DE102005022953A1

DE102005022953A1 - Nahrungsergänzungsmittel

Info

Publication number: DE102005022953A1
Application number: DE102005022953A
Authority: DE
Inventors: Gerhard Prof. Dr. Jahreis; Bianka Dr. Ditscheid
Original assignee: Chemische Fabrik Budenhiem KG; BK Giulini GmbH
Current assignee: Chemische Fabrik Budenhiem KG; BK Giulini GmbH
Priority date: 2005-05-19
Filing date: 2005-05-19
Publication date: 2006-11-23
Also published as: WO2006122966A3; WO2006122966A2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Verwendung von Calsiumphosphat oder einer Kombination von Calciumphosphaten bei der Herstellung eines Nahrungsergänzungsmittels. Die Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines alternativen Nahrungsergänzungsmittels, das presiwert herzustellen ist und die Nachteile des Standes der Technik überwindet. Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Nahrungsergänzungsmittel zur Cholesterinsenkung und/oder zur Prävention von koronaren Herzerkrankungen und/oder Prävention von Krebs, insbesondere Darmkrebs, und/oder zur Bindung von Gallensäuren und deren Ausscheidung, dadurch gekennzeichnet, daß es Calciumphosphat, besonders vorteilhaft in der Form von Pentacalciumhydroxyphosphat Ca¶5¶(PO¶4¶)¶3¶OH, enthält.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Nahrungsergänzungsmittel, dem gesundheitsfördernde und/oder krankheitsvorbeugende Wirkungen zugeschrieben werden. Zu diesen Wirkungen zählen die Senkung des Cholesterinspiegels bzw. die Erhöhung des Verhältnisses von HDL/LDL-Cholesterin und/oder die Prävention von koronaren Herzerkrankungen und/oder die Prävention von Krebs, insbesondere Darmkrebs, und/oder die Bindung von Gallensäuren und deren Ausscheidung aus dem Körper.

Über die Nahrung gelangen Fette, nach verschiedenen Umbau- und Spaltungsprozessen, in das Blut. Dort werden sie als Blutfette bezeichnet. Der Hauptbestandteil von Blut ist Wasser, worin sich die Fette nicht lösen, sondern ölige Tropfen bilden. Um dies zu vermeiden, erfolgt der Fetttransport in Lipoproteinpartikeln.

Die wichtigsten Lipoproteine für den Transport sind Chylomikronen, VLDL (Very Low Density Lipoprotein), LDL (Low Density Lipoprotein) und HDL (High Density Lipoprotein). LDL transpor tiert Cholesterin von der Leber zu Körpergeweben, wo es gebraucht wird, um verschiedene Hormone und auch Vitamin D herzustellen. Lipide können aber auch in den Gerfäßwänden abgelagert werden und so zur Atherogenese beitragen. Das geschieht verstärkt, wenn zu viel LDL Cholesterin vorhanden ist und dieses oxidiert wird (oxLDL). HDL nimmt überschüssiges Cholesterin auf und transportiert es von den Geweben zur Leber zurück. So verringert es Gefäßablagerungen. Ein hoher HDL-Wert und ein niedriges Verhältnis von LDL zu HDL sind daher wünschenswert zur Verringerung des Arteriosklerose-Risikos und zur Vorbeugung von Herzinfarkten.

In Tiermodellen sowie in Studien am Menschen wurde herausgefunden, daß erhöhte Plasmacholesterinkonzentrationen mit beeinträchtigter Endothelzellfunktion einhergehen (Hayakawa H & Raij L, 1999; O'Rourke M & Docherty JR, 1998; Creager MA, et al., 1990; Steinberg HO, et al., 1997). Darüber hinaus besteht ein proportional zunehmendes Risiko von koronaren Herzerkrankungen mit zunehmenden Serumcholesterinkonzentrationen (Lloyd-Jones DM, et al., 2003). Eine kürzlich veröffentlichte Studie zeigte eine umgekehrte Korrelation zwischen der Aufnahme von Calcium und dem Plasmalipoprotein-Lipid-Profil (Jacqmain M, et al., 2003).

Reid IR, et al., 2002, beschreiben eine Studie, in der die Wirkung einer Langzeitgabe über ein Jahr von Calciumcitrat auf die Lipidkonzentrationen (HDL-Cholesterin/LDL-Cholesterin) in älteren Frauen im Alter von 72 ± 4 Jahren untersucht wurde. Der einen Hälfte der Probandinnen (111 Frauen) wurden über ein Jahr täglich 1000 mg Calciumcitrat und der anderen Hälfte (112 Frauen) ein Placebo verabreicht. In der Gruppe, der das Calciumcitrat verabreicht worden war, wurde eine mittlere Erhöhung der Konzentrationen an HDL-Cholesterin von 7% und eine (nicht signifikante) Abnahme der Konzentrationen an LDL-Cholesterin von 6% beobachtet. Bei den Probandinnen, denen Placebo verabreicht worden war, wurden diese Veränderungen der Cholesterinwerte nicht festgestellt.

Bell L, et al., 1992, führten eine ähnliche Studie an 56 Patienten im Alter zwischen 30 und 69 Jahren mit mäßiger Hypercholesterolämie durch. Zu Beginn der Studie wurden die Patienten für 8 Wochen auf eine kohlenhydratreiche und cholesterinarme Diät gesetzt. Patienten, die nach dieser Diät eine Mindestkonzentration an LDL-Cholesterin und eine Höchstkonzentration an Triglyceriden aufwiesen, wurden dann in eine Untersuchungsgruppe und eine Kontrollgruppe aufgeteilt. Die Patienten der Untersuchungsgruppe erhielten über 6 Wochen täglich dreimal vor den Mahlzeiten jeweils 400 mg Calciumcarbonat verabreicht. Die Kontrollgruppe erhielt hingegen ein Placebo. Bei den Patienten, denen Calciumcarbonat verabreicht worden war, wurde eine Zunahme an HDL-Cholesterin von 4,1% und eine Abnahme an LDL-Cholesterin von 4,4% festgestellt.

