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Es ist allgemein bekannt, dass beim Fortpflanzungsprozess der höheren Tiere einschliesslich des Menschen nahezu die gleiche Anzahl männlicher und weiblicher Spermzellen vorhanden ist. Dies hat zur Folge, dass im allgemeinen eine nahezu gleiche Anzahl männlicher und weiblicher Nachkommen aus dem Fortpflanzungsprozess der Bevölkerung der gesamten Arten resultiert.
Dieses natürlich eintretende Verhältnis ist oftmals nachteilig. Zum Beispiel hängt bei einem Rindviehbestand notwendigerweise die Milchmenge von den weiblichenRindem (oder Kühen), den alleinigen Milchgebern, ab. Das männliche Rind ist allein zur Erhaltung der Art erforderlich.
In der Fleischwirtschaft sind anderseits als Nachkommen von Rindern in erster Linie männliche Tiere bevorzug. Das ist darauf zurückzuführen, dass das männliche Rind im allgemeinen als das beste und meistgefragte Rindfleischprodukt angesehen wird. Ein Interesse für weibliche Nachkommen besteht nur in dem Umfang, wie diese zur Zucht von Nachkommen erforderlich sind und um die Menge an Rindfleisch zu beschaffen, die als Nahrung für Menschen benötigt wird und um die Erhaltung der Art zu gewährleisten.
Ein weiteres Beispiel, das es notwendig und möglich macht, die Erfindung in die Praxis umzusetzen, betrifft die Nachfrage nach mehr weiblichen als männlichen Kaninchen, Diese weiblichen Kaninchen werden bei dem bekannten Ascheim-Zondeik Schwangerschaftstest, der mit und für Menschen benutzt wird, verwendet.
Es ist seit langem bekannt, dass lebende Spermzellen zu einem gewissen Grad in der einen oder der andern Weise elektrisch geladen sind und somit durch Elektrophorese konzentriert, aber nicht scharf getrennt werden können gemäss ihres geschlechtsbestimmendenCharakters. Die Wanderung der lebenden Spermzellen unter dem Einfluss eines elektrischen Gleichstromfeldes kann durch mikroskopische Prüfung beobachtet werden. Eine derartige Beobachtung zeigt, dass es zwei verschiedene Arten von Spermzellen gibt :
1. Anoden-orientierte oder
2. Kathoden-orientierte Spermzellen.
Einige Forscher haben auf diesem Gebiet bereits Berichte und Aufsätze veröffentlicht. Als besonders erwähnenswert seien hier folgende Veröffentlichungen genannt :
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690 bis 722 ; 6 [1937], S, 1235 bis 1250 ;
Bull. Acad. Sci. U. R. S. S., Ser. Biol., [1940], S, 426bis 455 ;
Compt. Rend. Acad. Sci. U. R. S. S. 26 [1940], S. 692 bis 697 ;
Z. Tierzucht Züchtungsbiol. 50 [1941], S. l bis 15 und 16 bis 23 ;
Uspekhi Sovremennoi Biol. (Moskau) 28 [1949], S. 211 bis 225 ;
A. A. Siljander, Sbomik Trudov Zootek. Kaf. s h. Skol.
Kirov., [1936], S. 148 bis 166 ; und M. J. Gordon, Proc. Nat. Acad. Sci. 43 [1957], S. 913 bis 918.
Die vorstehenden Veröffentlichungen zeigen, dass durch die Trennung der Spermzellen durch eine Elektrophorese ausgewählte fraktionierte Proben der Spermzellen entsprechend ihrer positiven oder negativen elektrischen Ladung erhalten werden, wodurch man den Anteil des einen oder andern Geschlechts in den Nachkommen erhöhen kann.
Das bekannte elektrophoretische Verfahren bringt die Erscheinung mit sich, dass die geladenen Spermzellen von einer zweckmässig geladenen Elektrode angezogen und in einer umgebenden Kammer konzentriert werden. Um als Elektrode wirken zu können, muss das Material, aus dem sie besteht, Elektrizität besser leiten als Materialien, die als "Nicht-Leiter" oder "Halb-Leiter" bezeichnet werden. Diese Materialien haben im allgemeinen einen Widerstand von weniger als 10-"Ohm cm, oder, um es anders auszudrücken, eine Leitfähigkeit von mehr als 10 Ohm-l cm*.
Bekannte elektrophoretische Behandlungen erfordern die Behandlung der hochempfindlichen Spermzellen über Zeiträume von hinlänglicher Dauer und unter solchen Bedingungen, dass die Ergebnisse oftmals schädlich oder sogar tödlich für die Spermzellen sind.
Teilweise ist dies darauf zurückzuführen, dass sich die Spermzellen ziemlich langsam bewegen, verglichen mit den ungeheuren Entfernungen, die bei ihrer Wanderung erforderlich sind.
Dies hat zur Folge, dass die elektrophoretische Zelle derart gestaltet sein muss, dass die Elektrodenkammer über genügend Raum verfügt, um eine brauchbare Probenmenge zu halten. Dies erfordert einen beträchtlichen Abstand zwischen den Elektroden der Zelle mit der sich daraus ergebenden Unmöglichkeit, dass die Elektrode den gesamten oder nahezu gesamten Raum des Inhalts der Vorrichtung durchdringt.
Es ist somit klar, dass bei der Elektrophorese die lebenden Spermien beträchtliche Entfernungen in Relation zu ihrer Grösse und der Geschwindigkeit, mit der sie sich bewegen können, zurücklegen müssen.
Wenn man all diese notwendigen Faktoren berüchsichtigt, erfordert das bekannte elektrophoretische Trennverfahren eine lange Behandlungszeit. Dies ist der Fall trotz der Tatsache, dass Spermien eine relativ kurze Lebensdauer besitzen. Weiterhin muss auch die Wirkung des bekannten Verfahrens in Betracht gezogen werden, die allein von den natürlich vorkommenden Ladungsunterschieden zwischen den Spermien abhängt und eine Menge nicht geeigneter, gefährdender Bedingungen mit sich bringt, die die Wirksamkeit des bekannten Trennverfahrens beeinträchtigt, um die Möglichkeiten des Überlebens der Spermien zu verbessern.
Es ist weiterhin bekannt, dass Spermzellen unterschiedliches Gewicht haben, was unter anderem von der Menge ihrer genetischen Bestandteile abhängig ist.
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Die bedeutendste Abweichung ist die Anzahl der genetischen Bestandteile zwischen den X-Chromosomen (die weiblich bestimmend sind) und den Y-Chromosomen (die männlich bestimmend sind). Was das Gewicht anbelangt, so geht aus der Literatur hervor, dass mit etwa 87, 5%iger Wahrscheinlichkeit ein zufällig gewähltes weiblich-bestimmendes Sperma schwerer ist als ein zufällig gewähltes männlich-bestimmendes Sperma.
Dies ist die Basis, von der die Spermientrennverfahren, die anders als die Erfindung sind, abhängen, wie die herkömmliche Sedimentation, Zentrifugierung und ähnliche Verfahren,
Da, wie vorstehend bereits beschrieben, das Gewichtsverhältnis zwischen männlichen und weiblichen
Spermzellen nicht vollkommen ist und die äusserste Gewichtsgrenze, die in der Literatur erwähnt wird, nur bei etwa 6, 21o liegt, beschränken derartige geringe Unterschiede die Wirksamkeit und Wirkungskraft der bekannten Verfahren in ihrer Fähigkeit, Spermzellen nach ihrem geschlechtsbestimmenden Charakter zu trennen, Auch hier, wie bei der bekannten Elektrophorese, müssen lange und/oder gründliche Einwirkungen auf die Spermzel- len ausgeübt werden, was beides schädlich ist.
In der Tat sind diese Verfahren manchmal, wie bereits erwähnt wurde, lebensgefährlich für die Spermien.
Ungeachtet der Nachteile, die bei den bekannten Verfahren zur Trennung von Spermien nach ihren geschlechtsgebundenen Merkmalen entstehen, waren die Ergebnisse manchmal verhältnismässig annehmbar. Zum Beispiel zeigt die bereits angeführte Untersuchung nach Gordon, dass bei Anwendung eines bekannten Elektrophoreseverfahrens bei 167 Geburten von Kaninchen in 31 Würfen das Geschlecht des Nachwuchses 113mal vorherbestimmt war. Demzufolge betrug das Erfolgsverhältnis etwa 67, 7%.
Aufgabe der Erfindung ist die verbesserte Vorherbestimmung des Geschlechts bei der Fortpflanzung von Säugetieren, einschliesslich des Menschen.
Eine weitere und wichtigeAufgabe der Erfindung ist ein neues und verbessertesVerfahren zur Vorherbestimmung des Geschlechts des tierischen Nachwuchses auf Grund der unterschiedlichen elektrischen Ladung eines geschlechtsbestimmenden Sperms im Vergleich zu dem andern, Dieses neue Verfahren hat nicht die vorstehend angegebenen Nachteile der bereits bekannten Verfahren.
Weiterhin richtet sich die Erfindung auf ein leichtes, wirksames Mittel zur Vorherbestimmung des Geschlechtes des Nachwuchses tierischer Vorfahren vor der Empfängnis.
Ferner richtet sich die Erfindung auf ein Mittel zur künstlichen Besamung, wobei das Geschlecht des entstehenden Nachwuchses kontrolliert werden kann.
Die Erfindung richtet sich weiterhin auf ein neues und verbessertesVerfahren zurTrennung lebender Spermzellen auf Grund ihrer verschiedenen Wechselwirkung gegenüber elektrostatisch geladenen Materialien.
Ferner richtet sich die Erfindung auf Mittel zur Trennung lebender Spermzellen in Fraktionen, die verschieden in bezug auf ihren geschlechtsbestimmenden Charakter sind.
Weiterhin richtet sich die Erfindung auf ein Verfahren, bei dem ein weibliches Wesen mit Spermzellen besamt wird, wobei die Spermzellen im Hinblick auf ihren geschlechtsbestimmenden Charakter getrennt worden sind.
Eine weitere bedeutsame Aufgabe der Erfindung besteht darin, von einer Probe von Samenflüssigkeit einen Teil der sich darin befindenden Spermien in Abhängigkeit von ihrem geschlechtsbestimmenden Merkmal abzutrennen ; die ursprüngliche Probe für eine künstliche Besamung zu verwenden und den abgetrennten Teil der Spermien in eine zweite flüssige Probe umzuwandeln und für eine zweite getrennte künstlicheBesamung zu verwenden.
Weiterhin richtet sich die Erfindung auf ein Verfahren, das die Trennung der lebenden Spermzellen in Fraktionen gemäss ihrem geschlechtsbestimmenden Charakter erleichtert.
Eine weitere und ebenfalls bedeutungsvolle Aufgabe der Erfindung ist dieEntfernung aller Spermzellen von einem behandelten Stoff oder Raum.
Gemäss der Erfindung können dieseAufgaben gelöst und die lebenden Spermzellen zumindest der Säugetiere nach ihrem geschlechtsbestimmenden Merkmal durch ein Verfahren getrennt werden, das im wesentlichen eine geeignete Behandlung der Spermien mit einer ausgewählten Art elektrisch geladener Teilchen in Form von Makromolekülen, Folien, Fasern, Teilen oder Agglomeraten oder Mischungen davon erfordert.
Das erfindungsgemässe Verfahren zum Behandeln eines flüssigen Mediums, das lebende Spermien insbesondere von Säugetieren, wie Rindern, enthält, die zum Teil eine positive, zum Teil eine negative Gesamtladung haben, wobei die Spermien mit Ladung der einen Polarität bewegungsunfähiggemacht werden und die Spermien mitladung der entgegengesetzten Polarität nicht bewegungsunfähig gemacht werden, ist dadurch gekennzeichnet, dass man das die lebenden Spermien enthaltende flüssige Medium der Einwirkung eines Mittels, das eine elektrische Ladung einer Polarität besitzt, unterwirft, um Spermien entgegengesetzter Ladung an dieses Mittel zu binden und sie dadurch im flüssigen Medium bewegungsunfähig zu machen und dass gegebenenfalls noch ein magnetisches oder magnetisierbares Mittel zugesetzt wird,
wobei die bewegungsunfähig gemachten Spermien abgetrennt und gegebenenfalls anschliessend wieder bewegungsfähig gemacht werden.
