DE10038111A1 - Verwendung von Polypeptiden oder diese kodierende Nukleinsäuren einer Familie von G-Protein gekoppelten Rezeptoren zur Diagnose oder Behandlung von Erkrankungen, beispielsweise Hautkrankheiten, sowie ihre Verwendung zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen - Google Patents

Abstract

Verwendung von Polypeptiden oder diese kodierende Nukleinsäuren einer Familie von G-Protein gekoppelten Rezeptoren zur (i) Diagnose und/oder Behandlung von Erkrankungen, beispielsweise Hauterkrankungen, und/oder (ii) Diagnose und/oder Behandlung bei der Wundheilung, oder (iii) Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Polypeptiden oder diese kodierende Nukleinsäuren einer Familie von G-Protein gekoppelten Rezeptoren zur (i) Dia­ gnose und/oder Behandlung von Erkrankungen, beispielsweise Hauterkrankun­ gen, und/oder (ii) Diagnose und/oder Behandlung bei der Wundheilung oder (iii) Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen.

Wunden heilen im allgemeinen ohne therapeutischen Eingriff ab. Es gibt jedoch zahlreiche Erkrankungen, bei denen die Wundheilung eine Rolle spielt, wie z. B. Diabetes mellitus, arterielle Verschlußkrankheiten, Schuppenflechte (Psoriasis), Morbus Crohn, Epidermolysis bullosa, altersbedingte Hautveränderungen oder Innervationsstörungen. Wundheilungsstörungen führen zu einer verzögerten Wundheilung oder zu chronischen Wunden. Diese Störungen können durch die Art der Verwundung (z. B. großflächige Wunden, tiefgehende und mechanisch gedehnte Operationswunden, Verbrennungen, Trauma, Dekubitus), medikamentö­ se Behandlung der Patienten (z. B. mit Corticoiden) aber auch durch die Art der Erkrankung selber verursacht werden. So leiden z. B. 25% der Patienten mit Typ- II-Diabetes häufig an chronischen Ulzera ("diabetischer Fuß"), von denen etwa die Hälfte aufwendige stationäre Behandlungen erfordern und letztlich doch schlecht heilen. Der diabetische Fuß verursacht mehr Klinikaufenthalte als jede andere mit Diabetes assoziierte Komplikation. Die Zahl dieser Fälle bei Diabetes Typ I und II ist im Steigen begriffen und repräsentiert 2,5% aller Klinikeinweisungen. Zudem heilen Wunden mit zunehmendem Alter der Patienten schlechter. Oft ist auch eine Beschleunigung des natürlichen Wundheilungsprozesses wün­ schenswert, um z. B. die Gefahr von bakteriellen Infektionen oder die Liegezeiten der Patienten zu verringern.

Auch nach erfolgtem Wundverschluß kann es zu weiteren Störungen kommen. Während Wunden fötaler Haut ohne Narbenbildung heilen, kommt es nach Ver­ letzungen in der Postnatalperiode stets zu Narbenbildungen, die oft ein großes kosmetisches Problem darstellen. Bei Patienten mit großflächigen Brandwunden kann zudem die Lebensqualität dramatisch beeinträchtigt werden, zumal vernarb­ ter Haut auch die Anhangsgebilde, wie Haarfollikel, Schweiß- und Talgdrüsen fehlen. Bei entsprechender genetischer Disposition kann es auch zu Keloiden kommen, hypertrophischen Narben, die in die umgebende Haut einwuchern.

Der Vorgang der Wundheilung erfordert komplexe koordiniert ablaufende Wir­ kungen und Interaktionen verschiedener Zelltypen. Im Wundheilungsprozeß un­ terscheidet man folgende Schritte: die Blutgerinnung im Bereich der Wunde, die Rekrutierung von Entzündungszellen, die Reepithelialisierung, die Bildung von Granulationsgewebe sowie die Restrukturierung von Matrix. Die exakten Reakti­ onsmuster der beteiligten Zelltypen während der Phasen der Proliferation, der Migration, der Matrixsynthese und der Kontraktion sind, ebenso wie die Regulati­ on von Genen wie z. B. Wachstumsfaktoren, Rezeptoren und Matrixproteinen, bislang wenig bekannt.

So sind bisher nur wenig zufriedenstellende Therapien entwickelt worden, um bei Wundheilungstörungen eingreifen zu können. Etablierte Therapieformen be­ schränken sich auf physikalische Unterstützung der Wundheilung (z. B. Verbände, Kompressen, Gele) oder der Transplantation von Hautgeweben, gezüchteten Hautzellen und/oder Matrixproteinen. In den letzten Jahren sind Wachstumsfakto­ ren zur Verbesserung der Wundheilung erprobt worden, ohne jedoch die konven­ tionelle Therapie entscheidend zu verbessern. Auch die Diagnose von Wundheilungsstörungen beruht auf wenig aussagekräftigen optischen Analysen der Haut, da ein tieferes Verständnis der Genregulation während der Wundheilung bisher fehlt.

Auch für andere Störungen von regenerativen Prozessen sind bisher wenig zufrie­ denstellende Therapien entwickelt worden. Auch hier ist die Kenntnis der Genre­ gulation vorteilhaft für die Entwicklung von Diagnostika und Therapien. Es ist gezeigt worden (Finch et al., 1997, Am. J. Pathol. 151: 1619-28; Werner, 1998, Cytokine Growth Factor Rev. 9: 153-165), daß wundheilungsrelevante Gene auch bei dermatologischen Erkrankungen, die auf Störungen der Regeneration der Haut beruhen, und allgemein bei regenerativen Prozessen eine entscheidende Rolle spielen. So spielt der Wachstumsfaktor KGF nicht nur eine entscheidende Rolle bei der Regulation der Proliferation und Differenzierung von Keratinozyten wäh­ rend der Wundheilung, sondern ist auch ein wichtiger Faktor bei der Hyperpro­ liferation der Keratinozyten bei der Schuppenflechte (Psoriasis) und Regenerati­ onsprozessen im Darm (bei Morbus Crohn und ulcerativer Colitis).

Neue Möglichkeiten bei der Modulation der Wundheilung und der Behandlung von Wundheilungsstörungen können sich durch die Untersuchung von G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCR) im Zusammenhang mit Wundheilung eröffnen. Die Superfamilie der GPCR, die die größte bislang bekannte Rezeptorfamilie dar­ stellt, ist durch sieben hoch konservierte, charakteristische Sequenzmotive von jeweils 20-30 Aminosäuren Länge gekennzeichnet, die sich durch eine hohe Hy­ drophobizität auszeichnen (Probst et al., 1992, DNA and Cell Biol., 11: 1-20; Flower, 1999, Biochem. Biophys. Acta, 1422: 207-234). Die Signaltransduktion erfolgt meist über heterotrimere G-Proteine, die wiederum sekundäre Botenstoffe, wie cAMP, cGMP, Diacylglycerol oder Inositol-1,4,5-triphosphat regulieren (Watson und Arkinstall (Hrsg.), 1999, The G-Protein Linked Receptors Facts Book, Academic Press, New York). Es können jedoch auch MAP Kinasen akti­ viert werden (Lefkowitz, 1998, J. Biol. Chem., 273: 18677-18680). Die Stimuli, die auf GPCRs wirken umfassen ein breites Spektrum, das von Licht, Riechstoffen, Neuromodulatoren bis zu verschiedensten Hormonen reicht (Lerner et al., 1993, Ciba Found. Symp., 179: 76-87), was die medizinische Bedeutung der GPCR begründet. Es wird geschätzt, daß über 50% aller modernen Medikamente auf GPCRs wirken (Gudermann et al., 1995, J. Mol. Med. 73: 51-63). Die bislang identifizierten Medikamente konzentrieren sich beispielsweise auf die Modulation des Gonadotropin-Releasing Hormon Rezeptors, wodurch Prostata- und Brust- Karzinome als auch Endometriose und fühzeitige Pubertät behandelt werden kön­ nen (Pace et al., 1992, Am. Fam. Physician, 44: 1777-1782). Propanolol, ein An­ tagonist des α-adrenergen Rezeptors im Herz, wird dagegen zur Behandlung von Bluthochdruck, Angina Pektoris und psychischen Störungen eingesetzt (Nace und Wood, 1987, Clin. Pharmacokinet. 13: 51-64; Ananth und Lin, 1986, Neuropsy­ chobiology, 15: 20-27). Metaproterenol, ein Antagonist des β2-adrenergen Re­ zeptors der Lunge, kommt bei der Erweiterung der Bronchien zur Anwendung (Hurst, 1973, Ann. Allergy, 31: 460-466).

Dagegen werden Agonisten oder Antagonisten von GPCRs bei Wundheilungspro­ zessen selten eingesetzt. Ein Antagonist des Histamin 2 Rezeptors kann bei­ spielsweise eingesetzt werden um Ulzera und idiopathische Urtikaria zu behan­ deln (Sontag et al., 1984, N. Engl. J. Med., 311: 689-693; Choy und Middleton, 1991, DICP, 25: 609-612). Zudem wurden "Protease-aktivierte Rezeptor 3 Protei­ ne" (US 5,892,014), Nukleotid-Rezeptoren (WO 98/32429; WO 94/23723), An­ giotensin Rezeptoren (WO 98/33813), der CCR-5 Rezeptor (WO 98/30218) und der Thromboxan A2 Rezeptor (US 4,851,413) als mögliche Targets bei der Mo­ dulation der Wundheilung und/oder Behandlung von Wundheilungserkrankungen beschrieben.

Ausgenommen der olfaktorischen GPCRs, von denen 1000-2000 im Mensch vor­ handen sind, wurden bislang mehrere hundert Mitglieder der GPCR-Superfamilie identifiziert (Flower, Biochem. Biophys. Acta, 1999, 1422: 207-234). Über 80 dieser Rezeptoren gehören zu den sogenannten Orphan-Rezeptoren, denen noch kein Ligand zugeordnet werden konnte (Marchese et al., 1999, Trends in Pharmacol. Sci., 20: 370-375). Durch die Identifizierung und Analyse von Orphan- Rezeptoren im Zusammenhang von Erkrankungen eröffnen sich neue Möglich­ keiten zur Behandlung dieser Erkrankungen (Marchese et al., supra), zumal eine Vielzahl spezieller Methoden zum Screening von Antagonisten und Agonisten von GPCRs zur Verfügung stehen (Lerner et al., supra; WO 96/41169; US 5,482,835; WO 99/06535; EP 0939902; WO 99/66326; WO 98/34948; EP 0863214; US 5,882,944; US 5,891,646).

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Polypeptide aus der Superfami­ lie der G-Protein gekoppelten Rezeptoren und diese kodierende Nukleinsäuren zur Verfügung zu stellen, die an Prozessen bei (i) Erkrankungen von Säugetierzellen, beispielsweise bei Erkrankungen von Hautzellen und/oder (ii) bei der Wundhei­ lung beteiligt sind, und deren Verwendung die Diagnose und/oder Behandlung sowie die Identifizierung und Entwicklung von in Zusammenhang mit diesen Er­ krankungen wirksamen Pharmazeutika entscheidend verbessert.

Bei der Analyse der Genexpression während des Wundheilungsprozesses konnten überraschenderweise zueinander homologe Gene identifiziert werden, die eine Genfamilie innerhalb der Superfamilie der G-Protein gekoppelten Rezeptoren bilden, und die bisher nicht mit Erkrankungen, beispielsweise Hauterkrankungen oder Wundheilung, in Verbindung gebracht wurden, deren Regulation aber für den Wundheilungsprozeß essentiell ist und die damit erstmals in kausalen Zu­ sammenhang mit Erkrankungen gebracht wurden. Die Polypeptide dieser Gene gehören nicht zu den bisher bekannten Zielen von Therapien von Erkrankungen, beispielsweise Hauterkrankungen und/oder von Therapien bei der Wundheilung, so daß sich aus dieser Erfindung völlig neue Therapieansätze ergeben.

Die Aufgabe der Erfindung wird durch die Verwendung mindestens eines Poly­ peptids oder Varianten davon gemäß einer der SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 4 und/oder diese kodierende Nukleinsäuren oder Varianten zur (i) Diagnose und/oder Behandlung von Erkrankungen, beispielsweise Hauterkrankungen, und/oder (ii) Diagnose und/oder Behandlung bei der Wundheilung, oder (iii) Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen gelöst.

Der Begriff "Varianten" eines Polypeptids im Sinne der vorliegenden Erfindung umfaßt auch funktionell aktive Varianten. Unter funktionell aktiven Varianten sind Polypeptide zu verstehen, die beispielsweise wie die erfindungsgemäß ver­ wendeten Polypeptide während Erkrankungen, beispielsweise Hauterkrankungen, oder bei regenerativen Prozessen der Haut reguliert werden. Unter "Regulation" wird beispielsweise die Erhöhung oder Erniedrigung der Menge der Polypeptide oder diese kodierende Nukleinsäuren verstanden, wobei diese Änderung bei­ spielsweise auf transkriptioneller oder translationeller Ebene stattfinden kann.

