DE10046034B4

DE10046034B4 - Verwendung von Lebensmittelfarbstoffen zur Anfärbung von Enzymlösungen

Info

Publication number: DE10046034B4
Application number: DE10046034A
Authority: DE
Inventors: Roger Dr. Blum; Sabine Kadow
Original assignee: Eppendorf SE
Current assignee: Eppendorf SE
Priority date: 2000-09-18
Filing date: 2000-09-18
Publication date: 2006-07-27
Anticipated expiration: 2020-09-19
Also published as: DE10046034A1; US7462473B2; US20040023352A1; US20020040507A1

Abstract

Verwendung von Lebensmittelfarbstoffen Ponceau 4R (E124), Patentblau (E131) und Tartrazin (E102) zur Vermeidung eines Aktivitätsverlustes von Restriktionsenzymlösungen bei längeren Lagerzeiträumen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Lebensmittelfarbstoffen Ponceau 4R, Patentblau (E131) und Tartrazin (E102) zur Anfärbung und Herstellung von Enzymlösungen, wobei ein Aktivitätsverlust vermieden wird.

Die DE 197 37 173 A1 betrifft ein Mikrodosiersystem zum Dosieren kleinster Flüssigkeitsmengen. Das System wird beispielsweise im Bereich der Molekularbiologie zur Durchführung enzymatischer Reaktionen verwendet. Die kleinsten 10 Flüssigkeitsmengen (z.B. Enzymlösungen) werden dabei mit Hilfe eines Freistrahldosierers z.B. elektrostatisch, piezoelektrisch oder thermomechanisch in ein Reaktionsgefäß eindosiert, wobei die Düse des Freistrahldosierers genau mittig über dem Reaktionsgefäß positioniert werden muß, um zu gewährleisten, daß die zudosierte Flüssigkeit tatsächlich in den Reaktionsansatz eingebracht wird und nicht ganz oder teilweise an der Wandung des Reaktionsgefäßes hängen bleibt, ohne mit der Lösung in Kontakt zu kommen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, für den Fachmann eine Möglichkeit zu schaffen, das Eindosieren der Flüssigkeitsmengen unter Verwendung des o. g. Mikrodosiersystems zu überprüfen, d.h. um beurteilen zu können, ob die zudosierten Probenvolumina auch wirklich vollständig dem Reaktionsansatz zugefügt wurden.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch eine Enzymlösung gelöst, die einen oder mehrere Lebensmittelfarbstoffe aus der Gruppe bestehend aus Ponceau 4R (E124), Patentblau (E131) und Tartrazin (E102) enthält. Diese Lebensmittelfarbstoffe zählen zu Azofarbstoffen und Triarylmethanfarbstoffen, die wasserlöslich sind und unter den Lebensmittelfarbstoffen sich durch ihre Farbtiefe, d.h. den sehr hohen molaren Extinktionskoeffizienten auszeichnen. Nur geringe Mengen Farbstoff sind nötig, um eine ausreichende Färbung zu erzielen (vgl. z.B. Ullmann – Encyklopädie der technischen Chemie, 4. Auflage, Verlag Chemie 1974, Band 8, S. 260 ff.). Aus diesen drei Grundfarben lassen sich praktisch beliebige Farbtöne mischen.

Die Enzymlösung enthält ein oder mehrere Restriktionsenzyme. Die erfindungsgemäßen Enzymlösungen zeichnen sich insbesondere dadurch aus, daß sie auch bei längeren Lagerzeiträumen keinen Aktivitätsverlust (oder nur einen geringen Aktivitätsverlust, vorzugsweise unter 20%) aufweisen.

Hinsichtlich der verwendeten Farbstoffmenge bestehen erfindungsgemäß keinerlei Beschränkungen. Bei Verwendung im Zusammenhang mit dem Mikrodosiersystem der DE 197 37 173 A1 hat sich eine Mindestmenge als vorteilhaft erwiesen, die es gestattet, eine Anfärbung eines Tropfens vor einem weißen Hintergrund visuell gerade noch zu erkennen. Es ist nicht notwendigerweise erforderlich, daß man auch noch nach Vermischen der angefärbten Enzymlösung mit dem Reaktionsansatz einen Farbton erkennen kann.

Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der vorgenannten Enzymlösungen in einem Mikrodosiersystem gemäß DE 197 37 173 A1 . Die Färbung der Enzymlösung ergibt folgende Handhabungsvorteile: Die mit Hilfe dieses Systems dosierten, sehr kleinen Tropfen (bis zu 10nl) sind ungefärbt nur schwer zu erkennen. Die Anfärbung der Enzymlösung ermöglicht die mühelose Kontrolle der Ereignisse, nämlich a) ob der Tropfen dosiert wurde und b) ob er dabei an die richtige Stelle gelangte.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ferner die Verwendung von Lebensmittelfarbstoffen Ponceau 4R, Patentblau (E131) und Tartrazin (E102) zur Herstellung von Enzymlösungen, vorzugsweise zur Verwendung in einem Mikrodosiersystem gemäß DE 197 37 173 A1 , wobei ein Aktivitätsverlust vermieden wird. Die Enzymlösungen enthalten ein oder mehrere Restriktionsenzyme.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen näher erläutert.
1) Material und Methode:
Restriktionsenzyme (Roche) und Verdünnungspuffer:

Bam H1, 10 Einheiten/μl (Nr. 567 604, Verdünnungspuffer = P2)
Cla 1, 10 Einheiten/μl (Nr. 404 217, Verdünnungspuffer = P1)
Dra 1, 10 Einheiten/μl (Nr. 779 695, Verdünnungspuffer = P1)
Eco R1, 10 Einheiten/μl (Nr. 1 175 084, Verdünnungspuffer = P3)

Farben:
Alle Farben von der Firma Synopharm, 22882 Barsbüttel

Ponceau 4R, Nr. 145 130, Charge: 94030770
Patentblau, Nr. 700 141, Charge: 95060280
Tartrazin, Nr. 145 160, Charge: 96040020

Herstellung der gefärbten Enzymlösungen
Den nach Herstellervorschrift Roche zu verwendenden Verdünnungspuffern P1, P2 oder P3 wurden die drei Farben rot, blau und gelb sowie zur Herstellung von grün das Gemisch blau + gelb ad 0,5 % Farbgehalt (w/v) zugemischt.
9 Teilen einer Enzymlösung wurde 1 Teil entsprechender, gefärbter Verdünnungspuffer zugegeben. Die Farbe des Verdünnungspuffers entsprach den Codefarben für die den Enzymen zugeordneten Reaktionspuffer (blau für Bam H1, rot für Cla 1, grün für Dra 1, rot für Eco R1).
Gelb wird also in der Kombination mit blau getestet.
Damit waren gefärbte Enzymlösungen hergestellt, die 500 ppm Farbe enthielten.
Als Referenz wurden Gemische von 9 Teilen der verwendeten Enzymlösungen mit 1 Teil des entsprechenden ungefärbten Puffers verwendet.
Messung der Enzymaktivität:
Die Enzymaktivität wurde durch Verdau von λ-DNA in Form einer Zeitreihe ausgeführt.
Aus dem gelelektrophoretischen Bild der zu 8 bis 10 aufeinanderfolgenden Zeitpunkten abgestoppten Reaktion lässt sich die Reaktionsgeschwindigkeit der gefärbten Enzymlösung mit der ungefärbten Referenz vergleichen. Die Reaktionsgeschwindigkeit ist dabei in erster Näherung umgekehrt proportional zu der Zeit, die für den Verdau des Substrats benötigt wird.
Als Reaktionspuffer wurden die Puffer von Roche verwendet, modifiziert durch einen Zusatz von 0,02% Tween 20 und 2% des entsprechenden Verdünnungspuffers.
2) Ergebnisse
1 bis 4 zeigen die Geschwindigkeiten des Verdaus von λ-DNA bei den 4 Enzymen nach 1 Woche Lagerung bei –21 °C, 5 bis 8 nach fast einem halben Jahr Lagerung bei –21 °C.
Eine Änderung der Aktivität der Enzyme durch die Gegenwart der verwendeten Farbstoffe ließ sich nicht erkennen, zu beiden Zeitpunkten ist die Geschwindigkeit des Verdaus durch gefärbte wie ungefärbte Enzymlösung gleich groß.

Claims

Verwendung von Lebensmittelfarbstoffen Ponceau 4R (E124), Patentblau (E131) und Tartrazin (E102) zur Vermeidung eines Aktivitätsverlustes von Restriktionsenzymlösungen bei längeren Lagerzeiträumen.
Verwendung von Lebensmittelfarbstoffen Ponceau 4R (E124), Patentblau (E131) und Tartrazin (E102) zur Herstellung von Restriktionsenzymlösungen, wobei ein Aktivitätsverlust vermieden wird.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Aktivitätsverlust weniger als 20% beträgt.
Verwendung nach den Ansprüchen 2 bis 3 in einem in DE 197 37 173 A1 beschriebenen Mikrodosiersystem mit – einem Reservoir, – einer Mikromembranpumpe, deren Eingang mit dem Reservoir verbunden ist, – einem Freistrahldosierer, dessen Eingang mit dem Ausgang der Mikromembranpumpe verbunden ist, – einer mit dem Ausgang des Freistrahldosierers verbundenen Dosieröffnung und – einer mit Mikromembranpumpe und Freistrahldosierer in Wirkverbindung stehenden Dosiersteuerung.