CH697372B1 - Verfahren mit und Verwendung von neuronalem Calcium-Sensor-1 (NCS-1). - Google Patents

Abstract

Beschrieben werden die Verwendung von NCS-1 und von entsprechenden Test auf der Basis von Zellen als Forschungs- und Arbeitsmittel für ein Verfahren zur Identifizierung und Gewinnung von Wirkstoffkandidaten für die Therapie der erwähnten Erkrankungen oder zur Verbesserung der Erkenntnis eines Individuums bereitgestellt.

Description

  [0001] Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung und zur Gewinnung von Wirkstoffkandidaten für die Therapie der erwähnten Krankheiten oder zur Verbesserung der Wahrnehmung eines Individuums. 

[0002] Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung ein transgenes nicht-menschliches Tier, welches im erwähnten Verfahren verwendet werden kann, oder eine transgene Zelle oder ein transgenes Gewebe davon, sowie die Verwendung einer Zelle, eines Gewebes eines nicht-menschlichen Tieres und/oder Wirkstoffkandidaten für das erwähnte Verfahren.

[0003] Mehrere Dokumente werden im Text dieser Beschreibung mit Namen zitiert. Die vollständigen bibliographischen Zitate können am Ende der Beschreibung unmittelbar vor den Ansprüchen gefunden werden.

   Jedes der hier zitierten Dokumente (einschliesslich aller Beschreibungen und Anweisungen von Herstellern) werden hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen.

[0004] Der neuronale Calcium-Sensor-1 (NCS-1) ist ein intrazellulärer Calcium-Sensor der Calcium-bindenden EF-Hand-Proteinfamilie, der Neuronen-spezifisch ist. Der NCS-1 ist im Verlauf der Evolution mit 100% Identität auf der Ebene der Aminosäure bei den Wirbeltieren und mit 75% zwischen Wirbeltieren und C. elegans hoch konserviert (Braunewell und Gundelfinger, 1999; De Castro et al., 1995).

   NCS-1 bindet 3 Calcium-Ionen mit einer hohen Affinität von ¯300 nM, was innerhalb des Bereichs der intrazellulären Ca<2+>i-Fluktuationen liegt, von denen bekannt ist, dass sie entscheidende neuronale Funktionen wie Neurotransmitterfreisetzung, Rezeptorphophorylierung, Ionenkanalaktivitäten oder Transkription regulieren (Bourne et al., 2001; Burgoyne und Weiss, 2001; Cox et al., 1994; Fontana und Blaustein, 1993; Martone et al., 1999; Paterlini et SH /12.04.2002, al., 2000; Yazejian et al., 2000). In Calcium-abhängiger Weise kann der rekombinante Wirbeltier-NCS-1 in vitro die G-Protein-Rezeptorkinase 1 (De Castro et al., 1995; Iacovelli et al., 1999) aktivieren, Calmodulin (CaM) ersetzen und CaM-abhängige Ziele wie 3 ¾:5 ¾-cyclische Nucleotidphosphodiesterase, Calcineurin, und Stickoxid-Synthaseenzyme (Schaad et al., 1996) direkt aktivieren.

   Von NCS-1 ist auch berichtet worden, dass er die in neuroendocrinen Zellen evozierte Exocytose reguliert (McFerran et al., 1998). Eine phänotypische Analyse, die die funktionelle Rolle von NCS-1 in vivo betraf, wurde mit Hefe, Paramecium, C. elegans und Drosophila durchgeführt. In S. cerevisiae codiert das frq 1-Gen NCS-1, der für das vegetative Wachstum essentiell ist und von dem auf Grund genetischer Untersuchungen gezeigt wurde, dass er mit der Phosphatidylinositol 4-OH-Kinase Pikl (Hendricks et al., 1999) wechselwirkt. Der Wirbeltier-NCS-1 ersetzt direkt eine mutierte Form von CaM in Paramecium und kann die normalen Wildtyp (WT)-Verhaltensreaktionen (Vermeidungsreaktion) von lebendigen Paramecium-Mutanten am wahrscheinlichsten über die Reaktivierung von CaM-abhängigen Kaliumkanälen (Schaad et al., 1996) wiederherstellen.

   Ein "Shaker"-ähnlicher Phänotyp bei Drosophila, der durch die Überexpression von Frequenin (Pongs et al., 1993), dem Drosophila-Orthologen von NCS-1, verursacht wird, scheint ein Anwachsen der evozierten Neurotransmitterfreisetzung an der neuromuskulären Verbindungsstelle (NMJ) von Fliegen mittels eines unbekannten Mechanismus zu umfassen, der möglicherweise die NCS-1-abhängige Regulierung eines K<+>-Kanals (Poulain et al., 1994) oder eines Na+-Ca2+-Austauschers (Rivosecchi et al., 1994) umfasst. Die Funktion von NCS-1, falls vorhanden, in Hinblick auf spezielle phänotypische Charakteristika in Reaktion auf NCS-1, blieb jedoch unbekannt.

[0005] Das vorstehend definierte technische Problem wird durch die vorliegende Erfindung durch die Bereitstellung der in den Ansprüchen charakterisierten Ausführungsformen gelöst.

   Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung einen neuen biochemischen Stoffwechselweg in der ZNS-Funktion mittels des neuronalen Calcium-Sensors NCS-1 bereit, der als neues Ziel für therapeutischen Eingriff verwendet werden kann.

[0006] Dementsprechend betrifft ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung und Gewinnung eines Wirkstoff-Kandidaten für die Therapie einer Verhaltensstörung oder zur Verbesserung des Lernens und/oder des Gedächtnisses eine Individuums. In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde die neuronale Rolle von ncs-Genen in vivo durch Funktionsverlust ("loss-of-function")-Genetik in einem eukaryontischen Organismus charakterisiert.

   Um die Rolle von NCS-1 als Regulator der neuronalen Aktivität in vivo zu untersuchen, wurde wegen seines einfachen Nervensystems und seiner gut beschriebenen neuronalen Leitung mit der Fähigkeit der Reaktion auf verschiedene Umweltstimuli wie Berührung, Geruch, Geschmack oder Temperatur C. elegans als Modellorganismus gewählt. Darüber hinaus wurde ein Wirbeltiermodell für assoziatives Lernen und Gedächtnis mit zwei transgenen Mauslinien benutzt.

[0007] Die Nucleotid- und Aminosäuresequenzen von NCS-1 sind im Stand der Technik beschrieben, zum Beispiel in den Dokumenten, die im vorstehenden Abschnitt über das Hintergrundwissen zitiert sind, deren Offenbarungsgehalt hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen ist.

   Darüber hinaus können die codierenden Sequenzen für NCS-1-Gene von öffentlichen Datenbanken erhalten werden, wie von NCBI; vgl. zum Beispiel die Zugangsnummern XM_005625 und NM_014286, die NCS-1 als das Frequenin (Drosophila)-Homologe (FREQ) von Homo sapiens beschreiben, NM_019681, die das NCS-1- oder Frequenin-Homologe von Mus musculus beschreiben, AL447416, die ein Paramecium-Homolog von NCS-1 beschreibt, AF020184, die die mRNA des neuronalen Calcium-Sensors-1 (NCS-1) der Maus beschreibt, L27421, die den neuronalen Calcium-Sensor-1 (NCS-1) der Ratte beschreibt, L33680, die das neuronale Calcium-bindende Protein (NCS-1) von Caenorhabditis elegans beschreibt und L27420, die den neuronalen Calcium-Sensor (NCS-1) eines Vogels (Gallus gallus) beschreibt und die in den Anmerkungen zitierte Literatur.

   Um Verwirrung zu vermeiden, sollte festgehalten werden, dass sich NCS-1 auf das Säugerprotein bezieht und Frequenin auf das Drosophila-Protein, dass aber tatsächlich NCS-1=Frequenin und Frequenin=NCS-1.

[0008] Wie vorstehend erwähnt konnte die vorliegende Erfindung unter Verwendung des Modellsystems C. elegans zum ersten Mal eine funktionelle Rolle von NCS-1 für den Phänotyp eines lebenden Organismus etablieren. Auf einem radialen Temperaturgradienten wandern C. elegans-Würmer nach Konditionierung mit Futter zu ihrer Kultivationstemperatur und bewegen sich entlang dieser Isothermen. Dieses erfahrungsabhängige Verhalten wird isothemisches Spurverhalten (IT) genannt.

   Experimente, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, zeigen überraschenderweise, dass der Neuronen-spezifische Calcium-Sensor-1 (NCS-1), ein während der Evolution hoch konserviertes Protein, für optimales IT-Verhalten essentiell ist. ncs-1 -knockout-Tiere zeigen beim IT-Verhalten grössere Defekte, obwohl ihr chemotaktisches, lokomotorisches und Temperaturvermeidungs-Verhalten normal sind. Der Knockout-Phänotyp kann durch Wiedereinführung eines Wildtyp-NCS-1 in das AIY-Interneuron, ein entscheidender Bestandteil des thermotaktischen Netzwerks, rückgänging gemacht werden.

   Eine Funktionsverlust-Form von NCS-1, die nicht in der Lage ist, Calcium zu binden, stellt das IT-Verhalten nicht wieder her, während die Überexpression von NCS-1 das Niveau an IT-Verhalten erhöht, das Lernen beschleunigt (schnellere Aufnahme) und ein Gedächtnis mit langsamerem Verlust produziert. Somit definiert ein ordnungsgemässer Calcium-Signalweg über den neuronalen Calcium-Sensor NCS-1 einen neuen Weg, der für assoziatives Lernen und Gedächtnis essentiell ist. In einem weiteren Satz an Experimenten wurde ein Wirbeltiermodell für assoziatives Lernen und Gedächtnis mit zwei transgenen Mauslinien, Tg26 und Tg200, studiert, die verschiedene Mengen an NCS-1 in verschiedene Gehirnbereiche überexprimieren.

   Im Vergleich mit WT-Kontrollen zeigen beide Linien einen signifikante Anstieg bei der Langzeit-Potenzierung von CA1 im Hippocampus (LTP), der mit der Menge an NCS-1 gut korreliert ist. Die Überexpression von NCS-1 in Motorneuronen resultiert in einer höheren und schnelleren synaptischen Ermüdung, einer Beobachtung, die mit einer präsynaptischen Erhöhung der Neurotransmitterfreisetzung durch NCS-1 kompatibel ist. Auf der Ebene des Verhaltens produziert die Überexpression von NCS-1 in Tg26 bessere Ergebnisse beim Lernen und Gedächtnis bei den Aufgaben im Morris Wasserlabyrinth und der aktiven Vermeidung. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse an, dass die Calcium-Signalübertragung mittels NCS-1 (einem innerhalb der Wirbeltiere identischen Protein) einen Weg reguliert, der für Prozesse des Lernens und des Gedächtnisses bei Wirbellosen und Wirbeltieren essentiell ist.

   Diese Ergebnisse implizieren auch, dass NCS-1 oder Verbindungen, die in der Lage sind, die Aktivität von NCS-1 zu modulieren, zur Behandlung von Erkrankungen des ZNS verwendet werden können, insbesondere diejenigen, die Phänotypen zeigen, die mit verändertem Verhalten und Gedächtnisverlust einhergehen. Dem entsprechend stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung von NCS-1 und von Verbindungen bereit, die in der Lage sind, die Aktivität von oder die Menge an aktivem NCS-1 zu modulieren, um Erkrankungen des ZNS zu verbessern, die mit einer Funktionsstörung des NCS-1-Gens oder seines Genprodukts in Beziehung stehen.

   Darüber hinaus können solche Verbindungen für die Behandlung von Symptomen von Erkrankungen des ZNS verwendet werden, die durch andere mutante Gene als NCS-1 verursacht werden und/oder durch das Einwirken von gewissen Umweltbedingungen, wie zum Beispiel Stress, Verschmutzung, Hitze, Vergiftung, Drogenmissbrauch, Rauchen und dergleichen. Zusätzlich ist zu erwarten, dass Erkrankungen, die von Alterungsprozessen herrühren, wie Gedächtnisverlust, wirkungsvoll mit Verbindungen behandelt werden, die in der Lage sind, die Aktivität von NCS-1 zu modulieren oder die Mengen an aktivem NCS-1-Protein zu erhöhen. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wird bei der Identifizierung und der Gewinnung von solchen Verbindungen helfen, die Wirkstoffkandidaten für die Behandlung der erwähnten Erkrankungen sind.

   Prominente Beispiele solcher Erkrankungen sind Schizophrenie, Alzheimer'sche Krankheit, Parkinson Krankheit, Depression, die Bipolare Krankheit, Angstgefühle, Appetitstörungen, Schlafstörungen, Schlaflosigkeit, Aufmerksamkeitsdefizit-Hyperaktivitäts-Störung, Drogenmissbrauch und andere.

[0009] Ein Agonist/Aktivator oder ein Antagonist/Inhibitor des Neuronen-spezifischen Calcium-Sensors-1 (NCS-1) oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon kann zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung von Erkrankungen des ZNS oder zur Verbesserung der Wahrnehmung eines Individuums verwendet werden.

   Vorzugsweise ist die besagte Erkrankung des ZNS Schizophrenie, Alzheimer'sche Krankheit, Parkinson Krankheit oder Hyperaktivität.

[0010] Die Ausdrücke "Antagonist/Inhibitor" und "Agonist/Aktivator" umfassen gemäss der vorliegenden Erfindung chemische Mittel, die die Wirkung von NCS-1 modulieren, entweder durch Veränderung seiner enzymatischen Aktivität oder durch die Modulation der Expression, d.h. durch Beeinflussung der Transkription oder Translation. In einigen Fällen können der Antagonist/Inhibitor oder Agonist/Aktivator auch ein Substrat oder ein Liganden-Bindungsmolekül sein.

[0011] Der Ausdruck "Aktivator", wie hier verwendet, umfasst sowohl Substanzen, die zuerst für das Aktivwerden von NCS-1 erforderlich sind, und Substanzen, die seine Aktivität nur fördern.

   Der Ausdruck "Inhibitor" umfasst sowohl Substanzen, die die Aktivität von NCS-1 reduzieren und diejenigen, die sie insgesamt aufheben. Wenn mehr als eine mögliche Aktivität für NCS-1 definiert ist, zum Beispiel die Bindung von Calcium, der Anstieg der Langzeit-Potenzierung im Hippocampus, die Verbesserung der Transmitterfreisetzung und/oder jede andere Aktivität, die im vorstehenden Abschnitt über Hintergrundwissen beschrieben ist, kann der Inhibitor oder Aktivator jede der oder alle Aktivitäten von NCS-1 modulieren. Ein "Antagonist" oder "Agonist", der die Aktivität von NCS-1 moduliert und in einem nachstehend beschriebenen Test auf der Basis von Zellen eine Reaktion hervorruft, betrifft eine Verbindung, die direkt oder indirekt die Aktivitäten von NCS-1 oder die Menge an aktivem NCS-1 verändert.

   Typischerweise wird die Wirkung eines Antagonisten als Blockierung einer von einem Agonisten induzierten Aktivierung der Calcium-Signalübertragung beobachtet. Antagonisten umfassen kompetitive und nicht-kompetitive Antagonisten. Ein kompetitiver Antagonist (oder kompetitiver Blocker) geht mit der Stelle oder in der Nähe der Stelle eine Wechselwirkung ein, die spezifisch für die Bindung eines Agonisten ist. Ein nicht-kompetitiver Antagonist oder Blocker inaktiviert die Funktion von NCS-1 durch Wechselwirkung mit einer anderen Stelle als der Stelle für die Wechselwirkung des Agonisten. Vorzugsweise sind der Antagonist/Inhibitor und Agonist/Aktivator von NCS-1 kleine chemische Mittel, die direkt mit NCS-1 interagieren.

   Deshalb wird es vorzugsweise eine direkte Beziehung zwischen der molaren Menge an Substanz geben, die erforderlich ist, um die Aktivität von NCS-1 zu inhibieren oder zu stimulieren und der molaren Menge an NCS-1, die in der Zelle anwesend ist oder fehlt.

[0012] Aktivatoren und Inhibitoren können durch Struktur-unterstützte Computer-Modellierung geplant werden, zum Beispiel entsprechend den Bereichen der alpha-Helix und der alpha-Helix-Bildung ("alpha-Bereiche"), Bereichen von beta-Faltblatt und beta-Faltblatt-Bildung, ("beta-Bereiche"), Bereichen von Umkehr und Umkehrbildung ("turn-regions"; "Umkehr-Bereiche"), Bereichen von Knäuel und Knäuelbildung ("coil-regions";

   "Knäuel-Bereiche"), hydrophilen Bereichen, hydrophoben Bereichen, alpha-amphipathischen Bereichen, beta-amphipathischen Bereichen, flexiblen Bereichen, Oberflächen-bildenden Bereichen, Substrat-bindenden Bereichen und Bereichen mit hohem antigenen Index. Solche bevorzugten Bereiche umfassen Garnier-Robson alpha-Bereiche, beta-Bereiche, Umkehr-Bereiche und Knäuel-Bereiche, Chou-Fasman alpha-Bereiche, beta-Bereiche und Umkehr-Bereiche, Kyte-Doolittle hydrophile Bereiche und hydrophobe Bereich, Eisenberg alpha- und beta-amphipathische Bereiche, Karplus-Schulz flexible Bereiche, Emini Oberflächen-bildende Bereiche und Jameson-Wolf Bereiche mit hohem antigenen Index.

   Computer-Voraussagen können zum Beispiel unter Verwendung der GCG-Software gemacht werden, die vom Programmhandbuch für das EGCC-Paket des HGMP-Ressourcenzentrums Cambridge (Rice, 1995) abgeleitet ist (Cambridge, CB10 IRQ, England: Hinxton Hall).

[0013] In einer Ausführungsform der pharmazeutischen Zusammensetzung und der Verwendung der vorliegenden Erfindung ist der Agonist/Aktivator ein NCS-1-Polypeptid oder ist davon abgeleitet, ein NCS-1-Antikörper, ein Transkriptionsregulator des ncs-1-Gens, ein Ligandenbindungsmolekül, ein Calcium-Mimetikum/Calcium-Imitator oder ein Derivat eines Calmodulin-Aktivators.

[0014] Unter Verwendung bekannter Verfahren der Proteintechnik und der rekombinanten DNA-Technik können Varianten erzeugt werden, um die Charakteristika der NCS-1-Polypeptide zu verbessern oder zu ändern.

   Zum Beispiel können eine oder mehrere Aminosäuren vom N-Terminus oder vom C-Terminus des Proteins ohne substantiellen Verlust der biologischen Funktion deletiert werden. Die Autoren von Ron, J. Biol. Chem. 268 (1993), 2984-2988, berichteten über Variante KGF-Proteine, die sogar nach der Deletion von 3, 8 oder 27 Aminosäureresten am Amino-Ende Heparin-bindende Aktivität hatten. In ähnlicher Weise zeigte Interferon gamma bis zu zehnfach höhere Aktivität nach der Deletion von 8-10 Aminosäureresten vom Carboxy-Ende dieses Proteins (Dobeli, J. Biotechnology 7 (1988), 199-216).

[0015] Darüber hinaus zeigen reichliche Beweise, dass Varianten oft eine dem natürlicherweise vorkommenden Protein ähnliche Aktivität behalten. Zum Beispiel führten Gayle und Mitarbeiter (J. Biol.

   Chem. 268 (1993); 22105-22111) eine ausführliche Mutationsanalyse des menschlichen Cytokins IL-1a durch. Sie benutzten die Zufallsmutagenese, um über 3.500 einzelne IL-1a-Mutanten zu erzeugen, die im Durchschnitt 2,5 Aminosäureveränderungen per Variante über die gesamte Länge des Moleküls hatten. Mehrfache Mutationen wurden an jeder möglichen Aminosäureposition untersucht. Die Forscher fanden, dass "[das meiste] des Moleküls konnte mit geringer Wirkung [auf entweder die Bindung oder die biologische Aktivität] verändert werden"; vgl. die Zusammenfassung. In der Tat produzierten nur 23 besondere Aminosäuresequenzen von mehr als 3.500 untersuchten Nucleotidsequenzen ein Protein, das sich in der Aktivität signifikant vom Wildtyp unterschied.

   Darüber hinaus können unter Verwendung des PESTFIND-Programms (Rogers, Science 234 (1986), 364-368) PEST-Sequenzen (reich an Prolin, Glutaminsäure, Serin und Threonin) identifiziert werden, die charakteristischerweise in instabilen Proteinen anwesend sind. Solche Sequenzen können von den NCS-1-Proteinen entfernt werden, um die Stabilität und gegebenenfalls die Aktivität der Proteine zu erhöhen. Verfahren zur Einführung solcher Modifikationen in Nucleinsäuremoleküle gemäss der Erfindung sind dem Durchschnittsfachmann geläufig.

[0016] Somit können auch NC-1-Polypeptidvarianten verwendet werden, die eine substantielle biologische Aktivität zeigen. Solche Varianten umfassen Deletionen, Insertionen, Inversionen, Wiederholungen und Substitutionen, die gemäss den allgemeinen Regeln im Fachgebiet so ausgewählt sind, dass sie eine kleine Wirkung auf die Aktivität haben.

   Zum Beispiel wird eine Anleitung bezüglich der Herstellung von phänotypisch stillen Aminosäuresubstitutionen in Bowie, Science 247 (1990), 1306-1310, bereitgestellt, wo die Autoren angeben, dass es zwei Hauptstrategien zur Untersuchung der Toleranz einer Aminosäuresequenz gegenüber Veränderungen gibt.

[0017] Neben konservativen Aminosäuresubstitutionen umfassen Varianten von NCS-1 (i) Substitutionen mit einem oder mehreren der nicht-konservierten Aminosäurereste, wobei der substituierte Aminosäurerest vom genetischen Code codiert sein kann oder auch nicht, oder (ii) Substitution mit einem oder mehreren Aminosäureresten, die eine Substituentengruppe haben, oder (iii) Fusion des reifen Polypeptids mit einer anderen Verbindung, wie z.B.

   einer Verbindung, die die Stabilität und/oder Löslichkeit des Polypeptids erhöht (zum Beispiel Polyethylenglycol), oder (iv) Fusion des Polypeptids mit zusätzlichen Aminosäuren, wie z.B. ein IgG Fc-Fusionsbereichpeptid, oder eine Leader- oder sekretorische Sequenz, oder eine Sequenz, die die Auf-Reinigung erleichtert. Solche Varianten Polypeptide und deren Herstellungen werden als im Bereich der Möglichkeiten eines Durchschnittsfachmanns auf dem Fachgebiet der Lehren hier betrachtet.

[0018] Zum Beispiel können Polypeptidvarianten von NCS-1, die Aminosäuresubstitutionen von geladenen Aminosäuren mit anderen geladenen oder neutralen Aminosäuren enthalten Proteine mit verbesserten Eigenschaften produzieren, wie z.B. geringere Aggregation.

   Aggregation von pharmazeutischen Formulierungen reduziert die Aktivität und erhöht den Abbau wegen der erhöhten immunogenen Aktivität des Aggregats; vgl. z.B. Pinckard, Clin. Exp. Immunol. 2 (1967), 331-340; Robbins, Diabetes 36 (1987), 838-845; Cleland, Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10 (1993), 307-377.

[0019] Ein anti-NCS-1-Antikörper, der in Übereinstimmung mit der hier beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden kann, kann ein monoklonaler Antikörper, ein polyklonaler Antikörper, ein Einzelketten-Antikörper, ein menschlicher oder humanisierter Antikörper, primatisiert, xenogen, chimär oder ein Fragment davon sein, der spezifisch ein NCS-1-Peptid oder -Polypeptid bindet und umfasst auch bispezifische Antikörper, synthetische Antikörper, Antikörperfragmente wie Fab-, Fv- oder scFv-Fragmente usw.,

   oder ein chemisch modifiziertes Derivat der vorgenannten. Die allgemeine Methodik zur Produktion von Antikörpern ist bekannt und wurde zum Beispiel in Köhler und Milstein, Nature 256 (1975), 494, beschrieben und zusammengefasst in J.G.R. Hurrel, Hrsg., "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications", CRC Press Inc., Boco Raron, FL (1982), ebenso wie die Verfahren gelehrt von L.T. Mimms et al., Virology 176 (1990), 604-619. Darüber hinaus können Antikörper oder Fragmente davon gegen die vorstehend erwähnten Peptide unter Verwendung von Verfahren erhalten werden, die z.B. in Harlow und Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988 beschrieben sind.

[0020] Weitere Quellen für die grundlegende Struktur von Aktivatoren oder Inhibitoren können angewendet werden und umfassen zum Beispiel imitierende Analoga des NCS-1-Polypeptids.

   Imitierende Analoga des NCS-1-Polypeptids oder biologisch aktive Fragmente davon können zum Beispiel durch Substitution der Aminosäuren, von denen man annimmt, dass sie für die biologische Aktivität essentiell sind, durch z.B. Stereoisomere, d.h. D-Aminosäuren, erzeugt werden; vgl. z.B. Tsukida, J. Med. Chem. 40 (1997), 3534-3541. Darüber hinaus können im Falle, dass Fragmente für die Planung von biologisch aktiven Analoga verwendet werden, pro-imitierende Komponenten in ein Peptid eingebaut werden, um zumindest einen Teil der Konformationseigenschaften wiederherzustellen, die durch die Entfernung eines Teils des ursprünglichen Polypeptids eventuell verloren gingen; vgl. z.B. Nachman, Regul. Pept. 57 (1995), 359-370.

   Darüber hinaus kann das NCS-1-Polypeptid verwendet werden, um synthetische chemische Peptidimitatoren zu identifizieren, die ebenso wirksam wie das natürliche Polypeptid an den Rezeptor des NCS-1-Polypeptids binden oder als Ligand, Substrat, Bindungspartner für den Rezeptor des NCS-1-Polypeptids funktionieren; vgl. z.B. Engleman, J. Clin. Invest. 99 (1997), 2284-2292. Zum Beispiel können die Simulationen der Faltung und die erneute Planung per Computer von strukturellen Motiven des Proteins der Erfindung unter Verwendung geeigneter Computerprogramme durchgeführt werden (Olszewski, Proteins 25 (1996), 286-299; Hofman, Comput. Appl. Biosci. 11 (1995), 675-679). Die Computermodellierung der Proteinfaltung kann für die Konformations- und energetische Analyse detaillierter Peptid- und Proteinmodelle verwendet werden (Monge, J. Mol. Biol. 247 (1995) 995-1012; Renouf, Adv. Exp. Med.

   Biol. 376 (1995), 37-45). Insbesondere können die geeigneten Programme für die Identifizierung von interaktiven Stellen des NCS-1-Polypeptids und seiner Liganden oder anderer wechselwirkender Proteine mittels Computer-assistierter Recherchen nach komplementären Peptidsequenzen verwendet werden (Fassina, Immunomethods 5 (1994), 114-120). Weiterhin sind geeignete Computersysteme für die Planung von Proteinen und Peptiden im Stand der Technik beschrieben, zum Beispiel bei Berry, Biochem. Soc. Trans. 22 (1994), 1033-1036; Wodak, Ann. N. Y. Acad. Sci. 501 (1987), 1-13; Pabo, Biochemistry 25 (1986), 5987-5991. Verfahren für die Erzeugung und Verwendung von Peptid-imitierenden Kombinationsbanken sind im Stand der Technik beschrieben, zum Beispiel bei Ostresh, Methods in Enzymology 267 (1996), 220-234, und Dorner, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 709-715.

   Darüber hinaus kann eine dreidimensionale und/oder kristallographische Struktur des NCS-1-Proteins für die Planung von imitierenden Inhibitoren der biologischen Aktivität des Proteins der Erfindung verwendet werden (Rose, Biochemistry 35 (1996), 12933-12944; Rutenber, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 1545-1558).

[0021] Die auf der Struktur beruhende Planung und Synthese von synthetischen Molekülen mit niedrigem Molekulargewicht, die die Aktivität des nativen biologischen Polypeptids imitieren, wird des Weiteren beschrieben in z.B. Dowd, Nature Biotechnol. 16 (1998), 190-195; Kieber-Emmons, Current Opinion Biotechnol. 8 (1997), 435-441; Moore, Proc. West Pharmacol. Soc. 40 (1997), 115-119; Mathews, Proc. West Pharmacol. Soc. 40 (1997), 121-125; Mukhija, European J.

   Biochem. 254 (1998), 433-438.