Zu funktionell aktiven Varianten zählen beispielsweise auch Polypeptide, die von einer Nukleinsäure kodiert werden, die aus Gewebe isoliert wurde, das bei der jeweilige Erkrankung nicht betroffen und/oder involviert ist, jedoch nach Expres­ sion in einer an der Erkrankung beteiligten Zelle die bezeichneten Funktionen besitzen.

Varianten im Sinne der vorliegenden Erfindung sind auch Polypeptide, die eine Sequenzhomologie, insbesondere eine Sequenzidentität, von ca. 70%, vorzugs­ weise ca. 80%, insbesondere ca. 90%, vor allem ca. 95% zu dem Polypeptid mit der Aminosäuresequenz gemäß einer der SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 4 und aufweisen. Beispiele solcher Varianten, die auch funktionell aktive Varianten sein können, sind demnach die entsprechenden Polypeptide, die aus anderen Organis­ men als dem Menschen bzw. der Maus, vorzugsweise aus nicht-menschlichen Säugetieren wie z. B. Affen, Schweinen und Ratten stammen. Andere Beispiele von Varianten sind Polypeptide, die durch unterschiedliche Allele des Gens, in verschiedenen Individuen oder in verschiedenen Organen eines Organismus ko­ diert werden.

Varianten des Polypeptids können auch Teile des erfindungsgemäß verwendeten Polypeptids mit mindestens 6 Aminosäuren Länge, vorzugsweise mit mindestens 8 Aminosäuren Länge, insbesondere mit mindestens 12 Aminosäuren Länge sein. Umfaßt sind auch Deletionen des erfindungsgemäß verwendeten Polypeptids im Bereich von ca. 1-60, vorzugsweise von ca. 1-30, insbesondere von ca. 1-15, vor allem von ca. 1-5 Aminosäuren. Beispielsweise kann die erste Aminosäure Me­ thionin fehlen, ohne daß die Funktion des Polypeptids wesentlich verändert wird.

Der Begriff "kodierende Nukleinsäure" bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, die für ein isolierbares bioaktives erfindungsgemäß verwendetes Polypeptid oder ei­ nen Precursor kodiert. Das Polypeptid kann durch eine Sequenz in voller Länge oder jeden Teil der kodierenden Sequenz kodiert werden, solange die spezifische, beispielsweise enzymatische Aktivität erhalten bleibt.

Es ist bekannt, daß kleine Veränderungen in der Sequenz der vorangehend be­ schriebenen Nukleinsäuren vorhanden sein können, zum Beispiel durch die Dege­ nerierung des genetischen Codes, oder daß nicht translatierte Sequenzen am 5' und/oder 3'-Ende der Nukleinsäure angehängt sein können, ohne daß dessen Ak­ tivität wesentlich verändert wird. Diese Erfindung umfaßt deshalb auch soge­ nannte "Varianten" der vorangehend beschriebenen Nukleinsäuren.

Unter Varianten der Nukleinsäuren sind alle DNA-Sequenzen zu verstehen, die komplementär zu einer DNA-Sequenz sind, die unter stringenten Bedingungen mit der Referenzsequenz hybridisieren und eine ähnliche Aktivität aufweisen wie das von der Referenzsequenz kodierte Polypeptid.

Unter "stringenten Hybridisierungsbedingungen" sind solche Bedingungen zu verstehen, bei denen eine Hybridisierung bei 60°C in 2,5 × SSC-Puffer, gefolgt von mehreren Waschschritten bei 37°C in einer geringeren Pufferkonzentration erfolgt und stabil bleibt.

Varianten der Nukleinsäure können auch Teile der erfindungsgemäß verwendeten Nukleinsäure mit mindestens 8 Nukleotiden Länge, vorzugsweise mit mindestens 18 Nukleotiden Länge, insbesondere mit mindestens 24 Nukleotiden Länge sein.

Der Begriff "pharmakologisch aktive Substanz" bezieht sich auf Substanzen, die mit lebenden Systemen interagieren, indem sie insbesondere an regulatorische Moleküle binden und normale Prozesse im Organismus aktivieren oder inhibieren. Die Identifizierung einer pharmakologisch aktiven Substanz erfolgt üblicherweise durch ein geeignetes Testsystem, das beispielsweise die Modulation der Aktivität des regulatorischen Moleküls durch Bindung von Substanzen nachweisen kann.

Die erfindungsgemäß verwendete Genfamilie kodiert für Proteine, die zu der Su­ perfamilie der G-Protein gekoppeltem Rezeptoren gehören. Bei den Untersuchun­ gen im Rahmen dieser Erfindung konnte zum ersten Mal ein Zusammenhang der erfindungsgemäß verwendeten Polypeptide mit Erkrankungen, beispielsweise Hauterkrankungen, festgestellt werden. Die nicht durch öffentliche Datenbanken zugänglichen Polypeptidsequenzen der erfindungsgemäß verwendeten Polypepti­ de und ihrer cDNAs sind im Sequenzprotokoll aufgelistet (Polypeptidsequenzen: SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 4, cDNA-Sequenzen: SEQ ID Nr. 5 bis SEQ ID Nr. 8). Fig. 5 und Fig. 6 zeigen den Vergleich der menschlichen und murinen Po­ lypeptidsequenzen von SW1368 (SEQ ID Nr. 1 und 2) und SW1695 (SEQ ID Nr. 3 und 4).

Die vorangehend beschriebenen Polypeptide können weiterhin dadurch gekenn­ zeichnet sein, daß sie synthetisch hergestellt werden. So kann das gesamte Poly­ peptid oder Teile davon zum Beispiel mit Hilfe der klassischen Synthese (Merri­ field-Technik) synthetisiert werden. Teile der vorangehend beschriebenen Poly­ peptide eignen sich insbesondere zur Gewinnung von Antiseren, mit deren Hilfe geeignete Genexpressionsbanken durchsucht werden können, um so zu weiteren Varianten der vorangehend beschriebenen Polypeptide zu gelangen.

Bevorzugterweise handelt es sich bei den erfindungsgemäß verwendeten Nuklein­ säuren um DNA oder RNA, vorzugsweise eine DNA, insbesondere eine doppel­ strängige DNA. Weiterhin kann die Sequenz der Nukleinsäuren dadurch gekenn­ zeichnet sein, daß sie mindestens ein Intron und/oder eine polyA-Sequenz auf­ weist. Die erfindungsgemäß verwendeten Nukleinsäuren können auch in Form ihrer antisense-Sequenz verwendet werden.

Für die Expression des betreffenden Gens ist im allgemeinen eine doppelsträngige DNA bevorzugt, wobei der für das Polypeptid kodierende DNA-Bereich beson­ ders bevorzugt ist. Dieser Bereich beginnt mit dem ersten in einer Kozak Sequenz (Kozak, 1987, Nucleic. Acids Res. 15: 8125-48) liegenden Start-Codon (ATG) bis zum nächsten Stop-Codon (TAG, TGA bzw. TAA), das im gleichen Leseraster zum ATG liegt.

Eine weitere erfindungsgemäße Verwendung der Nukleinsäuresequenzen ist die Konstruktion von anti-sense Oligonukleotiden (Zheng und Kemeny, 1995, Clin. Exp. Immunol. 100: 380-2; Nellen und Lichtenstein, 1993, Trends Biochem. Sci. 18: 419-23; Stein, 1992, Leukemia 6: 967-74) und/oder Ribozymen (Amarzguioui, et al. 1998, Cell. Mol. Life Sci. 54: 1175-202; Vaish, et al., 1998, Nucleic Acids Res. 26: 5237-42; Persidis, 1997, Nat. Biotechnol. 15: 921-2; Couture und Stinchcomb, 1996, Trends Genet. 12: 510-5). Mit anti-sense Oligonukleotiden kann man die Stabilität von Nukleinsäuren verringert werden und/oder die Translation von Nukleinsäuren inhibiert werden. So kann durch die erfindungs­ gemäße Verwendung der Nukleinsäuresequenzen beispielsweise die Expression der entsprechenden Gene in Zellen sowohl in vivo als auch in vitro verringert werden. Oligonukleotide können sich daher als Therapeutikum eignen. Diese Strategie eignet sich beispielsweise auch für Haut, epidermale und dermale Zel­ len, insbesondere, wenn die antisense Oligonukleotide mit Liposomen komple­ xiert werden (Smyth et al., 1997, J. Invest. Dermatol. 108: 523-6; White et al., 1999, J. Invest. Dermatol. 112: 699-705; White et al., 1999, J. Invest. Dermatol. 112: 887-92). Für die Verwendung als Sonde oder als "antisense" Oligonukleotid ist eine einzelsträngige DNA oder RNA bevorzugt.

Weiterhin kann zur Durchführung der Erfindung eine Nukleinsäure verwendet werden, die synthetisch hergestellt worden ist. So kann die erfindungsgemäß ver­ wendete Nukleinsäure beispielsweise chemisch anhand der in der SEQ ID Nr. 5 bis SEQ ID Nr. 8 beschriebenen DNA Sequenzen und/oder anhand der in SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 4 beschriebenen Proteinsequenzen unter Heranziehen des genetischen Codes z. B. nach der Phosphotriester-Methode synthetisiert werden (siehe z. B. Uhlmann, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Revievs, 90, 543-584, No. 4).

Oligonukleotide werden in der Regel schnell durch Endo- oder Exonukleasen, insbesondere durch in der Zelle vorkommende DNasen und RNasen, abgebaut. Deshalb ist es vorteilhaft, die Nukleinsäure zu modifizieren, um sie gegen den Abbau zu stabilisieren, so daß über einen langen Zeitraum eine hohe Konzentrati­ on der Nukleinsäure in der Zelle beibehalten wird (Beigelman et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23: 3989-94; Dudycz, 1995, WO 95/11910; Macadam et al., 1998, WO 98/37240; Reese et al., 1997, WO 97/29116). Typischerweise kann eine solche Stabilisierung durch die Einführung von einer oder mehrerer Internu­ kleotid-Phosphorgruppen oder durch die Einführung einer oder mehrerer Nicht- Phosphor-Internukleotide, erhalten werden.

Geeignete modifizierte Internukleotide sind in Uhlmann und Peymann (1990 Chem. Rev. 90, 544) zusammengefaßt (siehe auch Beigelman et al., 1995 Nucleic Acids Res. 23: 3989-94; Dudycz, 1995, WO 95/11910; Macadam et al., 1998, WO 98/37240; Reese et al., 1997, WO 97/29116). Modifizierte Internukleotid- Phosphatreste und/oder Nicht-Phosphorbrücken in einer Nukleinsäure, die bei einer der erfindungsgemäßen Verwendungen eingesetzt werden können, enthalten zum Beispiel Methylphosphonat, Phosphorothioat, Phosphoramidat, Phosphoro­ dithioat, Phophatester, während Nicht-Phosphor-Internukleotid-Analoge, beispielsweise Siloxanbrücken, Carbonatbrücken, Carboxymethylester, Acetamidat­ brücken und/oder Thioetherbrücken enthalten. Es ist auch beabsichtigt, daß diese Modifizierung die Haltbarkeit einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die bei einer der erfindungsgemäßen Verwendungen eingesetzt werden kann, verbessert.

In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung sind die vorangehend beschriebenen Nukleinsäuren in einem Vektor, vorzugsweise in ei­ nem "shuttle" Vektor, Phagemid, Cosmid, Expressionsvektor oder gentherapeu­ tisch wirksamen Vektor enthalten. Weiterhin können die vorangehend beschrie­ benen Nukleinsäuren in "knock-out" Genkonstrukten oder Expressionskassetten enthalten sein. Eine Expressionskassette im Sinne der vorliegenden Erfindung umfaßt mindestens einen Promotor oder Enhancer, mindestens ein Translationsi­ nitiationssignal, mindestens eine der vorangehend beschriebenen Nukleinsäuren, ein Translationsterminierungssignal, ein Transkriptionsterminierungssignal und ein Polyadenylierungssignal.

Vorzugsweise enthält ein gentherapeutisch wirksamer Vektor wund- bzw. haut­ spezifische regulatorische Sequenzen, die funktionell mit der vorangehend be­ schriebenen Nukleinsäure verbunden sind.

