DE10065241A1 - Adorber für die extrakorporale Blutreinigung und Verfahren der Herstellung - Google Patents
Adorber für die extrakorporale Blutreinigung und Verfahren der HerstellungInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft Immunadsorber für die extrakorporale Apherese und Verfahren zu ihrer Herstellung. DOLLAR A Die Erfindung ermöglicht die Entfernung von immunologisch wirksamen Substanzen aus dem Blutplasma, Vollblut oder jeder Art von Blutbestandteilen von Patienten, die an immunologischen Erkrankungen leiden. DOLLAR A Die erfindungsgemäßen Immunadsorber werden durch kovalente Bindung von vorzugsweise Protein A an unterschiedliche Trägermaterialien hergestellt. Zuvor erfolgt eine Aktivierung der Träger unter Verwendung eines speziellen Chlorkohlensäureesters (N-Chlorcarbonyloxy-5-norbonen-2,3-dicarboximid). DOLLAR A Die Erfindung zeichnet sich im Vergleich zu anderen auf dem Markt befindlichen Adsorbern durch höhere Stabilität und verbesserte Adsorptionseigenschaften, durch eine hohe Kapazität für die Elimination von Immunglobulinen, Antikörpern und Immunkomplexen aus dem Blutplasma und durch ein geringes Protein A-Leakage aus.
Description
Die Erfindung betrifft Immunadsorber für die extrakorporale Apherese und Verfahren zu ihrer
Herstellung.
Die Erfindung ermöglicht die Entfernung von immunologisch wirksamen Substanzen aus dem
Blutplasma, Vollblut oder jeder Art von Blutbestandteilen von Patienten, die an
immunologischen Erkrankungen leiden.
Die Erfindung zeichnet sich im Vergleich zu anderen auf dem Markt befindlichen Adsorbern
durch höhere Stabilität und verbesserte Adsorptionseigenschaften, durch eine hohe Kapazität
für die Elimination von Immunglobulinen, Antikörpern und Immunkomplexen aus dem
Blutplasma und durch ein geringes Protein A-Leakage aus.
Neben der therapeutischen Anwendung in der Apherese bieten sich Einsatzmöglichkeiten auf
anderen biowissenschaftlichen Gebieten an.
Die Aktivierung von unterschiedlichen Trägermaterialien (z. B. Perlcellulose, Sepharose CL-4B,
synthetische Polymere usw.) mit Cl-CO-ONB ist von Büttner W et al. in Biotechnol Bioeng
33 (1989) 26-31, Boeden HF et al. in J Chromatogr 552 (1991) 389-414 und von Boeden HF et
al. in Makromol Chem 193 (1992) 865-887 sowie in den Patentanmeldungen DD 219490, DD 220696
und EP 0134041 (unkatalytische Aktivierung) sowie in DD 279486 (basenkatalysierte
Aktivierung) beschrieben.
Bei der Überprüfung der in diesen Patenten und bei Boeden HF et al. in Biotechnol Bioeng
33 (1989) 26-31 beschriebenen unkatalytischen Aktivierung von Sepharose CL-4B wurde
gefunden, daß die Aktivierung in Dioxan (500 mg Cl-CO-ONB/ml Gel; 3 h bei 60°C) zu einer
Veränderung der Gelstruktur und teilweisen Zerstörung der Sepharoseperlen führte. Nach der
Überführung des Gels in Wasser löste sich die Sepharose zum Teil auf. Der verbliebene
unlösliche Trägeranteil war sehr weich und für chromatographische Zwecke nicht einsetzbar.
Das heißt, daß die in den o. g. Patenten beschriebene Aktivierung von Sepharose CL-4B nicht
für die Herstellung intakter aktivierter Träger sowie von Affinitätsträgern (nach Kopplung von
Liganden) geeignet ist. Für Perlcellulose ist diese Verfahrensweise jedoch wegen ihrer höheren
chemischen Stabilität anwendbar.
Bei eigenen umfangreichen Untersuchungen zur unkatalytischen Aktivierung von Sepharosen
(CL-4B und -4FF) mit Cl-CO-ONB wurde Sepharose CL-4B mit 30 bzw. 50-100 mg Cl-CO-
ONB/ml Gel in Aceton 16-20 h unter Schütteln bei 20-25°C aktiviert. Das aktivierte Gel löste
sich bei der anschließenden Überführung in Wasser zu etwa 25-50% bzw. vollständig auf. Das
heißt, die unkatalytische Aktivierung von Sepharose CL-4B mit Cl-CO-ONB kann nicht analog
zur Aktivierung von Perlcellulose durchgeführt werden.
Auch bei der Aktivierung der höher quervernetzten (und deshalb stabileren) Sepharose Fast
Flow wurde eine negative Veränderung der Matrix festgestellt, die sich dadurch äußerte, daß
sich die Durchflußeigenschaften der Sepharose FF nach erfolgter Aktivierung verschlechterten.
Für die Herstellung ONB-Carbonat-aktivierter Agarose-Träger mit einem Aktivierungsgrad bis zu
ca. 60 µmol aktiven Gruppen/ml Gel (abhängig von der Art des Trägers, dem eingesetzten
supernucleophilen Amin, dem Wassergehalt des Lösungsmittels und der Menge an Cl-CO-
ONB) ist generell auch die basenkatalysierte Aktivierung mit Cl-CO-ONB anwendbar [vgl. DD 279486
und Boeden HF et al. in J Chromatogr 552 (1991) 389-414], bei der eine Schädigung der
Gelstruktur durch die während der Aktivierung frei werdende HCl verhindert wird.
Bisher wurde nur die Herstellung von basenkatalytisch aktivierten Trägern mit einem
Aktivierungsgrad ≧20 µmol/ml Gel (Sepharose, Perlcellulose) beschrieben. Für die Herstellung
niedrigaktivierter Sepharose (Aktivierungsgrad: ca. 5-20 µmol/ml Gel) wurde diese Methode
bisher nicht genutzt.
Die erfolgreiche Immobilisierung von Proteinen an unkatalytisch aktivierte ONB-Carbonat-
Träger ist bereits mehrfach beschrieben worden [vgl. DD 219490, DD 220696, EP 0134041,
Büttner W et al. in Biotechnol Bioeng. 33 (1989) 26-31, Boeden HF et al. in J Chromatogr 552
(1991) 389-414, Boeden HF et al. in Makromol Chem 193 (1992) 865-887].
Es gibt aber keine detaillierten Angaben zum Einsatz von basenkatalytisch aktivierten Trägern
für eine Protein-Kopplung.
Die Immobilisierung von Protein A wurde nur für ONB-Carbonat-Perlcellulose (Divicell,
unkatalytisch aktiviert) beschrieben von Boeden HF et al. in J Chromatogr 552 (1991) 389-414.
Die Kopplung von Protein A an ONB-Carbonat-aktivierte Sepharose wurde bisher nicht
beschrieben.
Von einer Vielzahl der auf unterschiedliche Weise hergestellten Protein A-Adsorber sind von
den Herstellern Daten angegeben zur Aktivierung, zum immobilisierten Protein A und der IgG-
Bindungskapazität. Die angegebenen Daten zur IgG-Bindungskapazität sind nicht direkt
miteinander vergleichbar, weil deren Bestimmung nicht nach einer Standard-Methode erfolgte
(Variation der Bindungspuffer und pH-Werte, Flußrate, Gelbetthöhe, Menge an angebotenem
IgG und der Konzentration, Auswertung der Experimente, pH-Wert bei der Elution). Wegen der
notwendigen Vergleichbarkeit wurden diese Werte z. T. unter Standardbedingungen
nachgearbeitet.
Die kommerziell erhältlichen bzw. in der Apherese eingesetzten Protein A-Träger umfassen
folgende Bereiche für die immobilisierte Protein A-Menge und die hIgG-Bindungskapazität:
- a) 2-6,5 mg Protein A/ml Träger oder Gel
- b) 15-33 mg hIgG/ml Träger oder Gel.
Diese Werte werden auch durch die erfindungsgemäß hergestellten ONB-Sepharose 4FF-
Protein A-Adsorber erzielt.
Die bei der Immobilisierung von nativem Protein A an unterschiedlich aktivierte Träger (z. B. an
CNBr-, Tresyl-, Epoxy-, NHS-, Azlacton-, FMP-aktivierte Träger) erzielten Kopplungsausbeuten
betragen in der Regel weniger als 50%. Nur in einigen Ausnahmefällen (in Abhängigkeit von
der angebotenen Protein A-Menge und -Konzentration sowie der Pufferzusammensetzung)
wurden Kopplungsausbeuten von 60-90% erzielt.
In der Regel beträgt die dynamische hIgG-Bindungskapazität der meisten beschriebenen
Protein A-Träger bei Einsatz eines Überschusses von hIgG-haltigen Lösungen in geeigneten
Puffern zwischen 10-25 mg hIgG/ml Träger.
Die Mehrzahl der auf unterschiedliche Weise hergestellten Protein A-Adsorber bzw. -Träger (z. B.
Immobilisierung von nativem Protein A über CNBr-, Tresyl-, Epoxy-, NHS-, Azlacton-, FMP-,
bifunktionelle Silane) weist im Eluat mit 10-330 ng Protein A/mg eluiertes IgG ein relativ hohes
Protein A-Leakage auf.
Ein direkter Vergleich ist wegen der sehr unterschiedlichen Bedingungen bei der Bestimmung
des Protein A-Leakage schwierig (bei der IgG-Elution verwendete unterschiedliche pH-Werte,
unterschiedliche ELISA zur Bestimmung der Protein A-Konzentrationen). Der Bereich gibt aber
die Größenordnung des Protein A-Leakage der häufig verwendeten Protein-A-Träger an. Für
den Apherese-Träger von Excorim gibt es konkrete Angaben von Gjörstrup P et al. in Transfus
Sci 11 (1990) 281-302: protein A leakage: <1 ng/ml of treated plasma und Sepharose leakage
<2 µg/ml. Weitere Datenquellen für CNBr-aktivierte Träger sind Data Files von Pharmacia
Biotech, für NHS-aktivierte Träger Data Files von Pharmacia und Bio-Rad, für Epoxy-aktivierte
Träger Data Files von Amersham Pharmacia, für Tresyl-aktivierte Träger Info-Material von
TosoHaas GmbH und Nakamura K et al. in J Chromatogr 478 (1989) 159-167, für Azlacton-
aktivierte Träger (Fa. Pierce, USA) Instructions: UltraLink™ Immobilized Protein A and Protein A
Plus sowie Coleman PL et al. in J Chromatogr 512 (1990) 345-363 und Hermanson GT et al. in
J Chromatogr A 691 (1995) 113-122, für FMP-aktivierte Träger Protein A AvidPak™ der
Fa. UniSyn Technologies Incorp., USA, sowie Narinesingh C et al. in Analytical Letters 24 (1991)
2147-2155, für Silan-aktiviertes Kieselgel (Prosorba-Säulen) Firmenschriften der Imre-Corp.
sowie US 4681870 (1985), US 4801449 (1986), US 5037649 (1989) und US 5122112 (1992).
Weitere Patente zum Aufbau und Einsatz von Protein A-Adsorbern bestehen von Repligen
Corp. US 5089605 (1992), Hoechst Corp. US 4409330 (1983) und US 4464165 (1986), DuPont
de Nemours US 5356374 (1992), Sepracor Inc. US 5362859 (1992), Cypress Biosc. US 5782792
(1998), sowie US 4614513 (1986), US 5091091 (1990), US 5277701 (1991), WO 9736614 (1997)
und US 4879340 (1989).
Spezielle Nachteile der über andere Kopplungsmethoden hergestellten Protein A-Träger sind:
- a) CNBr-Aktivierung: höheres Protein A-Leakage
- b) Tresyl-Aktivierung: geringere Kopplungsausbeuten
- c) NHS-Aktivierung: geringere Kopplungsausbeute und hIgG-Bindungskapazität
- d) Epoxy-Aktivierung: geringe Reaktivität der aktiven Gruppen, geringe Kopp lungsausbeuten
- e) Azlacton-Aktivierung: geringere Kopplungsausbeute und hIgG-Bindungskapazität
- f) FMP-Aktivierung: geringere Kopplungsausbeute und hIgG-Bindungskapazität
- g) Kopplung an SiO2-Träger: höheres Protein A-Leakage
Die Aufgabe der Erfindung besteht erstens darin, ein Verfahren für die wirtschaftliche
Herstellung von stabilen und hochwirksamen Adsorbern zu entwickeln, die vorteilhaft für die
extrakorporale Blutreinigung eingesetzt werden können.
Zweitens liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, die Mängel der bisher in der
extrakorporalen Blutreinigung (Apherese) eingesetzten Adsorber am Beispiel eines Protein A-
Adsorbers zu beseitigen, d. h. Adsorber mit besseren Eigenschaften, insbesondere hinsichtlich
der Bindungskapazität für Antikörper und zirkulierende immunkomplexe, des
Durchflußverhaltens und der Stabilität (geringeres Protein A-Leakage) herzustellen.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß durch die Anwendung einer geeigneten
Aktivierungsmethode für das Matrixmaterial eine optimale Immobilisierung von Protein A
erreicht wird, die die vorteilhafte Anwendung des Adsorbers in der Apherese ermöglicht.
Als Aktivierungsmethode wurde die Aktivierung der Träger mit dem Chlorkohlensäureester N-
Chlorcarbonyloxy-5-norbonen-2,3-dicarboximid (Cl-CO-ONB) angewendet.
Für die Herstellung der aktivierten Sepharosen CL-4B, CL-6B, 4FF und 6FF wurden durch
Optimierungsversuche Bedingungen für die unkatalytische ONB-Aktivierung ermittelt, die eine
Herstellung der entsprechenden ONB-Carbonat-aktivierten Sepharosen ermöglicht, ohne daß
eine erhebliche Veränderung der Gelstruktur oder der Durchfluß-Charakteristik festgestellt
werden konnte.
Wesentlich für die Herstellung dieser ONB-Carbonat-aktivierten Sepharose-Gele ist, daß die
Mengen an Cl-CO-ONB/ml Gel 100 mg, die Reaktionszeiten 2 h und die Temperaturen 30°C
nicht übersteigen dürfen. Eine ausführliche Beschreibung der Reaktionsbedingungen erfolgt im
Ausführungsbeispiel 1/A.
