KR20000049647A - 개 정액 냉동용 조성물, 이를 이용한 개 정액 냉동방법 및이 냉동된 정액을 이용한 인공수정 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 개 정액의 냉동용 조성물 및 이를 이용한 냉동방법에 관한 것이며, 또한 상기의 냉동방법에 의해 냉동된 정액을 이용한 인공수정방법에 관한 것이다. 본 발명은 증류수 100ml 당 구연산 나트륨 0.25 내지 4.5g, 덱스트로우스 0.45 내지 4.0g, 페니실린 0.01 내지 0.3g, 스트렙토마이신 5만 내지 50만 IU, 카탈라제 0.25 내지 0.45g, 난황 0.045 내지 0.25g, 글리세롤 1.5 내지 15ml 및 개의 혈청 0.02 내지 0.1㎍을 함유하는 개 정액 냉동을 위한 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 (a) 맛사지법 또는 전기충격법에 의해 숫캐의 정액을 채취하는 정액채취단계; (b) 상기 채취한 정액을 원심분리하여 상층부의 유체는 걸러내고 하단부만을 취하는 정액분리단계; (c) 상기 하단부의 정액과 상술한 바와 같은 조성물을 용량비가 1:1이 되도록 1차 냉장시키는 단계; (d) 상기 (c) 단계에 의해 생성된 혼합물에 상술한 바와 같은 조성물을 더 부가하여 상기 정액과 조성물의 용량비가 1:2가 되도록 혼합하고 2차 냉장시키는 단계: 및 (e) 상기 (d) 단계에 의해 생성된 혼합물에 액체질소를 부가하여 냉동시키는 단계를 포함하는 개 정액의 냉동방법을 제공한다.

Description

개 정액 냉동용 조성물, 이를 이용한 개 정액 냉동방법 및 이 냉동된 정액을 이용한 인공수정 방법{Compositions for freezing dog sperm, freezing methods of the dog sperm utilizing the compositions and artificial insemination method empolying the freezed dog sperm}

본 발명은 개 정액 냉동을 위한 조성물, 이 조성물을 사용한 개 정액 냉동방법 및 이 냉동된 정액을 이용하여 인공수정하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 개 정액을 냉동하고 일정 시간이 경과한 후 해동하여도 정액 내에 살아 있는 정충의 수, 정충의 성상과 활력 등이 그대로 유지될 수 있게 하는 개 정액 냉동용 조성물, 이 조성물을 이용한 개 정액 냉동방법 및 냉동된 개 정액을 적당한 장소 및 시기에 해동하여 암캐의 질내에 주입하여 인공수정하는 방법에 관한 것이다.

근래 산업의 발달과 더불어 유전공학은 그 국가의 과학발전을 간음할 수 있는 척도라 할만큼 중요한 학문으로 자리잡고 있다. 이러한 유전공학은 우량 품종을 보존 개발하고, 나아가 인류의 생명을 보존하기 위해 필요한 학문으로서 기초 단계를 넘어 상당한 수준에 이르고 있다.

인간이 사육하고 있는 가축이나 애완동물의 번식을 위하여 종부를 시킬 때에 자연종부를 실시하게 되면 수컷 1마리와 암컷 1마리밖에 종부시킬 수 없으나, 액상 정액을 이용하여 인공수정을 시키면 한번 채취한 수컷의 원 정액을 희석액과 혼합하여 정액량을 증가시켜 여러마리의 암컷에 수정을 시킬 수 있다. 따라서 인공수정에 의하면 우수한 종자나 순종인 수컷의 정액을 채취하여 동시에 여러마리의 암컷에 수정이 가능하므로 혈통이 우수한 종자의 생산 및 순종의 보존이 가능해진다.

이러한 장점을 가지고 있는 인공수정 방법이 성공하기 위해서는 희석제의 개발이 중요한 관건이 되는데, 이에 대한 연구가 수십년 전부터 시작되어 돼지, 말 또는 소에 적용할 수 있는 희석제는 개발되어 사용되고 있으나, 아직 개의 정액에 적용가능한 희석제에 대한 개발은 현재 미비한 시점이다.

또한, 수컷의 정액을 갖 채취하였을 때와 유사한 상태를 유지하면서 장기간 보존할 수 있는 방법이 개발된다면 혈통이 우수한 종자 또는 순종이 수컷인 정자를 채취하였다가 필요한 경우에 암컷에 수정시킬 수 있기 때문에 축산 또는 애완동물 사업의 발전에 크게 기여할 수 있다.