Die Expressionsvektoren können prokaryotische oder eukaryotische Expressions­ vektoren sein. Beispiele für prokaryotische Expressionsvektoren sind für die Ex­ pression in E. coli z. B. die Vektoren pGEM oder pUC-Derivate und für eukaryoti­ sche Expressionsvektoren für die Expression in Saccharomyces cerevisiae z. B. die Vektoren p426Met25 oder p426GAL1 (Mumberg et al. (1994) Nucl. Acids Res., 22, 5767-5768), für die Expression in Insektenzellen z. B. Baculovirus- Vektoren wie in EP-B1-0 127 839 oder EP-B1-0 549 721 offenbart, und für die Expression in Säugerzellen z. B. die Vektoren Rc/CMV und Rc/RSV oder SV40- Vektoren, welche alle allgemein erhältlich sind.

Im allgemeinen enthalten die Expressionsvektoren auch für die jeweilige Wirts­ zelle geeignete Promotoren, wie z. B. den trp-Promotor für die Expression in E. coli (siehe z. B. EP-B1-0 154 133), den MET25, GAL1 oder ADH2-Promotor für die Expression in Hefen (Russel et al. (1983), J. Biol. Chem. 258, 2674-2682; Mumberg, supra), den Baculovirus-Polyhedrin-Promotor, für die Expression in Insektenzellen (siehe z. 13. EP-B1-0 127 839). Für die Expression in Säugetier­ zellen sind beispielsweise Promotoren geeignet, die eine konstitutive, regulierba­ re, gewebsspezifische, zellzyklusspezifische oder metabolischspezifische Expres­ sion in eukaryotischen Zellen erlauben. Regulierbare Elemente gemäß der vorlie­ genden Erfindung sind Promotoren, Aktivatorsequenzen, Enhancer, Silencer und/oder Repressorsequenzen.

Beispiel für geeignete regulierbare Elemente, die konstitutive Expression in Euka­ ryonten ermöglichen, sind Promotoren, die von der RNA Polymerase III erkannt werden oder virale Promotoren, CMV-Enhancer, CMV-Promotor, SV40 Promotor oder LTR-Promotoren z. B. von MMTV (mouse mammary tumour virus; Lee et al. (1981) Nature 214, 228-232) und weitere virale Promotor- und Aktivatorse­ quenzen, abgeleitet aus beispielsweise HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV oder HIV.

Beispiele für regulierbare Elemente, die regulierbare Expression in Eukaryonten ermöglichen, sind der Tetracyclinoperator in Kombination mit einem entspre­ chenden Repressor (Gossen M. et al. (1994) Curr. Opin. Biotechnol. 5, 516-20).

Vorzugsweise erfolgt die Expression von wundheilungsrelevanten Genen unter der Kontrolle von gewebespezifischen Promotoren, beispielsweise unter Kontrolle von hautspezifischen Promotoren wie beispielsweise dem humanen K10 Promotor (Bailleul et al., 1990. Cell 62: 697-708), dem humanen K14 Promotor (Vassar et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1563-67) oder dem bovinen Cytokeratin IV Promotor (Fuchs et al., 1988; The biology of wool and hair (Hrsg.: G. E. Rogers, et al.; S. 287-309; Chapman und Hall, London/New York).

Weitere Beispiele für regulierbare Elemente, die gewebespezifische Expression in Eukaryonten ermöglichen, sind Promotoren oder Aktivatorsequenzen aus Promo­ toren oder Enhancern von solchen Genen, die für Proteine kodieren, die nur in bestimmten Zelltypen exprimiert werden.

Beispiele für regulierbare Elemente, die zellzyklusspezifische Expression in Euka­ ryonten ermöglichen, sind Promotoren folgender Gene: cdc25A, cdc25B, cdc25C, Cyclin A, Cyclin E, cdc2, E2F-1 bis E2F-5, B-myb oder DHFR (Zwicker J. und Müller R. (1997) Trends Genet. 13, 3-6). Die Verwendung von zellzyklusregu­ lierten Promotoren ist besonders bevorzugt in Fällen, in denen die Expression der erfindungsgemäß verwendeten Polypeptide oder Nukleinsäuren auf proliferieren­ de Zellen beschränkt werden soll.

Beispiele für regulierbare Elemente, die metabolischspezifische Expression in Eukaryonten ermöglichen, sind Promotoren, die durch Hypoxie, durch Glukose­ mangel, durch Phosphatkonzentration oder durch Hitzeschock reguliert werden.

Um die Einführung von den vorangehend beschriebenen Nukleinsäuren und damit die Expression des Polypeptids in einer eu- oder prokaryotischen Zelle durch Transfektion, Transformation oder Infektion zu ermöglichen, kann die Nuklein­ säure als Plasmid, als Teil eines viralen oder nicht-viralen Vektors vorliegen. Als virale Vektoren eignen sich hierbei besonders: Baculoviren, Vakziniaviren, Ade­ noviren, adenoassoziierte Viren und Herpesviren. Als nicht-virale Vektoren eig­ nen sich hierbei besonders: Virosomen, Liposomen, kationische Lipide, oder po­ ly-Lysin konjugierte DNA.

Beispiele von gentherapeutisch wirksamen Vektoren sind Virusvektoren, bei­ spielsweise Adenovirusvektoren oder retroviralen Vektoren (Lindemann et al., 1997, Mol. Med. 3: 466-76; Springer et al., 1998, Mol. Cell. 2: 549-58). Eukaryo­ tische Expressionsvektoren eignen sich in isolierter Form für die gentherapeutische Anwendung, da nackte DNA bei topischer Applikation beispielsweise in Hautzellen eindringen kann (Hengge et al., 1996, J. Clin. Invest. 97: 2911-6; Yu et al., 1999, J. Invest. Dermatol. 112: 370-5).

Gentherapeutisch wirksame Vektoren lassen sich auch dadurch erhalten, daß man die vorangehend beschriebenen Nukleinsäure mit Liposomen komplexiert, da da­ mit eine sehr hohe Transfektionseffizienz, beispielsweise von Hautzellen, erreicht werden kann (Alexander und Akhurst, 1995, Hum. Mol. Genet. 4: 2279-85). Bei der Lipofektion werden kleine unilamellare Vesikel aus kationischen Lipiden durch Ultraschallbehandlung der Liposomensuspension herstellt. Die DNA wird ionisch auf der Oberfläche der Liposomen gebunden, und zwar in einem solchen Verhältnis, daß eine positive Nettoladung verbleibt und die Plasmid-DNA zu 100% von den Liposomen komplexiert wird. Neben den von Felgner et al. (1987, supra) eingesetzten Lipidmischungen DOTMA (1,2-Dioleyloxpropyl-3- trimethylammoniumbromid) und DPOE (Dioleoylphosphatidylethanolamin) wur­ den inzwischen zahlreiche neue Lipidformulierungen synthetisiert und auf ihre Effizienz der Transfektion verschiedener Zellinien getestet (Behr et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6982-6986; Gao und Huang (1991), Biochim. Biophys. Acta 1189, 195-203; Felgner et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 2550-­ 2561). Beispiele der neuen Lipidformulierungen sind DOTAP N-[1-(2,3- Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumethylsulfat oder DOGS (TRANSFECTAM; Dioctadecylamidoglycylspermin). Hilfsstoffe, die den Trans­ fer von Nukleinsäuren in die Zelle erhöhen, können beispielsweise Proteine oder Peptide, die an DNA gebunden sind oder synthetische Peptid-DNA-Moleküle, die den Transport der Nukleinsäure in den Kern der Zelle ermöglichen, sein (Schwartz et al. (1999) Gene Therapy 6, 282; Brandén et al. (1999) Nature Bio­ tech. 17, 784). Hilfsstoffe umfassen auch Moleküle, die die Freisetzung von Nu­ kleinsäuren in das Cytoplasma der Zelle ermöglichen (Planck et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 12918; Kichler et al. (1997) Bioconj. Chem. 8, 213) oder beispiels­ weise Liposomen (Uhlmann und Peymann (1990) supra). Eine andere besonders geeignete Form von gentherapeutischen Vektoren läßt sich dadurch erhalten, daß man die vorangehend beschriebene Nukleinsäure auf Goldpartikeln aufbringt und diese mit Hilfe der sogenannten "Gene Gun" in Gewebe, beispielsweise in die Haut, oder Zellen schießt (Wang et al., 1999, J. Invest. Dermatol., 112: 775-81, Tuting et al., 1998, J. Invest. Dermatol. 111: 183-8).

Eine weitere Form eines gentherapeutisch wirksamen Vektors läßt sich durch das Einbringen von "nackten" Expressionsvektoren in eine biokompatible Matrix, beispielsweise eine Kollagenmatrix, herstellen. Diese Matrix kann beispielsweise in Wunden eingebracht werden, um die einwandernden Zellen mit dem Expressi­ onsvektor zu transfizieren und die erfindungsgemäßen Polypeptide in den Zellen zu exprimieren (Goldstein und Banadio, US 5,962,427).

Für die gentherapeutische Anwendung der vorangehend beschriebenen Nuklein­ säure ist es auch von Vorteil, wenn der Teil der Nukleinsäure, der für das Poly­ peptid kodiert, ein oder mehrere nicht kodierende Sequenzen einschließlich Intronsequenzen, vorzugsweise zwischen Promotor und dem Startcodon des Poly­ peptids, und/oder eine polyA-Sequenz, insbesondere die natürlich vorkommende polyA-Sequenz oder eine SV40 Virus polyA-Sequenz, vor allem am 3'-Ende des Gens enthält, da hierdurch eine Stabilisierung der mRNA erreicht werden kann (Palmiter et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 478-482; Jackson, 1993, Cell 74: 9-14).

Knock-out Genkonstrukte sind dem Fachmann zum Beispiel aus den US-Patenten 5,625,122; US 5,698,765; US 5,583,278 und US 5,750,825 bekannt.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Wirtszelle, bei­ spielsweise eine Hautzelle, die mit einem der vorangehend beschriebenen Vekto­ ren, Expressionskassette, und/oder knock-out Genkonstrukt transformiert ist. Wirtszellen können sowohl prokaryotische als auch eukaryotische Zellen sein, Beispiele für prokaryotische Wirtszellen sind E. coli und für eukaryotische Zellen Saccharomyces cerevisiae oder Insektenzellen.

Ein besonders bevorzugte transformierte Wirtszelle ist eine transgene embryonale nichtmenschliche Stammzelle, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie mindestens einen Vektor, mindestens ein knock-out Genkonstrukt, und/oder mindestens eine Expressionskassette, wie vorangehend beschrieben, enthält. Verfahren zur Trans­ formation von Wirtszellen und/oder Stammzellen sind dem Fachmann gut be­ kannt und umfassen zum Beispiel Elektroporation oder Mikroinjektion.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein transgenes nichtmenschliches Säu­ getier, dessen Genom mindestens einen Vektor, mindestens ein knock-out Gen­ konstrukt, und/oder mindestens eine Expressionskassette, wie vorangehend be­ schrieben, enthält. Transgene Tiere zeigen im allgemeinen eine gewebespezifisch erhöhte Expression der Nukleinsäuren und/oder Polypeptide und lassen sich zur Analyse beispielsweise von Wundheilungsstörungen verwenden. So weist bei­ spielsweise eine Activin A transgene Maus eine verbesserte Wundheilung auf (Munz et al., 1999, EMBO J. 18: 5205-15) während eine transgene Maus mit do­ minant negativem KGF Rezeptor eine verzögerte Wundheilung aufweist (Werner et al., 1994, Science 266: 819-22).

Verfahren zur Herstellung von transgenen Tieren, insbesondere von transgenen Mäusen, sind dem Fachmann ebenfalls aus der DE 196 25 049 und den US 4,736,866; US 5,625,122; US 5,698,765; US 5,583,278 und US 5,750,825 be­ kannt und umfassen transgene Tiere, die beispielsweise über direkte Injektion von Expressionsvektoren (s. o.) in Embryonen oder Spermatozyten oder über die Transfektion von Expressionsvektoren in embryonale Stammzellen erzeugt wer­ den können (Polites und Pinkert: DNA Microinjection and Transgenic Animal Produktion, Seite 15 bis 68 in Pinkert, 1994: Transgenic animal technology: a laboratory handbook, Academic Press, London, UK; Houdebine, 1997, Harwood Academic Publishers, Amsterdam, The Netherlands; Doetschman: Gene Transfer in Embryonic Stem Cells, Seite 115 bis 146 in Pinkert, 1994, supra; Wood: Retro­ virus-Mediated Gene Transfer, Seite 147 bis 176 in Pinkert, 1994, supra; Monastersky: Gene Transfere Technology: Alternative Techniques and Applications, Seite 177 bis 220 in Pinkert, 1994, supra).

