DE10041342A1 - Vakzine gegen Krebserkrankungen - Google Patents
Vakzine gegen KrebserkrankungenInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung einer Vakzine gegen Krebserkrankungen sowie die Vakzine selbst zur Verfügung. In diesem Verfahren werden zunächst unter Verwendung eines oder mehrerer Antikörper, die gegen ein oder mehrere speziell von den Tumorzellen exprimierte Antigene spezifisch wirksam sind, aus einer Phagen-Peptid-Bibliothek ein oder mehrere Mimotope dieser Antigene ausgewählt. Um die Vakzine zu erhalten, werden diese Mimotope in Form ihrer Mono-, Di-, Tri- oder Oligomere ein- oder mehrfach mit einem makromolekularen Träger konjugiert. Die erfindungsgemäß hergestellten Vakzine führen bei Verabreichung zu einer humoralen Immunantwort und damit zur Entstehung einer aktiven Immunität als Folge der Vakzinierung.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer
Vakzine gegen Krebserkrankungen, sowie diese Vakzine selbst.
In den letzten Jahren ist in den westlichen Industrienationen ein stetiges
Anwachsen der Krebserkrankungen festzustellen. Beispielsweise erkranken in
der Bundesrepublik Deutschland jährlich schätzungsweise 23.000 Männer und
29.000 Frauen an Krebs des Dickdarms und Mastdarms, wobei das
Erkrankungsrisiko mit dem Lebensalter allmählich ansteigt. Maligne
Lymphome machen ca. 5% aller Krebsfälle aus, wobei in Deutschland
jährlich etwa 9.000 Menschen an Non-Hodgkin-Lymphomen erkranken - bei
steigender Tendenz. Von Brustkrebs sind sogar etwa 10% aller Frauen in den
westlichen Industrienationen betroffen.
Bisher bekannte Verfahren zur Therapie von Krebserkrankungen zielen vor
allen Dingen auf eine frühe Erkennung der Erkrankung und auf operative
Methoden bzw. eine möglichst selektive Abtötung der Tumorzellen ab. Diese
Verfahren weisen die Nachteile auf, daß eine wirkungsvolle Prophylaxe
gegen die Entstehung der Krebserkrankung nicht möglich ist und daß die
Behandlung zum Beispiel durch Chemotherapie mit ganz erheblichen
Nebenwirkungen für den Patienten verbunden ist.
Demgemäß ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vakzine gegen
Krebserkrankungen zur Verfügung zu stellen, mit Hilfe derer es möglich ist,
Krebserkrankungen wirksam vorzubeugen und somit das Risiko einer
solchen Erkrankung deutlich zu verringern.
Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß eine solche Vakzine durch
ein Verfahren erhalten werden kann, das Antikörper ausnutzt, die gegen ein
von den Tumorzellen gebildetes Antigen wirksam sind, um Mimotope dieses
Antigens zu erhalten, mit Hilfe derer eine körpereigene Immunantwort
stimuliert werden kann.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung
einer Vakzine gegen Krebserkrankungen, das dadurch gekennzeichnet ist,
daß zunächst unter Verwendung eines oder mehrerer körpereigener oder
synthetischer Antikörper, die gegen ein oder mehrere speziell von den
Tumorzellen exprimierte Antigene spezifisch wirksam sind, aus einer
Phagen-Peptid-Bibliothek ein oder mehrere Mimotope dieser Antigene
ausgewählt werden und diese Mimotope dann mit einem makromolekularen
Träger konjugiert werden.
Weiter ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung eine Vakzine gegen
Krebserkrankungen, die nach diesem Verfahren herstellbar ist.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren werden Vakzine gegen
Krebserkrankungen erhalten, selbst wenn die Natur bzw. Struktur des
entsprechenden Antigens nicht oder nicht im Detail bekannt ist.