Denke MA, et al., 1993, führten eine ähnliche Studie durch, bei der Patienten im Alter zwischen 38 und 49 Jahren mit mäßiger Hypercholesterolämie eine Diät mit hohem Calciumgehalt (1800 mg/Tag in der Untersuchungsgruppe) bzw. niedrigem Calciumgehalt (400 mg/Tag in der Kontrollgruppe) verordnet wurde. Calcium wurde in Form von Calcium-Citrat-Malat zugeführt. Am Ende der Studie zeigte die Untersuchungsgruppe, der die hohe Calciummenge verabreicht worden war, eine um 11% niedrigere Konzentration an LDL-Cholesterin und eine um 6% niedrigere Gesamtcholesterinkonzentration im Vergleich zu der Kontrollgruppe.

Es gibt somit einige Hinweise darauf, daß eine erhöhte Aufnahme von Calcium, z. B. mit der Nahrung oder als Nahrungsergänzungsmittel, eine die Konzentration von LDL-Cholesterin senkende bzw. eine das Verhältnis von LDL/HDL-Cholesterin vermindernde Wirkung haben kann. Man ging bislang jedoch immer davon aus, daß sich für eine solche ergänzende Gabe von Calcium nur solche Calciumverbindungen eignen, die im neutralen pH-Wert-Bereich leicht löslich sind, um eine gute Absorption bzw. Resorption des Calciums im Darm zu gewährleisten. Ein Nachteil dieser gut wasserlöslichen Calciumverbindungen ist jedoch, daß sie Gallensäuren nicht binden können, sondern das Calcium in ionisierter Form vorliegt.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin, ein alternatives Nahrungsergänzungsmittel bereitzustellen, das preiswert herzustellen ist und die Nachteile des Standes der Technik überwindet.

Gelöst wird diese Aufgabe durch ein Nahrungsergänzungsmittel zur Cholesterinsenkung und/oder zur Prävention von koronaren Herzerkrankungen und/oder zur Prävention von Krebs, insbesondere Darmkrebs und/oder zur Bindung von Gallensäuren und deren Ausscheidung, dadurch gekennzeichnet, daß es Calciumphosphat, besonders vorteilhaft in der Form von Pentacalciumhydroxyphosphat Ca₅(PO₄)₃OH enthält.

Sekundäre und tertiäre Calciumphosphate sind generell in wäßrigem Medium bei neutralem pH-Wert schlecht löslich. Für die Verabreichung von Calcium als Nahrungsergänzung wurden daher bisher überwiegend andere, im neutralen pH-Wert-Bereich gut lösliche Calciumsalze, wie Calciumcarbonat, Calciumcitrat oder Calcium-Citrat-Malat, den Calciumphosphaten vorgezogen. Man ging immer davon aus, daß die im neutralen pH-Wert-Bereich gut löslichen Calciumsalze vom Körper besser absorbiert werden. Im neutralen pH-Wert-Bereich lösliche Calciumsal ze lassen sich als Nahrungsergänzungsmittel auch besser verabreichen, wie beispielsweise als Brausegetränk mittels einer löslichen Brausetablette oder als ein vorgefertigtes Getränk in Flaschen.

Demgegenüber ist Calciumphosphat, insbesondere erfindungsgemäß bevorzugtes sekundäres und tertiäres Calciumphosphat und das besonders bevorzugte Pentacalciumhydroxyphosphat Ca₅(PO₄)₃OH im neutralen pH-Wert-Bereich in wäßrigem Medium im wesentlichen unlöslich und löst sich erst im Sauren mit sinkendem pH-Wert besser. Das Calciumphosphat im Nahrungsergänzungsmittels der vorliegenden Erfindung wird somit üblicherweise als Feststoff aufgenommen. Das Calciumphosphat kann in jeder geeigneten Darreichungsform verabreicht werden, z. B. als Tablette, Kapsel, Kaplette, Granulat oder ähnliches. Es kann auch in gekörnter Form oder als Pulver anderen Nahrungsmitteln beigemischt werden, um die Aufnahme zu erleichtern und den Geschmack zu verbessern.

Im Magen löst sich das Calciumphosphat des erfindungsgemäßen Nahrungsergänzungsmittels zunächst aufgrund des niedrigen pH-Wertes der Magensäure (pH-Wert ca. 1 bis 1,5) auf. Vom Magen gelangt es jedoch dann mit der Nahrung in den Dünndarm, wo das saure Milieu durch Bicarbonatpufferung wieder neutralisiert wird, Hier fällt das Calciumphosphat, insbesondere bevorzugtes sekundäres und tertiäres Calciumphosphat und das besonders bevorzugte Pentacalciumhydroxyphosphat als amorphes Calciumphosphat (ACP) wieder aus. Im neutralen pH-Wert-Bereich lösliche Calciumsalze, wie die oben genannten, bleiben hier gelöst, weshalb sie bislang als Nahrungsergänzungsmittel bevorzugt wurden. Man geht davon aus, daß amorphes Calciumphosphat im Darm als lockeres und voluminöses Präzipitat vorliegt.

