DE10084534B4

DE10084534B4 - Verfahren zum Einfrieren von Hundesamenflüssigkeit und Verwendung der eingefrorenen Hundesamenflüssigkeit

Info

Publication number: DE10084534B4
Application number: DE10084534T
Authority: DE
Inventors: Hwa Sub Son
Original assignee: Son Hwa Sub Seongnam
Current assignee: Son Hwa Sub Seongnam
Priority date: 1999-04-28
Filing date: 2000-04-26
Publication date: 2007-09-13
Anticipated expiration: 2020-04-27
Also published as: KR100320588B1; GB2364233A; DE10084534T1; AU773578B2; JP2002543101A; GB0126189D0; CN1351484A; KR20000049647A; WO2000066028A1; AU4435100A; GB2364233B; CN1170511C

Abstract

Verfahren zum Einfrieren einer Hundesamenflüssigkeit, das die Stufen umfasst:
(a) Sammeln von Hunderüdensamenflüssigkeit unter Anwendung einer Massagemethode oder Elektroschockmethode;
(b) Zentrifugieren der gesammelten Samenflüssigkeit, um die obere Flüssigkeit abzutrennen und zu entfernen, wobei nur die untere Samenflüssigkeit zurückbleibt;
(c) Mischen von gleichen Volumenteilen der unteren Samenflüssigkeit und einer Zusammensetzung, die, bezogen auf 100 ml destilliertes Wasser, umfasst:
0,25 bis 4,5 g Natriumcitrat, 0,45 bis 4,0 g Dextrose, 0,01 bis 0,3 g Penicillin, 50 000 bis 500 000 Internationale Einheiten (IU) Streptomycin, 0,25 bis 0,45 g Catalase, 0,045 bis 0,25 g Eigelb, 1,5 bis 15 ml Glycerin und 0,02 bis 0,1 μg Hundeserum, und primäres Abkühlen der Mischung auf etwa 5°C;
(d) weitere Zugabe der Zusammensetzung zu der in der Stufe (c) erhaltenen Mischung, um das Volumenverhältnis von Samenflüssigkeit zu der Zusammensetzung auf 1:2 zu verringern, und sekundäres Abkühlen der resultierenden Mischung auf etwa 5°C; und...