Darüber hinaus sind die erhaltenen Vakzine phagenfrei und somit auch
von daher bestens für eine Impfung im Humansystem geeignet. Damit ist
durch die Vakzine insbesondere auch eine Prophylaxe gegen
Krebserkrankungen möglich, d. h. die erfindungsgemäße Vakzine ist in der
Lage, durch aktive Immunisierung vor einer potentiellen Krebserkrankung
zu schützen, sie also erst gar nicht aufkommen zu lassen. Die Vakzine kann
allerdings auch zur Therapie einer bereits bestehenden Krebserkrankung
eingesetzt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden im erfindungsgemäßen
Verfahren Antikörper eingesetzt, die sich bereits als solche in klinischen
Tests gegen Krebserkrankungen wirksam erwiesen haben. Dadurch wird bei
Verabreichung der Vakzine die Bildung körpereigener Antikörper gegen
solche Antigene der Krebszellen induziert, gegen die auch die klinisch
erprobten Antikörper wirksam sind. Damit wird die Wirksamkeit der
Vakzine erhöht.
Die Konjugation der im erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen
Mimotope an den makromolekularen Träger kann auf beliebige Weise
erfolgen, beispielsweise auf gentechnologischem oder chemischem Weg, bei
dem die Mimotope mit Hilfe einer chemischen Reaktion an den Träger
gebunden werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Mimotope auf
gentechnologischem Weg mit dem Träger konjugiert, d. h. die Vakzine wird
so hergestellt, daß eine für die Vakzine codierende DNA- oder RNA-
Sequenz in ein Expressionssystem eingebaut wird, so daß die gesamte
Vakzine, d. h. der Träger mit den daran gebundenen Mimotopen, exprimiert
wird.
Die mit Hilfe der Antikörper aufgefundenen Mimotope können als Mono-,
Di-, Tri- oder Oligomere mit einem makromolekularen Träger konjugiert
werden. Solche Konjugationen sind zum Beispiel in der Druckschrift von
Th. H. Turpen, S. J. Reinl, Y. Charoenvit, S. L. Hoffman, V. Fallarme in
Bio/Technology 1995, Band 13, Seiten 53 bis 57 am Beispiel der
Konjugation von Epitopen mit makromolekularen Trägern beschrieben. Die
beschriebenen Vorgehensweisen lassen sich analog auf die im
erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Konjugation der Mimotope mit
dem makromolekularen Träger übertragen. Auf den Offenbarungsgehalt
dieser Druckschrift wird hiermit Bezug genommen.
In der genannten Druckschrift wird zur Konjugation der Epitope ein
gentechnologischer Weg eingeschlagen. In diesem werden die für die
Epitope kodierenden RNA-Abschnitte entweder einzeln oder ein- oder
mehrmals hintereinander gereiht in die RNA-Sequenz des Trägers integriert.
Dadurch wird die Expression mono-, di- oder oligomerer Epitopkonjugate
erreicht. Gemäß der vorliegenden Erfindung werden die für die Mimotope
kodierenden RNA- oder DNA-Abschnitte als mono-, di-, tri- oder oligomere
Mimotopsequenzen in die RNA- oder DNA-Sequenz des Trägers integriert.
Um die Immunogenität weiterhin zu erhöhen, können die mono-, di-, tri-
oder oligomeren Mimotope sowohl einfach als auch in multipler Form an
den makromolekularen Träger gebunden werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein
Verfahren zur Herstellung einer Vakzine gegen Adenocarcinome des
Gastrointestinaltraktes, Prostata Carcinom, Brustkrebs (Mamma Carcinom),
Multiples Myelom, B-lymphoproliferatives Post-Transplantat Syndrom, B-
Zell Malignom und Chronisch lymphatische Leukämie zur Verfügung. Durch
die durch das Verfahren hergestellte Vakzine kann der Entstehung dieser
Krebsarten entgegen gewirkt werden.