Die Erfinder haben nun überraschend herausgefunden, daß die Verabreichung eines Nahrungsergänzungsmittels mit Calciumphosphat, insbesondere mit dem bevorzugten sekundären und tertiären Calciumphosphat und besonders bevorzugt mit Pentacalciumhydroxyphosphat, über einen längeren Zeitraum die Konzentrationen an LDL-Cholesterin im Plasma von Patienten und das Verhältnis von LDL/HDL-Cholesterin senken kann und damit auf lange Sicht zur Prävention von koronaren Herzerkrankungen, für welche ein erhöhter Cholesterinspiegel mit verantwortlich gemacht wird, beitragen kann. Des weiteren haben die Erfinder herausgefunden, daß die nahrungsergänzende Verabreichung von Calciumphosphat über einen längeren Zeitraum zur Prävention von Krebs, insbesondere Darmkrebs, beitragen kann.

In einer von den Erfindern durchgeführten Studie wurden Probanden über einen Zeitraum von nur 4 Wochen etwa 1000 mg/Tag Calcium in der Form von Pentacalciumhydroxyphosphat zu sätzlich zur normalen Calciumaufnahme mit der täglichen Nahrung (etwa 1200 mg/Tag) verabreicht. Die Cholesterinkonzentrationen der Probanden lagen am Anfang der Studie alle im Normbereich. Die Studie wurde als Cross-Over-Studie durchgeführt, d.h. jeder Studienteilnehmer war seine eigene Kontrollperson und bekam jeweils für 4 Wochen Calciumphosphat bzw. das Placebo. In der Untersuchungsperiode, in der Pentacalciumhydroxyphosphat verabreicht worden war, war gegenüber der Kontrollperiode eine Senkung der Konzentration an LDL-Cholesterin um etwa 5,6% zu verzeichnen, und das Verhältnis von LDL/HDL-Cholesterin war etwa 5,4% niedriger als in der Kontrollgruppe.

Diese Ergebnisse waren überraschend. Während sich die in früheren Studien untersuchten, im neutralen pH-Wert-Bereich gut löslichen Calciumverbindungen, wie Calciumcarbonat, Calciumcitrat und Calcium-Citrat-Malat, aufgrund ihrer guten Löslichkeit durch eine hohe Bioverfügbarkeit auszeichnen, ist die Bioverfügbarkeit von Calciumphosphat, insbesondere Pentacalciumhydroxyphosphat, niedriger, da es unlösliches amorphes Calciumphosphat bildet, sobald es aus dem sauren Milieu des Magens in das neutrale Milieu des Darms eintritt. Es wird angenommen, daß die Wirkungen des Calciumphosphats gerade auf die Bildung des amorphen Calciumphosphats im Darm zurückzuführen sind. Es wird weiterhin angenommen, daß diese Wirkungen unter anderem darauf beruhen könnten, daß unlösliches amorphes Calciumphosphat Gallensäuren im Darm bindet und präzipitiert und die Gallensäuren auf diese Weise aus dem Körper ausgeschieden werden. Tatsächlich wurde in Studien der Erfinder herausgefunden, daß Probanden während der Aufnahme von Pentacalciumhydroxyphosphat 11% mehr Gallensäuren ausschieden als in der Kontrollperiode. Es wird vermutet, daß die Bindung von Gallensäuren an amorphes Calciumphosphat und deren Ausscheidung zu einer Verminderung des Gallensäurepools in der Leber führt, so daß die fehlenden Gallensäuren aus Cholesterin erneut hergestellt werden müssen. Dies könnte die Ursache für die Verminderung der Konzentrationen an LDL-Cholesterin und Gesamtcholesterin im Serum sein.

Die Erfindung betrifft somit die Verwendung von Calciumphosphat bei der Herstellung eines Nahrungsergänzungsmittels zur Cholesterinsenkung und/oder zur Prävention von koronaren Herzerkrankungen und/oder zur Prävention von Krebs, insbesondere Darmkrebs, und/oder zur Bindung von Gallensäuren und deren Ausscheidung. Die Erfindung betrifft auch ein entsprechendes Nahrungsergänzungsmittel.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Calciumphosphat in wäßrigem Medium bei neutralem pH-Wert von 6 bis 8 schwer löslich und weist eine Löslichkeit von <200 mg Calcium/ Liter bei 25°C auf. Besonders bevorzugt ist das Calciumphosphat unter diesen Bedingungen im wesentlichen unlöslich.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Calciumphosphat in wäßrigem Medium bei saurem pH-Wert <2 leicht löslich.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält das Nahrungsergänzungsmittel, bezogen auf das gesamte Gewicht an Calciumphosphat, wenigstens 90 Gew.-%, vorzugsweise wenigstens 95 Gew.-%, besonders bevorzugt etwa 100 Gew.-% sekundäres Calciumphosphat, tertiäres Calciumphosphat oder Kombinationen davon. Besonders bevorzugt enthält das Nahrungsergänzungsmittel, bezogen auf das gesamte Gewicht an Calciumphosphat, wenigstens 90 Gew.-%, vorzugsweise wenigstens 95 Gew.-%, besonders bevorzugt etwa 100 Gew.-% tertiäres Calciumphosphat.

In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform enthält das Nahrungsergänzungsmittel, bezogen auf das gesamte Gewicht an Calciumphosphat, wenigstens 90 Gew.-% Pentacalciumhydroxyphosphat (Ca₅(PO₄)₃OH), vorzugsweise wenigstens 95 Gew.-% Pentacalciumhydroxyphosphat, besonders bevorzugt etwa 100 Gew.-% Pentacalciumhydroxyphosphat.