Obwohl keineswegs beabsichtigt ist, die Erfindung durch eine bestimmte Erklärung oder Theorie einzuschränken, hat es den Anschein, dass die lebenden Spermzellen nach dergeschlechtsgebundenen elektrischen Ladung durch ausgewählte elektrostatische Anziehung abgetrennt werden.
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Die Wechselwirkung zwischen einem Teil der Spermienpopulation und dem Behandlungsmaterial hat zur Folge, dass dieser Teil der Spermien zumindest gehindert, wenn nicht sogar gänzlich unbeweglich gemacht wird, so dass er sich nicht einem Ei nähern und dieses befruchten kann.
Es kann sich deshalb nur der andere, durch die Behandlung nicht beeinträchtigte Teil der Spermzellen ungehindert dem Ei nähern, um eine Befruchtung herbeizuführen.
Vorausgesetzt, die Lehre von Schroeder und Gordon ist richtig, dass männlich-bestimmende Spermien positiv und umgekehrt, weiblich-bestimmende Spermien negativ geladen sind, so kann, nachdem der pH-Wert der die Spermien enthaltenden Flüssigkeit so eingestellt ist, dass zwei statt nur einer Spermpopulation anwesend sind (d. h. eine, in der das männlich-bestimmende Sperma eine positive Ladung hat und das weiblich-bestimmende eine negative Ladung hat), ein positiv elektrostatisch geladenes Behandlungsmaterial verwendet werden, um die negativ-geladenen weiblich-bestimmenden Spermien zumindest zu behindern (wenn nicht ganz unbeweglich zu machen).
Umgekehrt kann, wenn weiblicher Nachwuchs gewünscht wird, ein negativ elektrostatisch-geladenes Behandlungsmaterial verwendet werden, wobei die männlich-bestimmenden Spermzellen in ihrem Versuch, das Ei zu befruchten, benachteiligt werden. Vissolonovy, loc. cit., kam zu der Überzeugung, dass die bei den von ihm erwähnten Versuchen verwendeten männlich-bestimmenden Spermien eine negativ elektrische Ladung und weiblich-bestimmende Spermien eine positiv elektrische Ladung besitzen. Da der Sinn der Ladung auch von dem PH-Wert des die Spermien enthaltenden Mediums abhängt, kann über den Sinn der Ladung von männlichoder weiblich-bestimmenden Spermien für irgendeine gegebene Art aus den erhältlichen Daten der Literatur keine allgemein gültige Feststellung gemacht werden.
Um jedoch die Erfindung durchführen zu können, ist nur ein einfacher Versuch notwendig, um den elektrischen Ladungssinn für irgendeine gegebene Art zu ermitteln.
In andern Worten ausgedrückt sieht die Erfindung vor, dass lebende Spermzellen in verschiedene Populationen geteilt werden können mit Hilfe der geschlechts-gebundenen Unterschiede in ihrer Wechselwirkung mit Behandlungsmitteln, die elektrostatisch geladene Materialien enthalten.
Dieses Verfahren kann durch sorgfältiges Inberührungbringen der Spermzellen mit diesen Behandlungsmitteln durchgeführt werden, so dass die Spermzellen, die mit dem elektrostatisch geladenen Behandlungsmittel in Wechselwirkung treten, behindert bzw. immobilisiert werden. Die sich ergebende Wechselwirkung dieses Teils der Spermzellen bringt sie in ihrem Versuch, sich dem Ei zu nähern und es zu befruchten, in eine ungünstige Lage.
Daher sind nur die Spermien, die nicht mit dem elektrostatisch geladenen Behandlungsmittel in Wechselwirkung treten, in der Lage, sich dem Ei zu nähern und es zu befruchten.
Da die Neigung der Spermien, mit dem elektrostatisch geladenen Behandlungsmittel in Wechselwirkung zu treten, von ihrem geschlechts-bestimmenden Merkmal abhängt, trennt dieses Verfahren die Spermien in Fraktionen nach ihrem geschlechts-bestimmenden Merkmal. Da die Menge dieser Einzelverbindungen, Makromoleküle, Polyelektrolyte usw., die für die Behandlung der Samenflüssigkeit benutzt werden, eine sehr grosse Anzahl individueller Einheiten enthalten oder eine grosse Berührungsoberfläche anbieten, kann dasBehandlungsmittel den gesamten vorhandenen Raum beinahe so leicht oder in manchen Fällen sogar leichter, als es die lebenden Spermien können, durchdringen, so dass die anwesenden Spermien dem Ausleseverfahren nach dieser Erfindung unterworfen werden.
Dies steht im deutlichen Gegensatz zu der schwierig durchgeführten Wanderung der Spermien zu dem Behandlungsmittel, wie es in bekannten Verfahren beschrieben wurde.
Bei der praktischen Durchführung der Erfindung wird anfänglich in Übereinstimmung mit den bekannten Verfahren männliche Samenflüssigkeit erhalten. Das Verfahren zur Trennung oder selektiven Immobilisierung der Spermzellen oder zur Desaktivierung der gesamten Spermpopulation kann durch einfaches Mischen oder Inberührungbringen des die Spermien enthaltenden Mediums mit den ausgewählten positiv-und/oder negativgeladenen Behandlungsmitteln durchgeführt werden.
Auf diese Weise kann das Behandlungsmittel, das ein Feststoff, eine Flüssigkeit, ein Gel oder eine Disper-
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Gewebe, ein Netz oder eine andere Form an sich, sein kann. Das Behandlungsmittel kann in einem Bett, einer Kolonne oder einer ähnlichen physikalischen Anordnung angeordnet sein oder auch elektrisch geladen sein durch eine äussere Quelle. Ferner kann es als Granulat, Packungsgitter, Filter, als poröser oder kompakter Träger oder, weiterhin, in Form von Cremes, Gelen, Gelees, Salben od. dgl. vorliegen. Es ist bei der Durchführung der Erfindung auch möglich, behandeltes Samenmaterial oder das Behandlungsmittel in Form einer Dusche oder in irgendeiner vorgefertigten oder beliebigen Form anzuwenden, die einen hinreichenden Kontakt zwischen dem elektrostatisch geladenen Behandlungsmittel und den Spermien gewährleistet.
Dieses Behandlungsverfahren kann bei Spermien aller Tiere, bei denen die Spermien einen geschlechts-bestimmenden Charakter besitzen, angewendet werden. Dies trifft ebenfalls für Menschen zu. Sogar bei so einfachen Tieren wie dem Seeigel werden befriedigende Ergebnisse bei der Durchführung der Erfindung erzielt.
Hauptsächlich und am meisten anwendbar ist aber die Erfindung für und bei höheren Gattungen von Tieren, besonders Säugetieren und ganz besonders höheren Gattungen von Säugetieren.
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Die Spermien können in Form von natürlicher Samenflüssigkeit oder als eine geeignete verdünnte Samenflüssigkeit oder sogar als eine geeignete konzentrierte Samenflüssigkeit behandelt werden.
Die mikroskopische Prüfung der die Spermien enthaltenden Flüssigkeiten, die nachdem Verfahren der Er- findung behandelt wurden, offenbart, dass Teile der Spermpopulation durch das elektrostatisch geladene Behandlungsmittel, das bei der Durchführung der Erfindung verwendet wird, angegriffen werden. Mikroskopisch gesehen scheinen Teile der Spermien relativ ungehindert zu sein, während andere in ihrem Kurs gehindert und gehemmt werden. Es wurde beobachtet, dass einige sich in Form von Trauben bewegen ; andere änderten sich morphologisch, so dass ihre Fortbewegung gehindert wurde ; wieder andere wurden durch anhaftende Bestandteile belastet, wie z. B. durch andere bewegungsfähige und/oder unbewegliche Spermien.
Die durch das Behandlungsmittel beeinträchtigten Spermien können, wenn erwünscht, beseitigt werden, indem man sie durch das Behandlungsmaterial hindurchsickern lässt, durch Filtrieren, Ablagern, Schweben, Abgiessen usw. Es können auch hochentwickelte Mittel verwendet werden, wie z. B. solche, die die Verwendung magnetischer oder elektrostatischer Analogen des"Photomultipher"-Effekts beinhalten. Die behandelte Spermien-enthaltende Flüssigkeit wird dann natürlich dazu verwendet, um ein weibliches Wesen in Übereinstimmung mit für diesen Zweck bekannten Verfahren künstlich zu befruchten.
In manchen Fällen mag es alternativ zulässig sein, eine Paarung auf normale Art und Weise durchzuführen. In solchen Fällen werden die Scheide und die Gebärmutter mit dem Behandlungsmittel gespült, das ein oder mehrere elektrostatisch geladene Materialien der nachfolgend beschriebenen Art enthält.
Dies wird vorzugsweise unmittelbar vor der Paarung ausgeführt, so dass das Hindern der Spermien, die Chromosome des unerwünschten Geschlechts tragen, zur Folge hat, dass eine Befruchtung des Eis durch unerwünschte geschlechtsbestimmende Spermien verhütet wird,
Wenn die Spermzellen nach dem Verfahren der Erfindung behandelt werden, wobei eine besondere Trennmassnahme nicht notwendig ist, ist es wünschenswert, aber nicht unbedingt erforderlich, den Vorteil des PHWechsels, der Pufferung usw. auszunutzen, der bei den Spermien eingetreten ist, um so die Unbeweglichkeit der Spermzellen zu vergrössern, die den unerwünschten geschlechts-bestimmenden Charakter besitzen.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele noch näher erläutert : Beispiel l : Eine Krebs-Henseleit-Ringer ("KHR")-Puffer-Lösung wurde hergestellt, indem man die erforderlichen Komponenten der Lösungen im folgenden Verhältnis mischt :
100 ml einer 0, 90 gew.-l igen Natriumchloridlösung, 4 ml einer 1, 15 gew.-' igen Kaliumchloridlösung, 1 ml einer 2, 11 gew.-%igen Kaliumphosphat- (monobasisch)-Lösung, 1 ml einer 3, 82 gew. -%igen Magnesium- sulfat- (heptahydrat) -Lösung und 2 ml einer 1, 30 gew. -%igen Natriumbicarbonatlsung. Zu je 100 ml wurden 0, 5 g Fructose und 0, 1 g Gelatine hinzugegeben.
Eine 2 gew, -%ige Lösung von Poly- (vinylbenzyl trimethylammoniumchlorid) wurde hergestellt und verdünnt auf 0, 4 Gew,-% mit der KHR-Puffer-Lösung. Natürliche Stiersamenflüssigkeit, die lebende Spermien enthält, wurde in einem 1 : 1 Volumenverhältnis mit der KHR-Puffer-Lösung verdünnt. Je ein Tropfen davon wurde dann auf zwei mikroskopische Objektivträger gegeben. Zu einem davon wurde die obige Lösung aus Poly- (vinylbenzyltrimethylammoniumchlorid) in einer Menge, die an 6, 3 mm an der Spitze einer Seziernadel heftete, hinzugegeben. Deckgläser wurden über die Vertiefungen eines Objektivträgers mit zwei Vertiefungen gegeben und es wurden bei 600facher und 900facher Vergrösserung Prüfungen durchgeführt.
Die behandelte Probe enthielt sowohl ausgeflockte (d. h. immobilisierte oder behinderte) als auch unberührte, lebende bewegliche Spermzellen ; beide zeigten eine selektive Trennung der Spermzellen gemäss ihrer elektrischen Ladung.