[0022] Es ist dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet ebenfalls bekannt, dass es möglich ist, Imitatoren/Mimetika von kleinen organischen Molekülen zu planen, synthetisieren und bewerten, die, zum Beispiel, als Substrat oder Ligand des NCS-1-Polypeptids agieren können. Zum Beispiel ist beschrieben worden, dass D-Glucose-Imitatoren von Hapalosin eine Hapalosin ähnliche Wirksamkeit bei der Antagonese des Assistenz-assoziierten Proteins für Vielfachwirkstoff-Resistenz bei der Cytotoxizität zeigte; vgl. Dinh, J. Med. Chem. 41 (1998), 981-987.

[0023] Die Polynucleotide, die NCS-1 codieren, können auch als Ziele für Aktivatoren und Inhibitoren dienen.

   Aktivatoren könne zum Beispiel Proteine umfassen, die an die mRNA eines Gens binden, das das NCS-1-Polypeptid codiert, wobei sie die native Konformation der mRNA stabilisieren und die Transkription und/oder Translation erleichtern, z.B. in ähnlicher Weise, wie das Tat-Protein auf die HIV-RNA wirkt. Darüber hinaus sind in der Literatur Verfahren zur Identifizierung von Nucleinsäuremolekülen wie zum Beispiel einem RNA-Fragment beschrieben, das die Struktur eines definierten oder Undefinierten Ziel-RNA-Moleküls nachahmt, an das eine Verbindung innerhalb einer Zelle bindet, was in einer Verzögerung von Zellwachstum oder Zelltod resultiert; vgl. z.B. WO 98/18947 und dort zitierte Literaturstellen.

   Diese Nucleinsäuremoleküle können zur Identifikation unbekannter Verbindungen von pharmazeutischem und/oder landwirtschaftlichem Interesse verwendet werden und zur Identifikation unbekannter RNA-Ziele zur Verwendung bei der Behandlung einer Krankheit. Alternativ kann zum Beispiel die Konformationsstruktur des RNA-Fragments, das die Bindungsstelle nachahmt, bei der rationalen Wirkstoffplanung verwendet werden, um bekannte Liganden zu modifizieren, damit sie noch besser an das Ziel binden. Eine solche Methodik ist die magnetische Kernspinresonanz (NMR), die bei der Identifikation von Konformationsstrukturen von Wirkstoffen und RNA von Nutzen ist.

   Noch andere Verfahren sind zum Beispiel Verfahren zur Wirkstoffplanung, wie sie in der WO 95/35 367, US-A-5 322 933 beschrieben sind, wo die Kristallstruktur des RNA-Fragments abgeleitet werden kann und Computer-Programme verwendet werden, um neue Bindungssubstanzen zu planen, die als Antibiotika wirken können.

[0024] Einige genetische Veränderungen führen zu veränderten Proteinkonformationszuständen. Zum Beispiel können einige mutierte NCS-1-Proteine eine Tertiärstruktur besitzen, die sie weit weniger instand setzt, die Calcium-Signalübertragung zu erleichtern. Die Wiederherstellung der normalen oder regulierten Konformation von mutierten Proteinen ist die eleganteste und spezifischste Art, diese molekularen Defekte zu korrigieren, obwohl sie schwierig sein kann.

   Von besonderem Interesse in diesem Zusammenhang sind die folgenden Domänen von NCS-1: die drei funktionellen Calcium-Bindungsstellen, die EF-Hände (EF) genannt werden, an den Aminosäurepositionen 73-84 (EF2), 109-120 (EF3), 157-168 (EF4) und die umgebenden Aminosäuresequenzen oder -positionen, die mit den Calcium-Bindungsstellen wechselwirken. Zusätzlich kann die frühere Calcium-Bindungsstelle (EF1) an den Positionen 36-47 zur Calcium-Bindung beitragen oder die NCS-1-Funktion regulieren. Letztlich kann der N-Terminus (d.h. die Aminosäuren 1-8) als Stelle für die Myristoylierung dienen und eine regulierende Funktion von NCS-1 bereitstellen. Pharmakologische Manipulationen können daher darauf abzielen, die Wildtyp-Konformation des NCS-1-Proteins wiederherzustellen.

   Somit verwendet die vorliegende Erfindung auch Moleküle, die in der Lage sind, die Wildtyp-Funktionen eines NCS-1-Proteins, d.h. "NCS-1" oder "anti-NCS-1," zu aktivieren.

[0025] Rekombinante NCS-1-Polynucleotide, Antisense-Moleküle, Vektoren, die solche Polynucleotide oder Antisense-Moleküle enthalten, können mittels Verfahren hergestellt werden, die dem Durchschnittsfachmann in der Molekularbiologie bekannt sind. Zum Beispiel würde die Auswahl des Vektors, die abhängig wäre von der gewünschten Funktion, Plasmide, Cosmide, Viren, Bakteriophagen und andere Vektoren umfassen, die üblicherweise in der Gentechnik verwendet werden.

   Verfahren, die dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet bekannt sind, können verwendet werden, um verschiedene Plasmide und Vektoren zu konstruieren; vgl. zum Beispiel die Techniken, die im Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. und Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates und Wiley Interscience, N.Y. (1989), (1994) beschrieben sind. In einer anderen Ausführungsform können die Polynucleotide und Vektoren zur Verabreichung an die Zielzellen in Liposomen verpackt werden. Relevante Sequenzen können in Expressionsvektoren übertragen werden, wo die Expression eines speziellen Polypeptids erforderlich ist. Typische Clonierungsvektoren umfassen pBscpt sk, pGEM, pUC9, pBR322 und pGBT9.

   Typische Expressionsvektoren umfassen pTRE, pCAL-n-EK, pESP-1, pOP13CAT, pET, pGEX, pMALC, pPIC9, pBac.

[0026] In einer anderen Ausführungsform der pharmazeutischen Zusammensetzung und der Verwendung der vorliegenden Erfindung ist der Antagonist/Inhibitor von einem NCS-1-Polypeptid, einem NCS-1-Antikörper, einem ncs- 1-Antisense-Nucleinsäuremolekül, einem Liganden-Bindungsmolekül, einem Calcium-Chelator oder einem Calmodulin-Inhibitor abgeleitet.

   Vorzugsweise interferieren besagte Antagonisten/Inhibitoren mit der Calcium-Bindung von NCS-1 oder sie verändern die Konformation/Funktion von NCS-1.

[0027] Die in der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung verwendeten Antikörper, Nucleinsäuremoleküle, Inhibitoren und Aktivatoren haben vorzugsweise eine Spezifität, die zumindest im Wesentlichen der Bindungsspezifität des natürlichen Liganden oder Bindungspartners des NCS-1-Proteins identisch ist, insbesondere, wenn die NCS-1-Stimulierung erwünscht ist. Ein Antikörper oder Inhibitor kann zu dem NCS-1-Protein eine Bindungsaffinität von mindestens 10<5> M<-1> haben, vorzugsweise höher als 10<7> M<-1> und vorzugsweise bis zu 10<10> MT<-1>, im Falle, dass die NCS-1-Suppression vermittelt werden sollte.

   In einer bevorzugten Ausführungsform hat ein suppressiver Antikörper oder Inhibitor eine Affinität von mindestens 10<-7> M, vorzugsweise mindestens 10<-9> M und am meisten bevorzugt mindestens 10<-11> M; und ein NCS-1 stimulierender Aktivator hat eine Affinität von mindestens 10<-7> M, vorzugsweise weniger als 10<-6> M und am meisten bevorzugt in der Grössenordnung von 10<-5> M.

   Im Falle von Antisense-Nucleinsäuremolekülen ist es vorzuziehen, dass sie zu denen, die das NCS-1-Protein codieren, eine Bindungsaffinität haben, die mindestens 2-, 5-, oder 10-fach weniger ist als die eines exakten Komplementären von 20 aufeinanderfolgenden Nucleotiden der codierenden Sequenz.

[0028] Vorzugsweise ist der Agonist/Aktivator und Antagonist/Inhibitor nicht grösser als die "Bioverfügbarkeitsmauer" von 500-600 Da, um in der Lage zu sein, die lipophile Zellmembran in die Zelle zu durchqueren. Auf der anderen Seite ist bei der Proteintherapie kürzlich gezeigt worden, dass Enzyme, die mit einem Teil eines Proteins des HIV-Virus fusioniert sind, die Zellmembran durchqueren können und dabei ihre Enzymaktivität in vivo in Mäusen beibehalten (Schwarze, Science 285 (1999), 1569-1572).

   Es ist seit etwa 10 Jahren bekannt, dass das transaktivierende, regulatorische Protein (TAT-Protein) vom HIV-Virus eine aussergewöhnliche Fähigkeit besitzt, ohne Verwendung von Rezeptoren oder Transportern oder ohne Erfordernis von ATP, Zellmembranen zu durchqueren (Green und Loewenstein, Cell 55 (1988), 1179-1188). Obwohl sein genauer Mechanismus unbekannt ist, ist gezeigt worden, dass die Proteintransduktions-Domäne (PTD) von TAT ein "Loch" in der Lipiddoppelschicht der Zellmembran öffnet und alles durchzieht, was kovalent daran gebunden ist, bevor sie sie wieder schliesst. Dies ist ein spezifischer Prozess, der ansonsten die Zelle nicht schädigt.

   Somit können ein funktionelles NCS-1-Protein, ein anti-NCS-1-Antikörper oder andere Verbindungen über einen Linker an PTD gekoppelt werden, damit sie die Zellwand durchqueren, vgl. für einen Überblick auch DDT 4 (1999), 537.

[0029] Die vorliegende Erfindung betrifft ein auf Zellen beruhendes Verfahren zur Identifizierung und Gewinnung eines Wirkstoffkandidaten für die Therapie von ZNS-Krankheiten oder zur Verbesserung der Wahrnehmung, des Lernens und/oder des Gedächtnisses eines Individuums, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:
(a) : Durchmusterung einer Zelle, eines Gewebes oder nichtmenschlichen Tiers mit einer zu durchmusternden Verbindung unter Bedingungen, die die Neuronen-spezifische Calcium-Sensor-1 (NCS-1)-Aktivität zulassen; und
(b) :

   Bestimmung der NCS-1-Aktivität der behandelten Zelle, des Gewebes oder des nicht-menschlichen Tiers, wobei ein Unterschied bei der NCS-1-Aktivität, verglichen mit einer entsprechenden Kontrollzelle, einem entsprechenden Kontrollgewebe oder Kontrolltieren ein Hinweis auf einen Wirkstoffkandidaten ist; und gegebenfalls
(c) : Gewinnung des Wirkstoffkandidaten, von dem in Schritt (b) bestimmt wurde, dass er die NCS-1-Aktivität verändert.

[0030] Die Zeit, die für den Kontakt der Zelle mit der Verbindung erforderlich ist, wird empirisch bestimmt, zum Beispiel durch Durchführung eines Zeitverlaufs mit einem bekannten NCS-1-Modulator und Messung der zellulären Veränderungen als Funktion der Zeit.

   Die Messverfahren der Verfahren der vorliegenden Erfindung können durch Vergleich einer Zelle, die einer Verbindung ausgesetzt wurde, mit einer identischen Zelle, die nicht in ähnlicher Weise der Verbindung ausgesetzt wurde, weiterhin definiert werden. In einer anderen Ausführungsform könnten zwei Zellen, eine, die funktionelles NCS-1 enthält, und eine zweite, die zur ersten identisch ist, der aber funktionelles NCS-1 fehlt, mit derselben Verbindung in Kontakt gebracht werden und die Unterschiede zwischen den beiden Zellen verglichen werden. Diese Technik ist auch von Nutzen bei der Feststellung des Hintergrunds dieser Tests.

   Ein Durchschnittsfachmann wird erkennen, dass diese Kontrollmechanismen auch die einfache Selektion von Zellveränderungen zulassen, die auf Modulation mit funktionellem NCS-1 reagieren.

[0031] Der Ausdruck "Zelle" betrifft mindestens eine Zelle, umfasst aber eine Vielzahl an Zellen, die für Empfindlichkeit des Nachweisverfahrens geeignet sind. Zellen, die für die vorliegende Erfindung geeignet sind, können bakteriell, Hefe oder vorzugsweise eukaryontisch sein. Die Verfahren dieser Erfindung verwenden gewisse Arten von Zellen, die Beobachtung von gewissen Veränderungen in Hinblick auf den biologischen Zustand der Zelle und gewisse Vergleiche dieser beobachteten Veränderungen.

   Im Folgenden werden diese Zellarten, Beobachtungen und Vergleiche im Detail beschrieben.

[0032] Die vorliegende Erfindung verwendet drei prinzipielle Arten von Zellen: Wildtyp-Zellen, modifizierte/veränderte Zellen, d.h. transgene Zellen, und Zellen, die Verbindungen oder Wirkstoffen ausgesetzt wurden. "Wildtyp"-Zelle sind Referenz- oder Standardzellen, die bei einer besonderen Anwendung oder Ausführungsform der Verfahren dieser Erfindung verwendet werden. Wenn sie nur eine Referenzzelle ist, muss eine Wildtyp-Zelle nicht eine Zelle sein, die üblicherweise in der Natur gefunden wird, und wird oft eine rekombinante oder genetisch veränderte Zelllinie sein. Üblicherweise werden die Zellen in vitro als Zelllinie oder Stamm gezüchtet. Andere Zellarten, die bei den besonderen Anwendungen der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise von Wildtyp-Zellen abgeleitet.

   Weniger bevorzugt sind andere Zellarten von Zellen abgeleitet, die im Wesentlichen mit Wildtyp-Zellen isogen sind. Zum Beispiel können Wildtyp-Zellen eine spezielle Zelllinie der Hefe Saccharomyces cerevisiae sein, oder eine spezielle Säugerzelllinie (z.B. HeLa-Zellen). Obwohl sich die Beschreibung aus Gründen der Vereinfachung auf eine einzige Zelle bezieht (z.B. "Durchmusterung einer Zelle"), wird der Durchschnittsfachmann wissen, dass des Öfteren irgendein spezieller Schritt der Erfindung unter Verwendung einer Vielzahl genetisch identischer Zellen durchgeführt wird, z.B. einer kultivierten Zelllinie.

   Von zwei Zellen wird gesagt, dass sie "im Wesentlichen isogen" sind, wenn die exprimierten Genome sich durch eine bekannte Menge unterscheiden, die vorzugsweise weniger als 10% der genetischen Loci ist, mehr bevorzugt weniger als 1% oder am meisten bevorzugt weniger als 0,1% ist. Alternativ können zwei Zellen als im Wesentlichen isogen betrachtet werden, wenn die Teile ihres Genoms, die für die Wirkung des Wirkstoffs von Interesse relevant sind, um die vorstehenden Mengen differieren. Es ist weiterhin bevorzugt, dass die unterschiedlichen Loci im Einzelnen bekannt sind. Zellen, die einer/einem "Verbindung oder Wirkstoff ausgesetzt" sind, sind, in Kürze, entweder Wildtyp-Zellen oder modifizierte/veränderte Zellen, die der/den Verbindung(en) von Interesse, d.h.

   Wirkstoffkandidat(en), ausgesetzt wurden.

[0033] "Modifizierte Zellen"/"Veränderte Zellen" sind von Wildtyp-Zellen durch Modifikationen/Veränderungen spezieller Zellbestandteile abgeleitet. Verfahren der Modifikation/Veränderung werden an diese Erfindung anpassbar, wenn sie durch Erhöhung oder Erniedrigung vorzugsweise nur einen einzigen Zielzellbestandteil verändern, oder weniger bevorzugt höchstens wenige Zielzellbestandteile (d.h. 2-5 Zellbestandteile), die den Aspekt des biologischen Zustands einer Zelle beeinflussen, wie gemessen in einer Ausführungsform dieser Erfindung.

   Vorzugsweise sind Modifikationsverfahren in der Lage, viele gemessene Zellbestandteile individuell zu finden und zu verändern, die für einen Aspekt des biologischen Zustands relevant sind und sind am meisten bevorzugt in der Lage, einen substantiellen Anteil solcher Zellbestandteile zu finden und zu verändern. Zum Beispiel sind die Modifikationsverfahren vorzugsweise in der Lage, z.B. einen substantiellen Anteil aller Gene, Proteine oder Proteinaktivitäten in einer Zelle oder mindestens einen substantiellen Anteil der Bestandteile, die für die Charakterisierung der Wirkungen eines Wirkstoffs relevant sind, zu finden und zu verändern. Normalerweise wird die zu modifizierende eine transgene Zelle sein.

[0034] Die vorstehend beschriebenen Zellen können auch von einem Gewebe oder Organismus umfasst sein, d.h. einem nicht-menschlichen Tier.

   Allgemeine Verfahren für die Durchmusterung von Verbindungen, die die erwünschte Wirkung, wie gemessen in einem spezifischen Test, auf eine Zelle oder einen Organismus haben, sind im Stand der Technik beschrieben; vgl. zum Beispiel US-A-6 165 709 und darin zitierte Referenzen.

[0035] Zellen, nicht-menschliche Tiere und Expressions- und/oder Knockout-Systeme können im Stand der Technik gefunden werden und an die Verfahren der vorliegenden Erfindung angepasst werden; vgl. zum Beispiel die im Abschnitt Hintergrundwissen zitierten Dokumente. Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung NCS-1 spezifische Expressions- und/oder Knockout-Systeme bereit.

[0036] Die Testverfahren zur Bestimmung der Verbindungsmanipulation von funktionellem NCS-1 können im normalen Laborformat sein oder an Hochdurchsatz angepasst sein.

   Der Ausdruck "Hochdurchsatz" ("high through put") bezieht sich auf jede Testplanung, das die gleichzeitige, einfache Analyse vielfacher Proben erlaubt und/oder die Kapazität für Robotermanipulation aufweist. Eine andere erwünschte Eigenschaft von Hochdurchsatz-Tests ist eine Testplanung, die dahingehend optimiert ist, den Reagenzienverbrauch zu reduzieren oder die Anzahl an Handhabungsschritten zur Erreichung der erwünschten Analyse zu minimieren. Beispiele für Testformate umfassen Platten mit 96 Mulden, 384 Mulden oder mit mehr Mulden, schwebende Tröpfchen und "lab on a chip" Microchannel-Chips, die für Experimente mit der Handhabung von Flüssigkeiten verwendet werden.

   Es ist dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet bekannt, dass mit dem Fortschritt bei der Miniaturisierung von Plastikformen und Flüssigkeithandhabungssystemen, oder mit der Planung verbesserter Testsysteme, unter Verwendung der Planung der vorliegenden Erfindung grössere Zahlen von Proben getestet werden können.

[0037] Die zellulären Veränderungen, die für das Verfahren der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen die direkte Messung der Veränderungen bei der Funktion von oder Menge an NCS-1 oder die Messung von abgeleiteten Wirkungen der Funktion von NCS-1, zum Beispiel durch Messung der Konzentrationen von zweiten Botenstoffen, der Veränderungen bei der Transkription, der Veränderungen der Proteinspiegel von Genen, die transkriptionell von NCS-1 beeinflusst werden, oder durch Messung von phänotypischen Veränderungen in der Zelle.

   Bevorzugte Messverfahren umfassen Veränderungen der Menge an NCS-1-Proteinen, Veränderungen bei der funktionellen Aktivität von NCS-1, Veränderungen der Menge an mRNA, Veränderungen des intrazellulären Proteins, Veränderungen beim Oberflächenprotein oder beim sezenierten Protein, oder Veränderungen der Konzentration an Ca<2+>, cAMP oder GTP. Veränderungen der Menge oder der funktionellen Aktivität von NCS-1 werden hier beschrieben. Die besagte funktionelle Aktivität ist bevorzugt die Bindung von Calcium. Veränderungen bei den Spiegeln an mRNA werden mittels der Polymerase-Kettenreaktion mit reverser Transkriptase (RT-PCR) mittels differentieller Genexpression oder mittels Mikroarrays nachgewiesen.

   Quantitative Messverfahren für Veränderungen bei den Spiegeln von Protein in einer Wirtszelle umfassen die Immunaffinität, die Ligandenaffinität oder die enzymatische Messung. Protein-spezifische Affinitätskügelchen oder spezifische Antikörper werden verwendet, um zum Beispiel mit <35>S markiertes oder nicht markiertes Protein zu isolieren. Markiertes Protein wird mittels SDS-PAGE analysiert. Nicht markiertes Protein wird mittels Western Blotting Nachweis auf der Zelloberfläche mittels Sortierung von fluoreszierenden Zellen, Zell-Bildverarbeitung, ELISA oder RIA unter Verwendung von spezifischen Antikörpern nachgewiesen.

   Wenn das Protein ein Enzym ist, wird die Induktion von Protein mittels Spaltung eines fluorogenen oder kolorimetrischen Substrats gemessen.

[0038] Wenn das endogene Gen ein lösliches, intrazelluläres Protein codiert, können Veränderungen bei dem endogenen Gen mittels Veränderungen bei dem spezifischen Protein, das in dem Zelllysat enthalten ist, gemessen werden. Das lösliche Protein kann mittels der hier beschriebenen Verfahren gemessen werden.

[0039] Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Durchmusterung von Verbindungen, die die Expression von DNA oder RNA, die NCS-1 codiert, modulieren ebenso wie Verbindungen, die die Funktion von NCS-1-Protein in vivo modulieren. Verbindungen können modulieren, indem sie die Expression von DNA oder RNA, die NCS-1 codiert, erhöhen oder vermindern, oder indem sie die Funktion des NCS-1-Proteins modulieren.

   Verbindungen, die die Expression von DNA oder RNA, die NCS-1 codiert, oder die Funktion von NCS-1-Protein modulieren, können mittels einer Vielzahl von Tests nachgewiesen werden. Diese Tests können ein einfacher "ja/nein"-Test sein, um zu bestimmen, ob es eine Veränderung bei der Expression oder Funktion gibt. Der Test kann durch Vergleich der Expression oder Funktion der Testprobe mit den Spiegeln an Expression oder Funktion in einer Standardprobe quantitativ gemacht werden. Die durch diese Verfahren identifizierten Modulatoren sind von Nutzen als therapeutische Mittel.

[0040] Die vorstehend beschriebenen Verfahren können natürlich mit einem oder mehreren Schritten der vorstehend beschriebenen Durchmusterungsverfahren oder anderer, im Stand der Technik bekannter Durchmusterungsverfahren kombiniert werden.

   Verfahren zur Entdeckung von klinischen Verbindungen umfassen zum Beispiel Ultra-Hochdurchsatzdurchmusterung (Sundberg, Curr. Opin. Biotechnol. 11 (2000), 47-53) zur Entdeckung einer Leitstruktur und Struktur-basierte Wirkstoffplanung (Verlinde und Hol, Structure 2 (1994), 577-587) und kombinatorische Chemie (Salemme et al., Structure 15 (1997), 319-324) für die Optimierung der Leitstruktur.

[0041] Nachdem ein Wirkstoff ausgewählt wurde, kann das Verfahren unter Verwendung des modifizierten Wirkstoffs die zusätzlichen Schritte der Wiederholung des Verfahrens, das zur Durchführung der rationalen Wirkstoffplanung verwendet wurde, umfassen.

   Das Verfahren kann ebenfalls eine Beurteilung, ob der besagte modifizierte Wirkstoff eine verbesserte Affinität zeigt, gemäss zum Beispiel der Analyse von Wechselwirkung/Energie, umfassen.

[0042] In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist die besagte Zelle, das besagte Gewebe oder das besagte nicht-menschliche Tier eine transgene Zelle, ein transgenes Gewebe oder ein transgenes nicht-menschliches Tier, das einen substantiell reduzierten oder erhöhten Spiegel an Aktivität von Neuronen-spezifischem Calcium-Sensor-1 (NCS-1), im Vergleich mit einer entsprechenden Wildtyp-Zelle, einem entsprechenden Wildtyp-Gewebe oder nicht-menschlichen Tier, hat.

   Die Beispiele zeigen exemplarisch die Herstellung von transgenen, nicht menschlichen Tieren, insbesondere C. elegans und Maus.

[0043] Vorzugsweise resultiert der reduzierte oder erhöhte Spiegel an Aktivität von NCS-1 in einer veränderten und einer typischen Antwort der transgene Zelle, des transgenen Gewebes oder des nicht-menschlichen Tiers. Ein Agonist/Aktivator oder Antagonist/Inhibitor wird dann durch die Beobachtung, ob ein Kandidat bei einer bestimmten Konzentration in der Lage ist, die phänotypische Antwort besagter transgener Zelle, des besagten transgenen Gewebes oder nicht-menschlichen Tiers zu normal zurückzubringen, identifiziert. In einer insbesondere bevorzugten Ausführungsform zeigt das besagte transgene, nicht-menschliche Tier einen Unterschied im Verhalten im Vergleich mit einem Wildtyp-nicht-menschlichen Tier.

   Gemäss der vorliegenden Erfindung konnte überraschenderweise gezeigt werden, dass bei C. elegans die Aktivität von NCS-1 mit dem isothermischen Spurverhalten (IT) und auch mit Lernmechanismen verknüpft ist. Nicht überraschenderweise führt Verstärkung durch schnelleren Erwerb zusammen mit einer höheren Endleistung zu Gedächtnissen, die andauernder und daher konsistent mit einer längeren Beibehaltungsperiode sind (Milner et al., 1998). Wenn jedoch die Auslöschung ebenfalls ein Lernmechanismus ist, dann benötigen Tg-ncs-1-Würmer mehr Zeit, um auf die Abwesenheit eines konditionierenden Stimulus (z.B. Futter) zu reagieren, was wahrscheinlich mit dem Spiegel an [Ca<2+>]i-Signalübertragung verknüpft ist (vgl.

   Fig. 5 und 6).

[0044] Die Funktionsverlust- und Mosaikrettungsdaten, die gemäss der vorliegenden Erfindung erhalten wurden, zeigen klar, dass die Anwesenheit und Menge an Calcium-Sensor NCS-1 in AIY-Neuronen eine zentrale Rolle bei der Beeinflussung des Ca<2+><-abhängigen assoziativen Lernens bei C. elegans spielt, was durch direkte regulatorische Wirkung auf das IT-Verhalten gezeigt ist. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Calcium-Signalübertragung oder -Bindung durch NCS-1 für diese Aktivität kritisch und dass der NCS-1-Signalübertragungsweg für die Ausübung des IT-Verhaltens essentiell ist. Wie in der schematischen Darstellung (Fig. 6) gezeigt, könnte NCS-1 eine präsynaptische Rolle an den AIY-Interneuronsynapsen mit AIZ und RIA oder eine postsynaptische Funktion an den AFD/AIY-Synapsen haben.

   Die präsynaptische Aktivität von NCS-1 wird durch vorläufige Daten gestützt, die zeigen, dass erhöhte Spiegel an NCS-1 im Hippocampus der Maus über eine präsynaptische Erleichterung LTP erhöhen. In ähnlicher Weise kann das Anwachsen des IT-Verhaltens, das beobachtet wird, wenn NCS-1 überexprimiert wird (Tg-ncs-1-Tiere), einen Zustand reflektieren, bei dem die präsynaptischen AIY-Enden maximal stimuliert sind.

   Die Beobachtung einer präsynaptischen Wirkung auf die Überexpression von NCS-1 an der neuromuskulären Verknüpfung von Mäusen, Fliegen und Fröschen (Olafsson et al., 1995; Rivosecchi et al., 1994) trägt diese Hypothese und legt eine konservierte Funktion für NCS-1 durch die Evolution nahe.

[0045] Das AIY-Interneuron könnte wahrscheinlich als Integrator von Futter- und Temperatur-Inputs in der Form von Ca<2+>-Signalen, die von AFD und den umgebenden Zellen bereitgestellt werden, dienen. Diese Signale, die mittels des neuronalen Calcium-Sensors NCS-1 aufgenommen werden, könnten auf weiter stromabwärts liegende Ziele wie 3 ¾:5 ¾-cyclische Nucleotid-Phosphodiesterase, Calcineurin, Stickoxid-Synthase, Kalium-Kanäle oder Phosphatidylinositol 4-OH-Kinase mittels Mechnismen übertragen werden, die die synaptische Stärke von AIY beeinflussen könnten.

   Die Ca<2+>-Signalübertragung über NCS-1 definiert daher einen neuen Weg für die Regulierung der synaptischen Wirksamkeit.

[0046] Zusammengenommen stellen diese Thermotaxisverstärkten oder defizienten NCS-1-Stämme (unter Verwendung lebender Tiere) wertvolle Mittel für das Studium der synaptischen Plastizität auf den molekularen, zellulären und Netzwerk-Ebenen bereit.