Das erfindungsgemäße Nahrungsergänzungsmittel kann neben dem Calciumphosphat weitere Calcium- und/oder Phosphatverbindungen oder auch sonstige Hilfs- und Zusatzstoffe, wie Trägersubstanzen, Bindemittel, Verdünnungs- und Streckmittel, Aromastoffe etc., enthalten. Zweckmäßigerweise sind in dem erfindungsgemäßen Nahrungsergänzungsmittel, bezogen auf die Gesamtzusammensetzung des Nahrungsergänzungsmittels, jedoch wenigstens 50 Gew.-%, vorzugsweise wenigstens 70 Gew.-%, besonders bevorzugt wenigstens 90 Gew.-% Calciumphosphat enthalten. Als weitere Calciumverbindungen zusätzlich zu Calciumphosphat sind Calciumcarbonat, Calciumsulfat, Calciumcitrat, Calciumlactat, Calciumgluconat oder Kombinationen davon besonders bevorzugt. Diese sind in dem Nahrungsergänzungsmittel jedoch vorzugsweise in einer Menge von nicht mehr als 50 Gew.-%, vorzugsweise nicht mehr als 30 Gew.-%, besonders bevorzugt nicht mehr als 10 Gew.-% enthalten, bezogen auf die Gesamtzusammensetzung des Nahrungsergänzungsmittels.

Ganz besonders vorteilhaft ist es, wenn das molare Verhältnis von Ca:P in dem gesamten Nahrungsergänzungsmittel 0,9:1 bis 2,0:1, vorzugsweise 1,3:1 bis 1,8:1, besonders bevorzugt 1,5:1 bis 1,7:1 beträgt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Nahrungsergänzungsmittel für eine Verabreichung von Calciumphosphat mit 500 bis 2000 mg Calcium pro Tag pro Person, vorzugsweise 700 bis 1500 mg Calcium pro Tag pro Person, besonders bevorzugt 800 bis 1200 mg Calcium pro Tag pro Person ausgelegt bzw. dosiert.

Bei ausgewogener Ernährung nehmen jugendliche und erwachsene Personen etwa 1000 bis 1200 mg Calcium pro Tag und etwa 700 bis 1200 mg Phosphor pro Tag mit der Nahrung auf. Calciumionen besitzen wichtige Funktionen bei der Stabilisierung von Zellmembranen, der intrazellulären Signalübermittlung, der Reizübermittlung im Nervensystem, der elektromechanischen Kopplung im Muskel sowie bei der Blutgerinnung. Darüber hinaus stabilisieren Calciumsalze die Knochen. Organische Phosphorverbindungen sind Bestandteil von Membranen und Nukleinsäuren, die in allen lebenden Zellen vorkommen. Zahlreiche Stoffwechselprozesse der Zelle werden durch Phosphorylierungsreaktionen gesteuert. Anorganisches Phosphat wirkt als Puffersystem bei der Aufrechterhaltung des pH-Wertes mit. Im Körper eines Erwachsenen finden sich etwa 600 bis 700 g Phosphor. Mehr als 85% des Phosphors sind im Skelett und im Zahnapparat enthalten, ca. 65 bis 80g in den übrigen Geweben und nur etwa 2 g im Blut. Die Deutsche Gesellschaft für Ernährung (DGE) empfiehlt in „Referenzwerte für die Nährstoffzufuhr", 1. Auflage, 2000, eine Calciumaufnahme von 220 bis 400 mg/Tag für Säuglinge von 4 bis 12 Monaten, 600 bis 1200 mg/Tag für Kinder von 1 bis 15 Jahren und 1000 bis 1200 mg/Tag für Jugendliche und Erwachsene ab 15 Jahren. Für die Aufnahme von Phosphor wird eine Aufnahme von 120 bis 300 mg/Tag für Säuglinge von 0 bis 12 Monaten, 500 bis 1250 mg/Tag für Kinder von 1 bis 15 Jahren und 700 bis 1250 mg/Tag für Jugendliche und Erwachsene ab 15 Jahren empfohlen. Ein Erwachsener ab dem 19. Lebensjahr sollte demnach etwa 1000 mg Calcium/Tag und etwa 700 mg Phosphor/Tag mit der täglichen Nahrung aufnehmen.

Die Erfinder haben nun herausgefunden, daß eine Erhöhung der Aufnahme von Calcium und Phosphor über Calciumphosphat, insbesondere Pentacalciumhydroxyphosphat, auf beispielsweise das Doppelte der empfohlenen Menge die hierin beschriebenen vorteilhaften Wirkungen haben kann. Studien haben diese Wirkungen in signifikanter Weise belegt.

Das Calciumphosphat des erfindungsgemäßen Nahrungsergänzungsmittels kann als Reinsubstanz oder, sofern verschiedene Calciumphosphate enthalten sind, als Gemisch der Reinsubstanzen als Nahrungsergänzungsmittel verwendet werden, das dann als solches eingenommen oder anderen Nahrungsmitteln untergemischt wird. Alternativ kann das Nahrungsergänzungsmittel lebensmittelrechtlich zulässige und verträgliche Trägerstoffe, Verdünnungsmittel, Geschmacksstoffe und/oder Stabilisatoren enthalten.

Wie bereits ausgeführt wurde, wird dem erfindungsgemäßen Nahrungsergänzungsmittel neben der cholesterinsenkenden Wirkung auch eine präventive Wirkung gegen Krebs zugeschrieben. Die Erfinder haben überraschend herausgefunden, daß eine Nahrungsergänzung durch Calciumphosphat, insbesondere Pentacalciumhydroxyphosphat, die Genotoxizität bzw. karzinogene Wirkung von Faeces-Wasser von Probanden, denen das Calciumphosphat über einen Zeitraum von 4 Wochen verabreicht wurde, senkt. Dem erfindungsgemäßen Nahrungsergänzungsmittel wird daher auch eine präventive Wirkung gegen Krebs, insbesondere Darmkrebs, zugeschrieben.

