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Die
Erfindung betrifft Verfahren und Apparate für die Fragmentierung von großen Molekülen, insbesondere
von Biopolymeren.
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Die
Erfindung besteht darin, Analyt-Ionen mit angeregten oder radikalen
Neutralteilchen reagieren zu lassen, wodurch sich, wie beispielsweise
im Falle des Beschusses von Analyt-Ionen mit Heliumatomen aus einem FAB-Generator,
neuartige Fragmentierungsarten ergeben, die stark einer Fragmentierung durch
Elektroneneinfang (ECD) ähneln.
Die Reaktionen können
in magnetischen Ionenfallen (Ionencyclotronresonanz-Zellen, ICR),
in Hochfrequenz-Ionenfallen
nach Wolfgang Paul, in Ionenleitsystemen oder auch in freien Strahlen
der Analyt-Ionen
oder der Neutralteilchen stattfinden.
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Stand der
Technik
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Das
Ziel der Human-Proteomik ist es, alle Proteine des menschlichen
Körpers
zu erforschen, ihre stets wechselnden Strukturen und Modifikationen
zu bestimmen, ihre Partner für
Wechselwirkungen zu erkennen und die Art der Wechselwirkungen herauszufinden.
Die 22 000 Gene, die im menschlichen Genom gefunden wurden, erzeugen
eine viel höhere
Anzahl an verschiedenartigen Proteinen (100- bis 1000-mal mehr)
auf Grund von Mutationen, posttransskriptionalen oder posttranslationalen
Modifikationen der Proteine. Die Aufgabe der Human-Proteomik ist
daher gewaltig. Weitere Aufgaben warten in der Tier-Proteomik und
Pflanzen-Proteomik. Der letztendliche Erfolg in der Erforschung
dieser Grundlagen unseres Lebens wird von der Entwicklung adäquater Werkzeuge
zur Erkennung der Proteinstrukturen abhängen.
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Tandem-Massenspektrometrie
(MS/MS) ist eines der nützlichsten
Werkzeuge der Proteomik wegen seines hohen Nachweisvermögens (Femtomole und
niedriger) und seiner hohen Spezifität. Das übliche MS/MS-Verfahren für die Protein-Charakterisierung
besteht aus einem enzymatischen Verdau des Proteins und einer nachfolgenden
Fragmentierung der Verdaupeptide im Massenspektrometer durch Stöße mit einem
Stoßgas.
(Zur Definition: Peptide sind kleinere Proteine mit bis zu etwa
30 oder 40 Aminosäuren;
Verdaupeptide sind aus größeren Proteinen
durch enzymatischen Verdau entstanden, beispielsweise durch einen
Verdau mit dem Enzym Trypsin). Die Massen der Fragment-Ionen und
des Molekülions
werden anschließend
in eine Suchmaschine eingegeben, die das gemessene Fragmentierungsmuster
mit theoretischen Fragmentierungsmustern der virtuellen Verdaupeptide
des entsprechenden Enzyms aller Proteine einer Protein-Sequenzdatenbank
vergleicht. Der Erfolg dieses Verfahrens hängt davon ab, wie viele Fragment-Ionen aus
dem Verdaupeptid-Ion gebildet werden, und wie charakteristisch oder
spezifisch diese Fragment-Ionen für ein gegebenes Verdaupeptid
sind.
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Die
herkömmliche
Fragmentierungstechnik ist die Stoßfragmentierung (CID = collision
induced dissociation, auch CAD = collision activated dissociation).
Die Peptid-Ionen werden auf kinetische Energien von 20 bis 4000
Elektronvolt beschleunigt und stoßen mit Neutralgasmolekülen, dabei
werden innere Bindungssysteme zu Schwingungen angeregt. CID spaltet
vorzugsweise die so genannten Peptid-Bindungen (C-N-Bindungen in
der zentralen Kette aus Aminosäuren),
dabei werden N-terminale b-Fragmente und C-terminale y-Fragmente
gebildet. Die Nachteile dieser Fragmentierung bestehen in Verlusten
leicht abspaltbarer Gruppen, die in vielen posttranslationalen Modifikationen
vorkommen (beispielsweise Phosphorylierungen, Sulfatat-Ionen) und in
vielfach vorkommenden unvollständigen
Fragmentierungen.
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Tatsächlich sind
die Informationen über
das Protein, die in Form der MS/MS-Spektren an die Datenbank-Suchmaschinen übermittelt
werden, selten vollständig.
Es können
daher falsche Identifizierungen nicht ausgeschlossen werden; diese
kommen vielmehr häufig
vor, da die Datenbanken nur einen winzigen Bruchteil aller wirklich
vorkommenden Proteine einschließlich
aller Mutationsformen und Modifikationen enthalten, selbst wenn
das Genom voll entschlüsselt
ist. Falsche Identifizierungen und fehlerhafte Strukturinformationen
sind ein ernsthaftes Problem der heutigen Proteomik.
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Um
falsche Identifizierungen und fehlerhafte Strukturinformationen
zu vermeiden, müssen
unabhängige
(so genannte „orthogonale") und möglichst auch
sanfte Fragmentierungsarten zur Verfügung stehen. Als „sanft" werden hier solche
Fragmentierungsarten bezeichnet, die keine Seitenketten und insbesondere
keine Modifikationsgruppen abspalten. Zueinander „orthogonale" Fragmentierungsarten
liefern bestätigende
Informationen über
andere, unabhängige
Wege. Diese orthogonalen Fragmentierungsverfahren können zur
Bestätigung
der Identifizierungen und der Korrektur der Strukturinformationen
herangezogen werden. Ein guter Kandidat für eine solche zur Stoßfragmentierung
CID orthogonale Fragmentierungsart ist die Elektroneneinfang-Dissoziation
(ECD = electron capture dissociation), die N-Cα-Bindungen
der Aminosäurenkette
spaltet und N-terminale c-Fragmente und C-terminale z-Fragmente
erzeugt, ohne dabei labile Gruppen zu verlieren. Die Massendifferenz
zwischen b- und c-Ionen beträgt
+17 atomare Masseneinheiten (Dalton), die Differenz zwischen z-
und y-Ionen beträgt –16 Dalton.