   Weiterhin wird ein Modell bereitgestellt, das bei dem Verständnis konservierter Funktionen, wie Langzeitgedächtnis und assoziatives Lernen, über Arten hinweg helfen könnte.

[0047] Darüber hinaus zeigten die vorliegenden Beispiele, dass die Überexpression von NCS-1 in der Maus in einem Dosis-abhängigen Anwachsen von Hippocampus-LTP und in einer Erhöhung der präsynaptischen Neurotransmitterfreisetzung am NMJ resultierte.

[0048] Weiterhin führte die Überexpression von NCS-1 in der Tg26-Linie zu verbesserten Lernergebnissen, war aber ohne jegliche Wirkungen bei emotionalen Antworten. Es scheint, dass die Überexpression von NCS-1 bei Wirbellosen und Wirbeltieren das assoziative Lernen und Gedächtnisprozesse verbessert.

   Dies spiegelt sich nicht nur im sehr hohen Konservierungsgrad der Primärstruktur von NCS-1 in der Evolution wider, sondern zeigt auch, dass ein gemeinsamer NCS-1-abhängiger Calcium-Signalübertragungsweg als grundlegender Mechanismus bei der Regulierung der synaptischen Effizienz in verschiedenen neuronalen Umgebungen dient. In der Tat erfordern assoziatives Lernen und Gedächtnis in C. elegans die Funktion von und die Übertragung mittels NCS-1 in einem einzelnen inter-Neuron, das eine einzige Projektion von einem sensorischen Neuron erhält und auf nur zwei andere neuronale Zellen projiziert, während in der Maus NCS-1 die Effizienz der präsynaptischen Enden (d.h. CA3 neuronale Projektionen auf CA1-Neuronen im Hippocampus oder motorneuronale Endplatten), die ein sehr dichtes und komplexes Netzwerk bilden, zu regulieren scheint.

   Es ist daher sehr wahrscheinlich, dass die NCS-1-abhängige Signalübertragung bei höheren Wirbeltieren wie Affen und Menschen konserviert sein wird. Mit der Massgabe eines sicheren und effizienten Genübertragungssystems wird postuliert, dass die Überexpression von NCS-1 im menschlichen Hippocampus Defizite beim Lernen und Gedächtnis überwinden könnte. Diese Defizite können mit dem Alter assoziiert sein oder bei Patienten mit Alzheimer- oder Schizophrenie-Erkrankungen vorliegen.

[0049] Üblicherweise umfasst das besagte nicht-menschliche Tier, das reduzierte Spiegel von Neuronen-spezifischer Calcium-Sensor-1 (NCS-1)-Aktivität zeigt, mindestens ein mutiertes Allel des NCS-1 codierenden Gens oder eines anderen, entsprechenden transdominanten Allels eines anderen Gens.

   Vorzugsweise ist das besagte transgene, nichtmenschliche Tier ein ncs-1 -Knockout-Tier.

[0050] In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist das besagte transgene, nicht-menschliche Tier C. elegans und das besagte Verhalten ist das isothermische Spurverhalten (IT). Wie vorstehend beschrieben und in den Beispielen gezeigt, stellt die vorliegenden Erfindung zum ersten Mal einen Funktionstest bereit, der in der Lage ist, direkt die molekulare Wirkung eines Modulators der NCS-1-Aktivität mit einer phänotypischen Antwort eines Testtiers zu verknüpfen.

   Da C. elegans gut charakterisiert und leicht zu handhaben ist, und da die Kulturbedingungen und andere Faktoren leicht zu kontrollieren sind, ist dieses Testtier insbesondere für die Hochdurchsatz-Durchmusterung geeignet; vdl. zum Beispiel Link et al., Therapeutic target discovery using C. elegans.

   Pharmacogenomics 1 (2000), 203-218.

[0051] In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist das besagte transgene, nicht-menschliche Tier die Maus und das besagte Verhalten ist das Lernen und die Gedächtnisleistung im Morris-Wasserlabyrinth und beim aktiven Vermeidungstest; siehe auch Abschnitt 6.1.6 von Beispiel 6.

[0052] Die Verbindungen, die gemäss dem Verfahren der Erfindung getestet und identifiziert werden können, können Expressionsbanken sein, d.h. cDNA-Expressionsbanken, Peptide, Proteine, Nucleinsäuren, Antikörper, kleine organische Verbindungen, Hormone, Peptidnachahmer (Peptidomimetiker), PNAs oder dergleichen (Milner, Nature Medicine 1 (1995), 879-880; Hupp, Cell 83 (1995), 237-245; Gibbs, Cell 79 (1994), 193-198 und vorstehend zitierte Referenzen).

   Darüber hinaus können Gene, die einen mutmasslichen Regulator des NCS-1-Proteins codieren und/oder die ihre Wirkungen stromaufwärts oder stromabwärts vom NCS-1-Protein ausüben, unter Verwendung, zum Beispiel der Insertionsmutagenese durch, zum Beispiel, im Stand der Technik bekannten Genzielvektoren identifiziert werden. In ähnlicher Weise umfassen die Verfahren der Erfindung ENU-Mutagenese und Unterdrückungsdurchmusterung, die durchgeführt werden könnten, um Regulatoren der NCS-1-Dysfunktion, -Hyperfunktion, -Ziele oder -Signalübertragungswege zu finden. Besagte Verbindungen können auch funktionelle Derivate oder Analoga bekannter Liganden, z.B. Ca<2+>, sein.

   Solche nützlichen Verbindungen können auch zum Beispiel transagierende Faktoren sein, die an das NCS-1-Protein oder die regulatorischen Sequenzen des NCS-1-Gens binden.

[0053] Die mittels der vorstehenden Verfahren isolierten Verbindungen können auch als Leitverbindungen für die Entwicklung von Analogverbindungen dienen. Die Analoga sollten eine stabilisierte Elektronenkonfiguration und molekulare Konformation haben, die es erlauben, dass die entscheidenden funktionellen Gruppen dem NCS-1-Protein oder seinem Rezeptor in substantiell derselben Weise wie die Leitverbindung dargeboten werden. Insbesondere haben die Analogverbindungen räumliche Elektroneneigenschaften, die mit dem Bindungsbereich vergleichbar sind, können aber auch kleinere Moleküle als die Leitverbindung sein und die häufig ein Molekulargewicht von unter 2 kD und vorzugsweise unter 1 kD umfassen.

   Die Identifizierung von Analogverbindungen kann unter Verwendung von Verfahren wie der Analyse mit selbst-konsistentem Feld (SCF), mit Konfigurationswechselwirkung (CI) und mit Normalmodus-Dynamik durchgeführt werden. Computerprogramme zur Implementierung dieser Verfahren sind verfügbar; z.B. Rein, Computer-Assisted Modeling of Receptor-Ligand Interactions (Alan Liss, New York, 1989). Verfahren für die Herstellung von chemischen Derivaten und Analoga sind dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet bekannt und sind zum Beispiel beschrieben in Beilstein, Handbook of Organic Chemistry, Springer edition New York Inc., 175 Fifth Avenue, New York, N.Y. 10010 U.S.A. und Organic Synthesis, Wiley, New York, USA. Darüber hinaus können besagte Derivate und Analoga auf ihre Wirkungen gemäss im Stand der Technik bekannter Verfahren getestet werden; vgl. auch vorstehend.

   Darüber hinaus können auch für die Planung geeigneter Derivate und Analoga Peptidimitatoren und Computer-unterstützte Systeme gemäss der vorstehend beschriebenen Verfahren verwendet werden. Verfahren zur Erzeugung von Leitstrukturen bei der Wirkstoffentdeckung umfassen auch die Verwendung von Proteinen und Nachweisverfahren, wie die Massenspektrometrie (Cheng et al. J. Am. Chem. Soc. 117 (1995), 8859-8860) und einige Verfahren der magnetischen Kernspinresonanz (NMR) (Fejzo et al., Chem. Biol. 6 (1999), 755-769; Lin et al., J. Org.

   Chem. 62 (1997) 8930-8931).

[0054] Der neu identifizierte Wirkstoff, der gemäss einem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wurde, d.h. ein Antagonist/Inhibitor oder ein Agonist/Aktivator, kann zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von Erkrankungen verwendet werden, die vom NCS-1-Protein vermittelt werden oder damit in Zusammenhang stehen.

[0055] Ein Verfahren zur Herstellung eines Medikaments umfasst die Schritte eines der vorstehend beschriebenen Verfahren; und
(i) : die Synthese des in Schritt (b) identifizierten oder in Schritt (c) erhaltenen Wirkstoffkandidaten oder seines Analogon oder Derivats in einer Menge, die ausreichend ist, den besagten Wirkstoff in einer therapeutisch wirksamen Menge an ein Individuum zu verabreichen; und/oder
(ii) :

   die Kombination des in Schritt (b) identifizierten oder in Schritt (c) erhaltenen Wirkstoffkandidaten oder seines Analogon oder Derivats mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.

[0056] Nachdem ein Wirkstoff gemäss irgendeinem der vorstehend beschriebenen Verfahren der vorliegenden Erfindung ausgewählt wurde, kann der Wirkstoff oder ein Vorläufer davon in einer therapeutisch wirksamen Menge synthetisiert werden. Wie hier verwendet bedeutet der Ausdruck "therapeutisch wirksame Menge" die Gesamtmenge des Wirkstoffs oder Vorläufers, die ausreichend ist, um einen nennenswerten Vorteil für den Patienten, d.h. Behandlung, Heilung, Verhinderung oder Linderung eines Zustands, der mit einem NCS-1-Protein in Zusammenhang steht, oder ein Anwachsen der Rate an Behandlung, Heilung, Verhinderung oder Linderung eines solchen Zustands zu zeigen.

   Zusätzlich oder alternativ umfasst der Ausdruck "therapeutisch wirksame Menge", insbesondere in Hinblick auf die präklinische Testung der Wirkstoffs, die Gesamtmenge des Wirkstoffs oder Vorläufers, die ausreichend ist, um eine physiologische Antwort, vorzugsweise bei seiner Bindung an sein Ziel-NCS-1-Protein in einem nicht-menschlichen Tiertest, vorzugsweise in einem C. elegans- oder Mäuse-Test, wie hier beschrieben, hervorzurufen.

[0057] Wirkstoffe oder ihre Vorläufer werden nach ihrer in-vivio-Verabreichung metabolisiert, um entweder durch Exkretion oder durch Metabolismus zu einem oder mehr aktiven oder inaktiven Metaboliten (Meyer, J. Pharmacokinet. Biopharm. 24 (1996), 449-459) eliminiert zu werden.

   Somit kann statt der Verwendung der aktuellen Verbindung oder des aktuellen Wirkstoffs, die gemäss den Verfahren der vorliegenden Erfindung identifiziert und erhalten wurden, eine entsprechende Formulierung als Vorläuferwirkstoff verwendet werden, die in dem Patienten in seine aktive Form umgewandelt wird. Vorsichtsmassnahmen, die bei der Verabreichung von Vorläuferwirkstoffen und Wirkstoffen getroffen werden können, sind in der Literatur beschrieben; vgl. für einen Überblick Ozama, J. Toxicol.

   Sci. 21 (1996) 323-329.

[0058] Ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, das eine vorstehend beschriebene Verbindung umfasst, umfasst weiterhin die Schritte (a) Schritte der Modifikation der besagten Verbindung, die gemäss den Verfahren der Erfindung als Leitverbindung identifiziert wurde, um (i) eine modifizierte Wirkungsstelle, ein modifiziertes Aktivitätsspektrum, modifizierte Organspezifität zu erreichen und/oder (ii) erhöhte Wirksamkeit, und/oder (iii) erniedrigte Toxizität (verbesserter therapeutischer Index), und/oder (iv) weniger Nebenwirkungen, und/oder (v) einen modifizierten Verlauf der therapeutischen Wirkung, Dauer oder Effekte, und/oder (vi) modifizierte pharmakokinetische Parameter (Resorption, Verteilung, Metabolismus und Ausscheidung), und/oder (vii) modifizierte physiko-chemische Parameter (Löslichkeit, Hygroscopizität, Farbe,

   Geschmack, Geruch, Stabilität, Zustand), und/oder (viii) verbesserte allgemeine Spezifität, Organ/Gewebespezifität, und/oder (ix) optimierte Verabreichungsform und optimierter Verabreichungsweg durch (i) Veresterung von Carboxylgruppen, oder (ii) Veresterung von Hydroxylgruppen mit Carbonsäuren, oder (iii) Veresterung von Hydroxylgruppen zu z.B.

   Phosphaten, Pyrophosphaten, oder Sulfaten oder Hemisuccinaten, oder (iv) Bildung von pharmazeutisch verträglichen Salzen, oder (v) Bildung von pharmazeutisch verträglichen Komplexen, oder (vi) Synthese von pharmakologisch aktiven Polymeren, oder (vii) Einführung von hydrophilen Einheiten, oder (viii) Einführung/Austausch von Substituenten an Aromaten oder Seitenketten, Veränderung des Substititionsmusters, oder (ix) Modifikation durch Einführung von isosterischen oder bioisosterischen Einheiten, oder (x) Synthese von homologen Verbindungen, oder (xi) Einführung von verzweigten Seitenketten, oder (xii) Umwandlung von Alkylsubstituenten in cyclische Analoga, oder (xiii) Derivatisierung von Hydroxylgruppen zu Ketalen, Acetalen, oder (xiv) N-Acetylierung zu Amiden, Phenylcarbamaten, oder (xv) Synthese von Mannich-Basen, Iminen, oder (xvi)

   Transformation von Ketonen oder Aldehyden zu Schiff's Basen, Oximen, Acetalen, Ketalen, Enolestern, Oxazolidinen, Thiozolidinen oder Kombinationen davon; und (b) Schritte der Formulierung des Produkts besagter Modifikation mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.

[0059] Die verschiedenen, vorstehend zitierten Schritte sind im Stand der Technik allgemein bekannt. Sie umfassen oder beruhen auf quantitativer Struktur-Wirkungs-Beziehungs (QSAR)-Analyse (Kubinyi, J. Med. Chem. 41 (1993), 2553-2564, Kubinyi, Pharm Unserer Zeit 23 (1994), 281-290), kombinatorischer Biochemie, klassischer Chemie und andere (vgl. zum Beispiel Holzgrabe und Bechtold. Pharm.

   Acta Helv. 74 (2000), 149-155).

[0060] Wie vorstehend erwähnt stellt die vorliegenden Erfindung einfache Tests, vorzugsweise in-vivo-Tests, zur Identifizierung und Gewinnung von Wirkstoffen, die in der Lage sind, die NCS-1-Aktivität zu modulieren und damit als therapeutische Mittel für die Behandlung von Krankheiten von Nutzen sind, die mit der NCS-1-Aktivität in Zusammenhang stehen, wie ZNS-Krankheiten einschliesslich Schizophrenie, Parkinson Krankheit, Alzheimer Krankheit und andere Verhaltenserkrankungen, bereit.

   Aufgrund des Mangels an Wissen über die phänotypischen Antworten eines Organismus, die durch die NCS 1 Aktivität oder ihr Fehlen hervorgerufen werden, wurde für solche Verbindungen aber bisher keine medizinische Verwendung, insbesondere in der Therapie von ZNS-Erkrankungen, vorgeschlagen.

[0061] Die vorliegende Erfindung betrifft auch transgene nicht-menschliche Tiere, die einen reduzierten Spiegel an Neuronen-spezifischer Calcium-Sensor-1(NCS-1 )-Aktivität zeigen. Das nicht-menschliche transgene Tier kann mindestens ein mutiertes Allel des NCS-1 codierenden Gens oder eines korrespondierenden trans-dominanten Allels eines anderen Gens umfassen. Vorzugsweise ist das besagte transgene nicht-menschliche Tier ein ncs-1-Knockout-Tier.

   In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das besagte transgene nicht-menschliche Tier C. elegans und das besagte Verhalten ist das isothermische Spurverhalten (IT), oder das besagte nicht-menschliche Tier ist die Maus und das besagte Verhalten ist das Lernen und die Gedächtnisleistung im Morris-Wasserlabyrinth und den aktiven Vermeidungsaufgaben; vgl. auch Abschnitt 6.1.6 von Beispiel 6.

[0062] Ein Verfahren für die Herstellung eines transgenen nicht-menschlichen Tiers, zum Beispiel einer transgenen Maus, umfasst die Einführung eines NCS-1-Polynucleotids oder eines Zielvektors in eine Keimzelle, eine embryonale Zelle, Stammzelle oder ein Ei oder eine davon abgeleitete Zelle. Das nicht-menschliche Tier kann gemäss den hier beschriebenen Durchmusterungsverfahren der Erfindung verwendet werden.

   Die Herstellung von transgenen Embryonen und ihre Durchmusterung kann z.B. wie von A.L. Joyner Hrsg., Gene Targeting, A Practical Approach (1993), Oxford University Press, beschrieben durchgeführt werden, siehe auch Mäuse in den Beispielen 6 und 7. Die DNA der embryonalen Membranen von Embryos kann unter Verwendung von z.B. Southern Blots mit einer geeigneten Sonde analysiert werden, vgl. vorstehend. Die Erfindung betrifft auch transgene nicht-menschliche Tiere wie transgene Mäuse, Ratten, Hamster, Hunde, Affen, Kaninchen, Schweine, C. elegans und Fische wie Torpedofisch, die das NCS-1-Gen umfassen. Vorzugsweise ist das transgene nicht-menschliche Tier C. elegans wie ein in den Beispielen beschriebenes mutiertes Tier.

   Vorzugsweise umfasst das transgene nichtmenschliche Tier mindestens ein inaktiviertes oder supprimiertes Wildtyp-Allel des entsprechenden NCS-1 codierenden Gens; vgl. vorstehend. Diese Ausführungsform erlaubt zum Beispiel das Studium der Wechselwirkung verschiedener mutierter Formen von NCS-1-Polypeptiden auf den Fortgang der klinischen Symptome einer Krankheit, die mit Störungen beim Calcium-Signalübertragungsweg einhergeht. Alle Anwendungen, die hier vorstehend in Bezug auf ein transgenes Tier diskutiert wurden, betreffen auch Tiere, die zwei, drei oder mehr Transgene enthalten, die zum Beispiel Calmodulin codieren. Es könnte auch wünschenswert sein, bei einem gewissen Entwicklungszustand und/oder Lebensalter des transgenen Tiers die NCS-1-Proteinexpression oder -funktion zu inaktivieren.

   Dies kann unter Verwendung von zum Beispiel gewebespezifischen, Entwicklungs- und/oder Zell-regulierten und/oder induzierbaren Promotoren erreicht werden, die die Expression von z.B einem Antisense oder einem Ribozym antreiben, das gegen das RNA-Transkript gerichtet ist, das die NCS-1 codierende RNA codiert; vgl. auch vorstehend. Ein geeignetes induzierbares System ist zum Beispiel die Tetracyclin-regulierte Genexpression wie von z.B. Gossen und Bujard (Proc. Natl. Acad. Sci. 89 USA (1992), 5547-5551) und Gossen et al. (Trends Biotech. 12 (1994), 58-62) beschrieben.

   In ähnlicher Weise kann die Expression des (mutierten) NCS-1-Proteins durch solche regulatorischen Elemente kontrolliert werden.

[0063] Darüber hinaus betrifft die Erfindung auch eine transgene, vorzugsweise eukaryontische Zelle, die (vorzugsweise stabil in ihr Genom integriert) ein NCS-1-Nucleinsäuremolekül enthält oder einen Teil davon, wobei die Transkription und/oder Expression des Nucleinsäuremoleküls oder seines Teils zur Reduktion der Synthese eines NCS-1-Proteins führt.

   In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Reduktion durch eine Antisense-, Sense-, Ribozym-, Co-Suppressions- und/oder dominant mutante Wirkung erzielt. "Antisense" und "Antisense-Nucleotide" bedeutet DNA- oder RNA-Konstrukte, die die Expression des natürlicherweise vorkommenden Genprodukts blockieren.

[0064] Techniken zur Durchführung sind dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet bekannt. Diese umfassen zum Beispiel die Expression von Antisense-RNA, Ribozymen, von Molekülen, die Antisense- und Ribozym-Funktionen kombinieren und/oder von Molekülen, die eine Co-Suppressions-Wirkung bereitstellen; vgl. auch vorstehend.

   Wenn zur Reduktion der Menge der NCS-1-Proteine in Zellen der Antisense-Weg verwendet wird, ist das Nucleinsäuremolekül, das die Antisense-RNA codiert, vorzugsweise von homologem Ursprung in Bezug auf die Tierart, die für die Transformation verwendet wird. Es ist jedoch auch möglich, Nucleinsäuremoleküle zu verwenden, die einen hohen Grad an Homologie mit endogen vorkommenden Nucleinsäuremolekülen, die ein NCS-1-Protein codieren, haben. In diesem Fall ist die Homologie vorzugsweise höher als 80%, insbesondere höher als 90% und noch mehr bevorzugt höher als 95%. Die Reduktion der Synthese des NCS-1-Proteins in der transgenen eukaryontischen Zelle kann in einer Veränderung resultieren, z.B. bei der Calcium-Signalübertragung.

   In transgenen Tieren, die solche Zellen umfassen, kann dies zu verschiedenen physiologischen, Entwicklungs- und/oder morphologischen Veränderungen führen, vorzugsweise zu verringerten kognitiven Funktionen wie Lernen, Gedächtnis, Aufmerksamkeit oder Hyperaktivität. Solche Verhaltensbeurteilungen können bei Nager- oder nicht-Nager-Arten durchgeführt werden.

[0065] Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch transgene nicht-menschliche Tiere, die die vorstehend beschriebenen transgenen Zellen enthalten.

   Diese können wegen der stabilen oder transienten Anwesenheit von fremder DNA im Vergleich mit Wildtyp-Tieren zum Beispiel einen Mangel oder eine andere Veränderung bei der Calcium-Signalübertragung zeigen, was in mindestend einer der folgenden Eigenschaften resultiert:
(a) : Unterbrechung eines endogenen Gens/endogener Gene, die NCS-1 codieren;
(b) : Expression von mindestens einer Antisense-RNA und/oder Ribozym gegen ein Transkript, das das NCS-1-Polynucleotid umfasst;
(c) : Expression einer Sense- und/oder nicht-translatierbaren mRNA eines NCS-1-Polynucleotids;
(d) : Expression eines anti-NCS-1-Antikörpers;
(e) : Einbau einer funktionellen oder nicht-funktionellen Kopie einer regulatorischen Sequenz des NCS-1-Gens; oder
(f) :

   Einbau eines rekombinanten DNA-Moleküls oder Vektors, der eines der vorstehend beschriebenen Polynucleotide oder Nucleinsäuremoleküle umfasst.

[0066] Mit den NCS-1-Polypeptiden, ihren codierenden Polynucleotiden und den entsprechenden Vektoren ist es nun möglich, in vivo und in vitro die Wirksamkeit von Wirkstoffen in Bezug auf spezielle Mutationen in NCS-1-Proteinen eines Patienten und den betroffenen Phänotyp zu untersuchen. Darüber hinaus können mutante Formen von NCS-1-Polypeptiden verwendet werden, um das pharmakologische Profil von Wirkstoffen zu bestimmen.

   Weiterhin können diese mutanten Formen zur Identifikation und Gewinnung von weiteren Wirkstoffen verwendet werden, die bei der Behandlung von Krankheit wirksam sein können, die mit der Calcium-Signalübertragung in Beziehung stehen, insbesondere für die Linderung gewisser Phänotypen, die durch die entsprechenden Mutationen im NCS-1 codierenden Gen verursacht werden.

[0067] Über die letzten 20 Jahre ist die genetische Heterogenität zunehmend als wichtiger Grund von Unterschieden bei der Reaktion auf Wirkstoffe erkannt worden. Viele wissenschaftliche Mitteilungen (Meyer, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 37 (1997), 269-296 und West, J. Clin.

   Pharmacol. 37 (1997), 635-648) haben klar gezeigt, dass einige Wirkstoffe in einigen Patienten besser arbeiten als in anderen oder sogar hoch toxisch sein können und dass diese veränderten Reaktionen der Patienten auf Wirkstoffe auf eine molekulare Basis zurückgeführt werden können. Das Konzept der "Pharmacogenomik" stellt Korrelationen zwischen Reaktionen auf Wirkstoffe und den genetischen Profilen von Patienten her (Marshall, Nature Biotechnology, 15 (1997), 954-957; Marshall, Nature Biotechnology, 15 (1997), 1249-1252).

[0068] Im Kontext der Variabilität einer Population in Hinblick auf Wirkstofftherapie wurde die Pharmacogenomik als Mittel vorgeschlagen, das bei der Identifikation und Auswahl von Patienten von Nutzen ist, die auf einen speziellen Wirkstoff ohne Nebenwirkungen reagieren können.

   Diese Identifikation/Auswahl kann auf der molekularen Diagnose von genetischen Polymorphismen durch Genotypisierung von, zum Beispiel DNA von Leukoycten im Blut von Patienten, und Charakterisierung der Krankheit beruhen (Bertz, Clin. Pharmacokinet. 32 (1997), 210-256; Engel, J. Chromatogra. B. Biomed. Appl. 678 (1996), 93-103).

   Für die Verantwortlichen im Gesundheitswesen, wie Gesundheitsorganisationen in den USA und staatliche, öffentliche Gesundheitsdienste in vielen europäischen Ländern kann dieser Ansatz der Pharmacogenomik einen Weg zur Verbesserung des Gesundheitswesens sein und zur Reduzierung der Overhead-Kosten führen, denn es gibt enorme Kosten für überflüssige Medikamente, unwirksame Medikamente und Medikamente mit Nebenwirkungen.

[0069] Daher betrifft ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung die pharmacogenomische Auswahl von Wirkstoffen und Wirkstoffvorläufern für Patienten, die an ZNS-Erkrankungen, wie den vorstehend beschriebenen, leiden und/ oder von Wirkstoffen und Wirkstoffvorläufern, die mögliche Kandidaten für eine Medikamententherapie sind.

   Somit stellen die Befunde der vorliegenden Erfindung Optionen für die Entwicklung neuer Wirkstoffe für die pharmakologische Intervention, mit dem Ziel der Wiederherstellung der Funktion der genetisch modifizierten NCS-1-Proteine. Mit der Hilfe der vorliegenden Erfindung kann auch ein Weg der Gentherapie ins Auge gefasst werden.

[0070] In Übereinstimmung mit dem Vorstehenden kann ein Neuronen-spezifischer Calcium-Sensor-1 (NCS-1 ) oder ein biologisch aktives Fragment davon, ein Nucleinsäuremolekül, das NCS-1 codiert oder eines Nucleinsäuremoleküls mit einer Länge von mindestens 15 Nucleotiden, das mit einem ncs-1-Gen hybridisiert, ein anti-NCS-1-Antikörper, eine Zelle wie vorstehend beschrieben oder ein NCS-1-Aktivitätstest für ein Verfahren zur Gewinnung,

   Identifizierung und/oder Profilierung eines Wirkstoffkandidaten für die Therapie einer ZNS-Erkrankung oder zur Modulation der Erkenntnis eines Individuums verwendet werden.

[0071] Nucleotidsequenzen, die zu der NCS-1 codierenden Gensequenz komplementär sind, können für die Antisense-Therapie synthetisiert werden. Diese Antisense-Moleküle können DNA, stabile Derivate von DNA wie Phophorothioate oder Methylphosphonate, RNA, stabile Derivate von RNA wie 2 ¾-O-alkylRNA oder andere Imitatoren von NCS-1-Antisense-oligonucleotiden sein. NCS-1-Antisense-Moleküle könne mittels Mikroinjektion, Liposomenverkapselung oder durch Expression von Vektoren mit der Antisensesequenz in Zellen eingebracht werden.

   Die NCS-1-Antisense-Therapie kann besonders nützlich für die Behandlung von Krankheiten sein, bei denen es von Nutzen ist, die NCS-1-Aktivität zu reduzieren.

