FR2824478A1

FR2824478A1 - Nouvelle utilisation du ncs-1(neuron specific calcium sensor-1)pour le traitement des troubles du snc et le developpement d'agents therapeutiques

Info

Publication number: FR2824478A1
Application number: FR0204797A
Authority: FR
Inventors: Patrick Nef
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2001-04-17
Filing date: 2002-04-17
Publication date: 2002-11-15
Anticipated expiration: 2022-04-17
Also published as: JP2003040801A; US20030159158A1; DE10217066A1; FR2824478B1; US7230155B2; GB2377635B; GB0208525D0; GB0507998D0; GB2377635A; CH697372B1; GB2411403A

Abstract

Sont décrits des compositions pharmaceutiques comprenant des composés aptes à moduler le NCS-1 (neuron-specific calcium sensor-1) et leur utilisation pour le traitement de troubles du SNC tels que la schizophrénie, la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, l'hyperactivité, et pour améliorer la cognition du sujet. Sont en outre proposés l'utilisation de NCS-1 et d'analyses à base de cellules correspondantes en tant qu'outils de recherche et de travail pour un procédé permettant d'identifier et d'obtenir des candidats médicaments pour le traitement des troubles mentionnés ou pour améliorer la cognition d'un sujet.

Description

La présente invention concerne des compositions pharmaceutiques comprenant des composés aptes à moduler NCS-1(neuron-specific calcium sensor-1) et leur utilisation pour le traitement de troubles du système nerveux central (SNC) tels que la schizophrénie, la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, l'hyperactivité et pour améliorer la cognition du sujet. La présente invention concerne en outre l'utilisation de NCS-1 et des analyses sur une base cellulaire correspondantes en tant qu'outils de recherche et de travail pour un procédé permettant d'identifier et d'obtenir des candidats médicaments pour le traitement des troubles mentionnés ou pour améliorer la cognition d'un sujet. Les nouveaux médicaments obtenus par le procédé sont également un objet de la présente invention.

Plusieurs documents sont cités dans tout le texte de cette description par le nom. On trouvera les références bibliographiques complètes à la fin de cette description, immédiatement avant les revendications.

Chacun des documents cités dans la présente description (comprenant des spécifications de fabricants, instructions, etc. ) est incorporé à la présente à titre de référence ; il n'est cependant pas admis qu'un document quelconque cité constitue effectivement la technique antérieure quant à la présente invention.

NCS-1(neuron-specific calcium sensor-1) est un détecteur de calcium intracellulaire de la famille des protéines de liaison au calcium à sites "EF-hands", qui est spécifique des neurones et hautement conservé au cours de l'évolution avec 100 % d'identité au niveau acide aminé parmi les vertébrés, et 75 % entre les vertébrés et C. elegans (Braunewell et Gundelfinger, 1999 ; De Castro et al., 1995). Le NCS-1 se lie à

3 ions calcium avec une forte affinité de - 300 nM, c'est-à-dire dans l'intervalle des fluctuations du Ca2+i intracellulaire dont on connaît le rôle de régulation sur des fonctions neuronales clé, telles que la libération de neurotransmetteurs, la phosphorylation de récepteurs, des activités de canal ionique, ou la transcription (Bourne et al., 2001 ; et Weiss, 2001 ; Cox et al., 1994 ; Fontana et Blaustein, 1993 ; Martone et al., 1999 ; Paterlini et al., 2000 ; Yazejian et al., 2000). De manière calcium-dépendante, le NCS-1 de vertébré recombinant peut activer, in vitro, la G-protéine récepteur kinase 1 (De Castro et al., 1995 ; et al., 1999), se substituer à la calmoduline (CaM) et activer directement des cibles CaM-dépendantes telles que la phosphodiestérase nucléotidique cyclique 3':5', la calcineurine, et des enzymes NO-synthases (Schaad et al., 1996). Il a également été mentionné que le NCS-1 régule l'exocytose évoquée dans les cellules neuro-endocriniennes (McFerran et al., 1998). Des analyses phénotypiques abordant le rôle fonctionnel de NCS-1 in vivo ont été réalisées avec de la levure, Paracemium, C.elegans, et Drosophila. Dans S. cerevisiae, le gène frql code pour le NCS-1 qui est essentiel au développement végétatif, et dont l'interaction avec la phosphatidylinositol 4-OH kinase Pikl de levure (Hendricks et al., 1999) a été montrée suite à des études génétiques. Le NCS-1 des vertébrés se substitue directement à une forme mutée de la CaM dans Paramecium et peut restaurer des réponses comportementales (réaction d'évitement) de type sauvage (WT) normales dans les mutants Paracemium vivants, très vraisemblablement par l'intermédiaire de la réactivation d'un canal de potassium CaM-dépendant (Schaad et al., 1996). Un phénotype de type "shaker"

dans Drosophila, provoqué par une surexpression de la fréquénine (Pongs et al., 1993), l'orthologue de NCS-1 chez Drosophila, semble impliquer une augmentation de la libération de neurotransmetteurs évoquée au niveau de la jonction neuro-musculaire (NMJ) de mouches par l'intermédiaire de mécanismes inconnus qui pourraient éventuellement impliquer la régulation NCS-1-dépendante d'un canal de K+ (Poulain et al., 1994) ou d'un échangeur Na±Ca2+ (Rivosecchi et al., 1994). Toutefois, la fonction de NCS-1, s'il y en a une, en termes de caractéristiques phénotypiques particulières sensibles à l'activité de NCS-1 demeurait inconnue.

La présente invention résout le problème technique défini ci-dessus en proposant les modes de réalisation caractérisés dans les revendications. En particulier, la présente invention propose une nouvelle voie de fonction du SNC par l'intermédiaire du détecteur de calcium neuronal NCS-1 qui peut être utilisé en tant que nouvelle cible pour l'intervention thérapeutique.

Par conséquent, dans un aspect, la présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant un agoniste/activateur ou un antagoniste/inhibiteur de NCS-1(neuron-specific calcium sensor-1), et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

Conformément à la présente invention, le rôle neuronal des gènes ncs in vivo a été caractérisé par génétique de perte de fonction dans un organisme eucaryotique. Pour étudier le rôle de NCS-1 en tant que régulateur de l'activité neuronale in vivo, C. elegans a été choisi comme organisme modèle du fait de la simplicité de son système nerveux et que ses circuits neuronaux soient bien décrits, avec l'aptitude à répondre à diverses stimulations environnementales

telles que le toucher, l'odorat, le goût ou la température. De plus, un modèle vertébré d'apprentissage associatif et de mémoire avec deux lignées de souris transgéniques a été utilisé.

Les séquences de nucléotides et d'acides aminés de NCS-1 sont décrites dans la technique antérieure, par exemple dans les documents cités dans la section d'arrière-plan ci-dessus et dont le contenu descriptif est incorporé à la présente à titre de référence. De plus, les séquences codantes des gènes de NCS-1 peuvent être extraites des bases de données publiques, telles que de NCBI ; par exemple, les numéros d'accès XM 005625 et NM 014286 décrivant le NCS-1 sous la forme de l'homologue (FREQ) (Drosophila) fréquénine de l'Homo sapiens, NM~019681 décrivant le NCS-1 ou homologue fréquénine de Mus musculus (souris), AL447416 décrivant un homologue de NCS-1 de Paracemium, AF020184 décrivant l'ARNm du détecteur du calcium neuronal 1 (NCS-1) de la souris, L27421 décrivant NCS-1(neuron-specific calcium sensor-1) de rat, L33680 décrivant la protéine de liaison au calcium neuronal (NCS-1) de Caenorhabditis elegans et L27420 décrivant un détecteur du calcium neuronal (NCS-1) aviaire (Gallus gallus) et les références citées en notes. Afin d'éviter toute confusion, il convient de remarquer que NCS-1 désigne la protéine de mammifère, la fréquénine désignant la protéine de drosophile, mais en fait NCS-1 = fréquénine et fréquénine = NCS-1.

Comme mentionné ci-dessus, la présente invention a pour la première fois pu établir un rôle fonctionnel de NCS-1 pour le phénotype d'un organisme vivant en utilisant le système de modèle C. elegans. Sur un gradient de température radial, les vers de C. elegans migrent, après conditionnement avec de la nourriture,

vers leur température de culture et se déplacent le long de cet isotherme. Ce comportement dépendant de l'expérience est appelé traçage isotherme (TI). Des expériences réalisées conformément à la présente invention montrent de manière étonnante que NCS- 1(neuron-specific calcium sensor-1), une protéine hautement conservée au cours de l'évolution, est essentiel à l'obtention d'un comportement TI optimal.

Des animaux à inactivation génique, ncs-1, (NCS-1 knock-out animais) montrent des défauts majeurs de comportement de TI, bien que leurs comportements d'évitement chimiotactique, locomoteur et thermique soient normaux. Le phénotype présentant une inactivation de gène peut être "rattrapé" en réintroduisant le NCS-1 de type sauvage dans l'interneurone AIY, un composant clé du réseau de thermotaxie. Une certaine forme de perte de fonction de NCS-1 incapable de se lier au calcium ne restaure pas le comportement TI, alors qu'une surexpression de NCS-1 augmente les niveaux de performance du comportement TI, accélère l'apprentissage (acquisition plus rapide) et génère une mémoire d'extinction plus lente. Par conséquent, un échange de signaux de calcium adéquat par l'intermédiaire du détecteur du calcium neuronal NCS-1 définit une nouvelle voie essentielle à l'apprentissage associatif et à la mémoire. Dans une autre série d'expériences, un modèle vertébré d'apprentissage associatif et de mémoire avec deux lignées de souris transgéniques a été étudié, Tg26 et Tg200, surexprimant différentes quantités de NCS-1 dans des régions distinctes du cerveau. Lorsqu'elles sont comparées à des témoins WT, les deux lignées présentent une augmentation sensible de la potentialisation à long terme (PLT) dans la région CA1 hippocampique qui est en

