DE102005024836A1

DE102005024836A1 - Arzneimittel zur Vorbeugung und Bekämpfung von Knochenmetastasen

Info

Publication number: DE102005024836A1
Application number: DE102005024836A
Authority: DE
Inventors: Jochen Dr.med. Ralf; Franz Paul Dr. Armbruster
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2005-05-31
Filing date: 2005-05-31
Publication date: 2006-12-07

Abstract

Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung und Prophylaxe von Knochentumoren und Metastasen, die bevorzugt in Knochengeweben ansiedeln, enthaltend als Wirkstoff abgetötete oder schwach pathogene Mikroorganismen, die das Gen für Bonesialoprotein enthalten und zur Expression von ein oder mehrere Bonesialoprotein-Molekülen führen, welche sich in mindestens einem Strukturmerkmal von endogenem Human-Bonesialoprotein normaler Osteoblasten unterscheiden, so dass bei Applikation eine Immunreaktion gegen das veränderte Bonesialoprotein erzeugt wird.

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft Arzneimittel zur Vorbeugung und Behandlung von Knochenmetastasen auf der Basis von Antikörpern gegen nicht-zelluläre Knochenmatrixproteinen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Knochentumore treten besonders häufig als Folge einer primären Krebserkrankung auf. Trotz aller medizinischen Fortschritte gelten Knochentumore als nicht heilbar, da sie gestreut auftreten und operativ kaum behandelt werden können. Die Wahrscheinlichkeit der Ausbildung von Knochenmetastasen liegt beim Multiplen Myelom bei größer 96%, beim Mamma- und Prostatakarzinom zwischen 65 und 75%, und bei Karzinomen der Lunge, Niere, Cervix, Blase zwischen 30 und 50%. Auch die systemische Behandlung zeigt bislang nicht den gewünschten Erfolg. Erste Erfolge mit konnten hingegen mit therapeutischen Antikörpern erzielt werden. Weitere therapeutische Antikörper, die durch einen Angriff an Wachstumsfaktoren die Zellproliferation beziehungsweise die Metastasenbildung verhindern sollen, befinden sich in der klinischen Prüfung. Bei therapeutischen Antikörpern besteht jedoch das Problem, dass sie in der Regel gerichtet sind gegen Angriffsziele auf der Oberfläche der Tumorzellen, die nur bei sich teilenden Tumorzellen bestehen. Im Blutkreislauf zirkulierende nicht-proliferierende Tumorzellen und schlummernde Metastasen werden nicht erkannt.

Zwischen dem Auftreten von Knochenmatrixproteinen wie Osteopontin (OPN), Osteonectin (ON) und Bone-Sialoprotein II (BSP) im Primärtumor und späteren Tochtergeschwülsten im Knochen besteht ein enger Zusammenhang. Die Zellen eines osteotroph metastasierenden Primärtumors exprimieren nahezu stets signifikante Mengen BSP oder OPN (Diel IJ et al, Clinic Cancer Res, 1999, 5:3914; Tuck AB et al, J Mammary Gland Biol Neoplasia, 2001, 6:419; Rudland PS et al, Cancer Res 2002, 62:3417; Agrawal D et al, J Natl Cancer Inst, 2002, 94:513; Waltregny D et al, J Bone Miner Res, 2000, 15(5):834; Bellahcéne A et al, J Bone Miner Res, 1996, 11:665; Waltregny D et al, J Nat Cancer Inst, 1998, 90:1000; Bellahcène A et al, Int J Cancer, 1996, 69:350; WO 02 100901 (Immundiagnostik AG), WO 02 25285 A (Smith et al)).

BSP ist ein phosphoryliertes Glycoprotein mit einer relativen Masse von ca. 80 kDa in der SDS-PAGE. Die cDNA für BSP kodiert für eine Peptidsequenz von ca. 33 kDa (Fisher LW et al, J Biol Chem, 1990, 265:2347; US 5 340 934 (Termine)). Es stellt ca. 10 bis 15 % der nicht-kollagenen Proteine in der Knochenmatrix und wird in der Regel von Zellen exprimiert, die an der Bildung von Dentin, Knochen und Knorpel beteiligt sind, beispielsweise von Osteoblasten, sich entwickelnden Osteozyten, hypertrophen Chondrozyten, Odontoblasten und Zementoblasten. Das BSP soll als Adhäsionsmolekül die Anheftung und Ausbreitung von Osteoblasten und Osteoklasten auf der Knochengewebsmatrix bewirken. Das Ausschalten des BSP-Gens in Knock-out-Mäusen führte aber zu keiner erkennbaren Störung der Skelettbildung und -funktion. In Tumoren wird BSP eine Beteiligung an der Mikrokalzifikation und der Besiedlung von Knochen durch Tumorzellen zugeschrieben (Castronovo V et al, Int J Oncol, 1998, 12:308, Bellahcène A et al, Int. J. Cancer, 1996, 69:350).