Die Genotoxizität von Faeces-Wasser wurde von den Erfindern im Comet-Assay untersucht. Der Comet-Assay, auch Einzelzell-Mikrogelelektrophorese (MGE) genannt, ist ein Verfahren zur Beurteilung der Genotoxizität von Substanzen in einzelnen Zellen, die als Suspension vorliegen. Mit dem Comet-Assay werden DNA-Doppelstrangbrüche und DNA-Einzelstrangbrüche sowie alkalilabile Stellen in der DNA von untersuchten Zellen erfaßt. Hierfür werden die zuvor mit der Testsubstanz inkubierten Zellen (30 μl Faeceswasser + 270 μl Zellsuspension mit 2 × 10⁶ Zellen/ml, entsprechend 10% Faeceswasser, Inkubation für 30 min bei 37°C) zunächst auf einem Objektträger in ein Agarosegel eingebettet. Nach erfolgter Lyse der Zellen (1 h bei 4°C) unter Auflösung der Zellmembranen liegt die DNA der Zellen frei vor. Diese wird nun einer Elektrophorese (20 min Äquilibrierungszeit, dann 20 min bei 25 V, 300 mA) unterzogen, wobei kleinere Nukleinsäurestränge schneller zur Anode wandern als größere. Durch Anfärben der DNA mit einem Fluoreszenzfarbstoff (z. B. Ethidiumbromid, SYBR-Green) wird die DNA nach der Elektrophorese sichtbar gemacht und mikroskopisch ausgewertet. Die DNA ungeschädigter Zellen erscheint als runder, im wesentlichen intakter Kern, wogegen eine DNA-Schädigung daran zu erkennen ist, daß die DNA nicht dicht gedrängt und klar abgegrenzt vorliegt, sondern ein Kern mit Schweif (wie bei einem Kometen) erkennbar ist. Der Anteil der Fluoreszenz im Schweif oder die Länge eines Kometen bzw. des Schweifs ist ein Maß für den Prozentsatz geschädigter DNA.

Die Erfindung wird nun nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen und Versuchsergebnissen weiter beschrieben.

Beispiel 1 Untersuchung der cholesterinsenkenden Wirkung des erfindungsgemäßen Nahrungsergänzungsmittels
1.1. Studie
31 Probanden (16 Frauen, 15 Männer) im Alter von 21 bis 29 Jahren mit einem mittleren BMI (Body Mass Index) von 21,7 ± 2,4 kg/m² (17,3 bis 28,1 kg/m²) nahmen an der Studie teil. Die Probanden wurden mündlich und schriftlich über den Zweck, den Verlauf und die möglichen Risiken der Studie unterrichtet und gaben ihr schriftliches Einverständnis an der Teilnahme. Die Probanden wurden randomisiert auf die beiden Verabreichungsregime Calciumphosphat → Placebo bzw. Placebo → Calciumphosphat aufgeteilt. Als Nahrungsergänzungsmittel wurde Pentacalciumhydroxyphosphat Ca₅(PO₄)₃OH (Chemische Fabrik Budenheim, Deutschland), ein geruchloses und geschmackloses weißes Pulver, zu einer Brotbackmischung hinzugegeben. Der Gehalt an zugegebenem Pentacalciumhydroxyphosphat betrug 3 Gew.-% der Brotbackmischung bezogen auf das Trockengewicht. Das Brot wurde gemäß der Anleitung auf der Verpackung hergestellt. Eine tägliche Portion von 140 g dieses Brotes lieferte eine zusätzliche Aufnahme von 1060 mg Calcium und 490 mg Phosphor gegenüber "Placebo-Brot", dem kein ergänzendes Pentacalciumhydroxyphosphat zugesetzt war.
Jeder Proband erhielt über 4 Wochen täglich 140 g des Brotes, wobei in der Untersuchungsgruppe das mit Pentacalciumhydroxyphosphat angereicherte Brot und in der Kontrollgruppe das Placebo-Brot verabreicht wurde. Zu Beginn der Studie, während der Studie und am Ende der Untersuchungs- und der Kontrollperiode wurden von den Probanden Blutproben genommen sowie Stuhlproben gesammelt.
1.2. Serumanalysen
Die Konzentrationen an Gesamtcholesterin, HDL-Cholesterin und Triacylglycerin im Serum wurden enzymatisch am Autoanalyzer Synchron^® LX 20 (Beckman Coulter GmbH, Krefeld, DE) bestimmt. Die Konzentration von LDL-Cholesterin wurde unter Verwendung der Friedewald'schen Formel berechnet.
1.3. Analysen im Stuhl
Die Stuhlproben wurden nach der Entnahme unmittelbar bei –20°C eingefroren. Am Ende der Studie wurden alle Proben aufgetaut und unter Verwendung eines handelsüblichen Mixers homogenisiert. Aliquote Teile wurden lyophilisiert und bis zur Analyse bei –20°C gelagert.
Neutrale Sterole und Gallensäuren im Suhl wurden nach dem Verfahren von Keller & Jahreis, 2004, analysiert. Dafür wurden zwei aliquote Teile von lyophilisierten Fäkalproben in Reagenzgläser gegeben, welche einen internen Standard (5α-Cholestan) enthielten. Nach milder alkalischer Hydrolyse mit ethanolischem NaOH für 1 Stunde bei 70°C und Zugabe von destilliertem Wasser wurden die neutralen Sterole viermal mit Cyclohexan extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt, das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand in Decan erneut gelöst. Die Messung erfolgte mittels gekoppelter Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC17-QP5000, Shimadzu, Kyoto, JP).
Zur Bestimmung der Gallensäuren wurden die Sterolextrakte mit 10 M NaOH bei 120°C für 3 Stunden verseift. Anschließend wurden die Proben mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 1 angesäuert und viermal mit Diethylether extrahiert. Die Extrakte wurden in einem Reagenzglas vereinigt, welches einen internen Gallensäurestandard (Hyodeoxycholsäure) enthielt. Das Lösungsmittel der vereinigten Extrakte wurde verdampft, und der Rückstand wurde methyliert und silyliert. Nach Eindampfen wurde der Rückstand in Decan erneut gelöst, geschüttelt und zentrifugiert. Die Messung erfolgte mittels gekoppelter Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC17-QP5000, Shimadzu, Kyoto, JP).
1.4. Statistik
Die erhaltenen Daten wurden unter Verwendung der Statistik-Software SPSS für Windows (Version 11.5) ausgewertet. Werte sind als Mittelwerte ± Standardabweichung (SD) angegeben. Ein Wahrscheinlichkeitswert p <0,05 wird als signifikant und ein Wert p <0,1 als tendenziell angesehen.
1.5. Ergebnisse
1.5.1. Nährstoffaufnahme und berechnete Absorption
Die Nährstoffaufnahme der Probanden ist in Tabelle 1 wiedergegeben. Die berechnete Calciumaufnahme der Probanden in der Untersuchungsperiode, in der ein mit Pentacalciumhydroxyphosphat angereichertes Brot verabreicht worden war, betrug 2204 ± 290 mg im Vergleich zu 1193 ± 295 mg in der Kontrollperiode (p <0,001). Die Phosphoraufnahme in der Untersuchungsperiode betrug 1998 ± 291 mg im Vergleich zu 1528 ± 288 mg in der Kontrollperiode (p <0,001). Hinsichtlich der berechneten Fett- und Cholesterinaufnahme während der Studiendauer gab es keine Unterschiede zwischen den beiden Perioden. Tabelle 1: Nährstoffaufnahme (n = 31)

