DE10018403A1 - Verfahren zur Herstellung einer Vakzine gegen Krebserkrankungen - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung einer Vakzine gegen Krebserkrankungen zur Verfügung. In diesem Verfahren werden zunächst unter Verwendung eines oder mehrerer Antikörper, die gegen ein oder mehrere speziell von den Tumorzellen exprimierte Antigene spezifisch wirksam sind, aus einer Phagen-Peptid-Bibliothek ein oder mehrere Mimotope dieser Antigene ausgewählt. Um die Vakzine zu erhalten, werden diese Mimotope dann mit einem makromolekularen Träger konjugiert. Die erfindungsgemäß hergestellten Vakzine führen bei Verabreichung zu einer humoralen Immunantwort und damit zur Entstehung einer aktiven Immunität als Folge der Vakzinierung.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Vakzine gegen Krebserkrankungen.

In den letzten Jahren ist in den westlichen Industrienationen ein stetiges Anwachsen der Krebserkrankungen festzustellen. Beispielsweise erkranken derzeit in den Staaten der EU jährlich etwa 340.000 Frauen an Brustkrebs. Insgesamt sind etwa 10% aller Frauen in den westlichen Industrienationen von dieser Krankheit betroffen. Für Frauen mit familiärer Disposition für eine Brustkrebserkrankung ist dieses Risiko sogar noch stark erhöht.

Bisher bekannte Verfahren zur Therapie von Krebserkrankungen zielen vor allen Dingen auf eine frühe Erkennung der Erkrankung und auf eine möglichst selektive Abtötung der Tumorzellen ab. Diese Verfahren weisen die Nachteile auf, daß eine wirkungsvolle Prophylaxe gegen die Entstehung der Krebserkrankung nicht möglich ist und das die Behandlung zum Beispiel durch Chemotherapie mit ganz erheblichen Nebenwirkungen für den Patienten verbunden ist.

Demgemäß ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vakzine gegen Krebserkrankungen zur Verfügung zu stellen, mit Hilfe derer es möglich ist, Krebserkrankungen wirksam vorzubeugen und somit das Risiko einer solchen Erkrankung deutlich zu verringern.

Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß eine solche Vakzine durch ein Verfahren erhalten werden kann, das Antikörper ausnutzt, die gegen ein von den Tumorzellen gebildetes Antigen wirksam sind, um Mimotope dieses Antigens zu erhalten, mit Hilfe derer eine körpereigene Immunantwort stimuliert werden kann.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer Vakzine gegen Krebserkrankungen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß zunächst unter Verwendung eines oder mehrerer körpereigener oder synthetischer Antikörper, die gegen ein oder mehrere speziell von den Tumorzellen exprimierte Antigene spezifisch wirksam sind, aus einer Phagen-Peptid-Bibliothek ein oder mehrere Mimotope dieser Antigene ausgewählt werden und diese Mimotope dann mit einem makromolekularen Träger konjugiert werden.

Durch dieses Verfahren werden Vakzine gegen Krebserkrankungen erhalten, selbst wenn die Natur bzw. Struktur des entsprechenden Antigens nicht oder nicht im Detail bekannt ist. Diese Vakzine führen bei Verabreichung zu einer humoralen Immunantwort und damit zur Entstehung einer aktiven Immunität als Folge der Vakzinierung.

Darüber hinaus sind die erhaltenenen Vakzine endotoxinfrei und somit auch von daher bestens für eine Impfung im Humansystem geeignet. Durch die Verabreichung der erfindungsgemäßen Vakzine ist also eine Prophylaxe gegen Krebserkrankungen möglich.

In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Vakzine gegen Brustkrebs (Mamma­ carzinom) zur Verfügung. Dadurch kann der Entstehung dieser bei Frauen am häufigsten auftretenden Krebsart entgegen gewirkt werden. Dies ist vor allen Dingen für Frauen mit familiärer Disposition zur Entwicklung von Brustkrebs bedeutend.

Bevorzugterweise umfassen die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten körpereigenen oder synthetischen Antikörper solche Antikörper, die gegen einen als Antigen wirkenden Rezeptor für einen Wachstumsfaktor der Tumorzellen spezifisch wirksam sind. Durch den Einsatz von Antikörpern gegen diese bestimmte Art von Antigenen wird eine besonders ausgeprägte Wirkung der durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältlichen Vakzine sichergestellt.

