DE69936784T2

DE69936784T2 - Behandlung von gebärmutterhalskrebs

Info

Publication number: DE69936784T2
Application number: DE69936784T
Authority: DE
Inventors: Diane M. Toronto GAJEWCZYK; Roy North York PERSSON; Fei-Long North York YAO; Shi-Xian Etobicoke CAO; Michel H. Willowdale Klein; James Schenectady TARTAGLIA; Phillipe Moingeon; Benjamin Thornhill ROVINSKI
Original assignee: Sanofi Pasteur Ltd
Current assignee: Sanofi Pasteur Ltd
Priority date: 1998-09-04
Filing date: 1999-09-03
Publication date: 2008-04-30
Anticipated expiration: 2019-09-04
Also published as: CA2342289C; WO2000014244A2; EP1108035A2; EP1728865A1; PT1108035E; SI1108035T1; NZ510488A; DK1108035T3; JP4205572B2; WO2000014244A3; JP2004121263A; JP2002524078A; AU5611899A; AU766403B2; EP1108035B1; AU766403C; CY1107762T1; DE69936784D1; ATE369428T1; CA2342289A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung behandelt Vektoren und immunogene Zusammensetzungen wie in den Patentansprüchen bestimmt. Diese Vektoren und immunogenen Zusammensetzungen sind nützlich bei der Immuntherapie von Krebs, besonders bei Gebärmutterhalskrebs.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebärmutterhalskrebs ist der zweithäufigste Grund für krebsbedingte Todesfälle bei Frauen weltweit. Es gibt sowohl epidemiologische als auch experimentelle Daten, welche die Ätiologie von Gebärmutterhalskrebs mit einer Infektion mit humanem Papilloma-Virus (HPV) der Typen 16 und 18 in Verbindung bringen. Der HPV-Virus ist prävalent bei 35 bis 40% der jungen Frauen vorhanden. Obwohl die Behandlung des Frühstadiums der Erkrankung relativ erfolgreich ist, wird bei 15% der Patientinnen eine rezidive Erkrankung festgestellt. Der Ausgang bei den Patientinnen mit rezidiver Erkrankung ist relativ schlecht. Somit besteht ein Bedarf für einen neuen therapeutischen Ansatz (Ref. 1, 2, 3 – verschiedene Referenzen sind in Klammem genannt, um den Stand der Technik, zu der diese Erfindung gehört, vollständiger zu beschreiben. Die gesamte bibliograpische Information zu jedem Zitat ist am Ende der Patentschrift, unmittelbar vor den Patentansprüchen zu finden. Die Offenbarung dieser Referenzen ist hiermit durch den Bezug darauf in die vorliegende Offenbarung einbezogen).
Die starke Assoziation von HPV-Infektion und Gebärmutterhalskrebs suggeriert, dass eine virale Antigen-spezifische immuntherapeutische Vorgehensweise eine mögliche Strategie bei der Behandlung von Gebärmutterhalskrebs sein kann. Das Ziel der spezifischen Immuntherapie ist es, die Immunantwort einer Tumor-tragenden Patientin zu stimulieren, um Tumorläsionen anzugreifen und auszurotten. Diese Strategie wurde durch die Identifikation von Tumor-assoziierten Antigenen (TAA) möglich gemacht. Die starke Assoziation zwischen einer HPV-16-Infektion und Gebärmutterhalskrebs hat diese Erkrankung zu einem guten Kandidaten für eine immuntherapeutische Intervention (Ref. 4) gemacht.
Bei HPV-DNA-positiven Gebärmutterhalskrebserkrankungen werden die onkogenen E6- und E7-Proteine exprimiert. Ein experimenteller Nachweis suggeriert, dass diese zwei Proteine für die karzinogene Entwicklung von Gebärmutterhalskrebserkrankungen verantwortlich sind, da ihre Expression zu einem transformierten und immortalisierten Zustand in humanen Epithelzell kulturen führt (Ref. 5). Dafür sind diese zwei Proteine potentielle Kandidaten für eine antigenspezifische Immuntherapie bei HPV-induzierten Gebärmutterhalskrebserkrankungen und werden hierin evaluiert.
Obwohl noch viele Fragen hinsichtlich der Natur der Immunität gegenüber einer natürlichen HPV-Infektion vorhanden sind, und, im Gegenzug hinsichtlich Gebärmutterhalskrebs, ist es einleuchtend, dass es eine Immunkomponente gibt, da immunsupprimierte Individuen ein größeres Risiko besitzen, einen bösartigen Gebärmutterhalstumor zu entwickeln (Ref. 6). Des Weiteren ist diese Immunität höchstwahrscheinlich durch den zellulären Zweig der Immunantwort vermittelt. Umfangreiche zelluläre Infiltrate werden bei einer Untersuchung der spontanen Regressionen von Gebärmutterhalstumoren (Ref. 7) beobachtet. Demnach scheint eine Antigen-spezifische zelluläre Antwort erforderlich zu sein, um Gebärmutterhalskrebspatientinnen zu behandeln.
Obwohl die Natur des Resultats einer immuntherapeutischen Strategie identifiziert wurde, ist die Fähigkeit diesen Antworttyp zu induzieren, unter Anwendung der derzeitigen Impfstofftechnologie, begrenzt. Die prophylaktische Impfstoffentwicklung für HPV hat sich auf die Herstellung rekombinanter Untereinheiten, die aus strukturellen L1- und L2-Virion-Proteinen bestehen, konzentriert. In eukaryotischen Zellen organisiert sich L1 (Hauptcapsidprotein) selbst zu Papillomavirus-ähnlichen Partikeln (VLPs) (Ref. 17). Obwohl L1 allein für den Zusammenbau der VLPs ausreicht, gewährleistet die Coexpression von L2 (Nebencapsidprotein) eine größere Capsidherstellung (Ref. 18). Im Gegensatz dazu wurde die therapeutische Impfstoffentwicklung typischerweise auf die Expression des E6- und/oder E7-Protein-Wildtyps gerichtet. Die eingesetzten Expressionsvektoren schließen den Vacciniavirus (zum Beispiel wie in dem US-Patent Nr. 5 744 133 beschrieben (Ref. 19, 20), den Alphavirus (zum Beispiel in dem US-Patent Nr. 5 843 723 beschrieben) oder andere Poxviren (zum Beispiel US-Patent Nr. 5 676 950 ) ein. Daher wurde ein DNA-Vektor, der die HPV-Antigene kodiert, welche in die karzinogene Entwicklung der Erkrankung impliziert sind, als das optimale Verfahren, durch das eine erfolgreiche immuntherapeutische Strategie erreicht werden könnte, ermittelt.