In dem Vergleichsteil, der im wesentlichen unverändert war, konnten einzelne, bewegliche lebende Spermzellen beobachtet werden.
In einem gleichen Versuch wurde die Ausflockung der negativ geladenen Teile der Spermzellenpopulation durch ein Polykation in einem doppelten Reagenzprobeglas durchgeführt. Die überstehende Flüssigkeit in der behandelten Probe wurde entfernt und die Prüfung bei 600facher Vergrösserung zeigte, dass Teile der Spermpopulation tatsächlich lebend, beweglich und frei (aber natürlich) in verringerter Anzahl vorhanden waren. Die Vergleichsprobe zeigte keinen Unterschied gegenüber dem Original.
Ähnliche und gleichwertige Ergebnisse wurden erhalten, wenn so verschiedene positiv-geladene Ionenaustauscherharzpulver verwendet wurden wie :
Polyvinylpyridin, quaternisiertes Polyvinylpyridin, andere poly elektrolytische Reaktionsprodukte aus Vinylidenbenzylchlorid oder Vinylidenbenzylbromid mit nucleophilen Reagentien, Vinylpyrrole, Vinylpyrrolidone, Vinyloxazolidinone, Polyäthylenimin, polyelektrolytische Reaktionsprodukte von nucleophilen Reagentien mit
EMI4.1
(vinylidenaromatischen Verbindungen), positiv-geladeneDesgleichen wurde eine Ausflockung durchgeführt, bei der man Stiersamen mit Poly- (vinylbenzyltrimethylammoniumchlorid) verwendete, worin die Trennung der anfangs vorhandenen beiden negativ-geladenen und positiv-geladenen Spermpopulationen nach dem Verfahren der Erfindung bei einem PH von etwa 7,
28 und einer Konzentration von 1000 TpM erfolgte.
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Beispiel 2 : Ein 0, 5 gew.-iges sulfoniertes Polystyrol, hergestellt nach dem Verfahren von H. H. Roth in Ind. Eng. Chem., 49 [1957], S. 1820 und folgende, dessen PH-Wert durch Zugabe von Natriumhydroxyd auf etwa 7, 1 eingestellt wurde, wurde zur Behandlung von Samenflüssigkeit, verdünnt 1 : 2 mit KHR-Puffer, wie in Beispiel 1 beschrieben, in der Vertiefung eines Objektivträgers mit zwei Vertiefungen verwendet, Die andere Vertiefung enthielt unbehandelte Samenflüssigkeit gleicher Konzentration.
Das Mischen der behandelten Probe ergab eine partielle Klumpenbildung oder Anhäufung der Spermien,
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Bei einem weiteren Versuch wurden zu 2 ml der 1 : 2 verdünnten Samenflüssigkeit ungefähr 1 Tropfen der oben beschriebenen Lösung von sulfoniertem Polystyrolsalz gegeben. Nach 15 min ergab sich durch partielle Klumpenbildung die Ausbildung eines Niederschlages, Die mikroskopische Untersuchung der überstehenden Flüssigkeit zeigte viele unausgeflockte bewegliche lebende Spermzellen.
Bei einem ähnlichen Versuch wurde ein sulfoniertes Polystyrolionenaustauscherharz zu einem feinen Pulver zerkleinert und als Behandlungsmittel für Spermien in einer Vertiefung eines Objektivträgers für Kulturen mit zwei Vertiefungen verwendet, Die Untersuchung bei 600facher und 900facher Vergrösserung zeigte, dass in der behandelten Menge die Oberfläche des Ionenaustauscherharzes teilweise mit anhaftenden Spermzellen bedeckt war ; ausserdem befand sich dort etwa eine gleiche Anzahl nicht verfestigter, beweglicher lebender Spermzellen.
Es konnte beobachtet werden, dass Spermzellen sich den Harzteilchen nähern, zurückgetrieben werden und in manchen Fällen sich fortbewegen. In andern Fällen werden sie nicht zurückgetrieben, sondern haften an den Harzteilchen. Dadurch wird in sichtbarer Weise die Wirkung der Erfindung demonstriert, da im Mikroskop beobachtet werden kann, wie die Spermien mit einer Ladung, die entgegengesetzt zu der des Harzes ist, immobilisiert werden.
Das Verfahren ist infolgedessen geeignet, um Spermzellen nach ihrem geschlechts-bestimmenden Merkmal zu trennen. In der unbehandeltenProbe können nur einzelne bewegliche Spermien beobachtet werden. Eine andere Beobachtung einer Probe offenbart die Anwesenheit von Spermien, die feine Teilchen von Ionenaustauscherharz am Kopf, Schwanz oder beidem kleben haben.
Diese Spermien können sich nur mit Schwierigkeit bewegen,
Auf ähnliche Art und Weise lässt die gleiche Samenflüssigkeit, behandelt mit Poly- (maleinanhydrid), hergestellt nach der Methode beschrieben im Journal of Polymer Science, Bd. 55, Heft 162 [1961], S. 31 bis 32, in 0, 5 gew.-%iger Lösung mit einem auf 7, 1 eingestellten pH-Wert mit Natriumhydroxyd (unter Ausflockung der positiv-geladenen Spermpopulation) negativ-geladene Spermien frei, damit sie sich dem Ei nähern und es befruchten können, wie es 100fach und 600fach vergrössert unter dem Mikroskop beobachtet wurde,
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werden Poly- (acrylsäure),Beispiel 3 :
Dieses Beispiel, in dem die"in vitro"Spermienbehandlung und die künstliche Besamung verwendet werden, ist darauf ausgerichtet, ein verbessertes Erfolgsverhältnis bei der Vorbestimmung weiblichen Kaninchennachwuchses zu zeigen. Dies steht in Verbindung mit der Lehre von Siljander, Sbornik Tradov Zooteck, Kaf. s. h. Skol, Kirov, [1936], S. 148 bis 166, die fanden, dass die zur Kathode wandernden Spermien dazu verwendet werden können, einen überwiegenden Teil männlichen Nachwuchses zu produzieren, während die zur Anode wandernden Spermien ein Geschlechtsverhältnis ergeben, das nicht bedeutend unterschiedlicher ist als das der Kontrollversuche (M. J.
Gordons Behauptung in Sachen Siljander, loc, cit, )
Da es wesentlich schwieriger ist, mit Hilfe der bekannten Verfahren weiblichen Nachwuchs zu erhalten, besteht die anspruchsvollste Prüfung des neuen Verfahrens darin, dass man seine Fähigkeit zeigt, bevorzugt weiblichen Kaninchen-Nachwuchs zu bewirken, Die Besamungen wurden mit Hilfe "starker" Polyelektrolyte ausgeführt, d. h, mit solchen Gruppen darin, die über im wesentlichen den gesamten pH-Bereich ionisiert wurden.
Für die Kontrollversuche wurde die natürliche Besamung verwendet, Bei zwei weiblichen Kaninchen bestand der Wurf aus vier weiblichen und drei männlichen bzw. fünf weiblichen und vier männlichen Nachkommen. Das Geschlecht wurde durch die mikrobiologische Methode bestimmt, die auch Gordon benutzte, wie es in Proceedings of the National Academy of Science, Bd. 43 [1957], S, 914 bis 917, beschrieben wurde. Die Literatur gibt einen Wert von etwa 106 männlichen zu 100 weiblichen Nachkommen für das Kaninchen-Geschlechts-Verhältnis bei der Geburt an.
Für die künstliche Besamung mit Spermien, die mit dem Verfahren nach der Erfindung behandelt wurden, wurde der Samen eines männlichen Kaninchens gesammelt mit Hilfe des Verfahrens von C. Mac Irons und A,Walton,J,Agri, Sci., 28 [1938], S, 122, Der Samen wurde im Verhältnis 1 :
1 mit elektrostatisch geladenem Behandlungsmittel nach der Erfindung behandelt, nachdem er mit isotonischem Verdünnungsmittel (0, 851o Na- tnumchloridäquivalent) auf einen eingestellten pH-Wert verdünnt wurde, und bis zum Verbrauch im Kühlschrank aufbewahrt,
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Das weibliche Kaninchen wurde vorbereitet, indem man einem vasectonisierten männlichen Kaninchen erlaubte, es für einige Stunden zu stimulieren, bevor es besamt wurde, oder mit schleimigen luteinisierten Hormonen. Es wurde entweder mit 1, 2 ml einer lOoigen Lösung aus Natriumisoamyläthylbarbiturat betäubt oder in ein Handtuch eingehüllt, um es während der künstlichen Besamung unbeweglich zu machen.
Das weibliche Kaninchen wurde mit 5 bis 10 ml einer Spermien enthaltenden Samenflüssigkeit behandelt, die in die Vagina und/oder Gebärmutter mit Hilfe einer medizinischen Tropfflasche eingeführt wurde,
Nach der Schwangerschaft werden die Jungen entweder grossgezogen, bis das Geschlecht visuell zu bestimmen ist, oder sie werden getötet und zur Prüfung in einem Alkoholformaldehyd-Fixiermittel aufbewahrt. Die Geschlechtsorgane werden durch das mikrobiologische oben erwähnte Verfahren geprüft.
Drei weibliche Kaninchen wurden künstlich befruchtet, wobei man 0,02 gew, iges sulfoniertes Polystyrol mit einem pH-Wert von 7,02 als elektrostatisch geladenes Behandlungsmittel nach der Erfindung verwendete.
Die Würfe setzten sich wie folgt zusammen : 6 weibliche und ein aufgefressenes (cannibalized) Junges ; 6 weibliche Junge ; 6 weibliche Junge und ein weiteres aufgefressenes.
Vier andere weibliche Kaninchen wurden durch natürliche Paarung befruchtet, nachdem der Fortpflanzungsbereich von zwei von ihnen mit sulfoniertem Polystyrol bei 0, 02 Teilen und bei 0,01 Teil des Behandlungsmittels in der verdünnten Samenflüssigkeit bei einem pH-Wert von etwa 7,02 gespült worden war. Aus diesen Würfen gingen elf weibliche und zwei männliche Junge ; sechs weibliche Junge ; sechs weibliche und ein männliches Junges und fünf weibliche Junge hervor.
Zwei weibliche Kaninchen wurden in ähnlicher Weise mit Spermien, die mit 0, 1 gew. -%iger Lösung von Poly- (vinylbenzyltrimethylammoniumchlorid) bei einem pH-Wert von etwa 7,02 behandelt wurden, befruchtet.
Von diesen beiden Kaninchen wurden fünf männliche und ein weibliches bzw. fünf männliche und zwei weibliche Junge geboren.
Aus diesem, im vorstehenden beschriebenen Verfahren ergab sich ein Erfolgsverhältnis von 9, 0 : 1, O. Im Gegensatz hiezu ergaben das Verfahren nach Schroeder ein Verhältnis von nur 4, 0 : 1, 0 und das von Gordon ein Verhältnis von nur 2, 10 : 1, 0,
Beispiel 4: Es wurde eine weitere Versuchsreihe durchgeführt, bei der man leicht basische Polyelektrolyte, wie elektrostatisch geladene Materialien nach der Erfindung, mit denen man die Kaninchenspermien vor der Befruchtung des Weibchens behandelte, verwendete. Das Sammeln, die Befruchtung und die Geschlechtsbestimmungsverfahren waren die gleichen wie im vorangegangenen Beispiel 3. Jedoch wurde bei diesem Beispiel 4 der Nachwuchs von der Mutter durch Kaiserschnitt entnommen, um jede Verlustmöglichkeit der Jungen durch mütterlichen Kannibalismus zu eliminieren.
Das schwach saure, elektrostatisch geladene Behandlungsmittel, das bei diesen Versuchen verwendet wurde, war Poly- (acrylsäure), die in einer isotonischen Lösung ins Gleichgewicht gebracht wurde.
