an, die in diesem Prozess eine essentielle Rolle spielen. Dazu gehören die Adhäsionsmoleküle auf der Endotheloberfläche und/oder die Liganden, die von der Tumorzelle exprimiert werden. Diese Targets können durch kompetitive Bindung geeigneter Inhibitoren (Antikörper, Kohlenhydrate)⁶ oder durch Hemmung ihrer Expression mit Antisense- oder Gen-Knockout Strategien⁷ ausgeschaltet werden. Andere Ansätze zielen auf die Hemmung der Angiogenese. Dieser ebenfalls essentielle Prozess der Bildung neuer Blutgefäße zur Versorgung der sich neu formierenden Metastasen schließt sich an die Adhäsionskaskade an.
Trotz dieser Fortschritte im Verständnis der Metastasierung hat die weltweite Suche nach neuen Strategien und Medikamenten zur Hemmung von Krebs bisher nicht zu routinemäßig einsetzbaren Präparaten geführt.
Gegenüber dem Stand der Technik stellt sich daher die Aufgabe, ein neuartiges Antitumormedikament auf der Basis von Liposomen zur Verhinderung der Metastasierung von Tumoren zu entwickeln.
Diese Aufgabe wird gemäß den Ansprüchen 1 und 12 der vorliegenden Erfindung gelöst, die Unteransprüche sind Vorzugsvarianten.
Kernpunkt der Erfindung ist eine pharmazeutische Zubereitung, umfassend liposomale Formulierungen, die mindestens eine Substanz mit Antitumorwirkung und mindestens eine Substanz mit gerinnungshemmender Wirkung und gegebenenfalls weitere Stoffe beinhaltet.
Ein wichtiger Ansatzpunkt der Erfindung ist die Ausschaltung der Bildung von Aggregaten aus Tumorzellen untereinander bzw. aus Tumorzellen und Thrombozyten, die als wesentliche Voraussetzung eines Tumorzell-Engraftments angesehen wird. Dies soll durch Oberflächen-modifizierte Liposomen erreicht werden. Zusätzlich lässt sich unter bestimmten Bedingungen durch Liposomen auch die Adhäsion der Tumorzellen an die Blutgefäßwand als alternativer Schritt einer sekundären Tumorzellansiedlung verhindern.
Die im Sinne der Erfindung verwendeten Substanzen mit Antitumorwirkung sind insbesondere solche Stoffe, die die Bildung, das Wachstum und/oder die Ausbreitung von Tumoren negativ beeinflussen bzw. hemmen.
In Betracht kommen hierfür Substanzen aus der Gruppe der Zytostatika, wie Alkylantien, Mitosehemmstoffe, zytostatisch wirksamen Antimetabolite und Antibiotika, Hormone und Hormonantagonisten, sowie Alkylphospholipide, Asparaginase oder Hydroxyharnstoff.
Besonders geeignet sind Alkylphospholipide, wie z. B. Tetradecylphosphatidylcholin (TPC), Hexadecylphosphatidylcholin (HPC), Heptadecylphosphatidylcholin (HpPC), Octadecylphosphatidylcholin (OPC), Hexadecyl-(1,1-dimethyl-piperidin-4-yl)-phosphat (HPP), Octadecyl-(1,1-dimethyl-piperidin-4-yl)-phosphat (OPP), Hexadecylphosphatidylserin (HPS), Hexadecylphosphatidylethanolamin (HPE) oder Edelfosine, da sie sich aufgrund ihrer Struktur günstig in die Membran der liposomalen Formulierung einfügen lassen.
Als Substanzen mit gerinnungshemmender Wirkung werden eingesetzt: Substanzen aus der Wirkstoffgruppe der Aggregationshemmer, wie Dipyridamol, Azetylsalizylsäure, Ticlopidin, Resveratrol, der Antikoagulantien, wie Heparin, niedermolekulares Heparin, Heparinoide, Clopidogrel, der Vitamin K Antagonisten, wie Warfarin, Phenprocoumon, der Thrombolytika, wie Urokinase, Streptokinase, Anistreplase und der Antifibrinolytika, wie Aprotinin, Tranexamsäure und p-Aminomethylbenzoesäure.
Als besonders geeignete Substanzen mit gerinnungshemmender Wirkung im Rahmen der Erfindung haben sich die Wirkstoffe Dipyridamol und Azetylsalizylsäure erwiesen.
Die zur Realisierung der Erfindung verwendete liposomale Formulierung wird aus bekannten Bestandteilen aufgebaut. Sie besteht aus Basislipiden und enthält zusätzlich bevorzugt Helferlipide, Membranstabilisatoren und Ladungsträger, wodurch eine besonders günstige Stabilität der Zubereitung erreicht wird.
Als Basislipide im Sinne der Erfindung haben sich insbesondere Soja-Phosphatidylcholin, Ei-Phosphatidylcholin (EggPC), Hydriertes Phosphatidylcholin (HePC), (Dimyristoyl-Phosphatidylcholin (DMPC), (Dipalmitoyl-Phosphatidylcholin) (DPPC), Distearyl-Phosphatidylcholin (DSPC), Stearyl-Palmitoyl-Phosphatidylcholin (SPPC), Palmitoyl-Stearyl-Phosphatidylcholin (PSPC), Dioleyl-Phosphatidylcholin (DOPC), Palmitoyl-Oleyl-Phosphatidylcholin (POPC) oder Sphingomyelin bewährt.
Als Helferlipide im Sinne der Erfindung werden vorzugsweise Dioleyl-Phosphatidylethanolamin (DOPE) und Dioleyl-Phosphatidylcholin (DOPC) eingesetzt.
Als Membranstabilisator zur Realisierung der Erfindung wird Cholesterol (CH) eingesetzt.
Als Ladungsträger werden bevorzugt negative Ladungsträger eingesetzt, wie z. B. Dicetylphosphat (DCP), Stearylamin (SA), Phosphatidylsäure (PA), Phosphatidylglycerol (PG) oder Monosialogangliosid.
Es hat sich als zweckmäßig erwiesen, auch eine Substanz zur Modifizierung der Oberfläche hinzuzusetzen. Damit kann die liposomale Formulierung auf die Erfordernisse eines Targetings angepasst werden.