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Zusammensetzungen zum Einfrieren von Hundesamenflüssigkeit (Spermien), ein Verfahren zum Einfrieren der Hundesamenflüssigkeit (Spermien) unter Verwendung der Zusammensetzungen und ein künstliches Inseminationsverfahren, bei dem die eingefrorene Hundesamenflüssigkeit (Spermien) verwendet wird (werden). Die vorliegende Erfindung bezieht sich insbesondere auf Zusammensetzungen zum Einfrieren von Hundesamenflüssigkeit, in denen die Anzahl der in der Samenflüssigkeit lebenden Spermatozoen und die Form und Lebensfähigkeit derselben aufrechterhalten werden, wenn die Samenflüssigkeit innerhalb einer vorgegebenen Zeitspanne nach dem Einfrieren derselben aufgetaut wird, auf ein Verfahren zum Einfrieren der Hundesamenflüssigkeit unter Verwendung der Zusammensetzungen und ein künstliches Inseminationsverfahren, bei dem die eingefrorene Hundesamenflüssigkeit an einem geeigneten Ort und zu einem geeigneten Zeitpunkt aufgetaut und in die Vagina einer Hündin eingeführt wird.
In der jüngsten industriellen Entwicklung ist die Gentechnologie ein wichtiges Forschungsgebiet geworden. Die Gentechnologie ist erforderlich, um gute Tierrassen zu bewahren und zu entwickeln und die Lebensdauer von menschlichem Leben zu verlängern, und sie ist über die Grundstufe hinaus bereits bis zu einer beträchtlich hohen Stufe fortgeschritten.
Im Falle der Züchtung von Vieh oder Haustieren erlaubt die künstliche Insemination unter Verwendung von Spermienflüssigkeit die Befruchtung von mehreren weiblichen Tieren durch Mischen der von einem männlichen Tier gesammelten Spermienflüssigkeit (Spermien) mit einer Verdünnungsflüssigkeit, um das Volumen der für die Injektion erforderlichen Flüssigkeit zu erhöhen. Bei der Durchführung der künstlichen Insemination wird somit eine verbesserte oder reine Samenflüssigkeit (Spermien) gesammelt und mehrere weibliche Tiere können gleichzeitig befruchtet werden, wodurch verbesserte Rassen gezüchtet und reine Rassen aufrechterhalten werden können.
Um eine erfolgreiche künstliche Insemination zu erzielen, die mehrere Vorteile hat, wie vorstehend beschrieben, ist die Entwicklung von geeigneten Verdünnungsflüssigkeiten ein wichtiger Gesichtspunkt. Da mit der Erforschung von Verdünnungsflüssigkeiten bereits vor einigen Jahrzehnten begonnen worden ist, sind bereits Verdünnungsflüssigkeiten entwickelt und in der Praxis angewendet worden, die auf Schweine, Pferde und Rinder anwendbar sind. Die Entwicklung von Verdünnungsflüssigkeiten, die auf Hundesamenflüssigkeit (Spermien) anwendbar sind, ist jedoch noch nicht ausgereift.
Ein Verfahren zur Konservierung von tierischer Samenflüssigkeit (Spermien) für einen langen Zeitraum ohne Frischeverlust würde es erlauben, verbesserte Samenflüssigkeit (Spermien) für die Befruchtung von weiblichen Tieren, falls erforderlich, zu verwenden und würde somit einen großen Beitrag zur Entwicklung der Viehzucht- und Haustier-Industrie leisten.
Ein Einfrierverfahren ist am besten geeignet für die Konservierung von Samenflüssigkeit (Spermien) für einen langen Zeitraum. Ein Einfrierverfahren für Hundesamenflüssigkeit (Spermien) ist jedoch noch besonders unterentwickelt. Obgleich dies nicht eindeutig angegeben werden kann, scheint der spezifische Grund der zu sein, dass Reagentien zum Einfrieren von Hunderüdensamenflüssigkeit, deren Spermatozoen eine Besonderheit aufweisen, und Einfrierverfahren, in denen die Reagentien verwendet werden, noch nicht ausreichend entwickelt worden sind.

CA 91: 208548 offenbart eine Zusammensetzung zum Verdünnen von Hundesamen, die Natriumcitrat, Eigelb, Serum und Glycerin enthält. Zur Aufbewahrung des Hundesamens, der zur künstlichen Insemination von Hunden verwendet wird, wird die verdünnte Flüssigkeit eingefroren.

US-A-4007087 offenbart eine Verdünnungsflüssigkeit für Samen, die Eigelb, Glycerin, Glykose, Natriumcitrat, Penicillin, Streptomycin und Glycin enthält.

Beschreibung der Erfindung

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Einfrieren von Samenflüssigkeit (Spermien) zur Verfügung zu stellen, die aus männlichen Hunden (Rüden) gesammelt worden ist, unter Verwendung von Zusammensetzungen, mit deren Hilfe die Samenflüssigkeit (Spermien) für einen langen Zeitraum gelagert werden kann, und das bequem durchgeführt werden kann und bei dem die eingefrorene Hundesamenflüssigkeit (Spermien) zu einem geeigneten Zeitpunkt für eine künstliche Insemination aufgetaut und verwendet werden kann.

Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zum Einfrieren einer Hundesamenflüssigkeit, das die Stufen umfasst:

(a) Sammeln von Hunderüdensamenflüssigkeit unter Anwendung einer Massagemethode oder Elektroschockmethode;
(b) Zentrifugieren der, gesammelten Samenflüssigkeit, um die obere Flüssigkeit abzutrennen und zu entfernen, wobei nur die untere Samenflüssigkeit zurückbleibt;
(c) Mischen von gleichen Volumenteilen der unteren Samenflüssigkeit und einer Zusammensetzung, die, bezogen auf 100 ml destilliertes Wasser, umfasst: 0,25 bis 4,5 g Natriumcitrat, 0,45 bis 4,0 g Dextrose, 0,01 bis 0,3 g Penicillin, 50 000 bis 500 000 Internationale Einheiten (IU) Streptomycin, 0,25 bis 0,45 g Catalase, 0,045 bis 0,25 g Eigelb, 1,5 bis 15 ml Glycerin und 0,02 bis 0,1 μg Hundeserum, und primäres Abkühlen der Mischung auf etwa 5°C;
(d) weitere Zugabe der Zusammensetzung zu der in der Stufe (c) erhaltenen Mischung, um das Volumenverhältnis von Samenflüssigkeit zu der Zusammensetzung auf 1:2 zu verringern, und sekundäres Abkühlen der resultierenden Mischung auf etwa 5°C; und
(e) Eintauchen der in der Stufe (d) erhaltenen Mischung in flüssigen Stickstoff und Einfrieren der Mischung.

Die Aufgabe wird weiterhin gelöst durch die Verwendung der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eingefrorenen Hundesamenflüssigkeit zur künstlichen Insemination von Hunden.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäße Verwendung der Hundesamenflüssigkeit zur künstlichen Insemination von Hunden die Stufen:

(a) Prüfen, ob eine geeignete Ovulationsphase einer Hündin vorliegt, zur Verbesserung der Fertilitätsrate;
(b) Zugabe der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten eingefrorenen Samenflüssigkeit zu einer Mischung aus einer 0,3 bis 1,5 gew.-%igen Natriumchloridlösung und Hundeserum, die auf eine Temperatur von 30 bis 40°C erhitzt ist, und Auftauen der Samenflüssigkeit;
(c) Bestimmung der Mobilität der Spermatozoen in der aufgetauten Samenflüssigkeit unter einem Mikroskop; und
(d) Injizieren der aufgetauten Samenflüssigkeit in die Vagina einer Hündin und Massieren der Klitoris der Hündin.

Durch das künstliche Inseminationsverfahren können verbesserte Tiere gezüchtet werden und es kann weit verbreitet angewendet werden.

Der Erfinder der vorliegenden Erfindung hat umfangreiche Untersuchungen durchgeführt, um ein Verfahren zum Einfrieren von Hundesamenflüssigkeit (Spermien) und dafür verwendbare Zusammensetzungen zu entwickeln und er hat dabei gefunden, dass die Hundesamenflüssigkeit (Spermien) für die Lagerung eingefroren werden kann durch Kombinieren einer geringen Menge Hundeserum mit einer Zusammensetzung, die einer generellen Verdünnungsflüssigkeit ähnelt, die für Rinder oder Schweine verwendet wird, um die Erfindung zu vollenden.

Die vorliegende Erfindung wird nachstehend näher im Detail beschrieben.

Zuerst werden Zusammensetzungen zum Einfrieren von Hundesamenflüssigkeit (Spermien) beschrieben.

Die Zusammensetzungen zum Einfrieren von Hundesamenflüssigkeit gemäß der vorliegenden Erfindung werden hergestellt durch homogenes Einmischen von 0,25 bis 4,5 g Natriumcitrat zur Regulierung der Pufferfunktion, der Acidität (pH-Wert) und des osmotischen Druckes der Spermatozoen, von 0,45 bis 4,0 g Dextrose als Stoffwechsel- und Energiequelle, von 0,01 bis 0,3 g Penicillin als Antibiotikum zur Verhinderung einer Infektion, von 50 000 bis 500 000 IU (Internationalen Einheiten) Streptomycin, von 0,25 bis 0,45 g Catalase, von 0,045 bis 0,25 g Eigelb, von 1,5 bis 15 ml Glycerin und von 0,02 bis 0,1 μg Hundeserum in 100 ml destilliertes Wasser. Die so hergestellte Zusammensetzung wird in Form von Portionen von etwa 2 ml eingefroren, die bei ihrer Verwendung aufgetaut werden.

In der erfindungsgemäßen Zusammensetzung kann Samenflüssigkeit für einen langen Zeitraum gelagert werden unter Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit und Mobilität der in der eingefrorenen Samenflüssigkeit enthaltenen Spermatozoen. Ferner enthält die erfindungsgemäße Zusammensetzung Hundeserum, das nach dem Auftauen normale Fertilitäts- und Geburtenraten aufweist.