Dennoch, wie vorausgehend angemerkt, sind die E6- und E7-HPV-Antigene mutmaßlich onkogen, und demnach könnte eine Immunisierung mit einem DNA-Konstrukt, das ein beliebiges oder beide dieser Proteine kodiert, in der Induktion von weiteren bösartigen Tumoren resultieren (Ref. 5, 10, 11). Demnach wurde, um die Toxizitätrisiken zu minimieren, ein genetisch entgiftetes E7-Molekül hierin in einem DNA-Konstrukt kodiert. Dieses entgiftete Molekül wird durch die Deletion der Retinoblastom(Rb)-Bindungsregion (Ref. 8, 9) modifiziert. Ein weiteres Verfahren zum Erreichen einer antigenspezifischen Immunität, ohne die begleitenden Risiken der onkogenen Transformation, ist die Verwendung einer Epitopstrategie, bei der nur Schlüsselteile des Moleküls verabreicht werden, um eine spezifische Immunantwort zu induzieren (Ref. 12-16). Dieser Ansatz wird hierin (nur für Erläuterungszwecke; d.h. nicht für die Erfindung, wie sie in den Patentansprüchen dargelegt ist) in dem Entwurf des DNA-Polyepitopkonstruktes, bei dem eine Anzahl von T-Zellen-Epitopen, die sowohl von E6 als auch von E7 abgeleitet sind, verknüpft sind, beschrieben. Ein Vergleich dieser beiden Ansätze wurde hierin in einem Mausmodell von HPV-assoziiertem Gebärmutterhalskrebs durchgeführt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der Erfindung ist ein Vektor vorgesehen, der ein Nukleinsäuremolekül umfasst, das ein HPV-16-E7-Antigen umfasst, dem die Aminosäuren 21 bis 26 fehlen, wobei das Nukleinsäuremolekül operativ mit einem Cytomegalovirus-Promotor verknüpft ist. In einer Ausführungsform ist das Nukleinsäuremolekül innerhalb des Plasmid CMV-3, wie in der 2 zu sehen, enthalten. In einer weiteren Ausführungsform ist der Vektor pCMV-dE7, wie in der 1 zu sehen. Die Vektoren der Erfindung können zur Verabreichung an einen Wirt verwendet werden, um eine Immunantwort in dem Wirt vorzusehen, z.B. für die Immuntherapie von einem HPV-bedingten Tumor, insbesondere bei Gebärmutterhalskrebs.
Das für die Vektoren der vorliegenden Erfindung ausgewählte Antigen ist das E7-Antigen, von dem vorher gezeigt wurde, dass es eine Schutzfähigkeit in einem Vaccinia-System besitzt.
Potentielle Toxizitätsbedenken existieren bei der Verwendung einer nativen Form von E7 in einem Impfstoff infolge seiner Fähigkeit, an das Rb-Protein zu binden und demnach einen onkogenen Status zu fördern. Eine neue entgiftete Version von E7 wurde hierin durch die Deletion der Rb-Bindungsstelle konstruiert und in pCMV3 (2) eingebracht, um den Vektor pCMV-dE7 (1) für die Immunisierung bereitzustellen.
Die entgiftete E7-Kodiersequenz wurde aus der unmodifizierten Kodiersequenz durch Ersetzen von etwa 210 Bp durch DNA, die aus reassoziierten Oligos gebildet wurde, hergestellt. Die substituierte Sequenz spart eine Strecke von 18 Nukleotiden, welche die Region von E7 kodieren, aus, welche in die Komplexbildung mit der Familie der Proteine des zellulären Retinoblastoms (Rb) involviert ist, und zwar die Aminosäuren 21 bis 26 von dem nativen E7-Protein.
Die Immunisierung mit dem pCMV-dE7-Konstrukt resultierte in einem signifikanten Schutz vor Tumorauswuchs nach dem Einpflanzen bzw. Anwachsen von lebenden C3-Tumorzellen, die das Wildtyp E7-Molekül exprimieren, was zeigt, dass das E7-DNA-Konstrukt erfolgreich verwendet werden kann, um Schutzimmunität ohne irgendwelche assoziierten Toxozitätsrisiken zu stimulieren.
Um den T-Zellansatz (welcher hierin nur zu Erläuterungszwecken beschrieben ist) wie oben) zu evaluieren, wurde ein synthetisches Minigen hergestellt, welches Nukleotidsequenzen umfasst, die T-Zellepitope sowohl von E6- als auch von E7-Proteinen von HPV-16 (5A) kodieren. Ein DNA-Konstrukt (pCMV3-HPVT#1), welches das Mini-Gen (6) enthielt, wurde ver wendet, um Mäuse zu immunisieren. Die mit dem DNA-Konstrukt von der 6 immunisierten Mäuse waren zu 100% vor Tumorauswuchs geschützt.
Die Ergebnisse von diesen Studien zeigen an, dass eine DNA-Immunisierung erfolgreich verwendet werden kann, um vor einer Belastung mit lebendem C3-Tumor zu schützen und demnach effektiv bei der klinischen Behandlung von Gebärmutterhalskrebs sein kann.
Die Vektoren der vorliegenden Erfindung beinhalten einen Cytomegalovirus-Promotor. Das Nukleinsäuremolekül kann innerhalb des Plasmids CMV-3 enthalten sein, welches den Immediate-Early-Cytomegaloviruspromotor, einschließlich der Enhancer- und Intronsequenzen, enthält, und zwar zusammen mit dem Rinderwachstumshormon-PolyA-Schwanz und einem Kanamycinresistenzgen. Die Elemente von pCMV-3 sind in der 2 gezeigt.
Das Nukleinsäuremolekül kodiert ein HPV-16-E7-Antigen, welches entgiftet ist, um eine onkogene Replikation in dem Wirt zu verhindern. Die Entgiftung wird durch Entfernung der Nukleinsäure, welche die Aminosäuren 21 bis 26 von HPV-16 kodiert, aus der nativen Nukleinsäuresequenz durchgeführt. Der Vektor, welcher solch ein Nukleinsäuremolekül enthält, kann die identifizierenden Charakteristika von pCMV3-dE7 besitzen, was die Restriktionskarte und die Konstruktionselemente wie in der 1 gezeigt, einschließt.
Die vorliegende Erfindung sieht in einem weiteren Aspekt eine immunogene Zusammensetzung für die in vivo-Verabreichung an einen Wirt vor, welche einen Vektor, wie oben beschrieben umfasst, welcher einen pharmazeutisch akzeptablen Träger dafür einschließen kann. Die vorliegende Erfindung sieht in einem weiteren Aspekt einen Vektor, wie oben beschrieben, für die Verwendung als ein Medikament vor.
In einem noch weiteren Aspekt der Erfindung ist die Verwendung eines Vektors, wie oben beschrieben, für die Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von Gebärmutterhalskrebs vorgesehen.