Werden die vorangehend beschriebenen Nukleinsäuren in sogenannte "Targeting" Vektoren oder "knock-out" Genkonstrukte integriert (Pinkert, 1994, supra) kön­ nen nach Transfektion von embryonalen Stammzellen und homologer Rekombi­ nation beispielsweise knock-out Mäuse generiert werden, die im allgemeinen als heterozygote Mäuse verringerte Expression der Nukleinsäure zeigen, während homozygote Mäuse keine Expression der Nukleinsäure mehr aufweisen. Auch die so erzeugten Tiere lassen sich zur Analyse beispielsweise von Wundheilungsstö­ rungen verwenden. So weisen beispielsweise die eNOS- (Lee et al., 1999, Am. J. Physiol. 277: H1600-H1608), Nf-1 (Atit et al., 1999, J. Invest. Dermatol. 112: 835-­ 42) und Osteopontin (Liaw et al., 1998, J. Clin. Invest. 101: 967-71) knock-out Mäuse eine verschlechterte Wundheilung auf. Auch hier ist eine gewebespezifi­ sche Reduktion der Expression wundheilungsrelevanter Gene, beispielsweise in hautspezifischen Zellen unter Verwendung des Cre-loxP Systems (stat3 knock- out, Sano et al., EMBO J. 1999 18: 4657-68), besonders zu bevorzugen. So er­ zeugte transgene und knock-out Zellen oder Tiere lassen sich auch zum Screening und zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen bzw. genthera­ peutisch aktiven Vektoren verwenden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung ei­ nes Polypeptids zur (i) Diagnose und/oder Behandlung von Erkrankungen, bei­ spielsweise Hauterkrankungen, und/oder (ii) Diagnose und/oder Behandlung bei der Wundheilung, oder (iii) Identifizierung von pharmakologisch aktiven Sub­ stanzen in einer geeigneten Wirtszelle, das dadurch gekennzeichnet ist, daß min­ destens eine der vorangehend beschriebenen Nukleinsäuren verwendet wird.

Das Polypeptid wird beispielsweise durch Expression der vorangehend beschrie­ benen Nukleinsäuren in einem geeigneten Expressionssystem, wie oben bereits erwähnt, nach dem Fachmann allgemein bekannten Methoden hergestellt. Als Wirtszellen eignen sich beispielsweise die E. coli Stämme DHS, HB101 oder BL21, der Hefestamm Saccharomyces cerevisiae, die Insektenzellinie Lepidopte­ ran, z. B. von Spodoptera frugiperda, oder die tierischen Zellen COS, Vero, 293, HaCaT, und HeLa, die alle allgemein erhältlich sind.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins zur (i) Diagnose und/oder Behandlung von Erkrankungen, bei­ spielsweise Hauterkrankungen, und/oder (ii) Diagnose und/oder Behandlung bei der Wundheilung, oder (iii) Identifizierung von pharmakologisch aktiven Sub­ stanzen in einer geeigneten Wirtszelle, bei dem mindestens eine der vorangehend beschriebenen Nukleinsäuren verwendet wird.

Hergestellt werden hierbei Fusionsproteine, die die oben beschriebenen Polypep­ tide enthalten, wobei die Fusionsproteine selbst bereits die Funktion eines Poly­ peptids der Erfindung aufweisen oder erst nach Abspaltung des Fusionsanteils die spezifische Funktion aufweisen. Vor allem zählen hierzu Fusionsproteine mit ei­ nem Anteil von ca. 1-300, vorzugsweise ca. 1-200, insbesondere ca. 1-100, vor allem ca. 1-50 fremden Aminosäuren. Beispiele solcher Peptidsequenzen sind prokaryotische Peptidsequenzen, die z. B. aus der Galactosidase von E. coli ab­ geleitet sein können. Weiterhin können auch virale Peptidsequenzen, wie zum Beispiel vom Bakteriophagen M13 verwendet werden, um so Fusionsproteine für das dem Fachmann bekannte "phage display"-Verfahren zu erzeugen.

Weitere bevorzugte Beispiele für Peptidsequenzen für Fusionsproteine sind Pepti­ de, die die Detektion der Fusionsproteine erleichtern, hierzu zählen beispielsweise "Green-fluorescent-protein" oder Varianten davon.

Zur Aufreinigung der vorangehend beschriebenen Proteine kann ein weite­ res/weiterer Polypeptid ("tag") angefügt sein. Erfindungsgemäße Protein-tags erlauben beispielsweise die hochaffine Absorption an eine Matrix, stringentes Waschen mit geeigneten Puffern, ohne den Komplex in nennenswertem Maße zu eluieren und anschließend gezielte Elution des absorbierten Komplexes. Beispiele der dem Fachmann bekannten Protein-tags sind ein (His)₆-tag, ein Myc-tag, ein FLAG-tag, ein Hämagglutinin-tag, Glutathion-Transferase (GST)-tag, Intein mit einem Affinitäts-Chitin-binding-tag oder Maltose-binding protein (MBP)-tag. Diese Protein-tags können sich N-, C-terminal und/oder intern befinden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung ei­ nes Antikörpers oder Antikörperfragments, vorzugsweise eines polyklonalen oder monoklonalen Antikörpers zur (i) Diagnose und/oder Behandlung von Erkran­ kungen, beispielsweise Hauterkrankungen, und/oder (ii) Diagnose und/oder Be­ handlung bei der Wundheilung, oder (iii) Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen, bei dem ein Polypeptid oder eine Varianten davon, wie vor­ angehend beschrieben, verwendet wird.

Das Verfahren erfolgt nach dem Fachmann allgemein bekannten Methoden durch Immunisieren eines Säugetiers, beispielsweise eines Kaninchens, mit dem ge­ nannten Polypeptid oder Varianten davon, vorzugsweise mit Teilen davon, mit mindestens 6 Aminosäuren Länge, vorzugsweise mit mindestens 8 Aminosäuren Länge, insbesondere mit mindestens 12 Aminosäuren Länge, gegebenenfalls in Anwesenheit von z. B. Freund's Adjuvant und/oder Aluminiumhydroxidgelen (siehe z. B. Diamond, B. A. et al. (1981) The New England Journal of Medicine, 1344-1349). Die im Tier aufgrund einer immunologischen Reaktion entstandenen polyklonalen Antikörper lassen sich anschließend nach allgemein bekannten Me­ thoden leicht aus dem Blut isolieren und z. B. über Säulenchromatographie reini­ gen. Monoklonale Antikörper können beispielsweise nach der bekannten Methode von Winter & Milstein (Winter, G. & Milstein, C. (1991) Nature, 349, 293-299) hergestellt werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Antikörper oder Anti­ körperfragment zur (i) Diagnose und/oder Behandlung von Erkrankungen, bei­ spielsweise Hauterkrankungen, und/oder (ii) Diagnose und/oder Behandlung bei der Wundheilung, oder (iii) Identifizierung von pharmakologisch aktiven Sub­ stanzen, der gegen ein vorangehend beschriebenes Polypeptid gerichtet ist und mit dem vorangehend beschriebenen Polypeptiden spezifisch reagiert, wobei die oben genannten Teile des Polypeptids entweder selbst immunogen sind oder durch Kopplung an geeignete Träger, wie z. B. bovines Serumalbumin, immunogen ge­ macht bzw. in ihrer Immunogenität gesteigert werden können. Dieser Antikörper ist entweder polyklonal oder monoklonal, bevorzugt ist ein monoklonaler Anti­ körper. Unter dem Begriff Antikörper oder Antikörperfragment versteht man ge­ mäß der vorliegenden Erfindung auch gentechnisch hergestellte und gegebenen­ falls modifizierte Antikörper bzw. antigenbindende Teile davon, wie z. B. chimäre Antikörper, humanisierte Antikörper, multifunktionelle Antikörper, bi- oder oli­ gospezifische Antikörper, einzelsträngige Antikörper, F(ab)- oder F(ab)₂- Fragmente (siehe z. B. EP-B1-0 368 684, US 4,816,567, US 4,816,397, WO 88/01649, WO 93/06213, WO 98/24884).

Die erfindungsgemäßen Antikörper oder Antikörperfragmente können zur (i) Dia­ gnose und/oder Behandlung von Erkrankungen, beispielsweise Hauterkrankun­ gen, und/oder (ii) Diagnose und/oder Behandlung bei der Wundheilung, oder (iii) Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen verwendet werden.

So kann beispielsweise die lokale Injektion von monoklonalen Antikörpern gegen TGF beta 1 im Tiermodell die Wundheilung verbessern (Ernst et al., 1996, Gut 39: 172-5).

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Arz­ neimittels zur (i) Behandlung von Erkrankungen, beispielsweise Hauterkrankun­ gen, und/oder (ii) Behandlung bei der Wundheilung, bei dem mindestens eine Nukleinsäure, mindestens ein Polypeptid oder mindestens ein Antikörper, wie vorangehend beschrieben, zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen kombiniert wird.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein nach diesem Verfahren herge­ stelltes Arzneimittel zur (i) Behandlung von Erkrankungen, beispielsweise Hau­ terkrankungen und/oder (ii) Behandlung bei der Wundheilung, das mindestens eine Nukleinsäure, mindestens ein Polypeptid oder mindestens einen Antikörper, wie vorangehend beschrieben, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen, enthält. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung dieses Arzneimittels zur Behandlung von Erkrankungen, beispielsweise Hauterkrankun­ gen, und/oder bei der Wundheilung.

Die Therapie von Erkrankungen, beispielsweise Hauterkrankungen, und/oder bei der Wundheilung, kann mittels der erfindungsgemäßen Arzneimittel über orale Dosierungsformen, wie z. B. Tabletten oder Kapseln, über die Schleimhäute, zum Beispiel der Nase oder der Mundhöhle, oder in Form von unter die Haut implan­ tierten Dispositorien erfolgen. Transdermale therapeutische Systeme (TTS) sind zum Beispiel aus den EP 0 944 398, EP 0 916 336, EP 0 889 723 oder EP 0 852 493 bekannt.

Die Therapie kann jedoch auch, z. B. durch Verbände, Pflaster, Kompressen oder Gele erfolgen, die die erfindungsgemäßen Arzneimittel enthalten. Diese Therapie ist beispielsweise bei der Behandlung von Hauterkrankungen und/oder bei der Wundheilung bevorzugt. So ist es möglich, die geeignete Zusatz- oder Hilfsstoffe, wie z. B. physiologische Kochsalzlösung, entmineralisiertes Wasser, Stabilisato­ ren, Proteinaseinhibitoren, Gelformulierungen, wie z. B. weiße Vaseline, dünn­ flüssiges Paraffin und/oder gelbes Wachs, etc., enthaltenden Arzneimittel topisch und lokal zu verabreichen, um die Wundheilung sofort und unmittelbar zu beein­ flussen. Die Verabreichung der erfindungsgemäßen Arzneimittel kann weiterhin gegebenenfalls in Form von Liposomenkomplexen bzw. Goldpartikelkomplexen ebenfalls topisch und lokal im Bereich der Wunde erfolgen. Weiterhin kann die Behandlung mittels eines TTS erfolgen, das eine zeitlich gesteuerte Abgabe der erfindungsgemäßen Arzneimittel ermöglicht.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Diagnostikums zur (i) Diagnose von Erkrankungen, beispielsweise Hauterkran­ kungen und/oder zur (ii) Diagnose bei der Wundheilung, das dadurch gekenn­ zeichnet ist, daß mindestens eine Nukleinsäure, mindestens ein Polypeptid oder mindestens ein Antikörper, wie vorangehend beschrieben, gegebenenfalls zu­ sammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen, verwendet wird.

Beispielsweise kann gemäß der vorliegenden Erfindung anhand einer der be­ schriebenen Nukleinsäure ein Diagnostikum auf der Basis der Polymeraseketten­ reaktion (Beispiel 2, PCR-Diagnostik, z. B. gemäß EP 0 200 362) oder eines RNase-Protection-Assays (siehe z. B. Sambrook et al., supra Kapitel 7, Seite 7.71-­ 7.78; Werner et al., 1992, Growth Factors and Receptors: A Practical Approach 175-197; Werner, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 6896-6900) hergestellt werden. Diese Tests beruhen auf der spezifischen Hybridisierung einer Nuklein­ säure mit ihrem komplementären Gegenstrang, üblicherweise der entsprechenden mRNA oder ihrer cDNA. Die vorangehend beschriebenen Nukleinsäuren können hierbei auch modifiziert sein, wie z. B. in EP 0 063 879 offenbart. Vorzugsweise wird ein solches DNA-Fragment mittels geeigneter Reagenzien, z. B. radioaktiv mit α-P³²-dCTP oder nicht-radioaktiv mit Biotin oder Digoxigenin, nach allge­ mein bekannten Methoden markiert und mit isolierter RNA, die vorzugsweise vorher an geeignete Membranen aus z. B. Cellulose oder Nylon gebunden wurde, inkubiert. Bei gleicher Menge an untersuchter RNA aus jeder Gewebeprobe kann somit die Menge an mRNA bestimmt werden, die spezifisch durch die Sonde markiert wurde. Alternativ kann die Bestimmung der mRNA Menge auch direkt in Gewebeschnitten mit Hilfe der in situ Hybridisierung (siehe z. B. Werner et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 6896-900) erfolgen.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Diagnostikums kann somit auch in vitro die Expressionsstärke des jeweiligen Gens in einer Gewebeprobe spezifisch gemessen so werden, um beispielsweise eine Wundheilungsstörung oder dermatologische Erkrankungen sicher diagnostizieren zu können (Beispiele 1 bis 3). Insbesondere eignet sich ein solches Verfahren zur frühzeitigen Prognose von Störungen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Diagnostikum zur (i) Diagnose von Erkrankungen, beispielsweise Hauterkrankungen und/oder zur (ii) Diagnose bei der Wundheilung, das mindestens eine Nukleinsäure, minde­ stens ein Polypeptid oder mindestens einen Antikörper, wie vorangehend be­ schrieben, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen, umfaßt.

Ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Diagnostikum enthält das beschriebene Poly­ peptid bzw. die oben näher beschriebenen immunogenen Teile davon. Das Poly­ peptid bzw. die Teile davon, die vorzugsweise an eine Festphase, z. B. aus Ni­ trocellulose oder Nylon, gebunden sind, können beispielsweise mit der zu unter­ suchenden Körperflüssigkeit, z. B. Wundsekret, in vitro in Berührung gebracht werden, um so beispielsweise mit Autoimmunantikörper reagieren zu können. Der Antikörper-Peptid-Komplex kann anschließend beispielsweise anhand markierter Antihuman-IgG- oder Antihuman-IgM-Antikörper nachgewiesen werden. Bei der Markierung handelt es sich beispielsweise um ein Enzym, wie Peroxidase, das eine Farbreaktion katalysiert. Die Anwesenheit und die Menge an anwesenden Autoimmunantikörper kann somit über die Farbreaktion leicht und schnell nach­ gewiesen werden.

Ein weiteres Diagnostikum, das Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, ent­ hält die erfindungsgemäßen Antikörper selbst. Mit Hilfe dieser Antikörper kann beispielsweise eine Gewebeprobe leicht und schnell dahingehend untersucht wer­ den, ob das betreffende Polypeptid in einer erhöhten Menge vorhanden ist, um dadurch einen Hinweis auf eine mögliche Erkrankung, beispielsweise Hauter­ krankungen und Wundheilungsstörungen zu erhalten. In diesem Fall sind die er­ findungsgemäßen Antikörper beispielsweise mit einem Enzym, wie oben bereits beschrieben, markiert. Der spezifische Antikörper-Peptid-Komplex kann dadurch leicht und schnell über eine enzymatische Farbreaktion nachgewiesen werden.

Ein weiteres erfindungsgemäßes Diagnostikum umfaßt eine Sonde, vorzugsweise eine DNA-Sonde, und/oder Primer. Dies eröffnet eine weitere Möglichkeit, die beschriebenen Nukleinsäuren, zum Beispiel durch die Isolierung aus einer geeig­ neten Genbank, beispielsweise aus einer wundspezifischen Genbank, anhand einer geeigneten Sonde zu erhalten (siehe z. B. J. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning. A Laboratory Manual 2^nd edn., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY Kapitel 8 Seite 8.1 bis 8.81, Kapitel 9 Seite 9.47 bis 9.58 und Kapitel 10 Seite 10.1 bis 10.67).

Als Sonde eignen sich beispielsweise DNA- oder RNA-Fragmente mit einer Län­ ge von ca. 100-1000 Nukleotiden, vorzugsweise mit einer Länge von ca. 200-500 Nukleotiden, insbesondere mit einer Länge von ca. 300-400 Nukleotiden deren Sequenz aus den Polypeptiden gemäß den SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 4 des Sequenzprotokolls und/oder anhand der cDNA Sequenzen, die im Sequenzproto­ koll gemäß einer SEQ ID Nr. 5 bis SEQ ID Nr. 8 aufgelistet sind, abgeleitet wer­ den kann.

Alternativ können anhand der abgeleiteten Nukleinsäuresequenzen Oligonukleoti­ de synthetisiert werden, die sich als Primer für eine Polymerase Kettenreaktion eignen. Mit diesen kann die vorangehend beschriebene Nukleinsäure oder Teile dieser aus cDNA, beispielsweise wundspezifischer cDNA, amplifiziert und iso­ liert werden (Beispiele 2 und 3). Als Primer eignen sich beispielsweise DNA- Fragmente mit einer Länge von ca. 10 bis 100 Nukleotiden, vorzugsweise mit einer Länge von ca. 15 bis 50 Nukleotiden, insbesondere mit einer Länge von 20 bis 30 Nukleotiden deren Sequenz aus den Polypeptiden gemäß den SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 4 des Sequenzprotokolls und/oder anhand der cDNA Sequenzen, die im Sequenzprotokolls gemäß einer SEQ ID Nr. 5 bis SEQ ID Nr. 8 aufgelistet sind, abgeleitet werden kann.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung des erfindungs­ gemäßen Diagnostikums zur (i) Diagnose von Erkrankungen, beispielsweise Hauterkrankungen, und/oder (ii) Diagnose bei der Wundheilung.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung ei­ nes Tests zur Auffindung von Interaktoren (i) in Zusammenhang mit Erkrankun­ gen, beispielsweise Hauterkrankungen und/oder (ii) in Zusammenhang mit Wundheilung, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Nukleinsäure, min­ destens ein Polypeptids oder mindestens ein Antikörper oder Antikörperfragment, wie vorangehend beschrieben, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen, zur Herstellung des Tests verwendet wird.

Unter dem Begriff "Interaktoren" im Sinne der vorliegenden Erfindung sind alle diejenigen Moleküle, Verbindungen und/oder Zusammensetzungen und Stoffge­ mische zu verstehen, die mit den vorangehend beschriebenen Nukleinsäuren, Po­ lypeptiden, Antikörpern oder Antikörperfragmenten, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen, unter geeigneten Bedingungen in Wech­ selwirkung treten können. Mögliche Interaktoren sind einfache chemische organi­ sche oder anorganische Moleküle oder Verbindungen, können aber auch Peptide, Proteine oder Komplexe davon umfassen. Die Interaktoren können aufgrund ihrer Wechselwirkung die Funktion(en) der Nukleinsäuren, Polypeptide, Antikörper oder Antikörperfragmente in vivo oder in vitro beeinflussen oder auch nur an die vorangehend beschriebenen Nukleinsäuren, Polypeptiden, Antikörpern oder Anti­ körperfragmenten binden oder mit ihnen andere Wechselwirkungen kovalenter oder nicht-kovalenter Weise eingehen.

Die Erfindung umfaßt weiterhin einen erfindungsgemäß hergestellten Test zur Identifizierung von Interaktoren (i) in Zusammenhang mit Erkrankungen, insbe­ sondere Hauterkrankungen, und/oder (ii) in Zusammenhang mit Wundheilung, der mindestens eine Nukleinsäure, mindestens ein Polypeptid oder mindestens einen Antikörper oder Antikörperfragment gemäß der vorliegenden Erfindung, gegebe­ nenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen, umfaßt.

Ein geeignetes System läßt sich beispielsweise durch die stabile Transformation von Zellen, beispielsweise epidermalen bzw. dermalen Zellen, mit Expressions­ vektoren, die selektierbare Markergene und die beschriebenen Nukleinsäuren ent­ halten, herstellen. Bei diesem Verfahren wird die Expression der beschriebenen Nukleinsäuren in den Zellen so verändert, daß sie der pathologisch gestörten Ex­ pression in vivo entspricht. Auch anti-sense Oligonukleotide, die die beschriebe­ nen Nukleinsäure enthalten, können zu diesem Zweck eingesetzt werden. Von besonderem Vorteil für diese Systeme ist es daher, das Expressionsverhalten der Gene bei gestörten regenerativen Prozessen, wie in dieser Anmeldung offenge­ legt, zu kennen. Oft kann so das pathologische Verhalten der Zellen in vitro nach­ geahmt werden und es können Substanzen gesucht werden, die das normale Ver­ halten der Zellen wieder herstellen und die ein therapeutisches Potential besitzen.

Für diese Testsysteme eignen sich z. B. HaCaT-Zellen, die allgemein erhältlich sind, und der Expressionsvektor pCMV4 (Anderson et al., 1989, J. Biol. Chem. 264: 8222-9). Die vorangehend beschriebene Nukleinsäure kann dabei sowohl in sense als auch in anti-sense Orientierung in die Expressionsvektoren integriert werden, so daß die funktionelle Konzentration an mRNA der entsprechenden Ge­ ne in den Zellen entweder erhöht, oder durch Hybridisierung mit der antisense- RNA erniedrigt wird. Nach der Transformation und Selektion stabiler Transfor­ manden zeigen die Zellen in Kultur im allgemeinen ein verändertes Proliferations-, Migrations, und/oder Differenzierungsverhalten im Vergleich zu Kontrollzellen. Dieses Verhalten in vitro ist häufig mit der Funktion der entsprechenden Gene bei regenerativen Prozessen im Organismus korreliert (Yu et al., 1997, Arch. Derma­ tol. Res. 289: 352-9; Mils er al., 1997, Oncogene 14: 15555-61; Charvat et al., 1998, Exp Dermatol 7: 184-90; Werner, 1998, Cytokine Growth Factor Rev. 9: 153-65; Mythily et al., 1999, J. Gen. Virol. 80: 1707-13) und läßt sich mit einfa­ chen und schnell durchzuführenden Tests nachweisen, so daß man darauf basierend Testsysteme für pharmakologisch aktive Substanzen aufbauen kann. So läßt sich das Proliferationsverhalten von Zellen sehr schnell durch z. B. den Einbau von markierten Nukleotiden in die DNA der Zellen (siehe z. B. Savino und Dar­ denne, 1985, J. Immunol. Methods 85: 221-6; Perros und Weightman, 1991, Cell Prolif. 24: 517-23; de Fries und Mitsuhashi, 1995, J. Clin. Lab. Anal. 9: 89-95), durch Anfärbung der Zellen mit spezifischen Farbstoffen (Schulz et al., 1994, J. Immunol. Methods 167: 1-13) oder über immunologische Verfahren (Frahm et al., 1998, J. Immunol. Methods 211: 43-50) nachweisen. Die Migration läßt sich ein­ fach durch den "Migration Index" Test (Charvat et al., supra) und vergleichbare Testsysteme (Benestad et al., 1987, Cell Tissue Kinet. 20: 109-19, Junger et al., 1993, J. Immunol. Methods 160: 73-9) nachweisen. Als Differenzierungsmarker eignen sich z. B. Keratin 6, 10 und 14 sowie Loricrin und Involucrin (Rosenthal et al., 1992, J. Invest. Dermatol. 98: 343-50), deren Expression z. B. über allgemein erhältliche Antikörper leicht nachzuweisen ist.

Ein anderes geeignetes Testsystem basiert auf der Identifikation von Interaktionen mit dem sogenannten "Two-Hybrid System" (Fields und Sternglanz, 1994, Trends in Genetics, 10, 286-292; Colas und Brent, 1998 TIBTECH, 16, 355-363). Bei diesem Test werden Zellen mit Expressionsvektoren transformiert, die Fusions­ proteine aus dem vorangehend beschriebenen Polypeptid und einer DNA- Bindungsdomäne eines Transkriptionsfaktors wie beispielsweise Gal4 oder LexA exprimieren. Die transformierten Zellen enthalten außerdem ein Reportergen, des­ sen Promotor Bindungsstellen für die entsprechende DNA Bindungsdomäne ent­ halten. Durch Transformation eines weiteren Expressionsvektors, der ein zweites Fusionsprotein aus einem bekannten bzw. unbekannten Polypeptid mit einer Akti­ vierungsdomäne, beispielsweise von Gal4 oder Herpes simplex Virus VP16, ex­ primiert, kann die Expression des Reportergens stark gesteigert werden, wenn das zweite Fusionsprotein mit dem vorangehend beschriebenen Polypeptid interagiert. Diese Expressionssteigerung kann man ausnutzen, um neue Interaktoren zu identi­ fizieren, beispielsweise indem man zur Konstruktion des zweiten Fusionsproteins eine cDNA-Bibliothek aus sich regenerierenden Gewebe herstellt. Zudem läßt sich dieses Testsystem zum Screening von Substanzen ausnutzen, die eine Inter­ aktion zwischen dem vorangehend beschriebenen Polypeptid und einem Interaktor inhibieren. Solche Substanzen verringern die Expression des Reportergens in Zellen, die Fusionsproteine des vorangehend beschriebenen Polypeptids und des Intreraktors exprimieren (Vidal und Endoh, 1999, Trends in Biotechnology, 17: 374-81). So lassen sich schnell neue Wirkstoffe identifizieren, die zur Therapie von Störungen beispielsweise regenerativer Prozesse eingesetzt werden können.