In Abhängigkeit von der Art der Sepharose und den speziellen Aktivierungsbedingungen
können auf diese Weise aktivierte Sepharosen mit einem Aktivierungsgrad von 0.5 bis maximal
20 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel hergestellt werden (siehe Ausführungsbeispiele 1-20).
Hervorzuheben für die Aktivierung mittels Cl-CO-ONB ist:
- a) Die hier angewandte Methode ist eine milde unkatalytische Aktivierungsvariante für die gegen Säuren relativ instabilen Träger auf Agarosebasis (z. B. Sepharosen).
- b) Die unkatalytische Aktivierung mit Cl-CO-ONB ist auf einfache Weise durchführbar; sie ist insbesonders geeignet, Träger mit niedrigem Aktivierungsgrad herzustellen.
- c) Sie gestattet die gezielte Einstellung des gewünschten Aktivierungsgrades in
reproduzierbarer Weise (siehe auch Ausführungsbeispiele: 1; 2; 7; 14; 15; 16; 20).
Durch Erhöhung der eingesetzten Cl-CO-ONB-Menge steigt der Aktivierungsgrad an, wie am Beispiel der Sepharose 4FF- Aktivierung in Aceton (1 h bei RT) gezeigt wird (s. Tab. 1) (s. auch Ausführungsbeispiele 1-7).
Die so aktivierten Sepharosen können in vorteilhafter Weise für die Immobilisierung von
Liganden, z. B. von Proteinen, eingesetzt werden. Sie zeigen keine wesentlichen
Veränderungen in der Gelstruktur und den Durchflußeigenschaften. Lediglich beim Einsatz der
Sepharosen CL wurde eine bis zu 10% geringere, maximal anwendbare Durchflußrate (nach
Hydrolyse der aktiven Gruppen) beobachtet.
Dis bisher für die Sepharoseträger aufgeführten Zusammenhänge gelten auch für Träger auf
Cellulosebasis (Ausführungsbeispiele 43-56). Die Aktivierung mit Cl-CO-ONB führt zu
stabilen aktivierten Cellulosepartikeln, deren Aktivierungsgrad von der eingesetzten Menge und
Konzentration an Cl-CO-ONB abhängt (Ausführungsbeispiel 50, 51).
Für die Herstellung ONB-Carbonat-aktivierter Agarose-Träger wurde die basenkatalysierte
Aktivierung mit Cl-CO-ONB so optimiert, daß diese Methode auch für die Herstellung niedrig
aktivierter Sepharose (Aktivierungsgrad: ca. 5-20 µmol/ml Gel) genutzt werden kann.
Ähnlich wie bei der unkatalytischen Aktivierung kann bei der basenkatalysierten Aktivierung
durch Variation der Menge an eingesetztem Cl-CO-ONB der gewünschte Aktivierungsgrad
eingestellt werden (siehe auch Ausführungsbeispiele 21; 24; 30; 34; 39; 41).
Es wurde eine einfache Nachbehandlungsmethode nach dem Koppeln und Blocken (z. B. 3
Tage schütteln mit 0.1 M Borat, pH 9.3) gefunden, um die bei einer Anwendung in der Apherese
schädlichen Verunreinigungen HONB und DMAP, die von der basenkatalysierten Aktivierung
herrühren, nahezu quantitativ (Nachweisgrenze: jeweils ca. 0.6 µg HONB und 0.2 µg DMAP/ml
Gel) aus dem Adsorbergel zu entfernen (s. Ausführungsbeispiel 21).
Der Einfluß des Aktivierungsgrades auf die Protein A-Kopplungsausbeute wird durch die
Ausführungsbeispiele 1-6 für Sepharose 4FF sowie durch die Beispiele 44, 51 und 50 für
Cellulosepartikel belegt. Mit steigendem Aktivierungsgrad (unkatalytische Aktivierung) nimmt
die pro mg Gel gebundene Protein A-Menge zu.
Mit Zunahme des Aktivierungsgrades nimmt dagegen die hIgG-Bindungskapazität ab (siehe
Ausführungsbeispiele 2; 7; 26; 35; 38; 41).
Die Immobilisierung von Protein A an die unter optimierten Bedingungen unkatalytisch
(Ausführungsbeispiel 1) oder basenkatalytisch (Ausführungsbeispiel 21) ONB-aktivierten Träger
erfolgt unter den vorzugsweisen Bedingungen (Aktivierungsgrad, pH-Wert, Puffersystem,
Protein A-Angebot), um einen stabilen Protein A-Adsorber mit niedrigem Protein A-Leakage
und hoher hIgG-Bindungskapazität zu erhalten.
Der Einfluß des Aktivierungsgrades auf die Protein A-Kopplungsausbeute wird in den
Beispielen 1-6, 44, 50 und 51 belegt. Mit steigendem Aktivierungsgrad nimmt die pro ml Gel
gebundene Protein A-Menge zu.
Menge und Konzentration von Protein A haben Einfluß:
- a) auf die Kopplungsausbeute (s. auch Ausführungsbeispiele 7; 9; 11; 12).
Wird bei gleichem Aktivierungsgrad der Sepharose 4FF (3,3 µmol/ml Gel) das Protein A- Angebot gesenkt, fällt zwar die gekoppelte Protein A-Menge und damit auch die hIgG- Bindungskapazität ab, die Kopplungsausbeute steigt jedoch bis zum vollständigen Umsatz auf 100% an. - b) auf die hIgG-Bindung:
Parallel mit dem Protein A-Angebot verändert sich auch die Bindungskapazität für hIgG.
Die Herstellung von Protein A-Adsorbern mit niedrigerer (bei geringen Protein A Angeboten) und hoher hIgG-Bindungskapazität (bei höheren Protein A-Angeboten) wird belegt durch die Ausführungsbeispiele 7; 9; 11; 12, (s. Tab. 2).
Vorteilhaft ist der Einsatz hochkonzentrierter Protein A-Lösungen (0,5 Vol.Kopplungslösung/ml
Träger) im Vergleich zu Protein A-Lösungen mit 1,0 Vol.Puffer/ml Träger (s. Anspruch
4) (s. Ausführungsbeispiele 1, 2, 7, 13-16, 23, 27-30).
Erfolgt die Protein A-Kopplung bei unterschiedlichen pH-Werten unter sonst vergleichbaren
Bedingungen (gleicher Aktivierungsgrad: 27 µmol/ml; gleiche Molarität der Puffer, ähnliches
Protein A-Angebot von 6 mg), steigen Kopplungsgrad, Kopplungsausbeute und
Bindungskapazität des Sepharose-Protein A-Adsorbers zum sauren pH-Bereich hin an
(Ausführungsbeispiele 34-37).
Höchste Bindungskapazitäten werden bei pH 7,2 erzielt nach Immobilisierung in 1,0 M MOPS-
oder HERPES-Puffern. Durch Zusatz von hohen Salzkonzentrationen (1 M Na2SO4 oder 3 M
NaCl) zu verdünnten Pufferlösungen steigen Kopplungsrate und Bindungskapazität des
Sepharose-Protein A-Adsorbers an 0,1 M Phosphatlösung mit 1 M Na2SO4-Zusatz pH = 7,2 wird
vorzugsweise als Kopplungspuffer zur Immobilisierung eingesetzt (s. Anspruch 5)
(s. Ausführungsbeipiele 1, 21, 23, 24, 25, 28, 29).
Die hIgG-Bindungskapazität dient zur Beurteilung der Effektivität des erfindungsgemäß
hergestellten Protein A-Adsorbers. Die Bestimmung erfolgt unter Einsatz von humanem γ-
Globulin (hγ-Globulin, ICN) oder von Humanplasma unter bestimmten Bedingungen (Flußraten,
Puffersysteme). Die hγ-Globulin- bzw. Plasma-Menge wird dabei im Überschuß eingesetzt,
bezogen auf die hIgG-Bindungskapazität/ml Gel.
Die Ergebnisse zeigen, daß der eingesetzte IgG-Überschuß auf die Bestimmung der
dynamischen hIgG-Bindungskapazität (unter Standardbedingungen nach Ausführungsbeispiel
1/C für den gemäß Beispiel 1/B hergestellten Protein A-Adsorber) großen Einfluß hat und daher
festgelegt werden muß.
Die Behandlung des erfindungsgemäß hergestellten Protein A-Adsorbers für die Apherese in
einer Chromatographie-Säule mit Citrat-Puffer pH 2,2 führt zu einem völlig regenerierten Protein
A-Adsorber.
Ein Vergleich verschiedener, häufig eingesetzter Regenerierungs-Medien im pH-Bereich von 2-14
mit derselben Adsorber-Säule (s. Ausführungsbeispiel 13/D, Tab. 15) zeigt, daß die hIgG-
Bindungskapazität des erfindungsgemäß hergestellten Protein A-Adsorbers durch die
verwendeten Regenerierungs-Medien nicht verändert wurde.
Bei der Bestimmung des Protein A-Leakage nach wiederholtem (7maligem) Schütteln des
Protein A-Adsorber-Gels (in der Regel 1-7 Tage bei RT, jeweils bei Verwendung von frischem
Puffer) mit der 10fachen Puffermenge (v/v) zeigt der erfindungsgemäße Protein A-Adsorber ein
erheblich geringeres Protein A-Leakage als der Immunosorba Protein A-Adsorber (bei pH 7.2
nur ca. 20%) (s. Ausführungsbeispiel 2/E, Tab. 12).
Nach Lagerung der Protein A-Adsorber über einen Monat mit 5 Vol. dieser Puffer bei 2-4°C hat
der erfindungsgemäße Protein A-Adsorber die niedrigsten Protein A-Leakagewerte
(s. Ausführungsbeispiel 3/E, s. Tab. 14) im Vergleich zu kommerziell erhältliche Protein A-
Adsorber, die durch Immobilisierung von Protein A an CNBr-aktivierte Sepharose hergestellt
worden sind.
Nur unter Einhaltung der vorzugsweisen Herstellungsbedingungen
- - für die ONB-Carbonat-Aktivierung, bei der die Menge an Cl-CO-ONB/ml Gel 100 mg, die Reaktionszeit 2 h und die Temperatur 30°C nicht übersteigen darf, um den optimalen Aktivierungsgrad zwischen 0,5-5 µmol/ml Gel zu erzielen (Patentanspruch 2 und 3),
- - für die Immobilisierung von Protein A an die ONB-aktivierten Träger unter Einsatz von Protein A-Konzentrationen von 10-20 mg/ml Puffer und 0,5 Vol.Kopplungspuffer pro 1,0 Vol.Träger (Patentanspruch 4),
- - sowie unter Einsatz von konzentriertem Puffer oder verdünntem Puffer mit hochkon zentrierten Salzzusätzen zur Einstellung des erforderlichen pH-Wertes und der Molarität des Kopplungspuffers (Patentanspruch 5)
können stabile Protein A-Adsorber auf Sepharose- und Cellulosebasis hergestellt werden, die
eine hohe Bindungskapazität für hIgG und ein geringes Protein A-Leakage aufweisen.
Im Falle des Abweichens von den vorzugsweisen Herstellungsbedingungen (zu hoher
Aktivierungsgrad: Beispiele 40 und 41, ungünstige pH-Bedingungen und zu niedrige
Pufferkonzentration bei der Immobilisierung: Beispiele 8, 10, 22, 27, 31, 38, 39) werden
Adsorber erzielt, die nicht dem Patentanspruch 1 genügen.
Die Eignung der Adsorber für die extrakorporale Blutreinigung wurde geprüft in der FPLC unter
den in der Apherese gültigen Bedingungen.
Die Qualität des Adsorbers wurde beurteilt nach der Bindungskapazität für hIgG, der
anzuwendenden Flußrate, der Beständigkeit gegenüber Regenerierungsmitteln, der Möglichkeit
der Wiederverwendung, dem Protein A-Leakage und der Adsorption von zirkulierenden
Immunkomplexen aus Patientenplasmen. Zum Vergleich wurde die Prüfung kommerzieller
Adsorber (Immunosorba Protein A von Excorim) unter identischen Bedingungen vorgenommen.
Die hIgG-Bindungskapazität ist abhängig vom angebotenen Volumen an Humanplasma und
von der angebotenen Menge an hIgG.
Die Bindungskapazität des erfindungsgemäßen Protein A-Adsorbers ist beim Einsatz von 4.2 ml
Humanplasma/ml Gel (5,7 mg hIgG/ml Humanplasma) um 13% höher als die des Immunosorba
Protein A-Adsorbers (s. Ausführungsbeispiel 1/C, Tab. 6).
Die Bestimmung erfolgte mit einer linearen Flußrate von 2 cm/min.
Auch beim Einsatz verschiedener pathologischer Plasmen mit unterschiedlicher hIgG-
Konzentration besteht ein deutlicher Unterschied der pro ml Gel gebundenen hIgG-Menge und
der hIgG-Bindung [in %] (Reduktionsrate) zugunsten des erfindungsgemäß hergestellten
Sepharose 4FF- gegenüber dem Immunosorba Protein A-Adsorber (s. Ausführungsbeispiel
2/C, Tab. 10).
Eine Gegenüberstellung der statischen hIgG-Bindung (Batch-Versuch) von erfindungsgemäß
hergestellten Protein A-Adsorbern aus Cellulosepartikeln unterschiedlicher Partikelgröße (1 = 50-100 µm;
2 = 80-130 µm; 3 = 100-300 µm) mit Sepharose 4-Partikeln (45-160 µm) beim
identischen hIgG-Angebot aus Humanplasma zeigt, daß praktisch keine Unterschiede in der
Bindungskapazität und der hIgG-Reduktionsrate bestehen (s. Anspruch 1.1)
(s. Ausführungsbeispiele 53-55, 59) (s. Tab. 17).
Die hIgG-Bindungskapazität des erfindungsgemäßen Protein A-Adsorbers ist auch bei höheren
Flußraten um durchschnittlich 10% höher als die des Immunosorba Protein A
(s. Ausführungsbeispiel 1/C) (s. Tab. 7). Bei einer Flußrate von 2 cm/min wurden die höchsten
hIgG-Bindungskapazitäten erzielt. Diese Betriebsbedingung entspricht den
Apheresebedingungen mit dem Immunosorba Protein A-System von Excorim in der Klinik.