Das schwach basische elektrostatisch geladene Behandlungsmittel war ein Polyäthyleniminderivat, das ebenfalls in isotonischer Lösung ins Gleichgewicht gebracht wurde,
In der folgenden Tabelle I werden die Versuche mit den verschiedenen pH-Werten und Behandlungsmittelkonzentrationen gezeigt :
Tabelle I
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<tb>
<tb> Behandlungsmittel <SEP> Konzentration <SEP> PH <SEP> männlich <SEP> weiblich <SEP> Erfolgs-Bemerkungen <SEP>
<tb> TpM <SEP> verhältnis
<tb> %
<tb> Polyacrylat <SEP> 200 <SEP> 6, <SEP> 5 <SEP> 19 <SEP> 12 <SEP> 61, <SEP> 3
<tb> Polyacrylat <SEP> 200 <SEP> 6, <SEP> 8 <SEP> 7 <SEP> 14 <SEP> 66,7 <SEP> abgesetzt
<tb> Polyacrylat <SEP> 400 <SEP> 6, <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 6 <SEP> 75,0 <SEP> überstehend
<tb> Polyacrylat <SEP> 800 <SEP> 6, <SEP> 8 <SEP> 21 <SEP> 8 <SEP> 72, <SEP> 4 <SEP> überstehend
<tb> Polyacrylat <SEP> 600 <SEP> 7,
<SEP> 5 <SEP> 89 <SEP> 61 <SEP> 59, <SEP> 4 <SEP>
<tb> Polyimin <SEP> 200 <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 8 <SEP> 61, <SEP> 5
<tb>
Beispiel 5 : An verschiedenen Kühen, eingeschlossen Jerseys, Holsteiner und Guernseys, wurden Versu- che unternommen, wobei die Samenflüssigkeit der Stiere mit Natriumpolyacrylat (dessen Polymeres eine negative Ladung hat) bei verschiedenen pH-Werten und Konzentrationen behandelt wurde.
Im allgemeinen wurde die Samenflüssigkeit in einer volumetrischen Gesamtmenge von 2, 4 cms benutzt, wobei die Samenflüssigkeit auf eine Konzentration von etwa 30 Millionen Spermien pro ml mit entsprechenden Mengen einer 2, 8 gew. - zuigen wässerigen Natriumcitratlösung, 20 Gew.-% Eigelb und 7 Gel.-% Glycerin, alle bei einem PH-Wert von etwa 7, 4, verdünnt war.
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Die Versuchsergebnisse werden in der folgenden Tabelle II gezeigt.
Tabelle II
Einfluss des behandelten Samens auf das Geschlecht des Nachwuchses
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<tb>
<tb> Kuh <SEP> Behandlung <SEP> Fötusalter <SEP> vorhergesagtes <SEP> tatsächliche
<tb> Nr. <SEP> (in <SEP> Tagen) <SEP> Geschlecht <SEP> Geschlecht
<tb> bei <SEP> der <SEP> Prüfung
<tb> 1 <SEP> A <SEP> (1) <SEP> 93 <SEP> weiblich <SEP> weiblich
<tb> 2 <SEP> A <SEP> (1) <SEP> 91 <SEP> weiblich <SEP> weiblich
<tb> 3 <SEP> A <SEP> (1) <SEP> 92 <SEP> weiblich <SEP> weiblich
<tb> 4 <SEP> A <SEP> (1) <SEP> 89 <SEP> weiblich <SEP> weiblich
<tb> 5 <SEP> A <SEP> (1) <SEP> 91 <SEP> weiblich <SEP> weiblich
<tb> 6 <SEP> A <SEP> (2) <SEP> 76 <SEP> weiblich <SEP> männlich
<tb> 7 <SEP> A <SEP> (2) <SEP> 76 <SEP> weiblich <SEP> männlich
<tb> 8 <SEP> A <SEP> (2) <SEP> 75 <SEP> weiblich <SEP> weiblich
<tb> 9 <SEP> A <SEP> (2)
<SEP> 75 <SEP> weiblich <SEP> weiblich
<tb> 10 <SEP> A <SEP> (2) <SEP> 75 <SEP> weiblich <SEP> weiblich
<tb> 11 <SEP> A <SEP> (2) <SEP> 75 <SEP> weiblich <SEP> männlich
<tb> 12 <SEP> A <SEP> (2) <SEP> 80 <SEP> weiblich <SEP> weiblich
<tb> 13 <SEP> B <SEP> 78 <SEP> männlich <SEP> männlich
<tb> 14 <SEP> B <SEP> 76 <SEP> männlich <SEP> männlich
<tb> 15 <SEP> B <SEP> 76 <SEP> männlich <SEP> männlich
<tb> 16 <SEP> B <SEP> 86 <SEP> männlich <SEP> männlich
<tb> 17 <SEP> C <SEP> 84 <SEP> weiblich <SEP> weiblich
<tb> 18 <SEP> C <SEP> 83 <SEP> weiblich <SEP> weiblich
<tb> 19 <SEP> D <SEP> 79 <SEP> weiblich <SEP> weiblich
<tb>
Fussnote.
A Natriumpolyacrylat bei 500 TpM, mit einem pH-Wert der Behandlungslösung von 6,3 und am Ende 6, 9.
B Natriumpolyacrylat bei 500 TpM, mit einem pH-Wert der Behandlungslösung von 7, 2 und am Ende
7, 28.
C Natriumpolyacrylat bei 25,0 TpM, mit einem pH-Wert der Behandlungslösung von 6,0 und am Ende
EMI7.2
0.D Natriumpolyacrylat bei 12,5 TpM, mit einem pH-Wert der Behandlungslösung von 6,0 und am Ende
7, 0.
(1) Nach der Behandlung liess man die Samenflüssigkeit für 5 bis 10 min zur Ausflockung stehen, (2) Die Samenflüssigkeit wurde unmittelbar nach der Behandlung verwendet.
EMI7.3
bei einer Konzentration von etwa 500 TpM und einem pH-Wert von etwa 6, 3 behandelt wurde, besamt. Am Ende erreichte der pH-Wert einen Wert von etwa 6, 9. Die behandelte Samenflüssigkeit liess man zwischen 5 und 10 min stehen, bevor die Besamung durchgeführt wurde. Die Kühe 6 bis 8 und 11 wurden unmittelbar nach der Behandlung besamt.
Wie aus den beschriebenen Versuchen hervorgeht, ist das elektrisch geladene Behandlungsmittel, das bei der Erfindung verwendet wurde, wirkungsvoller, wenn es für kurze Zeit auf die Spermien eines geschlechts-bestimmenden Charakters einwirken kann. Dieser Vorgang ermöglicht die Abtrennung der untauglichen und/oder unbeweglichen oder anderweitig gehinderten Spermien, die eine wirkungsvolle Empfängnis des Eis nicht herbeiführen können.
In jedem Fall wurde, wie aus der Tabelle II ebenfalls hervorgeht, für die Behandlung des Samens, der zur Befruchtung der Kühe 13 bis 16 benötigt wurde, der pH-Wert der Behandlungslösung von Poly- (acrylsäure)-salz in 2,8 Gew.-% Natriumcitrat, 20% Eigelb und 7% Glycerin auf einen pH-Wert von etwa 7, 2 erhöht. Dies änderte, wie beobachtet wurde, die Beziehung zwischen den Spermien und dem Behandlungsmittel, da, wie gezeigt wurde, das dominierende Geschlecht der Nachkommen männlich war.
<Desc/Clms Page number 8>
Die Kühe 17 bis 19 wurden mit einer Samenflüssigkeit befruchtet, die etwa auf die gleiche Art und Weise behandelt wurde wie die der Kühe 1 bis 5, mit der Ausnahme, dass die Behandlungslösung von etwa 500 TpM auf etwa 25 TpM reduziert wurde. Es sei noch bemerkt, dass die Reduzierung der Konzentration eine sehr geringe Wirkung auf die Ergebnisse ausübte ; alle gewünschten Geschlechter wurden wie gewünscht erhalten,
Die Versuchsergebnisse aus Tabelle II sind in der folgenden Tabelle III zusammengefasst :
Tabelle III Rindvieh-Versuch-Zusammenfassung
EMI8.1
<tb>
<tb> Gruppe <SEP> vorhergesagtes <SEP> PH <SEP> Anzahl <SEP> der <SEP> männlich <SEP> weiblich <SEP> % <SEP> w/m
<tb> Geschlecht <SEP> Geburten <SEP> Verhältnis
<tb> I <SEP> weiblich <SEP> 7, <SEP> 05 <SEP> 5 <SEP> 0 <SEP> 5 <SEP> 100 <SEP> sehr <SEP> hoch
<tb> 11 <SEP> weiblich <SEP> 7,05 <SEP> 10 <SEP> 3 <SEP> 7 <SEP> 70 <SEP> 2, <SEP> 3 <SEP> : <SEP> 1
<tb> III <SEP> männlich <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> 4 <SEP> 4 <SEP> 0 <SEP> 100 <SEP> sehr <SEP> gering
<tb>
Beispiel 6 : Stiersamen wurde mit Natriumpolyacrylat bei einer Konzentration von etwa 25 TpM und einem pH-Wert von etwa 7, 4 behandelt, wobei als Verdünner eine Mischung aus etwa 2, 8 Gew. -"/0 Natrium- citrat, 2cp/o Hühnereigelb und 71o Glycerin verwendet wurde.
Diese Mischung wurde dann in ein Gefäss mit einem Fassungsvermögen von etwa 0, 8 ml bei einer Konzentration von etwa 30 Millionen bewegungsfähigen Spermien pro ml gegeben. Die gefüllten Gefässe wurden verschlossen, in flüssigem Stickstoff gefroren und dann auf die übliche Art und Weise gelagert, Beispiel 7 : Ochsige Kühe wurden mitHilfe allgemein verwendeter und anerkannterVerfahren für diesen Zweck künstlich befruchtet. Nach Schwangerschaftszeiträumen von 60 bis 70 Tagen wurden die Kälber operativ geholt und das jeweilige Geschlecht bestimmt. Vierzehn Kälber wurden nach Anwendung des auf die oben beschriebene Weise behandelten Stiersamens erhalten. Zum Vergleichszweck wurden 13 beaufsichtigte Kühe während des Versuches durch unbehandelten Samen schwanger.
Die erhaltenen Ergebnisse sind wie folgt :
EMI8.2
<tb>
<tb> gewöhnlicher <SEP> Samen <SEP> 7 <SEP> männlich <SEP> 6 <SEP> weiblich
<tb> behandelter <SEP> Samen <SEP> 10 <SEP> männlich <SEP> 4 <SEP> weiblich
<tb>
Beispiel8 :IneinemweiterenKrebs-Henseleit-Ringer(KHR)-PufferwurdeeineSuspensionauspulverförmigem Bariumsulfat hergestellt und für l min sich absetzen lassen.
Diese weitere typische Ausführungsform des bekannten Krebs-Henseleit-Ringer-Puffers (im folgenden kurz KHR genannt) wurde genau nach der folgenden Formulierung hergestellt :
Vermischen von :
EMI8.3
<tb>
<tb> 100 <SEP> ml <SEP> 0,9 <SEP> gew.-%igem <SEP> wässerigem <SEP> NaCl:
<tb> 4 <SEP> ml <SEP> 1, <SEP> 15 <SEP> gew.-loigem <SEP> wässerigem <SEP> KCl <SEP> ; <SEP>
<tb> 1 <SEP> ml <SEP> 2, <SEP> 11 <SEP> gew. <SEP> -%igem <SEP> wässerigem <SEP> KH <SEP> PO <SEP> ; <SEP>
<tb> 1 <SEP> ml <SEP> 3, <SEP> 82 <SEP> gew. <SEP> -%igem <SEP> wässerigem <SEP> MgSd. <SEP> 7 <SEP> HO <SEP> und
<tb> 2 <SEP> ml <SEP> 1, <SEP> 30 <SEP> gew. <SEP> -%igem <SEP> wässerigem <SEP> Na <SEP> COg <SEP>
<tb>
Plus :
EMI8.4
<tb>
<tb> 0, <SEP> 5 <SEP> g <SEP> Fructose <SEP> und <SEP>
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> g <SEP> normaler <SEP> Gelatine.