Die Vektoren der vorliegenden Erfindung können für die Immunisierung eines Wirtes gegen Gebärmutterhalskrebs, der durch humanen Papilloma-Virus (HPV) verursacht wurde, verwendet werden. Die Vektoren können an den Wirt in einer effektiven Menge verabreicht werden in der Form der immunogenen Zusammensetzung der Erfindung.
KURZBESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
Die 1A ist eine Karte eines pCMV-dE7-Plasmids, welches ein pCMV-3-Plasmid mit entgiftetem E7 von HPV-16 umfasst, das darin eingebracht wurde;
Die 1B zeigt die Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr.: 1) des PCR-amplifizierten dE7 von HPV-16 (pSE859.2). Die 5'- und 3'-PCR-Primer (SEQ ID Nr.: 2, 3) sind in dieser Figur durch Kästchen angegeben;
Die 2 ist eine Karte des Plasmidvektors pCMV3, der den Immediate-Early-CMV-Promotor enthält, einschließlich Enhancer- und Intronsequenzen, Rinderwachstumshormon-PolyA(BGH PA) und Kanamycinresistenz (KN(R));
Die 3 zeigt den Aufbau des Plasmidvektors pCMV3 aus pCMVK2K;
Die 4 ist eine Karte des Plasmidvektors pEN-1;
Die 5A zeigt das Nukleotid (SEQ ID Nr.: 4, Volllänge; SEQ ID Nr.: 5, Kodiersequenz) und die abgeleitete Aminosequenz (SEQ ID Nr.: 6) für ein synthetisches HPV-Minigen, das ein Protein kodiert, welches aus fünf HPV-16 T-Zellepitopen (vom NH₂- bis zum COOH-Terminus) E7: 49 bis 57, 11 bis 20, 82 bis 90, 86 bis 93, und E6: 29 bis 38 besteht. Drei Alanine wurden als Spacer zwischen jedem der Epitope eingeführt;
Die 5B zeigt den Aufbau synthetischer Oligonukleotide, die HPV-16-Epitope von E6 und E7 enthalten, um das Minigen der 5A zu bilden. Die fünf individuellen Oligonukleotide werden von I bis V bezeichnet (SEQ ID Nr.: 7, 8, 9, 10, 11). Die Epitope von E6 und E7 werden oberhalb der spezifischen Sequenzen angegeben, und die Zahlen entsprechen der Aminosäuresequenz der Volllängen-E6- und E7-Proteine des HPV-16; und
Die 6 zeigt den Aufbau von pCMV3-HPVT#1 durch Inserieren des synthetischen Minigens, welches in 5A gezeigt ist, in den Polylinker zwischen den SalI und EcoRI-Stellen des pCMV3-Vektors von 3.
ALLGEMEINE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung sieht Vektoren und immunogene Zusammensetzungen wie oben beschrieben vor, welche für einen immuntherapeutischen Ansatz für Gebärmutterhalskrebs, welcher durch den humanen Papillomavirus (HPV) verursacht wird, basierend auf einer DNA-Immunisierung nützlich sind.
Eine Reihe an Experimenten wurde in dem C3-Gebärmutterhalskrebsmodellsystem durchgeführt. Unter Verwendung einer DNA-Zuführungs-Plattform wurde eine Anzahl von auf E7-Antigen basierenden Impfstoffen auf ihre Fähigkeit evaluiert, den Tumorauswuchs zu verhindern im Anschluß an eine Belastung mit lebenden Tumorzellen. Obwohl gezeigt wurde, dass das E7-Antigen einige schützende Fähigkeiten in einem Vaccinia-Vektorsystem besitzt, bestehen, wie oben erwähnt, potentielle Toxizitätsbedenken bei der Verwendung einer nativen Form von E7 in einem Impfstoff aufgrund seiner Fähigkeit an das Rb-Protein zu binden und demnach einen onkogenen Zustand zu fördern. Daher wurde ein DNA-Konstrukt, das eine „entgiftete" Version (dE7) des E7 von HPV-16 kodiert, konstruiert. Die Immunisierung mit dem dE7-DNA-Konstrukt (pCMV3-dE7, 1) resultierte in einem signifikanten Schutz vor Tumorauswuchs anschließend an das Einpflanzen lebender C3-Tumorzellen, die das Wildtyp-E7-Molekül exprimieren. Dieses Ergebnis zeigt an, dass das dE7-DNA-Konstrukt erfolgreich verwendet werden könnte, um schützende Immunität ohne jedwede assoziierten Toxizitätsrisiken zu stimulieren.
Ein Epitop-spezifischer Ansatz wurde ebenfalls evaluiert (wie oben diskutiert, rein zu Erläuterungszwecken; d.h. nicht für die Erfindung, wie sie in den Patentansprüchen definiert wurde). Ein DNA-Konstrukt, das aus T-Zellepitopen, die sowohl von den E6- als auch den E7-Proteinen von HPV-16 abgeleitet worden waren, zusammengesetzt war, wurde verwendet, um Mäuse (pCMV3-HPVT#1, 6) zu immunisieren. Auffällige Ergebnisse wurden in der Gruppe der Mäuse, die mit diesem Polyepitopkonstrukt immunisiert worden waren, insofern beobachtet, als ein 100%-iger Schutz vor Tumorauswachsen beobachtet wurde.
Es ist deutlich ersichtlich für einen Fachmann, dass die verschiedenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sowie der hierin beschriebene Epitop-spezifische Ansatz, viele Anwendungsmöglichkeiten auf den Gebieten der Impfstoffe, der Diagnose und der Behandlung von HPV-Infektionen besitzen. Eine weitere nicht-beschränkende Diskussion solcher Anwendungen ist weiter unten aufgezeigt.
Impfstoffherstellung und -anwendung
Immunogene Zusammensetzungen, die für die Verwendung als Impfstoffe geeignet sind, können aus den HPV-Genen, -Epitopen und -Vektoren, welche hierin offenbart werden, hergestellt werden. Der Impfstoff löst eine Immunantwort in einem Subjekt bzw. Lebewesen aus, um eine schützende oder therapeutische Anti-Tumor-Antwort zu induzieren. Immunogene Zusammensetzungen, einschließlich Impfstoffen, welche die Nukleinsäure enthalten, können als injizierbare, in physiologisch akzeptablen, flüssigen Lösungen oder Emulsionen für die Polynukleotidverabreichung hergestellt werden. Die Nukleinsäuren in akzeptablen Flüssigkeiten können als direkte Immunisierungswirkstoffe (zum Beispiel, wie allgemein in dem US-Patent Nr. 5 589 466 beschrieben) verwendet werden. Alternativ kann die Nukleinsäure mit Liposomen, wie Lecithinliposomen oder anderen im Fachbereich bekannten Liposomen, wie einem Nukleinsäureliposom (zum Beispiel