상술한 정액의 장기 보존 방법으로는 냉동에 의한 방법이 가장 적절한데, 이러한 정액의 냉동 방법에 대해서도 유독 개에 대해서만 발전이 미비하다.

이에 대한 특별한 원인은 밝혀져 있지 않지만, 정충에 특이성이 있는 숫캐의 정액의 냉동 보관을 위한 시약 및 그 시약을 이용한 냉동방법이 개발되어 있지 않기 때문이다.

따라서, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 정충에 특이성을 가지고 있는 개의 정액의 냉동 보관을 가능하게 하는 개 정액 냉동용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명이 이루고자 하는 다른 기술적 과제는 상기의 조성물을 이용하여 숫캐에서 채취한 정액을 냉동시키는 방법으로서 정액의 장기간 보관이 가능하고, 운반이 편리하며 적기에 해동하여 인공수정이 가능하게 하는 개 정액 냉동방법을 제공하는 것이다.

본 발명이 이루고자 하는 또 다른 기술적 과제는 우수한 품종을 보존 개발하고, 이를 널리 보급할 수 있도록 하는 상기의 냉동방법에 의한 냉동 보관된 정액을 이용한 인공수정 방법을 제공하는 것이다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 증류수 100ml 당 구연산 나트륨 0.25 내지 4.5g, 덱스트로우스 0.45 내지 4.0g, 페니실린 0.01 내지 0.3g, 스트렙토마이신 5만 내지 50만 IU, 카탈라제 0.25 내지 0.45g, 난황 0.045 내지 0.25g, 글리세롤 1.5 내지 15ml 및 개의 혈청 0.02 내지 0.1㎍을 함유하는 개 정액 냉동을 위한 조성물을 제공한다.

상기 다른 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은,

(a) 맛사지법 또는 전기충격법에 의해 숫캐의 정액을 채취하는 정액채취단계;

(b) 상기 채취한 정액을 원심분리하여 상층부의 유체는 걸러내고 하단부만을 취하는 정액분리단계;

(c) 상기 하단부의 정액과 상술한 바와 같은 조성물의 용량비가 1:1이 되도록 혼합하고 1차 냉장시키는 단계;

(d) 상기 (c) 단계에 의해 생성된 혼합물에 상술한 바와 같은 조성물을 더 부가하여 상기 정액과 조성물의 용량비가 1:2가 되도록 혼합하고 2차 냉장시키는 단계: 및

(e) 상기 (d) 단계에 의해 생성된 혼합물에 액체질소를 부가하여 냉동시키는 단계를 포함하는 개 정액의 냉동방법을 제공한다.

상기 또 다른 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은

(a) 수태율 향상을 위해 질세포 검사법, 호르몬 검사법 및 질경으로 링클검사법으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 방법으로 암캐의 배란 적기를 검사하는 단계;

(b) 상술한 바와 같은 방법으로 제조된 냉동 정액을 30 내지 40℃로 가온된 0.3 내지 1.5 중량%의 염화나트륨 수용액과 개의 혈청으로 이루어진 혼합물에 부가하여 해동하는 단계; 및

(c) 상기 해동된 정액을 암캐의 질내에 주입하고 음핵을 맛사지하는 정액주입단계를 포함하는 냉동된 정액을 이용한 개 인공수정 방법을 제공한다.

본 발명자는 개 정액의 냉동 보관을 방법 및 이에 사용되는 조성물을 개발하기 위하여 광범위한 연구를 하던 중 일반적으로 소, 돼지 등에 사용된던 희석제와 유사한 조성을 가진 조성물에 개의 혈청을 미량 포함시키므로써 개 정액의 냉동 보관이 가능함을 발견하여 본 발명을 완성하게 된 것이다.

이하, 본 발명에 대해서 상세히 설명하기로 한다.

우선, 개 정액 냉동을 위한 조성물에 대하여 살펴보기로 한다.