FS: Fettsäuren; GFS: gesättigte Fettsäuren; tFS: trans-Fettsäuren; MUFS: monoungesättigte Fettsäuren; PUFS: polyungesättigte Fettsäuren; ns: nicht signifikant

1.5.2. Serumlipide und -lipoproteine
Die mittlere Gesamtkonzentration an Cholesterin im Serum der Probanden in der Untersuchungsperiode, der ein mit Pentacalciumhydroxyphosphat angereichertes Brot verabreicht worden war, betrug 4,36 ± 0,89 mmol/l und war signifikant niedriger als in der Kontrollperiode mit 4,60 ± 1,0 mmol/l (p <0,01, n = 31). Das Verhältnis von LDL/HDL-Cholesterin nahm nach der Verabreichung von mit Pentacalciumhydroxyphosphat angereichertem Brot während des Studienzeitraums tendenziell ab (1,59 ± 0,68 in der Untersuchungsperiode gegenüber 1,68 ± 0,74 in der Kontrollperiode; p = 0,062).
1.5.3. Stuhlparameter
Die mittlere Fettausscheidung mit dem Stuhl war während des Studienzeitraums in beiden Perioden sehr ähnlich (4,3 ± 1,1 g/Tag in der Untersuchungsperiode und 3,9 ± 1,4 g/Tag in der Kontrollperiode; p = 0,149) (siehe Tabelle 2).
Die Ergebnisse der Analysen der Stuhlproben zeigten keinen Unterschied der Gesamtausscheidung an neutralen Sterolen zwischen der Untersuchungsperiode und der Kontrollperiode (13,19 ± 6,81 mg/g Trockensubstanz in der Untersuchungsperiode und 13,15 ± 5,22 mg/g Trokkensubstanz in der Kontrollperiode).
Die Untersuchung der Gallensäureausscheidung zeigte, daß die Probanden der Untersuchungsperiode, in der ein mit Pentacalciumhydroxyphosphat angereichertes Brot verabreicht worden war, signifikant mehr Gallensäuren ausschieden als die Probanden der Kontrollperiode (9,84 ± 2,69 mg/g Trockensubstanz in der Untersuchungsperiode gegenüber 8,85 ± 2,10 mg/g Trockensubstanz in der Kontrollperiode; p <0,01). Diese Zunahme der Gallensäurenausscheidung in der Untersuchungsperiode wird einer signifikanten Erhöhung der Ausscheidung von sekundären Gallensäuren in der Untersuchungsperiode zugeschrieben (9,30 ± 2,69 mg/g Trokkensubstanz in der Untersuchungsperiode gegenüber 8,30 ± 2,15 mg/g Trockensubstanz in der Kontrollperiode; p <0,01). Die Ausscheidung primärer Gallensäuren war in beiden Perioden ähnlich. Tabelle 2: Ausscheidung (n = 31)