wie in WO 93/24640 , Ref. 21 beschrieben) assoziiert sein, oder die Nukleinsäure kann mit einem Adjuvans, wie im Detail weiter unten beschrieben, assoziiert sein. Liposomen, die kationische Lipide umfassen, interagieren spontan und schnell mit Polyanionen wie DNA und RNA, was in Liposom/Nukleinsäurekomplexen resultiert, welche bis zu 100% des Polynukleotids einschließen. Zusätzlich fusionieren die polykationischen Komplexe mit Zellmemb ranen, was in einer intrazellulären Zuführung des Polynukleotids resultiert, welche die degenerativen Enzyme des lysosomalen Kompartiments umgeht. Die veröffentlichte PCT-Anmeldung WO 94/27435 beschreibt Zusammensetzungen für die genetische Immunisierung, welche kationische Lipide und Polynukleotide umfasst. Agentien, welche bei der zellulären Aufnahme der Nukleinsäure mitwirken, wie Calciumionen, virale Proteine und andere die Transfektion fördernde Agentien, können vorteilhafterweise verwendet werden.
Immunogene Polynukleotid-Zusammensetzungen können auch als Mikrokapseln, einschließlich biologisch abbaubarer Teilchen mit zeitlich gesteuerter Abgabe formuliert werden. Somit beschreibt das US-Patent 5 151 264 einen partikulären Träger mit einer Phospholipid/Glykolipid/Polysaccharid-Natur, der als Bio Vecteurs Supra Moléculaires (BVSM) bezeichnet wird. Die partikulären Träger sind vorgesehen, eine Auswahl von Molekülen, die eine biologische Aktivität besitzen, in einer der Schichten davon zu transportieren.
Das US-Patent Nr. 5 075 109 beschreibt die Einkapselung der Antigene: trinitrophenyliertes Schlüsselloch-Napfschnecken-Hemocyanin und Staphylococcen-Enterotoxin B in Poly(DL-Lactideco-Glykolid im Verhältnis 50:50. Andere Polymere für die Einkapselung sind empfohlen, wie Poly(glykolid), Poly(DL-Lactid-co-glykolid), Copolyoxalate, Polycaprolakton, Poly(laktid-co-Caprolakton), Poly(esteramide), Polyorthoester und Poly(8-Hydroxybuttersäure) und Polyanhydride.
Die veröffentlichte PCT-Anmeldung WO 91/06282 beschreibt ein Zuführungsvehikel, welches eine Vielfalt an biohaftfähigen Mikrokügelchen und Antigenen umfasst. Die Mikrokügelchen bestehen aus Stärke, Gelatine, Dextran, Kollagen oder Albumin. Dieses Zuführungsvehikel ist insbesondere für die Aufnahme von Impfstoff über die Nasenschleimhaut vorgesehen. Das Zuführungsvehikel kann zusätzlich einen Absorptionsenhancer enthalten.
Die Vektoren können mit pharmazeutisch akzeptablen Exzipientien gemischt werden, welche damit kompatibel sind. Solche Exzipientien können Wasser, eine Salzlösung, Dextrose, Glycerol, Ethanol und Kombinationen davon einschließen. Die immunogenen Zusammensetzungen und Impfstoffe können weiter Hilfssubstanzen wie Feuchthaltemittel oder Emulgiermittel, pH-Puffermittel oder Adjuvantien, um die Effektivität davon zu fördern, enthalten.
Hierin vorgesehene immunogene Zusammensetzungen und Impfstoffe können parenteral, durch subkutane, intravenöse, intradermale oder intramuskuläre Injektion verabreicht werden, möglicherweise im Anschluß an eine Vorbehandlung der Injektionsstelle mit einem lokalen Anästhesiemittel. Alternativ können die immunogenen Zusammensetzungen, die gemäß der vorliegenden Erfindung formuliert wurden, in einer Weise formuliert und abgegeben werden, um eine Immunantwort auf Schleimhautoberflächen hervorzurufen. Demnach kann die immunogene Zusammensetzung auf Schleimhautoberflächen z.B. durch die nasalen oder oralen (intragastrischen) Wege verabreicht werden. Alternativ sind andere Verabreichungsarten, einschließlich Zäpfchen und orale Formulierungen erstrebenswert. Bei Zäpfchen können Bindemittel und Träger zum Beispiel Polyalkenglykole oder Triglyceride einschließen. Orale Formulierungen können normal eingesetzte Inzipienten, wie zum Beispiel pharmazeutische Grade von Saccharin, Zellulose und Magnesiumcarbonat einschließen.
Die immunogenen Herstellungen und Impfstoffe können in einer Weise verabreicht werden, die kompatibel mit der Dosierungsformulierung ist, und in einer solchen Menge, die therapeutisch effektiv, schützend und immunogen sein wird. Die zu verabreichende Menge hängt von dem zu behandelnden Subjekt ab, einschließlich, zum Beispiel, der Kapazität des Immunsystems des Individuums zur Synthese der mit dem Tumor assoziierten Antigene und Antikörper dagegen und, falls notwendig, zur Herbeiführung einer zellvermittelten Immunantwort. Die genauen Mengen an zur Verabreichung benötigtem aktivem Wirkstoff hängen von der Beurteilung des Arztes ab. Allerdings sind die geeigneten Dosierungsspannen einfach von einem Fachmann zu bestimmen und können größenordnungsmäßig von etwa 1 μg bis etwa 1 mg des Vektors betragen. Geeignete Formen für die Anfangsverabreichung und Dosierungen der Boosterungen bzw. Wiederholungsimpfungen sind auch variabel, sollten jedoch eine anfängliche Verabreichung, gefolgt von anschließenden Verabreichungen einschließen. Die Dosierung kann auch von dem Verabreichungsweg abhängen und wird gemäß der Wirtsgröße variieren.
Die Immunogenität kann signifikant verbessert werden, wenn die Vektoren zusammen mit Adjuvantien, üblicherweise verwendet als eine 0,05%-ige bis 0,1%-ige Lösung in phosphatgepufferte Kochsalzlösung, verabreicht werden. Adjuvantien erhöhen die Immunogenität eines Antigens, sind aber nicht unbedingt selbst immunogen. Adjuvantien können agieren, indem sie das Antigen lokal nahe der Verabreichungsstelle zurückhalten, um einen Depoteffekt zu erzeugen, welcher eine langsame, lang anhaltende Abgabe von Antigen an die Zellen des Immunsystems ermöglicht. Adjuvantien können auch Zellen des Immunsystems zu einem Antigendepot anlocken und solche Zellen zur Auslösung einer Immunantwort stimulieren.