nette corrélation avec la quantité de NCS-1. Une surexpression de NCS-1 dans les neurones moteurs se traduit par une fatigue synaptique plus forte et plus rapide, une observation compatible avec une stimulation présynaptique de la libération de neurotransmetteur par le NCS-1. Au niveau comportemental, une surexpression de NCS-1 chez Tg26 produit de meilleurs résultats en matière d'apprentissage et de mémoire dans le labyrinthe piscine de Morris et les tâches actives d'évitement. Prises ensemble, ces données indiquent qu'un échange de signaux calcium par l'intermédiaire de NCS-1 (une protéine identique parmi les vertébrés) régule une voie essentielle aux processus d'apprentissage et de mémoire tant chez les invertébrés que chez les vertébrés. Ces découvertes impliquent aussi que le NCS-1 ou des composés aptes à moduler l'activité de NCS-1 peuvent être utilisés pour le traitement de troubles du SNC, notamment ceux qui présentent des phénotypes associés à un comportement altéré et une perte de mémoire. Par conséquent, la présente invention propose l'utilisation de NCS-1 et de composés aptes à moduler l'activité ou la quantité de NCS-1 actif pour améliorer des troubles du SNC qui sont associés au défaut du gène de NCS-1 ou de son produit génique. De plus, de tels composés peuvent être utilisés pour le traitement de symptômes de troubles du SNC qui sont provoqués par des gènes mutants autres que NCS-1 et/ou provoqués par l'exposition à certaines conditions environnementales, par exemple le stress, la pollution, la chaleur, l'empoisonnement (intoxication), la pharmacodépendance, le tabac et analogues. De plus, on s'attend à ce que des troubles résultant de processus du vieillissement, tels qu'une perte de mémoire, soient traités de manière efficace avec des

composés aptes à moduler l'activité de NCS-1 ou en augmentant la quantité de la protéine active NCS-1. Le procédé de la présente invention aidera à identifier et à obtenir de tels composés qui sont des candidats médicaments pour le traitement des troubles mentionnés.

Des exemples importants de ces troubles sont la schizophrénie, la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la dépression majeure, le trouble bipolaire, les troubles de l'anxiété, les troubles de l'appétit, les troubles du sommeil, l'insomnie, les troubles du déficit d'attention avec hyperactivité, la pharmacodépendance, et d'autres.

La présente invention concerne donc l'utilisation d'un agoniste/activateur ou d'un antagoniste/inhibiteur de NCS-1(neuron-specific calcium sensor-1) ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci pour la préparation d'une composition destinée au traitement d'un trouble du SNC ou pour améliorer la cognition d'un sujet. De préférence, ledit trouble du SNC est la schizophrénie, la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson ou l'hyperactivité.

Les termes "antagoniste/inhibiteur et agoniste/activateur" conformément à la présente invention comprennent des agents chimiques qui modulent l'action de NCS-1, soit par le biais d'une altération de son activité enzymatique, soit par le biais d'une modulation de l'expression, par exemple en exerçant une influence sur la transcription ou sur la traduction.

Dans certains cas, l'antagoniste/inhibiteur ou l'agoniste/activateur peut être aussi une molécule de liaison à un ligand ou un substrat.

Le terme "activateur", tel qu'il est utilisé dans la présente, comprend tant les substances nécessaires pour que le NCS-1 devienne actif en premier lieu, que

les substances qui accentuent simplement son activité.

Le terme "inhibiteur" comprend tant les substances qui diminuent l'activité de NCS-1 que celles qui l'inhibent complètement. Lorsque plus qu'une seule activité possible est définie pour le NCS-1, par exemple la liaison au calcium, l'augmentation de la potentialisation à long terme dans l'hippocampe, la facilitation de la libération de transmetteurs et/ou n'importe quelle autre activité décrite dans la section d'arrière-plan ci-dessus, l'inhibiteur ou l'activateur peut moduler l'une quelconque ou la totalité des activités de NCS-1. Un "antagoniste" ou un "agoniste" qui module l'activité de NCS-1 et déclenche par exemple une réponse dans une analyse sur une base cellulaire décrite ci-dessous, désigne un composé qui altère directement ou indirectement le NCS-1 d'activité ou la quantité de NCS-1 actif. Classiquement, l'effet d'un antagoniste s'observe sous la forme d'un blocage de l'activation de l'échange de signaux de calcium induite par un agoniste. Les antagonistes comprennent les antagonistes tant compétitifs (de compétition) que non compétitifs. Un antagoniste compétitif (ou agent bloquant compétitif) entre en interaction avec ou à proximité du site spécifique à la liaison d'agoniste.

Un antagoniste non compétitif ou agent bloquant inactive la fonction de NCS-1 par interaction avec un site autre que celui de l'interaction avec l'agoniste.

De préférence, l'antagoniste/inhibiteur et agoniste/activateur de NCS-1 sont de petits agents chimiques qui entrent directement en interaction avec le NCS-1. Il y aura donc de préférence une relation directe entre la quantité molaire de composé nécessaire pour inhiber ou stimuler l'activité de NCS-1 et la

quantité molaire de NCS-1 présente ou manquante dans la cellule.

Les activateurs et les inhibiteurs peuvent être conçus par modélisation informatisée assistée par la structure, par exemple selon l'hélice alpha et les régions formant l'hélice alpha ("régions alpha"), le feuillet bêta et les régions formant le feuillet bêta ("régions bêta"), l'enroulement et les régions formant le tour ("régions tour"), la spirale et les régions formant la spirale ("régions spirale"), les régions hydrophiles, les régions hydrophobes, les régions amphipathiques alpha, les régions amphipathiques bêta, les régions souples, les régions formant surface, les régions de liaison à un substrat et les régions d'indice antigénique élevé. De telles régions préférées comprennent les régions de Garnier-Robson de type régions alpha, régions bêta, régions tour et régions spirale, les régions Chou-Fasman de type régions alpha, régions bêta et régions tour, les régions de KyteDoolittle de type régions hydrophiles et régions hydrophobes, les régions amphipathiques alpha et bêta d'Eisenberg, les régions souples de Karplus-Schulz, les régions formant surface d'Emini et les régions d'indice antigénique élevé de Jameson-Wolf. Des prédictions informatisées peuvent être faites en utilisant par exemple le logiciel GCG dérivé de HGMP resource center Cambridge (Rice, 1995) Programme Manual for the EGCG package (Cambridge, CB10 1RQ, Angleterre : Hinxton Hall).

Dans un mode de réalisation de la composition pharmaceutique et de l'utilisation de la présente invention, l'agoniste/activateur est ou est dérivé d'un polypeptide de NCS-1, d'un anticorps anti-NCS-1, d'un régulateur de transcription du gène ncs-1, d'une

molécule de liaison à un ligand, d'une substance mimétique du calcium ou d'un dérivé d'un activateur de la calmoduline.

En utilisant des procédés connus de technologie d'ADN recombiné et de génie génétique des protéines, des variants peuvent être générés afin d'améliorer ou d'altérer les caractéristiques des polypeptides de NCS-1. Par exemple, un ou plusieurs acides aminés peuvent être délétés de l'extrémité N ou de l'extrémité C de la protéine sans perte sensible de la fonction biologique.

Les auteurs de Ron, J. Biol. Chem. 268 (1993), 2984- 2988, ont fait état de protéines KGF variantes ayant une activité de liaison à l'héparine même après délétion de 3,8 ou 27 résidus acides aminés aminoterminaux. De manière similaire, l'interféron gamma a fait preuve d'une activité jusqu'à dix fois supérieure suite à la délétion de 8 à 10 résidus acides aminés de l'extrémité carboxy de cette protéine. (Dobeli, J.

Biotechnology 7 (1988), 199-216).

De plus, de nombreux arguments démontrent que des variants conservent souvent une activité biologique similaire à celle de la protéine naturelle. Par exemple, Gayle et ses collaborateurs (J. Biol. Chem.

268 (1993) ; 22105-22111) ont mené une vaste analyse de mutation sur la cytokine humaine IL la. Ils ont utilisé la mutagenèse aléatoire pour générer plus de 3. 500 mutants de IL la individuels qui présentaient en moyenne 2,5 variations au niveau d'acides aminés par variant sur toute la longueur de la molécule. De multiples mutations ont été examinées au niveau de chaque position d'acide aminé possible. Les chercheurs ont découvert que "[la plus grande partie de la molécule pouvait être altérée avec peu d'effet sur l'activité soit de liaison, soit biologique]" ;

Abrégé. En fait, seules 23 séquences d'acides aminés uniques sur un total de plus de 3. 500 séquences de nucléotides examinées ont produit une protéine dont l'activité différait sensiblement de celle du type sauvage. De plus, en utilisant le programme PESTFIND (Rogers, Science 234 (1986), 364-368), des séquences PEST (riches en proline, acide glutamique, sérine et thréonine) peuvent être identifiées, qui sont présentes de manière caractéristiques dans des protéines instables. De telles séquences peut être éliminées des protéines NCS-1 afin d'augmenter la stabilité et, éventuellement l'activité de ces protéines. Des procédés pour introduire de telles modifications dans les molécules d'acides nucléiques selon l'invention sont bien connues de l'homme du métier.

Par conséquent, la présente invention comprend l'utilisation de variants de polypeptides de NCS-1 qui font preuve d'une activité biologique importante. De tels variants comprennent des délétions, des insertions, des inversions, des répétitions et des substitutions sélectionnées conformément aux règles générales connues de l'homme du métier pour avoir peu d'effet sur l'activité. Par exemple, des conseils concernant la façon de faire des substitutions d'acides aminés phénotypiquement silencieuses sont donnés dans Bowie, Science 247 (1990), 1306-1310, où les auteurs indiquent qu'il existe deux stratégies principales pour étudier la tolérance d'une séquence d'acides aminés au changement.

Outre la substitution d'acides aminés conservative, des variants de NCS-1 comprennent (i) des substitutions avec un ou plusieurs des résidus acides aminés non conservés, les résidus d'acides aminés substitués pouvant être ou ne pas être du type encodé

par le code génétique, ou (ii) une substitution, avec un ou plusieurs des résidus acides aminés ayant un groupe substituant, ou (iii) la fusion du polypeptide mature avec un autre composé, tel qu'un composé destiné à augmenter la stabilité et/ou la solubilité du polypeptide (par exemple, du polyéthylène glycol), ou (iv) la fusion du polypeptide avec des acides aminés additionnels, par exemple un peptide à région de fusion Fc IgG, ou une séquence leader ou secrétaire ("remorque"), ou une séquence facilitant la purification. On considère que de tels polypeptides variants entrent dans les compétences de l'homme du métier d'après les enseignements contenus dans la présente.