Vorzugsweise wird als Substanz zur Modifizierung der Oberfläche der liposomalen Formulierung Polyethylenglycol-Phosphatidylethanolamin (PEG-PE) eingesetzt. Aber auch PEG-Sterole, Sialyl-Lewis^X-Peg-PE, Sialyl-Lewis^A-PEG-PE, Sialyl-Lewis^X-Peg-Sterole oder Sialyl-Lewis^A-PEG-Sterole sind wirksam. Diese Verbindungen erhöhen die Hydrophilie der liposomalen Oberfläche, schirmen die Vesikel dadurch sterisch gegenüber dem Monozyten/Phagozytensystem ab und verhindern, dass die Vesikel als Fremdkörper erkannt und vom Immunsystem eliminiert werden. Darüber hinaus erhöht eine solche Oberfläche die Affinität zu Thrombozyten, wodurch ein unspezifischer Targetingeffekt erzielt wird. Durch zusätzliche Konjugation von spezifischen Liganden wie Lewis^{X
oder A} wird das spezifische Targeting zum Wirkort (Thrombozyten, Endothelmembran) weiter erhöht.
In einer besonders geeigneten Ausführungsform der Erfindung wird die pharmazeutische Zubereitung aus den Bestandteilen Phosphatidylcholin (30–35 μmol), Octadecyl-(1,1-dimethyl-piperidin-4-yl)-phosphat (10–15 μmol), Cholesterol (10–15 μmol), Polyethylenglykol₂₀₀₀-Phosphatidylethanolamin (2–3 μmol), Dicetylphosphat (5–8 μmol) und Dipyridamol (15–20 μmol) hergestellt.
Besonders geeignet sind liposomale Formulierungen, in denen die Liposomen einen mittleren Durchmesser besitzen, der kleiner als 400 nm ist und die Größenverteilung einen Polydispersitätsindex kleiner 0,4 aufweist, um die Eliminierung durch das Monozyen/Phagozytensystem zu verringern, wodurch eine Akkumulation in den Aggregaten aus Thrombozyten und Tumorzellen gefördert wird.
Die Liposomen werden bevorzugt über klassische Verfahren hergestellt, also über Lipidfilmhydratisierung zur Herstellung der multilamellaren Vesikel, dann Extrusion zur Gewinnung von kleinen Vesikeln definierter Größe.
Im Einzelnen werden dazu die Stammlösungen der einzelnen Substanzen miteinander gemischt und es wird durch Verdampfen oder andere geeignete Methoden ein Lipidfilm hergestellt. Aus diesem erhält man durch die Anwendung bekannter Verfahren, wie z. B. Rehydratisierung, multilamellare Vesikel, welche dann anschließend mittels geeigneter Verfahren, vorzugsweise Extrusion, in eine homogene Suspension kleiner Vesikel mit einem Durchmesser von etwa 100–150 nm umgewandelt werden.
Die pharmazeutische Zubereitung ist zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Krankheiten, wie thromboembolische Erkrankungen und Gerinnungsstörungen geeignet, vorzugsweise dann, wenn die Krankheit eine metastasenbildende Tumorerkrankung ist.
Die pharmazeutische Zubereitung zur Behandlung metastasenbildender Tumorerkrankungen auf Liposomenbasis gemäß der Erfindung ist völlig neuartig.
Es konnte gezeigt werden, dass die in der pharmazeutischen Zubereitung enthaltenen Kombinationsliposomen über einen gewissen Zeitraum stabil sind, die Aggregatbildung hemmen, die Adhäsion von Tumorzellen an Endotheloberfläche und Endothelbestandteile hemmen, im Tierversuch die Metastasenverteilung beeinflussen, sowie die Metastasierung einschränken und damit die Metastasenzahl und das Tumorgesamtgewicht reduzieren.
Die eingesetzten Liposomen haben wesentliche Vorteile gegenüber anderen Wirkstoffen. Bei der Verwendung von Oberflächen-modifizierten Liposomen wird eine Anreicherung in Tumorzell-Thrombozytenaggregaten erreicht, wodurch eine gezielte Freisetzung der eingeschlossenen Wirkstoffe in unmittelbarer lokaler Nähe zu den Targets erzielt wird.
Ein zweiter wichtiger Vorteil ist die Möglichkeit des gleichzeitigen Einschlusses von mehreren Wirkstoffen mit unterschiedlichen Wirkprinzipien in die Liposomen, wodurch eine zielgerichtete und gleichzeitige Anreicherung aller Wirkstoffe (auch bei unterschiedlicher Pharmakokinetik der Einzelkomponenten) an Tumorzellen erreicht wird und diese dadurch effizient attackiert werden können.
Neuartig und originell an den erfindungsgemäßen Kombinationsliposomen ist, dass sie eine veränderte Oberfläche besitzen und ein Zytostatikum sowie ein Antigerinnungsmittel eingeschlossen haben. Damit lässt sich synergistisch sowohl die Bindung an das Endothel (Metastasierungskaskade) als auch die Bildung von Tumorzellaggregaten (Emboliemodell) verhindern. Trotz der Komplexität der Zubereitung dieser Vesikel lassen sich diese Liposomen herstellen, und in ihren Eigenschaften (Ladung, Stabilität und Anbindung von Liganden) modifizieren und auf die Erfordernisse eines spezifischen Targetings anpassen.
Durch die Kombination von Blockade der Bindungsfähigkeit, zytotoxischer Wirkung und Hemmung der Komplexbildung durch ein Antikoagulanz in einem Vesikel tritt eine starke, weil additive oder sogar synergistische Wirkung ein.
Der Vorteil dieses neuen Wirkstoffsystems besteht darin, dass es bei verschiedenen Tumoren eingesetzt werden kann, wodurch die hohe, durch Metastasen verursachte Mortalität bei Tumorerkrankungen verringert wird, indem der Prozess der Metastasierung über verschiedene Mechanismen synergistisch gehemmt wird, durch:

– Verringerung der Aggregationsfähigkeit der Thrombozyten.
– Blockade der Bindungsfähigkeit der zirkulierenden Tumorzellen
– Unterdrückung der Bildung von Tumorzell- bzw. Tumorzell/Thrombozytenaggregaten,
– Abtötung der Tumorzellen durch Freisetzung von Kanzerostatika in direkter Umgebung der Zelle.

Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zubereitung stellt einen völlig neuartigen Ansatz zur Metastasierungshemmung dar, der durch die komplexe und lokale Herangehensweise eine außerordentlich hohe Wirksamkeit verspricht.
Die Erfindung soll nachfolgend durch Ausführungsbeispiele näher erläutert werden.
Ausführungsbeispiel 1–3
Es wird an den Beispielen 1–3 gezeigt, wie verschiedene Vesikel mit unterschiedlich modifizierter Oberfläche hergestellt werden, die zusätzlich einen oder mehrere Wirkstoffe in effektiv wirkender Menge eingeschlossen haben. Daran schließt sich die Charakterisierung der Lager- und Serumstabilität an, und die physikochemischen Eigenschaften sowie die biologische Aktivität in vitro werden bestimmt.
Beispiel 1: Es werden Liposomen (Vesikel mit einem Durchmesser < 200 nm und einheitlicher Größenverteilung) nach bekannten Verfahren hergestellt. Die Vesikel unterscheiden sich in ihrer Oberfläche, die entweder unmodifiziert ist (Kon Lip), deren Hydrophilie verstärkt wurde oder an die ein spezifischer Ligand (gerichtet gegen Kohlenhydratepitope auf der Tumorzelloberfläche bzw. gegen Rezeptoren der Thrombozyten) gebunden ist. Die hydrophilen Oberflächenmoleküle (Galaktosebasierende Kohlenhydratmoleküle mit 1–4 Molekülen) und der Ligand vom Selektintyp werden über klassische Kopplungsmethoden an Phosphatidylethanolamin gekoppelt und über dieses Ankerlipid in die Membran integriert.
In diese Vesikel wird als Zytostatikum das Alkylphospholipid Octadecyl-1,1-dimethylpiperidin-4-yl-phosphat (OPP) eingeschlossen, um Tumorzellen spezifisch zu schädigen. Zusätzlich wird in diese OPP-Liposomen ein Antikoagulans (AK) verkapselt, um Tumorzellaggregate aufzulösen. Größe und Größenverteilung (quasielastische Lichtstreuung) und die aktuelle Wirkstoffkonzentration (HPTLC) werden bestimmt. Darüber hinaus wird die Stabilität der Liposomen bei 4°C in Puffer und bei 37°C im Serum über Größenveränderungen und Wirkstofffreisetzung charakterisiert.
Ein typischer Ansatz wird an folgendem Beispiel näher ausgeführt:
Es werden folgende Komponenten als Stammlösungen in einen 50 ml Rundkolben pipettiert: 31,2 μmol Phosphatidylcholin (PC), 12 μmol Octadecyl-(1.1-dimethyl piperidin-4-yl)-phosphat (OPP), 12 μmol Cholesterol (CH), 2,8 μmol Polyethylenglykol₂₀₀₀-Phosphatidylethanolamin (PEG-PE), 6 μmol Dicetylphosphat (DCP) und 15,9 μmol Dipyridamol (DIP). Der Lipidfilm wird durch Verdampfen des Lösungsmittels bei 42°C im Vakuum hergestellt und anschließend mit 2 ml PBS, pH 7.4 wieder resuspendiert. Dabei wird die Suspension gelblich trüb und besteht aus MLV, die über Nacht geschüttelt werden. Die MLV werden anschließend wiederholt durch einen Miniextruder gedrückt, der zwei zusammengelegte Polykarbonatfilter mit 400 nm Porendurchmesser enthält. Nach 19facher Extrusion liegen vollständig große unilamellare Vesikel (LUV's) mit einem mittleren Durchmesser von 131 ± 28 nm vor. Die Suspension hat einen Polydispersitätsindex (PI) von 0,14 ± 0,07.
Das nicht eingeschlossene DIP wird durch Größenausschlusschromatographie über eine Sephadex-Säule (G50 fine) abgetrennt.
Der Gehalt an PC wird mittels Hochleistungsdünnschichtchromatographie (HPTLC) bestimmt und beträgt nach der Säulentrennung etwa 16,4 ± 1,0 μmol/ml, während etwa 150 ± 24 μg DIP/ml Liposomen eingeschlossen sind.
Die Liposomen sind im Kühlschrank mindestens bis zu 8 Wochen lagerfähig, ohne dass sich ihre Eigenschaften wesentlich ändern (maximale Größenzunahme von 6% und einem Anstieg des PI um maximal 30%).
Beispiel 2: Die Wirksamkeit der Liposomen wird in vitro in verschiedenen Testsystemen charakterisiert. Die Adhäsion der Vesikel an Tumorzellmonolayer wird unter statischen (Bindungsassay) und dynamischen (Fließ-)Bedingungen bestimmt. Zusätzlich wird der Einfluss der Liposomen auf das Aggregationsverhalten von Tumorzellen in Abwesenheit und Anwesenheit von Thrombozyten in vitro gemessen. Die Liposomen mit zytotoxischen Wirkstoff werden zusätzlich auf ihren toxischen/wachstumshemmenden Effekt auf Tumorzellen und Thrombozyten untersucht (MTT-Test). Im Ergebnis wird die effektivste Liposomenformulierung für die sich anschließenden Versuche ausgewählt. Kriterien für die Effizienz sind:

a) hohe spezifische Bindungsfähigkeit an Tumorzellen;
b) hohe Zytotoxizität gegenüber Tumorzellen und geringe/keine toxischen Effekte gegenüber Thrombozyten; und
c) starke Zerstörungswirkung auf die Tumorzellaggregate.