ns: nicht signifikant

1.6. Diskussion
Die Untersuchung der Wirkung von Pentacalciumhydroxyphosphat auf den Cholesterinstoffwechsel zeigte eine signifikante Reduzierung der Serumcholesterinkonzentrationen um etwa 5,2% bei den Probanden durch eine ungefähre Verdoppelung der Calciumaufnahme über die Nahrung (etwa 2204 mg/Tag gegenüber 1193 mg/Tag) und unter Verwendung von Pentacalciumhydroxyphosphat als Nahrungsergänzung.
Pentacalciumhydroxyphosphat scheint daher eine geeignete Calciumverbindung zur Senkung der Serumcholesterinkonzentrationen zu sein. Zur Aufklärung des Mechanismus, der dieser lipidsenkenden Wirkung der Calciumphosphatsupplementation zugrunde liegt, wurde auch die Ausscheidung von Cholesterin, dessen Stoffwechselprodukten und von Gallensäuren sowie die Gesamffettausscheidung gemessen. Die Fettaufnahme und -ausscheidung mit dem Stuhl unterschied sich nicht zwischen den zwei Perioden, noch ergab die Normalisierung der Fettaufnahme auf 100g pro Tag einen Unterschied hinsichtlich der Fettausscheidung. Daher kann die Wirkung der Nahrungsergänzung durch Pentacalciumhydroxyphosphat auf die Konzentration von Cholesterin im Serum nicht mit einer Wirkung auf die Fettausscheidung erklärt werden.
Calciumverbindungen, die im Stand der Technik hinsichtlich ihrer cholesterinsenkenden Wirkung als Nahrungsergänzungsmittel untersucht wurden, wie Calciumcarbonat, Calciumcitrat und Calcium-Citrat-Malat, stellen Calcium mit einer relativ hohen Bioverfügbarkeit bereit. Im Gegensatz dazu ist die Bioverfügbarkeit des Calciums aus Pentacalciumhydroxyphosphat und anderen Calciumphosphaten aufgrund der Bildung unlöslicher amorpher Komplexe niedriger. Nach der Lösung von Calciumphosphat in dem sauren Milieu des Magens präzipitieren Calcium und Phosphat unter Bildung von amorphem Calciumphosphat (ACP), wenn sie in den Zwölffingerdarm eintreten (pH 5,5–8,0). Dieses ACP hat ein molares Verhältnis von Calcium:Phosphat von etwa 3:2. Das unlösliche Calciumphosphat besitzt die Fähigkeit, Gallensäuren im Darm zu binden und zu präzipitieren. Es wird angenommen, daß die negativ geladene Carboxylgruppe der unkonjugierten Gallensäure an die positiv geladenen Calciumionen auf der Oberfläche von ACP bindet. Darüber hinaus können weitere Gallensäuren über hydrophobe Aggregation binden. Unter den gleichen experimentellen Bedingungen binden Dihydroxygallensäuren viel stärker an ACP als Trihydroxygallensäuren, was zu einer Abnahme des Verhältnisses von (OH)₂/(OH)₃ führt. Gebundene Gallensäuren werden dem enterohepatischen Kreislauf entzogen und mit dem Stuhl ausgeschieden. Somit kann der Mechanismus der serumlipidsenkenden Wirkung mit einer erhöhten Ausscheidung von Gallensäuren erklärt werden. Es könnte aber auch Cholesterin in die hydrophoben Aggregate eingebunden und auf die gleiche Art und Weise ausgeschieden werden.
Täglich treten etwa 250–500 mg Nahrungscholesterin und 600–1000 mg Cholesterin aus der Galle durch den menschlichen Darm hindurch. Cholesterin unterliegt dem enterohepatischen Kreislauf. Das verbleibende Cholesterin gelangt in den Dickdarm und kann durch anaerobe, gram-positive Bakterien verstoffwechselt werden. Das Hauptumwandlungsprodukt von Cholesterin ist Coprostanol, das alternativ durch eine direkte Reduzierung von Cholesterin erzeugt wird oder indirekt über Cholestenon und Coprostanon, wobei der letztgenannte der bevorzugte Stoffwechselweg zu sein scheint. Dennoch gibt es einen geringen Prozentsatz an Menschen, die kaum Cholesterin in Coprostanol umwandeln, was zu einer hohen Cholesterin- und einer relativ niedrigen Coprostanolausscheidung führt.
Die im wesentlichen gleiche Ausscheidung an gesamten neutralen Sterolen mit dem Stuhl in beiden Perioden der vorgenannten Studie deutet darauf hin, daß es keinen Einschluß von Cholesterin und bakteriellen Cholesterinstoffwechselprodukten in ACP-Komplexe gibt. Jedoch wurden signifikante Veränderungen in dem Profil von ausgeschiedenen Cholesterinstoffwechselprodukten gemessen. Das veränderte Profil der bakteriellen Cholesterinstoffwechselprodukte im Stuhl könnte durch eine Wirkung auf die Bakterienbesiedlung erklärt werden. Jedoch wurde dies im Menschen bislang nicht bestätigt.
Die Ergebnisse deuten darauf hin, daß die Erniedrigung des Serumcholesterins nicht auf eine Bindung von Cholesterin an ACP im Darm zurückzuführen ist. Eine plausiblere Erklärung ist eine erhöhte Ausscheidung von Gallensäuren infolge der Bindung dieser sauren Steroide an ACP. Tatsächlich war die Gallensäurenausscheidung in der Untersuchungsperiode der vorgenannten Studie, in der ein mit Pentacalciumhydroxyphosphat angereichertes Brot verabreicht worden war, 11% höher als in der Kontrollperiode. Diese Zunahme bezog sich ausschließlich auf eine erhöhte Ausscheidung von sekundären Gallensäuren, wogegen die Ausscheidung primärer Gallensäuren in beiden Perioden gleich blieb. Die Bindung von Gallensäuren an ACP könnte zu einer Verminderung des Gallensäurepools in der Leber führen. Infolgedessen werden die fehlenden Gallensäuren aus Cholesterin hergestellt, was zu einer Erniedrigung der Serumkonzentrationen an LDL-Cholesterin und Gesamtcholesterin führt.
Die vorliegende Studie zeigte erstmals eine vorteilhafte Wirkung der Nahrungsergänzung durch Pentacalciumhydroxyphosphat auf die Konzentrationen an Serumlipiden. Als Nahrungsergänzungsmittel könnte Pentacalciumhydroxyphosphat daher das Langzeitrisiko der Entstehung koronarer Herzerkrankungen vermindern, welches – neben anderen Faktoren – erhöhten Lipidkonzentrationen im Serum zugeschrieben wird.
Beispiel 2 Untersuchung der Wirkung des erfindungsgemäßen Nahrungsergänzungsmittels auf die Genotoxizität des Feaceswassers
Faeceswasser der Probanden aus der oben genannten Studie (Beispiel 1), denen zuvor 4 Wochen lang in der Untersuchungsperiode ein mit Pentacalciumhydroxyphosphat angereichertes Brot und in der Kontrollperiode ein Placebobrot verabreicht worden war, wurde hinsichtlich seiner genotoxischen Wirkung im Comet-Assay untersucht. Hierfür wurden HT29-Stammzellen, eine human Kolonkrebszellinie, verwendet.
Die Ergebnisse zeigten, daß der Anteil der Fluoreszenz im Kometenschweif als Maß für die Schädigung der DNA (Strangbrüche) durch das Faeceswasser bei den Probanden der Untersuchungsperiode tendenziell geringer war als bei den Probanden der Kontrollperiode: 4,53 ± 1,36 % in der Untersuchungsperiode vs. 5,20 ± 1,88% in der Kontrollperiode (p = 0,077, n = 28), d.h. der Prozentsatz durch Faeceswasser geschädigter DNA ist in der CaP-Periode tendenziell gesunken (Faeceswasser der Probanden aus der CaP-Periode induzierte weniger DNA-Schäden im Comet-Assay als das Faeceswasser, das von denselben Probanden während der Placebo-Periode gewonnen wurde. Der Anteil der Fluoreszenz im Kometenschweif zeigte eine inverse Korrelation zu der Calcium- und Phosphoraufnahme der Probanden. Eine inverse Korrelation beschreibt einen negativen Zusammenhang zwischen zwei Parametern. Die Korrelationskoeffizienten "r" charakterisieren diesen Zusammenhang, wobei r = ± 0,99 einen stärkeren Zusammenhang darstellt als r = ± 0,10. Ein positives Vorzeichen kennzeichnet einen positiven Zusammenhang, ein negatives Vorzeichen steht für einen inversen Zusammenhang. Das heißt, je höher die Calcium- und die Phosphoraufnahme, desto geringer ist die Genotoxizität des Faeceswassers (gemessen als Tail Intensity) in unserer Studie. Mit r = –0,355 (Calcium) und r = –0,394 (Phosphor) besteht eine hochsignifikante Korrelation zur Genotoxizität (p = 0,007 und p = 0,003).
Diese Ergebnisse lassen den Schluß zu, daß die Supplementation der Nahrung mit dem erfindungsgemäßen Nahrungsergänzungsmittel zur Prävention von Krebs, insbesondere Darmkrebs, beiträgt.
Literatur