[0072] Die NCS-1-Gentherapie kann zur Einbringung von NCS-1 in die Zellen eines Zielorganismus verwendet werden. Das NCS-1-Gen kann in virale Vektoren ligiert werden, die den Transfer der NCS-1-DNA durch Infektion der Empfängerwirtszellen vermitteln. Geeignete virale Vektoren umfassen Retrovirus, Adenovirus, Adeno-assoziiertes Virus, Herpesvirus, Vacciniavirus, Poliovirus und dergleichen. Alternativ kann die NCS-1-DNA für die Gentherapie mittels nicht-viraler Verfahren in Zellen, einschliesslich Rezeptorvermitteltem, gezieltem DNA-Transfer unter Verwendung von Liganden-DNA-Konjugaten oder Adenovirus-Liganden-DNA-Konjugaten, Lipofection-Membranfusion oder direkte Mikroinjektion eingebracht werden.

   Diese Verfahren (und Varianten davon) sind geeignet für die ex vivo- und die in vzvo-NCS-1-Gentherapie. Die NCS-1-Gentherapie kann insbesondere bei der Behandlung von Krankheiten von Nutzen sein, wo es angebracht ist, die NCS-1-Aktivität zu erhöhen. Protokolle für die molekularen Methoden der Gentherapie, die geeignet sind für die Verwendung mit dem NCS-1-Gen, sind in "Gene Therapy Protocols", herausgegeben von Paul D. Robbins, Human press, Totawa NJ, 1996, beschrieben.

[0073] Pharmazeutisch nützliche Zusammensetzungen wie hier vorstehend beschrieben, die NCS-1-DNA, NCS-1-RNA oder NCS-1-Protein oder Modulatoren der NCS-1-Aktivität, d.h. Aktivatoren/Agonisten oder Inhibitoren/Antagonisten enthalten, können gemäss bekannter Verfahren formuliert werden, zum Beispiel mittels Beimischung eines pharmazeutisch verträglichen Trägers.

   Beispiele für solche Träger und Verfahren für die Formulierung können in Remington's Pharmaceutical Sciences gefunden werden. Um eine pharmazeutisch verträgliche Zusammensetzung, die für eine wirksame Verabreichung geeignet ist, zu bilden, wird die Zusammensetzung eine wirksame Menge des Proteins, der DNA, RNA oder des Modulators enthalten.

[0074] Therapeutische oder diagnostische Zusammensetzungen, wie oben beschrieben, werden einem Individuum in solchen Mengen verabreicht, die ausreichen, um Krankheiten, bei denen eine Modulation der NCS-1-Aktivität angezeigt ist, zu behandeln oder zu diagnostizieren. Die wirksame Menge kann in Abhängigkeit von einer Vielzahl von Faktoren, wie dem Zustand des Individuums, dem Gewicht, Geschlecht und Alter, variieren. Andere Faktoren umfassen den Verabreichungsweg.

   Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können dem Individuum mittels einer Vielzahl von Wegen verabreicht werden, wie zum Beispiel auf subkutanen, topischen, oralen und intramuskulären Wegen. Die zu verwendeten Verbindungen und Modifikationen passieren vorzugsweise die Blut-Hirn-Schranke. Sie können jedoch auch so modifiziert werden, zum Beispiel durch chemische oder biochemische Modifikationen, dass sie besser die Blut-Hirn-Schranke passieren.

[0075] Der Ausdruck "chemisches Derivat" beschreibt ein Molekül, das zusätzliche chemische Einheiten enthält, die normalerweise nicht Bestandteil des Grundmoleküls sind. Solche Einheiten können die Löslichkeit, die Halbwertszeit, die Adsorption usw. des Grundmoleküls verbessern. Alternativ können die Einheiten unerwünschte Nebenwirkungen des Grundmoleküls unterdrücken oder die Toxizität des Grundmoleküls vermindern.

   Beispiele für solche Einheiten sind in einer Vielzahl von Texten beschrieben wie Remingtons Pharmaceutical Sciences.

[0076] Verbindungen, die gemäss den hier offenbarten Verfahren identifiziert wurden, können auch allein bei geeigneten Dosierungen verwendet werden. Diese Dosierungen können mittels Routinetests definiert werden, um eine optimale Inhibition des NCS-1-Rezeptors oder seiner Aktivität zu erhalten und um eine minimale potentielle Toxizität zu erreichen. Zusätzlich kann die gleichzeitige oder sequentielle Verabreichung anderer Mittel wünschenswert sein.

[0077] Eine therapeutische wirksame Dosis betrifft eine Menge an Protein, Antikörper, Agonisten, Aktivatoren, Antagonisten oder Inhibitoren, die die Symptome oder Zustände lindern.

   Die therapeutische Wirksamkeit und Toxizität solcher Verbindungen kann mittels pharmazeutischer Standardverfahren in Zellkulturen oder Versuchstieren bestimmt werden, z.B. ED50 (die bei 50% der Population therapeutisch wirksame Dosis) und LD50 (die bei 50% der Population tödliche Dosis). Das Dosisverhältnis zwischen therapeutischen und toxischen Wirkungen ist der therapeutische Index und er kann als das Verhältnis LD50/ED50 ausgedrückt werden.

[0078] Geeignete topische, orale, systemische und parenterale pharmazeutische Formulierungen müssen zur Verwendung bei den neuen Behandlungsverfahren der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden.

   Die Zusammensetzungen, die Verbindungen oder Modulatoren enthalten, die als der aktive Inhaltsstoff zur Verwendung bei der Modulation von NCS-1 definiert wurden, können mit einer grossen Vielzahl an therapeutischen Dosierungsformen in herkömmlichen Verabreichungsvehikeln verabreicht werden. Zum Beispiel können die Verbindungen oder Modulatoren in oralen Dosierungsformen wie Tabletten, Kapseln (jede einschliesslich zeitlich gestreckter und gestützter Freisetzungsformulierungen), Pillen, Puder, Granulate, Elixiere, Tinkturen, Lösungen, Suspensionen, Sirup und Emulsionen verabreicht werden oder mittels Injektion.

   In ähnlicher Weise können sie in intravenöser (Bolus oder Infusion), intraperitonealer, subkutaner, topischer mit oder ohne Occlusion oder intramuskulärer Form, alle unter Verwendung von Formen, die dem Durchschnittsfachmann auf dem pharmazeutischen Fachgebiet bekannt sind, verabreicht werden. Eine wirksame aber nicht toxische Menge der erwünschten Verbindung kann als NCS-1-modulierendes Mittel verwendet werden.

[0079] Die tägliche Dosis der Produkte kann über einen weiten Bereich variiert werden von 0,01 bis 1.000 mg pro Patient pro Tag. Für die orale Verabreichung werden die Zusammensetzungen bevorzugt in der Form von gekerbten oder ungekerbten Tabletten bereitgestellt, die 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0, 25.0 und 50.0 Milligramm des aktiven Inhaltsstoffs zur symptomatischen Anpassung der Dosis des zu behandelnden Patienten enthalten.

   Eine wirksame Menge des Wirkstoffs wird üblicherweise zu Dosisspiegeln von etwa 0,0001 mg/kg bis zu etwa 100 mg/kg Körpergewicht pro Tag verabreicht. Der Bereich ist spezifischer von etwa 0.001 mg/kg bis zu 10 mg/kg Körpergewicht pro Tag. Die Dosierungen der NCS-1-Modulatoren werden angepasst, wenn sie kombiniert werden, um erwünschte Wirkungen zu erzielen. Auf der anderen Hand können die Dosierungen der verschiedenen Mittel unabhängig optimiert und kombiniert werden, um ein synergistisches Resultat zu erzielen, wobei die Pathologie mehr reduziert ist, als wenn jedes Mittel allein verwendet würde.

[0080] Vorteilhaft können die Verbindungen oder Modulatoren der vorliegenden Erfindung in einer einzelnen täglichen Dosis verabreicht werden oder die tägliche Gesamtdosis kann in geteilten Dosen von zwei-, drei- oder viermal täglich verabreicht werden.

   Darüber hinaus können die Verbindungen oder Modulatoren für die vorliegende Erfindung in intranasaler Form mittels topischer Verwendung von geeigneten intranasalen Vehikeln verabreicht werden oder über transdermale Wege unter Verwendung der Form von transdermalen Hautpflastern, die dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet bekannt sind. Um in der Form eines transdermalen Verabreichungssystems verabreicht zu werden, wird die Dosisverabreichung während der Dosierungsschemas natürlich kontinuierlich sein und nicht intermittierend.

   Für die Kombinationsbehandlung mit mehr als einem aktiven Mittel, wobei die aktiven Mittel in getrennten Dosisformulierungen sind, können die aktiven Mittel gleichzeitig verabreicht werden oder sie können zu verschiedenen, gestaffelten Zeiten verabreicht werden.

[0081] Das Dosierungsschema unter Verwendung der Verbindungen oder Modulatoren der vorliegenden Erfindung wird in Übereinstimmung mit einer Vielzahl von Faktoren ausgewählt. Diese Faktoren schliessen Typus, Art, Alter, Gewicht, Geschlecht und medizinischen Zustand des Patienten, Ernsthaftigkeit des zu behandelnden Zustands, Verabreichungsweg, Nieren- und Leberfunktion des Patienten, als auch spezielle, an ihn verabreichte Verbindung ein.

   Ein Arzt oder Tierarzt von normalem Können kann leicht die wirksame Menge des Medikaments feststellen und verschreiben, die erforderlich ist, um das Fortschreiten des Zustands zu verhindern, ihm zu begegnen oder festzuhalten. Die optimale Präzisierung zur Festlegung der Konzentrationen eines Medikaments innerhalb des Bereichs, der ohne Toxizität wirksam ist, erfordert ein Schema, das auf der Kinetik der Verfügbarkeit des Medikaments an den Zielstellen beruht.

   Dies beinhaltet eine Betrachtung der Verteilung, des Gleichgewichts und der Ausscheidung eines Medikaments.

[0082] Bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung können die hier im Detail beschriebenen Verbindungen oder Modulatoren den aktiven Inhaltsstoff bilden und werden typischerweise in Zumischung mit geeigneten pharmazeutischen Verdünnungsmitteln, Exzipienten oder Trägern (gemeinsam hier als "Träger"-Materialien bezeichnet) verabreicht, die in Hinblick auf ihre geplante Verabreichungsform in geeigneter Weise ausgewählt wurden.

   Diese Verabreichungsformen umfassen, wie oben beschrieben, (orale) Tabletten, Kapseln, Elixiere, Sirup und dergleichen und werden in Übereinstimmung mit herkömmlichen pharmazeutischen Praktiken hergestellt.

[0083] Zum Beispiel kann für die orale Verabreichung in der Form einer Tablette oder Kapsel der aktive Medikamentenbestandteil mit einem oralen, nicht-toxischen, pharmazeutisch verträglichen, inerten Träger wie Ethanol, Glycerin, Wasser und dergleichen kombiniert werden. Darüber hinaus können, wenn erwünscht oder erforderlich, geeignete Bindemittel, Schmiermittel, desintegrierende Mittel und Färbemittel in das Gemisch eingebaut werden.

   Geeignete Bindemittel umfassen ohne Einschränkung Stärke, Gelatine, natürliche Zucker wie Glucose oder beta-Lactose, Kornsüssstoffe, natürliche und synthetische Gummis wie Acacia, Tragacanth oder Natriumalginat, Carboxymethylcellulose, Polyethylenglycol, Wachse und dergleichen. In den Dosierungsformen verwendete Schmiermittel umfassen ohne Einschränkung Natriumoleat, Natriumstearat, Magnesiumstearat, Natriumbenzoat, Natriumacetat, Natriumchlorid und dergleichen. Desintegrierende Mittel umfassen ohne Einschränkung Stärke, Methylcellulose, Agar, Bentonit, Xanthangummi und dergleichen.

[0084] Für flüssige Formen kann der aktive Medikamentenbestandteil in mit geeignetem Geschmack versehenen suspendierenden oder dispergierenden Mitteln wie natürliche und synthetische Gummis, zum Beispiel Tragacanth, Acacia, Methylcellulose und dergleichen kombiniert werden.

   Andere dispergierende Mittel können zur Anwendung kommen, einschliesslich Glycerin und dergleichen. Für die parenterale Verabreichung sind sterile Suspensionen und Lösungen erwünscht. Isotonische Herstellungen, die im Allgemeinen Konservierungsstoffe enthalten, werden dann angewendet, wenn die intravenöse Verabreichung gewünscht wird.

[0085] Topische Präparationen, die den aktiven Medikamentenbestandteil enthalten, können einer Vielzahl, im Stand der Technik bekannten Trägern beigemischt werden, wie Alkohole, Aloe-vera-Gel, Allantoin, Glycerin, Vitamin A- und E-Ölen, Mineralöl, PPG2 Myristylpropionat und dergleichen um z.B.

   alkoholische Lösungen, topische Reinigungsmittel, Reinigungscremes, Hautgele, Hautlotionen, und Shampoos in Creme- oder Gelformulierungen.

[0086] Die Verbindungen oder Modulatoren der vorliegenden Erfindung können auch in der Form von Liposomen-Verabreichungssystemen verabreicht werden, wie kleine unilamellare Vesikel, grosse unilamellare Vesikel und multilamellare Vesikel. Liposomen können von einer Vielzahl von Phopholipiden gebildet werden wie Cholesterin, Stearylamin oder Phophatidylcholine.

[0087] Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch unter Verwendung von (monoklonalen) Antikörpern als individuelle Träger verabreicht werden, an die die Verbindungsmoleküle gebunden sind. Die Verbindungen oder Modulatoren der vorliegenden Erfindung können auch mit löslichen Polymeren als zielgerichteten Wirkstoffträgern gekoppelt sein.

   Solche Polymere können Polyvinylpyrrolidon, Pyrancopolymer, Polyhydroxypropylmethacrylamidphenol, Polyhydroxyethylaspartamidphenol oder mit Palmitoylresten substituiertes Polyethyleneoxidpolylysin umfassen. Darüber hinaus können die Verbindungen oder Modulatoren der vorliegenden Erfindung auch an eine Klasse von biologisch abbaubaren Polymeren gebunden sein, die zur kontrollierten Freisetzung eines Medikaments von Nutzen sind, zum Beispiel Polymilchsäure, Polyepsiloncaprolacton, Polyhydroxybuttersäure, Polyorthoester, Polyacetale, Polydihydropyrane, Polycyanoacrylate oder vernetzte oder amphipathische Blockcopolymere von Hydrogelen.

[0088] Für die orale Verabreichung können die Verbindungen oder Modulatoren in Kapseln, Tabletten der Form eines Bolus verabreicht werden oder sie können alternativ in das Tierfutter gemischt werden.

   Die Kapseln, Tabletten oder Bolen bestehen aus dem aktiven Inhaltsstoff in Kombination mit einem geeigneten Trägervehikel wie Stärke, Talcum, Magnesiumstearat oder Dicalciumphosphat. Diese Einheitsdosierungsformen werden durch intensive Mischung der aktiven Inhaltsstoffe mit geeigneten feinpudrigen inerten Inhaltsstoffen einschliesslich Verdünnungsmitteln, Füllstoffen, desintegrierenden Mitteln und/oder Bindemitteln hergestellt, so dass ein einheitliches Gemisch entsteht. Ein inerter Inhaltsstoff ist einer, der nicht mit den Verbindungen oder Modulatoren reagieren wird und der für das zu behandelnde Tier nicht-toxisch ist. Geeignete inerte Inhaltsstoffe umfassen Stärke, Lactose, Talcum, Magnesiumstearat, Pflanzengummis und -öle und dergleichen.

   Diese Formulierungen können in Abhängigkeit von zahlreichen Faktoren wie der Grösse und des Typs der zu behandelnden Tierart und des Typs und der Ernsthaftigkeit der Erkrankung eine breit variierende Menge der aktiven und inaktiven Inhaltsstoffe enthalten. Der aktive Inhaltsstoff kann auch als Zusatz zum Futter verabreicht werden, indem man einfach die Verbindung mit dem Futter mischt oder die Verbindung auf die Oberfläche des Futters aufbringt. Alternativ kann der aktive Inhaltsstoff mit einem inerten Träger gemischt werden und die resultierende Zusammensetzung kann dann mit dem Futter gemischt oder direkt an das Tier verfüttert werden. Geeignete inerte Träger umfassen Kornmehl, Citrusmehl, Fermentationsrückstände, Sojaschrot, getrocknetes Getreide und dergleichen.

   Die aktiven Inhaltsstoffe werden durch Zerreiben, Rühren, Vermahlen oder Schütteln intensiv mit diesen inerten Trägern gemischt, so dass die Endzusammensetzung 0.001 bis 5 Gew.-% des aktiven Inhaltsstoffs enthält.

[0089] Die Verbindungen oder Modulatoren können alternativ durch Injektion einer Formulierung, die aus dem aktiven Inhaltsstoff besteht, gelöst in einem inerten flüssigen Träger, parenteral verabreicht werden. Die Injektion kann intramuskulär, intraruminal, intratracheal oder subkutan erfolgen. Die injizierbare Formulierung besteht aus dem aktiven Inhaltsstoff, gemischt mit einem geeigneten inerten flüssigen Träger. Verträgliche flüssige Träger umfassen die pflanzlichen Öle wie Erdnussöl, Baumwollsamenöl, Sesamöl und dergleichen ebenso wie organische Lösungsmittel wie Solketal, Glycerinformal und dergleichen.

   Als eine Alternative können auch flüssige parenterale Formulierungen verwendet werden. Die pflanzlichen Öle sind die bevorzugten flüssigen Träger. Die Formulierungen werden durch Auflösen oder Suspendieren des aktiven Inhaltsstoffs in dem flüssigen Träger hergestellt, so dass die endgültige Formulierung 0.005 bis 10 Gew.-% des aktiven Inhaltsstoffs enthält.

[0090] Die topische Verabreichung der Verbindungen oder Modulatoren ist möglich durch Verwendung einer flüssigen Lotion oder eines Shampoo, das die betreffenden Verbindungen oder Modulatoren als eine wässrige Lösung oder Suspension enthält. Diese Formulierungen enthalten im Allgemeinen ein Suspensionsmittel wie Bentonit und werden normalerweise auch ein Antischaummittel enthalten. Formulierungen, die 0.005 bis 10 Gew.-% des aktiven Inhaltsstoffs enthalten, sind verträglich.

   Bevorzugte Formulierungen sind diejenigen, die 0.01 bis 5 Gew.-% der betreffenden Verbindungen oder Modulatoren enthalten.

[0091] Insbesondere können die bereits beschriebenen Verbindungen und Modulatoren auch mit Substanzen verabreicht werden, die den Verbindungen und Modulatoren eine Passage der Blut-Hirn-Schranke ermöglichen.

[0092] Ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten, der eine Behandlung einer Erkrankung benötigt, die von dem Neuronen-spezifischen Calcium-Sensor-1 (NCS-1) vermittelt wird, umfasst die Verabreichung eines Wirkstoffs oder eines Wirkstoffkandidaten, der gemäss einem der vorstehend beschriebenen Verfahren identifiziert oder gewonnen wurde.

   Zusätzlich betrifft die vorliegenden Erfindung auch ein Verfahren zur Behandlung von ZNS-Erkrankungen in einem Individuum oder zur Verbesserung des Erkennens eines Individuums, wobei das Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge eines therapeutischen Mittels umfasst, und das therapeutische Mittel den Spiegel und/oder die Aktivität von NCS-1 erhöht und damit die Calcium-Signalübertragung in dem Individuum verbessert oder wiederherstellt.

[0093] In einer bevorzugten Ausführungsform der Verwendungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung ist die besagte Krankheit die Alzheimer Krankheit, die Parkinson Krankheit, Alters-assoziierte Erkennungsdefizite, Depression, die Bipolare Krankheit, Angstgefühle, Appetitstörungen, Schlafstörungen, Schlaflosigkeit,

   Aufmerksamkeitsdefizit-Hyperaktivitäts-Störung oder Gedächtnisverlust oder eine Lernstörung oder sie bezieht sich darauf.

[0094] In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Diagnose eines pathologischen Zustands oder der Neigung zu einem pathologischen Zustand in einem Individuum, die mit einer ZNS-Störung in Beziehung steht:
(a) : Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Mutation in dem Polynucleotid, das den Neuronen-spezifischen Calcium-Sensor-1 (NCS-1) codiert; und
(b) :

   Diagnose eines pathologischen Zustands oder der Neigung zu einem pathologischen Zustand, beruhend auf der Anwesenheit oder Abwesenheit besagter Mutation.

[0095] In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Diagnose eines pathologischen Zustands oder der Neigung zu einem pathologischen Zustand in einem Individuum, die mit einer ZNS-Störung in Beziehung steht, das umfasst:
(a) : Bestimmung der Anwesenheit oder der Menge an Expression eines Neuronen-spezifischen Calcium-Sensor-1 (NCS-1)-Polypeptids in einer biologischen Probe; und
(b) :

   Diagnose eines pathologischen Zustands oder der Neigung zu einem pathologischen Zustand, beruhend auf der Anwesenheit oder Menge von Expression des Polypeptids.

[0096] In diesen Ausführungsformen sind die vorstehend identifizierten NCS-1-Polynucleotide, Nucleinsäuremoleküle, (Polypeptide, Antikörper oder Verbindungen vorzugsweise nachweisbar markiert. Eine Vielzahl an Verfahren sind zur Markierung von Biomolekülen verfügbar, sind dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet bekannt und werden als innerhalb dem Umfang der vorliegenden Erfindung liegend betrachtet.

   Solche Verfahren werden z.B. in Tijssen, "Practice and theory of enzyme immuno assays", Burden, RH und von Knippenburg (Hrsg.), Band 15 (1985), "Basic methods in molecular biology"; Davis LG, Dibmer MD; Battey Elsevier (1990), Mayer et al., (Hrsg.) "Immunochemical methods in cell and molecular biology" Academic Press, London (1987) oder in der Serie "Methods in Enzymology", Academic Press, Inc. beschrieben.

   Es sind dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet viele verschieden Markierungen und Verfahren zur Markierung bekannt. Üblicherweise verwendete Markierungen umfassen unter anderem Fluorochrome (wie Fluorescein, Rhodamin, Texasrot usw.), Enzyme (wie Meerrettich-Peroxidase, beta -Galactosidase, alkalische Phosphatase), radioaktive Isotope (wie <32>P oder <125>I), Biotin, Digoxygenin, kolloidale Metalle, chemi- oder biolumineszierende Verbindungen (wie Dioxetane, Luminol oder Acridinium). Verfahren zur Markierung wie kovalente Kopplung von Enzymen oder Biotinylgruppen, Jodierungen, Phosphorylierungen, Biotinylierungen, Zufallspriming, Nick-Translation, Tailing (unter Verwendung von terminalen Transferasen) sind im Stand der Technik bekannt.

   Nachweisverfahren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Autoradiographie, Fluoreszenzmikroskopie, direkte und indirekte enzymatische Reaktionen usw.

[0097] Zusätzlich können die vorstehend beschriebenen Verbindungen usw. an eine feste Phase gebunden werden. Feste Phasen sind dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet bekannt und können Polystyrolkügelchen, Latexkügelchen, magnetische Kügelchen, kolloidale Metallpartikel, Glas- und/oder Siliciumchips und -Oberflächen, Nitrocellulosestreifen, Membranen, Blätter, tierische rote Blutzellen, oder künstliche rote Blutzellen, Duracyte, und die Wände von Mulden von Reaktionsplatten, Plastikschläuche oder anderen Testschläuche umfassen.

   Geeignete Verfahren für die Immobilisierung von NCS-1-Nucleinsäuren, (Poly)Peptiden, Proteinen, Antikörpern usw. an der festen Phase umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, ionische, hydrophobe, kovalente Wechselwirkungen und dergleichen. Die feste Phase kann einen oder mehrere zusätzliche Rezeptoren behalten, welche(r) die Fähigkeit hat (haben), den vorstehend beschriebenen Bereich anzuziehen und zu immobilisieren.

   Dieser Rezeptor kann eine geladene Verbindung umfassen, die in Bezug auf das Reagens selbst oder auf eine geladenes Substanz, die mit dem festgehaltenen Reagens konjugiert ist, gegensätzlich geladen ist oder der Rezeptor kann jeder spezifische Bindungspartner sein, der an der festen Phase immobilisiert (daran gebunden) ist und der in der Lage ist, wie vorstehend definiert das Reagens zu immobilisieren.

[0098] Üblicherweise verwendete Nachweissysteme können radioisotopische oder nicht-radioisotopische Verfahren umfassen. Diese umfassen unter anderem RIA (radioisotopischer Test) und IRMA (Immun-Radioimmunometrischer Test), EIA (Enzymimmuntest), ELISA ((Enzymgebundener Immuntest), FIA (Fluoreszierender Immuntest) und CLIA (Chemilumineszierender Immuntest). Andere Nachweisverfahren, die im Stand der Technik verwendet werden, sind diejenigen, die keine Tracer-Moleküle verwenden.

   Ein Prototyp dieser Verfahren ist der Agglutinationstest, basierend auf der Eigenschaft eines gegebenen Moleküls, mindestens zwei Partikel zu überbrücken.

[0099] Für die Diagnose und Quantifizierung von (Poly)Peptiden, Polynucleotiden usw. in klinischen und/oder wissenschaftlichen Proben sind eine Reihe von immunologischen Verfahren, wie vorstehend beschrieben, ebenso wie molekularbiologische Verfahren, wie Nucleinsäurehybridisierungstests, PCR-Tests oder DNA-Enzymimmuntests (Mantero et al., Clinical Chemistry 37 (1991), 422-429) entwickelt worden und sind im Stand der Technik bekannt. In diesem Kontext sollte festgehalten werden, dass NCS-1-Nucleinsäuremoleküle auch PNAs, modfizierte DNA-Analoga mit Amidbindungen im Rückgrat, enthalten können.

   Solche PNAs sind unter anderem als Sonden für die DNA/RNA-Hybridisierung von Nutzen.

[0100] Die vorstehend beschriebenen Zusammensetzungen können für Verfahren zum Nachweis der Expression eines NCS-1-Polynucleotids durch Nachweis der Anwesenheit einer mRNA, die für ein NCS-1-(Poly)Peptid codiert, verwendet werden. Das Verfahren umfasst, zum Beispiel, die Gewinnung der mRNA von den Zellen eines Individuums und das In-Kontakt-Bringen der so erhaltenen mRNA mit einer Sonde/einem Primer, die/der ein Nucleinsäuremolekül enthält, das in der Lage ist, spezifisch mit einem NCS-1-Polynucleotid unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen zu hybridisieren, und den Nachweis der Anwesenheit von mRNA, die mit der Sonde/dem Primer hybridisiert.

   Weitere diagnostische Verfahren, die zum Nachweis eines Nucleinsäuremoleküls in einer Probe führen, umfassen z.B. die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die Ligase-Kettenreaktion (LCR), Southern Blotting in Kombination mit Nucleinsäurehybridisierung, vergleichende genomische Hybridisierung (CGH) oder repräsentative Differenzanalyse (RDA). Diese Verfahren für den Test auf die Anwesenheit von Nucleinsäuremolekülen sind im Stand der Technik bekannt und können ohne zusätzliche Experimente durchgeführt werden.

[0101] Darüber hinaus betrifft die Erfindung Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit von NCS-1-Protein in einer Probe, zum Beispiel einer Zelle.

   Solch ein Verfahren umfasst zum Beispiel die Gewinnung einer Zellenprobe von einem Individuum, das In-Kontakt-Bringen besagter Probe mit einem der vorstehend erwähnten Antikörper unter Bedingungen, die die Bindung des Antikörpers an das NCS-1-Protein zulassen und den Nachweis der Anwesenheit des so gebundenen Antikörpers unter Verwendung von zum Beispiel Immuntestverfahren wie Radioimmuntest oder Enzymimmuntest.

   Darüber hinaus kann ein Durchschnittsfachmann Polypeptide spezifisch nachweisen und voneinander unterscheiden, die funktionelle NCS-1-Proteine sind oder mutierte Formen sind, die ihre NCS-1-Aktivität verloren oder geändert haben, unter Verwendung eines Antikörpers, der spezifisch ein (Poly)Peptid erkennt, das NCS-1-Aktivität hat, der aber eine inaktive Form davon nicht erkennt, oder der spezifisch eine inaktive Form erkennt, aber nicht das entsprechende Polypeptid, das NCS-1-Aktivität hat.