Interaktoren der vorangehend beschriebenen Polypeptide können auch Nuklein­ säuren sein, die über Selektionsverfahren, wie beispielsweise SELEX (siehe Jaya­ sena, 1999, Clin. Chem. 45: 1628-50; Klug und Famulok, 1994, M. Mol. Biol. Rep. 20: 97-107; Toole et al., 1996, US 5,582,981) isoliert wereden. Im SELEX- Verfahren werden typischerweise aus einem großen Pool unterschiedlicher, ein­ zelsträngige RNA Moleküle durch wiederholte Amplifikation und Selektion die­ jenigen Moleküle isoliert, die an ein Polypeptid mit hoher Affinität binden (Aptamere). Aptamere können auch in ihrer spiegelbildlichen Form, beispielswei­ se als L-Ribonukleotid, synthetisiert und selektioniert werden (Nolte et al., 1996, Nat. Biotechnol. 14: 1116-9; Klussmann et al., 1996, Nat. Biotechnol. 14: 1112-5). So isolierte Formen haben den Vorteil, das sie nicht von natürlich vorkommenden Ribonukleasen abgebaut werden und daher größere Stabilität besitzen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines auf einem Trägermaterial fixierten Arrays zur Analyse in Zusammenhang mit Erkran­ kungen, beispielsweise Hauterkrankungen, und/oder in Zusammenhang mit Wundheilung, bei dem mindestens eine Nukleinsäure, mindestens ein Polypeptid oder mindestens ein Antikörper oder Antikörperfragment, wie vorangehend be­ schrieben, zur Herstellung verwendet wird.

Verfahren zur Herstellung von solchen Arrays sind zum Beispiel aus der WO 89/109077, WO 90/15070, WO 95/35505 und US 5,744,305 mittels Spottings, Druckens oder Festphasenchemie in Verbindung mit photolabilen Schutzgruppen bekannt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein auf einem Trägermaterial fixiertes Array zur Analyse in Zusammenhang mit Erkrankungen, beispielsweise Hauter­ krankungen, und/oder in Zusammenhang mit Wundheilung, das dadurch gekenn­ zeichnet ist, daß es mindestens eine Nukleinsäure und/oder mindestens ein Poly­ peptid und/oder oder mindestens einen Antikörper oder Antikörperfragment, wie vorangehend beschrieben, umfaßt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines DNA-Chips und/oder Protein-Chips zur Analyse in Zusammenhang mit Erkran­ kungen und/oder in Zusammenhang mit Wundheilung, das dadurch gekennzeich­ net ist, daß mindestens eine Nukleinsäure, mindestens ein Polypeptid oder minde­ stens ein Antikörper oder Antikörperfragment, wie vorangehend beschrieben, zur Herstellung verwendet wird.

Verfahren zur Herstellung solcher DNA-Chips und/oder Protein-Chips sind zum Beispiel aus der WO 89/109077, WO 90/15070, WO 95/35505 und US 5,744,305 mittels Spottings, Druckens oder Festphasenchemie in Verbindung mit photola­ bilen Schutzgruppen bekannt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung umfaßt einen DNA-Chip und/oder Prote­ in-Chip zur Analyse in Zusammenhang mit Erkrankungen, beispielsweise Hauter­ krankungen und/oder in Zusammenhang mit Wundheilung, der mindestens eine Nukleinsäure, mindestens ein Polypeptid, und/oder mindestens einen Antikörper oder Antikörperfragment, wie vorangehend beschrieben, umfaßt. DNA-Chips sind zum Beispiel aus der US 5,837,832 bekannt.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Arzneimittel zur Indika­ tion und Therapie, das eine Nukleinsäure oder ein Polypeptid oder einen Antikörper oder ein Antikörperfragment, wie vorangehend beschrieben, und gegebenen­ falls geeignete Zusatz- oder Hilfsstoffe enthält und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Arzneimittels zur Behandlung von Erkrankungen, beispielsweise Hauterkrankungen, und/oder bei der Wundheilung, bei dem eine Nukleinsäure oder ein Polypeptid, wie vorangehend beschrieben, mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger formuliert wird.

Für die gentherapeutische Anwendung bei Hauterkrankungen und/oder der Wundheilung, beispielsweise einer gestörten Wundheilung beim Menschen ist vor allem ein Arzneimittel geeignet, das die beschriebenen Nukleinsäure in nackter Form oder in Form eines der oben beschriebenen gentherapeutisch wirksamen Vektoren oder in mit Liposomen bzw. Goldpartikeln komplexierter Form enthält. Der pharmazeutische Träger ist beispielsweise eine physiologische Pufferlösung, vorzugsweise mit einem pH von ca. 6,0-8,0, vorzugsweise von ca. 6,8-7,8. Insbe­ sondere von ca. 7,4 und/oder einer Osmolarität von ca. 200-400 milliosmol/Liter, vorzugsweise von ca. 290-310 milliosmol/Liter. Zusätzlich kann der pharmazeuti­ sche Träger geeignete Stabilisatoren, wie z. B. Nukleaseinhibitoren, vorzugsweise Komplexbildner wie EDTA und/oder andere dem Fachmann bekannte Hilfsstoffe enthalten.

Die Verabreichung der beschriebenen Nukleinsäure gegebenenfalls in Form der oben näher beschriebenen Virusvektoren oder als Liposomenkomplexe bzw. Goldpartikelkomplex erfolgt üblicherweise topisch und lokal im Bereich der Wunde. Es ist auch möglich, das Polypeptid selbst mit geeigneten Zusatz- oder Hilfsstoffen, wie z. B. physiologische Kochsalzlösung, entmineralisiertes Wasser, Stabilisatoren, Proteinaseinhibitoren, Gelformulierungen, wie z. B. weiße Vaseli­ ne, dünnflüssiges Paraffin und/oder gelbes Wachs, etc., zu verabreichen, um die Wundheilung sofort und unmittelbar zu beeinflussen.

Allgemein ist die Analyse von differentiell exprimierten Genen in Geweben mit deutlich mehr Fehlern in Form von falsch positiven Klone behaftet, als bei der Analyse von Zellkultursystemen. Da beispielsweise bei der Wundheilung eine Vielzahl von verschiedenen Zelltypen beteiligt sind, deren Zusammensetzung und deren Genexpressionsmuster sich während des gesamten Wundheilungsprozesses ständig ändert, ergibt sich hier bei der Analyse von differentiell exprimierten Ge­ nen eine besonders niedrige Trefferquote. Diese kann nicht durch die Verwendung eines definierten Zellkultursystems umgangen werden, da ein solches auf Grund der Komplexität der Wundheilung nicht zur Verfügung steht. Zudem gibt es enorme Variabilitäten des Wundzustands zum Zeitpunkt einer möglichen Biopsie des Patienten beim Erstkontakt mit dem Arzt.

Daher wurde zur Identifikation der vorangehend beschriebenen Nukleinsäuren ein Tiermodell verwendet. Es wurden BALB/c Mäuse verwundet und zu verschiede­ nen Zeitpunkten Wundbiopsien entnommen. Dieses Verfahren hat den Vorteil, das sich die Randbedingungen wie genetischer Hintergrund, Art der Wunde, Zeit­ punkt der Biopsie etc. exakt kontrollieren lassen und so erst eine reproduzierbare Analyse der Genexpression erlauben. Selbst unter den definierten Maus- Bedingungen ergeben sich weitere methodische Probleme wie Redundanz der analysierten Klone und Unterrepräsentation von schwach exprimierten Genen, die die Identifikation von relevanten Genen erschweren.

Bei der vorliegenden Analyse der Genexpression konnte SW1368 durch subtrak­ tive Hybridisierung als wundreguliert identifiziert werden: in einer cDNA- Population, die durch Subtraktion von 1 Tages Wunden gegen intakte Haut ge­ wonnen wurde, konnte SW1368 angereichert werden (Beispiel 1).

Nach der primären Identifikation der Gene ist es notwendig, die wundheilungs­ spezifische Expression durch eine weitere Methode zu bestätigen. Dies erfolgte mit Hilfe von sogenannten "Reverse Northern Blots" oder "TaqMan Assays". Mit diesen Methoden wurde die Menge an mRNA in Gewebeextrakten aus verschie­ denen Wundheilungszuständen von 10 Wochen alten Mäusen und/oder von alten und jungen Mäusen und/oder von Mäusen mit Diabetes bestimmt. So konnte die wundspezifische Expression von SW 1368 in einer subtraktiven cDNA Bibliothek mit Hilfe eines "Reverse Northern Blots" verifiziert werden (Beispiel 1, Fig. 1). Zudem konnte mittels des "TaqMan Assays" die stark erhöhte Expression von SW1368 in normal heilenden Wunden von Mäusen als auch in Wunden von alten und jungen Mäusen im Vergleich zu intakter Haut quantifiziert werden (Beispiel 2; Fig. 2). Zudem wurde sowohl für SW1368 als auch für SW1695, das über seine hohe Sequenzhomologie zu SW1368 mittels PCR unter Verwendung dege­ nerierter Primer gefunden wurde, eine veränderte Expression bei anderen Wund­ heilungsprozessen in Maus nachgewiesen (Fig. 2 und Fig. 3). Während SW1368 in Wunden von Mäusen mit Diabetes um 50% schwächer exprimiert wird als in Wunden von Kontrollmäusen, konnte eine 3-fach stärkere Expression von SW1695 in schlecht heilenden Wunden von mit Dexamethason-behandelten Tieren im Vergleich zu Wunden von Kontrolltieren beobachtet werden. Dies ver­ deutlicht, daß die regulierte Expression der erfindungsgemäß verwendeten Gen­ familie nicht nur während der normalen Wundheilung eine Rolle spielt, sondern auch für die Verhinderung krankhafter Wundheilungsverläufe notwendig ist. Die Bedeutung der erfindungsgemäß verwendeten Genfamilie konnte zudem durch "TaqMan Analyse" von humanen 1-Tages und 5-Tages Wunden untermauert werden, bei denen eine deutliche Reduktion der Expression von SW1695 nach­ gewiesen werden konnte. Durch diese Experimente konnte zum ersten Mal ge­ zeigt werden, daß die vorangehend beschriebenen Polypeptide und die sie kodie­ renden Nukleinsäuren bei verschiedenen Erkrankungensverläufen differentiell reguliert werden und daß sie daher für einen normalen Heilungsprozeß essentiell sind.

Zur Überprüfung bzw. Generierung von Vollängen cDNA Sequenzen der voran­ gehend beschriebenen Nukleinsäuren wurden Vollängen-Klone mit Hilfe von Kolonie-Hybridisierung (Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, Kapitel 8-10) und/oder PCR basierten Methoden ("RACE", Frohman et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8998-9002, Chenchik et al., 1996, in A Laboratory Guide to RNA: Isolation, Analysis, and Synthesis, Ed. Krieg, Wiley-Liss, Seiten 272-321; "LDPCR", Barnes, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2216-20; "IPCR", Hartl und Ochman, 1994, Methods Mol. Biol., 31: 187-196) sowohl für die Maus-Gene als auch für die menschlichen Gene generiert und die Sequenz diese Klone bestimmt.

Die Erfindung soll nun im folgenden anhand der Figuren und Beispiele weiter verdeutlicht werden, ohne daß die Erfindung hierauf eingeschränkt wird.

Beschreibung der Tabellen, Figuren und Sequenzen

Fig. 1. Autoradiogramme von Hybridisierungen von Membranen mit glei­ chem Muster von aufgebrachten cDNA-Fragmenten mit zwei ver­ schiedenen Sonden. Die cDNA Fragmente entstammten alle einer wundspezifischen, subtraktiven cDNA-Bibliothek, die für solche cDNAs angereichert war, die in normal heilendem Wundgewebe stär­ ker im Vergleich zur intakten Haut exprimiert wurden. Beide Sonden wurden aus cDNAs hergestellt, die aus subtraktiven Hybridisierungen stammten. A: hautspezifische Sonde (Subtraktion intakte Haut versus normal heilende Wunde) B: wundspezifische Sonde (Subtraktion normal heilende Wunde versus intakte Haut). Die Positionen der SW1368 cDNAs (jeweils doppelt aufgetragen) sind mit Pfeilen ge­ kennzeichnet.

Fig. 2 Tabellarische Aufstellung der veränderten Expression der wundhei­ lungsrelevanten Gene SW1368 und SW1695 in normal heilenden Wunden und in mit Dexamethason-behandelten, schlecht heilenden Wunden von 10 Wochen alten BALB/c Mäusen als auch in Wunden von jungen (4 Wochen) und alten (12 Monate) BALB/c Mäusen.

Fig. 3 Tabellarische Aufstellung der veränderten Expression der wundhei­ lungsrelevanten Gene SW1368 und SW1695 in Mäusen mit Diabetes und in Kontrolltieren.