Freies BSP wird in Körperflüssigkeiten vom Komplementfaktor H mit hoher Affinität gebunden. So wurden Antikörper hergestellt gegen Peptidteilstrukturen des BSP, rekombinantes BSP und aus Knochen isoliertes BSP, die alle nicht BSP in Serum erkennen und binden (Fisher LW et al, Acta Orthop Scand Suppl. 1995, 266:61; Stubbs JT (III) et al, J Bone Miner Res, 1997, 12(8):1210). Das 150 kDa große Faktor-H-Molekül umschließt vermutlich das kleinere BSP-Molekül so, dass Antikörper nicht binden können. Die Trophoblasten und BSP-produzierenden Tumorzellen werden hierdurch dann vor einem Angriff des Immunsystems geschützt (Fedarko N.S. et al., J. Biol. Chem, 2000, 275, 16666-16672; WO 00 062065). Ferner kann BSP mittels der RGD-Sequenz (Arginin-Glycin-Aspartat) an alpha(v)beta(3) Integrin-Rezeptoren auf der Zellwand binden. Das BSP ist daher vermutlich auch beteiligt an der Adhäsion, Ausbreitung und Orientierung der Endothelzellen und die Angiogenese um einen Tumor (Bellahcène A et al, Circ Res. 2000, 86(8):885-91). Diese Eigenschaften machen das BSP in der Familie der nicht-kollagenen Integrinrezeptor-bindenden Glycoproteine der Knochenmatrix neben OPN und ON zu einem Ausgangspunkt für Medikamente aller Art ( US 5 780 526 ; US 5 767 071 ; US 5 792 745 ; US 5 939 383 ; US 5 773 412 ; US 5 849 865 ).

So gibt es Versuche, die Bindung von BSP an die Vitronectin- bzw. Integrin-Rezeptoren der Tumor- und Epithelzellen durch RGD-Antagonisten zu hemmen ( US 6 069 158 ; US 6 008 213 ; US 5 849 865 ; van der Pluijm et al., Cancer Res., 1996, 56, 1948–1955). EP 1 084 719 (DePuy Orthopeadics Inc.) lehrt BSP als Wirkstoff zur Unterstützung der Reparatur von geschädigten Knochen- und Bindegewebe, WO 94 13310 (ALFA-LAVAL AGRICULTURE INTERN. AB) ein BSP-bindendes Protein aus Staphylococcus aureaus zur Behandlung von Infektionen und entzündlichen Erkrankungen des Knochens, WO 02 100899 (ARMBRUSTER BIOTECHNOLOGY GMBH) einen Wirkstoff gegen Knochenmetastasen auf der Basis von Antikörpern gegen BSP. WO 00 36919 (UNIV VIRGINIA PATENT FOUND) beschreibt regulatorische Elemente zur Kontrolle und Unterdrückung der BSP-Expression in Tumor- und Bindegewebszellen und EP 0 020 789 (DKFZ) eine Hemmung der Zellmigration und Knochenmetastasenbildung durch Antisense-Oligonucleotide gegen die nicht-kollagene Knochenmatrixprotein, siehe hierzu ferner Adwan-Hassan et al in Cancer Gene Therapy, 2003:1; Intern J Oncol, 2004, 24:1235-1244; Proc Am Assoc Cancer Res Ann, 2003, 44:56).