[0102] Ein Verfahren zur Diagnose einer Prädisposition eines Individuums für eine ZNS-Erkrankung, die mit der Expression eines NCS-1-Allels assoziiert ist, umfasst, zum Beispiel, die Isolierung von DNA von Opfern der Erkrankung, die mit der Unter- oder Überexpression eines NCS-1-Proteins oder einer Mutante davon assoziiert ist;

   den Verdau der isolierten DNA mit mindestens einem Restriktionsenzym; die elektrophoretische Auftrennung der resultierenden DNA-Fragmente auf einem Grössengel; das In-Kontakt-Bringen des resultierenden Gels mit einer vorstehend beschriebenen Nucleinsäuresonde, die in der Lage ist, spezifisch mit DNA zu hybridisieren, die ein NCS-1-Protein codiert und die mit einer nachweisbaren Markierung markiert ist; den Nachweis der markierten Banden auf dem Gel, die mit der markierten Sonde hybridisiert haben, um ein Bandenmuster zu schaffen, das spezifisch ist für die DNA von Opfern der Erkrankung, die mit der Expression des NCS-1-Proteins assoziiert ist; die Präparation der DNA des Individuums gemäss den vorstehend erwähnten Schritten, um nachweisbar markierte Banden in einem Gel zu produzieren;

   und den Vergleich des Bandenmusters, das spezifisch ist für die DNA von Opfern der Erkrankung, die mit der Expression des NCS-1-Proteins assoziiert ist, und der DNA des Individuums, um zu bestimmen, ob die Muster gleich oder verschieden sind und um damit eine Prädisposition für die Erkrankung zu diagnostizieren, wenn die Muster gleich sind. Die nachweisbaren Marker der vorliegenden Erfindung können mit üblicherweise verwendeten radioaktiven Markierungen markiert sein, wie zum Beispiel <32>P und <35>S, obwohl auch andere Markierungen wie Biotin oder Quecksilber, ebenso wie die vorstehend beschriebenen, ebenso verwendet werden können. Verschiedene Verfahren, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind, können verwendet werden, um die nachweisbaren Marker zu markieren.

   Zum Beispiel können DNA-Sequenzen und RNA-Sequenzen unter Verwendung des Zufallsprimer-Verfahrens mit <32>P und <35>S markiert werden. Nachdem ein geeigneter nachweisbarer Marker erhalten wurde, können verschiedene, dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren zum In-Kontakt-Bringen des nachweisbaren Marker mit der Probe von Interesse verwendet werden. Zum Beispiel können unter Verwendung von Standardverfahren DNA/DNA-, RNA/RNA- und DNA/RNA-Hybridisierung durchgeführt werden. Verschiedene Verfahren für den Nachweis von Nucleinsäuren sind im Stand der Technik bekannt, z.B. Southern und Northern Blotting, PCR, Primerverlängerung und dergleichen.

   Geeignete weitere DNA-Amplifikationsverfahren sind im Stand der Technik bekannt und umfassen unter anderem die Ligase-Kettenreaktion, die Strangersatz-Amplifikation, die Nucleinsäuresequenz-basierende Amplifikation (NASBA) oder Q-beta-Replicase.

[0103] Darüber hinaus kann die mRNA, cRNA, cDNA oder genomische DNA, die von dem Individuum erhalten wurde, sequenziert werden, um Mutationen zu identifizieren, die charakteristische Fingerabdrücke von NCS-1-Mutationen bei vorstehend beschriebenen ZNS-Erkrankungen sein können, die mit der Expression von NCS-1 oder mutierten Versionen davon assoziiert sind.

   Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin Verfahren, worin ein solcher Fingerabdruck durch RFLPs oder AFLP von DNA oder RNA erzeugt wird, die von dem Individuum erhalten wurde, gegebenenfalls kann die DNA oder RNA vor der Analyse amplifiziert werden, diese Verfahren sind im Stand der Technik bekannt. RNA-Fingerabdrücke können durch zum Beispiel durch Verdau einer RNA-Probe, die von dem Individuum erhalten wurde, mit einem geeigneten RNA-Enzym, zum Beispiel RNase T1, RNase T2 oder dergleichen oder einem Ribozym und zum Beispiel durch elektrophoretischer Trennung und Nachweis der RNA-Fragmente auf PAGE, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt werden. Vorzugsweise wird die Hybridisierung (und das anschliessende Waschen) unter stringenten Bedingungen durchgeführt; vgl. z.B.

   Sambrook et al., loc. cit und vorstehend.

[0104] Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung ein vorstehend beschriebenes Verfahren, worin die besagte Probe, zum Beispiel Nervengewebe, Haar, Blut, Serum, Speichel, Kot, oder eine andere Körperflüssigkeit oder davon abgeleitet ist, umfasst. Die zu analysierende Probe kann behandelt werden, um unter anderem Nucleinsäuremoleküle, (Poly)Peptide oder Antikörper zu extrahieren.

[0105] Kits, die NCS-1 -DNA oder -RNA enthalten, Antikörper gegen NCS-1, oder NCS-1-Protein, können hergestellt werden. Solche Kits werden verwendet, um DNA nachzuweisen, die mit NCS-1-Nucleinsäure hybridisiert, oder um die Anwesenheit von NCS-1-Protein oder -Peptidfragmenten in einer Probe nachzuweisen.

   Eine solche Charakterisierung ist von Nutzen für eine Vielzahl von Zwecken, einschliesslich, aber nicht beschränkt auf, forensische Analysen, diagnostische Anwendungen und epidemiologische Studien gemäss den vorstehend beschriebenen Verfahren der vorliegenden Erfindung.

[0106] Die rekombinanten NCS-1-Proteine, DNA-Moleküle, RNA-Moleküle und Antikörper eignen sich für die Formulierung von Kits, die geeignet sind für den Nachweis und die Typisierung von NCS-1. Ein solcher Kit umfasst typischerweise einen kompartimentierten Träger, der geeignet ist, in enger Verbindung mindestens ein Behältnis zu halten. Der Träger kann weiterhin Reagenzien, wie rekombinantes NCS-1-Protein oder anti-NCS-1-Antikörper, enthalten, die geeignet sind, NCS-1 nachzuweisen.

   Der Träger kann auch Mittel zum Nachweis enthalten, wie markiertes Antigen oder Enzymsubstrate oder dergleichen.

[0107] Diese und andere Ausführungsformen werden durch die Beschreibung und die Beispiele der vorliegenden Erfindung offenbart und umfasst. Weitere Literatur betreffend der gemäss der vorliegenden Erfindung zu verwendenden Antikörper, Verfahren, Verwendungen und Verbindungen können öffentlichen Bibliotheken und Datenbanken entnommen werden, unter Verwendung von zum Beispiel elektronischen Mitteln.

   Zum Beispiel kann die öffentliche Datenbank "Medline" benutzt werden, die im Internet verfügbar ist, zum Beispiel unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html.

[0108] Weitere Datenbanken und Adressen wie http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, http://www.infobiogen.fr, http://www.fmi.ch/biology/research_tools.html, http://www.tigr.org/, sind dem Durchschnittsfachmann bekannt und können auch unter Verwendung von z.B. http://www.lycos.com erhalten werden. Ein Überblick über die Patientinformation in der Biotechnologie und ein Überblick über relevante Quellen für Patientinformation von Nutzen für retrospektive Recherchen und für gegenwärtige Aufmerksamkeit wird in Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364 gegeben.

[0109] Die Offenbarung kann am besten verstanden werden in Zusammenhang mit den beigefügten Abbildungen, die durch Zitierung hier eingeschlossen sind.

   Darüber hinaus wird ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung und ihrer vielen Vorteile durch die folgenden Beispiele erreicht, die zum Zwecke des Verständnisses gegeben werden und nicht als einschränkend zu verstehen sind.

[0110] Ausser wenn in den Beispielen nicht anders festgehalten, werden alle rekombinanten DNA-Verfahren gemäss den Protokollen wie in Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY oder in den Bänden 1 und 2 in Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, beschrieben durchgeführt. Stellen-gerichtete Mutagenese wurde unter Verwendung des QuikChange Site-directed Mutagenesis-Kits (Stratagene) durchgeführt.

   Der Wildtypstamm Bristol von C. elegans (N2) wurde vom Caenorhabditis Genetics Center (unterstützt vom NIH National Center for Research Resources) erhalten.

[0111] Die Figuren zeigen:

[0112] Fig. 1. Expressionsmuster des ncs-1::GFP-Reportergens
(A) Die ncs-1-Genexpression wird im Amphid, Phasmid, Nervenring- und im ventralen Nervenstrang von Tieren im Stadium L1 durch GFP-Färbung beobachtet. Markierung entspricht 100 MicroM.
(B) Die ncs-1-Genexpression im erwachsenen Kopf, die GFP-Färbung in amphiden Dendriten zeigt. Markierung entspricht 10 MicroM.

[0113] Fig. 2. CE-NCS-1: von der Genstruktur zum Calcium-Sensor
(A) Physikalische Karten von Wildtyp-Ce-ncs-1, ncs-1(pk242::Tc1) und Null ncs-1(qa401te)-Deletionsgenen. Die schwarzen Kästen repräsentieren die Exons 1-6, und die grauen Kästen die 5 ¾ und 3 ¾ nicht translatierten Bereiche des ncs-1-Gens.

   Markierung entspricht 500 Basenpaaren.
(B) Das NCS-1-Protein enthält 4 EF-Hände (EF1-4), die erste Bindungsstelle ist aber degeneriert und kann Ca<2+> nicht binden (De Castro et al., 1995). Die Asp-Positionen D73, D109 und D157 sind essentiell für die Calcium-Bindung. Die Veränderung der drei Asp-Reste (D*) in Ala inaktiviert die Ca<2+>-Bindung (Putkey et al., 1989) (vgl. nachstehend).
(C) Die Triple-Mutante mit Funktionsverlust ("loss-of-function"; lf) wurde durch Substitution des ersten Asp (D*)-Restes durch ein Ala bei den drei EF-Händen EF2, 3 und 4 konstruiert.
(D) CE-NCS-1 ist ein Calcium-Sensor. Calcium-gebundenes Wildtyp-NCS-1 zeigte eine grössere elektrophoretische Mobilität als die apo-Form, wohingegen die Mobilität von lf-NCS-1 durch die Anwesenheit (+Ca<2+>) oder Abwesenheit (+EGTA) von freiem Calcium nicht beeinflusst wurde.

   Dies legt nahe, dass Ca<2+> eine allosterische Veränderung bei der Konformation und wahrscheinlich Aktivität von CE-NCS-1 induziert.

[0114] Fig. 3. Ca<2+>-Signalübertragung durch NCS-1 im AIY-Interneuron ist essentiell für das isothermische Spurverhalten
(A) Aufzeichnungen von individuellen isothermischen Spuren (IT). Photographien von normalen und unterbrochenen isothermischen Verhaltensspuren von Wildtyp (WT), ncs-1(qa401te) Knockout (KO), gerettetem ncs-1(qa401te) mit Wildtyp-ncs-1 (RWT) oder mit ncs-1 mit Funktionsverlust (RLF) oder mit dem AFD neuronenspezifischen Promotor (RAFD), der die Expression von NCS-1 antreibt oder mit dem AIY neuronenspezifischen Promotor (RAIY), der die Expression von NCS-1 antreibt, und Wildtyp plus transgenen ncs-1 (Tg-ncs-1) individuellen Würmern werden gezeigt.

   Die Thermotaxis-Versuche wurden durchgeführt wie in Mori und Ashima (1995) beschrieben.
(B) Prozentsatz (Gruppenleistung) von Würmern, die das IT-Verhalten nach Fütterung über Nacht bei 20 deg. C durchführten. Jeder Datenpunkt repräsentiert 4-10 unabhängige Tests unter Verwendung von etwa 10-20 Tieren pro Test. Mindestens 2-3 verschiedene Linien wurden für jedes transgene Konstrukt hergestellt. Die chi-square-Verteilung und T-Test wurden verwendet, um die Signifikanz der IT-Verhaltensleistung zwischen den verschiedenen Stämmem zu bestimmen. Der P-Wert (*<= 0,02) zeigt einen signifikanten Unterschied zwischen Tg-ncs-1-Tieren im Vergleich mit Wildtyp-Würmern. Die P-Werte (**<= 0,002) stellen signifikante Unterschiede der Leistung zwischen KO-Tieren und RWT- oder RAIY-Tieren dar. Bei diesen Experimenten liegt die Standardabweichung bei 7 bis 14%.

   Eine Spur wird als isothermisch angesehen, wenn mehr als die Hälfte der Spurlänge auf der Agaroberfläche von einem einzelnen Tier kreisförmig ist oder auf einem Kreisbogen in der Nähe der Isotherme der Wachstumstemperatur liegt.
(C) CE-NCS-1-Proteinspiegel in den verschiedenen WT-, KO-, RWT-, RLF-Stämmem oder -Linien. Die Western Blot-Analyse unter Verwendung von polyklonalen Antikörpern gegen CE-NCS-1 und 80 Microg Gesamtproteinextrakt zeigt die Anwesenheit von NCS-1-Calcium-Sensor im Wildtyp-Stamm (WT), in den NCS-1 -geretteten Wildtyp-Linien (RWT) und in den geretteten Funktionsverlust-Linien (RLF). Die Abwesenheit von NCS-1 im Knockout-Stamm (KO) ist zu vermerken.

[0115] Fig. 4.

   Schnellerer Erwerb (Lernen) und längeres Behalten (Gedächtnis) der NCS-1 überexprimierende Würmer
(A) Das Erlernen der Assoziation zwischen Futter bei einer gegebenen Temperatur wurde für Wildtyp (WT)- und überexprimierende NCS-1 (Tg-ncs-1)-Würmer durch Messung des Prozentsatzes an Würmern gemessen, die bei 20 deg. C IT-Verhalten zeigten. In Kürze wurden Würmer auf besäten Platten mindestens 12 Stunden bei 25 deg. C wachsen gelassen, dann wurden sie einzeln für verschiedene Zeiträume auf eine besäte Platte bei 20 deg. C versetzt. Für beide Stämme wurden die maximalen Niveaus von IT-Verhalten (absolute Werte) nach Paarung der Konditionierungs-Stimuli für mindestens 12 Stunden erreicht. 50% der maximalen Niveaus wurden für WT-Würmer nach 68 Minuten und nach nur 28 Minuten für Tg-ncs-1-Würmer erreicht.

   Da das halb-maximale Erlernen gemessen wurde statt des relativen IT-Index (siehe nachstehende Definition) wurde das Experiment intern für jeden Stamm auf verbesserte Leistung kontrolliert.
(B) Das Auslöschen dieser Assoziation (Futter bei 20 deg. C) wurde für für Wildtyp (WT)- und überexprimierende NCS-1 (Tg-ncs-1)-Würmer bestimmt. In Kürze wurden Würmer bei 20 deg. C in der Anwesenheit von Futter für mindestens 18 Stunden wachsen gelassen, bei 20 deg. C gewaschen und bei 20 deg. C für verschiedene Zeitabschnitte auf eine nicht beschichtete Platte transferiert. Normalisierte IT-Werte (IT-Index) wurden verwendet, um die erhöhte Leistung von für Tg-ncs-1-Würmern nach der Konditionierung zu korrigieren und um nur das Auslöschen von trainierten Tieren zu berücksichtigen. 100% entspricht der mitteleren Leistung, die nach 18 Stunden bei 20 deg.

   C erreicht wurde (siehe Fig. 4A für die absoluten Werte). Das halb-maximale Auslöschen wurde bei den WT-Würmern nach 3 Stunden erreicht, während die Tg-ncs-1-Würmer eine verlängerte Retention hatten und das halb-maximale Auslöschen nach etwa 7 Stunden erreichten.

[0116] Fig. 5. Regulation von assoziativem Lernen und Gedächtnis durch NCS-1
Die schematische Ansicht zeigt an, dass die NCS-1 Menge das IT-Verhalten direkt reguliert. Die Abwesenheit des neuronalen Calcium-Sensor-1 (ncs-1 KO) hindert die Mehrzahl der Würmer an der Durchführung des isothermischen Spurverhaltens, während seine Anwesenheit (WT) diese zulässt. Die Überexpression von NCS-1 (Tg-ncs-1) erhöht die Leistungsniveaus, beschleunigt das Lernen und produziert ein Gedächtnis mit langsamerem Verlust.

   Der langsamere Verlust könnte eine erhöhte Reaktion von integrativen AIY-Neuronen auf [Ca<2+>]i-Stimuli widerspiegeln. Die NCS-1 Menge in den AIY-Neuronen und die Stärke der Ca<2+>-Stimulierung sind miteinander verknüpft, um das assoziative Lernen und Gedächtnis in C. elegans zu modulieren. Die gepunkteten Linien stellen hypothetische IT-Antworten dar.

[0117] Fig. 6. Modell für eine prä- oder postsynaptische Rolle des neuronalen Calcium-Sensor-1
NCS-1 ist in den AFD- und AIY-Neuronen vorhanden, entweder an den dendritischen oder axonalen Enden, und seine Funktion in den AIY-Neuronen ist essentiell für das IT-Verhalten.

   In diesem Modell dient das AIY-Interneuron als ein Integrator von Futter- und Temperatur-Input und der NCS-1-Calcium-Sensor überträgt die Calcium-Signale und reguliert die synaptische Stärke zwischen AIY/AIZ- und AIY/RIA-Zellen an dem präsynaptischen Ort, oder zwischen AFD/AIY-Neuronen an einem postsynaptischen Ort. Das +- oder -Zeichen zeigt die Anwesenheit einer exzitatorischen oder inhibitorischen Synapse an.

[0118] Fig. 7. Expression des thyl::ncs-1-Transgens in den Linien Tg 26 und Tg 200
(A) In-situ-Hybridisierung unter Verwendung einer Digoxigenin-markierten cRNA-Antisense-Sonde, die komplementär zum 3 ¾UTR des Kücken-NCS-1 (cNCS-1)-Transgen ist. Starke Signale werden im parasagitalen Bereich der transgenen Maus-Linien Tg26 und Tg200 beobachtet (vgl. Tabelle II für eine detaillierte Beschreibung der cNCS-1-Verteilung).

   Tg26 wird durch eine Überexpression von NCS-1 im Hippocampus und dem Rückenmark charakterisiert, während Tg200 eine quantitativ und räumlich breitere Gehirnverteilung für das cNCS-1-Transgen hat.
(B) Überexpression von cNCS-1 im Hippocampus von Tg26 und Tg200. Vergrösserung der in (A) gezeigten Schritte. Die grösste Menge an cNCS-1-Transkripten in Tg200 festhalten. Mikroskopische Ansichten von CA1- (C) und CA3-Bereichen (D). (E) Keine Signale werden in Schnitten von Lendenrückenmark beobachtet, die von WT-Wurfpartnern präpariert wurden, während Tg26- und Tg200-Tiere starke cNCS-1-Hybridisierungssignale zeigen. (F) Gesamt-NCS-1 -Proteinspiegel in WT-, Tg26- und Tg200-Linien.

   Western Blot-Analyse unter Verwendung von 30 Microg Gesamtproteinextrakten vom Hippocampus und einen polyklonalen Antikörper gegen menschliches NCS-1 zeigt ein signifikantes Anwachsen im Spiegel von NCS-1 in Tg26 (2-fach) und in Tg200 (6-fach) im Vergleich mit WT.

[0119] Fig. 8. Erhöhung von LTP im Gebiet CA1 ist NCS-1-dosisabhängig
(A) Veränderungen beim EPSP-Abfall, die durch eine Stimulation nach dem theta-Ausbruch (theta-burst)-Muster induziert worden waren, in Schnitten, die von WT- (n=4), Tg26- (n=4) und Tg200- (n=4) Tieren präpariert wurden. Der LTP-Spiegel, der 30 Min nach Stimulation erhalten wurde, ist 181,81% +- 9,1 (n=13) für Tg200, 162,62% +- 5,73 (n=13) für Tg26 und 144,96 +- 5,75 (n=41) für WT.

   Die LTP-Erhöhung, die durch Überexpression von NCS-1 produziert wird, ist für Tg200 grösser als für Tg26 und WT und ist statistisch signifikant zwischen Tg200 und WT (p<0,006), zwischen Tg26 und WT oder zwischen Tg200 und Tg26 (p<0,03). Es ist zu beachten, dass LTP von Anfang an erhöht ist und unter diesen experimentellen Bedingungen mindestens 70 Min dauert. (B) Die Korrelation zwischen NCS-1 und dem Niveau der Erhöhung von LTP in der Fläche CA1 30 Min nach der ursprünglichen Stimulation. Es gibt eine starke Korrelation zwischen der Menge an NCS-1 und dem resultierenden LTP. Das höchste Niveau an NCS-1 produziert ein grösseres Anwachsen an LTP.

[0120] Fig. 9.

   Die Überexpression von NCS-1 erhöht die NMDA-Rezeptorkomponente von Antworten auf Ausbrüche ("burst-responses")
(A) Die Erhöhung der Summierung von Antworten während der zur Induktion von LTP verwendeten Züge. Oberer Teil: die Spuren stellen Antworten dar, die durch eine einzige Stimulierung oder durch den ersten und fünften zur Induktion von LTP verwendeten Zug in Tg200 und WT-Schnitten hervorgerufen wurden. Der fünfte Zug wird der Einfachheit halber leicht verschoben gezeigt. Unterer Teil: Fläche unter den Antworten auf Ausbrüche, für jeden Zug als Prozent der Fläche unter dem EPSP ausgedrückt, das durch eine einzelne Stimulation in Tg200 und WT-Schnitten hervorgerufen wurden.

   Die Überexpression von NCS-1 resultiert in höheren Antworten während der Züge, die sich mit der Zahl an Ausbrüchen weiter erhöhen.
(B) Oberer Teil: vorbereitete Antworten auf Ausbrüche der Art, die verwendet wurden, um LTP zu induzieren, aufgezeichnet vor und nach der Verabreichung des NMDAR-Antagonisten D-AP5 mit 50 MicroM. Jede Spur ist der Mittelwert von vier aufeinanderfolgenden Aufzeichnungen und der Unterschied zwischen den beiden Aufzeichnungen spiegelt die vom NMDA-Rezeptor abhängige Komponente der Antworten auf Ausbrüche dar. Unterer Teil: Grösse der NMDA-Rezeptorkomponente der Antworten auf Ausbrüche, als Prozent der Fläche unter dem Ausbruch EPSP in Schnitten dargestellt, die von Tg200-Mäusen (schwarze Säule, n=9) und WT-Mäusen (gestrichelte Säule n=8, p<0,05) präpariert wurden.

[0121] Fig. 10.

   Erhöhung der Facilitation von gepaartem Puls ("paired-puls facilitation") durch NCS-1 ist dosisabhängig (A) Antworten von gepaartem Puls, die bei 50 ms Intervallen zwischen den Pulsen in der Fläche CA1 von Schnitten von WT- und Tg200-Tieren hervorgerufen wurden. Die horizontale gepunktete Linie zeigt zum Vergleich die maximale Amplitude des ersten EPSP. Die erhöhte Erleichterung in Tg200 festhalten. Massstäbe sind angezeigt. (B) Mass der Facilitation (Mittelwert +-SEM), das in Hippocampus-Schnitten von WT- (n=14), Tg26- (n=7) und Tg200- (n=5) Mäusen erhalten wurde und für verschiedene Intervalle zwischen den Pulsen als das Verhältnis der Amplitude der zweiten über die erste Antwort berechnet ist, die durch gepaarte Stimulation hervorgerufen wird.

   Die Unterschiede sind statistisch signifikant für Intervalle von 20-250 ms zwischen den Pulsen zwischen WT und Tg26/Tg200 und von 20-100 ms zwischen den Pulsen zwischen Tg26 und Tg200. Erhöhung der Facilitation von gepaartem Puls ist NCS-1-dosisabhängig.

[0122] Fig. 11. Erhöhung der Neurotransmitterfreisetzung an der neuromuskulären Verbindung durch cNCS-1
Experimente mit den linken Hemidiaphragm-Muskeln von Tg200 und WT sind gezeigt. Relatives Endplattenpotential (EPPs) (Mittelwerte +-SEM; n=4 Muskeln) bei 100 Hz-Zügen von 13 Stimuli werden einmal alle 6 Sekunden angelegt und 5-12 Endplatten werden pro Muskel analysiert mit einem Mittelwert von 10-30 Pulszügen pro Endplatte. (A) Die normalisierten Daten zeigen eine signifikante Erhöhung der synaptischen Ermüdung bei Tg200, die auch bei einer Erhöhung von extrazellulärem Ca<2+> beobachtet wird (Daten nicht gezeigt).

   Deshalb schaffen erhöhte Mengen an Neurotransmitterfreisetzung während der anfänglichen Stimuli eine Entleerung im Pool der "fertig zur Sekretion"-Transmittervesikel für die folgenden Aktionspotentiale (Ermüdung). (B) Illustration der gemittelten Endplattenpotentiale von einer WT- und einer transgenen Endplatte. Der Massstab ist angegeben.

[0123] Fig. 12. Das räumliche Gedächtnis ist in der NCS-1 überexprimierenden Linie Tg26 der Morris-Wasserlabyrinth-Aufgabe verbessert
(A und C) Vergleich zwischen der Tg26-Linie und Kontrollen von WT-Wurfpartnern beim Erlernen einer verborgene Plattform in einem räumlichen Wasserlabyrinth unter Verwendung eines Verfahrens des räumlichen Versuchs (3 Versuche/Tag, 10 Min ITI). Bei der Latenz (F1,18 = 1,0; NS) oder der Schwimmgeschwindigkeit (F1,18 = 2,3, NS) wurde kein signifikanter Unterschied festgestellt (Woche 1).

   Nach einem Intervall von sieben Tagen wurde ein zweites räumliches Versuchsverfahren durchgeführt (Woche 3), das im Aufbau identisch mit der Woche 1 war. In dieser Untersuchungsphase wurde ein wichtiger Gruppeneffekt auf den Latenzfaktor festgestellt (F1,18 = 4,8, p<0,05). (B) Probentests wurden nach den Versuchsblöcken 3 und 5 in jeder Untersuchungsphase durchgeführt, wie durch die gefüllten Dreiecke dargestellt. Keine Gruppe zeigte eine räumliche Beeinträchtigung nach Versuchsblock 3 (Daten nicht gezeigt) bei Woche 1. Nach Versuchsblock 5 jedoch entwickelte die Tg26-Linie eine signifikante Präferenz für den Inselquadranten (Tg26-Linie: F3,27 = 9,3, p<0,01; WT: F3,27 = 1,5, NS). Darüber hinaus machten Tg26-Mäuse signifikant mehr Inselüberquerungen, was eine grössere Suchgenauigkeit widerspiegelt. Die mittleren Darstellungen der Wege für jede Gruppe sind auch gezeigt.

   (D) Während der Woche 3 durchgeführte Probentests zeigten bei jeder Gelegenheit eine verbesserte Leistung der Tg26-Linie, d.h. die Daten repräsentieren die Leistung für den Probentest, der nach Versuchsblock 5 durchgeführt wurde, wobei die Tg26-Linie mehr Inselüberquerungen machte und eine grössere räumliche Präferenz für den Inselquadranten hatte im Vergleich mit den Kontrollen. Nach dem Versuchsblock 3 hatte die Tg26-Linie eine signifikante Präferenz für den Inselquadranten (Tg26-Linie: F3,27 = 11,4, p<0,01; WT: F3,27 = 1,3, NS; Inselüberquerungen: Tg26 9,2+-1,0; WT 5,4+-0,8, p<0,01). (E) Probentest, der 5 Tage nach der Woche 3 durchgeführt wurde, zeigte wiederum ein verbessertes räumliches Erinnerungsvermögen für die Lage der Inselplattform bei der Tg26-Linie (Tg26-Linie: F3,27 = 11,1, p<0,01; WT: F3,27 = 2,1, NS).

[0124] Fig. 13.

   Verbessertes assoziatives Gedächtnis (aktive Vermeidung) mit der NCS-1 überexprimierenden Linie Tg26
(A) Das Lernen der aktiven Vermeidung zeigte bei der Tg26-Linie einen erhöhten Erwerb im Vergleich mit WT (Genotyp x Versuchsblockwechselwirkung F9,198 = 1,9 p<0,05). (B) Die Tg26-Linie zeigte auch signifikant niedrigere Vermeidungslatenzen (Stammeffekt F1,19 = 11,9, p<0,05), obwohl die Fluchtlatenzen zwischen den Gruppen ähnlich waren (Genotyp x Versuchsblockwechselwirkung F9,81 = 0,8, p>0,05).

[0125] Fig. 14. Modell für die Erhöhung der synaptischen Stärke durch NCS-1-Überexpression
NCS-1 ist in den transgenen Mäuselinien Tg26 und Tg200 an beiden Enden der Synapse überexprimiert.