Immunstimulierende Wirkstoffe oder Adjuvantien wurden viele Jahre lang verwendet, um die Immunantworten des Wirtes auf, zum Beispiel, Impfstoffe zu verbessern. Demnach wurden Adjuvantien identifiziert, welche die Immunantwort auf Antigene fördern. Einige dieser Adjuvantien sind allerdings toxisch, und können unerwünschte Nebenwirkungen verursachen, was sie ungeeignet für die Verwendung in Menschen und in vielen Tieren macht. Tatsächlich werden nur Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat (gemeinsam üblicherweise als Alaun bezeichnet) routinemäßig als Adjuvantien in Human- und Veterinär-Impfstoffen verwendet.
Eine große Spanne an extrinsischen Adjuvantien und anderem immunmodulierendem Material kann starke Immunantworten auf Antigene hervorrufen. Dies schließt Saponine, die an Membranprotein-Antigene komplexiert sind, um immunstimulierende Komplexe (ISCOMS) herzustel len, Pluronic-Polymere mit Mineralöl, abgetötete Mycobakterien in Mineralöl, Freundsches Komplettadjuvans, bakterielle Produkte, wie Muramyldipeptid (MDP) und Lipopolysaccharid (LPS), sowie Monophoryl Lipid A, QS 21 und Polyphosphazen ein.
Der Vektor kann in Verbindung mit einem Targetingmolekül abgegeben werden, um den Vektor gezielt auf ausgewählte Zellen, einschließlich Zellen des Immunsystems, auszurichten.
Das Polynukleotid kann durch eine Vielzahl an Vorgehensweisen in den Wirt gebracht werden, zum Beispiel offenbarten Tang et al. (Ref. 22), dass die Einführung von Gold-Mikroprojektilen, die mit DNA überzogen sind, welche das Rinderwachstumshormon (BGH) kodiert, in die Haut von Mäusen in der Herstellung von Anti-BGH-Antikörpern in den Mäusen resultiert, während Furth et al. (Ref. 23) zeigten, dass ein Jet- bzw. Hochdruck-Injektor verwendet werden konnte, um Haut, Muskel, Fett und Brustgewebe von lebenden Tieren zu transfizieren.
BEISPIELE
Die obige Offenbarung beschreibt die vorliegende Erfindung allgemein (und den T Zell-Epitop-Ansatz nur zu Erläuterungszwecken). Ein vollständigeres Verständnis kann unter Bezug auf die folgenden spezifischen Beispiele erhalten werden. Diese Beispiele sind lediglich zu Erläuterungszwecken beschrieben und zielen nicht darauf ab, den Umfang der Erfindung zu begrenzen. Veränderungen in der Form und Substitution von Äquivalenten werden in Betracht gezogen, wenn es die Umstände nahe legen oder zweckmäßig werden lassen. Obwohl spezifische Begriffe hierin angewandt werden, sind solche Begriffe in einem beschreibenden Sinn beabsichtigt und nicht für die Zwecke von Begrenzungen.
Über Verfahren der molekularen Genetik, Proteinbiochemie und Immunologie, welche in dieser Offenbarung und in diesen Beispielen verwendet aber nicht explizit beschrieben sind, wird in der wissenschaftlichen Literatur reichlich berichtet, und sie liegen innerhalb der Fähigkeiten der Fachleute im Fachgebiet.
Beispiel 1:
Dieses Beispiel beschreibt das hierin angewandte Immunisierungsprotokoll.
Weibliche C57Bl/6-Mäuse, welche 18 bis 20 Gramm wiegen, wurden von Charles River (St. Constant, Quebec, Kanada) erhalten. Die Mäuse wurden in Microisolatoren bzw. -Käfigen in Übereinstimmung mit den Richtlinien untergebracht, wie sie durch das „Canadian Council an Animal Care" (CCAC) erlassen wurden. Zehn Tiere waren in jeder Behandlungsgruppe eingeschlossen. Am Tag 0 wurden die Mäuse mit 100 μg von jedem einzelnen DNA-Konstrukt entweder über den intramuskulären Weg (i.m.), in den vorderen Tibialmuskel, oder den intraderma len Weg (i. d.) immunisiert. Die Immunisierungen wurden mit equivalenten Dosierungen von jedem Konstrukt an den Tagen 21 und 42 der Studie wiederholt. Serumproben wurden von Mäusen an den Tagen 20, 40 und 56 erhalten.
Beispiel 2:
Dieses Beispiel beschreibt das Protokoll für die Belastung mit Tumorzellen.
Zwei Wochen im Anschluß an die letzte Booster-Dosierung mit dem DNA-Konstrukt, wobei dem Verfahren von Beispiel 1 gefolgt wurde, wurde jede Maus subkutan (s.c.) in den Nacken injiziert, und zwar mit einer Dosierung von 5 × 10⁵ lebenden C3-Tumorzellen. Die C3-Tumorzelllinie wurde freundlicherweise von R. Offringa und C. Melief bereitgestellt. Die C3-Zelllinie wurde durch Transfizieren von B6-Mausembryozellen mit dem vollständigen Genom von HPV-16 hergestellt, wurde mit dem ras-Onkogen transformiert. Die Expression der onkogenen HPV 16-Proteine E6 und E7 werden benötigt, um den transformierten Zustand zu erhalten.
Nachdem die Injektionen verabreicht worden waren, wurden die Mäuse dreimal pro Woche für die Dauer der Studie untersucht. Tumormessungen wurden unter Verwendung von Vernier-Messschiebern durchgeführt. Das Volumen der Tumormasse wurde unter Verwendung der folgenden Formel berechnet: Volumen = ab²/2, wobei a = der größerer Durchmesser und b = der kleinere Messwert der zwei ist. Mäuse, die für einen Zeitraum von etwa drei Monaten anschließend an diese anfängliche Belastung mit lebenden Tumorzellen tumorfrei blieben, wurden dann am Tag 141 der Studie mit der gleichen Dosierung und über den gleichen Weg wie bei der Anfangsbelastung am Tag 57 oben beschrieben, erneut belastet. Anschließend an die erneute Belastung wurden die Mäuse auf das Auftreten von Tumorauswuchs, wie vorher beschrieben, überwacht.
Beispiel 3:
Dieses Beispiel beschreibt die E7- und dE7-spezifischen IgG-Immunoassays (EIA).