Es wird also intensiv untersucht, was den Primärtumor, der in der Regel chirurgisch behandelt werden kann, zur Metastasenbildung veranlasst, wie Knochenmetastasen vorgebeugt werden kann und womit sich diese behandeln und gegebenenfalls heilen lassen. Problematisch an den bisherigen therapeutischen Ansätzen ist, dass, eine Therapie mit geeigneten Antisense-Oligonucleotiden oder Antikörpern, sofern möglich, nur über eine begrenzte Zeit wirksam aufrecht erhalten werden kann. Es besteht nicht nur ein Dosis- und Applikationsproblem, sondern es werden auch regelmäßig Autoantikörper gegen die verabreichten Immunglobuline und regulatorischen Nucleotide entwickelt. Demgegenüber muss eine Prophylaxe oder die direkte Behandlung von Knochenmetastasen über sehr lange Zeiträume erfolgen, soll sie Aussicht auf Erfolg haben. Die Gefahr des Auftretens von Knochenmetastasen nach einem behandelten osteotrophen Primärtumor besteht über Jahrzehnte, und es besteht somit Bedarf an einer therapeutischen Zusammensetzung, die über lange Zeiträume die Ansiedelung und Bildung von Knochentumoren unterbindet und die ferner eine nachhaltige Therapie von Knochenmetastasen erlaubt.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Diese Aufgabe wird gelöst durch eine therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind in den Unteransprüchen beschrieben.

EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die osteotrophen Tumore der Prostata, Mamma, Lunge, Niere und Schilddrüse, unterscheiden sich von weniger malignen Tumoren in der Regel dadurch, dass sie BSP-exprimierende Tumorzellen enthalten, die dann in das Knochengewebe wandern und dort Metastasen bilden können. Wenngleich die Vorgänge die Vorgänge bis zur Ansiedelung in Knochen außerordentlich komplex und letztlich unverstanden sind, so erlaubt das Auftreten von tumorgenen BSP im Serum eine sichere Prognose von Knochenmetastasen und das Vorkommen von tumorgenen BSP in der Knochenmatrix ist ein Maß für den Knochenumbau durch Knochenmetastasen. Es wurde ferner gefunden, dass die posttranslationalen Modifikationen von BSP aus Tumorzellen gegenüber natürlichem endogenem BSP normaler Osteoblasten verändert ist. So konnte zum Beispiel in Huhn IgY-Antikörper hergestellt werden konnten, die spezifisch das von Zellen osteotropher Tumore sezernierte BSP (fortan daher Tumor-BSP) erkennen. Diese Antikörper erwiesen sich im Tiermodell als wirksam (WO 02 100899). Die erfindungsgemäße therapeutische Zusammensetzung zur Therapie und Prophylaxe von Knochentumoren beruht auf der Erzeugung von eigenen Tumor-BSP-spezifischen Antikörpern, welche so mit dem Andockmechanismus streuender, osteotropher und damit Tumor-BSP-exprimierender Zellen aus dem Primärtumor interferieren. Da BSP vom Faktor-H des Komplementsystems gebunden und maskiert wird, können die BSP-exprimierenden Tochterzellen des Primärtumors vermutlich so einem Angiff des Immunsystems und der Nekrose durch das Komplementsystem entgehen. Auch die Wiederherbeiführung der Apoptose bei diesen osteotrophen Tumorzellen ist von großer Bedeutung. Normalerweise sorgt der Tod von als autoreaktiv erkannten Lymphozyten im Thymus dafür, dass sich die Immunabwehr nicht gegen „körpereigene Antigene" wie das BSP bzw. das Tumor-BSP richtet. Durch die erfindungsgemäße therapeutische Zusammensetzung wird diese fehlgeleitete Selbstschutz umgangen. Die zellvermittelte Zytotoxizität kann dann bei den Zielzellen einen nekrotischen oder auch einen apoptotischen Tod induzieren.

Anders als herkömmlich werden aber keine Tumor-BSP-spezifischen Antikörper verabreicht, wie zum Beispiel in der WO 02 100899 beschrieben, sondern im Patienten durch eine Mischung aus Xeno- und Idio-Immunisierung Antikörper und eine zellvermittelte Immunität gegen Tumor-BSP und Tumor-BSP-exprimierende Zellen erzeugt. Weiter kann die therapeutische Zusammensetzung durch bekannte Zusatz- und Wirkstoffe verstärkt werden, beispielsweise durch Antikörper, insbesondere Anti-Tumor-BSP-Antikörper, Liganden, insbesondere RGD-bindende Liganden, Inhibitoren, die mit Adhäsionsmolekülen, membran-assoziierten Proteasen oder Rezeptoren, die Chemotaxis vermitteln wie beispielsweise Chemokinrezeptoren, interagieren, sowie Apoptose-induzierende Substanzen wie vorzugsweise Antikörper oder Proteine/Peptide, die aus natürlichen oder künstlichen Peptidlibraries gewonnen werden können.

