DE10046034A1

DE10046034A1 - Verwendung von Lebensmittelfarbstoffen zur Anfärbung von Enzymlösungen

Info

Publication number: DE10046034A1
Application number: DE10046034A
Authority: DE
Inventors: Roger Blum; Sabine Kadow
Original assignee: Eppendorf SE
Current assignee: Eppendorf SE
Priority date: 2000-09-18
Filing date: 2000-09-18
Publication date: 2002-04-04
Anticipated expiration: 2020-09-19
Also published as: US20040023352A1; US20020040507A1; DE10046034B4; US7462473B2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Lebensmittelfarbstoffen zur Anfärbung von Enzymlösungen, mit Lebensmittelfarbstoffen versehene Enzymlösungen sowie deren Verwendung.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Lebens mittelfarbstoffen zur Anfärbung von Enzymlösungen, mit Lebensmittelfarbstoffen versehene Enzymlösungen sowie deren Verwendung.

Die DE 197 37 173 A1 betrifft ein Mikrodosiersystem zum Dosieren kleinster Flüssigkeitsmengen. Das System wird beispielsweise im Bereich der Molekularbiologie zur Durch führung enzymatischer Reaktionen verwendet. Die kleinsten Flüssigkeitsmengen (z. B. Enzymlösungen) werden dabei mit Hilfe eines Freistrahldosierers z. B. elektrostatisch, piezoelektrisch oder thermomechanisch in ein Reaktionsgefäß eindosiert, wobei die Düse des Freistrahldosierers genau mittig über dem Reaktionsgefäß positioniert werden muß, um zu gewährleisten, daß die zudosierte Flüssigkeit tatsächlich in den Reaktions ansatz eingebracht wird und nicht ganz oder teilweise an der Wandung des Reaktionsgefäßes hängen bleibt, ohne mit der Lösung in Kontakt zu kommen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, für den Fachmann eine Möglichkeit zu schaffen, das Eindosieren der Flüssigkeitsmengen unter Verwendung des o. g. Mikrodosiersystems zu überprüfen, d. h. um beurteilen zu können, ob die zudosierten Probenvolumina auch wirklich vollständig dem Reaktionsansatz zugefügt wurden.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch eine Enzymlösung gelöst, die einen oder mehrere Lebensmittelfarbstoffe, vorzugsweise einen oder mehrere Lebensmittelfarbstoffe gemäß Anhang I zur Richtlinie 94/36/EG vom 30.06.1994 (in der am 10.09.1994 im Amtsblatt Nr. L 237 (S. 0013-0029) der Europäischen Gemein schaften veröffentlichten Fassung), enthält. Zu den besonders bevorzugt verwendeten Lebensmittelfarbstoffen zählen Azofarb stoffe und Triarylmethanfarbstoffe, die wasserlöslich sind und unter den Lebensmittelfarbstoffen sich durch ihre Farbtiefe, d. h. den sehr hohen molaren Extinktionskoeffizienten auszeich nen. Nur geringe Mengen Farbstoff sind nötig, um eine aus reichende Färbung zu erzielen (vgl. z. B. Ullmann - Encyklopädie der technischen Chemie, 4. Auflage, Verlag Chemie 1974, Band 8, S. 260 ff.).

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Lebensmittelfarbstoffe aus der Gruppe bestehend aus Ponceau 4R (E124), Patentblau (E131) und Tartrazin (E102) ausgewählt. Aus diesen drei Grundfarben lassen sich praktisch beliebige Farbtöne mischen.

Hinsichtlich des Enzyms bestehen keinerlei Beschränkungen. Die Enzymlösung enthält ein oder mehrere Enzyme, wie z. B. Enzyme aus der Gruppe bestehend aus Restriktionsenzymen und Polymera sen.

Die erfindungsgemäßen Enzymlösungen zeichnen sich insbesondere dadurch aus, daß sie auch bei längerer Lagerzeiträumen keinen Aktivitätsverlust (oder nur einen geringen Aktivitätsverlust, vorzugsweise unter 20%) aufweisen.

Hinsichtlich der verwendeten Farbstoffmenge bestehen erfin dungsgemäß keinerlei Beschränkungen. Bei Verwendung im Zusammenhang mit dem Mikrodosiersystem der DE 197 37 173 A1 hat sich eine Mindestmenge als vorteilhaft erwiesen, die es gestattet, eine Anfärbung eines Tropfens vor einem weißen Hintergrund visuell gerade noch zu erkennen. Es ist nicht notwendigerweise erforderlich, daß man auch noch nach Ver mischen der angefärbten Enzymlösung mit dem Reaktionsansatz einen Farbton erkennen kann.

Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der vorgenannten Enzymlösungen in einem Mikrodosiersystem gemäß DE 197 37 173 A1. Die Färbung der Enzymlösung ergibt folgende Handhabungsvor teile: Die mit Hilfe dieses Systems dosierten, sehr kleinen Tropfen (bis zu 10 nl) sind ungefärbt nur schwer zu erkennen. Die Anfärbung der Enzymlösung ermöglicht die mühelose Kontrolle der Ereignisse, nämlich a) ob der Tropfen dosiert wurde und b) ob er dabei an die richtige Stelle gelangte.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ferner die Verwendung der o. g. Lebensmittelfarbstoffe zur Herstellung von Enzymlösungen, vorzugsweise zur Verwendung in einem Mikrodo siersystem gemäß DE 197 37 173 A1. Die Enzymlösungen können ein oder mehrere Enzyme, wie z. B. aus der Gruppe bestehend aus Re striktionsenzymen und Polymerasen, enthalten.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen näher erläutert.