Die zur erfindungsgemäßen Herstellung der Vakzine gegen
Krebserkrankungen verwendeten Antikörper sind gegen speziell von
Tumorzellen exprimierte Antigene spezifisch wirksam. Bei diesen
Antikörpern kann es sich zum einen um körpereigene handeln, wie sie in
Folge der humoralen Immunantwort auf das oder die Antigene zum Beispiel
im Blutserum von erkrankten Patienten vorhanden sind. Die Herstellung
bzw. Isolierung dieser Antikörper erfolgt nach bekannten, herkömmlichen
Methoden.
Zum anderen können auch synthetische Antikörper oder Antikörper
präparationen verwendet werden, die gegebenenfalls humanisiert wurden.
Weiter können im erfindungsgemäßen Verfahren monoklonale Antikörper,
aber auch polyklonale Antikörper verwendet werden.
In einer Ausführungsform umfassen die im erfindungsgemäßen Verfahren
verwendeten körpereigenen oder synthetischen Antikörper solche
Antikörper, die eine Antikörper Abhängige Celluläre Cytotoxizität (ADCC-
Reaktion) auslösen oder einen als Antigen wirkenden Rezeptor für einen
Wachstumsfaktor der Tumorzellen erkennen. Durch den Einsatz von solchen
Antikörpern wird eine besonders ausgeprägte Wirkung der durch das
erfindungsgemäße Verfahren erhältlichen Vakzine sichergestellt.
Bevorzugt umfassen die in dieser Ausführungsform eingesetzten
körpereigenen oder synthetischen Antikörper solche Antikörper, die gegen
das von den Tumorzellen exprimierte HER-2/neu Protein oder das epitheliale
Glycoprotein Antigen, CO17-1A, oder das Phosphoprotein
Oberflächenantigen an Lymphozyten, CD20, oder den Epidermal Growth
Factor (EGF)-Rezeptor spezifisch wirksam sind. Durch den Einsatz solcher
Antikörper ist vor allen Dingen eine sehr gute Wirksamkeit der durch das
erfindungsgemäße Verfahren hergestellten Vakzine gegen Brustkrebs
(Mamma Carcinom), Adenocarcinome des Gastrointestinaltraktes, Prostata
Carcinom, Multiples Myelom, B-lymphoproliferatives Post-Transplantat
Syndrom, B-Zell Malignom und Kopf-Hals-Tumoren gewährleistet.
Das HER-2/neu Protein stellt einen Rezeptor für einen Wachstumsfaktor dar,
unter dessen Kontrolle die Tumorzellen wachsen. Antikörper gegen das
HER-2/neu Protein sind zum Beispiel in US 5,772,997 beschrieben. Auf den
Offenbarungsgehalt dieser Patentschrift wird hiermit Bezug genommen.
Von den gegen das HER-2/neu Protein wirksamen Antikörpern wird im
erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugterweise die klinisch erprobte
Antikörperpräparation Herceptin von Genentech Inc. verwendet. Diese
Antikörperpräparation hat bereits bei der Zugabe zur konventionellen
Chemotherapie bei Brustkrebspatientinnen eine deutliche Verbesserung der
Ansprechrate auf die Behandlung der Patientinnen herbeigeführt. Bei
Herceptin handelt es sich um einen humanisierten monoklonalen Antikörper,
der aus Mäusen gewonnen wird. Herceptin ist gegen das Antigen HER-2/neu
wirksam, das als Wachstumsfaktor-Rezeptor auf Tumorzellen häufig
überexprimiert ist. Speziell bei Brustkrebstumoren wird in etwa bei 20-30%
der Fälle das HER-2/neu-Antigen spezifisch an der Zelloberfläche
exprimiert. Die Verabreichung von Herceptin führt zur Einleitung des
natürlichen Zelltods der das HER-2/neu exprimierenden Tumorzellen. Die
erfindungsgemäß hergestellte Vakzine ist besonders gegen die Krebsarten
wirksam, bei denen es zu einer Expression von HER-2/neu auf den
Tumorzellen kommt, d. h. z. B. gegen Brustkrebs.