Besonders bevorzugt ist eine therapeutische Zusammensetzung zur Induktion einer zielgerichteten somatischen Transgenität in Zellen des Patienten. Diese therapeutische Zusammensetzung kann beispielsweise abgetötete oder schwach pathogene Mikroorganismen enthalten, welche eine BSP-kodierende DNA-Sequenz oder ein Fragment hiervon in einem episomalen Vektor integriert enthalten. Bei der mit der dieser therapeutischen Zusammensetzung erzeugten Immunisierung des Patienten, die somit einem Impfstoff bzw. einem Lebendimpfstoff entspricht, wird dann die BSP-kodierende Fremd-DNA in entsprechende Tumor-BSP-Proteine bzw. Tumor-BSP-Peptide translatiert und exprimiert, so dass der Patient Antikörper gegen die fremden Tumor-BSP-Proteine und -Peptide entwickelt. Die eigene Immunität gegen Tumor-BSP schützt gegen ein Andocken von metastasierenden osteoptrophen Zellen des Primärtumors im Knochengewebe und verhilft zu einer zellvermittelten Zytotoxizität gegen Tumor-BSP-produzierende Zellen. Beide Mechanismen entfalten eine prophylaktische und therapeutische Wirkung gegen Knochenmetastasen.

Bevorzugt ist weiterhin eine therapeutische Zusammensetzung zur Induktion einer zielgerichteten somatischen Transgenität in Zellen des Patienten, wobei die abgetöteten oder schwach pathogenen Mikroorganismen zu einer Expression von Tumor-BSP in einer Form führen, dass das Tumor-BSP an der Plasmamembran gebunden ist. Die Plasmamembran kann hier die Plasmamembran des Mikroorganismus sein oder die Plasmamembran der Wirtszellen des Patienten, in denen zielgerichtet die genetische Information des Tumor-BSP eingeführt wurde.

Weiterhin bietet es sich, die eingeführte DNA des BSP vorab so modifizieren, dass bei einer Expression des BSP Tumor-BSP ähnliche Moleküle erhalten werden. Die möglichen Stellen für eine Modifikation des BSP liegen insbesondere an den Positionen der DNA, die für Aminosäuren kodieren, welche posttranslational N- bzw. O-glykosyliert werden. Durch eine gerichtete Punktmutationen können so posttranslationale Modifikationen des hBSP entfernt werden. Tumor-BSP unterscheidet sich nämlich von endogenem BSP vor allem durch ein veränderte oder unvollständige posttranslationale Glykosylierung.

Die Aminosäuresequenz von humanem BSP enthält vier potentielle N-Glykosylierungsstellen an den Positionen 88 (NTT), 161 (NGT), 166 (NST) und 174 (NGS). Für O-Glykosylierungen ist keine vergleichbare Konsensussequenz bekannt. Alle identifizierten N-Glykan-Sturkutren sind sowohl auf dem aus Knochen isolierten BSP als auch auf tumorgenen BSP zu finden. Die Unterschiede liegen jedoch im prozentualen Anteil der jeweiligen Strukturen an den gesamten N-Glykanen. So bestand der Hauptanteil der BSP-N-Glykane im Knochen aus triantennären Strukturen (58%) und z.B. in der „entarteten" EBNA-Zelllinie aus tetraantennären Strukturen (48%). Ferner sind auf dem humanen BSP-Moleküle mindestens acht O-Glykosylierungsstellen vorhanden, 5 auf dem Peptid 211–229 (TTTSP ... QVYR) und maximal drei auf dem Peptid zwischen AS 120 und AS 135 mit der Sequenz TGLAA. Hiervon sind im rekombinanten BSP, exprimiert in EBNA-Zellen, die Threonine in der Sequenz DATPGTG O-glykosyliert. Bei Knochen-BSP erfolgt eine dritte O-Glykosylierung. Bei rekombinantem BSP ist keine dritte Glykosylierungsstelle vorhanden. Vermutlich liegt diese Glykosylierungsstelle auf der TGLAA-BSP-Teilstruktur.