Im Folgenden sind einige ausgewählte Beispiele für Testsysteme näher ausgeführt:
2.1 Hemmung der Thrombozvtenaggregation durch Liposomen
100 μl Plättchenreiches Plasma (PRP) mit einer Thrombozytenzahl von 2,5 × 108/ml werden pro Well einer 96-Well Platte gegeben. und mit 0,05 u Thrombin/Well aktiviert. Bei einigen Wells wird auf die Aktivierung verzichtet, um nicht-aktivierte Thrombozyten als Kontrolle mitführen zu können. Zur Hemmung der Aggregation werden im nächsten Schritt die Liposomen (100 nmol Totallipid) bzw. die freien Substanzen in äquimolaren Mengen zugegeben und die Zunahme der Transmission photometrisch bei λ = 595 über einen Zeitraum von 120 Minuten wiederholt gemessen.
Durch die Aktivierung der Plättchen mit Thrombin kommt es in Folge der zunehmenden Thrombozytenaggregation zu einer Abnahme der Extinktion und zu einer Zunahme der Transmission. Die Ergebnisse sind als prozentuale Änderung der Transmission in Bezug auf den ersten Messwert (t = 0; Transmission = 0%)

E_MW: = Extinktion zum gemessenen Zeitpunkt (t = x min)
E_1.MW: = Extinktion zum Zeitpunkt der ersten Messung (t = 0)

Es kann eine Hemmung der Aggregation durch die Kombinationsliposomen um 40% nachgewiesen werden, während keine Hemmung durch Kontrollliposomen auftritt (siehe 1). DIP als freier Wirkstoff hemmt in einer Konzentration von 10 nmol/Well die Thrombozytenaggregation um 30% (Daten nicht gezeigt).
2.2 Hemmung der Adhäsion von Thrombozyten an immobilisierte Tumorzellen
2.2.1 Markierung der Thrombozyten mit Calcein-AM:
2,5 × 10⁸ Thrombozyten/ml werden mit 50 μl Calcein-AM Stocklösung 0,5 mM, in DMSO) versetzt und für 90 min bei 37°C inkubiert. Anschließend werden die Thrombozyten dreimal mit Pufferlösung (vorzugsweise mit TH-Puffer, pH 7,4) gewaschen. Die Fluoreszenz-markierten Thrombozyten werden durch Zentrifugation der Zellsuspension bei 1000 g^–1 für je 10 min erhalten und können über die Messung der Fluoreszenzintensität im Fluostar bei einer Anregungswellenlänge von λ_Ex = 490 nm und der Emissionswellenlänge λ = 530 nm über eine Standardkurve quantifiziert werden.
2.2.2 Adhäsionstest
In eine 96-Well-Platte werden 100 μl einer Suspension von 1 × 10⁶ Tumorzellen/ml RPMI-Medium mit 10% FCS einpipettiert und über Nacht zur Anheftung im Brutschrank bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert. Danach wird das Medium abgezogen und die angehefteten Zellen mit PBS gewaschen. Zur Blockade unspezifischer Bindungsstellen werden die Zellen eine Stunde mit 100 μl einer 1%igen BSA-Lösung bei RT inkubiert. Dann werden die Überstände entfernt und die Zellen erneut mit PBS gewaschen. Im nächsten Schritt werden dann 100 μl der Suspension mit 2,5 × 10⁸/ml Thrombozyten in jedes Well gegeben und die Thrombozyten (PRP) durch zusätzliche Zugabe von 0,05 u Thrombin aktiviert. Zur Hemmung der Adhäsion werden im nächsten Schritt die Tumorzellen und Thrombozyten mit Liposomen (100 nmol Totallipid/Well) bzw. 10 μl einer 1 M EDTA-Lösung/Well als Kontrolle inkubiert.
Parallel dazu erfolgt die Einsaat und serielle Verdünnung von Fluoreszenzmarkierten Thrombozyten in eine schwarze Maxi-Sorg-Platte (Nunc) und deren Aktivierung durch 0,05 u Thrombin, um eine Standardreihe für die Quantifizierung gebundener Thrombozyten zu erhalten.
Nach 1 h Inkubation bei 37°C werden die Überstände aus der Versuchsplatte entfernt und die Zellen zweimal mit PBS gewaschen. Dann erfolgt die Zugabe von 50 μl Lysepuffer/Well in die Kontrollplatte und von 50 μl Lysepuffer und 50 μl PBS je Well der Versuchsplatte. Die Platten werden 3 Minuten geschüttelt, bevor der Inhalt der Versuchsplatte Well für Well in die Messplatte transferiert wird und die Messung im Fluostar bei einer Anregungswellenlänge von λ_Ex = 490 nm und der Emissions-Wellenlänge λ = 530 nm durchgeführt wird. Die Zahl der gebundenen Thrombozyten wird über die Standardkurve bestimmt und ist in Prozent zugegebener Zellen angegeben.
Lysepuffer: 2,5 g Sodiumdodecylsulfat (SDS) mit 1 ml 10 N NaOH versetzen und mit PBS auf 50 ml auffüllen, filtrieren.
Die aktivierungsbedingte Steigerung der Adhäsion der Thrombozyten an HT29-Kolonkarzinomzellen (2) sowie an MT-3 Brustkrebszellen (Daten nicht gezeigt) kann durch Kombinationsliposomen komplett verhindert werden.
2.3 Hemmung der Adhäsion von Tumorzellen an immobilisierte Endothelbestandteile in Anwesenheit von Liposomen und/oder Thrombozyten
2.3.1 Fluoreszenzmarkierung der Zellen:
Tumorzellen (MT3 und MT1 Brustkrebszellen, HT29-Kolonkarzinomzellen und LL Lungenkarzinomzellen) werden wie unter 2.2.1 beschrieben Fluoreszenz-markiert, jedoch wird als Marker 282 nmol Hoechst 33258/75 cm² Kulturflasche verwendet. Die so markierten Zellen werden in PBS (Ca, Mg) aufgenommen und auf 1,2 × 106 Zellen/ml eingestellt.
2.3.2 Immobilisierung der Adhäsionskomponenten:
In eine 96-Well-ImmunoSorp-Platte werden pro Well jeweils 100 μl Ca/Mg-PBS mit den zu untersuchenden Endothelbestandteilen mit 200 ng Kollagen IV; 1 μg Fibronektin oder 200 ng Poly-L-Lysin) pipettiert und über Nacht zur Anheftung bei 4°C stehen gelassen. Danach wird der Überstand abgezogen und zur Blockade unspezifischer Bindungsstellen mit 100 μl einer 1%igen BSA-Lösung bei Raumtemperatur für eine Stunde inkubiert. Abschließend wird mit PBS gewaschen.
2.3.3 Bestimmung der Adhäsionshemmung:
Die Hemmung der Adhäsion der Tumorzellen in Abwesenheit und in Gegenwart von Thrombozyten durch Liposomen wird anschließend wie folgt durchgeführt.
In die Wells werden 50 μl der Hoechst 33258 markierten Tumorzellen und 100 nmol Kombinationsliposomen gegeben. Es wird für 1 h bei 37°C inkubiert, bevor nicht gebundene Tumorzellen durch Waschen mit Puffer entfernt werden. Dann werden zu den Wells mit Tumorzellen 50 μl PBS und 50 μl Lysepuffer gegeben und es wird 3 Minuten geschüttelt.
Parallel dazu wird eine Standardreihe mit Tumorzellen in einer schwarzen Maxi-Sorg Platte mitgeführt, die ebenfalls durch 50 ml Lysepuffer aufgelöst werden. Zu dieser Platte werden nun die Lysate der Inkubationsplatte Well für Well transferiert und anschließend die Fluoreszenzmessung im SLT Fluostar Mikroplattenreader bei λE_x = 355 nm und λ_EM = 460 nm vorgenommen. Die Quantifizierung der gebundenen Tumorzellen erfolgt dann über die mittlere Fluoreszenzintensität aus der Standardreihe für jede Tumorzelllinie.
In den Tabellen 1 und 2 sind die Ergebnisse zusammengefasst. Tabelle 1: Hemmwirkung der Kombinationsliposomen auf die Adhäsion von Tumorzellen an Endothelbestandteile