<tb>
In diesem Zusammenhang ist von Interesse, dass dieser KHR-Puffer ebenso wie gleichwertigemöglicheVa- riationen davon, eine isotonische Puffer-Lösung darstellt, die als solche nicht ausschlaggebend für gute Ergebnisse ist. Trotzdem ist es vorteilhaft, für die Spermien, die beim Verfahren nach der Erfindung verwendet werden, mit einem KHR-Puffer zu mischen. Allerdings ist der KHR-Puffer allein nicht verantwortlich für die guten Ergebnisse nach der Erfindung, obwohl verschiedene Ausführungsformen des KHR-Puffers gut zu verwenden sind, und besonders dann, wenn die behandelten Spermien nicht gefroren werden.
Es ist lediglich wesentlich, dass man bei der Behandlung der Spermien nach dieser Erfindung irgendeine mit den Spermien verträgliche isotonische Lösung verwendet. Die KHR-Puffer sind aber besonders gute synthetische isotonische Lösungen, die in ihrer Zusammensetzung verschiedene Ionen enthalten und eine annähernde Nachbildung von normalen Zellseren sind.
<Desc/Clms Page number 9>
Weitere Beispiele von geeigneten isotonischen Lösungen sind : wässerige Na1riumcitratlösung, Magermilch, wässerige Lösungen von Natriumchlorid, gelöstes Salz im Bereich von etwa 0, 78 bis etwa 0, 9 Gew, -% enthalten.
In andern Worten ausgedrückt ist die verwendete isotonische Lösung so ausgewählt, dass sie etwa die gleichen osmotischen Eigenschaften besitzt wie die Flüssigkeiten in Lebewesen. Ferner ist es sehr wichtig, dass sie keinen nachteiligen Einfluss auf die zu behandelnden Spermien ausübt.
In diesem Zusammenhang sei noch darauf hingewiesen, dass, wenn die behandelten Spermien gefroren werden sollen, im allgemeinen ein Zusatz von Eigelb oder ähnlichen Materialien erforderlich ist. Dabei wurde gefunden, dass Eigelb die Fähigkeit der Spermien erhöht, den"Eistod"in den gefrorenen Proben zu verhindern.
Aus bisher unbekannten Gründen verursacht es grosse Schwierigkeiten, genaue chemische Analysen des natürlichen Eigelbs zu erhalten. Künstlich hergestelltes Eigelb ist im allgemeinen unbefriedigend, wenn Spermkom- positionen zur Lagerung und vor der Verwendung eingefroren werden müssen.
In jedem Fall und um auf das vorliegende experimentelle Beispiel zurückzukommen, wurde die überstehende Suspension dekantiert und der pH-Wert mit 0, 154 molarer KH PO-Lösung auf 6, 8 eingestellt. Stiersamen wurde auf eine Konzentration von 120 Millionen beweglicher Spermien pro ml verdünnt, indem man Bariumsulfatsuspension benutzte, deren pH durch einen isotonischen KHR-Verdünner geregelt war.
BASE, wurde dazu verwendet, das Absetzen der Spermien/Puffer-Mischung zu erleichtern. Statt BaSO. können andere schwere Mineralien wie Bentonit-Ton u. dgl. benutzt werden.
Zu dieser Zubereitung wurde nun ein gleiches Volumen von 1000 TpM des Natriumsalzes von Poly- (acryl-
EMI9.1
und die Spermzellen beteiligt. Die Ausflockung setzte sich schnell auf dem Boden des Gefässes ab. Die überstehende Flüssigkeit enthielt im wesentlichen nur einzelne, sich frei bewegende Spermzellen.
Diese Abwandlung des Verfahrens nach der Erfindung zeigt die Wirksamkeit der Erhöhung des Dichtefaktors nach der gut bekannten Gleichung von Stoke betreffend das Absetzen von suspendierten Teilchen.
Der Vergleich der Absetzgeschwindigkeiten von Stiersamen, die durch Polyelektrolyte mit hohem spezifischem Gewicht (Chlor-enthaltend) ausgeflockt wurden, mit solchen, die mit Polyelektrolyten von niedrigerem spezifischem Gewicht, wie poly- (acrylsäure : Na1riumsalz) ausgeflockt wurden, zeigt, dass Ausflockungen von höherem spezifischem Gewicht aus Spermien und Polymeren innerhalb von 15 min sich beträchtlich absetzen.
Auf der andern Seite und im Gegensatz dazu werden die Spermien durch weniger dichte Polyelektrolyte nur zu einem geringen Grad nach einer Absetzzeit von 2 h ausgeflockt. Die überstehende Flüssigkeit enthielt lebende, einzelne, bewegliche Spermzellen bei allen Versuchen.
Dieser Versuch zeigt weiterhin die Bedeutung des Dichte-Faktors in der Stoket schen Sedimentationsgleichung in bezug auf die Beeinträchtigung derAusfällungszeit und des Grades der Trennung der ausgeflockten und unausgeflockten Spermpopulationen.
Das Vorstehende veranschaulicht einen weiteren"in vitro"-Test. Er ist wichtig, da er deutlich das verbesserte Verfahren nach der Erfindung zeigt, bei dem eine beschleunigte Trennung der verschiedenen Spermarten erreicht wird.
Beispiel 9 : In einem weiteren Versuch wird der vereinigte Samen, der von 8 männlichen Kaninchen gesammelt wurde, in drei Teile geteilt. Ein Drittel davon wird mit der KHR-Puffer-Lösung (die gleiche, die im vorangegangenen Beispiel verwendet wurde) bei einem pH-Wert von 7, 2 verdünnt, indem man für die Einstellung eine 1, 54 molare wässerige KHPC-Lösung plus Natrium-Reagenz-ZusXtzen in einem titrationsähnlichen Verfahren, bis der gewünschte pH-Wert erhalten wurde, verwendete. Dieser Samen wurde bei dem Kontroll versuch verwendet.
In einem weiteren, aber ähnlichen Verfahren wurde die Reihenfolge beim Mischen wie folgt geändert : Das Natriumpolyacrylat im KHR-Puffer wurde zu der Suspension von Bariumsulfat im KHR-Puffer gegeben. Die Ausfällung erfolgte während dieses ersten Vorganges, Der Samen wurde mit dem KHR-Puffer verdünnt und dann unter leichtem Schütteln der Masse hinzugegeben. Es wurden gemischte Ausflockungen aus Spermzellen, Bariumsulfat und dem Polymeren gebildet.
Im Gegensatz hiezu wurde festgestellt, dass dieAusflockung von dem feinverteilten Bariumsulfat durch kationische Polyelektrolyte in Abwesenheit der Spermzellen schwieriger ist als mit polyanionischen Polyelektrolyten.
Im vorhergehenden wurde ein"in vitro"-Verfahren gezeigt, um die Ausflockung zu zeigen und nachzuweisen, dass die Ausflockungsgeschwindigkeit durch Zugabe eines schweren Ausflockungsmittels, wie Bas4, erhöht wird,
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<Desc/Clms Page number 10>
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einer positiv geladenen Polyelektrolytlösung verdünnt, bei einem Verhältnis von etwa 1 ml des unbehandelten Samens zu 0, 1 ml einer 0, 6 gew. -%igen Lösung eines Copolymeren, das aus Poly- [oxyäthylen- (dimethylimin)- - äthylen- (imethylimin)-äthylendichlorid] bestand, einem Material, das kommerziell als Polymeres Nr. 7971 von der Tim Hennigan Engineering Division der W. D. Mann Company, Hingham, Massachusetts, U. S.
A., er- halten wurde, Das Polyimincopolymere wurde in Form einer 60 gew. -%igen wässerigen Lösung verwendet. Die sich ergebende Mischung wurde dann weiterhin mit 1, 87 ml des KHR-Puffers mit einem PH-Wert von 8,3 verdünn. Das endgültige Produkt wurde als"Polyimin-Behandlungsmittel l"bezeichnet.
Das restliche Drittel des Samens wurde mit einer negativ-geladenen Polyelektrolytlösung mit einem Verhältnis von 1 ml des unbehandelten Samens zu 0, 1 ml Natriumpolyacrylat Nr. 7930 von der oben bezeichneten Hennigan Engineering Division bei 2000 TpM Konzentration im KHR-Puffer und bei einem pH-Wert von 7,5 verdünnt ; dann wurden 1, 65 ml des KHR-Puffers bei PH 6,0 hinzugegeben. Dies ergab den mit"SPA-1 Behand- lungsmittel"behandelten Samen.
Weibliche Kaninchen, die für 16 Tage isoliert wurden, um "Pseudo- Schwangerschafts"-Effekte zu eliminieren, wurden durch Injektion in das Kreislaufsystem von 2, 5 mg allgemein gebräuchlichen schleimigen luteinisierten Hormonen stimuliert, um eine Eibildung herbeizuführen. Dann wurde jedes weibliche Kaninchen mit 0, 2 ml des behandelten Kaninchensamens befruchtet.
Nach 18 Tagen wurden sie durch Betastung des Unterleibes auf Schwangerschaft untersucht.
Nach 29tägiger Schwangerschaft wurden die weiblichen Kaninchen getötet und dieFöti chirurgisch entnommen, um möglichem Kannibalismus des gesamten oder eines Teils des natürlich geborenen Nachwuchses vorzubeugen.
Die Geschlechtsdrüsen der Föti wurden entfernt, dann eingebettet, Schnitte daraus hergestellt und gefärbt, so dass das Geschlecht eines jeden Fötus mikroskopisch untersucht werden konnte.
Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten :
Die im Kontroll versuch verwendeten Kaninchen und die Kaninchen, die unmittelbar nach der Behandlungsstufe des Samens besamt wurden, erzeugten Nachkommen, bei denen das Geschlecht eine breite Streuung zwischen männlich und weiblich zeigte, wie aus der folgenden Tabelle zu entnehmen ist :
Tabelle IV
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<tb>
<tb> Behandlung <SEP> männlich <SEP> weiblich
<tb> Kontroll-Weibchen <SEP> ;
<SEP> d <SEP> ;" <SEP> 1 <SEP> 3 <SEP> 3
<tb> Kontroll-Weibchen <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 0
<tb> "Polyimin <SEP> Behandlungsmittel <SEP> l"4 <SEP> 5
<tb> wie <SEP> gemischt <SEP> und <SEP> nicht <SEP> abgelagert
<tb> "SPA-1 <SEP> Behandlungsmittel"3 <SEP> 5
<tb> wie <SEP> gemischt <SEP> und <SEP> nicht <SEP> abgelagert
<tb>
Nach dem Absetzenlassen wurden vier weibliche Kaninchen mit Spermien befruchtet, die mit "Polyimin Behandlungsmittel 1" behandelt worden waren, und fünf weibliche Kaninchen mit Spermien, die mit"SPA-1 Behandlungsmittel" behandelt wurden.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben :
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<tb>
<tb> Behandlung <SEP> männlich <SEP> weiblich
<tb> "Polyimin-1" <SEP> # <SEP> pH <SEP> 6,5, <SEP> dann <SEP> 8,3 <SEP> 5 <SEP> 8
<tb> "SPA-1" <SEP> # <SEP> pH <SEP> 7,5, <SEP> dann <SEP> 6,0 <SEP> 16 <SEP> 7
<tb>
Das Verhältnis der Geschlechter liegt bei Nachkommen bei 0, 384 bzw. 2, 28. Im Vergleich hiezu wird natürliche Fortpflanzung im Verhältnis von 1, 06 erhalten.