Par exemple, des variants de polypeptides de NCS-1 contenant des substitutions de type acide aminé d'acides aminés chargés par d'autres acides aminés chargés ou neutres peuvent produire des protéines dotées de meilleures caractéristiques, moins d'agrégation par exemple. Une agrégation de formulations pharmaceutiques se traduit à la fois par une diminution d'activité et une augmentation de la clairance du fait de l'activité immunogène des agrégats ; voir, par exemple, Pinckard, Clin. Exp.

Immunol. 2 (1967), 331-340 ; Robbins,Diabetes 36 (1987), 838-845 ; Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10 (1993), 307-377.

Un anticorps anti-NCS-1 à utiliser conformément aux compositions pharmaceutiques de la présente invention peut être un anticorps monoclonal, un anticorps polyclonal, un anticorps à une seule chaîne, un anticorps humain ou humanisé, primatisé, xénogénique, chimérisé ou un fragment de ceux-ci qui se lie de manière spécifique à un peptide ou polypeptide

de NCS-1 et comprenant aussi anticorps bispécifique, anticorps de synthèse, fragment d'anticorps, tels que les fragments Fab, Fv ou scFv, etc., ou un dérivé chimiquement modifié de l'un quelconque de ceux-ci. La méthodologie générale pour produire des anticorps est bien connue et a été décrite, par exemple dans Kôhler et Milstein, Nature 256 (1975), 494, et réexaminée dans J. G.R. Hurrel, éd., "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications", CRC Press Inc., Boco Raron, FL (1982), ainsi qu'enseignée par L. T. Mimms et al., Virology 176 (1990), 604-619. De plus, des anticorps ou des fragments de ceux-ci dirigés contre les peptides susmentionnés peuvent être obtenus en utilisant des procédés qui sont décrits, par exemple dans Harlow et Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988.

D'autres sources pour la structure de base d'activateurs ou d'inhibiteurs peuvent être utilisées et comprennent, par exemple, des analogues mimétiques du polypeptide de NCS-1. Des analogues mimétiques du polypeptide de NCS-1 ou des fragments biologiquement actifs de ceux-ci peuvent être générés, par exemple en substituant les acides aminés dont on s'attend à ce qu'ils soient essentiels à l'activité biologique avec, par ex, des stéréo-isomères, c'est-à-dire des acides aminés D ; par exemple, Tsukida, J. Med. Chem. 40 (1997), 3534-3541. En outre, si des fragments sont utilisés pour la conception d'analogues biologiquement actifs, des composants pro-mimétiques peuvent être incorporés dans un peptide pour rétablir au moins une certaine partie des propriétés conformationnelles qui peuvent avoir été perdues lors de l'élimination d'une partie du polypeptide d'origine ; voir, par exemple, Nachman, Regul. Pept. 57 (1995), 359-370. De plus, le

polypeptide NCS-1 peut être utilisé pour identifier des substances mimétiques de peptide chimique de synthèse qui se lient à ou peuvent agir comme un ligand, un substrat, un partenaire de liaison ou le récepteur du polypeptide NCS-1 de manière aussi efficace que le fait le polypeptide naturel ; voir, par exemple, Engleman, J. Clin. Invest. 99 (1997), 2284-2292. Par exemple, des simulations de pliage et une re-conception informatisée des motifs structuraux de la protéine de l'invention peuvent être réalisés en utilisant des programmes informatiques appropriés (Olszewski, Proteins 25 (1996), 286-299 ; Hoffman,Comput. Appl. Biosci. 11 (1995), 675-679). Une modélisation informatisée du pliage de la protéine peut être utilisée pour l'analyse conformationnelle et énergétique de modèles détaillés de peptides et de protéines (Monje,; J. Mol. Biol. 247 (1995), 995-1012 ; Renouf,Adv. Exp. Med. Biol. 376 (1995), 37-45). En particulier, les programmes appropriés peuvent être utilisés pour l'identification de sites interactifs du polypeptide de NCS-1 et de son ligand ou d'autres protéines d'interaction par des recherches auxiliaires sur ordinateur pour des séquences peptidiques complémentaires (Fassina, Immunomethods 5 (1994), 114-120). D'autres systèmes informatiques appropriés à la conception de protéine et de peptides sont décrits dans la technique antérieure, par exemple dans Berry, Biochem. Soc. Trans. 22 (1994), 1033-1036 ; Wodak, Ann. N.Y. Acad. Sci. 501 (1987), 1- 13 ; Pabo, Biochemistry 25 (1986), 5987-5991. Des procédés pour la génération et l'utilisation de banques combinatoires peptidomimétiques sont décrits dans la technique antérieure, par exemple dans Ostresh, Methods in Enzymology 267 (1996), 220-234 et Dorner, Bioorg.

Med. Chem. 4 (1996), 709-715. De plus, une structure à

trois dimensions et/ou cristallographique de la protéine NCS-1 peut être utilisée pour la conception d'inhibiteurs mimétiques inhibiteurs de l'activité biologique de la protéine de l'invention (Rose, Biochemistry 35 (1996), 12933-12944 ; Bioorg.

Med. Chem. 4 (1996), 1545-1558).

La conception sur la base de la structure et la synthèse de molécules de synthèse de faible masse moléculaire qui simulent l'activité du polypeptide biologique natif sont en outre décrits, par exemple dans Dowd, Nature Biotechnol. 16 (1998), 190-195 ; Kieber-Emmons, Current Opinion Biotechnol. 8 (1997), 435-441 ; Moore, Proc. West Pharmacol. Soc. 40 (1997), 115-119 ; Mathews, Proc. West Pharmacol. Soc. 40 (1997), 121-125 ; European J. Biochem. 254 (1998), 433-438.

Il est également notoirement connu de l'homme du métier qu'il est possible de concevoir, synthétiser et évaluer des substances mimétiques de petits composés organiques qui, par exemple, peuvent agir comme un substrat ou un ligand au polypeptide NCS-1. Il a par exemple été décrit que des substances mimétiques Dglucose d'hapalosine présentaient une efficacité similaire à celle de l'hapalosine à produire des effets antagonistes sur la protéine associée à l'aide à la résistance à l'action de plusieurs médicaments en matière de cytotoxicité ; Dinh, J. Med. Chem. 41 (1998), 981-987.

Les polynucléotides codant pour le NCS-1 peuvent également servir de cible destinée à des activateurs et à des inhibiteurs. Les activateurs peuvent comprendre, par exemple, des protéines qui se lient à l'ARNm d'un gène codant pour un polypeptide de NCS-1, en stabilisant de cette manière la conformation native de

l'ARNm et en facilitant la transcription et/ou la traduction, par exemple de manière similaire à l'action de la protéine Tat sur l'ARN du VIH. Sont en outre décrits dans les publications des procédés permettant d'identifier des molécules d'acides nucléiques telles qu'un fragment d'ARN simulant la structure d'une molécule d'ARN cible, définie ou non, où un composé se lie à l'intérieur d'une cellule, conduisant à un retard de croissance cellulaire ou à la mort de la cellule ; voir, par exemple, WO 98/18947 et les références qui y sont citées. Ces molécules d'acides nucléiques peuvent être utilisées pour identifier des composés inconnus d'intérêt pharmaceutique et/ou agricole et pour identifier des cibles ARN inconnues pour une utilisation dans le traitement d'une maladie. En variante, par exemple, la structure conformationnelle du fragment d'ARN qui simule le site de liaison peut être utilisée dans la conception de médicaments rationnels pour modifier des ligands connus afin qu'ils se lient avec davantage de ferveur à la cible. Une telle méthodologie est la résonance magnétique nucléaire (RMN), qui est utile pour identifier des structures conformationnelles d'ARN et médicaments.

D'autres procédés encore sont, par exemple, les procédés de conception de médicaments tels que décrits dans WO 95/35367, US-A-5 322 933, où la structure cristalline du fragment d'ARN peut être déduite et des programmes informatiques sont utilisés pour concevoir de nouveaux composés de liaison qui peuvent agir comme des antibiotiques.

Certaines modifications génétiques conduisent à des états conformationnels protidiques altérés. Par exemple, certaines protéines NCS-1 mutantes peuvent posséder une structure tertiaire qui les rend beaucoup

moins aptes à faciliter la transmission des signaux calcium. La restauration de la conformation normale ou régulée de protéines mutées est le moyen le plus élégant et le plus spécifique pour corriger ces défauts moléculaires, bien que ce puisse être difficile.

Particulièrement intéressants à ce propos sont les domaines suivants de NCS-1 : les 3 sites fonctionnels de liaison au calcium appelés "EF-hands" (EF) aux positions d'acides aminés 73-84 (EF-2), 109-120 (EF3), 157-168 (EF4) et les positions ou séquences d'acides aminés environnantes entrant en interaction avec le site de liaison au calcium. Par ailleurs, le premier site de liaison au calcium (EF1) en position 36-47 pourrait contribuer à la liaison au calcium ou réguler la fonction de NCS-1. Finalement, l'extrémité N (c'est- à-dire les acides aminés 1-8) peut servir de site de myristoylation et pourrait fournir une fonction régulatrice de NCS-1. Des manipulations pharmacologiques peuvent donc avoir pour but de restaurer la conformation de type sauvage de la protéine NCS-1. La présente invention utilise donc aussi des molécules qui sont aptes à activer le type sauvage, c'est-à-dire la fonction "NCS-1" ou "anti-NCS-1" d'une protéine NCS-1.

Des molécules antisens, des polynucléotides de NCS-1 recombinants, des vecteurs incorporant de tels polynucléotides ou molécules anti-sens peuvent être produits au moyen de procédés connus de l'homme du métier spécialisé en biologie moléculaire. Par exemple, le choix de vecteurs qui dépendrait de la fonction souhaitée et comprennent plasmides, cosmides, virus, bactériophages et d'autres vecteurs traditionnellement utilisés en génie génétique. Des procédés qui sont notoirement connus de l'homme du métier peuvent être

utilisés pour construire divers plasmides et vecteurs ; voir, par exemple, les techniques décrites dans Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N. Y. et Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates ans Wiley Interscience, N.Y.