Zur Überprüfung der chemischen Beständigkeit des erfindungsgemäß hergestellten Sepharose
4FF-Protein A-Adsorbers gegenüber dem Regenerierungmittel wurde 0.5 N NaOH mit dem
80fachen des Gelvolumens wiederholt über die Säule gepumpt. Dazwischen wurde gewaschen
(mit Wasser, Apheresepuffer pH 2.2 und pH 7.0) und anschließend die hIgG-Bindung bei
Einsatz von Humanplasma bestimmt. Sämtliche Regenerierungszyklen wurden nacheinander
mit derselben Adsorber-Säule durchgeführt (s. Ausführungsbeispiel 14/D). Die hIgG-
Bindungskapazität des erfindungsgemäßen Protein A-Adsorbers fiel nach 5 Zyklen auf 50%, die
des Immunosorba Protein A dagegen auf 25% ab, bezogen auf die Bindungskapazität vor der
ersten Regenerierung (s. Tab. 16).
Auf die Bedingungen der Apherese nach Excorim bezogen (7 min regenerieren bei 62.5 ml
Adsorber) wurden nach 6 Regenerierungszyklen mit 0,5 M NaOH beim ONB-Sepharose-
Protein A-Adorber noch 83% und beim Immunosorba-Adsorber noch 75% der initialen
Bindungskapazität beobachtet.
Die Wiederverwendung des erfindungsgemäß hergestellten Sepharose 4FF-Protein A-
Adsorbers erfolgte unter Apherese-ähnlichen Bedingungen bezogen auf die eingesetzte
Humanplasma-Menge/ml Gel, die verwendeten Puffer und die Flußrate. Die Verweilzeit des
Humanplasmas in der Adsorber-Säule wurde jedoch erheblich verkürzt.
Die hIgG-Bindungskapazität des erfindungsgemäßen Protein A-Adsorbers nach 200 Zyklen war
praktisch identisch mit der, die nach dem ersten Zyklus ermittelt worden war. Die
durchschnittliche hIgG-Bindung aller 200 Zyklen betrug 17.9 ± 0.46 mg hIgG/ml Gel
(s. Ausführungsbeispiel 1/D, Tab. 8).
Der als Vergleich unter identischen Bedingungen eingesetzte Immunosorba Protein A-Adsorber
(Excorim) zeigte mit durchschnittlich 14.2 mg hIgG/ml Gel eine deutlich geringere dynamische
hIgG-Bindungskapazität, die auch nach 200facher Wiederverwendung praktisch unverändert
blieb.
Das Protein A-Leakage, bestimmt beim 200fachen Wiedereinsatz in den Human-Plasma-
Durchlauf- und in den Elutions-Fraktionen, zeigte keine signifikante Veränderung in
Abhängigkeit von der Zyklenzahl.
Im Eluat lagen die Leakagewerte des Immunosorba Protein A-Adsorbers über denen des
erfindungsgemäß hergestellten Sepharose 4FF-Protein A-Adsorbers (s. Anspruch 9). Die
Nachweisgrenze betrug 5 ng Protein A/ml in Gegenwart von Humanplasma und 2 ng/ml in
Gegenwart von hIgG (s. Ausführungsbeispiel 1/E, Tab. 9).
Die Bestimmung der Adsorption von zirkulierenden Immunkomplexen erfolgte wegen der
Labilität der Immunkomplexe (CIC) (Verdünnung und saures Milieu bei der Elution) im
Säulendurchfluß. Mittels ELISA (IMTEC Immundiagnostika GmbH, Berlin) für C1q-CIC und
C3d-CIC wurden Plasmaspiegel von Patienten mit Rheumatoid arthritis (RA), Kollagenose (K)
und Systemischem Lupus erythemadosus (SLE) bestimmt (s. Ausführungsbeispiele 2/D und
3/D, Tab. 11 und 13).
Beim Einsatz fast aller Plasmen wies der erfindungsgemäße Sepharose 4FF-Protein A-
Adsorber höhere Adsorptionen an Immunkomplexen auf und zeigte damit höhere
Reduktionsraten im Vergleich zum Protein A-Adsorber von Excorim (s. Anspruch 10).
Die Vorteile der erfindungsgemäß hergestellten Protein A-Adsorber werden durch folgende
Fakten belegt:
- 1. Der Einsatz von ONB-Carbonat-aktivierten Trägern für die Protein A-Adsorberherstellung hat den Vorteil, daß die aktivierten Träger auf einfache Weise in kürzester Zeit (1-2 h) auch im größeren Maßstab hergestellt werden können, ohne daß die Träger oder Gelstruktur, z. B. bei säureempfindlichen Agarosegelen, dabei verändert wird. Außerdem kann der gewünschte Aktivierungsgrad zielgerichtet zwischen 0.5-30 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel in reproduzierbarer Weise eingestellt werden (s. Anspruch 2 und 3).
- 2. Die hohe Reaktivität der ONB-Carbonatgruppen ermöglicht bei Einhaltung der gemäß den
Ansprüchen 1-4 vorzugsweise anzuwendenden Bedingungen hohe Protein A-
Kopplungsausbeuten nach nur 1 h, die bei Protein A-Angeboten von 1-6 mg Protein A/ml Gel
ca. 70-100% betragen (bezogen auf das angebotene Protein A) (s. Beispiele 1-7, 9, 11, 12, 17,
32, 42-56). Es können Protein A-Adsorber auf eine äußerst wirtschaftliche Art und Weise
hergestellt werden, da das wertvolle Protein A nahezu quantitativ immobilisiert werden kann.
Der Vergleich mit den erzielten Protein A-Kopplungsausbeuten beim Einsatz von einigen ausgewählten, kommerziell erhältlichen aktivierten Trägern für die Immobilisierung von nativem Protein A (Amersham Pharmacia) gemäß den empfohlenen Kopplungsvorschriften der Hersteller zeigt die Überlegenheit der erfindungsgemäßen Protein A-Kopplungsprozedur (s. Tab. 3).
- 3. Die erfindungsgemäß hergestellten Protein A-Adsorber zeichnen sich durch eine hohe dynamische hIgG-Bindungskapazität aus. In Abhängigkeit von den Kopplungsbedingungen und den hIgG-Bindungsbedingungen ist es möglich, Adsorber mit einer Bindungskapazität von 25-35 mg hIgG/ml Gel herzustellen (siehe Beispiele 1, 2, 7, 13, 15, 16, 24, 28, 29, 33).
- 4. Unter den hier fixierten Standardbedingungen ist die dynamische Bindungskapazität des
Sepharose 4FF-Protein A-Adsorbers für hIgG aus Humanplasma zwar etwas geringer als beim
Einsatz von hIgG, das in einem geeigneten Puffer gelöst ist. Sie ist aber (unter den gleichen
Bedingungen bestimmt) deutlich höher als z. B. für den in der Apherese eingesetzten
Immunosorba Protein A-Adsorber (Excorim) (s. Anspruch 10) (s. Tab. 4).
- 5. Eine Gegenüberstellung der statischen hIgG-Bindung von erfindungsgemäß hergestellten Protein A-Adsorbern aus Cellulosepartikeln vergleichbarer Partikelgröße mit Sepharose 4FF- Partikeln beim identischen hIgG-Angebot aus Humanplasma zeigt, daß keine Unterschiede in der Bindungskapazität und der hIgG-Reduktionsrate bestehen (s. Anspruch 11).
- 6. Die erfindungsgemäßen Protein A-Adsorber gestatten die Anwendung hoher Flußraten, z. B. bis zu 10 cm/min. Auch bei höheren Flußraten besitzen die erfindungsgemäßen Protein A- Adsorber eine höhere hIgG-Bindungskapazität im Vergleich zu dem Immunosorba Protein A- Adsorber (siehe Beispiel 1). So ist z. B. die Bindungskapazität des erfindungsgemäßen Sepharose 4FF-Protein A-Adsorbers beim Einsatz von Humanplasma und einer linearen Flußrate von 4 cm/min mit 16.1 mg hIgG/ml Gel höher als die des Immunosorba Protein A- Adsorbers bei einer Flußrate von 2 cm/min (14.9 mg/ml Gel). Das bedeutet bei einem Einsatz in der Apherese, daß die Behandlungszeit der Patienten durch Einsatz der erfindungsgemäßen Protein A-Adsorber erheblich verkürzt werden kann.
- 7. Die Immobilisierung über ONB-Carbonatgruppen ermöglicht die Herstellung eines ungewöhnlich stabilen Protein A-Adsorbers. Das Protein A ist wesentlich fester am Träger verankert als z. B. das über CNBr-Aktivierung immobilisierte (z. B. in Protein A-Sepharose CL- 4B, Protein A-Sepharose 4 Fast Flow oder im Immunosorba Protein A): nur 50% des immobilisierten Protein A wird mit 1 N NaOH in 20 h bei 20°C im erfindungsgemäßen Adsorber abgespalten, während unter den gleichen Bedingungen eine 100%ige Abspaltung des über CNBr-aktivierte Sepharose gekoppelten Protein A erfolgt. [Die Bestimmung des immobilisierten Protein A erfolgte nach Hydrolyse des Protein A vom Träger mit 1 N NaOH (20 h, RT) und mit 2 N NaOH (20 h, 50°C) im Überstand].
- 8. Die größere Stabilität der Carbamat-Bindung, die nach Kopplung von Liganden an ONB-
Carbonat-aktivierte Träger gebildet wird, gegenüber der Isoharnstoff-Bindung, die durch
Kopplung an CNBr-aktivierte Träger entsteht, wurde bereits früher eindrucksvoll nachgewiesen
durch Baeseler M et al. in J Chromatogr 589 (1992) 93-100. Die sehr stabile Carbamat-
Bindung, über die das Protein A an die Matrix gebunden ist, bewirkt ein sehr geringes Protein
A-Leakage (bestimmt mit Hilfe eines ELISA im Überstand des Protein A-Adsorbers).
Aus den Vergleichen des erfindungsgemäßen Protein A-Adsorbers mit Protein A-Adsorbern, die durch Immobilisierung von Protein A an CNBr-aktivierte Sepharose hergestellt wurden, ist ersichtlich, daß das-Protein A-Leakage (s. Anspruch 9)- a) nach Lagerung der Protein A-Adsorber als Suspension in Puffer pH 7.0 und pH 2.2 jeweils für 1 Monat bei 4°C,
- b) nach wiederholtem Schütteln der Protein A-Adsorber mit PBS pH 7.2 und Borat-Puffer pH 9.3 für jeweils 24 h bei Raumtemperatur, sowie
- c) beim wiederholten Einsatz der Protein A-Adsorber für die hIgG-Bindung aus Humanplasma unter Einsatz chromatographischer Säulen (Bedingungen analog zur Apherese)
- 9. Aufgrund der hohen Stabilität der Bindung zwischen Protein A und Matrix ist für die erfindungsgemäßen Protein A-Adsorber beim Wiedereinsatz für die hIgG-Bindung eine Regenerierung des Adsorbers mit Puffern/Lösungen von pH 2-14 möglich, ohne daß die hIgG- Bindungskapazität abnimmt (s. Beispiel 13, Tab. 15).
- 10. Die Regenerierung des erfindungsgemäß hergestellten Adsorbers kann mit 0.5 N NaOH erfolgen. Auf die Bedingungen der Apherese nach Excorim bezogen (7 min regenerieren bei 62.5 ml Adsorber) werden nach 6 Regenerierungszyklen mit 0,5 M NaOH beim ONB- Sepharose 4FF-Protein A-Adorber noch 83% und beim Immunosorba Adsorber noch 75% der initialen Bindungskapazität beobachtet (s. Beispiel 14/D, Tab. 16).
- 11. Beim 200fachen Wiedereinsatz des erfindungsgemäßen Protein A-Adsorbers unter Verwendung von Humanplasma unter Apherese-analogen Bedingungen wurde keine Abnahme der hIgG-Bindung/ml Gel festgestellt; die hIgG-Recovery (bestimmt mit dem Tina Quant Assay von Roche Diagnostics) betrug durchschnittlich 97±3% (s. Beispiel 1, Tab. 8).
- 12. Selbst nach einer 2jährigen Lagerung des erfindungsgemäßen Protein A-Adsorbers bei 4°C in Form einer Suspension in 20% Ethanol oder in Phosphat/Citrat-Puffer+0.1% Thimerosal, pH 7,0, konnte keine Abnahme der hIgG-Bindungskapazität festgestellt werden (s. Beispiel 2).
- 13. Das im erfindungsgemäßen Protein A-Adsober immobilisierte Protein A zeigt eine hohe hIgG-Bindungseffizienz, die ungefähr mit der vergleichbar ist, die für in Lösung befindliches Protein A beschrieben wurde von Coleman PL et al. in J Chromatogr 512 (1990), p. 357. Während die meisten kommerziell erhältlichen Protein A-Träger für das molare Verhältnis von hIgG : immobilisiertem Protein A Werte von 0,8-1,4 aufweisen, wurden für den erfindungsgemäßen Protein A-Adsorber in der Regel Werte von 1,4-2,1 gefunden.
- 14. Beim Einsatz identischer Plasmaproben wurde für den erfindungsgemäßen Sepharose- Protein A-Adsorber eine höhere Adsorption an zirkulierenden Immunkomplexen (C1q-CIC und C3d-CIC) nachgewiesen im Vergleich zum Immunosorba Protein A-Adsorber (Excorim) (s. Anspruch 10) (s. Tab. 5).
Die erfindungsgemäßen Adsorber, ihre Eignung für die extrakorporale Blutreinigung und das
Verfahren für ihre Herstellung sollen anhand der nachfolgenden Beispiele erläutert werden.
Die Ausführungsbeispiele 1-41 und 56-59 betreffen den Träger Sepharose 4FF, die
Beispiele 42-56 Cellulosepartikel von Chisso Corp., Japan.
Der Sepharose-Träger wurde in einer Glassäule vom wäßrigen Medium in Aceton
(Wassergehalt ≦0,3%) überführt. Ein Volumen des in Aceton sedimentierten Trägers wurde mit
dem halben Volumen der Aktivierungslösung versetzt, hergestellt durch Lösen von Cl-CO-ONB
in Aceton (Angebot: 50 mg/ml Gel mit einer Konzentration von 100 mg/ml Aceton).