Beispiele 1) Material und Methode Restriktionsenzyme (Rache) und Verdünnungspuffer

Bam H1, 10 Einheiten/µl (Nr. 567 604, Verdünnungspuffer = P2)
Cla 1, 10 Einheiten/µl (Nr. 404 217, Verdünnungspuffer = P1)
Dra 1, 10 Einheiten/µl (Nr. 779 695, Verdünnungspuffer = P1)
Eco R1, 10 Einheiten/µl (Nr. 1 175 084, Verdünnungspuffer = P3)

Farben

Alle Farben von der Firma Synopharm; 22882 Barsbüttel
Ponceau 4R, Nr. 145 130, Charge: 94030770
Patentblau, Nr. 700 141, Charge: 95060280
Tartrazin, Nr. 145 160, Charge: 96040020

Herstellung der gefärbten Enzymlösungen

Den nach Herstellervorschrift Roche zu verwendenden Ver dünnungspuffern P1, P2 oder P3 wurden die drei Farben rot, blau und gelb sowie zur Herstellung von grün das Gemisch blau + gelb ad 0,5% Farbgehalt (w/v) zugemischt.

9 Teilen einer Enzymlösung wurde 1 Teil entsprechender, gefärbter Verdünnungspuffer zugegeben. Die Farbe des Ver dünnungspuffers entsprach den Codefarben für die den Enzymen zugeordneten Reaktionspuffer (blau für Bam H1, rot für Cla 1, grün für Dra 1, rot für Eco R1).

Gelb wird also in der Kombination mit blau getestet.

Damit waren gefärbte Enzymlösungen hergestellt, die 500 ppm Farbe enthielten.

Als Referenz wurden Gemische von 9 Teilen der verwendeten Enzymlösungen mit 1 Teil des entsprechenden ungefärbten Puffers verwendet.

Messung der Enzymaktivität

Die Enzymaktivität wurde durch Verdau von λ-DNA in Form einer Zeitreihe ausgeführt.

Aus dem gelelektrophoretischen Bild der zu 8 bis 10 aufeinan derfolgenden Zeitpunkten abgestoppten Reaktion lässt sich die Reaktionsgeschwindigkeit der gefärbte Enzymlösung mit der ungefärbten Referenz vergleichen. Die Reaktionsgeschwindigkeit ist dabei in erster Näherung umgekehrt proportional zu der Zeit, die für den Verdau des Substrats benötigt wird.

Als Reaktionspuffer wurden die Puffer von Roche verwendet, modifiziert durch einen Zusatz von 0,02% Tween 20 und 2% des entsprechenden Verdünnungspuffers.

2) Ergebnisse

Fig. 1 bis 4 zeigen die Geschwindigkeiten des Verdaus von λ-DNA bei den 4 Enzymen nach 1 Woche Lagerung bei -21°C,

Fig. 5 bis 8 nach fast einem halben Jahr Lagerung bei -21°C.

Eine Änderung der Aktivität der Enzyme durch die Gegenwart der verwendeten Farbstoffe ließ sich nicht erkennen, zu beiden Zeitpunkten ist die Geschwindigkeit des Verdaus durch gefärbte wie ungefärbte Enzymlösung gleich groß.

Claims

1. Enzymlösung, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen oder mehrere Lebensmittelfarbstoffe enthält.

2. Enzymlösung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Lebensmittelfarbstoffe Lebensmittelfarbstoffe gemäß Anhang I zur Richtlinie 94/36/EG vom 30.06.1994 sind.

3. Enzymlösung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn zeichnet, daß die Lebensmittelfarbstoffe Azofarbstoffe und/oder Triarylmethanfarbstoffe sind.

4. Enzymlösung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn zeichnet, daß die Lebensmittelfarbstoffe aus der Gruppe bestehend aus Ponceau 4R (E124), Patentblau (E131) und Tartrazin (E102) ausgewählt sind.

5. Enzymlösung nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein oder mehrere Enzyme aus der Gruppe bestehend aus Restriktionsenzymen und Polyme rasen enthält.

6. Verwendung von Enzymlösungen nach den Ansprüchen 1 bis 5 in einem Mikrodosiersystem gemäß DE 197 37 173 A1.

7. Verwendung von Lebensmittelfarbstoffen zur Herstellung von Enzymlösungen zur Verwendung in einem Mikrodosier system gemäß DE 197 37 173 A1.

8. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Lebensmittelfarbstoffe Lebensmittelfarbstoffe gemäß Anhang I zur Richtlinie 94/36/EG vom 30.06.1994 sind.

9. Verwendung nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeich net, daß die Lebensmittelfarbstoffe Azofarbstoffe und/- oder Triarylmethanfarbstoffe sind.

10. Verwendung nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeich net, daß die Lebensmittelfarbstoffe aus der Gruppe bestehend aus Ponceau 4R (E124), Patentblau (E131) und Tartrazin (E102) ausgewählt sind.

11. Verwendung nach den Ansprüchen 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein oder mehrere Enzyme aus der Gruppe bestehend aus Restriktionsenzymen und Polyme rasen enthält.