(1989), (1994). En variante, les polynucléotides et vecteurs peuvent être reconstitués dans des liposomes pour une délivrance à des cellules cible. Des séquences utiles peuvent être transférées dans des vecteurs d'expression là où l'expression d'un polypeptide particulier est requise. Des vecteurs de clonage types comprennent pBscpt sk, pGEM, pUC9, pBR322 et pGBT9. Des vecteurs d'expression types comprennent pTRE, pCAL-nEK, pESP-1, pOP13CAT, pET, pGEX, pMALC, pPIC9, pBac.

Dans un autre mode de réalisation de la composition pharmaceutique et l'utilisation de la présente invention, l'antagoniste/inhibiteur est ou est dérivé d'un polypeptide de NCS-1, d'un anticorps anti-NCS-1, d'une molécule d'acide nucléique antisens de ncs-1, d'une molécule de liaison à un ligand, d'un chélateur du calcium ou d'un inhibiteur de la calmoduline. De préférence, ledit antagoniste/inhibiteur parasite l'action de liaison au calcium de NCS-1 ou modifie la conformation/fonction de NCS-1.

Les anticorps, molécules d'acides nucléiques, inhibiteurs et activateurs utilisés dans les compositions de la présente invention ont, de préférence, une spécificité au moins sensiblement identique à la spécificité de liaison du partenaire de liaison ou ligand naturel de la protéine NCS-1, notamment si une stimulation de NCS-1 est souhaitée. Un anticorps ou un inhibiteur peut avoir une affinité de liaison à la protéine NCS-1 d'au moins 105 M-1, de

préférence supérieure à 107 M-1 et, de manière avantageuse, jusqu'à 1010 M-1 si une suppression de NCS-1 doit être exercée par cet intermédiaire. Dans un mode de réalisation préféré, un anticorps ou un inhibiteur suppressif a une affinité d'au moins 10-7 M environ, de préférence d'au moins 10-9 M environ et, de manière très préférentielle, d'au moins 10-11 M environ ; et un activateur stimulant le NCS-1 a une affinité inférieure à 10-7 M environ, de préférence inférieure à 10-6 M environ et, de manière très préférentielle, de l'ordre de 10-5 M. Dans le cas de molécules d'acides nucléiques antisens, on préfère qu'elles aient une affinité de liaison à celles encodant la protéine NCS-1 qui représente au plus 2,5 ou 10 fois moins qu'un complément exact de 20 nucléotides consécutifs de la séquence codante.

De préférence, l'agoniste/activateur et l'antagoniste/inhibiteur ne sont pas plus grands que la "paroi de biodisponibilité" de 500-600 Da afin qu'ils puissent traverser la membrane cellulaire lipophile pour pénétrer dans la cellule. Par contre, en protéinothérapie, il a récemment été mis en évidence que des enzymes fusionnées à une partie d'une protéine du virus VIH peuvent traverser les membranes cellulaires tout en conservant leur activité enzymatique in vivo chez des souris (Schwarze, Science 285 (1999), 1569-1572). On sait depuis approximativement dix ans que la protéine régulatrice transactivante (protéine TAT) du virus VIH possède une aptitude inhabituelle à traverser les membranes cellulaires sans utiliser de récepteurs ou de transporteurs, ou nécessiter de l'ATP (Green et Loewenstein, Cell 55 (1988), 1179-1188). Bien que son mécanisme exact ne soit pas connu, on a montré que le

domaine de transduction protidique (PTD) de TAT ouvre une "brèche" dans la bicouche lipidique de la membrane cellulaire, en y poussant au travers tout ce qui lié par covalence, avant de la refermer à nouveau. Il s'agit d'un procédé spécifique qui sinon n'endommage par la cellule. Par conséquent, une protéine NCS-1 fonctionnelle, un anticorps anti-NCS-1 ou d'autres composés peuvent être couplés au PTD par l'intermédiaire d'un lieur afin qu'ils puissent traverser la membrane cellulaire ; vois aussi pour rappel DDT 4 (1999), 537.

Dans un autre aspect, la présente invention concerne un procédé sur une base cellulaire pour identifier et obtenir un candidat médicament destiné au traitement d'un trouble du SNC ou à améliorer la cognition d'un sujet, ledit procédé comprenant les étapes qui consistent à : (a) cribler une cellule, un tissu ou un animal non humain avec un composé à cribler dans des conditions permettant l'activité de NCS-1(neuron-specific calcium sensor-1) ; et (b) déterminer l'activité de NCS-1 de ladite cellule, dudit tissu ou dudit animal non humain traité, une différence d'activité de NCS-1 par rapport à une cellule, un tissu ou un animal témoin correspondant étant indicatrice d'un candidat médicamenteux ; et éventuellement (c) obtenir le candidat médicamenteux déterminé comme modifiant l'activité de NCS-1 à l'étape (b).

La quantité de temps nécessaire au contact cellulaire avec le composé est déterminée de manière empirique, par exemple en exécutant une évolution avec un modulateur connu de NCS-1 et en mesurant les modifications cellulaires en fonction du temps. Les

moyens de mesure de la présente invention peuvent de plus être définis en comparant une cellule qui a été exposée à un composé à une cellule identique qui n'a pas été exposée de la même manière à ce composé. En variante, deux cellules, une cellule contenant de NCS-1 fonctionnel et une seconde cellule identique à la première, mais manquant de NCS-1 fonctionnel ; pourraient être toutes deux mises en contact avec le même composé, puis comparées pour évaluer les différences entre ces deux cellules. Cette technique est également utile pour établir le bruit de fond de ces analyses. Un homme du métier sur la base de ces connaissances générales notera que ces mécanismes de contrôle permettent aussi de sélectionner facilement des modifications cellulaires qui sont sensibles à une modulation de NCS-1 fonctionnel.

Le terme "cellule" désigne au moins une cellule, mais comprend une pluralité de cellules appropriées à la sensibilité de la méthode de détection. Des cellules appropriées pour la présente invention peuvent être bactériennes, de levure ou, de préférence, eucaryotiques. Les procédés de cette invention emploient certains types de cellules, certaines observations de changements d'aspects de l'état biologique d'une cellule et certaines comparaisons des changements observés. Dans ce qui suit, ces types de cellules, ces observations et ces comparaisons sont décrits en détail à tour de rôle.

La présente invention utilise trois types principaux de cellules : les cellules de type sauvage, les cellules modifiées, c'est-à-dire transgéniques, les cellules exposées à un composé ou médicament. Les cellules de "type sauvage" sont les cellules de référence, ou standard, utilisées dans une application

particulière ou un mode de réalisation particulier des procédés de cette invention. N'étant qu'une cellule de référence, une cellule de type sauvage n'a pas besoin d'être une cellule normalement rencontrée dans la nature, et sera souvent une lignée cellulaire recombinante ou génétiquement modifiée. Généralement, les cellules sont cultivées in vitro sous la forme d'une lignée cellulaire ou souche. D'autres types de cellules utilisées dans la mise en #uvre spécifique de la présente invention sont de préférence dérivées des cellules de type sauvage. De manière moins préférentielle, d'autres types de cellules sont dérivées de cellules sensiblement isogéniques avec les cellules de type sauvage. Par exemple, des cellules de type sauvage pourraient être une lignée cellulaire particulière de la levure Saccharomyces cerevisiae, ou une lignée de cellules particulière de mammifère (par exemple, des cellules HeLa). Même si, par souci de simplification, il est souvent fait référence dans cette description à des cellules uniques (par exemple, "cribler une cellule") l'homme du métier comprendra que, le plus souvent, une étape particulière quelconque de l'invention sera réalisée en utilisant une pluralité de cellules génétiquement identiques, par exemple d'une lignée cellulaire cultivée. Deux cellules sont dites "sensiblement isogéniques" lorsque les génomes exprimés de celles-ci diffèrent de par une quantité connue qui équivaut de préférence à moins de 10 % des loci génétiques, de manière plus préférentielle à moins de 1 % ou, de manière encore plus préférentielle, à moins de 0,1 %. En variante, deux cellules peuvent être considérées comme étant sensiblement isogéniques lorsque les parties des génomes de celles-ci pertinentes aux effets d'un médicament d'intérêt

diffèrent de par les quantités précédentes. Il est en outre préférable que les loci de différence soient individuellement connus. Les cellules "exposées à un composé ou médicament" sont, en bref, soit des cellules de type sauvage, soit des cellules modifiées qui ont été exposées à un ou des composés d'intérêt, par exemple un ou des candidats médicaments.

Les "cellules modifiées" sont dérivées de cellules de type sauvage par le biais de modifications apportées à un constituant cellulaire spécifique. Des procédés de modification sont adaptables à cette invention s'ils altèrent, en augmentant ou en diminuant, de préférence un seul constituant cellulaire ciblé uniquement ou, de manière moins préférentielle, au plus seulement quelques constituants cellulaires ciblés (par exemple, de 2 à 5 constituants cellulaires), qui influencent l'aspect de l'état biologique d'une cellule mesuré dans un mode de réalisation de cette invention. Des procédés de modification préférables sont aptes à cibler individuellement et à altérer de nombreux constituants cellulaires mesurés pertinents à l'égard d'un aspect de l'état biologique et sont, de manière très préférentielle, aptes à cibler et altérer une fraction importante de tels constituants cellulaires. Par exemple, des procédés de modification préférables sont aptes à cibler et altérer par exemple une fraction importante de tous les gènes, protéines, ou activités de protéine dans une cellule, ou au moins une fraction importante des constituants qui sont pertinents pour caractériser les effets d'un médicament d'intérêt.

Normalement, la cellule modifiée sera une cellule transgénique.

Les cellules décrites ci-dessus peuvent également être comprises dans un tissu ou un organisme, c'est-à-

dire un animal non humain. Des procédés généraux pour le criblage de composés qui ont un effet souhaité sur une cellule ou un organisme comme mesuré dans une analyse spécifique sont décrits dans la technique antérieure ; voir, par exemple, US-A-6 165 709 et les références qui y sont citées.