Wegen der vorteilhaften Ergebnisse mit Antikörpern gegen bestimmte Teilstrukturen des hBSP bietet es sich an, diese DNA-Sequenzen – optional gekoppelt mit einer DNA für ein Carrierpeptid oder einen Membrananker, zum Beispiel poly-His – als Fremd-DNA in den Mikroorganismus einzuführen und zur Expression zu bringen, entweder im Mikroorganismus selbst oder in somatischen transgenen Wirtszellen des Patienten. Die exprimierten BSP-Fragmente werden als fremd erkannt, insbesondere wenn sie sich auf der Membran eines Mikroorganismus befinden oder von Wirtszellen auf der Zelloberfläche exprimiert werden. Die so induzierten körpereigenen Antikörper binden an das hBSP, welches von osteotrophen Tumorzellen produziert wird. Bevorzugte DNAs zur Herstellung spezifischer Tumor-BSP-Antikörper kodieren folgende Peptidsequenzen:

SEQ ID NR: 1

X-YTGLAAIQLPKKAGD-Z

SEQ ID NR 2:

Das markierte Threonin ist in Tumor-BSP nicht oder unvollständig oder in anderer Form glykosyliert. Es liegt nahe, dieses Threonin in eine nicht glykosylierbare Aminosäure zu überführen. X und Z stehen für Aminosäure- bzw. Peptidrest, z.B. für einen Membrananker mit Poly(His). In SEQ ID Nr. 2 können folgende Variationen vorliegen: an Position 179 Gly → Val; Position 252 Val → Ala; Position 254 Glu → Asp; Position 279 Asp → Gly.

In einer Ausführungsform der Erfindung führt die therapeutische Zusammensetzung zur Bildung von einem körpereigenen Antikörper oder eine Mehrzahl körpereigene Antikörper gegen das humane Bonesialoprotein (hBSP), wobei die Antikörper Epitope binden, die auf humanem Bonesialoprotein aus Tumorzellen vorhanden sind, dessen posttranslationale Glykosylierung im Bereich der Aminosäuren 120 bis 135 (SWISSPROT: SIAL_HUMAN, Acc.No. P21815, inkl. Signalsequenz), beinhaltend die Aminosäuren TGLAA, gegenüber normalem Bonesialoprotein aus Knochen verändert oder unvollständig ist. Bevorzugt sind als körpereigene Antikörper besonders solche, die ein hBSP-Epitop erkennen, welches die Aminosäuresequenz TGLAA oder YTGLAA und optional Zuckergruppen sowie ein Trägermolekül umfasst.

Die erfindungsgemäße therapeutischen Zusammensetzung entspricht somit einem Impfstoff bzw. einem Lebendimpfstoff, bei dem BSP-kodierende Fremd-DNA in entsprechende Tumor-BSP-Proteine bzw. Tumor-BSP-Peptide translatiert wird, so dass der Patient körpereigene Antikörper gegen die fremden Tumor-BSP-Proteine entwickelt. Die eigene Immunität gegen Tumor-BSP schützt somit vor einem Andocken von metastasierenden osteoptrophen Tumorzellen im Knochengewebe und verhilft zu einer zellvermittelten Zytotoxizität gegen Tumor-BSP-produzierende Zellen. Beide Mechanismen entfalten prophylaktische und therapeutische Wirkung gegen Knochenmetastasen, da auch fremde Antikörper gegen Tumor-BSP prophylaktische und therapeutische Wirkung besitzen.

Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung ist dem Anwendungsgebiet nach somit besonders geeignet zur Behandlung von Tumoren aus der Gruppe mit Prostata-, Mamma-, Lungen-, Nieren- und Schilddrüsentumoren, Tumorerkrankungen des Blutsystems, des Lymphsystems, des Herz-Kreislauf-Systems, des Nervensystems, des Respirationstraktes, des Verdauungstraktes, des endokrinen Systems, der Haut einschließlich Anhangsgebilde, des Bewegungsapparates und des Urogenitaltraktes.