Fig. 4 Tabellarische Übersicht über die bei der Analyse der Genexpression während des Wundheilungsprozesses identifizierten Polypeptidse­ quenzen der Genfamilie und ihre cDNAs.

Fig. 5 Vergleich der Polypeptidsequenz der identifizierten Proteine von SW1368 aus Maus und Mensch. Exakte Übereinstimmungen der Maus Sequenz von SW1368 mit der humanen Sequenz von SW1368 sind markiert.

Fig. 6 Vergleich der Polypeptidsequenz der identifizierten Proteine von SW1695 aus Maus und Mensch. Exakte Übereinstimmungen der Maus Sequenz von SW1695 mit der humanen Sequenz von SW1695 sind markiert.

SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 8 zeigen die erfindungsgemäß verwendeten Poly­ peptid- oder cDNA-Sequenzen aus Mensch oder Maus.

SEQ ID Nr. 9 bis SEQ ID Nr. 14 und SEQ ID Nr. 16 bis SEQ ID Nr. 17 zeigen DNA-Sequenzen von Oligonukleotiden, die für die Versuche der vorliegenden Erfindung verwendet wurden.

SEQ ID Nr. 15 zeigt die Teilsequenz der erfindungsgemäß verwendenten cDNA gemäß einer SEQ ID Nr. 1, die durch Sequenzieren eines als reguliert identifi­ zierten Klons in der "Reverse Northern Blot Analyse" ermittelt wurde.

Beispiele Beispiel 1 Anreicherung von wundrelevanter cDNA mittels subtraktiver Hybridi­ sierung und Identifizierung von SW1368 als wundrelevantes Gen

Aus intakter Haut und aus Wundgewebe (Verwundung am Rücken 1 Tag vor Ge­ webeentnahme durch Scherenschnitt) von BALB/c Mäusen wurde durch Stan­ dardmethoden (Chomczynski und Sacchi, 1987, Anal. Biochem. 162: 156-159, Chomczynski und Mackey, 1995, Anal. Biochem. 225: 163-164) Gesamt-RNA isoliert. Die RNAs wurden dann mit Hilfe einer reversen Transkriptase in cDNA umgeschrieben. Die cDNA Synthese erfolgte mit dem "SMART PCR cDNA Synthesis Kit" der Firma Clontech Laboratories GmbH, Heidelberg, nach Anwei­ sungen des entsprechenden Manuals.

Um diejenigen cDNAs zu identifizieren, die mit unterschiedlicher Häufigkeit in den cDNA Pools vorkamen, wurde eine subtraktive Hybridisierung (Diatchenko et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 6025-30) durchgeführt. Dies er­ folgte mit dem "PCR-Select cDNA Subtraction Kit" der Firma Clontech Labora­ tories GmbH, Heidelberg, nach Anweisungen des entsprechenden Manuals, wobei die Abtrennung überschüssiger Oligonukleotide nach der cDNA Synthese über Agarose-Gelelekrophorese erfolgte. Es wurden zwei für wundrelevante Gene an­ gereicherte cDNA Pools angelegt, wobei ein Pool für cDNA Fragmente angerei­ chert war, die im normal heilenden Wundgewebe im Vergleich zu intakter Haut stärker exprimiert sind ("wundspezifischer cDNA Pool"), während der andere Pool an cDNA Fragmenten angereichert war, die in intakter Haut im Vergleich zu normal heilendem Wundgewebe stärker exprimiert sind ("hautspezifischer cDNA Pool").

Um diejenigen Gene zu identifizieren, die in den wundheilungsrelevanten cDNA- Pools enthalten waren, wurde das Vorhandensein der entsprechenden cDNAs in den Pools im "Reverse Northern Blot" analysiert. Hier werden cDNA-Fragmente auf Membranen in Form von Arrays von vielen verschiedenen cDNAs fixiert, und mit einem komplexen Gemisch radioaktiv markierter cDNA hybridisiert (Sam­ brook et al., 1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, kapitel 9 Seite 9.47 bis 9.58 und kapitel 10 Seite 10.38 bis 10.50; Anderson and Young: Quantitative filter hybridi­ sation; in: Nucleic Acids Hybridisation, A Practical Approach, 1985, Eds. Hames and Higgins, IRL Press Ltd.; Oxford, Kapitel 4, Seite 73 bis 112). Auf den in die­ sem Beispiel verwendeten Membranen waren cDNA-Fragmente fixiert, die einer wundspezifischen, subtraktiven cDNA-Bibliothek entstammen, die für solche cDNAs angereichert war, die in normal heilendem Wundgewebe stärker im Ver­ gleich zur intakten Haut exprimiert wurden.

Zur Herstellung geeigneter Hybridisierungssonden wurden die subtrahierten cDNA Pools mit der Restriktionsendonuklease RsaI behandelt und über Agarose­ gelelektrophorese gereinigt (Sambrook et al., supra, Kapitel 6, Seite 6.1 bis 6.35), um die cDNA- Synthese- und Amplifikationsprimer (siehe Manual "PCR-Select cDNA Subtraction Kit", Clonetech) abzutrennen. Die cDNAs wurde dann mit der "random-hexamer priming" Methode (Feinberg und Vogelstein, 1983, Anal. Bio­ chem. 132: 6-13) radioaktiv markiert, um Hybridisierungssonden herzustellen.

Die Membran wurde für 30 min bei 65°C in 25 ml Hybridisierungslösung vorin­ kubiert (25 mM Natriumphosphat, pH = 7,5, 125 mM NaCl, 7% SDS). Die Hy­ bridisierungssonde wurde 10 min bei 100°C denaturiert, anschließend auf Eis ab­ gekühlt, ca. 100 CPM ("counts per minute") pro ml zur Hybridisierungslösung gegeben und die Hybridisierung für 16 Stunden bei 65°C im Hybridisierungsofen durchgeführt. Danach wurde die Membran zweimal für 10 min mit der Hybridi­ sierungslösung ohne Sonde bei 65°C gewaschen. Anschließend wurde die Mem­ bran mehrfach für jeweils 10 min in Waschlösung (2,5 mM Natriumphosphat, pH = 7,5, 12,5 mM NaCl, 0,7% SDS) bei 65°C gewaschen, bis in der abgegossenen Lösung keine Aktivität mehr nachgewiesen werden konnte. Die radioaktiven Si­ gnale wurden mit einem Phosphoimager (BioRad, Quantitiy One®) und nachfol­ gender Analyse mittels Array Vision 4.0 (Imaging Research Inc.) ausgewertet. Dabei wurde eine Maske definiert, durch die Länge und Breite der Felder als auch der Durchmesser der Spotpositionen bestimmt wurde. Die Autoradiographie mit überlagerter Maske ist in Fig. 1 dargestellt. Die Normierung der Signalintensi­ täten erfolgte über die Auswertung der Positivkontrolle, die aus LPHR cDNA aus Hefe bestand. Diese DNA wurde an definierten Positionen des Arrays gespottet und durch Zugabe einer geeigneten Sonde zu der Hybridisierungssonde des wundspezifischen bzw. des hautspezifischen cDNA-Pools quantifiziert. Es wur­ den diejenigen cDNAs ausgewählt, die mit den verwendeten Sonden unterschied­ liche normierte Signalintensitäten ergaben. Dabei ergab sich an den Positionen von SW1368 auf der Membran eine deutlich stärkere Signalintensität mit der Hy­ bridisierungssonde des wundspezifischen cDNA Pools (Fig. 1B) im Vergleich zum hautspezifischen cDNA Pool (Fig. 1A). Die Sequenzierung des Klons (Seq ID Nr. 15) und Analyse der Sequenz von 653 Basenpaar Länge ergaben, daß es sich um einen bislang unbekannten GPCR handelt.

Beispiel 2 Verifikation des Expressionsmusters von SW1368 mittels "real time quantitative RTPCR"

Eine Verifikation der differentiellen Expression der vorangehend beschriebenen Nukleinsäuren als auch die Untersuchung weiterer Wundheilungszustände er­ folgte über eine real-time RTPCR im ABI Prism 7700 Sequence Detection Sy­ stem (PE Applied Biosystems). Das Gerät war mit der ABI Prism 7200/7700 SDS-Software Version 1.6.3 (1998) ausgestattet. Der Nachweis von PCR Pro­ dukten erfolgte während der Amplifikation der cDNA mit Hilfe des Farbstoffs SYBR Green 1, dessen Fluoreszenz durch Bindung an doppelsträngige DNA stark erhöht wird (Karlsen et al. 1995, J. Virol. Methods. 55: 153-6; Wittwer et al., 1997, BioTechniques 22: 130-8, Morrison et al., 1998, BioTechniques 24: 954-­ 62). Basis für die Quantifizierung ist der PCR Zyklus ("threshold cycle", CT- Wert), der erreicht ist, wenn das Fluoreszenzsignal einen definierten Schwellen­ wert übersteigt. Die Auswertung erfolgt über die Δ-CT-Methode (User Bulletin #2, Relative Quantitation of Gene Expression, PE Applied Biosystems, 1997). Die Abundanzen der cDNAs wurden relativ zu einer endogenen Referenz (GAPDH) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 und 3 dargestellt.

Um Gewebe von Mäusen mit schlecht heilenden Wunden zu gewinnen, wurden BALB/c Mäuse vor der Verwundung mit Dexamethason (Injektion von 0,5 mg Dexamethason in isotonischer Salzlösung pro kg Körpergewicht zwei mal pro Tag für 5 Tage) behandelt. Um Gewebe von jungen und alten Mäusen zu gewinnen, wurden 1-Tageswunden von 4 Wochen alten und 12 Monate alten BALB/c Mäu­ sen verwendet. Um Wundgewebe von Mäusen mit Diabetes zu erhalten, wurden 1 Tageswunden von 10 Wochen alten C57BL/Ks-db/db/Ola Mäusen verwendet. Als Kontrolltiere wurden in diesem Fall 10 Wochen alte C57BL/Ks Mäuse verwendet. Gesamt-RNA wurde wie oben beschrieben aus Haut und Wundgewebe gewonnen und 1 µg Gesamt-RNA wurde mit dem TaqMan Reverse Transcription Reagents Kit (Perkin Eimer) nach den Empfehlungen des Herstellers (SYBR Green PCR and RT-PCR Reagents-Protokol, Perkin Eimer Applied Biosystems, 1998) in ei­ nem Thermocycler (GeneAmp PCR-System 9700, PE) revers transkribiert. Die Primer für die Amplifikation der SW1368 cDNA (SW1368-Primer 1: GAGGCATGTCAAATCAGTAAGCTG (SEQ ID Nr. 9), SW1368-Primer 2: GGTGGCTTTGGAGTGAGCAC (SEQ ID Nr. 10) und der Referenz (GAPDH- Primer 1: ATCAACGGGAAGCCCATCA (SEQ ID Nr. 11), GAPDH-Primer 2: GACATACTCAGCACCGGCCT (SEQ ID Nr. 12)) wurden anhand der vorange­ hend beschriebenen cDNA Sequenz von SW1368 aus Maus und der bekannten Sequenz von GAPDH aus Maus mit der Primer-Express-Software für Macintosh PPC Version 1.0 (PE Applied Biosystems, P/N 402089, 1998) ausgewählt. Für die PCR wurde das SYBR Green PCR Core Reagents Kit (4304886, PE Applied Bio­ systems) verwendet. Die Konzentration der Primer in der PCR wurde zunächst im Bereich von 50 nM bis 600 nM optimiert und die Spezifität der PCR durch Ana­ lyse der Länge der amplifizierten Produkte in einer Agarose-Gel Elekrophorese geprüft. Anschließend wurde mittels einer Verdünnungsreihe die Effizienz der PCR-Systeme ermittelt (User Bulletin #2, Relative Quantitation of Gene Expres­ sion, PE Applied Biosystems, 1997). Dabei ergab sich, daß für beide cDNAs die Effizienz der Amplifikation bei 100% lag, d. h. bei jeder 1 : 2 Verdünnung der cDNA wurde ein Zyklus mehr benötigt, um den Fluoreszensschwellenwert zu überschreiten.