In einer weiteren Ausführungsform umfassen die im erfindungsgemäßen
Verfahren verwendeten körpereigenen oder synthetischen Antikörper die
klinisch erprobte Antikörperpräparation Panorex von GlaxoWellcome. Diese
Antikörperpräparation wird auch als Edrecolamab bezeichnet. Bei Panorex
handelt es sich um einen monoklonalen Antikörper, der aus Mäusen
gewonnen wird. Wie von Riethmüller et al., Lancet 343 (1994) 1177-83
berichtet, ist Panorex gegen das epitheliale Glycoprotein Antigen CO17-1A
gerichtet. Auf den Offenbarungsgehalt dieser Druckschrift wird hiermit
Bezug genommen. Panorex wirkt insbesondere gegen Adenocarcinome des
Gestrointestinaltraktes (Punt, Cancer 83 (1998) 679-89; Martin et al., J. Clin.
Pathol. 52 (1999) 701-4; Samonigg et al., J. Immunother. 22 (1999) 481),
Prostata Carcinom (Poczatek et al., The Journal of Urology 162 (1999)
1462-6) und gegen Brustkrebs (Braun et al., Clin Cancer Res. 5 (1999)
3999-4004). Auf den Offenbarungsgehalt dieser Druckschriften wird hiermit
Bezug genommen. Daher ist die erfindungsgemäß hergestellte Vakzine
besonders gegen diese Krebsarten wirksam.
In einer weiteren Ausführungsform umfassen die im erfindungsgemäßen
Verfahren verwendeten körpereigenen oder synthetischen Antikörper die
klinisch erprobte Antikörperpräparation MabThera von Genentech Inc.
Diese Antikörperpräparation wird auch als Rituxan (IDEC Pharmaceuticals)
oder Rituximab (Hoffmann-LaRoche) bezeichnet. Bei MabThera handelt es
sich um einen humanisierten, monoklonalen Antikörper, der aus Mäusen
gewonnen wird und gegen das Phosphoprotein Oberflächenantigen an
Lymphozyten, CD20, gerichtet ist. MabThera wirkt insbesondere gegen
Multiples Myelom (Treon et al., Ann. Oncol. 11 (2000) 107-11), gegen B-
lymphoproliferatives Post-Transplantat Syndrom (Milpied et al., Ann. Oncol.
11 (2000) 113-116), gegen B-Zell Malignom (Behr et al., Clin. Cancer Res.
5 (1999) 3304-3314) und gegen Lymphatische Leukämie. Auf den
Offenbarungsgehalt dieser Druckschriften wird hiermit Bezug genommen.
Daher ist die erfindungsgemäß hergestellte Vakzine besonders gegen diese
Krebsarten wirksam.
In einer weiteren Ausführungsform umfassen die im erfindungsgemäßen
Verfahren verwendeten körpereigenen oder synthetischen Antikörper die in
klinischen Studien befindliche Antikörperpräparation IMC-C225
(Cetuximab) von ImClone. Bei IMC-C225 (Cetuximab) handelt es sich um
einen chimärisierten monoklonalen Antikörper, der gegen den Epidermal
Growth Factor (EGF)-Rezeptor gerichtet ist. IMC-C225 (Cetuximab) wirkt
insbesondere gegen Kopf-Hals-Tumoren (Hueng et al., Cancer Res. 59
(1999), 1935-40; Baselga et al., J. Clin. Oncol. 18 (2000) 904-14). Auf den
Offenbarungsgehalt dieser Druckschriften wird hiermit Bezug genommen.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Vakzine ist besonders
gegen diese Krebsarten wirksam.