Diese Massendifferenzen, die bei richtiger Zuordnung zwischen den
unabhängigen
Messungen auftreten müssen,
können
die Identifizierung sicherer machen. Die kombinierte Anwendung von
CID und ECD erhöht
die Sicherheit der Identifizierung um Faktoren von 20 bis 100.
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Die
Fragmentierung durch Elektroneneinfang ECD ist bisher nur in teueren
Ionencyclotronresonanz-Massenspektrometern ICR-MS (auch Fourier-Transform-Massenspektrometer
FTMS genannt) routinemäßig anwendbar.
Dieses Fragmentierungsverfahren hat zur Voraussetzung, dass doppelt
geladene Ionen der Untersuchungssubstanz (im Folgenden Analytsubstanz
genannt) zur Verfügung
stehen.
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In
neuester Zeit ist ein weiteres Fragmentierungsverfahren bekannt
geworden, das zur Stoßfragmentierung
CID orthogonal ist: Die Fragmentierung von mehrfach geladenen positiven
Ionen durch Reaktionen mit geeigneten negativen Ionen durch Elektronentransfer
(ETD = electron transfer dissociation, J.E.P. Syka, J.J. Coon, M.J.
Schroeder, J. Shabanowitz und D.F., Hunt „Peptide and protein sequence analysis
by electron transfer dissociation mass spectrometry", Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 2004, 101, 9528–9533).
Diese Reaktionen können
in Hochfrequenz-Ionenfallen ablaufen, und zwar sowohl in linearen
Ionenfallen aus Stabelektroden wie auch in dreidimensionalen Ionenfallen
aus Ring- und Endkappenelektroden. Um hohe Ausbeuten an Fragment-Ionen
zu erhalten, ist es jedoch notwendig, von dreifach geladenen Ionen
auszugehen. Da aber gerade für
die weitaus interessantesten Biomoleküle, die Verdaupeptide, die
Herstellung von dreifach geladenen Ionen nur mit sehr eingeschränkter Ausbeute möglich ist,
hat das Verfahren seine Grenzen. Die Notwendigkeit, von dreifach
gelade nen Analyt-Ionen auszugehen, reduziert das Nachweisvermögen des Verfahrens
mit ETD um Faktoren von 10 bis 20.
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Eine
gängige
Art der Ionisierung großer
Biomoleküle
ist die Elektrosprüh-Methode
(ESI = electron spray ionization), die Ionen bei Atmosphärendruck
außerhalb
des Massenspektrometers ionisiert. Diese Ionen werden dann über Einlasssysteme
bekannter Art in das Vakuum des Massenspektrometers und von dort
in die Ionenfalle eingebracht.
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Diese
Ionisierung erzeugt praktisch keine Fragment-Ionen, die Ionen sind
im wesentlichen die des Analytmoleküls. Wohl aber treten bei Elektrosprühen mehrfach
geladene Analyt-Ionen auf; für Peptide
gilt, dass die doppelt geladenen Ionen in etwa 85 bis 90 % der Fälle die
häufigsten
Ionen sind. Die dreifach geladenen Ionen treten in der Regel nur in
wenigen Prozenten der insgesamt gebildeten Ionen auf. Für leichtere
Peptide sind die einfach geladenen Ionen die häufigsten, die doppelt geladenen die
zweithäufigsten.
Durch das Fehlen fast jeder Fragmentierung der entstehenden Analyt-Ionen
während
des Ionisierungsprozesses beschränkt
sich die Information aus dem Massenspektrum auf das Molekülgewicht;
es fehlen Informationen über
interne Molekülstrukturen,
die zur weiteren Identifizierung der vorliegenden Substanz benutzt
werden können.
Diese Informationen können
erst über
die oben geschilderte Aufnahme von Fragment-Ionenspektren in Tandem-Massenspektrometern
erhalten werden.
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Wegen
der hohen Preise von Fourier-Transform-Massenspektrometern (FTMS)
ist es zu wünschen,
dass zur Stoßfragmentierung
CID komplementäre
und orthogonale Fragmentierungsverfahren wie Elektroneneinfang-Dissoziation
ECD auch in einfacheren, kleineren und weniger teueren Massenspektrometern
ausgeführt
werden können,
beispielsweise in Quadrupol-Ionenfallen-Massenspektrometern, die
mit Hochfrequenzspannungen betrieben werden. In Quadrupol-Ionenfallen
wird bisher ausschließlich
durch Stoßfragmentierung
CID fragmentiert. Für
eine Fragmentierung durch Elektroneneinfang ECD muss jedoch die
kinetische Energie der Elektronen sehr gering sein, da sonst kein
Einfang stattfinden kann. In der Praxis bietet man Elektronen mit
einer Energie an, die nur wenig über
der thermischen Energie liegt. Das geht in den sehr starken Magnetfeldern
der Fourier-Transfom-Massenspektrometer sehr gut, jedoch nicht in
elektrischen Hochfrequenz-Ionenfallen. Weder in dreidimensionalen
noch in linearen Ionenfallen ist bisher eine Fragmentierung der
Ionen durch Elektroneneinfang mit genügender Ausbeute gelungen. Hier
ist es störend,
dass praktisch zu jedem Zeitpunkt hohe elektrische Feldstärken herrschen,
die den Zugang von niederenergetischer Elektronen erschweren, wenn
auch nicht unmöglich
machen (J. Franzen
DE
100 58 706 C1 ; R. Zubarev et al.