Weiter bevorzugt umfassen die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten körpereigenen oder synthetischen Antikörper solche Antikörper, die gegen das von den Tumorzellen exprimierte HER-2/neu Protein spezifisch wirksam sind. Das HER-2/neu Protein stellt einen Rezeptor für einen Wachstumsfaktor dar, unter dessen Kontrolle die Tumorzellen wachsen. Durch den Einsatz solcher Antikörper ist vor allen Dingen eine sehr gute Wirksamkeit der durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellte Vakzine gegen Brustkrebs gewährleistet.

Von den gegen das HER-2/neu Protein wirksamen Antikörpern wird im erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugterweise die Antikörperpreparation Herceptin verwendet. Diese Antikörperpreparation hat bereits bei der Zugabe zur konventionellen Chemotherapie bei Brustkrebspatientinnen eine deutliche Verbesserung der Ansprechrate auf die Behandlung der Patientinnen herbeigeführt.

Die Darstellung der aus den Phagen-Peptid-Bibliotheken ausgewählten Mimotope in größerer Menge findet bevorzugt unter Verwendung eines pflanzlichen Expressionssystems statt, wie es zum Beispiel das Tabakmosaikvirussystem darstellt. In diesem System kann die Expression der Mimotope durch transiente Infektion der Wirtspflanzen mit Tabakmosaikviren erfolgen. Die solchermaßen exprimierten Mimotope sind endotoxinfrei und somit besonders für den Einsatz im erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung einer Vakzine geeignet.

Im folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren im Detail beschrieben.

Die erfindungsgemäße Herstellung der Vakzine gegen Krebserkrankungen erfolgt unter Verwendung von Antikörpern, die gegen speziell von Tumorzellen exprimierte Antigene spezifisch wirksam sind.

Bei diesen Antikörpern kann es sich zum einen um körpereigene handeln, wie sie in Folge der humoralen Immunantwort auf das oder die Antigene zum Beispiel im Blutserum von erkrankten Patienten vorhanden sind. Die Herstellung bzw. Isolierung dieser Antikörper erfolgt nach bekannten, herkömmlichen Methoden.

Zum anderen können auch synthetische Antikörper oder Antikörper­ präparationen verwendet werden. Als Beispiel kann hier die Antikörper­ präparation Herceptin von Genentech Inc. genannt werden. Bei dieser Antikörperpräparation handelt es sich um humanisierte monoklonale Antikörper, die aus Mäusen gewonnen werden.

Solche monoklonalen Antikörper sind zum Beispiel in US 5,772,997 beschrieben. Auf den Offenbarungsgehalt dieser Patentschrift wird hiermit Bezug genommen.

Herceptin ist gegen das als Wachstumsfaktor-Rezeptor auf Tumorzellen häufig überexprimierte Antigen HER-2/neu wirksam. Speziell bei Brustkrebstumoren wird in etwa bei 20-30% der Fälle das HER-2/neu- Antigen spezifisch an der Zelloberfläche exprimiert. Die Verabreichung von Herceptin führt zur Einleitung des natürlichen Zelltods der das HER-2/neu exprimierenden Tumorzellen.

Im Interesse einer hohen Wirksamkeit der hergestellten Vakzine werden im erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt polyklonale Antikörper verwendet, es sind aber auch monoklonale Antikörper geeignet.

Die körpereigenen oder synthetischen Antikörper werden dazu verwendet, um aus Phagen-Peptid-Bibliotheken geeignete Peptid-Mimotope der Antigene, gegen die die Antikörper spezifisch wirksam sind, auszuwählen. Einen Überblick über Phagen-Peptid-Bibliotheken und zugehörige Literatur geben M. B. Zwick, J. Shen und J. K. Scott in Current Opinion in Biotechnologie 1998, 9: 427-436. Auf den Offenbarungsgehalt dieser Druckschrift wird hiermit Bezug genommen.

Phagen-Peptid-Bibliotheken bestehen aus filamentösen Phagen, die an ihrer Oberfläche unterschiedliche Peptide in einer sehr großen Variationsbreite exprimieren. Durch herkömmliche Selektionsverfahren werden unter Verwendung der gegen das spezielle Antigen wirksamen Antikörper aus diesen Bibliotheken die passenden Peptid-Mimotope aufgefunden. Dabei ist anzumerken, daß die aufgefundenen Mimotope in ihrer chemischen Natur nicht mit dem entsprechenden Epitop des Antigens übereinstimmen müssen.