Beschichtg./Zelllinie HT29 MT3 MT1 LL

Kollagen ++++ ---- --- 0

Fibronektin 0 ---- - 0

Lysin 0 +++ --- 0

-/+ Hemmung/Steigerung der Anheftung um 0–10%
--/++ Hemmung/Steigerung der Anheftung um 10–20%
---/+++ Hemmung/Steigerung der Anheftung um 20–40%
----/++++ Hemmung/Steigerung der Anheftung über 40%
0 keine Änderung

Ergebnis:
Mit den Kombinationsliposomen lässt sich die Adhäsion von MT3 an Kollagen und an Fibronektin, bei MT1 an Kollagen und Lysin Brustkrebszellen zu über 40% hemmen. Tabelle 2: Hemmwirkung der Kombinationsliposomen auf die Adhäsion von Tumorzellen an Endothelbestandteile in Anwesenheit von Thrombin-aktivierten Thrombozyten

Beschichtg./Zelllinie HT29 MT3 MT1 LL

Kollagen +++ ---- - ++++

Fibronektin ---- ---- --- ----

Lysin ---- ---- - ---

-/+ Hemmung/Steigerung der Anheftung um 0–10%
--/++ Hemmung/Steigerung der Anheftung um 10–20%
---/+++ Hemmung/Steigerung der Anheftung um 20–40
----/++++ Hemmung/Steigerung der Anheftung über 40%
0 keine Änderung bei Anwesenheit von Thrombozyten