US 6,800,851 B1 ).
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Normalerweise
bestehen Ionenfallen nach Wolfgang Paul aus einer Ringelektrode
und zwei Endkappenelektroden, wobei in der Regel die Ringelektrode
mit der Speicherhochfrequenzspannung versorgt wird; diese Ionenfallen
werden auch dreidimensionale Ionenfallen genannt. Es können aber auch
Vierstab-Quadrupolfilter nach Paul als Ionenfallen verwendet werden,
wenn beide Enden des Stabsystems durch Blenden mit ionenabstoßenden Potentialen
beaufschlagt werden. Diese so genannten „linearen Quadrupol-Ionenfallen" oder kurz „linearen Ionenfallen" können leichter
mit Ionen befüllt
werden und möglicherweise
mit mehr Ionen als die „dreidimensionalen
Ionenfallen". Im
Inneren der Ionenfalle können
Ionen im quadrupolaren Hochfrequenzfeld gespeichert werden. Die
linearen Ionenfallen werden auch oft „zweidimensionale Ionenfallen" genannt.
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Sowohl
die dreidimensionalen wie auch die linearen Ionenfallen können auch
als Ionenanalysatoren verwendet werden, indem die Ionen durch resonante
Anregung massenselektiv ausgeworfen und dann als Ionenströme gemessen
werden. Aus den linearen Quadrupol-Ionenfallen können die Ionen sowohl radial
durch Schlitze in mindestens einer der langgestreckten Elektroden
(
US 5,420,425 , M. E. Bier
und J. E. Syka, entsprechend
EP 0 684 628 A1 ), wie auch axial durch Kopplungsvorgänge im inhomogenen
Endfeld des Stabsystems („A
new linear ion trap mass spectrometer", J. W. Hager, Rapid Commun. Mass Spectrom.
2002, 16, 512–526)
massenselektiv herausgeworfen werden. Die massenselektiv herausgeworfenen
Ionen werden durch eine Detektionseinheit, beispielsweise einen
Sekundärelektronenvervielfacher,
gemessen und dann zu einem Massenspektrum verarbeitet.
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Ionenfallenmassenspektrometer
haben Eigenschaften, die ihren Einsatz für viele Arten von Analysen
interessant macht. So können
insbesondere ausgewählte
Ionensorten (so genannte „Eltern-Ionen") in der Ionenfalle
isoliert und fragmentiert werden. Die Isolierung besteht darin,
alle unerwünschten Ionen
aus der Ionenfalle durch resonante Anregung hinauszuwerfen und nur
die erwünschten
Analyt-Ionen in der Ionenfalle zu belassen. Die Fragmentierung verläuft etwas
anders als die oben durch Beschleunigung der Analyt-Ionen beschriebene
Fragmentierung. Die Analyt-Ionen werden hier durch Anregung ihrer
Oszillationen zu vielen Einzelstößen mit dem
Stoßgas
gezwungen, wobei sehr viele kleine Energieportionen aufgenommen
werden, bis endlich eine Fragmentierung eintritt. Diese Art der
Fragmentierung liefert, ebenso wie die Stoßfragmentierung nach Beschleunigung,
Fragment-Ionen der b- und y-Reihe. Die Spektren dieser Fragment-Ionen
werden auch "Tochter-Ionenspektren" der betreffenden „Eltern-Ionen" genannt. Es können in
Ionenfallen auch „Enkel-Ionenspektren" als Fragment-Ionenspektren ausgewählter Tochter-Ionen
gemessen werden.
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Für Flugzeitmassenspektrometer
mit MALDI-Ionenquellen, deren Produkte gepulst axial in das Flugzeitmassenspektrometer
eingeschossen werden, sind ebenfalls zwei verschiedene, zueinander orthogonale
Fragmentierungsarten für
die Analyt-Ionen bekannt. Der metastabile Zerfall von Analyt-Ionen
auf der geraden Flugstrecke im Flugzeitmassenspektrometer, auch
PSD (post source decay) genannt, liefert Tochter-Ionenspektren,
die denen von stoßinduzierten
Fragmentierungen gleichen. Wenn die Laserstrahlen energiereicher
eingestellt werden, tritt ein Sofortzerfall von Analyt-Ionen noch
vor ihrer Beschleunigung ein, auch ISD (in source decay) genannt.
Dieser Sofortzerfall liefert Fragment-Ionen vom ECD-Typ. Der Mechanismus
wurde lange Zeit als Rekombination vorübergehend doppelt geladener Ionen
im heißen
Plasma durch freie Elektronen, also durch eine Art Elektroneneinfang,
erklärt.
In einer neueren Arbeit dagegen wird plausibel gemacht, dass die
Fragmentierung wohl durch Reaktion einfach geladener Ionen mit Wasserstoff-Radikalen
bewirkt wird, wobei die Wasserstoff-Radikale durch photolytische
Wirkung der UV-Laserstrahlung erzeugt werden sollen („Fragmentation
of Peptides in MALDI In-Source-decay by Hydrogen Radicals", T. Köcher et
al., Anal. Chem. 2005, 77, 172–177).