Nachstehend wird ein Verfahren zum Einfrieren von Hundesamenflüssigkeit unter Verwendung der Zusammensetzung beschrieben.

Um die Hundesamenflüssigkeit einfrieren zu können, ist es zuerst erforderlich, sie zu sammeln. Als Samenflüssigkeitssammelmethode können alle allgemein bekannten Methoden ohne Beschränkung angewendet werden, vorzugsweise eine Massage- oder Elektroschockmethode. Die Massagemethode, die am häufigsten angewendet wird, wird nachstehend kurz beschrieben.

Da Spermatozoen schnell absterben, wenn sie mit Urin gemischt werden, ist es bevorzugt, dass ein Hunderüde uriniert, bevor die Samenflüssigkeit aus dem Hunderüden gesammelt wird. Dann wird das Genitalorgan des Hunderüden unter Verwendung eines Reagensglases mit einer eingesetzten künstlichen Vagina massiert, um den Hunderüden dazu zu bringen, in das Reagensglas zu ejakulieren. Um das Sammeln von Samenflüssigkeit nach dieser Methode zu katalysieren, lässt man eine läufige Hündin um den Hunderüden herumstreifen. Andererseits wird ein eingefrorener Wattebausch oder Schwamm, der ein Vaginalsekret einer läufigen Hündin enthält, aufgetaut und man lässt den Hunderüden während des Sammelns der Samenflüssigkeit daran schnuppern.

Im Falle des Sammelns von Samenflüssigkeit unter Anwendung der Massagemethode wird die Samenflüssigkeit in drei Proben aufgeteilt, die in unterschiedlichen Röhrchen gesammelt werden. Die Probe der Samenflüssigkeit, die die Spermatozoen enthält, ist die zweite gesammelte Probe. Jede Probe wird in einem Zeitintervall von etwa 10 bis 20 s gesammelt. In einigen Fällen ist jedoch das Zeitintervall zwischen der ersten und der zweiten Probe zu kurz, um unterscheidbar zu sein. Erfindungsgemäß wird vorzugsweise die zweite Probe verwendet. Wenn es jedoch nicht möglich ist, die erste Probe von der zweiten Probe zu unterscheiden, werden alle drei Proben in einem zu verwendenden Reagensglas gesammelt.

Dann wird die so gesammelte Samenflüssigkeit mittels einer Zentrifuge getrennt und die obere Flüssigkeit wird verworten, wobei nur die untere sedimentäre Samenflüssigkeit zurückbleibt. Das Zentrifugieren wird 6 min lang bei etwa 500 bis 1100 UpM durchgeführt.

Gleiche Volumenteile der unteren sedimentären Samenflüssigkeit und der wie vorstehend beschrieben hergestellten Zusammensetzung werden bei Raumtemperatur miteinander gemischt und dann wird die Mischung primär abgekühlt. Die Abkühlungsdauer beträgt hier etwa 10 bis 20 min und die Abkühlungstemperatur beträgt etwa 5°C. Eine Mischung aus Samenflüssigkeit und der Zusammensetzung in einem Volumenverhältnis von 1:2 wird mit der primär abgekühlten Mischung bei Raumtemperatur weiter gemischt und dann bei der gleichen Temperatur für den gleichen Zeitraum sekundär abgekühlt. Während der primären und sekundären Abkühlungsstufen werden die Samenflüssigkeit und die Zusammensetzung homogen miteinander gemischt.

Danach wird eine vorgegebene Menge der sekundär abgekühlten Mischung mittels einer Tropfpipette entnommen und 2 bis 3 Tropfen werden auf die Oberfläche von Trockeneis aufgetropft. Da die Oberflächentemperatur von Trockeneis etwa –79°C beträgt, wird die Mischung bis zu einem gewissen Grade eingefroren. Die eingefrorene Mischung wird von dem Trockeneis getrennt und in einen Behälter mit flüssigem Stickstoff von etwa –196°C eingeführt, der dann hermetisch versiegelt wird, wodurch das Verfahren zum Einfrieren von Hundesamenflüssigkeit vervollständigt wird. Dieses Verfahren wird als "Pelletverfahren" bezeichnet, da die eingefrorene Mischung in dem flüssigen Stickstoff pelletförmig ist.