On peut trouver des cellules, des animaux non humains et des systèmes d'inactivation de gène spécifique et/ou d'expression de NCS-1 dans la technique antérieure et les adapter au procédé de la présente invention ; voir, par exemple, les documents cités dans la section d'arrière-plan.

Les procédés d'analyse pour déterminer la modulation du NSC-1 par un composé peuvent être au format laboratoire classique ou adapté à un haut débit.

L'expression "haut débit" désigne un type d'analyse qui permet de réaliser facilement et simultanément l'analyse d'échantillons multiples, et une capacité de manipulation robotisée. Une autre caractéristique souhaitée des analyses à haut débit est un type d'analyse optimisé afin de diminuer l'usage de réactifs ou de minimiser le nombre des manipulations pour parvenir à l'analyse souhaitée. Des exemples de formats d'analyse comprennent des plaques à 96 puits, 384 puits ou plus, des gouttelettes en lévitation et des puces à micro-canaux de type "lab on a chip" (laboratoire sur puce) utilisées pour des expériences impliquant des manipulations liquides. L'homme du métier sait bien, comme les progrès en matière de miniaturisation des moules en plastiques et des dispositifs de manipulation liquide ou la mise au point de dispositifs d'analyse s'améliorent, que des nombres plus importants d'échantillons peuvent être réalisés en utilisant le modèle de la présente invention.

Les changements cellulaires appropriés pour le procédé de la présente invention comprennent de mesurer directement les variations qui interviennent au niveau de la fonction ou de la quantité de NCS-1, ou de mesurer les effets de la fonction de NCS-1 en aval, par exemple en mesurant des concentrations de messagers secondaires ou les variations au niveau de la transcription ou par des variations des taux de protéines de gènes qui sont transcriptionnellement influencés par le NCS-1, ou en mesurant les changements phénotypiques dans la cellule. Des moyens de mesure préférés comprennent les variations de la quantité de protéine NCS-1, les variations de l'activité fonctionnelle de NCS-1, les variations de la quantité d'ARNm, les variations de protéine intracellulaire, les variations de protéine de surface cellulaire, ou protéine sécrétée, ou les variations de concentration de Ca2+, d'AMPc ou de GTP. Des variations de la quantité ou de l'activité fonctionnelle de NCS-1 sont décrites dans la présente description. Ladite activité fonctionnelle est de préférence la liaison au calcium.

Les variations de concentrations d'ARNm sont détectées par transcription inverse - amplification en chaîne par polymérase (RT-PCR), par expression génique différentielle ou par micro-réseaux. L'immunoaffinité, l'affinité à des ligands ou une mesure enzymatique permet de quantifier les variations de taux de protéine dans des cellules hôtes. Des billes d'affinité spécifique à une protéine ou des anticorps spécifiques sont utilisés pour isoler, par exemple, une protéine non marquée ou marquée avec de la 35S-méthionine. Une protéine marquée est analysée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS (SDS-PAGE).

Une protéine non marquée est détectée par un transfert

du type Western blot, détection de surface cellulaire par triage cellulaire fluorescent, analyse d'images de cellules, ELISA ou RIA (dosage radioimmunologique) utilisant des anticorps spécifiques. Lorsque la protéine est une enzyme, l'induction de protéine est contrôlée par clivage d'un substrat fluorimétrique ou colorimétrique.

Lorsque le gène endogène code pour une protéine intracellulaire soluble, les variations au niveau du gène endogène peuvent être mesurées par des changements de la protéine spécifique contenue dans le lysat de cellules. La protéine soluble peut être mesurée par les procédés décrits dans la présente description.

La présente invention a également pour objet des procédés de criblage permettant de sélectionner des composés qui modulent l'expression de l'ADN ou de l'ARN codant pour le NCS-1 ainsi que la fonction de la protéine NCS-1 in vivo. Les composés peuvent exercer une modulation en augmentant ou en atténuant l'expression de l'ADN ou de l'ARN codant pour le NCS-1, ou la fonction de la protéine NCS-1. Des composés qui modulent l'expression d'ADN ou d'ARN codant pour le NCS-1 ou la fonction de la protéine NCS-1 peuvent être détectés par diverses méthodes. La méthode peut être un simple test "oui/non" visant à déterminer s'il y a un changement d'expression ou de fonction. La méthode peut être quantitative, comparant l'expression ou la fonction d'un échantillon d'essai avec les taux d'expression ou de fonction d'un échantillon standard.

Des modulateurs identifiés dans ce procédé sont utiles en tant qu'agents thérapeutiques.

Les procédés décrits ci-dessus peuvent, bien sûr, être associés à une ou plusieurs étapes de l'un quelconque des procédés de criblage décrits ci-dessus

ou d'autres procédés de criblage connus de l'homme du métier. Des procédés permettant de découvrir des composés cliniques comprennent pas exemple un criblage à très haut débit (Sundberg, Curr. Opin. Biotechnol. 11 (2000), 47-53) pour identifier des composés chef de file, une conception de médicament sur la base de la structure (Verlinde et Hol, Structure 2 (1994), 577- 587) et la chimie combinatoire (Salemme et al., Structure 15 (1997), 319-324) pour une optimisation de composés chef de file.

Une fois qu'un médicament a été sélectionné, le procédé peut comporter l'étape supplémentaire de répéter le procédé utilisé pour réaliser une conception de médicament rationnelle avec le médicament modifié et pour évaluer si ledit médicament modifié fait preuve d'une meilleure affinité par exemple conformément à une analyse d'interaction/énergie.

Dans un mode de réalisation préféré du procédé de la présente invention, ladite cellule, ledit tissu ou ledit animal non humain est une cellule, un tissu ou un animal non humain qui est transgénique et qui présente un taux d'activité de NCS-1(neuron-specific calcium sensor-1) qui est sensiblement diminué ou augmenté par rapport à une cellule, un tissu ou un animal non humain de type sauvage.

De préférence, ledit taux d'activité sensiblement diminué ou augmenté de NCS-1 se traduit par une réponse altérée et typique de la cellule, du tissu ou de l'animal non humain transgénique. Un agoniste/activateur ou un antagoniste/inhibiteur seront ensuite identifiés par l'observation de l'aptitude d'un composé candidat, à une certaine concentration, à faire revenir la réponse phénotypique de ladite cellule, dudit tissu ou dudit animal non humain à la normale.

Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, ledit animal non humain transgénique affiche une différence de comportement par rapport à un animal non humain de type sauvage. Conformément à la présente invention, on pourrait montrer de manière étonnante que chez C. elegans, l'activité de NCS-1 est liée au comportement de traçage isotherme (TI) et aussi à des mécanismes de l'apprentissage. Un renforcement par l'intermédiaire d'une acquisition plus rapide conjointement avec des performances finales supérieures conduit, comme on peut s'y attendre, à des mémoires qui sont plus persistantes, et sont donc cohérentes avec une période de rétention plus longue (Milner et al., 1998). Toutefois, si l'extinction est aussi un mécanisme d'apprentissage, les vers de type Tg-ncs-1 ont besoin de davantage de temps pour réagir à l'absence d'une stimulation de conditionnement (c'est- à-dire, la nourriture) qui doit vraisemblablement être en relation avec le niveau de transmission de signaux [Ca2+]i (voir figures 5 et 6).

Les données de perte de fonction et de rattrapage mosaïque obtenues conformément à la présente invention démontrent clairement que la présence et la quantité du détecteur du calcium NCS-1 dans les neurones AIY joue un rôle central en influençant l'apprentissage associatif Ca2±dépendant chez C. elegans, comme démontré par son effet régulateur direct sur le comportement de TI.

On pourrait de plus montrer que la signalisation ou la liaison du calcium par le NCS-1 est déterminante pour cette activité, et que la voie de signalisation de NCS-1 est essentielle à la réalisation d'un comportement de TI. Comme représenté sur le diagramme schématique (Figure 6), le NCS-1 pourrait avoir un rôle

présynaptique au niveau des synapses des interneurones AIY avec AIZ et RIA, ou une fonction postsynaptique au niveau des synapses entre les neurones AFD/AIY.

L'activité présynaptique de NCS-1 est étayée par des données préliminaires indiquant que des taux augmentés de NCS-1 dans l'hippocampe de la souris augmentent la PLT (potentialisation à long terme) par l'intermédiaire d'une facilitation présynaptique. De manière similaire, l'intensification du comportement de TI observée lorsque le NCS-1 est surexprimé (animaux Tg-ncs-1) peut refléter un état où les terminaisons présynaptiques d'AIY sont stimulées de façon maximale. L'observation d'un effet présynaptique lors de la surexpression de NCS-1 au niveau de la jonction neuro-musculaire de souris, de mouches et de grenouilles (Olafsson et al., 1995 ; Rivosecchi et al., 1994) vient étayer cette hypothèse et suggère une fonction conservée pour le NCS-1 au cours de l'évolution.

L'interneurone AIY pourrait probablement servir d'intégrateur des entrées de nourriture et de température sous la forme de signaux Ca2+ fournis par AFD et des cellules environnantes. Ces signaux, détectés par le détecteur du calcium neuronal NCS-1, pourraient être transmis à d'autres cibles en aval, telles que la nucléotide phosphodiestérase cyclique 3':5', la calcineurine, la NO-synthase, les canaux de potassium ou la phosphatidylinositol 4-OH kinase, par l'intermédiaire de mécanismes qui pourraient influencer la force synaptique d'AIY. La signalisation du Ca2+ par l'intermédiaire de NCS-1 définit dont une nouvelle voie pour la régulation de l'efficacité synaptique.

Ensemble, ces souches à NCS-1 augmenté ou déficient thermotactiques fournissent des outils de valeur pour étudier la plasticité synaptique aux

niveaux moléculaires, cellulaires et de réseau en utilisant des animaux vivants, ainsi qu'un modèle qui pourrait aider à comprendre des fonctions conservées, telles que la mémoire à long terme et l'apprentissage associatif dans toutes les espèces.