Weitere und getrennte Versuche mit Kaninchen wurden auf etwa die gleiche Art und Weise und unter Verwendung etwa der gleichen Verfahren, wie unmittelbar zuvor beschrieben (ausser den unten angegebenen Änderungen der PH- Werte) ausgeführt, wobei die folgenden Ergebnisse erhalten wurden :
<Desc/Clms Page number 11>
200 TpM Natriumpolyacrylat * PH 6,8
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<tb>
<tb> weiblich <SEP> männlich <SEP> Verhältnis <SEP>
<tb> weiblich/männlich
<tb> besamt <SEP> nach <SEP> der <SEP> Mischung <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 0, <SEP> 86 <SEP>
<tb> nach <SEP> 20 <SEP> min <SEP> Absetzen <SEP> 14 <SEP> 7 <SEP> 2, <SEP> 00
<tb>
200 TpM Natriumpolyacrylat * pH 5
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<tb>
<tb> weiblich <SEP> männlich <SEP> Verhältnis
<tb> weiblich/männlich
<tb> besamt <SEP> nach <SEP> der <SEP> Mischung <SEP> 7 <SEP> 11 <SEP> 0, <SEP> 64 <SEP>
<tb> nach <SEP> # <SEP> 20 <SEP> min <SEP> Absetzen <SEP> 13 <SEP> 11 <SEP> 1,18
<tb>
EMI11.3
<Desc/Clms Page number 12>
Zu 0, 8 ml dieses behandelten Samens wurden 0, 1 ml einer isotonischen Lösung von Poly- (äthylenimin) bei einer Konzentration von 10 TpM gegeben. Die Probe wurde bei 100facher und 430facher Vergrösserung untersucht und es wurde eine starke Ausflockung beobachtet, Die Spermien waren also sensibilisiert worden oder durch die erhöhte elektrostatische Aufladung auf jedem Sperm mit einer Ladung, die gegensätzlich zu der des Behandlungsmittels war, indem bei der ersten Behandlung ein verdünnter anionischer Polyelektrolyt verwendet wird und dann die Spermien mit einem kationischen Polyelektrolyten ausgefällt werden.
Dieses Verfahren, das zur Behandlung verwendet werden kann, zeigt die "Sensibilisierung" mit einem geladenen Harz und die "Ausflockung" mit einem Harz entgegengesetzter Ladung,
Beispiel 14 : Eine Stiersamenprobe wurde auf eine Konzentration von 30 Millionen beweglicher Spermien pro ml mit 2,8 Gew.-% Natriumcitrat-Lösung bei einem pH-Wert von 7,86 verdünnt und dann mit einer Lösung von 2000TpM Poly-N-vinyl-pyrrolidon, einenFikentscher K-Wert von etwa 90 hatte, in 2, 8 Gew.-% Natriumcitrat (ebenfalls bei einem PlI-Wert von 7,86) im 1 : 1 Volumenverhältnis des verdünnten Samens zur Behandlungslösung, behandelt.
Beobachtungen bei 100facher und 430facher Vergrösserung zeigten, dass sich Harzkügelchen von der Lösung entfernt hatten und an oder in unmittelbarer Nachbarschaft einiger Spermköpfe klebten, jedoch nicht bei allen Spermzellen. Dadurch wurde das Schwimmen dieser Spermien erschwert. Ähn liche, aber weitgehende Ergebnisse erhielt man bei einem pH-Wert von 7, 28. Bei einem pH-Wert von 6,5 waren mehr als die Hälfte der Spermien in ihrer Beweglichkeit durch das an ihnen klebende Harz gehindert. Der Rest der Spermien schwamm frei, wenn die Proben einen der drei gegebenen pH-Werte hatten, Dies zeigte die selektive Behinderung der Spermien in Abhängigkeit von der Ladung.
Beispiel 15 : Eine Suspension aus magnetisierbarem Pulver (Bariumferrit von der Stockpole Carbon Company, St. Mary, Pennsylvania, U. S. A.) wurde in einem KHR-Puffer mit einem pH-Wert von 6, 9 herge- stellt, Man liess die Zubereitung für 1 min stehen. Danach wurde das Überstehende abgegossen. Diese Suspension aus fein verteiltem Bariumferrit wurde dann zurVerdünnung von Kaninchensamen im Verhältnis von einem Volumen des Samens zu vier Volumina der Bariumferrit-Dispersion verwendet. Zu fünf Volumina dieser Mischung wurden fünf Volumina einer Lösung von 1000 TpM Natriumpolyacrylat im KHR-Puffer, der ebenfalls auf einen pH-Wert von 6, 9 eingestellt worden war, gegeben.
Eine Probe der Mischung der lebenden Spermzellen, des Polyelektrolyten und der magnetisierbaren Teilchen in einem isotonischen Verdünnungsmittel wurde dann in den Hohlraum eines Objektträgers für Kulturen eines Mikroskops gegeben und bei 100facherVergrösserungbe- obachtet, einmal unter dem Einfluss von und dann ohne den Einfluss des magnetischen Feldes eines Stabmagneten. Das Absetzen eines Teils der lebenden Spermien durch die Schwere trat durch Bariumferrit ein. Die Bewegung der Bariumferrit-Spermzellen-Polyelektrolyt-Ausflockung kann in ihrer Richtung durch den Magneten beeinflusst werden. In andern Worten ausgedrückt, kann ihre Absetzgeschwindigkeit durch den Einfluss des Magneten erhöht werden; wobei die nicht ausgeflockten Spermzellen nicht in gleicher Weise beeinflusst werden.
Beispiel 16 : Neun Kühe wurden während eines Versuchs künstlich besamt. Hiebei wurden drei unbehandelte Spermproben, drei mit einem positiv-geladenen Mittel (Polyäthylenimin) behandelte Spermproben und drei mit einem negativ-geladenen Mittel (Natriumpolyacrylat) und einem gewichtserhöhenden Mittel (bas4) behandelte Spermproben verwendet. Nach einer normalen Schwangerschaftszeit wurden die Kälber geboren. Die Ergebnisse der Prüfung sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben.
Tabelle V
Rindvieh-Besamungen
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<tb>
<tb> Kuh <SEP> Behandlung <SEP> Geschlecht <SEP>
<tb> Nr.
<tb>
1 <SEP> Kontrolle <SEP> männlich <SEP>
<tb> 2 <SEP> Kontrolle <SEP> weiblich <SEP>
<tb> 3 <SEP> Kontrolle <SEP> Zwillinge
<tb> (1 <SEP> männlich
<tb> 1 <SEP> f-m <SEP> (a)) <SEP>
<tb> 4 <SEP> 800 <SEP> TpMPÄI <SEP> (b), <SEP> BaSO <SEP> -Suspension <SEP> (c), <SEP> PH <SEP> 6, <SEP> 9 <SEP> weiblich <SEP>
<tb> 5 <SEP> 800 <SEP> TpM <SEP> PÄI.
<SEP> BaSO-Suspension <SEP> (c), <SEP> PH <SEP> 6, <SEP> 9 <SEP> weiblich
<tb> 6 <SEP> 800 <SEP> TpM <SEP> PÄI <SEP> (b), <SEP> BaSO4-Suspension <SEP> (c), <SEP> pH <SEP> 6,9 <SEP> weiblich
<tb> 7 <SEP> 800 <SEP> TpM <SEP> SPA <SEP> (d), <SEP> BaSO4-Suspension <SEP> (c), <SEP> pH <SEP> 7,5 <SEP> männlich
<tb> 8 <SEP> 800 <SEP> TpM <SEP> SPA <SEP> (d), <SEP> BaSO4-Suspension <SEP> (c), <SEP> pH <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> männlich
<tb> 9 <SEP> 800 <SEP> TpM <SEP> SPA <SEP> (d), <SEP> BaSO.-Suspension <SEP> ), <SEP> PH <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> männlich
<tb>
<Desc/Clms Page number 13>
Fussnoten zu Tabelle V : (a) f-m bedeutet frei-Martin weiblich, d. h. weibliche Zwillinge eines gemischten Paares bedeutet, das niemals sekundäre geschlechtliche Merkmale entwickelt und unfähig ist, sich jemals zu einem voll- ständigen fertigen weiblichen Tier zu entwickeln.
(b) PÄI bedeutet Poly- (äthylenimin).
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Stehenlassen nach sorgfältigem Schütteln. (d) SPA bedeutet KHR-Salze von Poly- (acrylsäure).
EMI13.2
17 : Das Quinacrin-Dihydrochlorid-oder dasQuinacrin-Senffärbeverfahren zurBestimmungZech, Exp. cell. Res. 58 [1969], S. 463 ; P. L. Pearson, M. Bobrow & C. G. Vosa, Nature, 226 (4, April 1970), S. 78 bis 80) ;
P. L. PearsonundM. Bobrow, Nature, 226 (Juni 1970), S. 959 bis 961 ;
P. BarlowundC. G. Vosa, Nature, 226 (Juni 1970), S. 961 bis 962;
Editorial Anonymous Nature, 226 (6, Juni 1970), S. 897,
Die Lehren dieser Literaturstellen vermitteln eine grosse Hilfe bei der Beurteilung der verschiedenen Behandlungsmittel.
Sie vermitteln ausserdem eine ausgezeichnete Basis für die Wechselbeziehung der Wirkungen der Behandlungsmittel auf den Tiersamen, deren Spermien selbst nicht dem direkten Quinacrin-Identifizierungs- verfahren zugänglich sind.
Das Verfahren sieht eine Prüfung der Spermzellen in einem ultravioletten, fluoreszierenden Mikroskop bei geeigneter Vergrösserung vor. Diese liegt in derRegel bei einer 970fachen bis 1000fachen Vergrösserung, um die sogenannten "F-Körper" zu ermitteln, Der "F-Körper" ist, wie bekannt, typisch für die Gegenwart von Y-Chromosomen, die mit dem Karyotyp (dem Zählen oder Bestimmen der Gene oder Chromosoms in der Zelle) für Gewebevergleiche vergleichbar sind. Die Prüfung der Spermien auf sogenannte XYY"super-männliche"Indi- viduen haben und zeigen zwei solche"F-Körper" ; während die Hälfte der Spermien dieser "Supermännlichen" bei der Prüfung keine derartigen Flecken aufwies, woraus sich die Anwesenheit von nur den sogenannten XChromosomen ergibt.
Im normalen Samen von normalen männlichen Wesen des verbreiteteren XY-Typs zeigt die Hälfte der Spermien das Vorhandensein von nur einem einzigen F-Körper pro Sperm, während in der zweiten Hälfte keine F-Körper vorhanden sind.
Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wurde die menschliche Samenflüssigkeit 30 min lang bei 370C verflüssigt (d. h, den Gelzustand durch enzymatische Einwirkung aufheben) und dann bei einem 1: 3-Ver- hältnis in einem Krebs-Ringer-Puffer bei einem pH-Wert von etwa 7, 2 verdünnt, Eine vorher zubereiteteKolonne eines sulfonierten Polymeren aus Styrol mit zwischen 4 bis 12 Grew.-% Divinylbenzol ("Dowex 50") wurde mit dem gleichen Puffer und dem gleichen pH-Wert ins Gleichgewicht gebracht.
Die Grösse des Harzes lag bei 16 bis 50 Maschen und die Höhe der Kolonne betrug etwa 500 mm. 8 ml des oben beschriebenen verdünnten Samens wurden am oberen Ende der Kolonne aufgegeben, Man liess ihn dann durch die Kolonne durchsickern, wobei ein Abfluss aus der Kolonne von etwa 1 Tropfen pro Sekunde beobachtet wuide.
Schnitte dieses Abflusses, die jeweils ein Volumen von etwa 1 ml hatten, wurden weiter verdünnt und willkürlich mit 4 bis 12 numeriert. Jeder Schnitt wurde mit destilliertem Wasser im Verhältnis 1 : 16 verdünnt. Die
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ben wurde dann auf einen frisch gereinigten nicht fluoreszierenden Objektträger gesprüht und darauf getrocknet.