Die Darstellung der aus den Phagen-Peptid-Bibliotheken ausgewählten
Mimotope bzw. der Mimotopkonjugate findet bevorzugt unter Verwendung
eines pflanzlichen Expressionssystems statt, wie es zum Beispiel das
Tabakmosaikvirussystem darstellt. In diesem System kann die Expression
der Mimotope bzw. der Mimotopkonjugate durch transiente Infektion der
Wirtspflanzen mit Tabakmosaikviren erfolgen. Die solchermaßen
exprimierten Mimotope und Mimotopkonjugate sind endotoxin- und
phagenfrei und somit besonders für den Einsatz im erfindungsgemäßen
Verfahren zur Herstellung einer Vakzine bzw. als Vakzine selbst geeignet.
Dieses Expressionssystem eignet sich auch besonders für die Herstellung der
Mimotope bzw. Mimotopkonjugate in größerer Menge.
Im folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren im Detail beschrieben.
Die körpereigenen oder synthetischen Antikörper werden im
erfindungsgemäßen Verfahren dazu verwendet, um aus Phagen-Peptid-
Bibliotheken geeignete Peptid-Mimotope der Antigene, gegen die Antikörper
spezifisch wirksam sind, auszuwählen. Einen Überblick über Phagen-Peptid-
Bibliotheken und zugehörige Literatur geben M. B. Zwick, J. Shen und J. K.
Scott in Current Opinion in Biotechnologie 1998, 9: 427-436. Auf den
Offenbarungsgehalt dieser Druckschrift wird hiermit Bezug genommen.
Phagen-Peptid-Bibliotheken bestehen aus filamentösen Phagen, die an ihrer
Oberfläche unterschiedliche Peptide in einer sehr großen Variationsbreite
exprimieren. Durch herkömmliche Selektionsverfahren werden unter
Verwendung der gegen das spezielle Antigen wirksamen Antikörper aus
diesen Bibliotheken die passenden Peptid-Mimotope aufgefunden. Dabei ist
anzumerken, daß die aufgefundenen Mimotope in ihrer chemischen Natur
nicht mit dem entsprechenden Epitop des Antigens übereinstimmen müssen.
Die auf diese Weise ausgewählten Mimotope werden durch DNA
Sequenzierung charakterisiert. Nach dem Muster der gefundenen Sequenzen
werden Mimotope als Fusionsprotein mit makromolekularem Träger
produziert oder synthetisiert und chemisch an den makromolekularen Träger
konjugiert. Diese Konjugation kann beispielsweise so erfolgen, daß ein
Albumin-bindendes Protein (ABP), wie es zum Beispiel von Streptokokken
exprimiert wird, mit dem Mimotop-Protein verbunden wird. Die Verbindung
von ABP und Proteinen wird von S. Baumann, P. Grob, F. Stuart, D. Pertlik,
M. Ackermann und M. Suter im Journal of Immunological Methods 221
(1998) 95-106 beschrieben. Auf den Offenbarungsgehalt dieser Druckschrift
wird hiermit Bezug genommen.
Durch den Schritt der Konjugation der Mimotope mit makromolekularem
Träger wird gewährleistet, daß bei Verabreichung der Vakzine eine
Immunantwort des Körpers induziert wird, d. h. dieser Schritt erfolgt, um die
Mimotope immunogen zu machen.
Die Expression der aufgefundenen Mimotop-Proteine oder
Mimotopkonjugat-Proteine kann durch systemische transiente Infektion von
pflanzlichen Expressionssystemen (Wirtspflanzen), wie Nicotiana Tabacum
oder Nicotina benthamiana mittels der genomischen und infektiven RNA von
rekombinanten Tabakmosaikviren (TMV) oder durch vollständige
rekombinante TMV-Partikel erfolgen.
Dazu wird zuerst die für das Fremdprotein kodierende DNA Sequenz in eine
in einem Plasmid befindliche cDNA Kopie des TMV ligiert, so daß diese
Sequenz unter die Kontrolle des subgenomischen Promoters für das
ursprüngliche Hüllprotein des TMV gelangt. Im Falle des Mimotop-
Konjugats erfolgt zunächst die Fusion an das ABP. Dazu wird die für das
Mimotop kodierende cDNA an das 3'-Ende der für das ABP kodierenden
cDNA im gleichen Leserahmen angefügt. Die daraus entstehende cDNA des
Fusionsproteins ABP-Mimotop wird in eine cDNA Kopie des TMV Genoms
eingefügt. Damit gelangt diese Sequenz unter die Kontrolle des
subgenomischen Promoters für das ursprüngliche Hüllprotein des TMV.