Anschließend wurde die Sepharose-Suspension in einem gut verschlossene Reaktionsgefäß 1
Stunde bei Raumtemperatur auf einem Kreisschüttler geschüttelt. Danach wurde das Gemisch
auf eine Filternutsche (Por. 3) gegeben. Man läßt die Aktivierungslösung abtropfen und wäscht
danach gründlich mit Aceton (etwa 5mal mit jeweils einem Volumen bezogen auf das
Gelvolumen). Die erhaltene ONB-Carbonat-Sepharose kann in einer gut verschlossenen
Laborglasflasche mit PE- oder PP-Dichtung gelagert werden.
Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 3,8 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel (mit
Hilfe einer HONB-Eichkurve spektralphotometrisch bestimmt nach Boeden HF et al. in
Makromol Chem 193 (1992) 865-887).
100 ml des in Aceton sedimentierten, ONB-Carbonat-aktivierten Sepharose-Gels mit 3,8 µmol
aktiven Gruppen/ml Gel wurden auf eine Filternutsche (Por. 3) gegeben und innerhalb von ca. 5 min
in Wasser überführt. Das scharf abgesaugte Gel (Wasserstrahlpumpe) wurde in einen
Erlenmeyerkolben überführt und mit 50 ml der Protein A-Kopplungslösung versetzt, die durch
Lösen von 610 mg Protein A (Amersham Pharmacia) in 50 ml 0,1 M Phosphat + 1 M
Natriumsulfat, pH 7,2 (12,2 mg PrA/ml) hergestellt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde für eine
Stunde bei Raumtemperatur auf einem Kreisschüttler (ca. 100 U/min) geschüttelt. Danach
wurde das Gel auf einer Filternutsche mit 5 × 100 ml Kopplungspuffer (KP) und 5 × 100 ml Wasser
gewaschen, das abgesaugte Gel in einen Erlenmeyerkolben überführt, 100 ml Blockungslösung
(0,1 M Boratpuffer + 1 M Ethanolamin, pH 8.0) hinzugefügt und 1 h bei Raumtemperatur
geschüttelt. Anschließend wurde das Gel auf einer Filternutsche nacheinander mit 5 × 100 ml
KP, 5 × 100 ml Wasser, 10 × 100 ml 0,01 N HCl, 5 × 100 ml Wasser und zum Schluß mit 2 × 100 ml
0,1 M Borat, pH 9,3 gewaschen und 16-24 h mit 500-1000 ml 0,1 M Borat, pH 9,3 geschüttelt.
Dann wurde das Gel auf einer Filternutsche abgesaugt und gründlich mit Boratpuffer und
Wasser gewaschen und in das Lagerungsmedium (20% Ethanol oder 0,1 M Phosphat/Citrat-
Puffer + 0,1% Thimerosal, pH 7,0) überführt und bei 4-6°C gelagert.
Die Bestimmung des immobilisierten Protein A wurde nach Hydrolyse einer Trägerprobe mit 2 N
NaOH (20 h bei 50°C unter Schütteln) im Natronlauge-Überstand nach Lowry mit Hilfe einer
Protein A-Eichkurve bestimmt.
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug 4,8 mg Protein A/ml Gel, das entspricht einer
Kopplungsausbeute von 79% (bezogen auf die angebotene Protein A-Menge).
Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität erfolgte mit verschiedenen Protein
A-Adsorber-Chromatographiesäulen unter Einsatz von humanem γ-Globulin (hγ-Globulin, ICN)
gelöst in 0,01-0.1 M Phosphat/Citrat/NaCl-Bindungspuffer, pH 7,0 (PCP) (Standard-PCP: 0,06 M + 0,08 M
NaCl; über ein 0,2 µm-Membranfilter filtriert) oder von Humanplasma (über ein 0,45 µm-
Membranfilter filtriert) bei linearen Flußraten von 1-8 cm/min (Standard-Flußraten für die
hIgG-Bindung: 1,4 cm/min für hγ-Globulin-Lösungen und 2 cm/min für Humanplasma). Die hγ-
Globulin-Menge wurde im 3- bis 6fachen Überschuß eingesetzt (IgG-Konzentration: 5-8 mg/ml
Bindungspuffer), bezogen auf die hIgG-Bindungskapazität/ml Gel, die angebotene
Humanplasma-Menge betrug ca. 4 ml/ml Gel (IgG-Konzentrationen: ca. 6-8 mg IgG/ml
Plasma).
Nach der Bindung des hIgG wurde mit dem Bindungspuffer gewaschen (Standard-Methode: ca.
2 h mit 2,8 cm/min) und anschließend mit Elutionspuffer, pH 2,2 oder 2,0 (EP) (Standard-EP:
0,03 M Citrat-Puffer + 0,15 M NaCl, pH 2,2) das gebundene hIgG eluiert.
Die quantitative hIgG-Bestimmung in den Eluaten wurde entweder direkt spektralphotometrisch
bei 280 nm (mit E1% = 13,8 berechnet) und/oder nach Neutralisation mit 0,5 M di-
Kaliumhydrogenphosphat mit Hilfe des Tina-Quant-Assays (Roche Diagnostics)
immunoturbidimetrisch bestimmt.
Für die Ermittlung der hIgG-Bindungskapazität wurden folgende 4 Varianten (weiter unten als
C1, C2, C3 und C4 bezeichnet) mit unterschiedlichen Chromatographie-Säulen aus Glas oder
PP verwendet:
- 1. Omnifit-Säule (5,0.0,3 cm I. D.; ca. 350 µl Gel); Fa. Omnifit Limited, UK
- 2. ECONO-Säule (5,1.1,0 cm I. D.; ca. 4,0 ml Gel); Fa. Bio-Rad, USA
- 3. ECO-Säule (3,2.5,0 cm I. D.; ca. 62,5 ml Gel); Fa. KronLab, Deutschland
- 4. ECONO Pac-Säule (17.1,5 cm I. D., ca. 3,0 ml Gel); Bio-Rad, USA
Als Chromatographie-System wurde ein BioLogic LP System (Bio-Rad) oder ein ÄKTA FPLC-
System (Amersham Pharmacia) verwendet; für die 62,5 ml Gel-Säulen wurde eine Masterflex-
Schlauchpumpe eingesetzt. Die verwendeten Puffer wurden generell sterilfiltriert und entgast
(Degasser).
Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität unter Standardbedingungen (siehe
oben) für den gemäß B hergestellten Protein A-Adsorber ergab folgende Werte:
(3facher Überschuß)
Nach C1: 23,6 mg hIgG/ml Gel
Nach C2: 23,5 mg hIgG/ml Gel
Nach C3: 24,5 mg hIgG/ml Gel
Nach C1: 23,6 mg hIgG/ml Gel
Nach C2: 23,5 mg hIgG/ml Gel
Nach C3: 24,5 mg hIgG/ml Gel
(6facher Überschuß):
Nach C1: 34,5 mg hIgG/ml Gel
Nach C1: 34,5 mg hIgG/ml Gel
(4,2 ml Plasma/ml Gel; 1,6facher hIgG-Überschuß):
Nach C2: 18,0 mg hIgG/ml Gel
Nach C2: 18,0 mg hIgG/ml Gel
Die Bestimmung erfolgte nach Variante C2 mit einer linearen Flußrate von 2 cm/min. Der
Gehalt an hIgG/ml Humanplasma betrug: 5,7 mg IgG. Nach dem Auftragen des Humanplasmas
wurde der Protein A-Adsorber (4 ml Gel) mit 40 ml PCP gewaschen, mit 48 ml EP pH 2,2 eluiert
und danach wieder mit 32 ml PCP gewaschen.
Als Vergleich für den erfindungsgemäß hergestellten Protein A-Adsorber wurde der
Immunosorba Protein A-Adsorber (Excorim) unter gleichen Bedingungen getestet.
Die Bindungskapazität des erfindungsgemäßen Protein A-Adsorbers ist beim Einsatz von 4,2 ml
Humanplasma/ml Gel um 13% höher als die des Immunosorba Protein A-Adsorbers.
Die detaillierten Ergebnisse der Bindungsversuche sind in der Tabelle 6 dargestellt.
Die Bestimmung erfolgte wie unter II. beschrieben (siehe oben). Es wurde generell 4,2 ml
Humanplasma/ml Gel (= 16,8 ml/4 ml Gel) eingesetzt. Die Flußraten wurden von 2-8 cm/min
variiert. Für das Auftragen des Plasmas, für Waschen und Elution wurde stets die gleiche
Flußrate verwendet.
Als Vergleich wurde der Immunosorba Protein A-Adsorber (Excorim) unter gleichen
Bedingungen getestet.
Die hIgG-Bindungskapazität des erfindungsgemäßen Protein A-Adsorbers ist auch bei höheren
Flußraten um durchschnittlich 10% höher als die des Immunosorba Protein A.
Die erzielten Resultate sind in der Tabelle 7 zusammengefaßt.
Die Wiederverwendung des Protein A-Adsorbers erfolgte unter Apherese-ähnlichen
Bedingungen (wie von Excorim für die Verwendung des Immunosorba Protein A beschrieben),
bezogen auf das eingesetzte Humanplasmavolumen/ml Gel, die verwendeten Puffer und die
Flußrate.
Die Verweilzeit des Humanplasmas in der Adsorber-Säule wurde jedoch erheblich verkürzt (auf
ca. 1,4 min = 20% der normalerweise in der Apherese angewendeten Zeit). Die Zeit für das
Aufgeben des Plasmas und das anschließende Waschen mit pH 7,0-Puffer betrug ≈ 5 min/Zyklus.
- - Säule: ECONO (0,64.1,0 cm I. D.; 0,5 ml Gel)
- - Humanplasma-Angebot: 2,1 ml/Zyklus (d. h. 4,2 ml/ml Gel)
- - hIgG-Gehalt/ml Plasma: ≈ 8 mg/ml
- - Waschpuffer: PA pH 7,0 (Apherese-Puffer von Excorim)
- - Elutionspuffer: PA pH 2,2 (Apherese-Puffer von Excorim)
- - Flußrate: 2 cm/min
- - Detektor: UV280 nm-Durchflußzelle
- - Temperatur: 20-25°C
- - Standard-Zyklus: 2,1 ml Plasma (Auftragen), 5 ml PA pH 7,0 (Waschen), 6 ml PA pH 2,2 (Elution), 4 ml PA pH 7,0 (Waschen); Durchlauf-Fraktion: 8 ml; Elutions-Fraktion: 7 ml; Gesamtzeit pro Zyklus: ≈ 11 min
Die hIgG-Bindungskapazität des erfindungsgemäßen Protein A-Adsorbers nach 200 Zyklen war
praktisch identisch mit der, die nach dem ersten Zyklus ermittelt worden war. Die
durchschnittliche hIgG-Bindung aller 200 Zyklen betrug 17,9 ± 0,46 mg hIgG/ml Gel. Für die
Berechnung der prozentualen hIgG-Bindung in Abhängigkeit von der Zyklenzahl wurde die
Bindungskapazität von 18,0 mg hIgG/ml Gel für Zyklus 1 = 100% gesetzt (s. Tab. 8).
Der unter gleichen Bedingungen eingesetzte Immunosorba Protein A-Adsorber (Excorim) zeigte
mit durchschnittlich 142 mg IgG/ml Gel eine deutlich geringere hIgG-Bindungskapazität.
Die Bestimmung erfolgte in den Humanplasma-Durchlauf-Fraktionen und in den Elution-
Fraktionen (nach vorheriger Neutralisation mit 0,5 M di-Kaliumhydrogenphosphat) beim
200fachen Wiedereinsatz (s. unter D) mit Hilfe eines ELISA's.
Mikrotiterplatte MaxiSorp (Nunc, 96 wells); primärer Antikörper: rabbit anti-protein A IgG fraction
(Sigma); sekundärer Antikörper: biotinylated monoclonal anti-protein A (Sigma); Enzym-
Konjugat: streptavidin alkaline phosphatase conjugated (Calbio-chem); Substrat: Sigma Fast 4-
nitrophenylphosphate tablet sets; Reader-Messung: 405 nm nach 15 min bei RT.
Die quantitative Bestimmung von Protein A in den ausgewählten, entsprechend verdünnten
Fraktionen wurde mit Hilfe einer Eichkurve von Protein A (1-20 ng/ml) in Gegenwart von
entsprechend verdünntem Humanplasma für die Durchlauf-Fraktionen oder in Gegenwart von
0,3 mg/ml Human IgG (Sigma) für die entsprechend verdünnten Elutions-Fraktionen
durchgeführt (Regression 2. Ordnung mit r2 = 1.00; CV% = 1-5).
Die Nachweisgrenze beträgt 5 ng Protein A/ml in Gegenwart von Humanplasma und 2 ng/ml in
Gegenwart von hIgG.
Es wurde keine signifikante Veränderung des Protein A-Leakage in Abhängigkeit von der
Zyklenzahl festgestellt. Die durchschnittlichen Protein A-Leakagewerte wurden in ng Protein
A/ml Plasma oder in ng Protein A/mg eluiertes hIgG (häufigste Angabeform in der Literatur)
angegeben. Als Vergleich zu dem erfindungsgemäßen Protein A-Adsorber wurden die
Leakagewerte für den Immunosorba Protein A-Adsorber (Excorim) in analoger Weise bestimmt
(s. Tab. 9).
Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 1 mit 30 mg Cl-CO-ONB/ml Gel (Konzentration: 60 mg/ml
Aceton) aktiviert.
Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 2,4 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,3 mg/ml Gel; Konzentration: 12,6 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 1/B mit 50 ml Gel und 25 ml Protein A-Kopplungs-Lösung durchgeführt
(die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der
verringerten Gelmenge angepaßt).
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 4,4 mg Protein A/ml Gel (70% Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C
durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(3facher Überschuß):
Nach C1: 25,3 mg hIgG/ml Ge
Nach C1: 25,3 mg hIgG/ml Ge
(5facher Überschuß):
Nach C2: 31,8 mg hIgG/ml Gel
Nach C2: 31,8 mg hIgG/ml Gel
(4,2 ml Plasma/ml Gel; 1,5facher hIgG-Überschuß):
Nach C2: 18,7 mg hIgG/ml Gel
Nach C2: 18,7 mg hIgG/ml Gel
Die Abhängigkeit der hIgG-Bindung und prozentualen Reduktion der hIgG-Spiegel vom Ange
bot an Plasma-hIgG wurde durch Einsatz verschiedener pathologischer Plasmen parallel mit
dem erfindungsgemäß hergestellten Sepharose 4FF- und Immunosorba Protein A-Adsorber
ermittelt.