Die Objektträger wurden dann durch Eintauchen in Alkohol für 5 min "gehärtet" und in einer 1 gew.-%igen Quinacrin-Dihydrochloratzusammensetzung für zirka 20 min gefärbt ; anschliessend wurden sie mindestens dreimal in destilliertem Wasser gewaschen und sorgfältig gespült, bis keine gelbe Farbe auf der Objektträger-Probe mit dem Auge zu erkennen war. Jeder Objektträger wurde dann mit einem Wasser-nassen 24 X 40 mm Deckglas bedeckt und die Ecken von jeder Probe wurden dann mit klarem Lack, wie er für Fingernägel verwendet wird, versiegelt.
Beobachtungen in dem ultravioletten fluoreszierenden Bereich mit Y48 Schutzfiltern (barrier filters) infrarot-absorbierender und ultraviolett-durchlässiger Beleuchtung bei 650 Nanometer (nm) bei 1000facher Vergrö- sserung mit Hilfe eines ultravioletten fluoreszierenden Mikroskops zeigten deutlich den "F-Körper" in annähernd einer Hälfte der unbehandelten Spermprobe, die im Verhältnis 1 : 25 mit destilliertem Wasser verdünnt worden war.
Die Prüfung der Objektträger mit den aus der Kolonne ausströmenden Schnitten durch Abtasten jedes Schnittes bei ultraviolett fluoreszierender Beleuchtung bei 650 nm und unter Verwendung eines mikroskopischen Prüf-
EMI13.4
<Desc/Clms Page number 14>
"F-Körper",Tabelle VI
EMI14.1
<tb>
<tb> Schnitt <SEP> F-Körper <SEP> keine <SEP> F-Körper <SEP> beobachtet
<tb> (oder <SEP> Fraktion) <SEP> beobachtet
<tb> Nr.
<tb>
1 <SEP> sehr <SEP> wenige <SEP> Sperma <SEP> anwesend <SEP> in <SEP> Fraktion
<tb> 2 <SEP> sehr <SEP> wenige <SEP> Sperma <SEP> anwesend <SEP> in <SEP> Fraktion
<tb> 3 <SEP> sehr <SEP> wenige <SEP> Sperma <SEP> anwesend <SEP> in <SEP> Fraktion
<tb> 4 <SEP> 4 <SEP> 62
<tb> 5 <SEP> 21 <SEP> 162
<tb> 6 <SEP> 8 <SEP> 208
<tb> 7 <SEP> 8 <SEP> 320
<tb> 8 <SEP> 16 <SEP> 352
<tb> 9 <SEP> 3 <SEP> 64
<tb> 10 <SEP> 7 <SEP> 111
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zufällig beobachtet wurden. Dieses entspricht einem Verhältnis von etwa 26 : 1 im Vergleich zu dem Verhältnis von l : l, das in den unbehandelten Proben beobachtet wurde, und dem Verhältnis von 1, 8 : 1 nach den Berichten von Barlow und Vosa, supra.
Aus dem angeführten Verhältnis von Zellen mit und ohne "F-Körper" bei den nach der Erfindung behandelten Spermzellen ergibt sich, dass die Chancen weiblicher Nachkommen, die aus der Befruchtung mit diesen Spermien hervorgehen würden, 20- bis 26mal grösser sein würden als bei der Befruchtung mit unbehandelten Spermien.
Die mikroskopische Untersuchung von Teilchen des Ionenaustauschermaterials, die vom Kopf der Kolonne entnommen wurden, zeigte, dass Spermzellen an der Oberfläche dieser Teilchen hafteten.
Für die Behandlung der Spermien wurde eine Vielzahl von elektrisch geladenen Polymeren herangezogen, z. B. lineare schwach-saure Polymere (Natriumpolyacrylat) ; ein ziemlich wenig vernetztes schwach-saures Copolymeres (bekannt als "ASE 60" von Rohm and Haas Company, Philadelphia, Pennsylvania, U. S. A.) ; ein ziemlich vernetztes schwach-sauresIonenaustauscher-Copolymeres (bekannt als"Rexyn 102"von Fisher Scientific Company, Pittsburgh, Pennsylvania, U. S. A., Katalog Nr.
R 184) ; ein weitgehend lineares und ziemlich schwach vernetztes und stark saures Ionenaustauscherharz aus sulfo-
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ein anderes ziemlich dicht vernetztes schwach-basisches Ionenaustauscherharz (bekannt als"Rexyn 206" von Fisher Scientific Company) ; das ziemlich wenig vernetzte (z. B. leicht in Wasser aufquellende) stark-basische quaternisierteEmulsions- copolymere aus Vinylbenzylchlorid ; vernetzte Copolymere aus Methacrylsäure und mindestens einem difunktionellen Monomeren, wie Divinylbenzol, Trivinylbenzol, Glykoldimethacrylat usw. (die z.
B, vorzugsweise durch ein umgekehrtes Suspensionspolymerisationsverfahren mit 0, 03je Divinylbenzol hergestellt wurden) ; und ein ziemlich dicht vernetztes stark basisches Copolymeres (quaternisiertes chlormethyl iertes Copolymeres aus 92 Gel.-% Styrol und 8 Gew.-% Divinylbenzol).
Die Untersuchung mit diesen Polymeren zeigt, dass die Spezifizität des Verfahrens nach der Erfindung, neben andern Faktoren, durch die Änderung des Grades der Vernetzung des makromolekularen Polyelektrolyten
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geändert und/oder gesteigert werden kann. Dies trifft jedoch nicht auf die unlöslichen Mittel, wie Mineralien, zu. Weitere Möglichkeiten zur Beeinflussung der Spezifizität und Änderung der Teilchengrösse, des pH-Wertes und/oder des Ionisierungsbereiches der funktionellen Gruppe, die die elektrostatisch geladene Stelle des Behandlungsmittels schafft.
Es ist bemerkenswert, dass die zunehmende Vernetzung auch den Bereich der zulässigen Konzentration erhöht, bevor die physikalische Einschliessung ein Faktor wird.
Dies, verbunden mit der bemerkenswerten Neigung der positiv-geladenen Spermien, negativ-geladene lineare Polyelektrolyte auszufällen und umgekehrt, fördert das Bestreben, vernetzte oder "unlösliche" elektro- statisch-geladene Behandlungsmittel zu verwenden.
Die mikroskopische Untersuchung von menschlichen, Stier-, Hamster- und Kaninchen-Samen, die mit Ionenaustauscherharzen und besonders mit ziemlich dicht vemetzten feinteiligen makromolekularen Polyelektrolyten behandelt wurden, bei sichtbarem Licht und mit Hilfe ultraviolett fluoreszierender Verfahren, ermöglicht es, Effekte der Behandlung von Spermien dieser verschiedenen Arten zu erkennen und miteinander in Beziehung zu setzen, z, B. die Verhinderung der Bewegung eines Teils der Spermzellen durch Haften solcher Teilchen daran. Dies beschränkt die Fähigkeit der so behinderten Spermzellen, sich dem Ei zu nähern und es zu befruchten.
Ein einfacher Versuch, bei dem derartig behinderte Spermien verwendet werden, verschafft die notwendige Information über das erforderliche Verfahren, um das gewünschte Geschlecht der betreffenden Art zu erhalten, Es sei noch unter Bezugnahme auf Tabelle VI darauf hingewiesen, dass der Höhepunkt des weiblich zu männlich Verhältnisses etwa bei Schnitt Nr. 7 beginnt, was in gewissem Umfang auf ein chromatographisches Verhalten hindeutet. Ausserdem muss beachtet werden, dass die beteiligten Spermien am Leben sind, aber unter den künstlichen Bedingungen der vorgesehenen Behandlung möglicherweise ziemlich frühzeitig sterben im Vergleich zu ihrer wahrscheinlichen Lebenserwartung innerhalb der weiblichen Fortpflanzungsorgane.
Dies ist, wie bereits erwähnt, ein Ergebnis der "künstlichen" Behandlung der Spermien unter den notwendigen Bedingungen bei der praktischen Ausführung des vorliegenden Beispiels. Das beschriebene Verfahren und dessen Dauer machen es umso mehr einer Ionenaustauscher-Veränderung des chromatographischen Verfahrens ähnlicher. Nichtsdestoweniger muss beachtet werden, dass Spermien, auch dann, wenn sie nach der Erfindung behandelt wurden, eine nahezu unbegrenzte Lebensdauer haben, wenn sie bei niedrigen Temperaturen, etwa bei 10 bis 5 C oder weniger, gehalten werden.
Beispiel 18 : Bei einer weiteren Untersuchung liess man menschliche Spermien durch ein 75 mm-Bett eines mit physiologischer Salzlösung ins Gleichgewicht gebrachten sulfonierten Copolymeren aus 92 Gew.-% Styrol und 8 Gel,-% Divinylbenzol ("Dowex 50") hindurchlaufen. Die Spermien wurden dann mit einem positiv-geladenen Behandlungsmittel, das ein Mikrogel eines quaternisierten Copolymeren aus Vinylbenzylchlorid mit 0,3 Grew,-% Divinylbenzol war, "gefärbt". Eine 970fache Vergrösserung bei ultraviolettem fluoreszierendem Licht zeigte, dass das positiv-geladene Mikrogel an mindestens der Hälfte der Köpfe der Spermien haftete, während sie lebten, praktisch genauso, wie wenn man die Quinacrin-Färbung für tote Spermien verwende-
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Beispiel 19 : In einem weiteren Versuch wurde menschliche Spermien enthaltende Flüssigkeit durch ein Bett des gleichen Ionenaustauschers wie in Beispiel 18 ("Dowex 50") in einer Kolonne mit einem Durchmesser von 0, 48 cm, die 150 mm hoch war und durch 0, 8'7go NaCl und 0, 154 Mol Natriumphosphat bei einem pH-Wert von etwa 7, 15 ins Gleichgewicht gebracht worden war, hindurchgeleitet.
Die Untersuchung der Objektträger, die aus dem Abfluss der behandelten menschlichen Spermien hergestellt wurden, ergab, nach dem Färben mit einer zuigen wässerigen Lösung von Quinacrin-Dihydrochlorid (von der gleichen Art wie vorstehend beschrieben) Verhältnisse von"F-Körpern"zu"Nicht-F-Körpem"von 2 : 34, 3 : 32 und 1 : 32, was jeweils den männlich-zu-weiblich-Verhältnissen in den behandelten Spermien entspricht.
Auf ähnliche Art und Weise liess man Spermien durch 700 mm des gleichen Ionenaustauschers wie in Beispiel 18 ("Dowex 50") von einerTeilchengrösse von 16 bis 50 Maschen, der mit etwa 0, 1 Mol NatriumphosphatNatriumcitrat bei einem pH-Wert von etwa 7, 18 ins Gleichgewicht gebracht worden war, hindurchlaufen ; nach anschliessender Herstellung und Färbung der Objektträger ergaben sich Verhältnisse der"F-Körper"zu"Nicht- F-Körper"von l : 18, 17 : 208 und 2 : 242, besonders für die Schnitte Nr. 3 bis 5 des Abflusses.
Wenn das Verfahren bei 50C durchgeführt wird, verlängert sich, wie ebenfalls im vorangegangenen Beispiel 18 bereits erwähnt wurde, das Leben und somit der Prozentsatz der beweglichen und/oder lebenden (und relativ ungehinderten) Spermien in dem wiedererwärmten Abfluss.
Beispiel 20 : Dieses Beispiel betrifft die Ionenaustauscher-Behandlung von Kaninchen-Spermien für in vivo Versuche, wobei das Geschlecht des Kaninchennachwuchses bestimmt wurde durch ein 6-Tage Blastocyst-
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ninchen wurden 4 Tage lang durch ein Follikel-stimulierendes Hormon (d, h, "FSH") stimuliert und dann durch eine Gabe von chorionischem Gonadotrophin zur Ovulation gebracht.