En outre, les présents exemples ont montré que la surexpression de NCS-1 chez la souris se traduisait par une augmentation dose-dépendante de la PLT hyppocampique et par une stimulation de la libération de neurotransmetteurs présynaptiques au niveau de la jonction neuro-musculaire (NMJ). De plus, la surexpression de NCS-1 dans la lignée Tg26 s'est traduite par une amélioration des performances en matière d'apprentissage, mais est restée sans effets sur les réponses émotionnelles. Il semble que la surexpression de NCS-1, tant chez les invertébrés que chez les vertébrés, facilite les processus d'apprentissage associatif et de mémoire. Ceci est reflété non seulement par le très haut taux de conservation de la structure primaire de NCS-1 au cours de l'évolution, mais révèle aussi qu'une voie commune de transmission des signaux calcium NCS-1-dépendante sert de mécanisme de base pour réguler l'efficacité synaptique dans divers environnements neuronaux. En fait, l'apprentissage associatif et la mémoire chez C. elegans ont besoin de la fonction de NCS-1 et de la transmission des signaux par l'intermédiaire de celuici dans un seul interneurone recevant une seule projection d'un neurone sensitif et projetant à seulement deux autres cellules neuronales, alors que chez la souris, le NCS-1 semble réguler l'efficacité des terminaisons présynaptiques (c'est-à-dire, projections neuronales en CA3 sur neurones en CA1 dans l'hippocampe, ou plaques motrices des neurones moteurs)

qui forment un réseau très dense et très complexe. Il est donc très vraisemblable que la transmission des signaux NCS-1-dépendante sera conservée chez les vertébrés supérieurs, tels que les singes et les hommes. Avec la fourniture de systèmes de délivrance de gènes sûrs et efficaces, il est posé comme postulat que la surexpression de NCS-1 dans l'hippocampe humain pourrait résoudre les déficits de mémoire et d'apprentissage associés à l'âge, ou aux patients souffrant de la maladie d'Alzheimer, ou de maladies du type schizophrénie.

Généralement, ledit animal non humain transgénique présentant un niveau réduit d'activité de NCS-1(neuronspecific calcium sensor-1) comprend au moins un allèle mutant du gène codant pour le NCS-1 ou un allèle transdominant correspondant d'un gène différent. De préférence, ledit animal non humain transgénique est un animal présentant une inactivation génique, ncs-1.

Dans un mode de réalisation particulièrement préféré du procédé de la présente invention, ledit animal non humain transgénique est C. elegans et ledit comportement est un traçage isotherme (TI). Comme décrit ci-dessus et illustré par les exemples, la présente invention propose pour la première fois l'analyse fonctionnelle qui est apte à lier directement l'action moléculaire d'un modulateur de l'activité de NCS-1 à une réponse phénotypique d'un animal d'essai.

Etant donné que C. elegans est bien caractérisé, facile à manipuler et que la condition de culture et d'autres facteurs peuvent être facilement contrôlés, cet animal d'essai se prête particulièrement bien au criblage à haut débit ; voir, par exemple, Link et al., Therapeutic target discovery using C. elegans.

Pharmacogenomics 1 (2000), 203-218.

Dans un autre mode de réalisation particulièrement préféré du procédé de l'invention, ledit animal non humain transgénique est la souris et ledit comportement correspond aux performances d'apprentissage et de mémoire dans le labyrinthe piscine de Morris et à des tâches d'évitement actives ; voir également la section 6. 1.6 de l'exemple 6.

Les composés qui peuvent être testés et identifiés selon un procédé de l'invention peuvent être des banques d'expression, par exemple des banques d'expression d'ADNc, des peptides, des protéines, des acides nucléiques, des anticorps, des petits composés organiques, des hormones, des peptidomimétiques, des APN ou analogues (Milner, Nature Medicine 1 (1995), 879-880 ; Hupp, Cell 83 (1995), 237-245 ; Cell 79 (1994), 193-198 et références citées plus haut). De plus, des gènes codant pour un régulateur généralement admis de la protéine NCS-1 et/ou qui exercent leurs effets en amont ou en aval de la protéine NCS-1 peuvent être identifiés au moyen, par exemple, d'une mutagenèse par insertion en utilisant, par exemple, des vecteurs de ciblage de gènes connus de l'homme du métier. De même, les procédés de l'invention comprennent une mutagenèse ENU et des cribles suppressifs qui pourraient être préformés pour trouver un régulateur de l'hyperfonctionnement, du dysfonctionnement de NCS-1, des cibles ou des voies de signalisation. Lesdits composés peuvent être aussi des dérivés fonctionnels ou analogues de ligands connus, par exemple Ca2+. De tels composés utiles peuvent être aussi, par exemple, des facteurs de transaction qui se lient à la protéine NCS-1 ou des séquences régulatrices du gène de NCS-1.

Les composés isolés au moyen des procédés cidessus peuvent également servir de composés chef de

file pour le développement de composés analogues. Les analogues devraient avoir une configuration électronique et une conformation moléculaire stabilisées permettant que des groupes fonctionnels clé soient présentés à la protéine NCS-1 ou son récepteur sensiblement de la même façon que le composé chef de file. En particulier, les composés analogues ont des propriétés électroniques spatiales qui sont comparables à la région de liaison, mais peuvent être des molécules plus petites que le composé chef de file, ayant fréquemment une masse moléculaire inférieure à environ 2 kD et, de préférence, inférieure à environ 1 kD.

L'identification de composés analogues peut être réalisée par l'intermédiaire de l'utilisation de techniques telles que l'analyse de champ d'autocohérence (SCF), l'analyse des interactions configurationnelles (CI) et l'analyse de dynamique en mode normal. Des programmes informatiques pour mettre ces techniques en #uvre sont disponibles ; par exemple, Rein, Computer-Assisted Modeling of Receptor-Ligand Interactions (Alan Liss, New York, 1989). Des procédés pour la préparation de dérivés chimiques et analogues sont notoirement connus de l'homme du métier et sont décrits, par exemple dans Beilstein, Handbook of Organic Chemistry, Springer edition New York Inc., 175 Fifth Avenue, New York, N. Y. 10010 U.S.A. et Organic Synthesis, Wiley, New York, USA. En outre, lesdits dérivés et analogues peuvent être testés concernant leurs effets selon des procédés connus de l'homme du métier ; voir également les références citées plus haut. De plus, des peptidomimétiques et/ou une conception assistée par ordinateur de dérivés appropriés et analogues peuvent être utilisés, par exemple, conformément au procédé décrit ci-dessus. Des

procédés pour la génération de composés chef de file dans la découverte de médicament comprend aussi d'utiliser des protéines et des procédés de détection tels que la spectrométrie de masse (Cheng et al. J. Am.

Chem. Soc. 117 (1995), 8859-8860) et certains procédés de résonance magnétique nucléaire (RMN) (Fejzo et al., Chem. Biol. 6 (1999), 755-769 ; et al., J. Org.

Chem. 62 (1997), 8930-8931).

Le médicament nouvellement identifié, obtenu par un procédé de la présente invention, c'est-à-dire un antagoniste/inhibiteur ou un agoniste/activateur, peut être utilisé pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement d'un trouble lié à ou à médiation protéine NCS-1. En accord avec ceci, la présente invention concerne également un procédé permettant de produire un médicament, ledit procédé comprenant les étapes de l'un quelconque des procédés décrits ci-dessus ; et (i) la synthèse du candidat médicament identifié à l'étape (b) ou obtenu à l'étape (c) ou d'un analogue ou dérivé de celui-ci en une quantité suffisante pour fournir ledit médicament en une quantité thérapeutiquement efficace à un sujet ; et/ou (ii) la combinaison du candidat médicament identifié à l'étape (b) ou obtenu à l'étape (c) ou d'un analogue ou dérivé de celui-ci avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

Une fois qu'un médicament a été sélectionné conformément à l'un quelconque des procédés de la présente invention décrits ci-dessus, le médicament ou promédicament de celui-ci peut être synthétisé en une quantité thérapeutiquement efficace. Telle qu'on l'utilise dans la présente, l'expression "quantité thérapeutiquement efficace" désigne la quantité totale

du médicament ou du promédicament qui est suffisante pour présenter un effet favorable significatif sur le patient, c'est-à-dire un traitement, un rétablissement, une prévention ou une amélioration d'un état lié à une protéine NCS-1, ou une augmentation de la vitesse de traitement, rétablissement, prévention ou amélioration de tels états. De plus ou en variante, notamment en ce qui concerne l'essai préclinique du médicament, l'expression "quantité thérapeutiquement efficace" comprend la quantité totale du médicament ou du promédicament qui est suffisante pour déclencher une réponse physiologique, de préférence lors de sa liaison à sa cible, la protéine NCS-1, dans un essai sur un animal non humain, de préférence chez C. elegans, ou une analyse chez la souris, tels que décrits dans la présente.

Les médicaments ou promédicaments, après leur administration in vivo, sont métabolisés afin d'être éliminés soit par élimination, soit par le métabolisme en un ou plusieurs métabolites actifs ou inactifs (Meyer, J. Pharmacokinet. Biopharm. 24 (1996), 449- 459). Par conséquent, plutôt que d'utiliser le véritable composé ou médicament identifié et obtenu conformément aux procédés de la présente invention, une formulation correspondante sous forme de promédicament peut être utilisée, celle-ci étant convertie en sa substance active dans le patient. Des mesures de précaution qui peuvent être prises pour l'application de promédicaments ou de médicaments sont décrites dans les publications ; voir, pour rappel, Ozama, J.

Toxicol. Sci. 21 (1996), 323-329.