Es besteht ein deutlicher Unterschied der pro ml Gel gebundenen hIgG-Menge und der hIgG-
Reduktion [%] zugunsten des erfindungsgemäß hergestellten Sepharose 4FF- im Vergleich
zum Immunosorba Protein A-Adsorber von Excorim (s. Tab. 10).
Bestimmung der Bindungsfähigkeit des gemäß B hergestellten Protein A-Adsorbers für
zirkulierende Immunkomplexe (CIC) aus Patientenplasma:
Die Bestimmung erfolgte wegen der Labilität der Immunkomplexe (CIC) (Verdünnung und saures Milieu bei der Elution) im Säulendurchfluß. Mittels ELISA (IMTEC Immundiagnostika GmbH, Berlin) für C1q-CIC und C3d-CIC wurden Plasmaspiegel von Patienten mit Rheumatoid arthritis (RA), Kollagenose (K) und Systemischem Lupus erythemadosus (SLE) bestimmt.
Die Bestimmung erfolgte wegen der Labilität der Immunkomplexe (CIC) (Verdünnung und saures Milieu bei der Elution) im Säulendurchfluß. Mittels ELISA (IMTEC Immundiagnostika GmbH, Berlin) für C1q-CIC und C3d-CIC wurden Plasmaspiegel von Patienten mit Rheumatoid arthritis (RA), Kollagenose (K) und Systemischem Lupus erythemadosus (SLE) bestimmt.
Parallel wurde die Adsorption am Immunosorba Protein A-Adsorber ermittelt. Beim Einsatz fast
aller Plasmen wies der erfindungsgemäße Adsorber (Adsorber I) höhere Adsorptionen an
Immunkomplexen auf und zeigte damit höhere Reduktionsraten im Vergleich zum Protein A-
Adsorber von Excorim (Adsorber II) (s. Tab. 11).
Nach 7maligem Schütteln (in der Regel 1-7 Tage bei RT, jeweils bei Verwendung von frischem
Puffer) des Protein A-Adsorber-Gels mit der 10fachen Puffermenge (v/v) wurde das Protein A
im Überstand des Gels nach dem letzten Schütteln (24 h) bestimmt. Die Bestimmung erfolgte
wie unter Beispiel 1/E angegeben. Die Protein A-Leakagewerte wurden in ng/mg
immobilisiertes Protein A angegeben.
Der erfindungsgemäße Protein A-Adsorber zeigt ein erheblich geringeres Protein A-Leakage als
der Immunosorba Protein A-Adsorber, bei pH 7,2 nur 20%.
Als Vergleich zu dem erfindungsgemäßen Protein A-Adsorber wurden unter analogen
Bedingungen Leakagewerte (schattiert) für den Immunosorba Protein A-Adsorber (Excorim)
bestimmt. Diese Werte sind in Tabelle 12 angeführt.
Das Protein A-Adsorber-Gel wurde ca. 2 Jahre bei 2-4°C gelagert, wobei das Gel vor der
Lagerung mit dem jeweils 10fachen Volumen der folgenden Lagerungslösungen auf einer
Filternutsche (Por. 3) gewaschen und dann mit jeweils 2 Vol. dieser Lösungen in eine gut
verschlossene Laborglasflasche überführt wurde:
- a) 20% Ethanol/Wasser (v/v)
- b) PCP-Bindungspuffer + 0,1% Thimerosal, pH 7,0.
Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität erfolgte gemäß Beispiel 1 nach C1
(jeweils mit 3fachem hγ-Globulin-Überschuß).
Die hIgG-Bindungskapazität nach Lagerung betrug danach für
a) 24,9 mg hIgG/ml Gel, b) 25,2 mg hIgG/ml Gel.
a) 24,9 mg hIgG/ml Gel, b) 25,2 mg hIgG/ml Gel.
Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 1 mit 20 mg Cl-CO-ONB/ml Gel (Konzentration: 40 mg/ml
Aceton) aktiviert.
Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 1,3 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 3,15 mg/ml Gel; Konzentration: 6,3 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 1/B mit 100 ml Gel durchgeführt.
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 2,8 mg Protein A/ml Gel (88% Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C
durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(2facher Überschuß):
Nach C1: 17,8 mg hIgG/ml Gel
Nach C1: 17,8 mg hIgG/ml Gel
1,4facher Überschuß):
Nach C3: 18,6 mg hIgG/ml Gel
Nach C3: 18,6 mg hIgG/ml Gel
(4,2 ml Plasma/ml Gel; 1,5facher hIgG-Überschuß):
Nach C2: 13,7 mg hIgG/ml Gel
Nach C2: 13,7 mg hIgG/ml Gel
Bestimmung der Bindungsfähigkeit des gemäß B hergestellten Protein A-Adsorbers für
zirkulierende Immunkomplexe (CIC) aus Patientenplasma:
Die Bestimmung erfolgte wegen der Labilität der Immunkomplexe (CIC) (Verdünnung und saures Milieu bei der Elution) im Säulendurchfluß. Mittels ELISA (IMTEC Immundiagnostika GmbH, Berlin) für C1q-CIC und C3d-CIC wurden Plasmaspiegel von Patienten mit Kollagenose (K) und Systemischem Lupus erythemadosus (SLE) bestimmt.
Die Bestimmung erfolgte wegen der Labilität der Immunkomplexe (CIC) (Verdünnung und saures Milieu bei der Elution) im Säulendurchfluß. Mittels ELISA (IMTEC Immundiagnostika GmbH, Berlin) für C1q-CIC und C3d-CIC wurden Plasmaspiegel von Patienten mit Kollagenose (K) und Systemischem Lupus erythemadosus (SLE) bestimmt.
Parallel wurde die Adsorption am Immunosorba Protein A-Adsorber ermittelt. Beim Einsatz fast
aller Plasmen wies der erfindungsgemäße Adsorber (Adsorber I) höhere Adsorptionen an
Immunkomplexen auf und zeigte damit höhere Reduktionsraten im Vergleich zum Protein A-
Adsorber von Excorim (Adsorber II) (s. Tab. 13).
Der Protein A-Adsorber wurde mit dem 10fachen Vol. an Lagerungspuffer auf einer
Filternutsche (Por. 3) gewaschen und dann mit jeweils 5 Vol. dieser Puffer in eine gut
verschlossene Laborglasflasche überführt und einen Monat bei 2-4°C gelagert. Das
freigesetzte Protein A-Menge wurde im Überstand des Gels nach der Lagerung mit Hilfe
eines ELISA's bestimmt. Die Bestimmung erfolgte gemäß Beispiel 1/E. Die Protein A-
Leakagewerte wurden in ng/mg immobilisiertes Protein A angegeben. Als Vergleich zum
erfindungsgemäßen Protein A-Adsorber wurden die analog bestimmten Leakagewerte für
kommerziell erhältliche Protein A-Adsorber, die durch Immobilisierung von Protein A an CNBr-
aktivierte Sepharose hergestellt worden sind, angeführt (schattiert) (s. Tab. 14).
Der erfindungsgemäße Protein A-Adsorber hat mit 7 ng bei pH 7,0 und mit 3 ng bei pH 2,2 die
niedrigsten Protein A-Leakagewerte.
Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 1 mit 20 mg Cl-CO-ONB/ml Gel (Konzentration: 40 mg/ml
Aceton) aktiviert.
Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 1,4 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 3,0 mg/ml Gel; Konzentration: 6,0 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,5 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt (die
in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten
Gelmenge angepaßt).
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 2,8 mg Protein A/ml Gel (93% Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C
durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(3facher Überschuß):
Nach C1: 18,4 mg hIgG/ml Gel
Nach C1: 18,4 mg hIgG/ml Gel
Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 1 mit 10 mg Cl-CO-ONB/ml Gel (Konzentration: 20 mg/ml
Aceton) aktiviert.
Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 1,0 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 3,1 mg/ml Gel; Konzentration: 6,2 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,5 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt (die
in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten
Gelmenge angepaßt).
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 2,5 mg Protein A/ml Gel (81% Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C
durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(3facher Überschuß):
Nach C1: 17,7 mg hIgG/ml Gel
Nach C1: 17,7 mg hIgG/ml Gel
Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 1 mit 5 mg Cl-CO-ONB/ml Gel (Konzentration: 10 mg/ml
Aceton) aktiviert.
Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 0,6 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 3,0 mg/ml Gel; Konzentration: 6,0 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,5 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt (die
in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten
Gelmenge angepaßt).
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 2,4 mg Protein A/ml Gel (80% Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C
durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(3facher Überschuß):
Nach C1: 18,4 mg hIgG/ml Gel
Nach C1: 18,4 mg hIgG/ml Gel
Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 1 mit 50 mg Cl-CO-ONB/ml Gel (Konzentration: 100 mg/ml
Aceton) aktiviert.
Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 3,3 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,0 mg/ml Gel; Konzentration: 12,0 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,5 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt (die
in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten
Gelmenge angepaßt).
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 4,6 mg Protein A/ml Gel (75% Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C
durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(3facher Überschuß):
Nach C1: 24,9 mg hIgG/ml Gel
Nach C1: 24,9 mg hIgG/ml Gel
Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 7 aktiviert.
Aktivierungsgrad: 3,3 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Aktivierungsgrad: 3,3 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,2 mg/ml Gel; Konzentration: 10,3 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,7 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 0,1 M
MOPS, pH 7,2, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und
Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 3,1 mg Protein A/ml Gel (50% Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C
durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(3facher Überschuß):
Nach C1: 19,4 mg hIgG/ml Gel
Nach C1: 19,4 mg hIgG/ml Gel
Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 7 aktiviert.
Aktivierungsgrad: 3,3 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Aktivierungsgrad: 3,3 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 3,0 mg/ml Gel; Konzentration: 6,0 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,5 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt (die
in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten
Gelmenge angepaßt).
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 2,6 mg Protein A/ml Gel (86% Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C
durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(3facher Überschuß):
Nach C1: 14,7 mg hIgG/ml Gel
Nach C1: 14,7 mg hIgG/ml Gel
Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 7 aktiviert.
Aktivierungsgrad: 3.3 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Aktivierungsgrad: 3.3 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 3,0 mg/ml Gel; Konzentration: 6,0 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,5 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 0,1 M MES,
pH 6,1, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und
Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 1,3 mg Protein A/ml Gel (43% Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C
durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(3facher Überschuß):
Nach C1: 6,5 mg hIgG/ml Gel
Nach C1: 6,5 mg hIgG/ml Gel
Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 7 aktiviert.
Aktivierungsgrad: 3,3 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Aktivierungsgrad: 3,3 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 2,0 mg/ml Gel; Konzentration: 4,0 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,5 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt (die
in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten
Gelmenge angepaßt).
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 1,9 mg Protein A/ml Gel (95% Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C
durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(3facher Überschuß):
Nach C1: 11,3 mg hIgG/ml Gel
Nach C1: 11,3 mg hIgG/ml Gel
Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 7 aktiviert.
Aktivierungsgrad: 3.3 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Aktivierungsgrad: 3.3 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 1,0 mg/ml Gel; Konzentration: 2,0 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,5 ml Protein A-Kopplungsösung durchgeführt (die
in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten
Gelmenge angepaßt).
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 1,0 mg Protein A/ml Gel (100%
Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C
durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(3facher Überschuß):
Nach C1: 6,8 mg hIgG/ml Gel
Nach C1: 6,8 mg hIgG/ml Gel
Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 1 mit 30 mg Cl-CO-ONB/ml Gel (Konzentration: 60 mg/ml
Aceton) aktiviert.
Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 2,6 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6.4 mg/ml Gel; Konzentration: 12,8 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 1/B mit 100 ml Gel durchgeführt.
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 4,1 mg Protein A/ml Gel (65% Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C
durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
Nach C1 (3facher Überschuß): 23,8 mg hIgG/ml Gel
Nach C2 (3facher Überschuß): 24,4 mg hIgG/ml Gel
Nach C3 (ohne Überschuß): 19,1 mg hIgG/ml Gel
Nach C2 (3facher Überschuß): 24,4 mg hIgG/ml Gel
Nach C3 (ohne Überschuß): 19,1 mg hIgG/ml Gel
Nach C1 (6facher Überschuß): 32,8 mg hIgG/ml Gel
(4,2 ml Plasma/ml Gel; 1,6facher hIgG-Überschuß):
Nach C3: 19,0 mg hIgG/ml Gel
Nach C3: 19,0 mg hIgG/ml Gel
Die Regenerierung des gemäß B hergestellten Protein A-Adsorbers erfolgte in einer
Chromatographie-Säule unter Verwendung verschiedener, häufig eingesetzter Medien im pH-
Bereich von 2-14.
- - Säule: ECONO (5,1.1,0 cm I. D.; 4,0 ml Gel)
- - hγ-Globulin-Angebot: 2,7facher Überschuß (relativ zur Bindungskapazität); gelöst in PA pH 7,0 (Konzentration: 8 mg/ml)
- - Waschpuffer: PA pH 7,0 (Apherese-Puffer von Excorim)
- - Elutionspuffer: PA pH 2,2 (Apherese-Puffer von Excorim)
- - Flußrate: 2,8 cm/min
- - Detektor: UV280 nm-Durchflußzelle
- - Temperatur: 20-25°C
Das Regenerierungs-Medium wurde für 1 h bei RT mit einer Flußrate von 1,4 cm/min (entspricht
ca. dem 16fachen des Gelvolumens) über die Säule gepumpt. Danach wurde 20 min mit PA pH
7,0 gewaschen und anschließend die hIgG-Bindungskapazität bestimmt. Sämtliche
Regenerierungsversuche wurden nacheinander mit derselben Adsorber-Säule durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität des erfindungsgemäß hergestellten Protein A-Adsorbers wurde
durch die verwendeten Regenerierungs-Medien nicht verändert.
In der Tabelle 15 sind die verwendeten Regenerierungs-Medien und die hIgG-Bindungs
kapazitäten zusammengestellt.
Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 1 aktiviert.
Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 3,5 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,4 mg/ml Gel; Konzentration: 12,8 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 1/B mit 20 ml Gel und 10 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt (die
in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten
Gelmenge angepaßt).