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Claims

Verwendung von Calciumphosphat oder einer Kombination von Calciumphosphaten bei der Herstellung eines Nahrungsergänzungsmittels zur Cholesterinsenkung und/oder zur Prävention von koronaren Herzerkrankungen und/oder zur Prävention von Krebs, insbesondere Darmkrebs, und/oder zur Bindung von Gallensäuren und deren Ausscheidung.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Calciumphosphat oder die Kombination von Calciumphosphaten in wässrigem Medium bei neutralem pH-Wert von 6 bis 8 schwer löslich ist und eine Löslichkeit von <200 mg Calcium/Liter bei 25°C aufweist.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Calciumphosphat oder die Kombination von Calciumphosphaten in wässrigem Medium bei saurem pH-Wert <2 leicht löslich ist.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Nahrungsergänzungsmittel, bezogen auf das gesamte Gewicht an Calciumphosphat, wenigstens 90 Gew.-%, vorzugsweise wenigstens 95 Gew.-%, besonders bevorzugt etwa 100 Gew.-% sekundäres Calciumphosphat, tertiäres Calciumphosphat oder Kombinationen davon enthält.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Nahrungsergänzungsmittel, bezogen auf das gesamte Gewicht an Calciumphosphat, wenigstens 90 Gew.-%, vorzugsweise wenigstens 95 Gew.-%, besonders bevorzugt etwa 100 Gew.-% tertiäres Calciumphosphat enthält.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Nahrungsergänzungsmittel, bezogen auf das gesamte Gewicht an Calciumphosphat, wenigstens 90 Gew.-% Pentacalciumhydroxyphosphat (Ca₅(PO₄)₃OH), vorzugsweise wenigstens 95 Gew.-% Pentacalciumhydroxyphosphat, besonders bevorzugt etwa 100 Gew.-% Pentacalciumhydroxyphosphat enthält.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Nahrungsergänzungsmittel, bezogen auf die Gesamtzusammensetzung des Nahrungsergänzungsmittels, wenigstens 50 Gew.-%, vorzugsweise wenigstens 70 Gew.-%, besonders bevorzugt wenigstens 90 Gew.-% Calciumphosphat enthält.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Nahrungsergänzungsmittel zusätzlich zu Calciumphosphat weitere Calciumsalze enthält, vorzugsweise Calciumcarbonat, Calciumsulfat, Calciumcitrat, Calciumlactat, Calciumgluconat oder Kombinationen davon und vorzugsweise in einer Menge von nicht mehr als 50 Gew.-%, vorzugsweise nicht mehr als 30 Gew.-%, besonders bevorzugt nicht mehr als 10 Gew.-% bezogen auf die Gesamtzusammensetzung des Nahrungsergänzungsmittels.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das molare Verhältnis von Ca:P in dem gesamten Nahrungsergänzungsmittel 0,9:1 bis 2,0:1, vorzugsweise 1,3:1 bis 1,8:1, besonders bevorzugt 1,5:1 bis 1,7:1 beträgt.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Nahrungsergänzungsmittel für eine Verabreichung von Calciumphosphat mit 500 bis 2000 mg Calcium pro Tag pro Person, vorzugsweise 700 bis 1500 mg Calcium pro Tag pro Person, besonders bevorzugt 800 bis 1200 mg Calcium pro Tag pro Person ausgelegt bzw. dosiert ist.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Nahrungsergänzungsmittel weiterhin verträgliche Trägerstoffe, Verdünnungsmittel, Geschmacksstoffe und/oder Stabilisatoren enthält.
Nahrungsergänzungsmittel, wie es in einem der vorangegangenen Ansprüche definiert ist.