Nunc Maxisorp-Immunoassayplatten wurden über Nacht entweder mit rekombinantem E7- oder rekombinanten dE7-Antigen bei einer Konzentration von 10 μg/ml, verdünnt in 50 mM Carbonatpuffer pH 9,6 beschichtet. Am nächsten Tag wurden die Platten in PBS, das 0,05% Tween 20 (PBS-T) enthielt, gewaschen und dann mit einer 1%-igen Milchlösung während einer Stunde bei Raumtempratur blockiert. Anschließend an den Blockierungs-Schritt wurden die Platten in PBS-T gewaschen, und die Serumproben wurden in verschiedenen Verdünnungen den Platten zugefügt. Die Proben wurden auf den Platten über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Proben wurden am nächsten Tag mit PBS-T von den Platten gewaschen, und ein Peroxidase-markiertes Schaf-anti-Maus-IgG-Konjugat wurde bei einer Verdünnung von 1/25 000 zu jeder Mulde hinzugegeben.
Nach einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Platten in PBS-T gewaschen und die colorimetrische Reaktion wurde unter Verwendung eines TMB-Substrates (ADI) entwickelt. Die Reaktionen wurden bei 450 nm in einem Dynatech MR 5000 96-Mulden-Plattenlesegerät abgelesen.
Beispiel 4:
Diese Beispiele beschreiben die Konstruktion des pCMV-dE7.
Das Plasmid pCMV3 enthält Segmente von unterschiedlichen Quellen, und die Elemente der Konstruktion sind in der 2 dargestellt. Kurz gesagt ist der prokaryotische Vektor pBluescript SK (Stratagen) das Rückgrat von pCMV3, und er wurde durch das Ersetzen des Amp^R-Gens durch ein Kan^R-Gen und die Deletion der f1- und der LacZ-Region modifiziert. Diese Modifizierungen wurden durch Deletion der Sequenzen zwischen den Restriktionsstellen AhdI (Nukleotid 2041) und SacI (Nukleotid 759) auf pBluescript SK, welcher die Amp^R-, f1-Ursprungs- und die LacZ-Sequenzen enthält, erreicht. Ein 1,2 kb PstI-Fragment von dem Plasmid pUC-4K (Pharmacia), welches das Kan^R-Gen enthielt, wurde glattendig an die AhdI-Stelle des modifizierten pBluescript SK-Plasmids in einer Orientierung gegen den Uhrzeigersinn relativ zu seiner Transkription ligiert. Ein 1,6 kb SspI/PstI-Fragment, welches den Immediate-Early-Genpromotor, Enhancer und Intron-A-Sequenzen des humanen Cytomegalovirus enthielt (bezeichnet mit CMV in der 2), wurde an das andere Ende des Kan^R-Gens ligiert, so dass die Transkription von dem CMV-Promotor in einer Orientierung im Uhrzeigersinn fortschreitet. Dieses Verfahren stellte das Plasmid pCMV2K her, wie in der 3 gezeigt.
Ein 0,2 kb-Fragment, welches die Rinderwachstumshormon(BGH)-Polyadenylierungs-Signal-Sequenz enthält, wurde von dem Plasmid pEN-3 durch Xba I-Restriktion entfernt, gefolgt von einer Klenow-Behandlung, um ein glattes Ende herzustellen und dann einer Bam-HI-Restriktion. Das 192 Bp-Fragment, welches das BGHpA-Fragment enthielt, wurde durch eine Agarosegel-Elektrophorese isoliert. Das Plasmid pEN-3 wurde durch das Klonieren von bGHpA in pEN-1 (4) hergestellt.
Das Plasmid pCMV2K wurde dann mit BglII restringiert, mit Klenow behandelt und mit BAM HI restringiert. Das 4,2 kb-Fragment (siehe 3) wurde dann isoliert und an das vorher isolierte 192 Bp BGHpA-Fragment ligiert, um das Plasmid pCMV3 herzustellen.
Das dE7-Gen wurde dann PCR-amplifiziert, ausgehend von dem Plasmid pSE859.2 unter Verwendung von Primern, die eine PSTI-Stelle am 5'-Ende (SEQ ID Nr.: 2-CTGCAGCAGGCTAGCATGCATGGAGATACACCT) und eine SalI-Stelle am 3'-Ende (SEQ ID Nr.: 12-GTCGACTTATGGTTTCTGAGAACAGATGGGGCACA) einführen. Die amplifizierte Sequenz ist in der 1B gezeigt und enthält entgiftetes E7-Protein von HPV-16. Das PCR- Fragment wurde in pCR2.1, welches mit PstI und SalI (Invitrogen) restringiert wurde, inseriert und das Insert wurde sequenziert (1B). Das PstI- bis SalI-Fragment wurde dann in pCMV3 von PstI bis SalI subkloniert, um das Plasmid pCMV-dE7, wie in der 1A gezeigt, herzustellen.
Beispiel 5:
Dieses Beispiel veranschaulicht die Verwendung von pCMV-dE7, um Tiere vor einem Tumorauswuchs, der nach einer Einpflanzung einer Tumorzelllinie, die den HPV-16 E7-Wildtyp exprimiert, folgt, zu schützen.
Die Mäuse wurden entweder mit einem DNA-Konstrukt, welches das entgiftete E7-Protein (pCMV-dE7, hergestellt wie in Beispiel 4 beschrieben; 1) kodiert, einer DNA-Kontrolle (pCMV-3; 2) oder mit PBS über den intramuskulären Weg, dem Protokoll von Beispiel 1 folgend, immunisiert. Nach drei aufeinander folgenden Immunisierungen wurden lebende C3-Tumorzellen, die das Wildtyp-E7-Protein exprimieren, in einer Dosierung von 5 × 10⁵ Zellen, dem Protokoll von Beispiel 2 folgend, eingepflanzt. Die Anzahl der tumorfreien Mäuse im Anschluß an die Belastung mit lebenden Zellen ist in der unten stehenden Tabelle 1 gezeigt.
Etwa einen Monat nach der Belastung (Tag 30) hatten alle Mäuse in den Kontrollgruppen (pCMV-3-Kontroll- und PBS-Gruppen) palpable bzw. ertastbare Tumore. Im Gegensatz dazu allerdings wies keine der Mäuse in der mit pCMV-dE7 immunisierten Gruppe ertastbare Tumore auf. Am Tag 60 wies eine Maus der mit pCMV-dE7 immunisierten Gruppe, welche vorher Tumor-negativ war, das Erstanzeichen eines ertastbaren Tumors auf. Am Tag 90 wurde diese Maus aufgrund des großen Tumorvolumens eingeschläfert. Die übrigen Mäuse der mit pCMV-dE7 immunisierten Gruppe jedoch blieben tumorfrei. Demnach wurde ein signifikanter Unterschied im tumorfreien Status zwischen den Mäusen in der dE7-immunisierten Gruppe und den Kontrollgruppen beobachtet. Die Ergebnisse zeigen demnach an, dass die Immunisierung mit einem DNA-Konstrukt, welches ein genetisch entgiftetes E7-Molekül (dE7) kodiert, eine Immunantwort hervorruft, die in der Lage ist, das Tier gegen nachfolgendes Anwachsen von lebenden Tumorzellen zu schützen. Tabelle 1 Prozentsatz tumorfreier Mäuse zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem Einpflanzen von lebenden C3-Tumorzellen