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Aufgabe der
Erfindung
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Es
ist die Aufgabe der Erfindung, Fragmentierungsverfahren für Analyt-Ionen
und entsprechende Apparate bereitzustellen, wobei die Fragmentierung
bevorzugt von einfach oder doppelt geladenen Ionen ausgehen und
zur Stoßfragmentierung
CID orthogonal sein soll. Die Zu fuhr der Partnerteilchen für die Fragmentierung
soll möglichst
nicht durch elektromagnetische Felder behindert werden können.
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Kurze Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
Erfindung stellt Verfahren und Apparate für die Fragmentierung von Analyt-Ionen
bereit, in denen die Analyt-Ionen durch Reaktionen mit angeregten
oder radikalen Neutralteilchen fragmentiert werden. Dabei kann beispielsweise
einerseits eine Wolke der Analyt-Ionen erzeugt werden, die mit einem Strahl
von angeregten oder radikalen Neutralteilchen beschossen wird. Andererseits
kann eine Ansammlung von angeregten oder radikalen Neutralteilchen bereitgestellt
werden, durch die ein Strahl von Analyt-Ionen gesandt wird.
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Im
Falle der Reaktion mit angeregten Neutralteilchen kann bevorzugt
von doppelt geladenen Analyt-Ionen ausgegangen werden, die durch
Elektrosprühen
von Peptiden vorherrschend erzeugt werden; doch können im
Bedarfsfalle, beispielsweise bei schwereren Proteinen, auch höhere Ladungszustände verwendet
werden. Der Strahl der angeregten Neutralteilchen wird hier vorzugsweise
in einem üblichen
FAB-Generator erzeugt (FAB = fast atom bombardment). Üblicherweise
werden dazu Edelgasatome verwendet, vorzugsweise Heliumatome; jedoch können auch
andere Arten von Atomen oder Molekülen als Neutralteilchen des
Strahls verwendet werden.
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Im
Falle der Verwendung von radikalen Neutralteilchen, vorzugsweise
von Wasserstoff-Radikalen,
kann sogar von einfach geladenen Analyt-Ionen ausgegangen werden,
wie sie beispielsweise durch Ionisierung der Analytmoleküle durch
matrix-unterstützte
Laserdesorption (MALDI) geliefert werden. Ein Strahl von Wasserstoff-Radikalen
kann mit kommerziell erhältlichen
Generatoren erzeugt werden, wie sie beispielsweise zur Reinigung
von Wafern und Chips von Verunreinigungen und Oxiden in der Elektrotechnik
verwendet werden. Wasserstoff in statu nascendi ist außerordentlich
reaktiv. Wasserstoff-Radikale können
sowohl thermisch wie auch in Mikrowellen-Plasmen erzeugt werden.
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Die
Wolke der Analyt-Ionen kann sich dabei durch ein Ionenleitsystem
bewegen, sie kann aber auch ruhend in einer Ionenfalle bereitgestellt
werden. Es kann sich dabei um magnetische oder auch um Hochfrequenz-Quadrupol-Ionenfallen
linearer oder dreidimensionaler Art handeln; der Strahl der angeregten
oder radikalen Neutralteilchen wird dabei durch die jeweils vorherrschenden
elektrischen oder magnetischen Felder nicht gestört. Sowohl bei Verwendung eines
Strahls von Heliumatomen aus einem FAB-Generator wie auch bei Verwendung
von Wasserstoff-Radikalen ähneln
die Fragment-Ionenspektren überraschenderweise
denen, die mit Elektroneneinfang ECD gemessen werden. Die Ausbeute
an Fragment-Ionen ist dabei relativ hoch, sie ist etwa ebenso so
hoch wie die Ausbeute des Elektroneneinfangs ECD (möglicherweise
sogar höher).
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Die
Erfindung umfasst auch Massenspektrometer, die einen Generator für die Erzeugung
von angeregten oder radikalen Neutralteilchen besitzen und eine
Speichermöglichkeit
für die
Analyt-Ionen enthalten, wobei der Strahl an Neutralteilchen zumindest zeitweise
in den Ionenspeicher eingeschossen werden kann. Auch Massenspektrometer
mit einer Kammer für
die angeregten oder radikalen Neutralteilchen und einer Einrichtung
zum Einschuss oder Durchschuss eines Ionenstrahls sollen mit umfasst sein.
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Kurze Beschreibung
der Abbildungen
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1 zeigt
schematisch eine Ionenfalle mit zwei Endkappenelektroden (1, 2)
und einer Ringelektrode (3), durch deren Bohrung (7)
ein Strahl von Neutralteilchen (8) auf die gespeicherte
Wolke (6) von Analyt-Ionen trifft. Der Strahl von Neutralteilchen (8)
wird hier in einem FAB-Generator (9–14) produziert. In
dessen Elektronenstoßkammer
(11) erzeugen Elektronen aus einer Glühkathode (12), geleitet durch
ein Magnetfeld zwischen den Magneten (13) und (14),
zunächst
Ionen für
einen Ionenstrahl, der durch Potentiale zwischen Elektronenstoßkammer (11)
und Linsensystem (10) beschleunigt und durch das Linsensystem
(10) fokussiert wird. Die Ionen werden in der Umladungskammer
(9) durch Ladungsaustausch entladen und bilden dann den
Strahl (8) von Neutralteilchen. Statt des FAB-Generators (9–14)
kann auch ein Generator für
Wasserstoff-Radikale verwendet werden.
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2 zeigt
eine ähnliche
Anordnung, bei der aber der Strahl der Neutralteilchen (8)
axial in die Ionenfalle eingeschossen wird. Der Strahl (8)
passiert dabei die Detektionseinheit des Massenspektrometers, bestehend
aus einer Konversionsdynode (16), die die durch die Öffnung (5)
aus der Ionenfalle massenselektiv ausgeworfenen Ionen in Elektronen umwandelt,
und einem Channeltron-Multiplier (17).