Ergebnis:
Es konnte eine Hemmung der Adhäsion an alle Endothelbestandteile in Gegenwart von Thrombozyten von über 40% nachgewiesen werden. Die Hemmung war jedoch Zelllinien-abhängig und am ausgeprägtesten bei MT3 Zellen zu beobachten.
Beispiel 3: Nach Auswahl der wirksamsten Vesikeltypen (Beispiel 2a–c) wird eine ausreichend große Menge an Liposomen (2 Testformulierungen, dazu die notwendigen Kontrollformulierungen) als homogenes Prüfmuster für die präklinischen in vivo Studien hergestellt und charakterisiert (siehe Eigenschaften in Beispiel 1). Die Stabilität im Serum und die Lagerstabilität des Testliposomen wird bestimmt.
Ergebnis:
Es liegt eine ausreichende Menge an Liposomen mit hoher aggregationshemmender Wirksamkeit unter in vitro Bedingungen vor.
Ausführungsbeispiele 4 und 5
In diesen Beispielen werden im Rahmen einer Verträglichkeitsstudie Erkenntnisse über die Verträglichkeit der ausgewählten liposomalen Formulierungen, sowie deren Verteilung und Verteilungskinetik unter in vivo Bedingungen gesammelt, um therapeutische Studien effizient durchführen zu können.
Ausführungsbeispiel 4: Für die Verträglichkeitsstudie werden gesunde Mäuse (je 6 Tiere/Gruppe) mit steigenden Mengen von 4–5 ausgewählten Liposomenformulierungen intravenös behandelt. Es wird eine Dosierung in Abhängigkeit von der zytotoxischen Wirksamkeit der Liposomen in vitro gewählt. Zusätzlich wird die bekannte Dosierung für OPP Liposomen als Orientierung herangezogen. Neben der Verträglichkeitsgrenze werden Nebenwirkungen (Gewichtsveränderungen, Leber- und hämatologische Toxizität) erfasst.
Ausführungsbeispiel 5: Parallel dazu wird für die Pharmakokinetik in der Maus (5 Tiere/Zeitpunkt) die Konzentration an Wirkstoff (OPP mittels HPTLC) für ausgewählte Formulierungen über einen Zeitraum von 48 Stunden an 6 Zeitpunkten erfasst. Gleichzeitig wird die Organverteilung für diese Formulierungen quantifiziert. Hierfür werden die Organe (zum Beispiel Leber, Milz, Niere) entnommen, der Wirkstoff und oder/andere Komponenten der Liposomen extrahiert und mittels HPTLC quantifiziert.
Im nächsten Beispiel werden auf Basis der Verträglichkeitsstudien, der Kinetikdaten und der Wirkstoff Verteilungseigenschaften die effektivsten Liposomenformulierungen in therapeutischen Untersuchungen getestet.
Ausführungsbeispiel 6: Es werden therapeutische Studien zur Wirksamkeit der ausgewählten liposomalen Formulierungen durchgeführt.
Der Antimetastasierungeffekt wird im Mausmodell in drei verschiedenen Tumormodellen mit unterschiedlichem Metastasierungspotenzial getestet (humanes HT29 Kolonkarzinom- und MT3 Brustkrebsmodell auf Nudemäusen, sowie das stark metastasierende Mausmelanommodell B16/F10). Eine definierte Zahl von Tumorzellen wird i. v. injiziert und zu geeigneten Zeitpunkten die Mäuse (4–6 Tiere/Gruppe) mit den Liposomen, die im Beispiel 2 ausgewählt wurden, i. v. behandelt.
Zu erfassende Kriterien in diesen Experimenten sind die Gerinnungsparameter (Thrombozytenzahl, aktivierte Rekalzifizierungszeit), und die Zahl und Lokalisation der Mikrotumoransiedlungen in der Lunge in Abhängigkeit von der Dosierung, dem Zeitpunkt der Applikation und dem Behandlungsschedule. Die Metastasen werden makroskopisch und/oder immunhistochemisch bestimmt. Zusätzlich wird das Lungengewicht erfasst.
Ausgewählte Beispiele für die therapeutischen Studien:
6.1 Einfluß des Zeitpunktes der Liposomenapplikation auf die Hemmung der Metastasenentwicklung in der Maus
5 × 10⁶ MT3 Brustkrebszellen aus der Zellkultur werden zum Zeitpunkt t = 0 in je 4 NMRI nu/nu – Mäuse pro Behandlungsgruppe i. v. injiziert. Neben der Kontrollgruppe, die einmalig physiologische Kochsalzlösung erhält, wird eine Gruppe zum Zeitpunkt –6 h (bezogen auf die Tumorzellinjektion), eine weitere Gruppe zu den Zeitpunkten –6, –4 und –2 h, sowie eine Gruppe zu den Zeitpunkten –6, –2, +2 und +4 h mit jeweils 100 nmol Totallipid an Liposomen pro 20 g Maus i. v. behandelt.
Nach 29 d werden die Tiere abgetötet, eine Autopsie vorgenommen und die Gewichte der Tumoren sowie der Lungen bestimmt. Das Ergebnis ist in den 3 und 4 dargestellt.
Bei Behandlung der Tiere mit Kombinationsliposomen 6 Stunden vor der Tumorzellgabe wird die Zahl der Lungenmetastasen sehr stark reduziert, teilweise treten keine Lungenmetastasen mehr auf.
Trotz Verschiebung des Metastasierungsmusters von Lungen- zu mehr Muskelmetastasen wird die Gesamtzahl an Metastasen stark reduziert und es werden keine anderen Organe befallen.
6.2 Einfluss der Dosis der Liposomen auf die Hemmung der Metastasenentwicklung in der Maus
Das Experiment wird entsprechend 6.1 durchgeführt mit der Abwandlung, dass nur zum Zeitpunkt –6 h behandelt wird, jedoch mit unterschiedlichen Dosierungen von Liposomen. Die Mäuse erhalten 50, 100 oder 200 nmol Totallipid Kombinationsliposomen pro 20 g Maus.
Wie in den 5 und 6 dargestellt, kann mit einer einmaligen Behandlung mit 100 nmol Kombinationsliposomen/Maus eine signifikante Reduktion der Metastasierung erzielt werden. In einigen Tieren treten keine Lungenmetastasen mehr auf. Während auch keine anderen Organe befallen sind, treten bei einzelnen Mäusen Muskelmetastasen auf.
Alle in der vorangehenden Beschreibung, den nachfolgenden Ansprüchen und den Abbildungen dargestellten Merkmale können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein.
Legende zu den Abbildungen
1: Hemmung der Aggregation von Thrombozyten durch Kombinationsliposomen in Plasma
Dargestellt sind die Mittelwert der Transmission ± S. D. 80 min nach der Aktivierung in Bezug auf den ersten Messwert (Transmission = 0%). 2,5 × 107 Thrombozyten im Plasma (PRP) wurden mit 0,05 units Thrombin aktiviert und 100 nmol Liposomen zugegeben. Die Änderung der Extinktion in der Thrombozytensuspension wurde bei einer Wellenlänge von 595 nm gemessen. Jeder Wert repräsentiert den Mittelwert +/– S. D. für eine Vierfachbestimmung von mindestens 10 unabhängig durchgeführten Experimenten.