Tag 30 nach der Belastung Tag 60 nach der Belastung Tag 90 nach der Belastung

CMV-dE7 100 90 90

CMV-3 Kontrolle 0 0 0

PBS 0 0 0
Beispiel 6:
Dieses Beispiel veranschaulicht, dass Seren, die von Mäusen, welche mit dem pCMV-dE7-Konstrukt immunisiert worden waren, abgeleitet wurden, sowohl mit dem rekombinanten entgifteten E7- als auch dem rekombinanten E7-Wildtyp-Protein, reagieren.
Um einen serologischen Nachweis bereitzustellen, dass Mäuse, die mit dem genetisch entgifteten E7-Protein gemäß Beispiel 5 immunisiert wurden, Immunität erzeugen konnten, die kreuzreaktiv mit dem E7-Wildtypprotein war, wurden Seren von immunisierten Mäusen mittels EIA analysiert in Anlehnung an das Verfahren von Beispiel 3. Die überprüfte Serumprobe wurde von einer Blutprobe abgeleitet, die am Tag 56, einen Tag vor der Belastung mit lebenden Tumorzellen und zwei Wochen in Anschluß an die letzte Booster-Immunisierung genommen wurde.
Der Titer des Serums an reaktivem Antikörper, wie in der unten stehenden Tabelle 2 zu sehen, war equivalent, unabhängig davon, ob es anhand eines dE7-spezifischen EIAs oder einem E7-spezifischen EIAs untersucht wurde. Demnach waren, auf der Stufe des dem Antikörperspiegels, die durch die Immunisierung mit dE7 erzeugten Antikörper kreuzreaktiv mit dem E7-Protein. Tabelle 2
Beispiel 7:
Diese Beispiel veranschaulicht, dass der spezifische Immunisierungsweg einen signifikanten Effekt auf die Induktion von Schutzimmunität besitzt.
Der Effekt des intramuskulären (i.m.) Weges im Vergleich zum intradermalen (i.d.) Weg der DNA-Immunisierung für die Induktion von Antitumor-Immunität wurde erforscht. Kurz gesagt wurden beide Mäusegruppen mit dem selben Konstrukt (pCMV-dE7, hergestellt wie in Beispiel 4 beschrieben; 1) mit Dosierungen und Frequenzen wie oben in Beispiel 1 beschrieben, immunisiert. Allerdings wurde eine Gruppe über den i.m.-Weg immunisiert, während die andere Gruppe über den i.d.-Weg immunisiert wurde. In Anlehnung an die Belastung mit lebenden C3-Tumorzellen in Anlehnung an das Verfahren in Beispiel 2, zeigte die Gruppe, welche so wie die i.d.-Gruppe immunisiert wurde, Tumorauswuchs, in direktem Gegensatz zu der Gruppe, welche über den i.m.-Weg immunisiert wurde, welche tumorfrei blieb. Demnach wurde ermittelt, dass die DNA-Impfung mit dem dE7-DNA-Konstrukt nur dann Schutzimmunität gegen eine Belastung mit Tumorzellen auslöste, wenn die Immunisierung über den i.m. Weg erfolgte. Die Ergebnisse werden in der nachstehenden Tabelle 3 dargelegt: Tabelle 3 Prozentsatz tumorfreier Mäuse nach dem Einpflanzen lebender C3-Tumorzellen

Tag 30 nach der Belastung Tag 60 nach der Belastung Tag 90 nach der Belastung

CMV-dE7 i.m. 100 90 90

CMV-dE7 i.d. 0 0 0
Beispiel 8 (nur zu Erläuterungszwecken):
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung des Plasmids pCMV3-HPVT#1.
Das synthetische Minigen, das die fünf T-Zellepitope der HPV-16 E6- und -E7-Proteine kodiert (5A), wurde durch Oligonukleotidsynthese unter Verwendung eines Applied Biosystem 3AB DNA-Synthesizers konstruiert. Das synthetische Mini-Gen, zusammengesetzt unter Verwendung von fünf synthetischen Oligonukleotiden (I bis V, 5B), enthielt eine SalI-Restriktionsstelle am 5'-Ende und eine EcoRI-Stelle am 3'-Ende. Dieses zusammengesetzte Gen (5) wurde in das SalI/EcoRI-restringierte Plasmid pCMV3 kloniert, um ein Plasmid pCMV3-HPVT#1, wie in der 6 gezeigt, herzustellen. Die Konstruktion von pCMV3 ist in Beispiel 3 beschrieben, und die Elemente sind in der 2 gezeigt.
Beispiel 9 (nur zu Erläuterungszwecken):
Dieses Beispiel veranschaulicht die Verwendung von pCMV3-HPVT#1, um schützende Antitumor-Immunität zu induzieren.
C57Bl/6-Mäuse wurden entweder mit einem DNA-Konstrukt, welches multiple Epitope der E6- und E7-Proteine von HPV-16 kodiert (pCMV-HPVT#1, hergestellt wie in Beispiel 8 beschrieben; 6) oder mit Kontrollen (pCMV-3 Vektor allein, 2, oder PBS), immunisiert, in Anlehnung an das Protokoll von Beispiel 1. Eine prophylaktische Immunisierung mit dem DNA-Polyepitopkonstrukt in Anlehnung an das Protokoll von Beispiel 2 induzierte schützende Anti tumor-Immunität bei 100% der belasteten Mäuse. Im Gegensatz dazu waren in den Kontrollgruppen keine Mäuse tumorfrei. Die Ergebnisse werden in der nachstehenden Tabelle 4 dargelegt. Tabelle 4: Prozentsatz tumorfreier Mäuse nach dem Einpflanzen lebender C3-Tumorzellen