Die auf diese Weise ausgewählten Mimotope werden zunächst von den sie tragenden Phagen entkoppelt und dann mit Carrier-Proteinen konjugiert (Haptenisierung). Diese Konjugation kann beispielsweise so erfolgen, daß ein Albumin-bindendes Protein (ABP), wie es zum Beispiel von Streptokokken exprimiert wird, mit dem Mimotop-Protein verbunden wird. Die Verbindung von ABP und Proteinen wird von S. Baumann, P. Grob, F. Stuart, D. Pertlik, M. Ackermann und M. Suter im Journal of Immunological Methods 221 (1998) 95-106 beschrieben. Auf den Offenbarundgsgehalt dieser Druckschrift wird hiermit Bezug genommen.

Zur Konjugation von ABP und Mimotop-Protein wird zunächst eine einzelsträngige DNA-Sequenz der selektionierten Mimotope gewonnen und daraus doppelsträngige DNA erstellt. Diese DNA wird in den Expressionsvektor pSB 511 ligiert. Das resultierende Konstrukt aus Information für Mimotop und ABP wird zur Transformation kompetenter E. coli XL-1 Zellen verwendet. Nach Amplifikation und Ernte der Zellen kann das rekombinante Protein mittels NiNTA Agarose gereinigt werden.

Durch diesen Schritt der Konjugation der Mimotope mit Carrier-Proteinen wird gewährleistet, daß bei Verabreichung der Vakzine eine Immunantwort des Körpers induziert wird, d. h. dieser Schritt erfolgt, um die Mimotope immunogen zu machen.

Die Expression der aufgefundenen Mimotop-Proteine erfolgt durch systemische transiente Infektion von pflanzlichen Expressionssystemen (Wirtspflanzen), wie Nicotiana Tabacum oder Nicotina benthamiana mittels der genomischen und infektiven RNA von rekombinanten Tabakmosaikviren (TMV) oder durch vollständige rekombinante TMV-Partikel.

Dazu wird zuerst die für das Fremdprotein kodierende DNA Sequenz in eine in einem Plasmid befindliche cDNA Kopie des TMV ligiert, so daß diese Sequenz unter die Kontrolle des subgenomischen Promoters für das ursprüngliche Hüllprotein des TMV gelangt. Anschließend wird in vitro ein RNA Transkript des rekombinanten TMV Genoms synthetisiert. Diese RNA ist infektiv und wird auf verwundete Blätter der o. g. Wirtspflanzen aufgetragen. Im Zytoplasma der Wirtszellen kommt es zur Synthese der viralen Proteine und des gewünschten Fremdproteins.

Die Expression des Mimotops erfolgt durch Fusion an das Albumin­ bindende Protein (ABP). Dazu wird die für das Mimotop kodierende cDNA an das 3'-Ende der für das ABP kodierenden cDNA im gleichen Leserahmen angefügt. Die daraus entstehende cDNA des Fusionsproteins ABP-Mimotop wird in eine cDNA Kopie des TMV Genoms eingefügt, so daß diese Sequenz unter die Kontrolle des subgenomischen Promoters für das ursprüngliche Hüllprotein des TMV gelangt.

Durch diese Expressionsverfahren können die Mimotop-Proteine problemlos auch in größerem Maßstab in endotoxinfreier Form erhalten werden können.

Die Expression bzw. Herstellung der aufgefundenen Mimotop-Proteine kann aber auch nach herkömmlichen Methoden, wie zum Beispiel der Expression in E. Coli-Bakterien erfolgen.

Claims (6)

1. Verfahren zur Herstellung einer Vakzine gegen Krebserkrankungen, dadurch gekennzeichnet, daß aus einer Phagen-Peptid-Bibliothek unter Verwendung eines oder mehrerer körpereigener oder synthetischer Antikörper, die gegen ein oder mehrere speziell von den Tumorzellen exprimierte Antigene spezifisch wirksam sind, ein oder mehrere Mimotope dieser Antigene ausgewählt werden und diese Mimotope mit einem makromolekularen Träger konjugiert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als körpereigene oder synthetische Antikörper solche ausgewählt werden, die einen als Antigen wirkenden Rezeptor für einen Wachstumsfaktor der Tumorzellen erkennen.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als körpereigene oder synthetische Antikörper solche ausgewählt werden, die das von den Tumorzellen exprimierte Antigen HER-2/neu-Protein erkennen.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Antikörper die Antikörperpräparation Herceptin verwendet wird.

5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Expression des oder der Mimotope unter Verwendung eines pflanzlichen Expressionssystem erfolgt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Expression des oder der Mimotope mittels transienter Infektion des pflanzlichen Expressionssystems durch Tabakmosaikviren erfolgt.