   In diesem Modell dient der neuronale Calcium-Sensor 1 als Modulator der dosisabhängigen, synaptischen Vesikelfreisetzung, wobei die Menge an präsynaptischen NCS-1 die Wahrscheinlichkeit der Neurotransmitterfreisetzung proportional beeinflusst. Je mehr NCS-1, desto mehr Neurotransmitter wird freigesetzt. Als Resultat der modulierenden Wirkung von NCS-1 wird die postsynaptische Depolarisierung erhöht, mehr AMPA-Rezeptoren werden geöffnet, mehr NMDA-Rezeptoren werden geöffnet und das finale Outputsignal wird erhöht.

[0126] Fig. 15. Zielkonstrukt und Analysenverfahren für NCS-1-Knockout-Mäuse
(A) Zielkonstrukt für NCS-1-Knockout-Mäuse. (B) Verfahren zur Zielrichtung und Analyse von homologer Rekombination mit Sonden für Southern Blot. (C) PCR-positives Kontrollkonstrukt.

   (D) Zielverfahren und PCR-Analyse von homologer Rekombination.

Beispiele

Beispiel 1: Ce-ncs-1-Genexpression

[0127] Das Ce-ncs-1 -Gen, das im linken Arm von Chromosom X lokalisiert ist, codiert Ce-NCS-1, ein kleines saures Protein, das aus 192 Aminosäuren zusammengesetzt ist (Molekulargewicht von 22 kDa), und das 3 Calcium-Ionen über 4 vermutliche EF-Hände bindet (De Castro et al, 1995).

   Die zelluläre Verteilung von Ce-NCS-1 wurde mittels Licht- und Immunfluoreszenzmikroskopieuntersuchungen unter Verwendung einer transgenen Linie (XA411), die das grün fluoreszierende Protein (GFP) unter der Kontrolle des Ce-NCS-1-Promotorbereichs exprimierte, bestimmt (Fig. 1).

[0128] Das ncs-1: Das GFP-Reportergen wurde durch Subklonierung eines ncs-1-Promotors von 3100 bp konstruiert, der die Sequenz des ncs-1 -Promotor-Bereichs umfasste:
 <EMI ID=1.0> 

 <EMI ID=2.0> 

[0129] Transgene Würmer wurden wie früher beschrieben hergestellt (Mello et al., 1991). Der Marker rol-6 (Plasmid pRF4) und das ncs-1::GFP-Konstrukt wurden gemeinsam in die Gonaden von hermaphroditen Tieren injiziert. Die Aneinanderlagerung der GFP-Fluoreszenzbilder mit den differentiellen Interferenz-Nomarski-Bildern erlaubte die Identifizierung von ncs-1::GFP-positiven Zellen (vgl.

   Tabelle I).

Tabelle I: NCS-1-positive Zellen und ihre Funktionen

[0130] 
<tb>Positive Zellen<sep>Funktion


  <tb>Sensorische Neuronen<sep>


  <tb>AWC (links, rechts)<sep>Amphide Neuronen. Chemotaxis zu flüchtigen Duftstoffen (Benzaldehyd,
Butanon, Isoamylalkohol)


  <tb>ASE (L,R)<sep>Amphide Neuronen. Chemotaxis zu löslichen Verbindungen (Na<+>, Cl<->, cAMP, Biotin, Lysin), Eierlegen


  <tb>AWB (L,R)<sep>Amphide Neuronen. Vermeiden von Flüchtigem


  <tb>BAG (L,R)<sep>Sensorische Neuronen


  <tb>PHB (L,R)<sep>Phasmid-Neuronen


  <tb>AWA (L,R)<sep>Amphide Neuronen. Chemotaxis zu flüchtigen Duftstoffen (Diacetyl, Pyrazin, 2,4,5-Trimethylthiazol)


  <tb>AFD (L,R)<sep>Amphide Neuronen. Isothermisches Spurverhalten. Thermotaxis


  <tb>ADF (L,R)<sep>Amphide Neuronen. Dauer-Bildung; Chemotaxis zu löslichen 
Verbindungen (wenig)


  <tb>ASG (L,R)<sep>Amphide Neuronen. Dauer-Bildung (wenig);
Chemotaxis zu löslicher Verbindungen (wenig)


  <tb>PHA (L,R)<sep>Phasmid-Neuronen


  <tb>Interneuronen:<sep>


  <tb>AVK (L,R)<sep>


  <tb>AIY (L,R)<sep>Isothermisches Spurverhalten. Thermotaxis


  <tb>Motorneuron:<sep>


  <tb>RMG<sep>Nerveninnervation (Nervenversorgung) von Muskeln im Kopf


  <tb>Muskelzelle:<sep>


  <tb>pml<sep>Öffnung der metastomalen, pharyngealen Lappen

[0131] Eine Bestätigung der GFP-Färbung und von NCS-1-positiven Zellen wurde mit Antikörpern gegen Ce-NCS-1 erhalten. Ce-NCS-1 wurde vor allem in sensorischen Neuronen exprimiert (10 neuronale Paare: AWC, ASE, AWB, BAG, PHB, AWA, AFD, ADF, ASG, PHA). Zusätzlich exprimierten 2 Paare von Interneuronen (AVK, AIY), 1 Motorneuron (RMG) und ein Muskelzelltyp (pm1) Ce-NCS-1 (Tabelle I). Die meisten der NCS-1 exprimierenden Neuronen waren mit zwei sensorischen Organen assoziiert, den Kopf-Amphiden und den Schwanz-Phasmiden (Fig. 1A, 1B). Eine dendritische, axonale und Zellkörper-subzelluläre Verteilung wurde mit Ce-NCS-1-spezifischen Antikörpern beobachtet.

Beispiel 2: Herstellung des ncs-1-Knockout-Stammes

[0132] Um die funktionelle Rolle von Ce-NCS-1 zu untersuchen, wurden Knockout (KO)-Tiere erzeugt.

   Eine mutierte ncs-1 Tcl Transposon-Insertionslinie (ncs-1(pk242::Tc1)) wurde verwendet, um einen Deletions-Derivatstamm ncs-1(qa401te) zu isolieren (Fig. 2A).

[0133] Eine homozygote Mutante ncs-1(pk242) mit einer Tc1-Insertion, die an Position 5231 relativ zum ncs-1-Genfragment lokalisiert war, wurde mittels PCR-Durchmusterung einer Tcl-Insertionsbank (siehe Zwaal et al., Target-selected gene inactivation in C. elegans by using a frozen transposon insertion mutant bank. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 7431-7435) erhalten. Deletions-Derivate wurden wie von Plasterk (1995) beschrieben erhalten. Ein Stamm, dem der genomische DNA-Bereich zwischen Exon 1 und 5 des ncs-1-Gens fehlte, wurde isoliert (diese Deletion entfernte das erste Initiator-ATG).

   Dieser ursprünglich homozygote Stamm, der XA401 ncs-1(qa401te) genannt wurde, wurde fünfmal mit N2 Wildtyp-Tieren rückgekreuzt (endgültiger Name XA406).

[0134] Die Null-ncs-1-Tiere waren lebensfähig, ihre Entwicklungszeit war normal, obwohl sie leicht untersetzt waren, und das NCS-1-Protein war in diesen KO-Tieren nicht mehr vorhanden (Fig. 3C).

   Da von 8/10 Paaren von NCS-1-positiven Neuronen bekannt ist, dass sie in die Chemotaxis und die Vermeidung von flüchtigen Duftstoffen involviert sind, wurden mehrere Klassen von Duftantworten mit den KO-Stämmen gemessen. Überraschenderweise verhielten sich die mutanten Null-ncs-1-Tiere wie Wildtyp-Würmer, was nahelegt, dass die Calcium-Signalübertragung über NCS-1 nicht in die C. elegans-Duftwahrnehmung involviert ist, oder dass andere Calcium-Sensoren in den Geruchsneuronen das Fehlen von NCS-1 ersetzen oder kompensieren können.

Beispiel 3: Thermotaxis-Spurverhaltenstest

[0135] Als kaltblütiges Tier, das nur innerhalb eines beschränkten Temperaturbereichs (¯12-26 deg.

   C) lebensfähig und fruchtbar ist, verfügt C. elegans über effiziente thermosensorische Verhaltensmuster, einschliesslich der themischen Vermeidung als Schutz gegen Berührung mit schädlicher Temperatur (Wittenburg und Baumeister, 1999) und der Thermotaxis für die Wahrnehmung von physiologischen (<0,1 deg. C) Veränderungen bei der lokalen Temperatur (Mori, 1999). Würmer lernen während einer Konditionierungsperiode (Erwerb) von mehreren Stunden, eine gegebene Temperatur (die Wachstumstemperatur) mit der Anwesenheit von Futter zu assoziieren (Hedgecock und Russell, 1975). Diese assoziative Konditionierung spiegelt sich in einem einzigartigen Phänotyp wider, dem isothermen Spurverhalten (IT), das auf nicht besäten Platten mit einem radialen Gradienten der Temperatur beobachtet werden kann, wobei ein einzelnes Tier zu der genauen Wachstumstemperatur (+-0,2 deg.

   C) wandert (Hedgecock und Russell, 1975) und sich dann isotherm bewegt. Wenn die Assoziation unterbrochen wird (durch Verbrauch des Futters) bleibt das IT-Verhalten für mehrere Stunden erhalten (Extinktionsperiode), dann wird ein Suchmodus aktiviert und die Würmer werden die Isothermen blindlings kreuzen, um bei anderen Temperatur Futter zu suchen (Mori, 1999). Eine Temperaturveränderung wird aber nicht zu einem blinden Suchmodus führen, sondern eher zu einem langsamen Neuerwerb der Assoziation zwischen Futter und neuer Temperatur. Da Ce-NCS-1 in AFD und AIY zwei Neuronen des neuronalen Netzes für die Thermotaxis gefunden wurde, wurden ncs-1(qa401te)-KO-Würmer auf ihr IT-Verhalten bei 20 deg. C getestet (Messung des Prozentsatzes von Würmern, die bei 20 deg.

   C isothermischen Spuren folgten).

[0136] In Kürze wurden 20-30 Würmer in der Gegenwart von frischem Rasen des Bakterienstamms OP50 (der unkondiotionierte Stimulus) in einer 6-cm-Petrischale wachsen gelassen, wobei die Petrischale mit einem Medium (NGM) gefüllt ist, das aus 1,7% Agar, 0,25% Bactopepton, 50 mM NaCl, 25 mM Kaliumphosphat pH 6,0, besteht. Dies geschieht über Nacht bei einer konstanten Temperatur von 20 deg. C (der konditionierte Stimulus). Junge Ausgewachsene wurden dann für zwei Minuten auf eine frische Platte ohne Bakterien übertragen. Einzelne Würmer wurden dann auf eine 9-cm-Petrischale gesetzt, die 9 ml NGM enthielt. Ein radialer Temperaturgradient wurde geschaffen, indem ein Gefäss, das gefrorenen Eisessig enthielt, auf den Boden der Platte gesetzt wurde und die Platte 90 Minuten bei 26 deg. C bei einer konstanten Feuchtigkeit von 60% inkubiert wurde.

   Nach Entfernung des Tieres von der Platte wurden die auf der Agar-Oberfläche gelassenen Spuren photographiert.

[0137] Die IT-Aufzeichnungen von einzelnen Würmern wurden nach 90 Minuten auf Testplatten visualisiert, wie gezeigt in Fig. 3A. Ce-NCS-1-KO-Tiere waren abnorm, indem sie im Verhalten einen signifikanten Unterschied im Vergleich zu Wildtyp (WT)-Tieren zeigten (Fig. 3B). 75% +-8% der WT-Tiere (n=94) zeigten ein normales IT-Verhalten, während sich nur 31% +-9% der ncs-1 (qa401te)-Mutanten (n=96) normal verhielten.

   Die Mehrheit der KO-Tiere zeigte irreguläres IT-Verhalten und wurden, basierend auf früheren Beschreibungen von Thermotaxis-Phänotypen durch Mori und Oshima (Mori und Oshima, 1995), in fünf Kategorien eingeteilt: 31% waren cryophil, 27% athermotaktisch, 6% thermophil, 5% zeigten ein mittleres Verhalten (gemischte athermotaktische und normale Phänotypen) und 31% waren normal.

   Die IT-Defekte der ncs-1-Mutanten insgesamt (meistens athermotaktisch und cryophil) waren ähnlich den Phänotypen, die mit Laser-getöteten AFD- (athermotaktisch und cryophil) oder AIY-(zumeist cryophil) Tieren oder mit ttx-3- (zumeist cryophil) Mutanten beobachtet wurden (Hobert et al, 1997), waren aber klar unterschiedlich zu AIZ- (zumeist thermophil) lasergetöteten Tieren (Mori und Oshima, 1995).

[0138] Das thermische Vermeidensverhalten des ncs-1-Knockout-Stammes nach Begegnung mit einer schädlichen Temperatur wurde ebenfalls getestet. Schädliche Temperaturen verursachen einen Wegbewegungsreflex, der sich signifikant vom thermotaktischen Verhalten unterscheidet, involviert verschiedene Neuronen und wird von Mutationen in verschiedenen Genen beeinflusst (Wittenburg und Baumeister, 1999).

   Das Verhalten der ncs-1(qa401te)-Mutante unterschied sich bei diesem Test nicht von dem der Wildtyp-Würmer.

[0139] Um sicherzugehen, dass die Verminderung des IT-Verhaltens bei der KO-Mutante an der Abwesenheit des Ce-NCS-1-Gens lag, wurde unter Verwendung von entweder einem Transgen mit einem genomischen Fragment von 7Kb, das den gesamten codierenden genomischen ncs-1-Bereich plus ¯3Kb seiner 5 ¾ stromaufwärts liegenden genomischen Sequenzen enthielt oder einem PCR-Fragment, das den ncs-1-cDNA codierenden Bereich plus ¯3Kb der 5 ¾ stromaufwärts liegenden genomischen Sequenzen (Linien RWT, Fig. 3A, B) eine Keimbahnreparatur des KO-Stamms durchgeführt.

   Beide Transgene waren in der Lage, den mutanten ncs-1-defekten Phänotyp zu reparieren, was in einer Wiederherstellung des IT-Verhaltens bei 62% +- 9% der Tiere (n=92, P=0,00001) resultierte.

Beispiel 4: Calcium-Bindung ist für die NCS-1-Aktivität erforderlich

[0140] Um zu testen, ob die Funktion von Ce-NCS-1 Calcium-abhängig war, wurde eine mutierte Form von NCS-1 hergestellt, die nicht in der Lage war, Calcium zu binden ("Funktionsverlust" "loss-of-function" oder lf-NCS-1). 5 Microg gereinigter Wildtyp-NCS-1 oder lf-NCS-1 wurden in der Gegenwart von 5 mM CaCl2 oder 2 mM EGTA einer Elektrophorese auf 10% SDS-PAGE unterworfen. Die Proteine wurden für die Sichtbarmachung mit Coomassie Blau gefärbt (Geiser et al., 1991).

[0141] <45>[Ca <2+>]-radioaktive Bindung wird einfach nachgewiesen bei Wildtyp (wt)-NCS-1, aber nicht bei dem Funktionsverlust (lf)-Ce-NCS-1.

   Eine Proteinkontrolle mit Färbung mit Ponceau-Rot ist gezeigt. 5 Microg rekombinantes, gereinigtes Wildtyp-NCS-1 oder Funktionsverlust (lf)-NCS-l wurden auf einem 10% SDS-PAGE-Gel einer Elektrophorese unterworfen, auf eine Nitrcellulosemembran geblotted und mit <45>[Ca<2+>] inkubiert. Nach mehreren Waschvorgängen wurden mittels 48-Stunden-Autoradiographie die Radio-Aktivität sichtbar gemacht (Maruyama et al., 1984). NCS-1nt der entscheidenden Asp-Reste der drei EF-Hand-Calcium-Bindungsstellen (Positionen 73, 109 und 157, Fig. 2B) mit Ala verhinderte sowohl die Ca<2+>-Bindung (Fig. 2C) als auch den Ca<2+>-abhängigen Konformationsshift von lf-NCS-1 (Fig. 2D).

   Linien, die mit dem lf-ncs-1-Transgen (RLF) erhalten wurden, sind auf ihr IT-Verhalten getestet (Fig. 3A, B) worden und zeigten einen defekten IT-Phänotyp (27% +-13%, n=78), trotz der Expression des mutierten lf-NCS-1-Proteins (Fig. 3C). Dies zeigt, dass ein normales IT-Verhalten Calcium-abhängig ist und eines funktionellen, Calcium-bindenden NCS-1-Sensors bedarf.

[0142] Um zu bestimmen, welche Zellen NCS-1 erfordern, wurde eine Mosaik-Reparatur der KO-Tiere unter Verwendung von AFD (gcy-8 (Yu et al., 1997))- oder AIY (ttx-3 (Hobert et al., (1997))-spezifischen Promotoren, die die Expression von ncs-1 antrieben, durchgeführt. Ein repariertes IT-Verhalten (56% +- 5%) wurde mit dem ttx-3::NCS-1-Konstrukt (RAIY-Tiere, n=50, P=0,002) auf einem Niveau beobachtet, wie bei der Reparatur, die in RWT-Tieren beobachtet wurde (Fig. 3A, B).

   Keine Reparatur (12,5% +- 9%) des IT-Verhaltens wurde mit dem gcy-8::NCS-l-Konstrukt erhalten (RAFD-Tiere, n=40) (Fig. 3A, B). Diese Daten legen sehr nahe, dass für normales IT-Verhalten die NCS-1-Funktion in AIY, aber nicht in AFD oder irgendwelchen anderen Neuronen, erforderlich ist.

Beispiel 5: Erhöhte Spiegel von NCS-1 beeinflussen das IT-Verhalten von WT-Tieren

[0143] Nach der Erzeugung von transgenen Linien, die NCS-1 überexprimieren, (Tg-ncs-1) unter Verwendung der ncs-1-cDNA unter der Kontrolle des ncs-1-Promotors (die Anwesenheit des Konstrukts wird mittels PCR bestimmt), wurde die Wirkung auf die Thermotaxis gemessen. Fig. 3B zeigt bemerkenswert, dass die NCS-1-Überexpression die IT-Thermotaxisleistung signifikant (P=0,018) erhöht (90% +- 10%, n=70) im Vergleich mit dem Verhalten von WT-Tieren (75% +- 8%).

   Diese Resultate zeigen, dass das Niveau von NCS-1-Aktivität die Effizienz der IT-Leistung bestimmen kann und bestätigen, dass NCS-1 wahrscheinlich essentiell für das Verhalten ist und nicht nur fakultativ für IT.

[0144] Um Tg-ncs-1-Würmer weiter zu charakterisieren wurde ihre IT-Verhaltensleistung detaillierter untersucht und mit der Leistung von WT-Würmern verglichen. Die für den Erwerb (Lernen) und das Löschen (Gedächtnis) erforderliche Zeitperiode für die assoziative Information (Vorhandensein von Futter bei der Temperatur von 20 deg. C) wurde bestimmt. Für die Lernexperimente (Fig. 4A) wurden die Würmer mindestens 12 Stunden bei 25 deg. C in der Anwesenheit von Futter wachsen gelassen und wurden dann einzeln für verschiedene Zeitintervalle auf eine besäte Platte bei 20 deg. C verbracht und ihr IT-Verhalten bei 20 deg. C wurde bestimmt.

   Wie in Fig. 4A gezeigt, benötigten WT-Würmer etwa 68 Minuten, um etwa 50% ihres maximalen Leistungsniveaus zu erreichen, während Tg-ncs-1-Würmer ihr 50%-Niveau nach nur 24 Minuten erreichten. Die überexprimierenden NCS-1-Würmer waren daher beim Erlernen des neuen Konditionierungsparadigmas (Futter bei 20 deg. C) 2-3-mal schneller als WT. Für beide Stämme wurde ein maximales Leistungsniveau bereits nach 12 Stunden erreicht. Für die Auslöschexperimente (Fig. 4B) wurden die Würmer auf besäten Platten bei 20 deg. C für mindestens 18 Stunden wachsen gelassen, dann wurden einzelne, junge, ausgewachsene Würmer bei 20 deg. C gewaschen, für verschiedene Zeitintervalle auf eine nicht besäte Platten bei 20 deg. C transferiert und ihr IT-Verhalten bei 20 deg. C wurde bestimmt.

   Wie in Fig. 4B gezeigt, benötigten trainierte Würmer etwa 3 Stunden, um 50% ihres maximalen Leistungsniveaus zu verlieren, während Tg-ncs-1-Würmer 50% ihres maximalen Niveaus erst nach 7 Stunden verloren. Deshalb war die Auslöschperiode für das assoziative Paradigma (Futter bei 20 deg. C) für die NCS-1 überexprimierenden Würmer mindestens um den Faktor 2 verlängert im Vergleich mit den WT-Würmern. Für beide Stämme war die Rückkehr zu einem Grundlinienniveau nach etwa 18 Stunden erreicht.

   Zusammengenommen zeigten diese Daten an, dass eine erhöhte Menge des NCS-1 -Calcium-Sensorproteins nicht nur die Leistung, sondern auch die Lern- und Gedächtnisfunktionen mittels schnellerem Erwerb und längerem Behalten erhöht (Fig. 5).

Beispiel 6: Erhöhung der Langzeit-Potenzierung und -Erkennung mittels NCS-1 in Mäusen

6.1 Experimentelle Verfahren

6.1.1 Produktion von transgenen Mäusen, die Hühner-NCS-1 überexprimieren:

[0145] Thy1-cNCS-1 transgene Mäuse wurden wie folgt erzeugt: ein 573 Basenpaare langes DNA-Fragment, das das Hühner-NCS-1 (cNCS-1)-Volllängenprotein (von AUG zum Stop-Codon (Nef et al., 1995)) codiert wurde mit den benachbarten 215 Basenpaaren (SEQ ID NR:2) fusioniert, die dem 3 ¾ nicht translatierten Bereich von cNCS-1-mRNA entsprechen. Das resultierende cNCS-1-DNA-Fragment von 788 bp wurde in die Thy1 Promotorkassette inseriert.

   Nach der Linearisierung wurde das 7kb lange Thy1-cNCS-1-Konstrukt unter Verwendung etablierter Verfahren (Hogan, 1994) in die Pronuclei von C57BL/6J - BALB/cJ F1-Zygoten mikroinjiziert. Die erfolgreiche Transgenese wurde mittels PCR-Analyse von genomischer DNA vom Schwanz, die von heterozygoten Geschwistern erhalten wurde, unter Verwendung der folgenden Oligonucleotid-Primer bestimmt: vorwärts 5 ¾-ccacagaatccaagtcgg-3 ¾ (SEQ ID NR:3) entsprach der stromaufwärts 5 ¾-Sequenz des Thy-1-Promotors, und rückwärts 5 ¾-atacgagcccgtcgtagag-3 ¾ (SEQ ID NR:4) war homolog zu den Nucleinsäurepositionen 553-571 des cNCS-1 codierenden Bereichs.

6.1.2 Gewebeverteilung von cNCS-1-Transgenen im Nervensystem:

[0146] In-situ-Hybridisierung (ISH) wurde wie zuvor beschrieben (Schaeren-Wiemers und Gerfin-Moser, 1993) durchgeführt.

   In Kürze wurden dig-markierte Antisense-RNA-Sonden (Ribosonden) synthetisiert wie im Herstellerhandbuch (DIG-RNA labelling kit, Roche Biochemicals) angegeben. Es wurde eine 3 ¾UTR-Sequenz (Nucleinsäurepositionen 636-750 und 501-750) von Hühner-NCS-1 als Matrize verwendet, um jegliche Kreuz-Hybridisierung mit den endogenen ncs-1-mRNA-Transkripten der Maus zu vermeiden. Die Gehirne von transgenen und WT-Tieren wurden seziert, in Tissue Tek eingebettet und sofort in Isopentan mit Trockeneis eingefroren. Die Gewebe wurden bis zur Verarbeitung bei -80 deg. C gehalten. 12 Microm dicke Schnitte wurden bei -15 deg. C mit einem Mikrotom hergestellt, auf SuperFrost Plus Objektträger (Menzel-Gläser) aufgebracht, 20 Minuten bei RT getrocknet und entweder bei -20 deg. C aufbewahrt oder direkt für ISH verwendet.

   Nach Nachfixierung in 4% Paraformaldehyd und PBS wurden die Schnitte 2 X 15 Min in PBS inkubiert, das 0,1% aktives DEPC enthielt, und dann 15 Min in 5X SSC äquilibriert. Die Schnitte wurden in Hybridisierungsmix (50% Formamid, 5X SSC, 5X Denhardt'sLösung, 0,25 mg/ml Hefe-tRNA, 0,5 mg/ml Lachssamen-DNA) zwei Stunden bei 65 deg. C prähybridisiert. Nach der Zugabe von hitzedenaturierten Riboproben mit 500 ng/ml wurde die Hybridisierung über Nacht bei 65 deg. C durchgeführt. Die Schnitte wurden dann bei Raumtemperatur 30 Min in 2X SSC gewaschen, bei 72 deg. C 1 Std. in 2X SSC und letztlich in Puffer 1 (Maleinsäure 0,1 M, NaCl 0,15M, pH 7,5) äquilibriert.

   Die Schnitte wurden dann 2 Std. mit anti-Digoxigenen-Antikörpern, die an alkalische Phophatase gekoppelt waren (Roche Biochemicals), bei einer Verdünnung von 1:3000 in Puffer 1, der 0,5% Blockierungsreagens (Roche Biochemicals) enthielt, inkubiert. Der Überschuss an Antikörper wurde durch 2X 15 Min Waschen in Puffer 1 entfernt und dann wurden die Schnitte in Puffer 2 (TrisHCl 0,1 M, NaCl 0,1 M, MgCl2 50 mM, pH 9,5) äquilibriert. Die Farbentwicklung wurde bei Raumtemperatur im Dunkeln mit Puffer 2 durchgeführt, der NBT/BCIP (Gibco) und Levamisol (0,24 mg/ml Endkonzentration) enthielt und die Färbung wurde durch Zugabe von Tris 10 mM und EDTA 0,1 mM bei pH 8 gestoppt. Die Schnitte wurden dann kurz in bidestilliertem Wasser gespült und mit VectaMount (Vector Laboratories) montiert.

   Eine detaillierte morphologische Analyse der Gesamtzahl von Synapsen, der Form und Morphologie von Endplatten ebenso wie der Menge von Nervensprossen wurde wie anderswo beschrieben (Caroni et al., 1997) durchgeführt.

6.1.3 NCS-1-Niveau bei Überexpression:

[0147] Gesamtproteinextrakte von Gehirngewebe von transgenen und WT-Tieren wurden wie folgt produziert: Sezierter Hippocampus wurde in PBS-Puffer, der Proteaseinhibitoren (Tabletten EDTA-frei, Roche Biochemicals) enthielt homogenisiert und für 3X 5 Sek auf Eis mit Ultraschall (mit 10 Watt) unter Verwendung eines Vibracell Sonicators (Sonic&Materials ine.) bestrahlt. Das Homogenisat wurde mittels 30 Min Zentrifugation mit 12 000 g bei 4 deg. C geklärt.

   Die Proteinkonzentration des Lysats wurde mit dem Bradford Proteintest (Bio-Rad, Hercules, CA) unter Verwendung von BSA als Standard bestimmt. 30 Microg Gesamtprotein wurden unter Verwendung von Standardverfahren mittels SDS-PAGE aufgelöst. Die Proteine wurden dann mittels Elektroblotting gemäss den Vorschriften des Herstellers (Novex) auf PVDF-Membranen übertragen und für den Immunnachweis verarbeitet. Die PVDF-Membranen wurden bei Raumtemperatur 30 Min in Blockierungspuffer (PBS, das 5% fettfreie Milch und 0,05% Tween 20 enthielt) inkubiert und dann 2 Std. bei Raumtemperatur mit einem spezifischen polyklonalen anti-menschlichen NCS-1-Antikörper, der 1:500 mit Blockierungspuffer verdünnt war. Der Immunkomplex wurde wie früher beschrieben mittels Chemilumineszenz sichtbar gemacht (ECL-System, Amersham).