Kaninchensamen wurde im Verhältnis l : 9 mit wässeriger physiologischer Salzlösung verdünnt und in einer Kolonne mit einer Betthöhe von etwa 50 mm mit einem Ionenaustauscher behandelt. Die stimulierten weiblichen Kaninchen wurden mit dem Abfluss aus dieser Kolonne besamt, wobei vorher durch eine mikroskopische Untersuchung festgestellt worden war, dass der Abfluss lebende Spermien enthielt,
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Nach einer etwa 6tägigen Schwangerschaftsdauer wurden die Blastocysten aus dem Fortpflanzungssystem entnommen, anschliessend abgesondert und zwischen dem Objektträger und dem Schutzglas eines Mikroskops flachgedrückt.
Das Chromatin der Zellen wurde gefärbt und das Geschlecht einer jeden Blastocyst-Probe wurde durch Untersuchung verschiedener Zellen bestimmt, wobei gefunden wurde, dass jede Zelle in der richtigen Zellteilungsphase war, in der die X- und Y-Chromosomen gesehen werden können.
Diese Behandlung ergab Blastocysten, die ausschliesslich weiblich waren.
Beispiel 2l : Ergebnisse von zumindest gleicher Qualität, Erfolg und Nutzen können nach dem Verfahren der Erfindung erhalten werden, wenn man vornehmlich die ausführlichen Arbeitsweisen und Lehren, die in all den vorangegangenen Beispielen beschrieben wurden, mit irgendeinem Säugetier, das behandelt werden soll, wiederholt. Besonders geeignet hiefür sind die Beispiele 3, 4,5, 6,7 und 10.
Als Beispiele von in Betracht kommenden Säugetieren seien genannt : Hasen, Biber, Bisamratten, Ratten aller Arten, Mäuse aller Arten, Hunde aller Arten, Eichhörnchen aller Arten, Hamster, Spitzmäuse, Maulwürfe u. dgl,
Beispiel 22 : Gleichwertige Ergebnisse werden auch erhalten, wenn ein oder sämtliche Verfahren der vorstehenden Beispiele auf andere Säugetiere, deren Typ und Art nicht einzeln angegeben wurden und die als sogenannte höhere Klasse der Säugetiere bezeichnet werden, angewendet werden, z.
B. auf : Beuteltiere, wie das Känguruh oder Opossum usw. : Huftiere, einschliesslich solcher Spalt- oder Einzelhuftiere wie Wild, Antilopen, Pferde ; Bären, Raubtiere, einschliesslich, aber nicht nur : Hunde, Wölfe. Kojoten usw., Katzen, Tiger und andere katzenartige Tiere, wie Dachse, usw., Dickhäuter, einschliesslich Elefanten, Nilpferde usw. wie auch Mitglieder der Rhinozeros-Familie, Walfische, einschliesslich Seehunden usw., und andere Säugetiere, wie Faultiere, Murmeltiere, Nerze, Wiesel, Fledermäuse aller Arten usw.
Aus der vorangehenden Beschreibung und den Beispielen geht klar hervor, dass sich die Erfindung im Grunde durch ein einfaches, vorteilhaftes und wirtschaftliches Verfahren für die Trennung lebender Spermzellen in das männliche oder weibliche Geschlecht bestimmende Spermzellen bezieht.
In grossen Umrissen, und wie aus dem Vorstehenden klar hervorgeht, schliessen die allgemeinen Parameter und Faktoren fUr die erfolgreiche Durchführung der Erfindung folgendes ein :
1, den Molekülbau, wenn ein polymeres Behandlungsmittel verwendet wird ;
2. die Teilchengrösse irgendeines gegebenen Behandlungsmittels, das für diesen Zweck verwendet wird ; und
3. die pH-Bedingungen, bei denen die Behandlung durchgeführt wird.
Weiterhin, und wie aus dem Vorstehenden ebenfalls ersichtlich, richtet sich die Erfindung theoretisch und praktisch auf ein Verfahren zur zuverlässigen Geschi echtsvorherbestimmung und auf verschiedene Methoden und Anwendungen für die elektrostatische Aufladung der Spermien zum Zwecke ihrer Trennung.
Es können dabei unter anderem folgende Faktoren eine Rolle spielen : a) Die Änderung der Dichte oder des Gewichtes in Abhängigkeit von dem geschlechtsbestimmenden Fak- tor der Spermien. b) Die Änderung der elektrostatischen Ladung der das männliche oder weibliche Geschlecht bestimmen- den Faktoren der Spermien. c) Die magnetische Beeinflussung der das männliche oder weibliche Geschlecht bestimmenden Spermien. d) Die Trennung der Spermien nach ihren das Geschlecht bestimmenden Faktoren durch Behandlung mit
Ionenaustauschern. e) Das Behindern oder Unbeweglichmachen der Spermien mit dem geschlechtsbestimmenden Faktor für eine Art (männlich oder weiblich) Spermien, die nach einem Verfahren der Erfindung behandelt wur- den.
Auf diese Art und Weise wird bei dieser Erfindung durch die Wechselwirkung eine Art von Spermzellen (männlich oder weiblich, wie erwünscht) durch das Behandlungsmittel daran gehindert, sich dem Ei zu nähern und es zu befruchten. So kann sich allein die gewünschte Art der Spermien frei auf das Ei hinbewegen und die Befruchtung ausführen.
Angenommen, die Angaben in dem zitierten Aufsatz von Schroeder und Gordon stimmen und die daraus gefolgerten Schlüsse, dass die das männliche Geschlecht bestimmenden Spermien positiv geladen sind, dann müssten umgekehrt die das weibliche Geschlecht bestimmenden Spermien negativ geladen sein. Wenn dies der
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steht aus weiblichen Spermien, die negativ geladen sind. Angenommen, man möchte weiblichen Nachwuchs erhalten, so muss man nach der Erfindung ein negativ elektrostatisch geladenes oder wirksames Mittel verwenden, das die männlichen Spermien hemmt und inhibiert.
Auf der andern Seite kann, wenn männlicher Nachwuchs gewünscht wird, ein positiv elektrostatisch geladenes (oder ähnlich wirkendes) Mittel verwendet werden, wobei die weiblichen Spermzellen in ihrem Versuch, das Ei zu befruchten, gehindert werden (oder in eine ungünstige Lage gesetzt, wenn nicht gänzlich unbeweglich gemacht werden). Da Vissolonovy (bereits vorstehend zitiert) vom Beginn seiner Versuche an erwähnt hat, dass männliche Spermien negativ geladen und weibliche Spermien positiv geladen sind, kann man die wahre
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Art der Ladung der männlich- und weiblich-bestimmenden Spermien durch einen einfachen Versuch feststellen.
In andern Worten ausgedrückt, schränkt das "Behindern" eines Teils der Spermzellen durch Anhaften von den oben beschriebenen Teilchen daran, die Fähigkeit der gehinderten Spermien sehr ein, sich dem Ei zu nähern und es zu befruchten. Wie bereits erwähnt, verschafft ein einfacher Versuch, bei dem so "gehinderte" Spermien verwendet werden, die erwünschte Auskunft bezüglich der notwendigen Behandlung, um das für die Art gewünschte Geschlecht zu erhalten und vorherzubestimmen.
Es muss noch einmal darauf hingewiesen werden, dass eine natürliche oder eine angemessen verdünnte Samenflüssigkeit, nach der Behandlung in Übereinstimmung mit der Erfindung, Spermien aufweist, die unter anderem folgende Merkmale besitzen : a) unbeeinflusste Spermien ; b) bewegliche Spermien ; c) wirkungslos sich bewegende vielfache Spermien, die, in dem einen oder andern Fall, tatsächlich phy- sikalisch aneinanderhaften oder -"kleben", mindestens als Paare und häufig, was viele Beobachtungen ergaben, in grossen Massen, bei denen die lebenden Spermien nicht in der Lage sind, das Ei zu errei- chen und zu befruchten ;
d) Spermien, die durch das Anhaften des Behandlungsmittels an sich behindert sind oder durch Zusätze (wie BaSO. usw.), wobei die Spermien an diese Stoffe physikalisch gebunden sind, so dass sie zumin- dest gehindert oder teilweise oder gänzlich unbeweglich gemacht sind und nicht in der Lage sind, ein
Ei zu befruchten ; e) vergeblich sich bewegende einzelne Spermien, manchmal verformt, deren Bewegungsfähigkeit durch Änderung ihrer normalen Morphologie oder Physiologie beeinträchtigt wird ; und f) Spermien, die in ein unbewegliches Stadium übergegangen sind und somit keine Möglichkeit haben, das Ei zu erreichen und/oder es zu befruchten.
Obwohl es bei der Durchführung des Verfahrens nicht unbedingt erforderlich ist, wird empfohlen, den PHWert und den Sinn der elektrischen Ladung des Behandlungsmittels so einzustellen, dass dies dem natürlichen PH-Gradienten des weiblichen Fortpflanzungsteils entspricht, wobei es sich hiebei um eine sehr zweckmässige Ausgestaltung der Erfindung handelt.
Das Anhaften geeigneter und zweckmässiger Behandlungsmittel nach der Erfindung an einzelne Spermien oder Spermgruppen erhöht die Wechselwirkung zwischen dem Behandlungsmittel und den Spermien.
Dies schliesst das Hinzufügen vonBehandlungsmitteln irgendeines gegebenen bestimmten Typs oder Charakters ein, die ein bestimmtes spezifisches Gewicht in einem weiten Bereich haben können.
Dementsprechend schliesst dies solche Faktoren und notwendigen Vorgänge bei der Spermtrennung ein, wie : Absetzen, Zentrifugieren, Dekantieren usw.
Das Gewicht und/oder die Grösse der X-Chromosomen des weiblich-bestimmenden Teils der normalen Spermien ist sichtbar grösser als die der entgegengesetzten Y-Chromosomen der männlich-bestimmenden Spermien. Die Literatur berichtet über die Wahrscheinlichkeit, dass in natürlichem Säugetiersamen aus verschiedenen Quellen etwa 9 o des weiblich-bestimmenden Spermas schwerer sind als etwa 0, 006% der männlich bestimmenden Spermien darin ;
trotz der bekannten und beobachteten Unterschiede in Gewicht und/oder Grösse der andern Chromosomen in der Spermzelle, die im Falle der menschlichen Spermien 22 beträgt, mit im ganzen 23 in jedem normalen Sperma, wenn man die normal gefundenen einzelnen X- oder Y-Chromosome mitzählt,
Daraus ergibt sich der Vorteil bei der Verwendung der erfindungsgemässen Behandlungsmittel, die eine höhere Dichte als das Sperma besitzen, um ein schwereres Sperma von einem leichteren Sperma zu trennen oder umgekehrt,
Alternativ und mit gleich guten Ergebnissen können Materialien verwendet werden, die eine höhere Ladungsdichte besitzen als die behandelten Spermien. Darauf beruht ihre Verhaltensweise unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes.
In ähnlicher Weise können magnetisierbare Materialien mit den Spermien verknüpft werden, so dass dadurch eine Beeinflussbarkeit der so behandelten Spermien durch ein magnetisches Feld gegeben ist.
Schliesslich sei erneut darauf hingewiesen, dass eine besonders vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung vorsieht, dass man ein flüssiges Medium, das lebende Spermien enthält, über ein Bett oder eine Kolonne oder eine ähnliche physikalische Anordnung des gewünschten Behandlungsmittels leitet und dadurch eine schnelle und einfache Trennung der Spermien nach ihrem geschlechtsbestimmenden Merkmal herbeiführt. Als Behandlungsmittel in solchen Kolonnen oder ähnlichen Anordnungen sind besonders Ionenaustauscherharze, wie ein sulfoniertes Styroldivinylbenzolcopolymeres, geeignet.
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