L'invention concerne en outre un procédé permettant de produire une composition pharmaceutique comprenant un composé tel que décrit ci-dessus, ledit

procédé comprenant les étapes qui consistent à (a) modifier ledit composé identifié au moyen du procédé de l'invention en tant que composé chef de file pour obtenir (i) un site d'action, un spectre d'activité, une spécificité d'organe modifiés et/ou (ii) une meilleure activité et/ou (iii) une toxicité diminuée (meilleur index thérapeutique) et/ou (iv) des effets secondaires diminués et/ou (v) un délai d'action thérapeutique, une durée d'effet modifiés et/ou (vi) des paramètres pharmacocinétiques modifiés (résorption, distribution, métabolime et élimination), et/ou (vii) des paramètres physico-chimiques modifiés (solubilité, hygroscopicité, couleur, goût, odeur, stabilité, état) et/ou (viii) une spécificité générale, une spécificité organe/tissu améliorées et/ou (ix) une forme d'application et une voie d'administration optimisées par (i) estérification de groupes carboxyle ou (ii) estérification de groupes hydroxyle avec des acides de carbone ou (iii) estérification de groupes hydroxyle en, par exemple, phosphates, pyrophosphates ou sulfates ou hémisuccinates ou (iv) formation de sels pharmaceutiquement acceptables ou (v) formation de complexes pharmaceutiquement acceptables ou (vi) synthèse de polymères pharmacologiquement actifs ou (vii) introduction de fragments hydrophiles ou (viii) introduction/échange de substituants sur aromates ou chaînes latérales, changement de modèle de substituant ou (ix) modification par introduction de fragments isostères ou bioisostères ou (x) synthèse de composés homologues ou (xi) introduction de chaînes latérales ramifiées ou (xii) conversion de substituants alkyle en analogues cycliques ou (xiii) dérivatisation de groupe hydroxyle en kétales, acétales ou (xiv) Nacétylation en amides, phénylcarbamates ou

(xv) synthèse de bases de Mannich, imines ou (xvi) transformation de cétones ou aldéhydes en bases de Schiff, oximes, acétales, kétales, énolesters, oxazolidines, thiozolidines ou combinaisons de ceuxci ; et (b) formuler le produit de ladite modification avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

Les diverses étapes énumérées ci-dessus sont généralement connues de l'homme du métier. Elles comprennent ou reposent sur des analyses de la relation quantitative structure-action (QSAR) (Kubinyi, J. Med.

Chem. 41 (1993), 2553-2564, Kubinyi, Pharm. Unserer Zeit 23 (1994), 281-290), une biochimie combinatoire, une chimie classique et autres (voir, par exemple, Holzgrabe et Bechtold, Pharm. Acta Helv. 74 (2000), 149-155).

Comme mentionné ci-dessus, la présente invention propose des analyses appropriées, de préférence des analyses in vivo, pour identifier et obtenir des médicaments aptes à moduler l'activité de NCS-1, en étant ainsi utiles en tant qu'agent thérapeutique pour le traitement de maladies liées à l'activité de NCS-1, telles que des troubles du SNC comprenant la schizophrénie, la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer et d'autres troubles du comportement. La présente invention propose donc des agents thérapeutiques dont le mode d'action diffère de celui des composés utilisés précédemment pour le traitement des troubles mentionnés. En accord avec ceci, la présente invention propose aussi une utilisation pour des composés connus dans la technique, de manière adéquate connus également comme étant aptes à moduler l'activité de NCS-1, mais qui n'ont pas été suggéré pour une utilisation médicale jusqu'à présent du fait du manque de connaissances des réponses phénotypiques

d'un organisme déclenchées par l'activité de NCS-1 ou son manque.

Dans un autre mode de réalisation, la présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant un médicament ou un candidat médicament identifié ou obtenu au moyen du procédé de l'invention ou un racémate, énantiomère, diastéréoisomère, tautomère, mélanges de diastéréoisomères ou sel pharmaceutiquement acceptable de l'un quelconque de ceux-ci, dans laquelle ledit médicament ou candidat médicament est un modulateur de l'activité de NCS-1. De préférence, ledit médicament facilite ou entrave la liaison de NCS-1 au calcium ou change la conformation de NCS-1.

La présente invention concerne également des animaux non humains transgéniques présentant un niveau réduit d'activité de NCS-1(neuron-specific calcium sensor-1), comprenant au moins un allèle mutant du gène codant pour le NCS-1 ou un allèle trans-dominant correspondant d'un gène différent. De préférence, ledit animal non humain transgénique est un animal avec inactivation génique, ncs-1. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, ledit animal non humain transgénique est C. elegans et ledit comportement est un traçage isotherme (TI), ou ledit animal non humain transgénique est la souris et ledit comportement correspond aux performances d'apprentissage et de mémoire dans le labyrinthe piscine de Morris et à des tâches d'évitement actives ; voir également la section 6. 1.6 de l'exemple 6.

Un procédé permettant de produire un animal non humain transgénique, par exemple une souris transgénique, comprend l'introduction d'un vecteur de ciblage ou d'un polynucléotide de NCS-1 dans une

cellule germinale, une cellule embryonnaire, une cellule souche ou un #uf ou une cellule qui en est dérivée. L'animal non humain peut être utilisé conformément au procédé de criblage de l'invention décrit dans la présente description. La production d'embryons transgéniques et le criblage de ceux-ci peuvent être réalisés, par exemple, comme décrit par A. L. Joyner Ed., Gene Targeting, A Practical Approach (1993), Oxford University Press ou pour les souris de l'exemple 6. L'ADN des membranes embryonnaires d'embryons peut être analysé en utilisant, par exemple, des buvardages de Southern avec une sonde appropriée ; voir référence citée plus haut. L'invention concerne également des animaux non humains transgéniques, tels que des souris, rats, hamsters, chiens, singes, lapins, cochons, C. elegans et poissons transgéniques tels que le poisson Torpedo comprenant un gène de NCS-1. De préférence, ledit animal non humain transgénique est C. elegans, tel qu'un animal mutant décrit dans les exemples. De préférence, l'animal non humain transgénique comprend au moins un allèle de type sauvage inactivé ou supprimé du gène codant pour le NCS-1 correspondant ; voir référence citée plus haut.

Ce mode de réalisation permet, par exemple, l'étude de l'interaction de diverses formes mutantes de polypeptides de NCS-1 lors de l'apparition des symptômes cliniques d'une maladie liée à des troubles de la voie de signalisation du calcium. Toutes les mises en #uvre qui ont été précédemment examinées dans la présente description à propos d'un animal transgénique s'appliquent aussi à des animaux portant deux, trois transgènes ou plus, par exemple codant pour la calmoduline. Il pourrait également être souhaitable d'inactiver l'expression ou la fonction de la protéine

NCS-1 à un certain stade de développement et/ou de durée de vie de l'animal transgénique. Ceci peut être obtenu en utilisant, par exemple, des promoteurs spécifiques de tissus, de développement et/ou à régulation cellulaire et/ou inductibles qui acheminent l'expression, par exemple, d'un antisens ou d'une ribozyme dirigés contre le transcrit ARN codant pour l'ARN codant pour le NCS-1 ; voir également référence citée plus haut. Un système inductible approprié est, par exemple, une expression génique régulée par la tétracylcine comme décrit, par exemple, par Gossen et Bujard (Proc. Natl. Acad. Sci. 89 USA (1992), 5547- 5551) et Gossen et al. (Trends Biotech. 12 (1994), 58- 62). De manière similaire, l'expression de la protéine NCS-1 (mutante) peut être contrôlée par de tels éléments régulateurs.

L'invention concerne en outre aussi une cellule transgénique, de préférence eucaryotique, qui contient (de préférence intégrée de manière stable dans son génome) une molécule d'acide nucléique de NCS-1 ou une partie de celle-ci, dans laquelle la transcription et/ou l'expression de la molécule d'acide nucléique ou d'une partie de celle-ci conduit à une diminution de la synthèse d'une protéine NCS-1. Dans un mode de réalisation préféré, cette diminution s'obtient par un effet mutant dominant et/ou de co-suppression, antisens, sens, ribozyme. "Antisens" et "nucléotides antisens" désignent des produits de construction d'ADN ou d'ARN qui bloquent l'expression du produit génique naturel.

Des techniques pour parvenir à ceci sont bien connues de l'homme du métier. Celles-ci comprennent, par exemple, l'expression d'ARN antisens, ribozymes, de molécules qui combinent les fonctions antisens et

ribozyme et/ou de molécules qui fournissent un effet de co-suppression ; voir également référence citée plus haut. Lorsque l'on utilise l'approche antisens pour une diminution de la quantité de protéines NCS-1 dans les cellules, la molécule d'acide nucléique codant pour l'ARN antisens est, de préférence, d'une origine homologue par rapport à l'espèce animale utilisée pour la transformation. Il est cependant également possible d'utiliser des molécules d'acides nucléiques ayant un fort degré d'homologie avec les molécules d'acides nucléiques produites de manière endogène codant pour une protéine NCS-1. Dans ce cas, l'homologie est, de préférence, supérieure à 80 %, en particulier supérieure à 90 % et, de manière encore plus préférentielle, supérieure à 95 %. La diminution de la synthèse de protéine NCS-1 dans les cellules eucaryotiques transgéniques peut se traduire par une altération par exemple au niveau de la signalisation du calcium. Chez des animaux transgéniques comprenant de telles cellules, ceci peut se traduire par divers changements physiologiques, de développement et/ou morphologiques, de préférence par une diminution des fonctions cognitives, telles que l'apprentissage, la mémoire, l'attention, ou une hyperactivité. De telles évaluations du comportement peuvent être faites chez des espèces appartenant aux rongeurs ou non.

La présente invention concerne donc aussi des animaux non humains transgéniques comprenant les cellules transgéniques décrites ci-dessus. Ceux-ci peuvent présenter, par exemple, une insuffisance ou une autre altération au niveau de la transmission de signaux calcium par rapport à des animaux de type sauvage, du fait de la présence stable ou passagère

d'un ADN étranger débouchant sur au moins une des caractéristiques suivantes : (a) disruption d'un ou de plusieurs gènes endogènes codant pour le NCS-1 ; (b) expression d'au moins un ARN antisens et/ou ribozyme contre un transcrit comprenant un polynucléotide de NCS-1 ; (c) expression d'un ARNm non traduisible et/ou sens d'un polynucléotide de NCS-1 ; (d) expression d'un anticorps anti-NCS-1 ; (e) incorporation d'une copie fonctionnelle ou non fonctionnelle d'une séquence régulatrice du gène de NCS-1 ; ou (f) incorporation d'une molécule d'ADN recombiné ou vecteur comprenant l'un quelconque parmi les polynucléotides ou molécules d'acides nucléiques décrits ci-dessus.