   Die Färbung der alpha -Untereinheit von Calmodulin-abhängiger Kinase II mit einem monoklonalen anti-Ratte-Antikörper (Calbiochem), der 1:2000 verdünnt war, wurde als interne Referenzkontrolle verwendet, um sicherzustellen, dass ähnliche Mengen an Protein geladen, übertragen und nachgewiesen wurden. Nach der Exposition wurde der Film auf einem Image Densitometer (Bio-Rad) aufgenommen und die NCS-1-Signale wurden quantifiziert (Molecular Analyst Software, Bio-Rad).

6.1.4 Elektrophysiologie von Hippocampus-Scheiben

[0148] Die Aufzeichnungen wurden wie früher beschrieben durchgeführt (Muller et al., 1996). Kurz gesagt wurden Hippocampus-Scheiben von jungen ausgewachsenen (2-4 Monate alt) transgenen Mäusen (Tg26 und Tg200) und ihren Wildtyp-Wurfgenossen (WT) durch Abtrennung des Kopfes und Schneiden in Scheiben mittels eines Gewebehackmessers präpariert.

   Sie wurden unter kontinuierliche Perfusion mit einem Medium, das (in mM) enthielt: NaCl 124, KCl 1,6, CaCl2 2,5, MgCl2 1,5, NaHC03 24, KH2PO4 1,2, Glucose 10 und Ascorbinsäure 2; pH 7,4, Temperatur 33 deg. C in einer Interface-Kammer gehalten. Exzitatorische postsynaptische Potentiale (EPSPs) wurden mittels Stimulierungselektroden hervorgerufen, die aus verdrehten Nichrome-Drähten gemacht waren. Die Elektroden wurden in den collateralen Schaffer-Weg platziert und zeichneten in der dendritischen Fläche (stratum radiatum) der CA1-Region auf. LTP wurde unter Verwendung der theta-Ausbruchsmuster-Stimulierung (fünf Ausbrüche von 5 Hz, jeder zusammengesetzt aus 4 Pulsen von 100 Hz) induziert, zweimal aufeinanderfolgend mit einem 10-Sek-Intervall wiederholt.

   Der EPSP-Abfall wurde kontinuierlich aufgezeichnet und die Resultate als das Verhältnis der Veränderungen, die 30 Min und 60 Min nach der Stimulierung gegen die Grundlinienwerte beobachtet wurden, ausgedrückt. Um die NMDA-Komponente der Ausbruchs-Antworten zu analysieren wurden Züge von 4 Pulsen zu 100 Hz unter Verwendung eines Priming-Paradigmas repetitiv (0,03 Hz) hervorgerufen, um inhibitorische Antworten zu unterdrücken. Dies wurde durch Verwendung einer zweiten Stimulierungselektrode und Hervorrufen einer synaptischen Antwort auf einem verschiedenen, unabhängigen Input 200 ms vor der Ausbruchs-Antwort erreicht. Die NMDA-Komponente wurde dann als die Differenz zwischen den Ausbruchs-Antworten vor und nach der Verabreichung von 50 MicroM D-AP5 bestimmt.

   Die Facilitation wurde als das Verhältnis von Abfällen von EPSPs, die in kurzen Intervallen (25-500 mSek.) unter Verwendung eines gepaarten Puls-Paradigmas evoziert wurden, gemessen.

6.1.5 Synaptische Ermüdung an der neuromuskulären Verbindung:

[0149] Die Experimente wurden mit dem linken Hemidiaphragma, das in einer Lösung inkubiert wurde, die 40% Leibovitz L15-Medium mit den folgenden Ionenkonzentrationen (Na<+> 1 mM, K<+> 1 mM, Ca<2+> 2,5 mM, Mg<2+> 1 mM) enthielt, bei pH 7,5 mit HEPES, durchgeführt. Der phrenische Nerv wurde mittels einer Saugelektrode stimuliert und die intrazellulären Aufzeichnungen der Endplattenpotentiale (EPPs) wurden durchgeführt. Die Membranpotentiale waren zwischen -65 und -75 mV. Die Nervenstimulation war ein Zug von 13 Pulsen, mit 100 Hz verabreicht, einmal alle 6 Sek.

   Die Muskelfaserkontraktion wurde durch die Zugabe 1-1,5 Microg/ml d-Tubocurarin blockiert. Bei diesen Konzentrationen waren die EPPs zwischen 1-3 mV in der Amplitude. Die Antworten auf 15 bis 30 aufeinanderfolgende Stimuluszüge wurden für jede Endplatte gemittelt und jede gemittelte EPP-Amplitude in einem Zug wurde in Relation zu der Amplitude der ersten fünf mittleren EPP desselben Zuges ausgerückt. Um Interferenz durch nicht-lineare Summierung zu vermeiden (Martin, (1976) wurde die Datenerhebung in einem Experiment dann unterbrochen, wenn das Membranpotential um mehr als 5mV abgefallen war.

6.1.6 Verhaltensstudien:

[0150] Neurologische Tests: Gruppen von Tg26, Tg200 und ihren WT-Wurfgenossen (n=12 pro Gruppe) wurden verwendet, um die neurologischen Funktionen wie zuvor beschrieben (Higgins et al., 2001) zu bewerten.

   Die lokomotorische Aktivität wurde in unvertrauten Photozellkäfigen (36 X 24 X 19 cm, Benwick Electronics, UK) gemessen und sowohl die horizontale als auch die vertikale Aktivität wurden über einen Zeitraum von 60 Min aufgezeichnet.

[0151] Morris-Wasserlabyrinth: Eine Gruppe von Tg26 und ihren WT-Wurfgenossen (n=10 pro Gruppe) wurden trainiert, um eine fixierte, eingetauchte Plattform (8 cm Durchmesser, 1 cm unter der Oberfläche) innerhalb eines runden Pools (Durchmesser 1 m; Höhe 30 cm), gefüllt mit milchigem Wasser (Tiefe 20 cm; 21+-1 deg. C) zu finden. Die Lage der Plattform wurde innerhalb der Gruppen balanciert. Externe sichtbare Marken wurden um den Pool platziert, um den Tieren die Navigation zu erleichtern.

   Jede Maus erhielt 1 Trainingslektion pro Tag über 5 aufeinanderfolgende Tage (drei Versuche pro Lektion), bei denen sie angesichts der Poolwände platziert wurden und es ihnen erlaubt wurde, die versteckte Plattform zu lokalisieren. Die Zeit, die die Maus brauchte, um das Ziel zu lokalisieren (Fluchtlatenz) und der Schwimmweg und die Schwimmgeschwindigkeit wurden unter Verwendung eines automatischen Bewegungs-Videosystems (HVS Image, Hampton, UK) gemessen. Die maximale Versuchsdauer war 60 Sek. Die Einschätzung des räumlichen Lernens wurde in Probeversuchen vorgenommen, die 1 Stunde nach den Sitzungen 3 und 5 durchgeführt wurden. Im zweiten Experiment wurde der Probentest auch 5 Tage nach der letzten Trainigslektion durchgeführt. Die Fluchtlatenzdaten wurden mit Zweiweg-ANOVA mit Genotypus als unabhängigem Faktor und Trainigslektionen als wiederholten Messungen analysiert.

   Die Probentestdaten wurden mit einer Einweg-ANOVA analysiert. Posthoc-Vergleiche wurden unter Verwendung des Newman Keuls-Test durchgeführt.

[0152] Tests für das aktive Vermeiden und Schockschwelle: Tg26 und ihre WT-Wurfgenossen (n=12 pro Gruppe) wurden getestet. Der Tests für das aktive Vermeiden wurde in vier identischen Zweikammerboxen (Gemini II avoidance system, San Diego Instruments, USA) durchgeführt. Jede Box war mit einem Drahtgitterboden, Stimuluslicht, das an der Decke von jedem Abteil lokalisiert war und einer automatischen Schiebetür, die die beiden Kammern trennte und während des Trainigs offengelassen wurde, ausgestattet. Die Tiere erhielten 20 Versuche pro Tag (Versuchsblock), fortgesetzt für 10 aufeinanderfolgende Tage.

   Jede Trainingslektion begann mit einer Akklimatisierungsphase von 5 Min und die Tiere wurden trainiert, um einen 0,2mA-Stimulus zu vermeiden, indem sie auf ein visuelles Signallicht reagierten, das in jeder Kammer lokalisiert war. Ein Intervall von 20 Sek. zwischen den Versuchen (ITI) wurde verwendet. Wenn die Maus nicht innerhalb von 10 Sek. nach dem Zeigen des Signals wechselte, wurde ein Schock (0,2mA) verabreicht, bis das Tier auf die andere Seite wechselte (Fluchtantwort) oder bis die 10 Sek. verstrichen waren. Die Schockschwelle wurde für Tg26 und WT bestimmt (n=6 pro Gruppe). Jede Maus wurde wurde in der Funktionskammer (14 cm X 14 cm X 13 cm; Med Associates, VT) mit einem Drahtgitterboden getestet und es wurden ihnen manuelle Fussschocks von einer Sek. gegeben. Die Schockniveaus begannen bei 0,05 mA und erhöhten sich um 0,05-mA-Schritte mit 30 Sek.

   Pause zwischen den Schocks, bis sowohl Zucken (jede sichtbare Antwort) als auch Lautäusserungen induziert waren. Die Analyse der aktiven Vermeidensdaten wurde mit Zweiweg-ANOVA mit Genotypus als unabhängigem Faktor und Trainigslektionen als wiederholten Messungen durchgeführt. Posthoc-Vergleiche wurden unter Verwendung des Newman Keuls-Test durchgeführt.

[0153] Licht/Dunkel-Exploration und Schrecktests: Zehn Tg26- und zehn WT-Mäuse wurden im Licht-Dunkel-Test getestet, wie kürzlich beschrieben (Kew et al., 2000). Die in jedem Abteil verbrachte Zeit, die Anzahl der Versuche, das beleuchtete Abteil zu betreten und die Anzahl der Übergänge von den dunklen zu den beleuchteten Abteilen wurde während einer 5-minütigen Testperiode aufgezeichnet. Die Unterschiede zwischen den Linien wurden mittels Student's t-Test verglichen.

   Die Schrecktestung wurde wurde in einer Schreckvorrichtung (SR-LAB, San Diego Instruments, USA) wie zuvor beschrieben (Kew et al., 2000) durchgeführt. Jede Lektion wurde mittels einer 5-minütigen Akklimatisierungsphase begonnen, gefolgt von fünf aufeinanderfolgenden 110-dB-Versuchen. Diese Versuche wurden nicht in die Analyse mitaufgenommen. Zehn verschiedene Versuchsarten wurde dann angeboten: Schreckpuls allein (ST110, 110-dB/40 ms); sechs verschiedene Vorpulsversuche, bei denen entweder 20 mSek. lange 74, 82 oder 90-dB-Stimuli allein angeboten wurden (P74, P82 und P90) oder dem der 110-dB-Puls um 100 mSek. vorangingen (PP74, PP82 und PP90); und letztlich ein Versuch, bei dem nur der Hintergrundlärm angeboten wurde, um die Grundlinienbewegung in den Zylindern zu messen.

   Alle Versuche wurden in pseudo-zufälliger Ordnung vorgenommen und das Mittlere Intervall zwischen den Versuchen war 15 Sek. Die Analyse der Daten wurde mit Zweiweg-ANOVA mit Genotypus als unabhängigem Faktor und Stimuli als wiederholter Massnahme durchgeführt.

6.2 Herstellung und Selektion von transgenen Mäusen, die NCS-1 überexprimierten:

[0154] Mehrere transgene (Tg) Mäuselinien wurden unter Verwendung der codierenden Volllängensequenz des neuronalen Calcium-Sensor-1 (cNCS-1) des Huhns und einem kleinen Bereich seines 3 ¾ nicht translatierten Bereichs unter der Kontrolle des Thyl-Promotors hergestellt.

   Dieser Promotor treibt die Neuronen-spezifische Transkription des Transgens, startet nur in den postnatalen Stadien P6-10 (Caroni, 1997; Kelley et al., 1994), und reduziert daher stark die potentiellen Probleme, die mit der Überexpression eines Transgens während der embryonalen Neuro-Entwicklung assoziiert sind. Die spezifische Expression des thyl::cNCS-1-Genkonstrukts wurde mittels In-situ-Hybridisierung (ISH) mehrerer serieller Schnitte des Gehirns und des Rückgrats, die von ausgewachsenen Tg-Mäusen abgeleitet waren. Um von den endogenen Maus-ncs-1 -Transkripten zu unterscheiden, wurde der 3 ¾ nicht translatierte Bereich der NCS-1-cDNA des Huhns als Antisense-Sonden verwendet (Fig. 7A). Basierend auf der Verteilung der cNCS-1-Transkripte und den Expressionsniveaus im Gehirn wurden zwei unabhängige transgene Linien selektiert und Tg26 und Tg200 genannt.

   Die Gesamtverteilung und die spezifische Gehirnverteilung der cNCS-1-positiven Signale für die beiden Tg-Linien werden in Fig. 7 und Tabelle II beschrieben.

[0155] Die Überexpression von cNCS-1 in Tg26 wurde nur in zwei Hauptbereichen beobachtet: 1) dem Hippocampus, in der pyramidalen Zellschicht der CA-1-2-3-4-Bereiche und in der Granulum-Zellschicht des gezähnten Gyrus, und 2) dem Rückenmark, bei den Motorneuronen und bei wenigen sensorischen Nuclei in der Medulla (Fig. 7A, Tabelle II). Eine schwache aber nachweisbare Markierung wurde in Tg26 in den Nuclei des oberen Colliculus und des tiefen Kleinhirns beobachtet. Bei Tg200 war die cNCS-1-Überexpression jedoch deutlich höher im Hippocampus und den Motorneuronen und wurde in mehreren zusätzlichen Gehirnbereichen beobachtet.

   Tatsächlich wurde eine gemässigte bis starke cNCS-1-Markierung im Neocortex, der Brücke (Pons), Teilen des limbischen Cortex, in den olfaktorischen, akustischen und visuellen Systemen, dem Thalamus, und Hypothalamus und auch dem Cerebellum beobachtet (vhl. Fig. 7A und Tabelle II). Die cNCS-1-Signale waren bei Tg200 im Hippocampus deutlich stärker als bei Tg26 (Fig. 7B, 7C und 7D) und entsprachen, nicht überraschenderweise, höheren Mengen an gesamt-NCS-1-Protein im Hippocampus (Fig. 7F). Eine Scan-Analyse der Western-Blot-Intensität zeigte an, dass im Vergleich zu endogenen Niveaus bei WT die Menge an NCS-1 in Tg26 zweifach und in Tg200 sechsfach höher war. Die NCS-1-Überexpression war in Motorneuronen von Tg200 im Vergleich zu Tg26 ebenfalls höher (Fig. 7E).

   Insgesamt war die thyl::cNCS-1-Expression in glutamatergischen und cholinergischen Strukturen höher und breiter als in monoaminergischen Strukturen. Für Tg26- und Tg200-Linien konnte keine cNCS-1-Überexpression in der weissen Masse nachgewiesen werden.

Tabelle II. Vergleich der Verteilung von NCS-1-Transkripten zwischen den transgenen Linien Tg16 und Tg200

[0156] 
<tb>Strukturen des Nervensystems<sep>Tg26<sep>Tg200


  <tb>Vorhirn<sep><sep>


  <tb>Riechkolben<sep><sep>


  <tb>Reichknoten<sep>-<sep>-


  <tb>Zusätzlicher Riechkolben<sep>-<sep>+


  <tb><sep>-<sep>+


  <tb>Neocortex<sep><sep>


  <tb>Schicht I<sep>-<sep>-


  <tb>Schichten II-VI<sep>-<sep>+++


  <tb>Limbischer Cortex<sep><sep>


  <tb>amygdala<sep>-<sep>++


  <tb>nucleus accumbens<sep>-<sep>-


  <tb>Hippocampus (CA1-CA4)<sep>++<sep>+++


  <tb>dentale gyrus<sep>++<sep>+++


  <tb>globus pallidus<sep>-<sep>++


  <tb>ventral pallidus<sep>-<sep>++


  <tb>piriform cortex<sep>-<sep>++


  <tb>striatum<sep>-<sep>-


  <tb>Mittelhirn<sep><sep>


  <tb>Thalamus<sep><sep>


  <tb>thalamic nuclei<sep>-<sep>+


  <tb>subthalamic nuclei<sep>-<sep>+


  <tb>Hypothalamus<sep><sep>


  <tb>vorderer Hypothalamus<sep>-<sep>+


  <tb>hinterer Hypothalamus<sep>-<sep>-


  <tb>Hypophyse<sep>-<sep>-


  <tb>Pons<sep><sep>


  <tb>inferior colliculus<sep>-<sep>++


  <tb>superior colliculus<sep>+<sep>+++


  <tb>periaqueducal Grau<sep>-<sep>+


  <tb>red nucleus<sep>-<sep>++


  <tb>Medulla Oblongata<sep><sep>


  <tb>pontine nuclei<sep>+<sep>++


  <tb>facial nuceus<sep>-<sep>++


  <tb>reticularis gigantocellularis nuclei<sep>+<sep>++


  <tb>trigeminale nuclei<sep>+<sep>++


  <tb>vestibulare nuclei<sep>+<sep>++


  <tb>Cerebellum<sep><sep>


  <tb>molekulare Schicht<sep>-<sep>-


  <tb>tiefe cerebellare nuclei<sep>+<sep>++


  <tb>Purkinje Zellen<sep>-<sep>+


  <tb>Rückgrat<sep><sep>


  <tb>Motorneuronen<sep>+<sep>++


  <tb>Weisse Masse<sep>-<sep>-- kein Signal; + cNCS-1-Transkripte nachgewiesen, schwaches Signal;
++ cNCS-1-Transkripte nachgewiesen, mässiges Signal;
+++ cNCS nachgewiesen, starkes Signal.

[0157] cNCS-1-Tg-Tiere schienen normal und gesund, ihre Lebenserwartung war der ihrer WT-Wurfgenossen vergleichbar und sie hatten keine grob auffälligen lokomotorischen oder neurologischen Differenzen. Die lichtmikroskopischen und histologischen Analysen von Tg26 und Tg200 offenbarten keine grösseren anatomischen oder zellulären Unterschiede im Nervensystem und die Architektur des Hippocampus und des Rückgrats waren normal.

   Eine detaillierte Analyse von Veränderungen, die am NMJ von Tg26 und Tg200 während der postnatalen Entwicklung auftraten, zeigte, dass die Gesamtzahl an Synapsen, die Form und Morphologie von Endplatten ebenso wie die Menge an Nervensprossen den WT-Wurfpartnern ähnlich war.

6.3 Erhöhung der Langzeitpotenzierung des Hippocampus bei Tg26 und Tg200

[0158] Nach Stimulierung der Schaffer-Kollateralen nach dem theta-Ausbruchsmuster erleben pyramidale Neuronen von CA1 in Schnitten, die vom Hippocampus präpariert wurden, ein Phänomen, das Langzeitpotenzierung (LTP) genannt wird. Um die potentielle Rolle der NCS-1-Überexpression bei der synaptischen Erleichterung zu untersuchen, wurden die LTP-Spiegel bei Tg26-, Tg200- und WT-Wurfpartnern gemessen und verglichen.

   Schnitte, die NCS-1 überexprimierten, hatten eine signifikant höhere LTP (Fig. 8A). 30 Minuten nach dem ursprünglichen Stimulus gemessen war die LTP-Erhöhung bei Tg200 der von Tg26 überlegen und war bei Tg26 signifikant höher als bei WT. Diese Beobachtungen konnten direkt mit der relativen Menge an NCS-1 korreliert werden, die im Hippocampus vorhanden ist (Fig. 8B). Diese Daten legen sehr nahe, dass die beobachtete Erhöhung von LTP in CA1-Neuronen abhängig war von der NCS-1-Dosis, wobei die höchste Menge an NCS-1 in einem grösseren LTP resultierten.

   Darüber hinaus war die statistisch signifikante Erhöhung von LTP von Anfang an bei LTP vorhanden und dauerte bis zu 70 Min nach der ursprünglichen Stimulierung, was nahe legt, dass die Wirkung der NCS-1-Überexpression bereits während der frühen Phasen von LTP auftrat.

[0159] Da bekannt ist, dass die Induktion von LTP in kritischer Weise von der Aktivierung des NMDA-Rezeptors abhängig ist (Bliss und Collinridge, 1993; Nicoll und Malenka, 1995), wurde getestet, ob LTP-Erhöhung durch NCS-1 über eine Hochregelung der NMDAR-abhängigen exzitatorischen post-synaptischen Antworten (EPSPs) vermittelt wurde. Wenn die Ausbruchsantworten analysiert wurden, die zur Induktion von LTP in der Anwesenheit oder Abwesenheit des NMDA-Rezeptorantagonisten D-AP5 verwendet wurden, konnten zwischen Tg200 und WT-Wurfpartnern signifikante Unterschiede bei EPSPs beobachtet werden.

   Die Summierung der Antworten innerhalb der Ausbrüche war bei Tg200 viel höher als bei WT (Fig. 9A). Der Unterschied war besonders bedeutend beim Vergleich der letzten Ausbrüche in der Reihe von 5, die zur Induktion von LTP verwendet wurden. Als Ergebnis davon wurde auch die Grösse der NMDA-Komponente dieser Antworten auf Ausbrüche in Tg200 proportional erhöht (Fig. 9B), was zeigt, dass die NCS-1-Wirkung auf LTP vermutlich durch eine effizientere Aktivierung des NMDAR-Rezeptoren während der Stimulierung der Ausbrüche vermittelt wurde (Fig. 9A und 9B). Diese Beobachtung legt klar eine präsynaptische Modulation der Facilitation durch NCS-1 nahe. Wie in Fig. 10 gezeigt, wurde tatsächlich gefunden, dass die Facilitation des gepaarten Pulses in Dosis-abhängiger Weise von NCS-1 erhöht wird, wobei Tg200 besser ist als Tg26, diese wiederum besser als WT ist (Fig. 10A und 10B).

   Die beobachteten Unterschiede waren statistisch signifikant. Die Erhöhung der Erleichterung wurde bei allen getesteten Zeitintervallen beobachtet und war nicht mit einer Veränderung im Zeitverlauf der Erleichterung assoziiert (Fig. 10B). Das letzte Ergebnis legte eine präsynaptische Rolle für NCS-1 sehr nahe. Zusammengenommen legten diese Daten nahe, dass die Erhöhung von LTP im Gebiet CA1 vom Hippocampus und der Erleichterung des gepaarten Pulses zwischen CA3- und CA 1-Neuronen abhängig waren von der Menge an präsynaptischem NCS-1.

[0160] In ähnlicher Weise könnte eine höhere Menge an NCS-1 in Motorneuronen ebenfalls zu einem Anwachsen der Neurotransmitterfreisetzung an NMJ beitragen. Um diese Hypothese zu testen, wurden Analysen der Amplitude von Endplattenpotentialen (EPP) mit Tg200, der Linie mit dem höchsten Spiegel an NCS-1 an NMJ, durchgeführt.

   Bei normalen physiologischen Bedingungen wird ein Zug von Stimuli, der an einen motorischen Nerv angelegt wird, eine Senkung der EPP-Amplituden während des Zuges hervorrufen, ein Phänomen, das als synaptische Ermüdung bezeichnet wird und das durch die Entleerung des Pools von Vesikeln verursacht wird, die zur Fusion mit der synaptischen Membran zur Neurotransmitterfreisetzung bereit sind. Als Antwort auf identische Stimulus-Züge zeigte Tg200, nach Normalisierung, unter Verwendung von Diaphragma-NMJ-Präparationen eine ernsthaftere Entleerung als WT-Kontrollen (Fig. 11A und 11B). Diese Daten zeigten, dass die Überexpression an NCS-1 die präsynaptische Neurotransmitterfreisetzung erhöhte und eine rasche Entleerung des Pools von synaptischen Vesikeln, die zur Sekretion an NMJ bereit sind, verursacht wird.

   Dasselbe Phänomen der Entleerung von Neurotransmittervesikeln ereignet sich, wenn die Calciumkonzentration im extrazellulären Bad erhöht wird. Diese Befunde legen nahe, dass die präsynaptische Überexpression von NCS-1 eine ähnliche Wirkung hatte wie die Erhöhung der extrazellulären Calciumionenkonzentration und die anschliessende Erhöhung der Calcium-Signalübertragung.

6.4 Erhöhung des Lern- und Gedächtnisverhaltens bei Tg26

[0161] Die elektrophysiologischen Untersuchungen zeigten, dass NCS-1 LTP eine Form der synaptischen Plastizität, die bei Lern- und Gedächtnisprozessen eine wichtige Rolle spielt und, im Hippocampus erleichtert. Deswegen wurden Tg26, Tg200 und ihre WT-Wurfpartner auf ihre neurologischen und kognitiven Funktionen untersucht.

   Die anfänglichen Untersuchungen zeigten keinen offenkundigen neurologischen Phänotyp und Mäuse von Tg26- und Tg200-Linien zeigten eine gute Allgemeingesundheit und eine normale Zunahme im Körpergewicht im Vergleich mit WT. Es wurden keine Unterschiede bei der motorischen Koordination, der Schwimmfähigkeit, der Balance und den Muskelfunktionen gefunden und darüber hinaus wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen den drei Gruppen in Hinblick auf die allgemeine Aktivität im offenen Feld bemerkt.

[0162] In einem vorläufigen Wasserlabyrinth-Experiment unter Verwendung eines relativ massierten Versuchsprotokolls (d.h. 3 Versuche/Block, 2 Blöcke/Tag) zeigten die WT-Kontrollen und die Tg26-Linie äquivalentes Orientierungs- und räumliches Lernen, obwohl die Tg200-Linie eine leichte Beeinträchtigung beim räumlichen Lernen zeigten.

   Dies wurde anhand eines Probentests gezeigt, der unmittelbar nach dem Training durchgeführt wurde. Wichtig ist, dass Orientierungslernen und Schwimmgeschwindigkeit zwischen den Gruppen ähnlich waren. Deshalb wurde beschlossen, sich auf die Tg26-Linie zu konzentrieren, bei der die NCS-1-Überexpression mehr auf den Hippocampus beschränkt war und man spekulierte, dass die weitere und quantitativ höhere Expression von NCS-1 bei Tg200 für die kognitive Leistung nachteilig sein könnte. Unter Verwendung eines Wasserlabyrinthprotokolls mit getrennten Versuchen bei experimentell naiven Mäusen (d.h. 2 Versuche/Block, 1 Block/Tag, 5 Tage) zeigten bei WT- und Tg26-Mäuse eine ähnliche Erwerbsrate (Fig. 12A).

   Ein Probentest jedoch, der 1 Std. nach dem 5ten Versuchsblock durchgeführt wurde, zeigte eine verbesserte räumliche Präferenz für die Lage der Insel in der transgenen Linie Tg26 (Fig. 12B). Ein weiterer Block von 5 Versuchen wurde durchgeführt (Woche 3; Fig. 12C) und bei dieser Gelegenheit war die Tg26-Linie signifikant schneller als die WT-Kontrollen in Bezug auf die Latenz der Lokalisierung der Inselplattform. Probentests, die nach nach den Blöcken 3 und 5 während dieser Phase durchgeführt wurden, waren konsistent mit verbessertem Lernen bei den Tg26-Mäusen (Fig. 12D). Ein letzter Probentest wurde 5 Tage nach der zweiten Phase (Woche 3) durchgeführt und zeigte erneut verbesserte Leistung bei den Tg26-Mäusen im Vergleich mit WT (Fig. 12E).

   Zu diesem Zeitpunkt zeigten Tg26-Mäuse, nicht aber die WT-Kontrollen, noch eine signifikante Präferenz für den Inselquadranten und zeigten damit bessere Merkfähigkeiten für die Tg26-Tiere.

[0163] Um Unterschiede bei der Lernfähigkeit zwischen Tg26- und WT-Mäusen weiter zu untersuchen, wurde ein konditionierter aktiver Vermeidenstest durchgeführt. Eine andere Gruppe von experimentell naiven Mäusen wurde auf Vermeiden eines Fussschocks getestet, der durch einen konditionierten visuellen Stimulus signalisiert wurde. Wiederum zeigten Tg26-Mäuse während des Trainings verbesserte Lernleistungen im Vergleich mit WT-Mäusen (Fig. 13A). Die grössten Unterschiede zwischen den beiden Linien wurden nach dem 3ten und 4ten Versuchsblock nachgewiesen.