Neben dem vorstehend beschriebenen Pelletverfahren kann die Hundesamenflüssigkeit auch unter Anwendung eines Verfahrens eingefroren werden, bei dem ein Strohhalm verwendet wird, das nachstehend kurz beschrieben wird.

Die sekundär abgekühlte Mischung wird in etwa 0,5 ml-Proben aufgeteilt und in Strohhalme eingeführt. Jeweils 20 bis 30 Strohhalme werden zu einer Gruppe zusammengefasst und in einen flüssigen Stickstoff enthaltenden Behälter eingetaucht. Wenn die Strohhalme zum Einfrieren in den Behälter eingetaucht werden, werden sie schrittweise eingetaucht, anstatt sie auf einmal bis zum Boden des Behälters einzutauchen. Zuerst werden sie nur bis zum oberen Abschnitt des Behälters eingetaucht und dort für eine bestimmte Zeitspanne belassen, dann werden sie bis zur Mitte des Behälters eingetaucht, dort für eine bestimmte Zeitspanne belassen, und dann werden sie bis zum Boden des Behälters eingetaucht.

Die auf diese Weise eingefrorene Samenflüssigkeit kann für eine lange Zeitspanne gelagert und übertragen werden und sie kann je nach Bedarf nach dem Auftauen für eine künstliche Insemination verwendet werden.

Nachstehend wird ein künstliches Inseminationsverfahren unter Verwendung der eingefrorenen Samenflüssigkeit beschrieben.

Zur Durchführung einer künstlichen Insemination wird zuerst ein Test durchgeführt, um festzustellen, ob sich die Hündin in einer Ovulationsphase befindet. Der Ovulationsphasentest, der zur vorliegenden Erfindung gehört, wird unter Anwendung allgemein bekannter Methoden durchgeführt, beispielsweise ein Vaginalzellentest oder ein Hormontest.

Danach wird die eingefrorene Samenflüssigkeit aufgetaut durch Zugabe der eingefrorenen Samenflüssigkeit zu einer Mischung aus einer 0,3 bis 1,5 gew.-%igen Natriumchloridlösung und einer geringen Menge Hundeserum, unter Erhitzen, die Mischung wird auf eine Temperatur von 30 bis 40°C erhitzt, was vorteilhaft ist für die Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit und der Form der Spermatozoen. Obgleich die Mischung auch direkt erhitzt werden kann, ist es bevorzugt, einen luftdichten Behälter, der die Mischung aus Natriumchloridlösung und Hundesamenflüssigkeit enthält, in heißes Wasser von etwa 50°C einzutauchen und zu erhitzen, da es sehr schwierig ist, die Temperatur in geeigneter Weise zu kontrollieren.

Vor der Verwendung der auf diese Weise aufgetauten Samenflüssigkeit bei der künstlichen Insemination werden die Anzahl, die Form und die Mobilität der lebenden Sperma tozoen unter einem Mikroskop untersucht. Eine erfolgreiche künstliche Insemination hängt von der Anzahl der sich vorwärtsbewegenden Spermatozoen ab. Die Spermatozoen werden auf der Basis ihrer Mobilität in vier Klassen eingeteilt.

Die Klasse 0 steht für den Fall, bei dem die Spermatozoen ihre Schwänze bewegen, ohne sich vorwärtszubewegen, die Klasse 1 steht für den Fall, bei dem weniger als 20 % der Spermatozoen sich vorwärtsbewegen, die Klasse 2 steht für den Fall, bei dem 20 bis 50 % der Spermatozoen sich vorwärtsbewegen, die Klasse 3 steht für den Fall, bei dem 50 bis 80 % der Spermatozoen sich vorwärtsbewegen, und die Klasse 4 steht für den Fall, bei dem mehr als 80 % der Spermatozoen sich vorwärtsbewegen. Wenn die aufgetaute Samenflüssigkeit auf einen Objektträger aufgebracht und unter einem Mikroskop betrachtet wird, kann nur die Samenflüssigkeit der Mobilitätsklassen 2 oder höher für die künstliche Insemination verwendet werden.