Beispiel 1 Herstellung eines Expressionsvektors und Mikroorganismen für die Immunisierung
Aus dem Plasmid B6-5g (Fisher L.W. et al., Human bone sialoprotein. Deduced protein sequence and chromosomal localisation, in J. Biol. Chem., 1990, 265 4, 2347-51) wurde die cDNA für humanes BSP (SEQ ID Nr 2) mittels PCR amplifiziert, mit einem Polyhistidine-Transmembrananker (His₆-Tag) gekoppelt, in die Polyklonierungstelle des episomalen pSOG-Shuttlevektors kloniert und in E.coli transformiert und repliziert (Machner et al., J. Biol. Chem., 2001, 276(43), 40096). Die Einhaltung des korrekten Leserahmens wurde mittels Sequenzierung und durch Expression des Fusionspeptids überprüft. Das Fusionspeptid wurde von Anti-hBSP-Antikörpern und insbesondere von dem bereits therapeutisch eingesetzten IgY-Antikörper erkannt. Der pSOG-Shuttlevektor wurde in abgeschwächt pathogenen Gram-positiven Listeria-Bakterien transformiert und Impfbakterien mit pSOG-hBSP(2) generiert. Erste Tierversuche zeigen, dass auf diesem Weg eine Immunisierung gegen hBSP und insbesondere Tumor-BSP erhalten werden können.
Bei L.monocytogenes ist nämlich der Weg in die Zelle von Mensch und Tier gut definiert. Für die volle Pathogenität der Listerien sind verschiedene Faktoren nötig wie PrfA (positive regulator of virulence), ActA (actin nucleating protein), PlcA (phosphatidylinositol-specific phospholipase), PlcB (phosphatidyl-choline-specific phospholipase), Hly (listeriolysin), Mpl (metalloprotease), die für eine Abschwächung der Pathogenität gezielt ausgeschaltet werden können. Die Spezifität von Pathogen und Wirtszelle wird unter anderem vermittelt durch die Internaline inlA und inlB. L.monocytogenes kann Endothelzellen, Epithelzellen, Fibroblasten und Hepatozyten infizieren, ferner neutrophile Granulocyten, Makrophagen, Lymphozyten und andere Zellen des weißen Blutbildes. Nach der Adhäsion an der Zelloberfläche wird L.monocytogenes durch Endozytose in die Zellen eingeschleust. Dann zerstört der Keim mithilfe von Listeriolysin (Hly) die Endosomenmembran, setzt sich im Zytosol der Wirtszelle frei, vermehrt sich dort unter der Produktion des klonierten hBSP und weiterer Proteine und befällt schließlich Nachbarzellen. In diesem Prozess wird unter anderem das transgene hBSP-Peptid sezerniert bzw. mit den Listeria-Bakterien freigesetzt, wo es Ziel der körpereigenen Immunreaktion ist.
Beispiel 2 BSP-Peptidteilstrukturen für die Immunsierung
Die Epitope von therapeutische aktiven anti-BSP-IgG und -IgY wurden kartiert. Sie enthalten Antigene bzw. Haptene für eine mögliche aktive Immunisierung mit gegen die Wirkungen von tumorgenen BSP und Tumor-BSP exprimierenden Tumorzellen.
Tabelle 1 Epitopmapping von therapeutisch aktiven anti-BSP-IgG und -IgY
Die Ergebnisse zeigen, dass die bekannten Hühnerantikörper bevorzugt an die C-terminale Sequenz des BSP binden, während die Kaninchenantikörper über einen größeren Bereich binden.

Besonders therapeutisch nutzbare Peptidteilstruktur des hBSP sind:

TyrThrGlyLeuAlaAlaIleGlnLeuProLysLysAlaGlyAsp	(Position 124–138)
ThrGlyLeuAlaAla	(Position 125–130)
TyrThrGlyLeuAlaAla	(Position 124 bis 130)
TyrGluSerGluAsnGlyGluProArgGlyAspAsnTyrArgAlaTyrGluAsp	(Position 278–295)
LeuLysArgPheProValGlnGlyGly	(N-terminus)