Tag 30 nach der Belastung Tag 60 nach der Belastung Tag 90 nach der Belastung

pCMV-Polyepitop 100 100 100

pCMV-3-Kontrolle 0 0 0

PBS 0 0 0
Beispiel 10:
Dieses Beispiel veranschaulicht den Effekt einer zweiten Wiederholungsbelastung mit lebenden C3-Tumorzellen in drei Monate nach der Erstbelastung mit lebenden Tumorzellen tumorfreien Mäusen.
Um zu bestimmen, ob die schützende Antitumor-Immunität, die entweder durch das pCMV-dE7-Konstrukt, das wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt wurde (1), wie in Beispiel 7 zu sehen, oder durch das pCMV-Polyepitopkonstrukt, hergestellt, wie in Beispiel 8 (6) beschrieben, wie in Beispiel 9 zu sehen, induziert war, lang andauernd war, wurden Mäusen, welche die Erstbelastung mit Tumorzellen überlebten und für einen Zeitraum von drei Monaten tumorfrei blieben, erneut lebende C3-Tumorzellen eingepflanzt. Die Mäuse wurden dann nach Hinweisen auf eine Tumorentwicklung beobachtet.
Wie in der unten stehenden Tabelle 5 dargestellt, entwickelte ein Tier der pCMV-dE7-Gruppe einen Tumor nachstehend an diese zweite Belastungsdosierung. Allerdings blieben alle Mäuse in der mit DNA-Polyepitop immunisierten Gruppe tumorfrei. Demnach scheint der höchste Schutzspiegel vor einer Tumorzellenbelastung in der Polyepitop-immunisierten Gruppe zu sein. Tabelle 5 Prozentsatz tumorfreier Mäuse nach dem zweiten Einpflanzen von lebenden C3-Tumorzellen

Tag 30 nach der zweiten Tumorzellenbelastung Tag 60 nach der zweiten Tumorzellenbelastung

PCMV-dE7 i.m. 80 80

PCMV-Polyepitop i.m. 100 100
REFERENZEN

1. Pisani P. et al., Estimates of the worldwide mortality from eighteen major cancera in 1985. Implications for prevention and projections of future burden, Int. J. Cancer 1993: 55: 891-903.
2. Piver M. S., Hadbook of gynecologic oncology. Boston: Little, Brown, 1996.
3. Kurman R. J. et al., Interim guidelinses for management of abnormal cervical cytology. The 1992 National Cancer Institute Workshop, IAMA 1994-271: 1866-9.
4. Bosch FX, et al., Prevalance of human papillomavirus in cervical cancer – a worldwide perspective. International biological study on cervical cancer (IBSCC) Study Group [see comments], J. Natl. Cancer Inst. 1995: 87: 796-802.
5. Pecoraso G. et al., Differential effects of human papillomavirus type 6, 15 and 18 DNAs on immortalization and transformation of human cervical epithelial cells. Proc. Natl. Acad Sci. USA, 1989: 86: 563-7.
6. Shamanin V., et al., Specific types of human papillomavirus found in benign preliferations and carcinomas of the skin in immunosuppressed patients, Cancer Res. 1994: 54: 4610-3.
7. Hilders C. G., et al., Association between HLA-expression and infiltration of immune cells in cervical carcinoma [siehe Kommentare]. Lab. Invest. 1993: 69: 651-9.
8. Munger K., et al., Interactions of HPV E6 and E7 oncoproteins with tumour suppressor gene products. Cancer Surv. 1992: 12: 197-217.
9. Dyson N., et al. The human papilloma virus-16 E7 oncoprotein is able to bind to the retinoblastoma gene product. Science: 1989: 243: 934-7.
10. Munger K., et al. The E6 and E7 genes of the human papillomavirus type 16 together are necessary and sufficient for transformation of primary human keratinocytes. J. Virol 1989: 63: 4417-21.
11. Crook T., et al., Continued expression of HPV-16 E7 protein is required for maintenance of the transofmred phenotype of cells co-transformed by HPV-16 plus EJ-ras. EMBO. J. 1989: 8: 513-9.
12. Ressing N. E., et al., Human CTL epitopes encoded by human papillomavirus type 16 E6 and E7 identified through in vivo and in vitro immunogenicity studies of HLA-A-0201-binding peptides. J. Immumol. 1995: 154: 5934-5943.
13. Kast W. M., et al., Role of HLA-A motifs in identification of potential CTL epitopes in human papillomavirus typs 16 E6 and E7 proteins. J. Immunol. 1994: 152: 3904-3912.
14. Feltkamp M. C., et al., Vaccination with cytotoxic T lymphocyta epitope-containing peptide protects against a tumor induced by human papillomavirus type 16-transformed cells. Eur. J. Immunol. 1993: 23: 2242-2249.
15. Alexander M., et al., Generation of tumor specific cytolytic T-lymphocytes from peripheral blood of cervical cancer patients by in vitro stimulation with a synthetic HPV-16 E7 epitope. Am. J. Obster. Gynecol 1996: 175: 1586-1593.
16. Steller M. A., et al. Human papillomavirus immunology and vaccine prospects. J. Natl. Cancer Inst. Monogr. 1996: 21: 145-148.
17. Schiller J. T., et al., Papillomavirus vaccines: current status and future prospects. Adv. Dermatol. 1996: 11: 355-80; discussion: 355-80; discusstion: 381.
18. Kimbauer R., et al., Efficient self-assembly of human papillomavirus type 16 L1 and L1-L2 into virus-like particles, J. Virol. 1993: 67: 6929-6936.
19. Borysiewicz L. K., et al., A recombinant vaccinia virus encoding human papillomavirus type 16 and 18, E6 and E7 proteins as immunotherapy for cervical cancer [siehe Kommentare]. Lancet 1996: 347: 1523-1527.
20. Irvine K. R., et al., Synthetic oligonucleotide expressed by a recombinant vaccinia virus elicits therapeutic CTL. J. Immunol. 1995: 154: 4651-7.
21. WO 93/24640
22. Tang et al. Nature 1992, 356: 152-154.
23. Furth et al., Analytical Biochemistry, 1992, 205: 365-368.

SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Ein Vektor, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, das ein HPV-16 E7-Antigen codiert, dem die Aminosäuren 21 bis 26 fehlen, wobei das Nukleinsäuremolekül operativ mit einem Cytomegalovirus-Promoter verknüpft ist.
Der Vektor, der in Anspruch 1 beansprucht wird, wobei das Nukleinsäuremolekül innerhalb des Plasmids CMV-3, wie man es in 2 sieht, enthalten ist.
Der Vektor, der in Anspruch 1 beansprucht wird, welcher pCMV-dE7, wie man es in 1 sieht, ist.
Eine immunogene Zusammensetzung zur in vivo-Verabreichung an einen Wirt, welche einen Vektor, wie er in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 beansprucht wird, umfasst.
Ein Vektor wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 beansprucht zur Verwendung als ein Medikament.
Verwendung eines Vektors wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 beansprucht zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Gebärmutterhalskrebs.