Anschließend wird in vitro ein RNA Transkript des rekombinanten TMV
Genoms synthetisiert. Diese RNA ist infektiv und wird auf verwundete
Blätter der o. g. Wirtspflanzen aufgetragen. Im Zytoplasma der Wirtszellen
kommt es zur Synthese der viralen Proteine und des gewünschten
Fremdproteins.
Durch diese Expressionsverfahren können die Mimotop-Proteine problemlos
auch in größerem Maßstab in endotoxinfreier Form erhalten werden.
Die Expression bzw. Herstellung der aufgefundenen Mimotop-Proteine kann
aber auch nach herkömmlichen Methoden, wie zum Beispiel der Expression
in E. Coli-Bakterien erfolgen.
Dabei wird zur Konjugation von ABP und Mimotop-Protein zunächst eine
einzelsträngige DNA-Sequenz der selektionierten Mimotope gewonnen und
daraus doppelsträngige DNA erstellt. Diese DNA wird in den
Expressionsvektor pSB 511 ligiert. Das resultierende Konstrukt aus
Information für Mimotop und ABP wird zur Transformation kompetenter E.
Coli XL-1 Zellen verwendet. Nach Amplifikation und Ernte der Zellen kann
das rekombinante Protein mittels NiNTA Agarose gereinigt werden.
Claims (11)
1. Verfahren zur Herstellung einer Vakzine gegen Krebserkrankungen,
dadurch gekennzeichnet, daß aus einer Phagen-Peptid-Bibliothek unter
Verwendung eines oder mehrerer körpereigener oder synthetischer
Antikörper, die gegen ein oder mehrere speziell von den Tumorzellen
exprimierte Antigene spezifisch wirksam sind, ein oder mehrere Mimotope
dieser Antigene ausgewählt werden und diese Mimotope mit einem
makromolekularen Träger konjugiert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Antikörper
solche ausgewählt werden, die klinische Wirksamkeit gegen Krebs
erkrankungen besitzen.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die
Mimotope gentechnologisch oder chemisch an den makromolekularen
Träger konjugiert werden.
4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß die Mimotope als Monomere, Dimere, Trimere oder
Oligomere mit dem makromolekularen Träger konjugiert werden.
5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß die monomeren, dimeren, trimeren oder oligomeren
Mimotope einfach oder mehrfach an den makromolekularen Träger
gebunden werden.
6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß als Antikörper solche ausgewählt werden, die eine
Antikörper Abhängige Celluläre Cytotoxizität auslösen oder einen als
Antigen wirkenden Rezeptor als einen Wachstumsfaktor der Tumorzellen
erkennen.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Antikörper
solche ausgewählt werden, die das von Tumorzellen exprimierte Antigen
HER-2/neu-Protein oder das epitheliale Glycoprotein Antigen, CO17-1A,
oder das Phosphoprotein-Oberflächenantigen an Lymphozyten, CD20,
oder den Epidermal Growth Factor (EGF)-Rezeptor erkennen.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper
aus den Antikörperpräparationen Herceptin oder Panorex oder MabThera
oder IMC-C225 ausgewählt werden.
9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß die Expression der Mimotope oder der Mimotop
konjugate unter Verwendung eines pflanzlichen Expressionssystem erfolgt.
10. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß die Expression der Mimotope oder der Mimotop
konjugate mittels transienter Infektion des pflanzlichen Expressions
systems durch Tabakmosaikviren erfolgt.
11. Vakzine gegen Krebserkrankungen, dadurch gekennzeichnet, daß sie nach
einem Verfahren gemäß einem der vorstehenden Anprüche herstellbar ist.
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