본 발명에 따른 개 정액 냉동을 위한 조성물은 증류수 100ml에 정충의 완충작용, 및 산도(pH)와 삼투압을 조절하기 위하여 구연산 나트륨 0.25 내지 4.5g, 대사기질 및 에너지원으로 덱스트로우스 0.45 내지 4.0g, 액상 정액 내의 세균오염에 의한 정자의 생존성 저하를 방지하기 위하여 항생제인 페니실린 0.01 내지 0.3g과 스트렙토마이신 5만 내지 50만 IU, 카탈라제 0.25 내지 0.45g, 난황 0.045 내지 0.25g, 글리세롤 1.5 내지 15ml 및 개의 혈청 0.02 내지 0.1㎍을 부가하여 균일하게 혼합하여 제조된다. 이렇게 제조된 조성물은 약 2ml씩 나누어 냉동하고 사용할 때 해동하여 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 냉동 정액의 정충 생존성 및 활력을 유지시켜 정액을 장기간 보존할 수 있고 해동 후에 정상적인 수태율과 분만율을 보이게 하는 개의 혈청을 함유하고 있다.

다음으로 상술한 바와 같은 조성물을 이용한 개 정액의 냉동방법에 대하여 살펴보기로 한다.

우선, 개의 정액을 냉동시키기 위해서는 정액채취단계가 선행되어야 하는데, 이 정액채취방법은 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 지식을 가진 자에 널리 알려진 방법이라면 특별한 제한없이 이용가능하나, 바람직하게는 맛사지법 또는 전기충격법을 이용할 수 있다. 이중 가장 많이 이용되는 맛사지법에 대해 간단히 살펴보면 다음과 같다.

뇨가 섞이면 정충이 빨리 죽기 때문에 정액을 채취하기 전에 숫캐의 소변을 보게하는 것이 바람직하다. 이어서 인공질을 삽입한 시험관을 이용하여 숫캐의 생식기를 맛사지하여 사정을 시켜서 정액을 채취하게 된다. 이 때에서 정액 채취를 용이하게 하기 위하여 숫캐의 근처에 발정난 암캐를 두거나, 발정난 암캐의 질 분비물을 흡습시킨 면이나 스폰지를 냉동시켰두었다가 정액을 채취할 때 해동하여 면이나 스폰지를 개의 코에 대어 질 분비물 냄새를 맡게한다.

이러한 맛사지법으로 정액을 채취하는 경우에 정액은 세분획으로 나누어 채취할 수 있는데 정충을 함유하는 분획은 두번째 분획이며, 각 분획은 일반적으로 10초 내지 20초 간격이 있으나, 개체에 따라서는 첫째 분획과 둘째 분획의 간격이 짧아서 구별할 수 없는 경우가 있다. 본 발명에서는 두번째 분획을 이용하는 것이 바람직하나, 구별할 수 없는 경우에는 세가지 분획 모두를 하나의 시험관에 채취하여 이용할 수 있다.

이어서, 상술한 방법으로 채취한 정액을 원심분리기를 통해 분리하여 하단부에 가라 앉은 것만 남기고 상층부의 유체(fluid)는 버린다. 원심분리는 대략 RPM 500 ~ 1100/분에서 6분간 이루어지게 된다.

이렇게 분리된 하단부의 정액과 앞서서 제조한 조성물을 동일한 용량비로 실온에서 혼합한 후 이 혼합물을 1차 냉장시킨다. 여기에서 냉장시간은 약 10 내지 20분 정도이고 냉장온도는 약 5℃ 정도이다. 1차 냉장을 시킨 혼합물에 정액과 조성물의 용량비가 1:2가 되도록 조성물을 실온에서 더 부가하고 혼합한 후 동일한 온도와 동일한 시간동안 2차 냉장시킨다. 이러한 1차, 2차 냉장 과정을 통하여 정액과 조성물은 균질하게 혼합되게 된다.

다음으로 2차 냉장을 시킨 혼합물을 스포이드를 이용하여 일정량 취한 후 드라이 아이스 표면에 2 내지 3방울씩 떨어뜨린다. 드라이 아이스의 표면 온도가 약 -79℃ 정도이므로 상기 혼합물이 어느 정도 냉동되게 된다. 이 냉동된 혼합물을 드라이 아이스에서 분리하고 약 -196℃를 보이는 액체 질소가 담긴 컨테이너에 부가하여 밀폐하면 개 정액의 냉동 공정은 완료되게 된다. 이와 같은 방법은 액체 질소내에 냉동된 혼합물의 형태가 펠릿 형태를 가지게 되어 일명 "펠릿법"이라 불린다.