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3 zeigt
ein lineares Ionenfallen-Massenspektrometer, bestehend aus den vier
Polstäben (21–24),
der Einschussblende (25) an der Stirnfläche der Polstäbe, einer
Vertiefung (26) mit einem Schlitz (27) zum massenselektiven
Auswerfen der Ionen. Die Neutralteilchen können axial als Strahl (28)
eingeschossen werden, oder diagonal als Strahl (29) in den
Schlitz zwischen den Polstäben.
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4 zeigt
ein Fragment-Ionenspektrum des Peptids RSarKSarQQFFGLM-NH2 nach
dieser Erfindung, aufgenommen in einer dreidimensionalen Ionenfalle
nach 1 in einem einzigen Scan (hier noch ohne korrekte
Massenkalibrierung und ohne optimierte Fragmentierungsparameter).
Die Fragmentierung wurde durch Heliumatome von vier Kiloelektronenvolt
Energie erzeugt, die für
200 Millisekunden in die Ionenfalle eingestrahlt wurden.
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5 zeigt
zum Vergleich ein ECD-Spektrum des gleichen Peptids in einem ICR-Massenspektrometer,
wobei hier 100 Scans aufgenommen und addiert wurden.
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6 zeigt
ein Fragment-Ionenspektrum des Peptids YGADFLRRIRPK-NH2 nach dieser Erfindung, analog zum Spektrum
des Peptids in 4.
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7 zeigt
zum Vergleich ein ECD-Spektrum des gleichen Peptids in einem ICR-Massenspektrometer,
wobei hier wieder 100 Scans aufgenommen und addiert wurden.
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8 gibt
einen Scan der Fragment-Ionen des Peptids FKDLGEQYFK-NH2 wieder,
erzeugt nach dieser Erfindung in einer Ionenfalle aus dreifach geladenen
Analyt-Ionen unter 200 Millisekunden Beschuss mit Heliumatomen von
vier Kiloelektronenvolt.
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9 zeigt
zum Vergleich ein ECD-Spektrum des gleichen Peptids, ebenfalls aus
dreifach geladenen Analyt-Ionen, gewonnen aus 100 Scans in einem
ICR-Massenspektrometer.
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10 stellt
das Prinzip eines Flugzeitmassenspektrometers mit orthogonalem Ioneneinschuss (OTOF)
dar, das mit einer MALDI-Ionenquelle betrieben wird, in der ein
Laserstrahl (2) aus einem Laser (4) eine Probe
auf einem Probenträger
(1) bestrahlt. Gewünschte Eltern-Ionen
werden in einer Selektionsstufe (7) ausgefiltert, die Fragmentierung
wird durch Neutralteilchen aus dem Wasserstoff-Radikal-Generator
(9) in der Fragmentierungskammer (10) vorgenommen.
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Besonders
günstige
Ausführungsformen
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Eine
besonders günstige
Ausführungsform eines
Verfahrens und einer Apparatur werde an Hand der 1 beschrieben.
Analyt-Ionen werden als Wolke (6) in einer Ionenfalle aus
zwei hyperboloiden Endkappenelektroden (1) und (2)
und einer hyperboloiden Ringelektrode (3) gespeichert.
An der Ringelektrode (3) ist eine Hochfrequenzspannung
von einigen Kilovolt Spannung und einer Frequenz von etwa einem
Megahertz angelegt, das im Inneren ein weitgehend quadrupolares
Hochfrequenzfeld aufspannt. Dieses Hochfrequenzfeld erzeugt zeitintegriert
eine Wirkung auf eingesperrte Ionen, die durch ein Pseudopotential
beschrieben werden kann. Das Pseudopotential hat ein Minimum im
Zentrum der Ionenfalle und steigt in alle Richtungen quadratisch
an. Es bildet also für
die Ionen eine Potentialmulde, in der sie harmonische Oszillationen
um das Zentrum herum oder durch das Zentrum hindurch ausführen können.
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Die
Analyt-Ionen wurden durch die Öffnung (4)
in der Endkappenelektrode (1) in die Ionenfalle eingeschossen.
In der Ionenfalle befindet sich ein Stoßgas (üblicherweise Helium) unter
einem Druck von einigen Hundersteln Pascal, das eine Dämpfung der
Oszillationen der Ionen und damit ihre Speicherung im Zentrum der
Ionenfalle bewirkt. In der Wolke (6) herrscht ein Gleichgewicht
zwischen den Coulombschen Abstoßungskräften zwischen
den Ionen und der rücktreibenden
Kraft des Pseudopotentials.
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Es
können
dann in der Ionenfalle die doppelt geladenen Analyt-Ionen von allen
anderen Ionenarten befreit werden. Diesen Vorgang nennt man „Isolierung" oder „Alleinstellung". Es werden dabei
alle anderen Ionenarten durch resonante Anregung ihrer Schwingungen
aus der Ionenfalle ausgeworfen, so dass nur die doppelt geladenen
Analyt-Ionen in der Ionenfalle verbleiben. In der Regel sind die
doppelt geladenen Analyt-Ionen auch die häufigsten Ionen der Analytsubstanz;
jedenfalls dann, wenn es sich bei dem Analyten um ein Peptid handelt
und wenn die Ionen durch Elektrosprühen erzeugt wurden.