Dann wird die aufgetaute Samenflüssigkeit in die Vagina einer Hündin eingespritzt, von der festgestellt worden war, dass sie sich in der Ovulationsphase befindet, und die Klitoris der Hünden wird massiert, um die künstliche Insemination zu vervollständigen.

Zusätzlich zu dem vorstehend beschriebenen künstlichen Inseminationsverfahren kann die aufgetaute Samenflüssigkeit auch in den Uterus der Hündin auf chirurgischem Wege injiziert werden. Das heißt mit anderen Worten, der untere Teil des Nabels wird etwa 2 cm eingeschnitten, um den Uterus anzuheben, und die Samenflüssigkeit des Hunderüden wird mittels einer Injektionsspritze direkt in den Uterus der Hündin eingespritzt. Dann werden das Peritoneum, der Abdominalmuskel und die Haut der Hündin nacheinander wieder zugenäht.

Beste Art der Durchführung der Erfindung
Diese Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, auf welche der Bereich der Erfindung jedoch keineswegs beschränkt ist.
Beispiel 1
Herstellung einer Zusammensetzung zum Einfrieren von Hundesamenflüssigkeit
Eine Mischung mit der nachstehend angegebenen Zusammensetzung bezogen auf 100 ml destilliertes Wasser, wurde unter Verwendung eines Mischers homogen durchmischt zur Herstellung der Zusammensetzung zum Einfrieren von Hundesamenflüssigkeit:

Natriumcitrat 0,35 g

Dextrose 2,5 g

Penicillin 0,02 g

Streptomycin 100 000 IU

Catalase 0,35 g

Eigelb 0,05 g

Glycerin 2 ml

Hundeserum 0,05 μg
Verfahren zum Einfrieren der Hundesamenflüssigkeit
Die Samenflüssigkeit wurde gesammelt aus einem 6 Jahre alten Schäferhund mit einem Gewicht von 43 kg durch Anwendung der Elektroschockmethode. Die Menge der gesammelten Samenflüssigkeit betrug 6,2 ml. Danach wurde die gesammelte Samenflüssigkeit mittels einer Zentrifuge getrennt, um die obere Flüssigkeit zu entfernen, wobei nur das untere Sediment zurückblieb. Das Zentrifugieren wurde 6 min lang bei 500 bis 1100 Upm durchgeführt.
Gleiche Volumenteile der auf diese Weise abgetrennten unteren Samenflüssigkeit und der auf die vorstehend beschriebene Weise hergestellten Zusammensetzung wurden bei Raumtemperatur miteinander gemischt und dann einem primären Abkühlen unterzogen.
Die Abkühlungsdauer betrug 10 bis 20 min und die Abkühlungstemperatur betrug etwa 5°C. Zu der primär abgekühlten Mischung wurde weitere Zusammensetzung zugegeben und so damit gemischt, dass das Mischungsverhältnis zwischen der Samenflüssigkeit und der Zusammensetzung, bezogen auf das Volumen, 1:2 betrug. Diese resultierende Mischung wurde dann sekundär abgekühlt bei der gleichen Temperatur und für die gleiche Zeitspanne.
Danach wurde eine vorgegebene Menge der sekundär abgekühlten Mischung mittels einer Tropfpipette entnommen und es wurden 2 bis 3 Tropfen auf die Oberfläche von Trockeneis aufgetropft. Da die Oberflächentemperatur von Trockeneis etwa –79°C beträgt, wurde die Mischung bis zu einem gewissen Grade eingefroren. Die eingefrorene Mischung wurde von dem Trockeneis getrennt und in einen Behälter eingeführt, der flüssigen Stickstoff von etwa –196°C enthielt, dieser wurde dann hermetisch versiegelt, wodurch das Einfrieren der Hundesamenflüssigkeit vervollständigt wurde.
Künstliche Insemination unter Verwendung von eingefrorener Samenflüssigkeit
Für die künstliche Insemination wurden drei 3 Jahre alte Schäferhündinnen mit einem Gewicht von 30 kg verwendet. Durch einen Vaginalzellentest wurde bestimmt, ob die Hündinnen sich in einer Ovulationsphase befanden oder nicht.
Jetzt war es erforderlich, die auf die vorstehend beschriebene Weise eingefrorene Samenflüssigkeit aufzutauen. Das Auftauen wurde so durchgeführt, dass die eingefrorene Samenflüssigkeit zu einer Mischung aus einer 0,3 bis 1,5 gew.-%igen Natriumchloridlösung und einer geringen Menge Hundesamenflüssigkeit zugegeben wurde, die Mischung auf eine Temperatur von 38°C erhitzt wurde und dann 5 h lang stehen gelassen wurde.
Vor der Verwendung der aufgetauten Samenflüssigkeit für die künstliche Insemination wurde dann die Mobilität der lebenden Spermatozoen geprüft, indem die aufgetaute Samenflüssigkeit auf einen Objektträger aufgebracht und unter einem Mikroskop betrachtet wurde. Die erfolgreiche künstliche Insemination hängt von der Anzahl der sich vorwärtsbewegenden Spermatozoen ab. Der Prozentsatz der sich vorwärtsbewegenden Spermatozoen betrug etwa 85 %, was für eine künstliche Insemination geeignet war.
Danach wurde die aufgetaute Samenflüssigkeit in drei Portionen aufgeteilt und dann in die Vaginas von Hündinnen, bei denen zuvor festgestellt worden war, dass sie sich in einer Ovulationsphase befanden, injiziert. Dann wurde die Klitoris jeder Hündin 5 min lang massiert, um die künstliche Insemination zu vervollständigen.
Einen Monat nach Beendigung der künstlichen Insemination wurde ein Trächtigkeitstest durchgeführt und es zeigte sich, dass alle drei Hündinnen trächtig waren. Später warfen die drei Hündinnen 4, 6 bzw. 9 gesunde Welpen.
Beispiel 2
In diesem Beispiel wurde die Zusammensetzung zum Einfrieren von Hundesamenflüssigkeit auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 hergestellt, jedoch mit der Ausnahme, dass 0,02 μg Hundeserum verwendet wurden.
Anschließend wurden das Einfrieren der Hundesamenflüssigkeit und die künstliche Insemination unter Verwendung der Zusammensetzung nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.
Bei dieser Ausführungsform wurden ein 5 Jahre alter Schäferhundrüde mit einem Gewicht von 40 kg und drei 3 Jahre alte Schäferhündinnen mit einem Gewicht von 25 kg, 30 kg und 28 kg verwendet.
Das Mobilitätstestergebnis der aufgetauten Samenflüssigkeit zeigte, dass der Prozentsatz der sich vorwärtsbewegenden Spermatozoen 60 % betrug, was ein für die künstliche Insemination geeigneter Zustand war.
Einen Monat nach Beendigung der künstlichen Insemination wurde ein Trächtigkeitstest durchgeführt und es zeigte sich, dass zwei Hündinnen trächtig waren. Später warten die beiden Hündinnen 5 bzw. 6 gesunde Welpen.
Vergleichsbeispiel 1
In diesem Vergleichsbeispiel wurde die gleiche Zusammensetzung zum Einfrieren von Hundesamenflüssigkeit wie in Beispiel 1 hergestellt und die Hundesamenflüssigkeit wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 eingefroren, jedoch mit der Ausnahme, dass das Volumenverhältnis zwischen der Zusammensetzung und der Hundesamenflüssigkeit 1:1 betrug. Die Hundesamenflüssigkeit wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 unter Verwendung des gleichen Hunderüden gesammelt.
Die eingefrorene Samenflüssigkeit wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 aufgetaut und es wurde die Mobilität der Spermatozoen in der aufgetauten Samenflüssigkeit getestet.
Das Testergebnis zeigt, dass der Prozentsatz der Spermatozoen, die sich vorwärtsbewegten, weniger als 20 % betrug, ein Wert, der für eine künstliche Insemination nicht geeignet ist.
Vergleichsbeispiel 2
In diesem Vergleichsbeispiel wurde die gleiche Zusammensetzung zum Einfrieren von Hundesamenflüssigkeit auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 hergestellt, jedoch mit der Ausnahme, dass kein Hundeserum in der Zusammensetzung enthalten war. Die Einfrier- und Auftau-Verfahren waren die gleichen wie in Beispiel 1 und die Hundesamenflüssigkeit wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 gesammelt unter Verwendung des gleichen Hunderüden.
Der Mobilitätstest der in diesem Beispiel eingefrorenen und aufgetauten Spermatozoen zeigte, dass sich die Spermatozoen nur mit ihren Schwänzen bewegten, ohne sich vorwärtszubewegen, was für eine künstliche Insemination nicht geeignet ist.
Wie vorstehend beschrieben, betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Einfrieren von Hundesamenflüssigkeit, die wegen der Besonderheit der Spermatozoen der Hundesamenflüssigkeit für eine Lagerung schwierig einzufrieren ist, und die darin verwendeten Zusammensetzungen. Die Hundesamenflüssigkeit kann daher im eingefrorenen Zustand gelagert werden, wodurch ein Hund einer guten Rasse aufrechterhalten werden kann. Außerdem kann die eingefrorene Hunderüdensamenflüssigkeit für eine künstliche Insemination zu einem geeigneten Zeitpunkt und an einem geeigneten Ort verwendet werden, wodurch eine Erhöhung der Geburtsrate ermöglicht wird.