상술한 바와 같은 펠릿법 외에 스트로우를 이용하는 스트로우법으로 개 정액을 냉동시킬 수 있는데 스트로우법에 대해서 간략히 설명하면 다음과 같다.

상술한 바와 같은 2차 냉장시킨 혼합물을 스트로우에 약 0.5ml씩 소분하고, 이 스트로우를 대략 20 내지 30개 단위로 묶어 액체질소가 담기 컨테이너에 담근다. 스트로우를 컨테이너에 담글 때 한번에 컨테이너 바닥에 까지 깊게 담그는 것이 아니라 순착적으로 컨테이너의 상부까지 담근 후에 일정시간 방치하고 다시 중간부까지 담그고 일정시간 방치하고 이어서 바닥까지 담그어 냉동시키는 것이 바람직하다.

이와 같이 냉동된 정액은 임의의 장소로 이동 및 장기간의 보관이 가능하며, 필요한 때에 해동하여 인공수정에 사용할 수 있다.

다음으로 냉동된 정액을 이용한 인공수정 방법을 살펴보기로 한다.

먼저, 인공수정을 위해서는 암캐가 배란 적기에 있는가를 검사하게 되는데, 이 암캐의 배란 적기 검사는 예를 들어 질 세포 검사, 호르몬 검사 및 질경으로 링클검사와 같이 본 발명이 속하는 통상의 지식을 가진 자에게 널리 알려진 방법에 의해 실시된다.

다음으로 상술한 것과 같은 방법으로 냉동된 정액을 해동하여야 하는데 해동방법은 30 내지 40℃로 가온된 0.3 내지 1.5중량%의 염화나트륨 수용액과 미량의 개 혈청의 혼합액에 냉동된 정액을 부가하여 해동하게 되는데 염화나트륨 수용액과 개 혈청 혼합액에 부가하는 것이 정충의 활력 및 성상을 유지하는 데 바람직하다. 또한, 염화나트륨 수용액과 개 혈청의 혼합액을 가온하는 방법은 직접 가열할 수 도 있으나, 이 경우에는 적절한 온도 조절이 곤란하므로 약 50℃ 정도의 온수에 염화나트륨 수용액과 개 혈청의 혼합액을 함유한 밀폐 용기를 넣고 가온하는 방법이 바람직하다.

상술한 바와 같은 방법으로 해동된 정액을 인공수정에 이용하기 전에 현미경을 이용하여 살아 있는 정충의 수와 정충의 성상 및 운동성을 검사한다. 전진운동을 하는 정충의 양에 따라 인공수정의 성공여부가 달려있는데 이러한 정충의 운동성은 다음과 같은 4등급으로 분류할 수 있다.

0등급은 전진 운동을 하지 않고 정충의 꼬리 부분만이 운동하는 경우이고, 1등급은 전진운동을 하는 정충의 양이 20% 이하인 경우이고, 2등급은 전진운동을 하는 정충의 양이 20 내지 50%인 경우이고, 3등급은 전진운동을 하는 정충의 양이 50 내지 80%인 경우이고, 4 등급은 전진운동을 하는 정충의 양이 80% 이상인 경우이다. 상기의 해동된 정액을 슬라이드에 놓고 현미경을 통하여 관찰하였을 때 정충의 운동성 등급이 적어도 2등급 이상인 경우의 정액을 인공수정에 사용한다.

이어서 배란 적기에 있는 것으로 판단된 암캐의 질에 상기 해동된 정액을 주입한 후 암캐의 음핵을 수분간 맛사지하면 인공수정은 완료된다.

물론 이러한 인공수정 방법 이외에 해동된 정액을 외과적으로 암캐의 자궁에 주입할 수 도 있다. 즉, 암캐의 정준선 제대 3 내지 5cm 하단을 약 2cm 정도 절개하여 자궁을 들어 올린 다음, 주사 바늘을 이용하여 숫캐의 정액을 직접 자궁각에 주입한 후 복막, 복근, 피부를 순차적으로 봉합하는 수정방법이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명하기로 한다. 후술하는 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것이 아님은 명백하다.

＜실시예 1＞

개정액 냉동용 조성물의 제조

다음과 같은 조성을 혼합물을 혼합기를 이용하여 균일하게 혼합하여 개정액 냉동용 조성물을 제조하였다.