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Die
Wolke der doppelt geladenen Analyt-Ionen wird jetzt mit einem Strahl
(8) von angeregten Neutralteilchen beschossen. Die Neutralteilchen
werden in einem FAB-Generator (9–14) erzeugt. Dazu werden
zunächst
in einer normalen Elektronenstoß-Ionenquelle
(11) mit einer Glühkathode
(12) und zwei Führungsmagneten
(13, 14) Ionen eines geeigneten Elementes erzeugt,
hier Ionen von Helium, das in die Elektronenstoß-Ionenquelle (11)
eingeleitet wird. Die Helium-Ionen werden in üblicher Weise aus der Elektronenstoß-Ionenquelle
(11) extrahiert und durch eine Spannungsdifferenz von einigen
Kilovolt zwischen dem Gehäuse
(11) der Elektronenstoß-Ionenquelle
und dem Linsensystem (10) beschleunigt. Gute Elektronenstoß-Ionenquellen liefern
eine Ionenstromdichte von einigen 1010 Ionen/(s × mm2). Durch das Linsensystem (10)
wird der Ionenstrahl fein fokussiert und durch eine Entladungskammer
(9) geschickt. In dieser Entladungskammer (9)
wird ein Teil der Helium-Ionen mit Hilfe eines geeigneten Reaktionsgases
durch Ladungsaustausch entladen, wobei die entladenen Helium-Ionen allerdings
praktisch keine kinetische Energie verlieren und ungebremst weiterfliegen.
Der Strahl (8) der Neutralteilchen (hier also hoch angeregte
Heliumatome) trifft dann die Wolke (8) der Analyt-Ionen
und kann mit diesen reagieren. Die noch geladenen Helium-Ionen werden
durch elektrische Potentiale daran gehindert, in die Ionenfalle
einzutreten.
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Ergebnisse
sind in den 4, 6 und 8 wiedergegeben,
die Spektren ähneln
sehr stark den ECD-Spektren in 5, 7 und 9,
die in einem ICR-Massenspektrometer aufgenommen wurden. Es ist zu
beachten, dass es sich bei den Spektren nach dieser Erfindung um
Einzelscans handelt, während
im ICR-Massenspektrometer jeweils 100 Einzelscans gemessen und addiert
wurden. Dieses Ergebnis ist überraschend
und konnte nicht erwartet werden.
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Der
Mechanismus der Fragmentierung ist noch unbekannt. Aus langer Erfahrung
wissen wir, dass eine Stoßfragmentierung
CID mit Bildung von b- und y-Ionen stattfindet, wenn die Analyt-Ionen
mit etwa vier Kiloelektronenvolt Energie in ein Stoßgas eingeschossen
werden (auch in Helium als Stoßgas). Im
umgekehrten Fall der 4, 6 und 8 aber,
in denen die neutralen Heliumatome mit vier Kiloelektronenvolt Energie
in die Wolke der Analyt-Ionen eingeschossen wird, wird diese Stoßfragmentierung
CID nicht beobachtet. Stattdessen werden hier, wie auch bei ECD,
Ionen der c- und z-Reihe gebildet. Das deutet auf einen neuen, unbekannten
Prozess hin, über
den hier nur Spekulationen angestellt werden können.
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Es
war vor Beginn der Experimente erwartet worden, dass sich entweder
Stoßfragmentierung oder
aber eine elektronische Wechselwirkung des Analytions mit dem durchfliegenden
hoch angeregten Neutralteilchen einstellen würde, wobei letztere a- und
x-Ionen liefern müsste.
Dieser letztere Fall würde
ebenfalls eine zu CID orthogonale Fragmentierung darstellen. Die überraschenden
Ergebnisse lassen jedoch vermuten, dass es sich um einen Prozess
handelt, bei dem Elektroneneinfang oder Elektronentransfer eine
Rolle spielt. Das starke elektrische Wechselfeld in der Ionenfalle
macht es unwahrscheinlich, dass die schnellen Heliumatome Elektronen
durch Stöße mit dem
Helium-Dämpfungsgas oder
durch Aufprall auf die Wände
der Ionenfalle erzeugen, und dass diese Elektronen für Elektroneneinfang
zur Verfügung
stehen. Diese Elektronen würden
innerhalb von Nanosekunden aus der Ionenfalle ausgeworfen werden.
Es ist daher sehr wahrscheinlich, dass die Heliumatome des Strahls
der Neutralteilchen hoch angeregt sind, so dass eines der beiden
Elektronen außerordentlich
schwach gebunden ist, und dass ein Elektronentransfer bei einem Durchflug
eines Heliumatoms durch ein Analyt-Ion stattfinden kann. Dazu leicht
widersprüchlich
ist es jedoch, dass im Gegensatz zu Elektronentransfer in Reaktionen
mit negativen Ionen hier die Ausbeute bei doppelt geladenen Analyt-Ionen
sehr hoch ist. Der Mechanismus bedarf daher noch weiterer Aufklärung. Es
ist dazu zu bemerken, dass der Vorbeiflug eines Heliumatoms mit
vier Kiloelektronenvolt an einem Analyt-Ion etwa die gleiche Wechselwirkungszeit
bietet wie der Vorbeiflug eines Elektrons mit einem halben Elektronvolt
kinetischer Energie, also einer Energie, die für Elektroneneinfang ECD optimal ist.
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Die
hohe Anregung der Heliumatome könnte durch
den Ladungsaustausch in der Entladungskammer (9) entstehen,
bei der das übertragene
Elektron in einem hohem Anregungszustand verbleibt und die Anregungsenergie
nicht abgestrahlt werden kann. Die hohe Anregung könnte jedoch
auch durch Stöße der schnellen
Heliumatome mit den Heliumatomen des Dämpfungsgases in der Ionenfalle
erzeugt werden, wenn auch dieser Mechanismus weniger wahrscheinlich
ist.