Claims

Verfahren zum Einfrieren einer Hundesamenflüssigkeit, das die Stufen umfasst: (a) Sammeln von Hunderüdensamenflüssigkeit unter Anwendung einer Massagemethode oder Elektroschockmethode; (b) Zentrifugieren der gesammelten Samenflüssigkeit, um die obere Flüssigkeit abzutrennen und zu entfernen, wobei nur die untere Samenflüssigkeit zurückbleibt; (c) Mischen von gleichen Volumenteilen der unteren Samenflüssigkeit und einer Zusammensetzung, die, bezogen auf 100 ml destilliertes Wasser, umfasst: 0,25 bis 4,5 g Natriumcitrat, 0,45 bis 4,0 g Dextrose, 0,01 bis 0,3 g Penicillin, 50 000 bis 500 000 Internationale Einheiten (IU) Streptomycin, 0,25 bis 0,45 g Catalase, 0,045 bis 0,25 g Eigelb, 1,5 bis 15 ml Glycerin und 0,02 bis 0,1 μg Hundeserum, und primäres Abkühlen der Mischung auf etwa 5°C; (d) weitere Zugabe der Zusammensetzung zu der in der Stufe (c) erhaltenen Mischung, um das Volumenverhältnis von Samenflüssigkeit zu der Zusammensetzung auf 1:2 zu verringern, und sekundäres Abkühlen der resultierenden Mischung auf etwa 5°C; und (e) Eintauchen der in der Stufe (d) erhaltenen Mischung in flüssigen Stickstoff und Einfrieren der Mischung.
Verwendung der nach dem Verfahren nach Anspruch 1 eingefrorenen Hundesamenflüssigkeit zur künstlichen Insemination von Hunden.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei die künstliche Insemination von Hunden die Stufen umfasst: (a) Prüfen, ob eine geeignete Ovulationsphase einer Hündin vorliegt, zur Verbesserung der Fertilitätsrate; (b) Zugabe der nach dem Verfahren nach Anspruch 1 hergestellten eingefrorenen Samenflüssigkeit zu einer Mischung aus einer 0,3 bis 1,5 gew.-%igen Natriumchloridlösung und Hundeserum, die auf eine Temperatur von 30 bis 40°C erhitzt ist, und Auftauen der Samenflüssigkeit; (c) Bestimmung der Mobilität der Spermatozoen in der aufgetauten Samenflüssigkeit unter einem Mikroskop; und (d) Injizieren der aufgetauten Samenflüssigkeit in die Vagina einer Hündin und Massieren der Klitoris der Hündin.