Für die Quantifizierung wurden je Ansatz cDNA aus 10 ng revers transkribierter Gesamt-RNA in einem Gesamtvolumen von 25 µl amplifiziert. Die Laufbedin­ gungen für die PCR entsprachen den Angaben des Herstellers (PE Applied Biosy­ stems, SYBR Green PCR and RT-PCR Reagents Protocol, 1998). Die CT-Werte wurden analysiert und daraus wurde die Häufigkeit von SW1368 mRNA relativ zu GAPDH mRNA berechnet. Dabei bestätigte sich sowohl die Zunahme von SW1368 in normal heilenden Wunden im Vergleich zu intakter Haut von Kon­ trolltieren als auch in Wunden im Vergleich zu intakter Haut von jungen und alten Mäusen (Fig. 2, vergleiche Fig. 1). Die Analyse weiterer Wundheilungszustän­ de ergab, daß die Expression von SW1368 in schlecht heilenden Wunden von mit Dexamethason behandelten Mäusen im Vergleich zu Wunden von Kontrolltieren leicht erhöht war. Dagegen konnte eine um 50% verringerte Menge an SW1368 in Wunden von Mäusen mit Diabetes im Vergleich zu Kontrollmäusen gezeigt wer­ den (Fig. 3). Somit konnte nicht nur die wundspezifische Regulation von SW1368 bestätigt werden, sondern es konnte zusätzlich eine Rolle bei gestörter Wundheilung nachgewiesen werden (Fig. 3). Außerdem konnte gezeigt werden, daß das SW1695 wundspezifisch reguliert wird (Fig. 2). In diesem Fall wurde in schlecht heilenden Wunden von mit Dexamethason-behandelten Tieren eine 3- fach höhere Menge an SW1695 gemessen als in Wunden von Kontrolltieren. Dies verdeutlicht, daß sowohl SW1368 als auch SW1695 in verschiedenen Wundhei­ lungsprozessen reguliert werden.

Beispiel 3 Analyse des Expressionsmusters von SW1695 in humanen Wunden

Von unbehandelter intakter Haut und von unbehandelten 1- und 5-Tages Wunden von gesunden Probanden wurden mittels Stanzen 4 mm dicke Hautproben ent­ nommen. Diese wurden mittels "real time quantitative RTPCR" wie im Beispiel 2 beschrieben, untersucht. Die Primer für die Amplifikation der SW1695 cDNA (SW1695-Primer 1: TTCTTCTGCTTTGTGGCAAGG (SEQ ID Nr. 13), SW1695- Primer 2: GAAAAGGATCAGGAAGACCGG (SEQ ID Nr. 14) und der Referenz (hGAPDH-Primer 1: CATGGGTGTGAACCATGAGAAG (SEQ ID Nr. 16), hGAPDH-Primer 2: CTAAGCAGTTGGTGGTGCAGG (SEQ ID Nr. 17)) wur­ den anhand der offengelegten cDNA Sequenz von humanem SW1695 und anhand der bekannten Sequenz von humanem GAPDH ausgewählt. Für die Quantifizie­ rung wurden je Ansatz cDNA aus 10 ng revers transkribierter Gesamt-RNA in einem Gesamtvolumen von 25 µl amplifiziert. Die PCR wurde entsprechend den Angaben des Herstellers (PE Applied Biosystems, SYBR Green PCR and RT- PCR Reagents Protocol, 1998) durchgeführt. Die CT-Werte wurden analysiert und daraus wurde die Häufigkeit von SW1695 mRNA relativ zu GAPDH mRNA berechnet. Es wurde eine Abnahme von SW1695 um 60% in 1-Tageswunden im Vergleich zu intakter Haut gemessen. Diese Meßwerte stimmen mit dem im Mausmodell erhaltenen Ergebnissen überein, bei denen eine vergleichbare Ab­ nahme an murinem SW1695 in normal heilenden Wunden im Vergleich zu intak­ ter Haut von Kontrolltieren beobachtet wurde (Fig. 2). Zudem konnte in huma­ nen 5-Tageswunden eine um 70% verringerte SW1695 Expression im Vergleich zu intakter Haut nachgewiesen werden. Dies verdeutlicht, daß die SW1695 Ex­ pression nicht nur kurzfristig reguliert wird, sondern daß eine veränderte Expres­ sion über einen längeren Zeitraum für den Heilungsprozeß essentiell ist.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (33)

1. Verwendung mindestens eines Polypeptids oder einer Variante davon ge­ mäß einer der SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 4 und/oder diese kodierende Nukleinsäure oder Variante davon zur (i) Diagnose und/oder Behandlung von Erkrankungen, und/oder (ii) Diagnose und/oder Behandlung bei der Wundheilung, oder (iii) Identifizierung von pharmakologisch aktiven Sub­ stanzen.

2. Verwendung mindestens eines Polypeptids oder einer Variante davon ge­ mäß einer der SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 4 und/oder diese kodierende Nukleinsäure oder Variante davon zur Diagnose und/oder Behandlung von Hauterkrankungen.

3. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure eine DNA oder RNA, vorzugsweise eine DNA, insbe­ sondere eine doppelsträngige DNA ist.

4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz der Nukleinsäure mindestens ein Intron und/oder eine po­ lyA-Sequenz aufweist.

5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure ihre antisense-Sequenz aufweist.

6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure synthetisch hergestellt worden ist.

7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid synthetisch hergestellt worden ist.

8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1, 2, oder 7, dadurch gekennzeich­ net, daß das Polypeptid ein Fusionsprotein ist.

9. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure in einem Vektor, vorzugsweise in einem Plasmid, shuttle Vektor, Phagemid, Cosmid, Expressionsvektors oder gentherapeu­ tisch wirksamen Vektor enthalten ist.

10. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure in einem knock-out Genkonstrukt oder einer Expressi­ onskassette enthalten ist.

11. Wirtszelle, transformiert mit einem Vektor oder einem knock-out Genkon­ strukts oder einer Expressionskassette gemäß einem der Ansprüche 9 oder 10.

12. Wirtszelle nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine Hautzelle handelt.

13. Transgene embryonale nichtmenschliche Stammzelle, dadurch gekenn­ zeichnet, daß sie einen Vektor oder ein knock-out Genkonstrukt oder eine Expressionskassette gemäß einem der Ansprüche 9 oder 10 enthält.

14. Verfahren zur Herstellung eines transgenen nichtmenschlichen Säugetiers, dadurch gekennzeichnet, daß eine embryonale nichtmenschliche Stamm­ zelte gemäß Anspruch 13 zu einem transgenen nichtmenschlichen Säugetier regeneriert wird.

15. Transgenes nichtmenschliches Säugetier, dadurch gekennzeichnet, daß sein Genom einen Vektor oder ein knock-out Genkonstrukt oder eine Expressi­ onskassette gemäß einem der Ansprüche 9 oder 10 enthält.

16. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids zur (i) Diagnose und/oder Be­ handlung von Erkrankungen, und/oder (ii) Diagnose und/oder Behandlung bei der Wundheilung, oder (iii) Identifizierung von pharmakologisch akti­ ven Substanzen in einer geeigneten Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, 9 oder 10 exprimiert wird.

17. Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins zur (i) Diagnose und/oder Behandlung von Erkrankungen, und/oder (ii) Diagnose und/oder Behand­ lung bei der Wundheilung, oder (iii) Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen in einer geeigneten Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nukleinsäure gemäß einem der Anspruche 1 bis 6, 9 oder 10 ex­ primiert wird.

18. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers oder Antikörperfragments, vorzugsweise eines polyklonalen oder monoklonalen Antikörpers oder An­ tikörperfragments zur (i) Diagnose und/oder Behandlung von Erkrankun­ gen, Erkrankungen, und/oder (ii) Diagnose und/oder Behandlung bei der Wundheilung, oder (iii) Identifizierung von pharmakologisch aktiven Sub­ stanzen, dadurch gekennzeichnet, daß ein Antikörper produzierender Orga­ nismus mit einem Polypeptid oder einer Variante davon gemäß einem der Ansprüche 1, 2, 7 oder 8 immunisiert wird.

19. Antikörper oder Antikörperfragment zur (i) Diagnose und/oder Behandlung von Erkrankungen, und/oder (ii) Diagnose und/oder Behandlung bei der Wundheilung, oder (iii) Identifizierung von pharmakologisch aktiven Sub­ stanzen, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper oder das Antikörper­ fragment gegen ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1, 2, 7 oder 8 gerichtet ist.

20. Verwendung eines Antikörpers oder Antikörperfragments gemäß Anspruch 19 zur (i) Diagnose und/oder Behandlung von Erkrankungen, und/oder (ii) Diagnose und/oder Behandlung bei der Wundheilung, oder (iii) Identifizie­ rung von pharmakologisch aktiven Substanzen.

21. Verfahren zur Herstellung eines Diagnostikums zur Diagnose von Erkran­ kungen und/oder zur Diagnose bei der Wundheilung, dadurch gekennzeich­ net, daß mindestens eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, 9 oder 10, mindestens ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1, 2, 7 oder 8 oder mindestens ein Antikörper oder Antikörperfragment gemäß ei­ nem der Ansprüche 18 oder 19, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen kombiniert wird.

22. Diagnostikum zur Diagnose von Erkrankungen und/oder zur Diagnose bei der Wundheilung, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens eine Nuklein­ säure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, 9 oder 10, mindestens ein Poly­ peptid gemäß einem der Ansprüche 1, 2, 7 oder 8 oder mindestens einen Antikörper oder ein Antikörperfragment gemäß einem der Ansprüche 18 oder 19, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen, enthält.

23. Diagnostikum nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Son­ de, vorzugsweise eine DNA-Sonde, enthält.

24. Verwendung eines Diagnostikums nach einem der Ansprüche 21 bis 23 zur Diagnose von Erkrankungen und/oder zu Diagnose bei der Wundheilung.

25. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Erkran­ kungen und/oder zur Behandlung bei der Wundheilung, dadurch gekenn­ zeichnet, daß mindestens eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, 9 oder 10, mindestens ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1, 2, 7 oder 8 oder mindestens ein Antikörper oder Antikörperfragment gemäß einem der Ansprüche 18 oder 19 zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen kombiniert wird.

26. Arzneimittel zur Behandlung von Erkrankungen und/oder zur Behandlung bei der Wundheilung, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens eine Nu­ kleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, 9 oder 10, mindestens ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1, 2, 7 oder 8 oder mindestens ei­ nen Antikörper oder ein Antikörperfragment gemäß einem der Ansprüche 18 oder 19, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstof­ fen, enthält.

27. Verwendung eines Arzneimittels nach Anspruch 26 zur Behandlung von Erkrankungen und/oder zur Behandlung bei der Wundheilung.

28. Verfahren zur Herstellung eines Tests zur Auffindung von Interaktoren in Zusammenhang mit Erkrankungen und/oder in Zusammenhang mit Wund­ heilung dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, 9 oder 10, mindestens ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1, 2, 7 oder 8 oder mindestens ein Antikörper oder Antikörperfragment gemäß einem der Ansprüche 18 oder 19 zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen kombiniert wird.

29. Test zur Identifizierung von Interaktoren in Zusammenhang mit Erkrankun­ gen und/oder im Zusammenhang mit Wundheilung, dadurch gekennzeich­ net, daß er mindestens eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, 9 oder 10, mindestens ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1, 2, 7 oder 8 oder mindestens einen Antikörper oder ein Antikörperfragment ge­ mäß einem der Ansprüche 18 oder 19, gegebenenfalls zusammen mit geeig­ neten Zusatz- und Hilfsstoffen, enthält.

30. Verfahren zur Herstellung eines auf einem Trägermaterial fixierten Arrays zur Analyse in Zusammenhang mit Erkrankungen und/oder in Zusammen­ hang mit Wundheilung, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Nu­ kleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, 9 oder 10, mindestens ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1, 2, 7 oder 8 oder mindestens ein Antikörper oder Antikörperfragment gemäß einem der Ansprüche 18 oder 19 auf einem Trägermaterial fixiert wird.

31. Auf einem Trägermaterial fixiertes Array zur Analyse in Zusammenhang mit Erkrankungen und/oder in Zusammenhang mit Wundheilung, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens eine Nukleinsäure gemäß einem der An­ sprüche 1 bis 6, 9 oder 10 und/oder mindestens ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1, 2, 7 oder 8 und/oder mindestens einen Antikörper oder ein Antikörperfragment gemäß einem der Ansprüche 18 oder 19 enthält.

32. Verfahren zur Herstellung eines DNA-Chips und/oder Protein-Chips zur Analyse in Zusammenhang mit Erkrankungen und/oder in Zusammenhang mit Wundheilung, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Nuklein­ säure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, 9 oder 10, mindestens ein Poly­ peptid gemäß einem der Ansprüche 1, 2, 7 oder 8 oder mindestens ein Anti­ körper oder Antikörperfragment gemäß einem der Ansprüche 18 oder 19 auf einem Chip fixiert wird.

33. DNA-Chip und/oder Protein-Chip zur Analyse in Zusammenhang mit Er­ krankungen und/oder in Zusammenhang mit Wundheilung, dadurch ge­ kennzeichnet, daß er mindestens eine Nukleinsäure gemäß einem der An­ sprüche 1 bis 6, 9 oder 10 und/oder mindestens ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1, 2, 7 oder 8 und/oder mindestens einen Antikörper oder ein Antikörperfragment gemäß einem der Ansprüche 18 oder 19 enthält.