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In 2 ist
eine Anordnung wiedergegeben, die ebenfalls einen Beschuss der Ionenwolke
(6) im Inneren einer Ionenfalle (1, 2, 3)
erlaubt. Sie hat den Vorteil, dass die Bohrung (7) durch
die Ringelektrode (1) vermieden wird. Stattdessen
wird hier ausgenutzt, dass der Zugang des Strahls (8) der Neutralteilchen
zur Ionenwolke (6) auch durch die Austrittsöffnung (5)
erfolgen kann, wobei die Anordnung des Detektors mit Konversionsdynode
(16) und Channeltron-Multiplier (17) einen Durchschuss
dieses Strahls ermöglicht.
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In 3 ist
ein lineares Ionenfallen-Massenspektrometer gezeigt. Hier kann der
Strahl der Neutralteilchen entweder axial (28) in die Ionenfalle oder
diagonal (29) durch einen Schlitz zwischen den Polstäben eingeschossen
werden. Für
stabförmige Ionenleitsysteme,
die im Prinzip der linearen Ionenfalle gleichen, aber in der Regel
als Hexapol- oder Oktopolsysteme mehr Stäbe besitzen, bietet sich ebenfalls
der diagonale Durchschuss der schnellen Neutralteilchen an.
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Der
FAB-Generator hat im Falle der Spektren in den 4, 6 und 8 einen
Strahl schneller Heliumatome mit etwa vier Kiloelektronenvolt Energie
gebildet. Normalerweise arbeiten handelsübliche FAB-Generatoren mit
Beschleunigungsspannungen zwischen vier und acht Kilovolt. Es ist
jedoch auch möglich,
sie im Bereich von etwa einem bis zu 20 Kilovolt arbeiten zu lassen.
Es können
in den FAB-Generatoren aber auch andere Sorten von Neutralteilchenstrahlen
außer
Strahlen aus Heliumatomen erzeugt werden, beispielsweise alle Arten
von Edelgasatomstrahlen. Weiterhin lassen sich auch Alkali- oder
Halogenatomstrahlen herstellen. Es müssen aber nicht unbedingt Atomstrahlen
sein: es können
auch Molekülstrahlen
hergestellt werden, beispielsweise von den zweimolekularen Gasen
Sauerstoff oder Stickstoff.
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Das
Massenspektrum aus 8 wurde aus dreifach protonierten
Ionen (M + 3H)3+ erzeugt. Dabei entstehen
durch einfachen Elektronentransfer, aber ohne Abspaltung eines Wasserstoffatoms,
auch doppelt geladene Radikal-Kationen (M + 3H)2+ in
erheblicher Menge. Diese können,
wie man aus ETD-Experimenten weiß, durch eine zarte Anregung
mit einer resonant eingestrahlten dipolaren Anregungswechselspannung
zwischen den beiden Endkappenelektroden durch sachte Stoßfragmentierung
weiter zu Fragment-Ionen gespalten werden, die den durch ECD gebildeten
Fragment-Ionen gleichen, also der c- und z-Reihe angehören. Dadurch
wird die Ausbeute an Fragment-Ionen nochmals gesteigert. Diese Möglichkeit,
die hier wegen der Herstellung einer Vergleichbarkeit mit entsprechenden
ECD-Spektren in einem ICR-Massenspektrometer nicht angewandt wurde,
besteht in einem ICR-Massenspektrometer nicht und stellt einen weiteren
Vorteil dieses Verfahrens in Hochfrequenz-Ionenfallen dar. Allerdings
entstehen diese Radikal-Kationen im ICR-Massenspektrometer sehr
viel weniger.
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In
den 1 oder 2 kann der FAB-Generator (9–14)
aber auch durch einen Generator für einen Strahl von Wasserstoff-Radikalen
(Wasserstoff in statu nascendi) ersetzt werden. Es ist nach den oben
zitierten Untersuchungen über
die Spontan-Fragmentierung der Analyt-Ionen in MALDI-Ionenquellen zu erwarten
(wenn es bis heute auch noch nicht sicher erwiesen ist), dass durch
die Wasserstoff-Radikale ebenfalls Analyt-Ionen gespalten werden.
Aus den genannten Untersuchungen der Vorgänge in ISD (in source decomposition)
ist zu schließen,
dass dabei nicht nur doppelt oder mehrfach geladene Analyt-Ionen,
sondern auch einfach geladene Analyt-Ionen gespalten werden. Wie
es in ISD der Fall ist, werden aller Wahrscheinlichkeit nach auch
hier c- und z-Fragmente gebildet. Trifft dieses zu, so werden damit
auch MALDI-Ionen einer ECD-ähnlichen
Fragmentierung zugänglich.
MALDI liefert bis heute praktisch nur einfach geladene Ionen, die
selbst durch Stöße nur schwierig
und nicht zu vollständigen
Fragmentreihen zu fragmentieren sind. Die einzige zufriedenstellend
informationsreiche Art der Fragmentierung von MALDI-Ionen ist der
metastabile Zerfall in der Flugstrecke von Flugzeitmassenspektrometern.
Eine erfolgreiche Fragmentierung von MALDI-Ionen mit langen Fragmentreihen
(welcher Fragmentierungsart auch immer) wäre von außerordentlich hohem Wert.
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Wasserstoff-Radikale
(H) lassen sich aus Wasserstoff (H2) durch
thermische Dissoziation herstellen, aber auch durch ein Mikrowellenplasma.
Generatoren für
die Bildung von Strahlen aus Wasserstoff-Radikalen sind kommerziell
erhältlich.
Sie werden in der Fabrikation elektronischer Bauelemente zur Reinigung
von Wafern und Chipoberflächen
verwendet, wobei sie Verunreinigungen zersetzen und Oxide reduzieren.