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 5,4 mg Protein A/ml Gel (86% Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C
durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
Nach C2 (3facher Überschuß): 20,3 mg hIgG/ml Gel
(4,2 ml Plasma/ml Gel; 6,5facher hIgG-Überschuß):
Nach C2: 19,1 mg hIgG/ml Gel
Nach C2: 19,1 mg hIgG/ml Gel
Die Regenerierung des gemäß B hergestellten Protein A-Adsorbers erfolgte in einer
Chromatographie-Säule.
- - Säule: ECONO (5,1.1,0 cm I. D.; 3,0 ml Gel)
- - Humanplasma-Angebot: 4,2 ml/ml Gel; 6,5facher hIgG-Überschuß (relativ zur Bindungskapazität); (hIgG-Konzentration: 9,8 mg/ml)
- - Waschpuffer: PA pH 7,0 (Apherese-Puffer von Excorim)
- - Elutionspuffer: PA pH 2,2 (Apherese-Puffer von Excorim)
- - Flußrate: 2,0 ml/min
- - Detektor: UV280 nm-Durchflußzelle
- - Temperatur: 20-25°C
Das Regenerierungmittel 0,5 N NaOH wurde für 2 h bei RT mit einer Flußrate von 2 ml/min (=
240 ml; entspricht ca. dem 80fachen des Gelvolumens) über die Säule gepumpt. Danach wurde
5 min mit Wasser, 15 min mit PA pH 2,2 und zum Schluß 15 min mit PA pH 7,0 gewaschen und
anschließend die hIgG-Bindung bei Einsatz von Humanplasma bestimmt. Sämtliche
Regenerierungszyklen wurden nacheinander mit derselben Adsorber-Säule durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität des erfindungsgemäßen Protein A-Adsorbers nahm nach 5 Zyklen
lediglich um ca. 50%, die des Immunosorba Protein A dagegen um ca. 75% ab, bezogen auf
die Bindungskapazität vor der ersten Regenerierung.
In der Tabelle 16 sind die hIgG-Bindungskapazitäten und die prozentuale Abnahme der hIgG-
Bindungskapazität in Abhängigkeit von der Zyklenzahl zusammengestellt. Als Vergleich zu dem
erfindungsgemäßen Protein A-Adsorber wurden die hIgG-Bindungskapazitäten für den
Immunosorba Protein A-Adsorber in analoger Weise bestimmt.
Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 1 mit 50 mg Cl-CO-ONB/ml Gel (Konzentration: 100 mg/ml
Aceton) aktiviert.
Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 3,8 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 8,2 mg/ml Gel; Konzentration: 16,4 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,5 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt (die
in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten
Gelmenge angepaßt).
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 4,1 mg Protein A/ml Gel (50% Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C
durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(3facher Überschuß):
Nach C1: 28,4 mg hIgG/ml Gel
Nach C1: 28,4 mg hIgG/ml Gel
Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 1 mit 50 mg Cl-CO-ONB/ml Gel (Konzentration: 100 mg/ml
Aceton) 2 h bei RT aktiviert.
Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 4,5 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 8,2 mg/ml Gel; Konzentration: 16,4 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,5 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt (die
in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten
Gelmenge angepaßt).
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 3,9 mg Protein A/ml Gel (48% Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C
durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(3facher Überschuß):
Nach C1: 26,6 mg hIgG/ml Gel
Nach C1: 26,6 mg hIgG/ml Gel
Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 16 aktiviert.
Aktivierungsgrad: 4,5 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel
Aktivierungsgrad: 4,5 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 4,1 mg/ml Gel; Konzentration: 8,2 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,5 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt (die
in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten
Gelmenge angepaßt).
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 2,9 mg Protein A/ml Gel (71% Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C
durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(3facher Überschuß):
Nach C1: 18,6 mg hIgG/ml Gel
Nach C1: 18,6 mg hIgG/ml Gel
Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 1 mit 40 mg Cl-CO-ONB/ml Gel (Konzentration: 80 mg/ml
Aceton) aktiviert. Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 3,0 µmol ONB-
Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,4 mg/ml Gel; Konzentration: 12,8 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,5 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 0,1 M
Phosphat + 0,5 M K2SO4, pH 7,2, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für
Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 3,8 mg Protein A/ml Gel (60% Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C
durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(3facher Überschuß):
Nach C1: 24,1 mg hIgG/ml Gel
Nach C1: 24,1 mg hIgG/ml Gel
Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 18 aktiviert.
Aktivierungsgrad: 3,0 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Aktivierungsgrad: 3,0 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,3 mg/ml Gel; Konzentration: 12,6 mg/ml
KP) wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,5 ml Protein A-Kopplungslösung, KP:
0,5 M Phosphat, pH 7,2, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs-
und Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 3,7 mg Protein A/ml Gel (59% Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C
durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(3facher Überschuß):
Nach C1: 23,5 mg hIgG/ml Gel
Nach C1: 23,5 mg hIgG/ml Gel
Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 1 mit 50 mg Cl-CO-ONB/ml Gel (Konzentration: 100 mg/ml
Aceton) 2 h bei RT in getrocknetem Aceton (Wassergehalt: ≦0.01%) aktiviert.
Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 6,2 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,0 mg/ml Gel; Konzentration: 10,0 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,8 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 0,5 M
Phosphat, pH 7,2, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und
Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 4,5 mg Protein A/ml Gel (75% Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C
durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(3facher Überschuß):
Nach C1: 22,1 mg hIgG/ml Gel
Nach C1: 22,1 mg hIgG/ml Gel
Sepharose 4FF (zuvor überführt in getrocknetes Aceton) wurde gemäß DD 279486 mit 8 mg Cl-
CO-ONB/ml Gel (Konzentration: 8 mg/ml Aceton) in trockenem Aceton (Wassergehalt: ≦0,01%)
in Gegenwart von Triethylamin (TEA) und 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) bei einem
Molverhältnis von Cl-CO-ONB : TEA : DMAP von 1,0 : 1.2 : 0,1 aktiviert. Dazu wurde das Amin-
Gemisch in trockenem Aceton unter Schütteln oder Rühren (z. B. mit einem Schwimm-
Magnetrührer) zur Gelsuspension innerhalb von 2-5 min zugetropft und weitere 20 min unter
Ausschluß von Luftfeuchtigkeit auf einem Kreisschüttler bei RT geschüttelt. Anschließend wird
das aktivierte Gel auf einer Filtemutsche (Por. 3) gründlich mit Aceton gemäß Beispiel 1/A
gewaschen.
Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 4,4 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 5,4 mg/ml Gel; Konzentration: 10,8 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,5 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 0,1 M
Phosphat + 3 M NaCl, pH 7,2, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für
Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 3,0 mg Protein A/ml Gel (60% Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C
durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(3facher Überschuß):
Nach C1: 17,2 mg hIgG/ml Gel
Nach C1: 17,2 mg hIgG/ml Gel
Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 21 aktiviert.
Aktivierungsgrad: 4,4 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Aktivierungsgrad: 4,4 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 5,1 mg/ml Gel; Konzentration: 5,1 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 3 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 0,1 M
Phosphat, pH 7,2, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und
Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 2,4 mg Protein A/ml Gel (47% Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C
durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(3facher Überschuß):
Nach C1: 15,2 mg hIgG/ml Gel
Nach C1: 15,2 mg hIgG/ml Gel
Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 21 aktiviert.
Aktivierungsgrad: 4,4 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel
Aktivierungsgrad: 4,4 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 11,8 mg/ml Gel; Konzentration: 23,6 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,5 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 1,0 M
MOPS, pH 7,2, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und
Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 3,8 mg Protein A/ml Gel (32% Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C
durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(3facher Überschuß):
Nach C1: 20,5 mg hIgG/ml Gel
Nach C1: 20,5 mg hIgG/ml Gel
Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 21 mit 15 mg Cl-CO-ONB/mi Gel aktiviert.
Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 8,9 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 11,3 mg/ml Gel; Konzentration: 11,3 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 3 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 1,0 M MOPS,
pH 7,2, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und
Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 5,0 mg Protein A/ml Gel (44% Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C
durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(3facher Überschuß):
Nach C1: 25,3 mg hIgG/ml Gel
Nach C1: 25,3 mg hIgG/ml Gel
Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 24 aktiviert.
Aktivierungsgrad: 8,9 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Aktivierungsgrad: 8,9 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 10,1 mg/ml Gel; Konzentration: 10,1 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 3 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 1,0 M
HEPES, pH 7,2, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und
Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 4,9 mg Protein A/ml Gel (49% Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C
durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(3facher Überschuß):
Nach C1: 23,1 mg hIgG/ml Gel
Nach C1: 23,1 mg hIgG/ml Gel
Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 24 aktiviert.
Aktivierungsgrad: 8,9 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Aktivierungsgrad: 8,9 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,1 mg/ml Gel; Konzentration: 12,2 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,5 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 0,5 M
Phosphat, pH 7,2, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und
Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 3,8 mg Protein A/ml Gel (63% Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C
durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(3facher Überschuß):
Nach C1: 18,2 mg hIgG/ml Gel
Nach C1: 18,2 mg hIgG/ml Gel
Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 24 aktiviert.
Aktivierungsgrad: 8,9 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Aktivierungsgrad: 8,9 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 10,1 mg/ml Gel; Konzentration: 20,2 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,5 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 0,1 M Citrat,
pH 4,0, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und
Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 3,1 mg Protein A/ml Gel (31% Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C
durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(3facher Überschuß):
Nach C1: 8,1 mg hIgG/ml Gel
Nach C1: 8,1 mg hIgG/ml Gel
Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 21 mit 17 mg Cl-CO-ONB/ml Gel aktiviert.
Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 12,0 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 12,2 mg/ml Gel; Konzentration: 20,4 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,7 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 0,1 M
MOPS + 1 M Na2SO4, pH 7,2, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für
Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 4,8 mg Protein A/ml Gel (39% Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C
durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(3facher Überschuß):
Nach C1: 25,3 mg hIgG/ml Gel
Nach C1: 25,3 mg hIgG/ml Gel
Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 28 aktiviert.
Aktivierungsgrad: 12,0 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Aktivierungsgrad: 12,0 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 10,0 mg/ml Gel; Konzentration: 20,0 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,5 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 1,0 M
MOPS, pH 7,2, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und
Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 4,6 mg Protein A/ml Gel (46% Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C
durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
Nach C1 (3facher Überschuß): 24,1 mg hIgG/ml Gel
Nach C2 (6facher Überschuß): 34,4 mg hIgG/ml Gel
Nach C2 (6facher Überschuß): 34,4 mg hIgG/ml Gel
(8,4 ml Plasma/ml Gel; 4,5facher hIgG-Überschuß):
Nach C2 (bei 1 cm/min): 22,7 mg hIgG/ml Gel
Nach C2 (bei 1 cm/min): 22,7 mg hIgG/ml Gel
Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 21 mit 30 mg Cl-CO-ONB/ml Gel aktiviert.
Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 20 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 7,8 mg/ml Gel; Konzentration: 15,6 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,5 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 0,1 M
Citrat + 1 M NaCl, pH 4,0, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs-
und Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 4,1 mg Protein A/ml Gel (52% Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C
durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(3facher Überschuß):
Nach C1: 23,2 mg hIgG/ml Gel
Nach C1: 23,2 mg hIgG/ml Gel
Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 30 aktiviert.
Aktivierungsgrad: 20 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Aktivierungsgrad: 20 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,4 mg/ml Gel; Konzentration: 12,8 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,5 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 0,1 M Citrat,
pH 4,0, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und
Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 3,2 mg Protein A/ml Gel (50% Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C
durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(3facher Überschuß):
Nach C1: 19,1 mg hIgG/ml Gel
Nach C1: 19,1 mg hIgG/ml Gel
Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 21 mit 35 mg Cl-CO-ONB/ml Gel aktiviert.
Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 24 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,0 mg/ml Gel; Konzentration: 10,0 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,7 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 1,5 M
MOPS, pH 7,2, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und
Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 5,8 mg Protein A/ml Gel (92% Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C
durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(3facher Überschuß):
Nach C1: 16,9 mg hIgG/ml Gel
Nach C1: 16,9 mg hIgG/ml Gel
Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 32 aktiviert.
Aktivierungsgrad: 24 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Aktivierungsgrad: 24 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 12,0 mg/ml Gel; Konzentration: 20,0 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,7 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 0,1 M
Citrat + 1 M Na2SO2, pH 7,2, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für
Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 3,6 mg Protein A/ml Gel (30% Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C
durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(3facher Überschuß):
Nach C1: 24,7 mg hIgG/ml Gel
Nach C1: 24,7 mg hIgG/ml Gel
Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 21 mit 40 mg Cl-CO-ONB/ml Gel aktiviert.
Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 27 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 5,4 mg/ml Gel; Konzentration: 5,4 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 3 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 0,1 M Borat,
pH 9.3, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und
Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 3,3 mg Protein A/ml Gel (61% Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C
durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(3facher Überschuß):
Nach C1: 11,4 mg hIgG/ml Gel
Nach C1: 11,4 mg hIgG/ml Gel
Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 34 aktiviert.
Aktivierungsgrad: 27 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Aktivierungsgrad: 27 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 5,3 mg/ml Gel; Konzentration: 5,3 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 3 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 0,1 M
Phosphat, pH 7,2, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und
Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 5,0 mg Protein A/ml Gel (94% Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C
durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(3facher Überschuß):
Nach C1: 9,3 mg hIgG/ml Gel
Nach C1: 9,3 mg hIgG/ml Gel
Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 34 aktiviert.
Aktivierungsgrad: 27 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Aktivierungsgrad: 27 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,3 mg/ml Gel; Konzentration: 6,3 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 3 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 0,1 M
Phosphat/Citrat, pH 5,1, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs-
und Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 5,1 mg Protein A/ml Gel (81% Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C
durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(3facher Überschuß):
Nach C1: 12,7 mg hIgG/ml Gel
Nach C1: 12,7 mg hIgG/ml Gel
Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 34 aktiviert.
Aktivierungsgrad: 27 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Aktivierungsgrad: 27 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 5,5 mg/ml Gel; Konzentration: 5,5 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 3 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 0,1 M Citrat,
pH 4,0, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und
Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 5,2 mg Protein A/ml Gel (95% Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C
durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(3facher Überschuß):
Nach C1: 16,5 mg hIgG/ml Gel
Nach C1: 16,5 mg hIgG/ml Gel
Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 21 mit 40 mg Cl-CO-ONB/ml Gel aktiviert.
Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 29 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 4,2 mg/ml Gel; Konzentration: 4,2 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 3 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 0,5 M
Phosphat, pH 7,2, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und
Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 3,7 mg Protein A/ml Gel (92% Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C
durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(3facher Überschuß):
Nach C1: 5,9 mg hIgG/ml Gel
Nach C1: 5,9 mg hIgG/ml Gel
Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 21 mit 50 mg Cl-CO-ONB/ml Gel aktiviert.
Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 37 µmol ONB-Carbonatgruppen/ ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,3 mg/ml Gel; Konzentration: 10,0 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,6 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 1,0 M
MOPS, pH 7,2, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und
Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 6,0 mg Protein A/ml Gel (95% Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C
durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(3facher Überschuß):
Nach C1: 12,8 mg hIgG/ml Gel
Nach C1: 12,8 mg hIgG/ml Gel
Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 39 aktiviert.
Aktivierungsgrad: 37 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Aktivierungsgrad: 37 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,3 mg/ml Gel; Konzentration: 10,0 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,6 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 0,1 M
Citrat + 1 M Na2SO4, pH 7,2, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina f 24921 00070 552 001000280000000200012000285912481000040 0002010065241 00004 24802ür
Blockungs- und Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 3,1 mg Protein A/ml Gel (48% Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C
durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(3facher Überschuß):
Nach C1: 13,3 mg hIgG/ml Gel
Nach C1: 13,3 mg hIgG/ml Gel
Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 21 mit 150 mg Cl-CO-ONB/ml Gel aktiviert.
Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 56 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,0 mg/ml Gel; Konzentration: 12,0 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 1/B mit 3 ml Gel und 1,5 ml Protein A-Kopplungslösung, KP: 0,5 M
Phosphat, pH 7,2, durchgeführt (die in Beispiel 1/B eingesetzten Volumina für Blockungs- und
Waschpuffer wurden der verringerten Gelmenge angepaßt).
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 5,5 mg Protein A/ml Gel (92% Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der dynamischen hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 1/C
durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(5facher Überschuß):
Nach C1: 7,3 mg hIgG/ml Gel
Nach C1: 7,3 mg hIgG/ml Gel
Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 1 mit 50 mg Cl-CO-ONB/ml Gel (Konzentration: 100 mg/ml
Aceton) aktiviert.
Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 3,97 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,4 mg/ml Gel; Konzentration: 12,8 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 1/B mit 4 ml Gel und 2 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt.
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 4,89 mg Protein A/ml Gel (76,4%
Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 43/C durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
10 ml (1,3facher Überschuß: 17,8 mg hIgG/ml Gel
10 ml (1,3 ml Plasma/ml Gel; 1,3facher hIgG-Überschuß):
Nach C4: 20,6 mg hIgG/ml Gel
Nach C4: 20,6 mg hIgG/ml Gel
Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 1 mit 50 mg Cl-CO-ONB/ml Gel (Konzentration: 100 mg/ml
Aceton) aktiviert.
Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 2,1 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 3,15 mg/ml Gel; Konzentration: 6,3 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 1/B mit 4 ml Gel und 2 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt.
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 2,2 mg Protein A/ml Gel (69% Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 43/C durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
10 ml (1,3 ml Plasma/ml Gel; 1,3facher hIgG-Überschuß):
Nach C4: 20,1 mg hIgG/ml Gel
Nach C4: 20,1 mg hIgG/ml Gel
Sepharose 4FF wurde gemäß Beispiel 1 mit 50 mg Cl-CO-ONB/ml Gel (Konzentration: 100 mg/ml
Aceton) aktiviert.
Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 3,43 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,4 mg/ml Gel; Konzentration: 12,8 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 1/B mit 4 ml Gel und 2 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt.
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 4,66 mg Protein A/ml Gel (72,8%
Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 43/C durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(1,3 ml Plasma/ml Gel; 1,3facher hIgG-Überschuß):
Nach C4: 24,1 mg hIgG/ml Gel
Nach C4: 24,1 mg hIgG/ml Gel
Cellulosepartikel wurden gemäß Beispiel 1 mit Cl-CO-ONB aktiviert.
Der Cellulose-Träger (Partikelgröße 50-100 µm) wurde in einer Glassäule vom wäßrigen
Medium in Aceton (Wassergehalt ≦0,3%) überführt. Ein Volumen des in Aceton sedimentierten
Trägers wurde mit dem halben Volumen der Aktivierungslösung versetzt, hergestellt durch
Lösen von Cl-CO-ONB in Aceton (Angebot: 50 mg/ml Gel mit einer Konzentration von 100 mg/ml
Aceton). Anschließend wurde die Cellulose-Suspension in einem gut verschlossenen
Reaktionsgefäß 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einem Kreisschüttler geschüttelt. Danach
wurde das Gemisch auf eine Filternutsche (Por. 3) gegeben. Man läßt die Aktivierungslösung
abtropfen und wäscht danach gründlich mit Aceton (etwa 5mal mit jeweils einem Volumen
bezogen auf das Gelvolumen). Die erhaltene ONB-Carbonat-Cellulose kann in einer gut
verschlossenen Laborglasflasche mit PE- oder PP-Dichtung gelagert werden.
Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 4,3 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung erfolgte analog zu Beispiel 1B.
5 ml des in Aceton sedimentierten, ONB-Carbonat-aktivierten Cellulose-Gels mit 4,3 µmol
aktiven Gruppen/ml Gel wurden auf eine Filternutsche (Por. 3) gegeben und innerhalb von ca. 5 min
in Wasser überführt. Das scharf abgesaugte Gel wurde in einen Erlenmeyerkolben
überführt und mit 2,5 ml der Protein A-Kopplungslösung versetzt (12,8 mg Protein A pro ml
Kopplungspuffer 0,1 M Phosphat + 1 M Natriumsulfat, pH 7,2). Das Reaktionsgemisch wurde für
eine Stunde bei Raumtemperatur auf einem Kreisschüttler (ca. 100 U/min) geschüttelt. Danach
wurde das Gel auf einer Filternutsche mit 5 × 5 ml Kopplungspuffer (KP) und 5 × 5 ml Wasser
gewaschen, das abgesaugte Gel in einen Erlenmeyerkolben überführt, 5 ml Blockungslösung
(0,1 M Boratpuffer + 1 M Ethanolamin, pH 8,0) hinzugefügt und 1 h bei Raumtemperatur
geschüttelt. Anschließend wurde das Gel auf einer Filternutsche nacheinander mit 5 × 5 ml KP,
5 × 5 ml Wasser, 10 × 5 ml 0,01 N HCl, 5 × 5 ml Wasser und zum Schluß mit 2 × 5 ml 0,1 M Borat,
pH 9,3 gewaschen und 16-24 h mit 25-50 ml 0,1 M Borat, pH 9,3 geschüttelt. Dann wurde das
Gel auf einer Filternutsche abgesaugt und gründlich mit Boratpuffer und Wasser gewaschen
und in das Lagerungsmedium (20% Ethanol oder 0,1 M Phosphat/Citrat-Puffer + 0,1%
Thimerosal, pH 7,0) überführt und bei 4-6°C gelagert.
Die Bestimmung des immobilisierten Protein A wurde nach Hydrolyse einer Trägerprobe mit 2 N
NaOH (20 h bei 50°C unter Schütteln) im Natronlauge-Überstand nach Lowry mit Hilfe einer
Protein A-Eichkurve bestimmt.
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug 5,7 mg Protein A/ml Gel, das entspricht einer
Kopplungsausbeute von 89,1% (bezogen auf die angebotene Protein A-Menge).
Die Bestimmung der hIgG-Bindungskapazität erfolgte unter Einsatz von humanem
γ-Globulin (hγ-Globulin, ICN), gelöst in 0,01-0,1 M Phosphat/Citrat/NaCl-Bindungspuffer, pH 7,0
(PCP) (Standard-PCP: 0,06 M + 0,08 M NaCl, über ein 0,2 µm-Membranfilter filtriert) oder von
Humanplasma (über ein 0,45 µm-Membranfilter filtriert). Die Menge an hγ-Globulin als auch an
angebotenem hIgG im Humanplasma wurde im 1,3-1,6fachen Überschuß eingesetzt, bezogen
auf die hIgG-Bindungskapazität/ml Gel (hIgG-Konzentration: ca. 8 mg/ml Bindungspuffer und
hIgG-Konzentration ca. 8 mg hIgG/ml Plasma). Das Volumen betrug jeweils 10 ml/3 ml Gel.
Die Adsorption erfolgte im Batchversuch während 30 min unter Rotation (5 rpm) bei Einsatz von
3 ml Adsorber.
Die quantitative Bestimmung des hIgG im Überstand erfolgte mit dem Tina-Quant-Assay
(Roche Diagnostics) immunoturbidimetrisch.
Für die Ermittlung der statischen hIgG-Bindungskapazität wurden unterschiedliche
Chromatographie-Säulen aus Glas oder PP verwendet:
ECONO-Säule (5,1.1,0 cm I. D.; ca. 4,0 ml Gel); Fa. Bio-Rad, USA (C3)
ECONO Pac-Säule (17.1,5 cm I. D., ca. 3,0 ml Gel); Bio-Rad, USA (C4).
ECONO-Säule (5,1.1,0 cm I. D.; ca. 4,0 ml Gel); Fa. Bio-Rad, USA (C3)
ECONO Pac-Säule (17.1,5 cm I. D., ca. 3,0 ml Gel); Bio-Rad, USA (C4).
Unter diesen Standardbedingungen ergaben sich folgende Werte für die hIgG-
Bindungskapazität an der 3 ml Cellulosesäule (C4):
10 ml (1,3facher Überschuß): 20,2 mg hIgG/ml Gel
10 ml (1,3facher Überschuß): 22,5 mg hIgG/ml Gel
Cellulosepartikel (Größe 80-130 µm) wurden gemäß Beispiel 42/A mit 50 mg Cl-CO-ONB/ml
Gel (Konzentration: 100 mg/ml Aceton) aktiviert.
Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 5,3 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,4 mg/ml Gel; Konzentration: 12.8 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 42/B mit 5 ml Gel und 2,5 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt.
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 5,8 mg Protein A/ml Gel (90,6%
Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 42/C durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(1,3facher Überschuß):
Nach C4: 19,3 mg hIgG/ml Gel
Nach C4: 19,3 mg hIgG/ml Gel
(1,3 ml Plasma/ml Gel; 1,3facher hIgG-Überschuß):
Nach C4: 22,6 mg hIgG/ml Gel
Nach C4: 22,6 mg hIgG/ml Gel
Cellulosepartikel (Größe 100-300 µm) wurden gemäß Beispiel 42/A mit 50 mg Cl-CO-ONB/ml
Gel (Konzentration: 100 mg/ml Aceton) aktiviert.
Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 5,6 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,4 mg/ml Gel; Konzentration: 12,8 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 42/B mit 5 ml Gel und 2,5 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt.
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 6,3 mg Protein A/ml Gel (98,4%
Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 42/C durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(1,3facher Überschuß):
Nach C4: 18,6 mg hIgG/ml Gel
Nach C4: 18,6 mg hIgG/ml Gel
(1,3 ml Plasma/ml Gel; 1,3facher hIgG-Überschuß):
Nach C4: 21,6 mg hIgG/ml Gel
Nach C4: 21,6 mg hIgG/ml Gel
Cellulosepartikel (Größe 25-55 µm) wurden gemäß Beispiel 42/A mit 50 mg Cl-CO-ONB/ml Gel
(Konzentration: 100 mg/ml Aceton) aktiviert.
Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 6,5 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,4 mg/ml Gel; Konzentration: 12,8 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 42/B mit 5 ml Gel und 2,5 m) Protein A-Kopplungslösung durchgeführt.
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 6,1 mg Protein A/ml Gel (95,6%
Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 42/C durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(1,3facher Überschuß):
Nach C4: 16,3 mg hIgG/ml Gel
Nach C4: 16,3 mg hIgG/ml Gel
(1,3 ml Plasma/ml Gel; 1,3facher hIgG-Überschuß):
Nach C4: 19,5 mg hIgG/ml Gel
Nach C4: 19,5 mg hIgG/ml Gel
Cellulosepartikel (Größe 50-100 µm) wurden gemäß Beispiel 42/A mit 50 mg Cl-CO-ONB/ml
Gel (Konzentration: 100 mg/ml Aceton) aktiviert.
Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 5,15 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,4 mg/ml Gel; Konzentration: 12,8 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 42/B mit 4 ml Gel und 2,0 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt.
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 6,93 mg Protein A/ml Gel (100%
Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 42/C durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(1,3facher Überschuß):
Nach C4: 14,2 mg hIgG/ml Gel
Nach C4: 14,2 mg hIgG/ml Gel
(1,3 ml Plasma/ml Gel; 1,3facher hIgG-Überschuß):
Nach C4: 18,6 mg hIgG/ml Gel
Nach C4: 18,6 mg hIgG/ml Gel
Cellulosepartikel (Größe 80-130 µm) wurden gemäß Beispiel 42/A mit 50 mg Cl-CO-ONB/ml
Gel (Konzentration: 100 mg/ml Aceton) aktiviert.
Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 6,03 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,4 mg/ml Gel; Konzentration: 12,8 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 42/B mit 4 ml Gel und 2 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt.
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 6,47 mg Protein A/ml Gel (100%
Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 42/C durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(1,3facher Überschuß):
Nach C4: 13,6 mg hIgG/ml Gel
Nach C4: 13,6 mg hIgG/ml Gel
(1,3 ml Plasma/ml Gel; 1,3facher hIgG-Überschuß):
Nach C4: 17,5 mg hIgG/ml Gel
Nach C4: 17,5 mg hIgG/ml Gel
Cellulosepartikel (Größe 100-300 µm) wurden gemäß Beispiel 42/A mit 50 mg Cl-CO-ONB/ml
Gel (Konzentration: 100 mg/ml Aceton) aktiviert.
Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 7,25 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,4 mg/ml Gel; Konzentration: 12,8 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 42/B mit 4 ml Gel und 2 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt.