Um eine Selektion für die Peptide bzw. die damit generierbaren Antikörper zu erhalten, die mit BSP im Komplex mit Faktor H reagieren, wurde Faktor H oder aus Knochen isoliertes oder gentechnisch hergestelltes BSP an Cyanogenbromid aktivierte Sepharose 4 B chemisch kovalent gebunden und danach soviel BSP bzw. Faktor H auf die Säule aufgetragen und gebunden, dass sämtliche Liganden in der Matrix mit dem Partner komplexiert waren. Dann wird eine IgG-Fraktion aus Serum von immunisierten Tieren auf diese Affinitätssäule aufgetragen und die Antikörperfraktion gewonnen, die spezifisch an das freie Epitop im BSP-Faktor-H Komplex bindet.
Die Erfindung stellt somit eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit zur Erzeugung von Antikörpern gegen das humane Bonesialoprotein (hBSP), welche spezifisch Epitope auf hBSP von Tumorzellen binden. Tumor-hBSP enthält keine posttranslationale O-Glykosylierung im Bereich der Aminosäuren 120 bis 135 (SWISSPROT: SIAL_HUMAN, Acc.No. P21815, ohne Signalsequenz), beinhaltend die Aminosäuren TGLAA. Anders das normale hBSP aus Knochen. Die pharmazeutische Zusammensetzung wird insbesondere optimiert auf hBSP-Fragment, die Antikörper erzeugen, welche tumorgenes Serum-hBSP im Komplex mit dem Komplementfaktor-H erkennen.
Die Erfindung umfasst weiterhin Mikroorganismen beschränkt, die cDNA für Osteopontin (OPN), Osteonectin (ON) und Bone-Sialoprotein II (BSP) kloniert enthalten, bevorzugt in einem Vektorsystem und einen Wirt für die Induktion einer zielgerichteten somatischen Transgenität in einem animalen Wirt, insbesondere auch in einem menschlichen Patienten, wie z.B. in der WO 99 29884 beschrieben. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung erstreckt sich insbesondere auf körpereigene Knochenproteine, die von Zellen osteotropher Tumor selbst produziert werden und für dessen Aussiedelung im Knochen benötigt werden bzw. erforderlich sind. Es wird ausgenutzt, dass proliferierende Tumorzellen diese ursprünglich stark glykosylierten Proteine nicht mehr richtig posttranslational modifizieren, so dass körpereigene Antikörper gegen die eigentlichen körpereigenen Proteine hergestellt werden können.

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung und Prophylaxe von Knochentumoren und Metastasen, die bevorzugt in Knochengeweben ansiedeln, enthaltend als Wirkstoff abgetötete oder schwach pathogene Mikroorganismen, die das Gen für Bonesialoprotein enthalten und zur Expression von ein oder mehrere Bonesialoprotein-Molekülen führen, welche sich in mindestens einem Strukturmerkmal von endogenem Human-Bonesialoprotein normaler Osteoblasten unterscheiden, so dass bei Applikation eine Immunreaktion gegen das veränderte Bonesialoprotein erzeugt wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die exprimierten Bonesialoprotein-Moleküle dem in der Glykosylierung veränderten Bonesialoprotein entsprechen, das von osteotrophen Zellen eines Primärtumors exprimiert wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Mikroorganismen ausgewählt sind aus Bakterium, Virus und Einzeller.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Mikroorganismen Gram-positive Bakterien sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Mikroorganismen aus intrazellulär in Wirtszellen vermehrenden Bakterien ausgewählt sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Bakterien ausgewählt sind aus den Gattungen Aeromonas, Bartonella, Bruceila, Campylobacter, Clostridia, Enterobacteriaceae, Legionella, Listeria, Mycobacterium, Renibacterium, Rhodococcus, Bakterien der Spezies Yersinia, Escherichia, Shigella, Salmonella, und Bakterien, die in einem eukaryonten Wirtsorganismus lebensfähig sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 3 oder 4, wobei ursprünglich nicht-intrazellulär wachsende Bakterien durch genetische Manipulationen mit Faktoren ausgestattet sind, die ihnen Zutritt zur Zelle erlauben.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei die Bakterien ausgewählt sind aus Bacillen, Bacillus subtilis, Lactobacillen, Pseudomonaden, Staphylokokken, Yersinia.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei der Mikroorganismus ein exogenes Suizidgen aufweist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei der Mikroorganismus eine zielgerichtete, somatischen Transgenität in den Wirtzellen herbeiführt.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend als Wirkstoff ein Fremdprotein mit einem Hapten, das auf humanem Bonesialoprotein aus Tumorzellen vorhanden ist, dessen posttranslationale Glykosylierung im Bereich der Aminosäuren 120 bis 135 (SWISSPROT: SIAL_HUMAN, Acc.No. P21815, inkl. Signalsequenz), beinhaltend die Aminosäuren TGLAA, gegenüber normalem Bonesialoprotein aus Knochen verändert oder unvollständig ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Behandlung von Tumoren aus der Gruppe mit Prostata-, Mamma-, Lungen-, Nieren- und Schilddrüsentumoren, Tumorerkrankungen des Blutsystems, des Lymphsystems, des Herz-Kreislauf-Systems, des Nervensystems, des Respirationstraktes, des Verdauungstraktes, des endokrinen Systems, der Haut einschließlich Anhangsgebilde, des Bewegungsapparates und des Urogenitaltraktes, einschließlich der Niere.