Thrombozyten: aktivierte Thrombozyten ohne Liposomen als Kontrolle.
Kon Lip: Agggregation in Gegenwart von Kontrollliposomen.
Komb-Lip: Agggregation in Gegenwart von Kombinationsliposomen.
(*): signifikant verschieden zur Kontrolle (p < 0,05).

2: Hemmung der Adhäsion von aktivierten Thrombozyten an immobilisierten HT 29 Kolonkarzinomzellen durch Kombinationsliposomen
1 × 10⁵ Tumorzellen/Well wurden in einer 96-Well Platte immobilisiert und nach Behandlung mit BSA mit 2,5 × 10⁷ Calcein-AM-markierten Thrombozyten (mit/ohne Thrombinaktivierung) und 100 nmol Liposomen bei 37°C inkubiert. Nach der Zelllyse wurde die Fluoreszenzintensität der gebundenen Thrombozyten gemessen bei: λ_Ex: 490 nm und λ_EM: 530 nm. Jeder Wert repräsentiert den Mittelwert +/– S. D. für eine Vierfachbestimmung von mindestens 8 unabhängig durchgeführten Experimenten.

Thrombozyten: Thrombozyten ohne Liposomen als Kontrolle
Kon Lip: Adhäsion in Gegenwart von Kontrollliposomen.
Komb-Lip: Adhäsion in Gegenwart von Kombinationsliposomen.
s(*): signifikant verschieden zur Kontrolle (p < 0,05).

3: Zahl der sichtbaren Metastasen/Tier
4: Gewicht der extrapulmonalen Metastasen/Tier
5: Gesamtzahl der sichtbaren Metastasen/Tier
6: Masse an extrapulmonaler Metastasen/Tier
Abkürzungsverzeichnis

CH: Cholesterol
DCP: Dicetylphosphat
DMPC,: Dimyristoyl-Phosphatidylcholin
DOPC,: Dioleyl-Phosphatidylcholin
DOPE: Dioleyl-Phosphatidylethanolamin
DPPC,: Dipalmitoyl-Phosphatidylcholin
DSPC,: Distearyl-Phosphatidylcholin
EggPC,: Ei-Phosphatidylcholin
HePC,: Hydriertes Phosphatidylcholin
HPC: Hexadecylphosphatidylcholin
HPE: Hexadecylphosphatidylethanolamin
HPP: Hexadecyl-(1,1-dimethyl-piperidin-4-yl)-phosphat
HpPC: Heptadecylphosphatidylcholin
HPS: Hexadecylphosphatidylserin
Kon-Lip: Kontroll-Liposomen
LUV: Large unilamellar vesicles (Große unilamellare Vesikel)
MLV: Multilamellare Vesikel
OPC: Octadecylphosphatidylcholin
OPP: Octadecyl-(1,1-dimethyl-piperidin-4-yl)-phosphat
PA: Phosphatidylsäure
PE: Phosphatidylethanolamin
PEG: Polyethylenglykol
PG: Phosphatidylglycerol
PI: Polydispersitätsindex
POPC,: Palmitoyl-Oleyl-Phosphatidylcholin
PSPC,: Palmitoyl-Stearyl-Phosphatidylcholin
SA: Stearylamin
SPPC,: Stearyl-Palmitoyl-Phosphatidylcholin
TPC,: Tetradecylphosphatidylcholin

Literaturverzeichnis

¹ Kannagi, R. (1997) Glycoconj J 14: 577–584. Saiki, I., et al. (1996) Int J Cancer 65: 833–839.
² Engers, R. und Gabbert, H. E. (2000) J Cancer Res Clin Oncol 126: 682–692. Ley, K. (1996) Cardiovasc Res 32: 733–742. McEver; R. P. (1997) Glycoconj J 14: 585-591.
³Obana, S. et al. (2002) Kobe J. Med. Sci. 48: 43–54. de Mascarel, I. Et al. (1998) Eur. J. Cancer. 34: 58–65.
⁴ Li, C. Y. et al. (2000) Cancer Metastasis Rev. 19: 7–11.
⁵ Borsig, L. et al. (2001) Proc Natl Acad Sci U S A 98: 3352–3357. Yu, Y. et al. (2002) J Cancer Res Clin Oncol 128: 283–287. Ma, Y. Q. und Geng, J. G. (2002) J Immunol 168: 1690–1696.
⁶ Gege, C. et al. (2000) Chemistry 6: 111–122. Ikegami-Kuzuhara, A. et al, (2001) Br. J. Pharmacol. 134: 1498–1504. Ito, I. Et al. (2001) Am. J. Kidney Dis. 38: 265–273. Stahn, R. et al. (2000) Tumour Biol 21: 176–186.
⁷ Stahn, R. et al. (2001) Cell Mol Life Sci 58: 141–147. Chef, H. H. et al. (2003) Int J Cancer 103: 169–176. Magdolen, V. (2003) Recent Resu/ts Cancer Res. 162: 43-63.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

- Kannagi, R. (1997) Glycoconj J 14: 577–584 [0086]
- Saiki, I., et al. (1996) Int J Cancer 65: 833–839 [0086]
- Engers, R. und Gabbert, H. E. (2000) J Cancer Res Clin Oncol 126: 682–692 [0086]
- Ley, K. (1996) Cardiovasc Res 32: 733–742 [0086]
- McEver; R. P. (1997) Glycoconj J 14: 585-591 [0086]
- de Mascarel, I. Et al. (1998) Eur. J. Cancer. 34: 58–65 [0086]
- Li, C. Y. et al. (2000) Cancer Metastasis Rev. 19: 7–11 [0086]
- Borsig, L. et al. (2001) Proc Natl Acad Sci U S A 98: 3352–3357 [0086]
- Yu, Y. et al. (2002) J Cancer Res Clin Oncol 128: 283–287 [0086]
- Ma, Y. Q. und Geng, J. G. (2002) J Immunol 168: 1690–1696 [0086]
- Gege, C. et al. (2000) Chemistry 6: 111–122 [0086]
- Ikegami-Kuzuhara, A. et al, (2001) Br. J. Pharmacol. 134: 1498–1504 [0086]
- Ito, I. Et al. (2001) Am. J. Kidney Dis. 38: 265–273 [0086]
- Stahn, R. et al. (2000) Tumour Biol 21: 176–186 [0086]
- Stahn, R. et al. (2001) Cell Mol Life Sci 58: 141–147 [0086]
- Chef, H. H. et al. (2003) Int J Cancer 103: 169–176 [0086]
- Magdolen, V. (2003) Recent Resu/ts Cancer Res. 162: 43-63 [0086]