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Das
hier geschilderte Verfahren zur Fragmentierung mit Strahlen von
hoch angeregten oder radikalen Neutralteilchen kann für alle Peptide
eines Gemischs, beispielsweise eines Gemischs der Verdaupeptide
eines Proteins, wiederholt und auch mit den Ergebnissen aus der
Stoßfragmentierung
CID verglichen werden. Es ergibt sich so eine sehr sichere Identifizierung
des Proteins. Die Fragmentierungen sind sanft; sie spalten keine
Modifikationsgruppen ab. Es können
sogar Unterschiede des untersuchten Proteins zu solchen aus Proteinsequenzdatenbanken
sicher festgestellt werden. Die Unterschiede können mutativer Art oder Modifizierungen des
ursprünglich
in einer Zelle an Hand eines DNA-Codes hergestellten Proteins sein.
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Die
durch die Erfindung ermöglichte
Fragmentierung durch angeregte oder radikale Neutralteilchen hat
einen weiteren Vorteil, der nicht auf den ersten Blick ersichtlich
ist: Durch die Fragmentierung bei niedriger Hochfrequenzspannung
können alle
Tochter-Ionen bis zu kleinen Massen herunter gespeichert werden,
weil die Schwellenmasse jetzt sehr niedrig liegt. Eine Ionenfalle
kann nur Ionen über der
Schwellenmasse speichern, die Schwellenmasse ist der Hochfrequenzspannung
proportional. Die Speicherung kleiner Tochter-Ionen war bisher nicht möglich, da
für Stoßfragmentierung
CID mit einer Mindesthochfrequenzspannung gearbeitet werden musste,
weil sonst die Stoßenergie
zu klein wurde und eine Fragmentierung oft nicht möglich war.
Erst durch sehr kleine Hochfrequenzspannungen kann das ganze Aminosäuren-Fragmentspektrum
der c-Brüche
ab der ersten Aminosäure
aufgenommen werden. Beispiel: Ein großes, doppelt geladenes Peptid
mit 20 Aminosäuren
hat ein Molekulargewicht von etwa 2400 atomaren Masseneinheiten
und eine spezifische Masse von m/z = 1200 Masseneinheiten pro Elementarladung.
Normalerweise können
Tochter-Ionen durch Stoßfragmentierung
nur etwa ab einer Schwellenmasse von 400 Masseneinheiten pro Elementarladung
(entspricht etwa drei bis vier Aminosäuren) gespeichert werden, jetzt
ist aber durch Wahl einer sehr kleinen Hochfrequenzspannung eine Speicherung
ab 80 Masseneinheiten pro Elementarladung möglich, so dass auch die kleinste,
endständige
Aminosäure
noch erfasst werden kann.
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Die
Erfindung lässt
sich aber nicht nur in Ionenfallenrriassenspektrometern ausnutzen;
sie kann vielmehr für
fast alle Arten von Massenspektrometern verwendet werden. Eine besonders
interessante Art von Massenspektrometer für diesen Zweck ist das Flugzeitmassenspektrometer
mit orthogonalem Ioneneinschuss (OTOF), wie es als Prinzip in 10 dargestellt
ist.
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Wie
in 10 schematisch dargestellt, kann dieses Spektrometer
(wie viele andere Spektrometer auch) nicht nur mit einer Elektrosprüh-Ionenquelle
verwendet werden, sondern auch mit einer MALDI-Ionenquelle. Die
auf dem Probenträger
(1) aufgebrachten Proben werden dabei mit gepulsten Lichtstrahlen
(2) über
einen Spiegel (3) aus einem Pulslaser (4) bestrahlt.
Die im Desorptionsplasma entstehenden Analyt-Ionen werden durch
einen Ionentrichter (5) aufgefangen und durch einen Blendenstapel
(6) einem Quadrupol-Filter (7) zur Filterung der
ausgewählten
Sorte von Eltern-Ionen zugeführt.
Die so selektierten Eltern-Ionen werden durch einen weiteren Blendenstapel
(8) in die Fragmentierungskammer (10) eingebracht,
wo sie aus einem Generator (9) für die Herstellung von Wasserstoff-Radikalen
mit diesen Radikalen bestrahlt und so zu Fragmentierungs-Reaktionen
gebracht werden. Die Fragment-Ionen können durch einen weiteren Blendenstapel
(11) in den Pulser (12) des Flugzeitmassenspektrometers
eingefädelt
werden. Im Pulser werden Abschnitte diesen eingefädelten Ionenstroms vertikal
abgelenkt und über
einen Reflektor (13) dem Ionendetektor (14) zugeführt. Das
Massenspektrometer wird mit den Pumpen (15), (16)
und (17) auf die erforderlichen Restdrucke evakuiert.
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Ein
solches Flugzeitmassenspektrometer hat besondere Vorteile, die in
hoher Massenauflösung
und hoher Massengenauigkeit, in hohem dynamischen Messbereich und
in einer stabilen Massenskalierung bestehen. Es eignet sich daher
in besonderem Maße
für die
erfindungsgemäßen neuen
Fragmentierungsarten.
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Weitere
Vorteile der erfindungsgemäßen Fragmentierungsarten
werden durch weitere Aufklärung
der beteiligten Prozesse sichtbar werden. So erscheint es durchaus
möglich,
mit anderen Energien der Neutralteilchen oder anderen Arten von
Neutralteilchen zu weiteren orthogonalen Fragmentierungsprozessen
zu gelangen, beispielsweise solche, die wie oben geschildert zu
a- und x-Brüchen
führen. Diese
und andere Fragmentierungsmechanismen sollen vom Erfindungsgedanken
mit umfasst sein.