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 5,95 mg Protein A/ml Gel (93%
Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 42/C durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(1,3facher Überschuß):
Nach C4: 12,3 mg hIgG/ml Gel
Nach C4: 12,3 mg hIgG/ml Gel
(1,3 ml Plasma/ml Gel; 1,3facher hIgG-Überschuß):
Nach C4: 16,7 mg hIgG/ml Gel
Nach C4: 16,7 mg hIgG/ml Gel
Cellulosepartikel (Größe 25-55 µm) wurden gemäß Beispiel 42/A mit 50 mg Cl-CO-ONB/ml Gel
(Konzentration: 100 mg/ml Aceton) aktiviert.
Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 8,37 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,4 mg/ml Gel; Konzentration: 12,8 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 42/B mit 4 ml Gel und 2 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt.
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 6,28 mg Protein A/ml Gel (98%
Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 42/C durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(1,3facher Überschuß):
Nach C4: 10,7 mg hIgG/ml Gel
Nach C4: 10,7 mg hIgG/ml Gel
(1,3 ml Plasma/ml Gel; 1,3facher hIgG-Überschuß):
Nach C4: 16,3 mg hIgG/ml Gel
Nach C4: 16,3 mg hIgG/ml Gel
Cellulosepartikel (Größe 100-300 µm) wurden gemäß Beispiel 42/A mit 50 mg Cl-CO-ONB/ml
Gel (Konzentration: 100 mg/ml Aceton) aktiviert.
Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 4,79 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,4 mg/ml Gel; Konzentration: 12,8 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 42/B mit 5 ml Gel und 2,5 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt.
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 6,25 mg Protein A/ml Gel (97,7%
Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 42/C durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(1,3facher Überschuß):
Nach C4: 11,7 mg hIgG/ml Gel
Nach C4: 11,7 mg hIgG/ml Gel
(1,3 ml Plasma/ml Gel; 1,3facher hIgG-Überschuß):
Nach C4: 18,0 mg hIgG/ml Gel
Nach C4: 18,0 mg hIgG/ml Gel
Cellulosepartikel (Größe 100-300 µm) wurden gemäß Beispiel 42/A mit 50 mg Cl-CO-ONB/ml
Gel (Konzentration: 100 mg/ml Aceton) aktiviert.
Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 3,51 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,4 mg/ml Gel; Konzentration: 12,8 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 42/B mit 4 ml Gel und 2 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt.
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 5,78 mg Protein A/ml Gel (90,3%
Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 42/C durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(1,3facher Überschuß):
Nach C4: 15,1 mg hIgG/ml Gel
Nach C4: 15,1 mg hIgG/ml Gel
(1,3 ml Plasma/ml Gel; 1,3facher hIgG-Überschuß):
Nach C4: 19,8 mg hIgG/ml Gel
Nach C4: 19,8 mg hIgG/ml Gel
Cellulosepartikel (Größe 100-300 µm) wurden gemäß Beispiel 42/A mit 50 mg Cl-CO-ONB/ml
Gel (Konzentration: 100 mg/ml Aceton) aktiviert.
Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 4,79 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 5,0 mg/ml Gel; Konzentration: 10,0 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 42/B mit 5 ml Gel und 2,5 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt.
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 4,4 mg Protein A/ml Gel (88,0%
Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 42/C durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(1,3facher Überschuß):
Nach C4: 10,9 mg hIgG/ml Gel
Nach C4: 10,9 mg hIgG/ml Gel
(1,3 ml Plasma/ml Gel; 1,3facher hIgG-Überschuß):
Nach C4: 14,73 mg hIgG/ml Gel
Nach C4: 14,73 mg hIgG/ml Gel
Cellulosepartikel (Größe 50-100 µm) wurden gemäß Beispiel 42/A mit 50 mg Cl-CO-ONB/ml
Gel (Konzentration: 100 mg/ml Aceton) aktiviert.
Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 4,30 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,4 mg/ml Gel; Konzentration: 12,8 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 42/B mit 5 ml Gel und 2,5 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt.
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 5,72 mg Protein A/ml Gel (89,4%
Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 42/C durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(1,3 ml Plasma/ml Gel; 1,3facher hIgG-Überschuß):
Nach C4: 23,1 mg hIgG/ml Gel
Nach C4: 23,1 mg hIgG/ml Gel
Cellulosepartikel (Größe 80-130 µm) wurden gemäß Beispiel 42/A mit 50 mg Cl-CO-ONB/ml
Gel (Konzentration: 100 mg/ml Aceton) aktiviert.
Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 5,34 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,4 mg/ml Gel; Konzentration: 12,8 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 42/B mit 5 ml Gel und 2,5 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt.
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 5,81 mg Protein A/ml Gel (90,8%
Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 42/C durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(1,3 ml Plasma/ml Gel; 1,3facher hIgG-Überschuß):
Nach C4: 23,1 mg hIgG/ml Gel
Nach C4: 23,1 mg hIgG/ml Gel
Cellulosepartikel (Größe 100-300 µm) wurden gemäß Beispiel 42/A mit 50 mg Cl-CO-ONB/ml
Gel (Konzentration: 100 mg/ml Aceton) aktiviert.
Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 5,59 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,4 mg/ml Gel; Konzentration: 12,8 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 42/B mit 5 ml Gel und 2,5 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt.
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 6,29 mg Protein A/ml Gel (98,3%
Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 42/C durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(1,3 ml Plasma/ml Gel; 1,3facher hIgG-Überschuß):
Nach C4: 21,6 mg hIgG/ml Gel
Nach C4: 21,6 mg hIgG/ml Gel
Aus den Beispielen 53-55 und 59 ergeben sich die in Tab. 17 zusammengestellten
Bindungskapazitäten für die erfindungsgemäß hergestellten Cellulose- und Sepharose 4FF-
Protein A-Adsorber.
Cellulosepartikel (Größe 25-55 µm) wurden gemäß Beispiel 42/A mit 50 mg Cl-CO-ONB/ml Gel
(Konzentration: 100 mg/ml Aceton) aktiviert.
Die Bestimmung des Aktivierungsgrades ergab: 6,55 µmol ONB-Carbonatgruppen/ml Gel.
Die Immobilisierung von Protein A (Angebot: 6,4 mg/ml Gel; Konzentration: 12,8 mg/ml KP)
wurde analog Beispiel 42/B mit 5 ml Gel und 2,5 ml Protein A-Kopplungslösung durchgeführt.
Die immobilisierte Protein A-Menge betrug: 6,10 mg Protein A/ml Gel (95,3%
Kopplungsausbeute).
Die Bestimmung der hIgG-Bindungskapazität wurde gemäß Beispiel 42/C durchgeführt.
Die hIgG-Bindungskapazität betrug danach:
(1,3 ml Plasma/ml Gel; 1,3facher hIgG-Überschuß):
Nach C4: 20,4 mg hIgG/ml Gel
Nach C4: 20,4 mg hIgG/ml Gel
CIC zirkulierende Immunkomplexe
Cl-CO-ONB N-Chlorcarbonyloxy-5-norbonen-2,3-dicarboximid
DMAP 4-Dimethylaminopyridin
EP Elutionspuffer: 0,03-0,05 M Citrat + 0,15 M NaCl, pH 2,2
FF Fast Flow
FMP Fluormethyl-pyridinium-toluensulfonat
HEPES N-(2-Hydroxymethyl)-piperazin-N'-(2-ethansulfonsäure)
hγ-Globulin humanes γ-Globulin
hIgG humanes Immunglobulin G
HONB N-Hydroxy-5-Norbornen-2.3-dicarboximid
IgG Immunglobulin G
KP Kopplungspuffer: 0,1 M Natriumphosphat + 1 M Na2
Cl-CO-ONB N-Chlorcarbonyloxy-5-norbonen-2,3-dicarboximid
DMAP 4-Dimethylaminopyridin
EP Elutionspuffer: 0,03-0,05 M Citrat + 0,15 M NaCl, pH 2,2
FF Fast Flow
FMP Fluormethyl-pyridinium-toluensulfonat
HEPES N-(2-Hydroxymethyl)-piperazin-N'-(2-ethansulfonsäure)
hγ-Globulin humanes γ-Globulin
hIgG humanes Immunglobulin G
HONB N-Hydroxy-5-Norbornen-2.3-dicarboximid
IgG Immunglobulin G
KP Kopplungspuffer: 0,1 M Natriumphosphat + 1 M Na2
SO4
, pH 7,2
MES 2-(N-Morpholino)-ethansulfonsäure
MOPS 3-(N-Morpholino)-propansulfonsäure
NHS N-Hydroxysuccinimid
ONB-Carbonat N-(5-Norbornen-2,3-dicarboximidyl)-carbonat
PA pH 7.0 Apherese-Bindungspuffer der Fa. Excorim: Na2
MES 2-(N-Morpholino)-ethansulfonsäure
MOPS 3-(N-Morpholino)-propansulfonsäure
NHS N-Hydroxysuccinimid
ONB-Carbonat N-(5-Norbornen-2,3-dicarboximidyl)-carbonat
PA pH 7.0 Apherese-Bindungspuffer der Fa. Excorim: Na2
HPO4
+
KH2
PO4
+ Na-Citrat + Natriumacetat + NaCl
PA pH 2.2 Apherese-Elutionspuffer der Fa. Excorim = Elutionspuffer
PE Polyethylen
PCP Bindungspuffer: 0,01-0,1 M Phosphat/Citrat + 0,07-0,15 M NaCl, pH 7,0-7,4
PP Polypropylen
PrA Protein A
rProtein A rekombinantes Protein A
RT Raumtemperatur
Seph. Sepharose
TEA Triethylamin
Vol. Volumen/Volumina
PA pH 2.2 Apherese-Elutionspuffer der Fa. Excorim = Elutionspuffer
PE Polyethylen
PCP Bindungspuffer: 0,01-0,1 M Phosphat/Citrat + 0,07-0,15 M NaCl, pH 7,0-7,4
PP Polypropylen
PrA Protein A
rProtein A rekombinantes Protein A
RT Raumtemperatur
Seph. Sepharose
TEA Triethylamin
Vol. Volumen/Volumina
Claims (11)
1. Verfahren zur Herstellung von Adsorbern für die extrakorporale Blutreinigung, dadurch
gekennzeichnet, daß zum Erreichen einer hohen Bindungskapazität zum humanen
Immunglobulin G (hIgG) ONB-Carbonat-aktivierte Träger mit relativ niedrigem
Aktivierungsgrad mit Protein A, in hohen Konzentrationen gelöst in stark salzhaltigen
Puffern, umgesetzt werden.
2. Verfahren der Herstellung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß nach
unkatalytischer Aktivierung der Aktivierungsgrad der Träger zwischen 0,5 bis 30 µmol/ml
Gel, vorzugsweise zwischen 0,5 bis 5 µmol/ml Gel, liegt.
3. Verfahren der Herstellung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß nach
basenkatalytischer Aktivierung der Aktivierungsgrad der Träger zwischen 0,5 bis 60 µmol/ml
Gel, vorzugsweise zwischen 0,5 bis 5 µmol/ml Gel, liegt.
4. Verfahren der Herstellung nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das
Protein A in Konzentrationen von 3 bis 20 mg/ml Kopplungspuffer, vorzugsweise von 10 bis
20 mg/ml, verwendet wird, wobei vorzugsweise 0,5 Vol. Kopplungspuffer pro 1,0 Vol.Träger
eingesetzt werden.
5. Verfahren der Herstellung nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß
relativ konzentrierte Puffer (z. B. 0,5 bis 1 M Citrat-, Phosphat-, MOPS-Puffer) von pH 4 bis
pH 10 bzw. verdünnte Puffer mit hohen Salzzusätzen (z. B. 1 bis 3 M NaCl, 0,5 bis 1,0 M
Na2SO4 oder K2SO4) eingesetzt werden.
6. Verfahren der Herstellung nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß mit
ONB-Carbonat aktivierbare Träger, vorzugsweise Sepharosen, eingesetzt werden.
7. Verfahren der Herstellung nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß mit
ONB-Carbonat aktivierbare Träger, vorzugsweise cross-linked Agarosen, eingesetzt
werden.
8. Verfahren der Herstellung von Adsorbern nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet,
daß mit ONB-Carbonat aktivierbare Träger, vorzugsweise Cellulosen, eingesetzt werden.
9. Adsorber nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß unter Verwendung
von vorzugsweise Sepharose 4FF chemisch stabile Adsorber mit einem sehr geringen
Protein A-Leakage hergestellt werden können.
10. Adsorber nach den Ansprüchen 1 bis 9 und 9, dadurch gekennzeichnet, daß unter
Verwendung von Sepharose 4FF Adsorber mit hohen Bindungskapazitäten für humanes
Immunglobulin G und für zirkulierende Immunkomplexe hergestellt werden können.
11. Adsorber nach den Ansprüchen 1 bis 6 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß unter
Verwendung von Cellulosepartikeln vergleichbare Bindungskapazitäten für humane
Immunglobuline wie beim Sepharose 4FF-Protein A-Adsorber erreicht werden.
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE10065241A DE10065241A1 (de) | 2000-01-20 | 2000-12-27 | Adorber für die extrakorporale Blutreinigung und Verfahren der Herstellung |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE10002299 | 2000-01-20 | ||
DE10065241A DE10065241A1 (de) | 2000-01-20 | 2000-12-27 | Adorber für die extrakorporale Blutreinigung und Verfahren der Herstellung |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE10065241A1 true DE10065241A1 (de) | 2001-07-26 |
Family
ID=7628135
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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DE10065241A Withdrawn DE10065241A1 (de) | 2000-01-20 | 2000-12-27 | Adorber für die extrakorporale Blutreinigung und Verfahren der Herstellung |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE10065241A1 (de) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3862078A1 (de) * | 2020-02-05 | 2021-08-11 | Pentracor GmbH | Verwendung einer alkalihydroxid-lösung zur regeneration einer apheresesäule |
-
2000
- 2000-12-27 DE DE10065241A patent/DE10065241A1/de not_active Withdrawn
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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EP3862078A1 (de) * | 2020-02-05 | 2021-08-11 | Pentracor GmbH | Verwendung einer alkalihydroxid-lösung zur regeneration einer apheresesäule |
WO2021156482A1 (de) | 2020-02-05 | 2021-08-12 | Pentracor Gmbh | Verwendung einer alkalihydroxid-lösung zur regeneration einer apheresesäule |
CN115052677A (zh) * | 2020-02-05 | 2022-09-13 | 彭特科尔有限公司 | 碱金属氢氧化物溶液用于单采柱再生的用途 |
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