Claims

Pharmazeutische Zubereitung, umfassend eine liposomale Formulierung, welche – mindestens eine Substanz mit Antitumorwirkung und – mindestens eine Substanz mit gerinnungshemmender Wirkung, sowie – gegebenenfalls weitere Stoffe enthält.
Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet dass die liposomale Formulierung mindestens ein Basislipid, bevorzugt alle der folgenden Bestandteile umfasst: – Basislipid, – Helferlipid, – Membranstabilisatoren, – Ladungsträger und – gegebenenfalls eine Substanz zur Modifizierung der Oberfläche.
Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 2, wobei als Basislipide Soja-Phosphatidylcholin, EggPC (Ei-Phosphatidylcholin), HePC (Hydriertes Phosphatidylcholin), DMPC (Dimyristoyl-Phosphatidylcholin), DPPC (Dipalmitoyl-Phosphatidylcholin), DSPC (Distearyl-Phosphatidylcholin), SPPC (Stearyl-Palmitoyl-Phosphatidylcholin), PSPC (Palmitoyl-Stearyl-Phosphatidylcholin), DOPC (Dioleyl-Phosphatidylcholin), POPC (Palmitoyl-Oleyl-Phosphatidylcholin) oder Sphingomyelin eingesetzt werden.
Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 2–3, wobei als Helferlipide DOPE (Dioleyl-Phosphatidylethanolamin) oder DOPC (Dioleyl-Phosphatidylcholin) eingesetzt werden.
Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 2–4, wobei als Membranstabilisator CH (Cholesterol) eingesetzt wird.
Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 2–5, wobei als Ladungsträger ein negativer Ladungsträger eingesetzt wird.
Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 2–6, wobei als negativer Ladungsträger DCP (Dicetylphosphat), SA (Stearylamin), PA (Phosphatidylsäure), PG (Phosphatidylglycerol) oder Monosialogangliosid eingesetzt werden.
Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 2–7, wobei als Substanz zur Modifizierung der Oberfläche der liposomalen Formulierung PEG-PE (Polyethylenglycol-Phosphatidylethanolamin), PEG-Sterole, Sialyl-Lewis^X-Peg-PE, Sialyl-Lewis^A-PEG-PE, Sialyl-Lewis^x-Peg-Sterole oder Sialyl-Lewis^A-PEG-Sterole eingesetzt werden.
Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 1–8, wobei der Durchmesser der Liposomen der liposomalen Formulierung kleiner als 400 nm ist und die Größenverteilung einen Polydispersitätsindex kleiner 0,4 aufweist.
Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 1–9, wobei als Substanzgruppen mit Antitumorwirkung Zytostatika, wie Alkylantien, Mitosehemmstoffe, zytostatisch wirksame Antimetabolite und Antibiotika, Hormone und Hormonantagonisten, sowie Alkylphospholipide, Asparaginase und/oder Hydroxyharnstoff eingesetzt werden.
Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 1–10, wobei als Substanzgruppen mit Antitumorwirkung Alkylphospholipide eingesetzt werden.
Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 1–11, wobei als Alkylphospholipide TPC (Tetradecylphosphatidylcholin), HPC (Hexadecylphosphatidylcholin), HpPC (Heptadecylphosphatidylcholin), OPC (Octadecylphosphatidylcholin), HPP (Hexadecyl-(1,1-dimethyl-piperidin-4-yl)-phosphat), OPP (Octadecyl-(1,1-dimethyl-piperidin-4-yl)-phosphat), HPS (Hexadecylphosphatidylserin), HPE (Hexadecylphosphatidylethanolamin) und/oder Edelfosine eingesetzt werden.
Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 1–12, wobei als Wirkstoffgruppen mit gerinnungshemmender Wirkung Aggregationshemmer (Dipyridamol, Azetylsalizylsäure, Ticlopidin, Resveratrol); Antikoagulantien (Heparin, niedermolekulares Heparin, Heparinoide, Clopidogrel). Vitamin K Antagonisten (Warfarin, Phenprocoumon) Thrombolytika (Urokinase, Streptokinase, Anistreplase und/oder Antifibinolytika (Aprotinin, Tranexamsäure, p-Aminomethylbenzoesäure) eingesetzt werden.
Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 1–13, wobei bevorzugt als Wirkstoff Dipyridamol und/oder Azetylsalizylsäure eingesetzt wird.
Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 1–14, welche bevorzugt die Bestandteile Phosphatidylcholin (30–35 μmol), Octadecyl-(1.1-dimethyl piperidin-4-yl)-phosphat (10–15 μmol), Cholesterol (10–15 μmol), Polyethylenglykol₂₀₀₀-phosphatidylethanolamin (2–3 μmol), Dicetylphosphat (5-8 μmol) und Dipyridamol (15–20 μmol) umfasst.
Verwendung einer pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 1–15 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Krankheit, ausgewählt aus den folgenden Gruppen: metastasenbildende Tumorerkrankungen, thromboembolische Erkrankungen oder Gerinnungsstörungen.
Verwendung nach Anspruch 1–16, wobei die Krankheit eine metastasenbildende Tumorerkrankung ist.