증류수 100ml에 있어서,

구연산 나트륨 0.35g

덱스트로우스 2.5g

페니실린 0.02g

스트렙토마이신 10만IU

카탈라제 0.35g

난황 0.05g

글리세롤 2ml

개의 혈청 0.05㎍

개 정액 냉동방법

정액은 전기충격법으로 체중이 43㎏이고, 6살된 세파트를 사용하여 채취하였다. 채취한 정액의 양은 6.2ml이였다. 다음으로, 채취한 정액은 원심분리기를 통해 분리하여 하단부에 가라 앉은 것만 남기고 상층부의 유체는 제거하였다. 원심분리는 대략 RPM 500 ~ 1100/분에서 6분간 이루어졌다. 그 결과는 채취 완료된 정액은 0.8ml이였다.

이렇게 분리된 하단부의 정액과 앞서서 제조한 조성물을 동일한 용량비로 실온에서 혼합한 후 이 혼합물을 1차 냉장시켰다. 여기에서 냉장시간은 약 10 내지 20분 정도이고 냉장온도는 약 5℃ 정도이였다. 1차 냉장을 시킨 혼합물에 정액과 조성물의 용량비가 1:2가 되도록 조성물을 실온에서 더 부가하고 혼합한 후 동일한 온도와 동일한 시간동안 2차 냉장시켰다.

다음으로 2차 냉장을 시킨 정액과 조성물의 혼합물을 스포이드를 이용하여 일정량 취한 후 드라이 아이스 표면에 2 내지 3방울씩 떨어뜨렸다. 드라이 아이스의 표면 온도가 약 -79℃ 정도이므로 상기 혼합물이 어느 정도 냉동되게 된다. 이 냉동된 혼합물을 드라이 아이스에서 분리하였다. 이어서, 약 -196℃를 보이는 액체 질소가 담긴 컨테이너에 부가하여 밀폐하여 개 정액을 냉동시켰다.

냉동된 정액을 이용한 인공수정

인공수정에는 체중이 30kg이고, 3살난 세파트 암컷 3마리를 사용하였다. 이 암캐가 배란 적기에 있는 가는 질 세포 검사법을 이용하여 검사하였다.

다음으로 상술한 것과 같은 방법으로 냉동된 정액을 해동하여야 하는데, 해동방법은 38℃로 가온된 1.5중량%의 염화나트륨 수용액 30ml과 개 혈청 0.01㎍의 혼합액에 냉동된 정액을 부가하고 5시간 동안 방치하여 냉동된 정액을 해동하였다.

이어서, 해동된 정액을 인공수정에 이용하기 전에 현미경을 이용하여 살아 있는 정충의 운동성을 검사하였다. 이 운동성 검사는 해동된 정액을 슬라이드에 놓고 현미경을 통하여 관찰하는 방법으로 하였다. 전진운동을 하는 정충의 양에 따라 인공수정의 성공여부가 달려있는데, 전진운동을 하는 정충의 양이 85%로 나타나, 인공수정을 위해서는 매우 적합한 상태를 보였다.

이어서 상기 해동된 정액을 3등분하여 배란 적기에 있는 것으로 판단된 암캐의 질에 각각 주입한 후 암캐의 음핵을 5분간 맛사지하여 인공수정을 완료하였다.

인공수정 완료 후에 1개월 후에 수태 여부를 검사한 결과 암캐 3마리 모두다 수태된 것으로 나타났다. 그 후에 암캐 3마리는 각각 4마리, 6마리, 9마리의 건강한 강아지를 출산하였다.

＜실시예 2＞

본 실시예에서는 전술한 실시예 1에서 개의 혈청의 양을 0.02㎍으로 한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 개 정액 냉동용 조성물을 제조하였다.

이어서, 이 조성물을 이용하여 전술한 실시예 1과 동일한 과정을 거쳐 개정액의 냉동 및 인공수정을 실시하였다.

본 실시예는 숫캐로 체중이 40kg이고, 5살된 세파트를 이용하였고, 암캐로는 각각의 체중이 25kg, 30kg, 28kg인 3살 난 세파트를 이용하였다.

해동된 정액의 운동성 검사 결과는 전진운동을 하는 정충의 양이 60%로 나타나, 인공수정을 위해서는 적합한 상태이였다.