   Nach der 5ten Runde erreichten die Tg26-Mäuse nahezu ein Maximalniveau bei der Leistung, während WT-Mäuse ein ähnliches Leistungsniveau am 8ten Versuchsblock erreichten. Tg26-Mäuse zeigten auch eine signifikant niedrigere Vermeidenslatenz im Vergleich mit WT-Mäusen (Fig. 13B). Im Gegensatz dazu wurden bei den Fluchlatenzen zwischen den Tg26- und WT-Mäusen keine Unterschiede nachgewiesen, konsistent damit, dass beide Gruppen ähnliche Reaktionen auf den elektrischen Schock zeigten. Um mögliche Unterschiede in der Gehirnleistung zwischen den beiden Gruppen weiter zu untersuchen, wurde am Ende des aktiven Vermeidenstests eine Schockschwellenanalyse durchgeführt.

   Die Schockniveaus, bei denen die Tg26- und WT-Mäuse den Schock zuerst bemerkten (Zucken) oder Lautäusserungen von sich gaben, waren ähnlich (Zucken: WT = 0,15+-0,0 mA und Tg26 = 0,14+-0,1 mA; Lautäusserungen: WT = 0,42+-0,0 mA und Tg26 =0,40+0,1 mA). Dies legt nahe, dass die verbesserte Lernfähigkeit der Tg26-Mäuse nicht eine Konsequenz einer veränderten Schmerzwahrnehmung ist, die durch die Überexpression von NCS-1 verursacht ist.

[0164] Weil Unterschiede bei der Angst- oder Stressreaktivität Unterschieden bei der Lernleistung zwischen TG26- und WT-Mäusen zugrunde liegen könnten, wurden auch Antworten auf Aversions-Stimuli bestimmt und verglichen. Zunächst wurde das angeborene Vermeidensverhalten der Tg26- und WT-Mäuse für eine helle Umgebung unter Verwendung des Licht-Dunkel-Tests untersucht.

   Bei den Angstmessungen wurden zwischen den beiden Linien keine Unterschiede festgestellt. Das Ausmass an Zeit, das in dem beleuchteten Abteil verbracht wurde und die Anzahl an Übergängen zwischen dem hellen und dunklen Abteil waren für die beiden Linien vergleichbar. Die defensiven Reaktionen der Tiere in Bezug auf verschiedene akustische Stimuli (74, 82, 90 und 110 dB) wurden ebenfalls verglichen. Erneut zeigten die Tg26- und WT-Mäuse eine ähnliche Schreckreflexschwelle. Bei demselben Verfahren wurde untersucht, ob die NCS-1-Überexpression die Vorpuls-Inhibition (PPI) des akustischen Schrecks, die auch von Funktionen des Hippocampus abhängt, beeinflusst.

   PPI ist die Modulation der Schreckantwort durch einen schwachen Vorpuls und wird als ein Index für das sensorimotorische Filtern angesehen, welches der Prozess ist, durch den inhibitorische Wege vielfache Stimuli filtern und es zulassen, dass nur auf einen Stimulus konzentriert wird. Bei den Niveaus an PPI wurden zwischen Tg26-Mäusen und ihren WT-Wurfpartnern bei keiner der Vorpuls-Intensitäten von 74, 82 und 90 dB Unterschiede festgestellt.

6.5 Zusammenfassung

[0165] Bei den vorstehend beschriebenen Experimenten wurden zwei transgenen Mäuselinien getestet, TG200 und Tg26, die den neuronalen Calcium-Sensor-1 der Wirbeltiere überexprimierten, um die synaptische Plastizität und assoziatives Lernen und Gedächtnis zu untersuchen.

   Die Linie Tg26 wurde ausgewählt, weil das Niveau an NCS-1-Überexpression moderat ist und zumeist auf den Hippocampus beschränkt, wohingegen die Linie Tg200 ausgewählt wurde, weil die NCS-1-Überexpression ein viel höheres Niveau erreichte und eine breitere Verteilung hatte. Interessanterweise zeigte Tg26 eine Erhöhug bei LTP, und unter Verwendung des Morris-Wasserlabyrinth- und aktiven Vermeidenstests ein verbessertes räumliches Lernen im Vergleich mit WT. Die Tg-26-Tiere zeigten einen schnelleren Erwerb des Lernens des aktiven Vermeidens im Vergleich zu Kontrollen von WT-Wurfpartnern. Auf der zellulären Ebene resultierte die Überexpression von NCS-1 in einem Dosis-abhängigen Anwachsen von LTP im CA1-Bereich des Hippocampus.

   Es ist verlockend, die verbesserten Lernfähigkeiten von Tg26-Mäusen mit dem langandauernden Anwachsen der synaptischen Effizienz zu verknüpfen, die im Hippocampus offenbart wird. Obwohl das Anwachsen von LTP nur im CA1-Bereich des Hippocampus bestimmt wurde, ist es sehr wahrscheinlich, dass die NCS-1-abhängige LTP-Erleichterung auch im gezähnten Gyrus und in anderen CA-Neuronen des Hippocampus auftritt, wo NCS-1 überexprimiert wurde.

   Die vorliegenden Befunde erweitern kürzliche Untersuchungen, die schlaue Mäuse beschrieben, die modifizierte Spiegel der Expression von wichtigen synaptischen Komponenten aufweisen, die wichtig sind für die Induktion oder das Bewahren der Langzeit-Potenzierung, wie die NMDA-Rezeptoruntereinheit NR2B (Tang et al., 1999), Gewebetyp-Plaminogenaktivator (tPA) Madani et al., 1999), Wachstum-assoziiertes Protein GAP-43 (Routtenberg et al., 2000), Calcineurin (Malleret et al., 2001), wo ein Anwachsen von LTP mit verbesserten Leistungen bei Aufgaben des räumlichen Lernens korreliert wurde.

   Weiterhin unterstützen die Ergebnisse, die gemäss der vorliegenden Erfindung erhalten wurden, viele andere Beobachtungen, wo Mäuse mit einer genetischen Störung oder Veränderung von essentiellen synaptischen Elementen, wie alpha CaMKII, CREB oder NR1, erniedrigten oder keinen LTP, zusammen mit verschlechterten Lern- und Gedächtnisfähigkeiten, zeigten (Giese et al., 1998; Mayford et al., 1996; Silva et al., 1992; Silva et al., 1992) (Bourtchuladze et al., 1995) (Tsien et al., 1996; Tsien et al., 1996). Mit anderen genetisch veränderten Mäusen erhaltene Ergebnisse haben jedoch die Verbindung zwischen LTP im Hippocampus und Leistungen bei Aufgaben des räumlichen Lernens in Frage gestellt.

   Tatsächlich wurden Knockouts des AMPA-Rezeptors GluR1, GluR2, PSD-95, OFQ oder PTPdelta beschrieben, bei denen eine veränderte Expression von LTP nicht übereinstimmte mit niedrigerer Leistung bei Hippocampus-abhängigem Lernen (Jia et al., 1996) (Zamanillo et al., 1999) (Migaud et al., 1999) (Koster et al., 1999; Uetani et al. 2000; Wei und Xie, 1999) (Übersicht in (Picciotto und Wickman, 1998). Zum Beispiel korrelierte in Tg200-Mäusen, die eine stärkere und weitere Überexpression von NCS-1 im Gehirn hatten, das Anwachsen von CA1-LTP nicht mit verbesserten Leistungen beim räumlichen Lernen, das von komplexen funktionellen Wechselwirkungen (Kompetition und Synergismus) zwischen dem Hippocampus und anderen Gehirnstrukturen abhängt (für einen Überblick vgl. (Kim und Baxter, 2001; Rossi-Arnaud und Ammassari-Teule, 1998)).

   Es ist daher möglich, dass die beschränkten Lernleistungen der Tg200-Linie mit einer Überexpression von NCS-1 in anderen corticolimbischen Strukturen einhergehen, von denen bekannt ist, dass sie eine inhibitorische Kontrolle auf die Verarbeitung von räumlichen Informationen ausüben.

[0166] Interessanterweise war die Höhe der LTP-Erleichterung mit der Menge an NCS-1 korreliert, die im Hippocampus anwesend ist. Dieses NCS-1-abhängige Anwachsen von LTP konnte höchstwahrscheinlich durch einen präsynaptischen Mechanismus vermittelt werden (Fig. 14). Ähnliche Beobachtungen wurden mit C. elegans in den Beispielen 3 bis 5 erhalten. Eine präsynaptische Wirkung von NCS-1 wurde auch an der NMJ von Fliegen und Fröschen berichtet (Olafsson et al., 1995; Rivosecchi et al., 1994).

   An NMJ jedoch wird die synaptische Entleerung durch eine progressive Abnahme der mittleren Zahl an Transmitterquantenfreisetzungen durch Aktionspotentiale verursacht. Es ist vorgeschlagen worden, dass entweder die Entleerung im Pool an freisetzbaren Vesikeln (Mallart und Martin, 1968) oder die Modulation der Freisetzung vom präsynaptischen Ende durch Adenosin (Redman und Silinsky, 1994) die synaptische Depression an NMJ verursachen. Die vorliegenden Ergebnisse sind somit konsistent mit der Idee, dass in den präsynaptischen Nervenenden von Motorneuronen, die NCS-1 überexprimieren, der Ca<2+>-Einfluss/die Ca<2+>-Signalübertragung erhöht wird oder dass die Sequestrierung von Ca<2+> im Vergleich mit WT erniedrigt ist.

   Die erhöhte Zahl an Transmitterquantenfreisetzungen während der anfänglichen Aktionspotentiale ist am Säugetier-NMJ schwierig zu bestimmen, induziert aber wahrscheinlich die synaptische Ermüdung und die verminderten Antworten. Durch NCS-1 erhöhte Mechanismen der Calcium-Signalübertragung könnte auch während LTP in Hippocampus-Schnitten von NCS-1-transgenen Tieren eine Rolle spielen, wie hier gezeigt. Darüber hinaus legen die vorliegenden Daten eine präsynaptische Rolle für NCS-1 nahe, schliessen aber eine postsynaptische Wirkung nicht aus, da NCS-1 eindeutig an beiden Seiten von vielen Synapsen vorhanden ist (Martone et al., 1999). In der Abwesenheit von bewiesen NCS-1-abhängigen molekularen oder zellulären in-vivo-Wegen stellt der vorgeschlagene Mechanismus noch eine Arbeitshypothese dar.

   NO-Synthase, PDE und Calcineurin sind unter den Zielen, von denen bekannt ist, dass sie von NCS-1 in vitro reguliert werden (Schaad et al., 1996). Von NCS-1 ist auch gezeigt worden, dass es mit einer Phosphatidylinositol 4-OH-Kinase wechselwirkt (Zhao et al., 2001) und in vivo CaM-abhängige Kaliumkanäle ersetzt (Schaad et al., 1996). Alle diese stellen daher potentielle Ziele dar, die für die Vermittlung der in vivo beobachteten NCS-1-Wirkung verantwortlich sind. Darüber hinaus hat eine sehr neue Untersuchung nahe gelegt, dass NCS-1 bei der Regulierung von Ca<2+>-Calciumkanälen vom P/Q-Typ durch eine Tyrosinkinase von der Src-Familie in kultivierten Zellen eine Rolle spielt (Weiss und Burgoyne, 2001).

   Trotz der synaptischen Ermüdung, die durch elektrophysiologische Aufzeichnungen an der NMJ gezeigt wurde, wurde gefunden, dass beide transgenen Linien normale allgemeine motorische Leistungen hatten, bestimmt unter Verwendung der Muskelstärke, der lokomotorischen Aktivität und der Schwimmfähigkeit. Die neurophysiologischen Veränderungen, die durch die Überexpression von NCS-1 produziert werden, scheinen deshalb zu subtil zu sein, um auf der Ebene des Verhaltens nachgewiesen zu werden. Es sollte auch betont werden, dass in Tg26-Mäusen die Überexpression von NCS-1 keine Wirkung auf emotionales Verhalten hatte. Diese Mäuse zeigten normale defensive Reaktionen auf akustische Stimuli und normale neophobische Antworten im Licht-Dunkel-Test.

   Dies legt nahe, dass die verbesserte Lernfähigkeit von Tg26-Mäusen nicht eine Folge von Veränderungen in der Reaktion auf Stress ist, die durch die Überexpression von NCS-1 im Hippocampus verursacht werden. Dies ist eine wichtige Beobachtung angesichts der zentralen Rolle des Hippocampus bei der Modulierung von Verhalten in Bezug auf Stress und Angst (Gray, 1982). Es scheint daher, dass im Hippocampus NCS-1 eine essentielle Komponente des neuralen Netzwerks ist, das Lern- und Gedächtnisprozessen dient. In Übereinstimmung mit dieser Hypothese wurde kürzlich gezeigt, dass die Induktion von NCS-1-mRNA ein Teil der transkriptionellen Antwort ist, die mit der aktivitätsabhängigen neuronalen Plastizität in vivo assoziiert ist (Genin et al., 2001).

   Zusammengenommen würden die vorliegenden Befunde nahelegen, dass die Überexpression von NCS-1 im Hippocampus Lern- und Gedächtnisprozesse erleichtert, indem es viele wichtige neuronale Funktionen beeinflusst, einschliesslich Neurotransmitterfreisetzung, intrazellulärer Signalübertragung, synaptischer Plastizität und der Genexpressionskaskade, die zur Bildung neuer Erinnerungen erforderlich ist.

Beispiel 7: NCS-1-Knockout-Mäuse

7.1 Experimentelle Verfahren

7.1.1 Herstellung von NCS-1-Knockout-Mäusen

[0167] Exon 1 des NCS-1-Gens der Maus wurde durch seinen Ersatz mit einer LacZ-Reportergenkassette unterbrochen. Das verwendete Zielkonstrukt ist in Fig. 15A gezeigt. Fig. 15B zeigt die Zielrichtung auf Exon 5 ebenso wie die Lage der Sonden, die zur Bestimmung von erfolgreichen homologen Rekombinationen mittels Southern Blot verwendet wurden.

   In Fig. 15C wird das PCR-positive Kontrollkonstrukt dargestellt. Fig. 15D zeigt erneut die Zielrichtung mit der Lage der Primer Neol und C55 für die PCR-Analyse von erfolgreichen homologen Rekombinationen.

7.1.2 Verhaltensuntersuchungen

[0168] Knockout-Mäuse werden in Tests auf Defekte im Verhalten untersucht. Diese Tests schliessen das Morris-Wasserlabyrinth, die Furchtkonditionierung und das aktive und passive Vermeiden, wie nachstehend beschrieben, ein. Darüber hinaus werden ihre allgemeinen Niveaus bei, zum Beispiel, der lokomotorischen Aktivität, dem Erkennen, dem Lernen, Furcht und Angst erfasst. Die Mäuse werden wöchentlich gewogen und das allgemeine Erscheinungsbild überprüft.

   Alle Mäuse werden individuell beherbergt.

Neurologische Tests

[0169] Lokomotorische Aktivität: Die Mäuse werden für eine Std. in eine neue Testkammer gebracht, die aus einem Plexiglas<(RTM)>-Kasten (20 cm X 20 cm X 27 cm) mit Sägemehlstreuung auf dem Boden besteht. Die Bewegung der Tiere wird unter Verwendung eines elektronischen Aufzeichnungssystems (Omnitech Electronics Inc., Columbus, Ohio, USA) festgehalten. Die Bewegung der Tiere resultiert in einer Unterbrechung eines Arrays von Lichtstrahlen von vertikal und horizontal lokalisierten Infrarotquellen, die um die Testkammer platziert waren. Die insgesamt zurückgelegte Strecke (cm) und die Zahl der Umkehren wird gemessen.

[0170] Draht-Manöver: Die Mäuse werden mit den Vorderpfoten auf einen angehobenen Drahtstab gesetzt und die Latenz bis zum Herabfallen festgehalten.

   Die Ausschlusszeit ist 60 Sek. und der beste Wert von drei Versuchen wird festgehalten.

[0171] Griffstärke: Die Mäuse werden gezwungen an einem Kraftmesser zu ziehen und der Punkt des Loslassens wird festgehalten. Der beste Wert von 5 Versuchen wird festgehalten.
1 Meter-Schwimmtest: Die Mäuse werden in einen glatten Schwimmtank (1 m lang X 6 cm breit) platziert. Die Latenz, um die Strecke zu schwimmen und auf die Plattform zu klettern, wird notiert. Den Mäusen werden 3 Versuche über drei aufeinanderfolgende Tage gestattet und die schnellste Zeit wird festgehalten.

[0172] Drehstab: Die Mäuse werden auf einen Drehstab mit konstanter Geschwindigkeit gesetzt und die Latenz bis zum Fallen notiert. Die Ausschlusszeit ist 120 Sek. und das beste Ergebnis von drei Versuchen wird genommen.

   Zwei Geschwindigkeiten werden verwendet: 16 Umdr./Min und 32 Umdr./Min.

[0173] Zusätzlich werden auch die Körpertemperatur, das Aussehen des Fells, sekretorische Zeichen und die Körperhaltung notiert.

[0174] Y-Labyrinth: Die Mäuse werden 5 Min in ein Y-Labyrinth platziert, das aus schwarzem Perpex hergestellt ist (jeder Arm ist 53 cm Lang, 15 cm breit und 30 cm hoch). Eine Kamera wird oberhalb des Labyrinths positioniert und der Experimentator beobachtet die Tiere auf einem Monitor in einem benachbarten Raum. Die Zahl des Betretens eines Arms und die Sequenz des Betretens wird notiert, um ein Wechselmass zu berechnen.

[0175] Morris Wasser-Labyrinth: Das Wasser-Labyrinth besteht aus einem grauen kreisförmigen Tank (1 m Durchmesser), der mit Wasser gefüllt ist, das durch die Zugabe einer Latexlösung (E-308; Induchem, Volketswil, Schweiz) opaque gemacht wurde.

   Die Pooltemperatur wird bei 21 + 1 deg. C gehalten. Für die Aufgabe mit der versteckten Plattform wird die Fluchtplattform (8 cm Durchmesser) 1 cm unter der Wasseroberfläche in der Mitte von einem der Poolquadranten positioniert. Für die Orientierungsaufgabe wird die Position der Plattform durch die Zugabe einer kleinen schwarzen Flagge, die in der Mitte der untergetauchten Plattform positioniert ist, signalisiert. Die das Wasser-Labyrinth umgebenden Wände sind mit Postern und Flaggen behängt, die als visuelle Orientierungspunkte dienen und die während aller Stadien von Training und Test sichtbar sind.

   Die Bewegung der Mäuse innerhalb des Pools wird verfolgt und mittels eines Computer-basierten Video-Spurverfolgungssystems (HVS Image, Hampton, UK) analysiert.

[0176] Für das Orientierungstraining werden die Mäuse gegenüber einer Ecke von einer von vier Startpositionen (NO, SO, SW, NW) positioniert und es wird verlangt, die geflaggte Plattform zu lokalisieren, deren Position innerhalb der Versuche variiert. Jede Maus erhält insgesamt 12 Versuche (3 Versuche pro Block, 2 Blöcke am Tag, 2 Tage Dauer). Die Intervalle zwischen den Versuchen sind im Durchschnitt 10 Min und die maximale Länge eines Versuchs ist 60 Sek. Wenn es den Mäusen nicht gelingt, die Plattform innerhalb von 60 Sek. zu finden, werden sie von dem Experimentator zu ihrer Position geleitet.

   Allen Mäusen wird es gestattet, für einen Zeitraum von 10 Sek auf der Plattform zu bleiben, bevor sie entfernt und in ihren Käfig zurückgebracht werden. Der Orientierungsaufgabe folgt die Platzaufgabe, bei denen von den Mäusen erwartet wird, eine untergetauchte, versteckte Plattform zu lokalisieren, deren Position während des Trainings fixiert bleibt. Die Lage der Plattform wird innerhalb der Gruppen balanciert. Jede Maus erhält 8 Trainigsblöcke über vier aufeinanderfolgende Tage (drei Versuche pro Block, Zeiteinteilung wie beim Orientierungstest), bei denen sie an einer der vier Startpositionen im Pool platziert werden und es ihnen erlaubt wird, die versteckte Plattform zu lokalisieren. Die Bewertung des räumlichen Lernens wird in Probeversuchen durchgeführt, die sowohl 30 Min nach Block 4 und 24 Std. nach dem letzten Versuch durchgeführt werden.

   Bei jedem Probeversuch wird die Plattform aus dem Pool entfernt und der von der Maus geschwommene Weg über einen Zeitraum von 60 Sek. aufgezeichnet.

[0177] Aktives Vermeiden: Die Mäuse werden in eine Kammer mit zwei Abteilen platziert, innerhalb derer sie sich zwischen den beiden Abteilen frei hin und her bewegen können (San Diego Instruments, USA). Jeder Versuch beginnt damit, dass die Seite, wo sich die Maus gerade befindet, mit 10 Sek. Licht (CS) beleuchtet wird, welches verwendet wird, um einen Fussschock (0,2 mA) mit einer maximalen Dauer von 20 Sek. anzukündigen. (NB. Die Mäuse erhalten diese Fussschockdauer nie, wenn sie entweder innerhalb von 1 Sek. in das andere Abteil entweichen (ohne Schock) oder lernen, den Schock insgesamt zu vermeiden).

   Dem folgt ein variabler Zeitabschnitt (Mittelwert 20 Sek., Bereich 15-25 Sek.) (kein Licht), in dem die Maus die Kammer frei erforschen kann. Nach dieser Auszeit beginnt der nächste Versuch. Der Schock kann entweder durch Wechsel in das nächste Abteil während der CS-Periode (d.h. Vermeiden) oder durch Flucht zu jeder Zeit während des Schocks vermieden werden. Zehn tägliche Läufe werden während jeder Versuchsperiode abgehalten, die aus 20 Versuchen bestand. Die abhängige Messung ist "%-Vermeiden".

7.2 Zusammenfassung

[0178] Da die NCS-1-Überexpression die Langzeit-Potenzierung (LTP) und kognitive Phänotypen mit besseren Lern- und Gedächtnisfähigkeiten erhöht (basierend auf elektrophysiologischen und Verhaltensanalysen), ist zu erwarten, dass eine Maus-Linie, der die NCS-1-Genexpression fehlt (ncs-1-Knockout-Maus) einen gegensätzlichen Phänotyp hat.

   Dies schliesst weniger Gedächtnis und Lernen oder niedrigere oder veränderte Niveaus an LTP ein.

[0179] 18 chimäre Mäuse mit 10-95% Chimärie wurden erhalten. Diese Mäuse wurden gekreuzt, um heterozygote Gründer zu erhalten. Bei diesen Mäusen ist das Exon 1 des endogenen ncs-1-Gens unterbrochen und damit nicht mehr funktionsfähig. Dies wird das Fehlen des NCS-1-Proteins im Gehirn verursachen. Diese Mäuse werden auf Verhaltensdefekte getestet (d.h. Morris-Wasser-Labyrinth, Furcht-Konditionierung, aktives und passives Vermeiden) und ihr allgemeines Niveau an lokomotorischer Aktivität, Erkennen, Gedächtnis, Lernen, Furcht, Angst bewertet, das mit dem Niveau von Wildtyp-Mäusen und transgenen NCS-1-Mäusen verglichen wird. Das Niveau an LTP/LTD im Hippocampus und anderen Gehirnbereichen wird bestimmt und mit Wildtyp- und transgenen NCS-1-Tieren verglichen.

   Darüber hinaus werden NCS-1-Knockout-Mäuse verwendet, um die Rolle von NCS-1 bei der Entwicklung und Synaptogenese zu untersuchen und um die biochemischen Funktionen zu bestimmen, d.h. die Bestätigung und Charakterisierung seiner Bindungspartner.

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[0252] Es ist klar, dass die Erfindung anders ausgeführt werden kann als spezifisch in der vorstehenden Beschreibung und den Beispielen beschrieben. Viele Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung sind angesichts der vorstehenden Lehren möglich und liegen daher im Umfang der beigefügten Ansprüche.

Sequenzprotokoll

[0253] 
<110> : F.

   Hoffmann-La Roche AG
<120> : Neue Verwendung des Neuronalen Calcium-Sensors-1 (NCS-1) bei der Therapie von ZNS-Erkrankungen und bei der Entwicklung von therapeutischen Mitteln
<130> : F 1348 DE
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<213> : Caenorhabditis elegans
<400> : 1

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<tb>agctttactg<sep>tttttgaact<sep>aatcatcaat<sep>tagctccacc<sep>tacttttaac<sep>tagatctgtt<sep>60


  <tb>aacaacccat<sep>gtagtgatag<sep>cttccctcat<sep>tttcaaacca<sep>atcagcagtt<sep>aggtcaatct<sep>120


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Claims (12)

1. Verfahren zur Identifizierung und Gewinnung eines Wirkstoffkandidaten für die Therapie einer Verhaltensstörung oder zur Verbesserung des Lernens und/oder des Gedächtnisses eines Individuums, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Durchmusterung einer Zelle, eines Gewebes oder eines nicht-menschlichen Tieres mit einer zu durchmusternden Verbindung, unter Bedingungen, die die Aktivität des Neuronen-spezifischen Calcium-Sensors-1 (NCS-1) zulassen; und (b) Bestimmung der NCS-1-Aktivität der behandelten Zelle, des behandelten Gewebes oder des nicht-menschlichen Tieres, wobei ein Unterschied bei der NCS-1-Aktivität im Vergleich mit einer entsprechenden Kontrollzelle, einem entsprechenden Kontrollgewebe oder einem entsprechenden nicht-menschlichen Kontrolltier, ein Indiz für einen Wirkstoffkandidaten ist;

und gegebenenfalls (c) Gewinnung des Wirkstoffkandidaten, von dem bei Schritt (b) bestimmt wurde, dass er die NCS-1-Aktivität verändert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die NCS-1-Aktivität die Calcium-Bindung von NCS-1 oder eine Veränderung der Konformation und/oder der Funktion von NCS-1 ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Zelle, das Gewebe oder nichtmenschliche Tier eine transgene Zelle, ein transgenes Gewebe oder ein transgenes nicht-menschliches Tier ist, welche(s) ein im Wesentlichen reduziertes oder erhöhtes Niveau an Neuronen-spezifischem Calcium-Sensor-1 (NCS-1)-Aktivität im Vergleich mit den entsprechenden Wildtyp-Zelle, Wildtyp-Gewebe oder Wildtyp-Tier zeigt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei für das transgene nicht-menschliche Tier der Unterschied bei der NCS-1-Aktivität zu einem Unterschied im Verhalten führt.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei das transgene nicht-menschliche Tier, das ein reduziertes Niveau an Neuronen-spezifischen Calcium-Sensor-1 (NCS-1)-Aktivität zeigt, mindestens ein mutantes Allel des NCS-1 codierenden Gens umfasst oder ein entsprechendes trans-dominantes Allel eines anderen Gens.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das transgene nicht-menschliche Tier ein ncs-1-Knockout-Tier ist.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei das transgene nicht-menschliche Tier C. elegans ist und das Verhalten das isothermische Spurverhalten (IT) ist, oder das nicht-menschliche Tier eine Maus ist und das Verhalten die Lern- und Gedächtnisleistung im Morris Wasserlabyrinth und bei den Aufgaben des aktiven Vermeidens ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Verbindung, die überprüft werden soll, von einem NCS-1-Polypeptid, einem NCS-1-Antisense-Molekül, einem NCS-1-Antikörper, einem Transkriptionsregulator des ncs-1-Gens, einem Ligandenbindungsmolekül, einem Calcium-Imitator und/oder Calcium-Mimetikum oder einem Derivat eines Calmodulin-Aktivators oder -Inhibitors abgeleitet ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der Wirkstoffkandidat eine Leitsubstanz ist.

10. Ein transgenes nicht-menschliches Tier, eine transgene Zelle davon oder ein transgenes Gewebe davon, die ein reduziertes Niveau an Neuronen-spezifischen Calcium-Sensor-1 (NCS-1) Aktivität zeigen und die mindestens ein mutantes Allel des NCS-1 codierenden Gens oder ein entsprechendes trans-dominantes Allel eines anderen Gens umfassen für ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9.

11. Ein transgenes nicht-menschliches Tier, eine transgene Zelle davon oder ein transgenes Gewebe davon nach Anspruch 10, wobei das transgene Tier ein ncs-1-Knockout-Tier ist.

12. Ein transgenes nicht-menschliches Tier, eine transgene Zelle davon oder ein transgenes Gewebe davon nach Anspruch 10 oder 11, wobei das transgene Tier C. elegans oder eine Maus ist.