인공수정 완료 후에 1개월 후에 수태 여부를 검사한 결과 2마라의 암캐에서 수태된 것으로 나타났다. 그 후, 수태한 암캐 2마리는 각각 5마리, 6마리의 건강한 강아지를 출산하였다.

＜비교예 1＞

본 비교예에서는 전술한 실시예 1과 동일한 조성을 갖는 개 정액을 냉동용 조성물을 제조하였으며, 이 조성물과 채취한 정액의 용량비를 1:1로 한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 냉동하였다. 정액의 채취는 실시예 1에서와 동일한 방법으로, 같은 숫캐를 이용하여 실시되었다.

냉동한 정액은 전술한 실시예 1과 동일한 방법으로 해동하여 정충의 운동성을 검사하였다. 그 결과는 전진운동을 하는 정충의 양이 20% 이하로 나타났으며, 이는 인공수정을 하기에는 부적합한 상태이다.

＜비교예 2＞

본 비교예에서는 전술한 실시예 1의 냉동용 조성물에서 개의 혈청을 포함시키지 않은 것을 제외하고는 동일한 개 정액 냉동용 조성물을 제조하였다.

개정액의 냉동방법 및 해동방법은 전술한 실시예1과 동일하였으며, 정액을 채취한 숫캐 역시 같았다.

본 비교예에 따라 냉동되고 해동된 정충의 운동성을 검사한 결과 전진 운동을 하지 않고 정충의 꼬리 부분만이 운동하는 것으로 나타났다. 이는 인공수정을 하기에는 매우 부적합한 상태이다.

상술한 바와 같이 본 발명은 정충에 특이성이 있어서 냉동 보관이 힘들었던 개의 정액을 냉동할 수 있는 방법 및 그에 이용되는 조성물을 제공하므로써 냉동보관이 가능하게 되어 혈통이 우수한 개의 품종을 보존할 수 있고, 냉동 보관된 숫캐의 정액을 적절한 시기 및 장소에서 암캐에 인공수정하여 수태율을 높일 수 있는 효과를 가지고 있다.

또한, 본 발명에 의하면 매년 1,500 내지 2,000두(농림수산부 통계)의 외국산 품종의 개 수입으로 인한 외화의 낭비를 막을 수 있으며, 역으로 우수한 혈통의 개를 생산하여 수출이 가능하다.

Claims (3)

1. 증류수 100ml 당 구연산 나트륨 0.25 내지 4.5g, 덱스트로우스 0.45 내지 4.0g, 페니실린 0.01 내지 0.3g, 스트렙토마이신 5만 내지 50만 IU, 카탈라제 0.25 내지 0.45g, 난황 0.045 내지 0.25g, 글리세롤 1.5 내지 15ml 및 개의 혈청 0.02 내지 0.1㎍을 함유하는 개 정액 냉동을 위한 조성물.
2. (a) 맛사지법 또는 전기충격법에 의해 숫캐의 정액을 채취하는 정액채취단계;

   (b) 상기 채취한 정액을 원심분리하여 상층부의 유체는 걸러내고 하단부만을 취하는 정액분리단계;

   (c) 상기 하단부의 정액과 제 1항의 조성물의 용량비가 1:1이 되도록 혼합하고 1차 냉장시키는 단계;

   (d) 상기 (c) 단계에 의해 생성된 혼합물에 제 1항의 조성물을 더 부가하여 상기 정액과 조성물의 용량비가 1:2가 되도록 혼합하고 2차 냉장시키는 단계: 및

   (e) 상기 (d) 단계에 의해 생성된 혼합물에 액체질소를 부가하여 냉동시키는 단계를 포함하는 개 정액의 냉동방법.
3. (a) 수태율 향상을 위해 질세포 검사법, 호르몬 검사법 및 질경으로 링클검사법으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 방법으로 암캐의 배란 적기를 검사하는 단계;

   (b) 제 2항에 의해 제조된 냉동정액을 30 내지 40℃로 가온된 0.3 내지 1.5중량%의 염화나트륨 수용액과 개의 혈청으로 이루어진 혼합물에 부가하여 해동하는 단계;

   (c) 상기 해동된 정액을 현미경을 통하여 정충의 운동성을 검사하는 단계; 및

   (d) 상기 해동된 정액을 암캐의 질내에 주입하고 음핵을 맛사지하는 정액주입단계를 포함하는 냉동된 정액을 이용한 개 인공수정방법.