Avec les polypeptides NCS-1, leurs polynucléotides codant et vecteurs correspondants, il est à présent possible d'étudier in vivo et in vitro l'efficacité de médicaments par rapport à des mutations particulières au niveau des protéines NCS-1 d'un patient et le phénotype affecté. De plus, des formes mutantes de polypeptides NCS-1 peuvent être utilisées pour déterminer le profil pharmacologique de médicaments et pour l'identification et la préparation d'autres médicaments qui sont susceptibles d'être efficaces pour traiter des troubles liés à la transmission de signaux calcium, notamment pour améliorer certains phénotypes provoqués par les mutations respectives, dans le gène codant pour le NCS-1.

Au cours de ces 20 dernières années, l'hétérogénéité génétique a été de plus en plus reconnue comme une source importante de variation au

niveau de la réponse aux médicaments. De nombreuses communications scientifiques (Meyer, Ann. Rev.

Pharmacol. Toxicol. 37 (1997), 269-296 et West, J. Clin. Pharmacol. 37 (1997), 635-648) ont clairement montré que certains médicaments agissent mieux ou peuvent même être très toxiques chez certains patients comparativement à d'autres et que ces variations au niveau des réponses des patients aux médicaments peuvent être liées à une base moléculaire. Ce concept de "pharmacogénomique" observe des corrélations entre les réponses obtenues face à des médicaments et les profils génétiques des patients (Marshall, Nature Biotechnology, 15 (1997), 954-957 ; Nature Biotechnology, 15 (1997), 1249-1252).

Dans ce contexte de variabilité au sein de la population face au traitement médicamenteux, la pharmacogénomique a été proposée comme un outil utile pour identifier et sélectionner des patients qui peuvent répondre à un médicament spécifique sans effets secondaires. Cette identification/sélection peut être basée sur un diagnostic moléculaire des polymorphismes génétiques en dressant le génotype de l'ADN à partir des leucocytes du sang d'un patient, par exemple, et une caractérisation de la maladie (Bertz, Clin.

Pharmacokinet. 32 (1997), 210-256 ; Engel, J.

Chromatogra. B. Biomed. Appl. 678 (1996), 93-103). Pour les fondateurs des soins de santé, tels que les mutuelles aux Etats-Unis et les services de santé publique gouvernementaux dans de nombreux pays européens, cette approche par la pharmacogénomique peut représenter une manière pour à la fois améliorer les soins de santé et diminuer les frais généraux, de nombreuses dépenses concernant en effet des médicaments

inutiles, des médicaments inefficaces et des médicaments à effets secondaires.

De ce fait, un autre objet de la présente invention concerne la sélection pharmacogénomique de médicaments et de promédicaments pour des patients souffrant de troubles du SNC, tels que ceux décrits cidessus, et qui sont des candidats éventuels à un traitement médicamenteux. Les découvertes de la présente invention fournissent donc les options de développement de nouveaux médicaments destinés à l'intervention pharmacologique dans le but de rétablir la fonction de protéines NCS-1 génétiquement modifiées.

Une approche thérapeutique génique peut aussi être envisagée avec l'aide de la présente invention.

En accord avec ce qui figure ci-dessus, la présente invention concerne aussi l'utilisation d'un NCS-1(neuron-specific calcium sensor-1) ou d'un fragment biologiquement actif de celui-ci, d'une molécule d'acide nucléique codant pour le NCS-1 ou d'une molécule d'acide nucléique d'au moins 15 nucléotides de long s'hybridant à un gène ncs-1, d'un anticorps anti-NCS-1, d'une cellule telle que décrite ci-dessus ou d'un dosage de l'activité de NCS-1 pour un procédé permettant d'obtenir, d'identifier et/ou d'établir le profil d'un candidat médicament pour le traitement d'un trouble du SNC ou pour moduler la cognition d'un sujet.

Des séquences nucléotidiques qui sont complémentaires de la séquence du gène codant pour le NCS-1 peuvent être synthétisées pour une thérapie antisens. Ces molécules antisens peuvent être de l'ADN, des dérivés stables d'ADN, tels que phosphorothioates ou méthylphosphonates, de l'ARN, des dérivés stables d'ARN, tels que 2'-O-alkylARN, ou d'autres

oligonucléotides mimétiques antisens de NCS-1. Des molécules antisens de NCS-1 peuvent être introduites dans les cellules par micro-injection, encapsulation dans des liposomes ou expression à partir de vecteurs hébergeant la séquence antisens. La thérapie antisens de NCS-1 peut être particulièrement utile pour le traitement de maladies pour lesquelles une diminution de l'activité de NCS-1 serait bénéfique.

La thérapie génique de NCS-1 peut être utilisée pour introduire de NCS-1 dans les cellules d'organismes cibles. Le gène de NCS-1 peut être soudé dans des vecteurs viraux par l'intermédiaire desquels l'ADN du NSC-1 est transféré par infection des cellules hôtes receveuses. Des vecteurs viraux appropriés comprennent les rétrovirus, les adénovirus, les virus apparentés aux adénovirus, le virus de l'herpès, le virus de la vaccine, le poliovirus et analogues. En variante, l'ADN de NCS-1 peut être transféré dans les cellules pour une thérapie génique par des techniques non virales comprenant le transfert d'ADN ciblé à médiation récepteur en utilisant des conjugués ligand-ADN ou des conjugués adénovirus-ligand-ADN, la fusion membranaire de type "lipofection" ou la micro-injection directe. Ces procédés et leurs variantes sont appropriés à une thérapie génique de NCS-1 tant ex vivo qu'in vivo. La thérapie génique de NCS-1 peut être particulièrement utile pour le traitement de maladies pour lesquelles une augmentation de l'activité de NCS-1 serait bénéfique. Des protocoles pour une méthodologie moléculaire de thérapie génique appropriés à une utilisation avec le gène de NCS-1 sont décrits dans Gene therapy Protocols, édité par Paul D. Robbins, Human Press, Totawa New Jersey, 1996.

Des compositions pharmaceutiquement utiles telles que décrites précédemment dans la présente description, comprenant ADN de NCS-1, ARN de NCS-1, ou protéine NCS-1, ou des modulateurs de l'activité de NCS-1, c'est-à-dire activateur/agoniste ou inhibiteur/antagoniste, peuvent être formulées conformément aux procédés connus, tels que par le mélange additionnel d'un véhicule pharmaceutiquement acceptable. On peut trouver des exemples de ces véhicules et procédés de formulation dans Remington's Pharmaceutical Sciences. Afin de former une composition pharmaceutiquement acceptable appropriée à une administration efficace, de telles compositions contiendront une quantité efficace de la protéine, de l'ADN, de l'ARN ou du modulateur.

Les compositions thérapeutiques ou diagnostiques de l'invention sont administrées à un individu en des quantités suffisantes pour traiter ou diagnostiquer des troubles pour lesquels une modulation de l'activité liée au NCS-1 est indiquée. La quantité efficace peut varier en fonction de divers facteurs, tels que l'état, le poids, le sexe et l'âge du sujet. D'autres facteurs comprennent le mode d'administration. Les compositions pharmaceutiques peuvent être fournies au sujet par diverses voies, telles que les voies sous-cutanée, topique, orale ou intramusculaire.

L'expression "dérivé chimique" décrit une molécule qui contient des fragments chimiques additionnels qui ne font normalement pas partie de la molécule de base.

De tels fragments peuvent améliorer la solubilité, la demi-vie, l'absorption, etc. de la molécule de base. En variante, ces fragments peuvent atténuer des effets secondaires indésirables de la molécule de base ou en diminuer la toxicité. Des exemples de tels fragments

sont décrits dans divers textes, par exemple dans Remington's Pharmaceutical Sciences.

Les composés identifiés conformément aux procédés décrits dans la présente peuvent être utilisés seuls à des posologies appropriées, définies par des tests de routine, pour obtenir une inhibition optimale du récepteur NCS-1 ou de son activité tout en minimisant toute toxicité éventuelle. De plus, une administration simultanée ou dans un ordre de succession déterminé d'autres agents peut être souhaitable.

Une dose thérapeutiquement efficace fait référence à la quantité de protéine ou de ses anticorps, agonistes, activateurs, antagonistes ou inhibiteurs qui améliore les symptômes ou l'état. L'efficacité thérapeutique et la toxicité de tels composés peuvent être déterminées par des procédés pharmaceutiques standard en cultures cellulaires ou sur des animaux d'expérience, par exemple la DE50 (la dose thérapeutiquement efficace sur 50 % de la population) et la DL50 (la dose léthale pour 50 % de la population). Le rapport des doses entre les effets thérapeutiques et toxiques est l'index thérapeutique, et il peut être exprimé sous la forme du rapport LD50/DE50.

La présente invention a également pour objet de proposer des formulations pharmaceutiques appropriées d'administration par voies topique, orale, générale et parentérale, destinées à être utilisées dans les nouveaux procédés de traitement de la présente invention. Les compositions contenant des composés ou des modulateurs identifiés conformément à cette invention en tant que principe actif à utiliser dans la modulation de NCS-1 peuvent être administrées sous une grande variété de formes galéniques thérapeutiques dans

des véhicules traditionnels pour l'administration. Par exemple, les composés ou les modulateurs peuvent être administrés sous des formes galéniques orales, telles que les comprimés, les gélules (chacune comprenant les formulations à libération échelonnée et à libération prolongée), les pilules, les poudres, les granulés, les élixirs, les teintures, les solutions, les suspensions, les sirops et les émulsions, ou par injection. De même, ils peuvent également être administrés sous forme intraveineuse (à la fois embol et perfusion), intrapéritonéale, sous-cutanée, topique avec ou sans occlusion, ou intramusculaire, toutes les formes d'utilisation étant notoirement connues de l'homme du métier sur la base de ses connaissances générales en techniques pharmaceutiques. Une quantité efficace mais non toxique du composé souhaité peut être utilisée en tant qu'agent de modulation de NCS-1.

On peut faire varier la posologie quotidienne des produits sur un large intervalle, de 0,01 à 1. 000 mg par patient par jour. Pour l'administration par voie orale, les compositions sont de préférence fournies sous la forme de comprimés sécables ou non sécables contenant 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0,25,0 et 50,0 milligrammes du principe actif pour l'adaptation symptomatique de la posologie au patient à traiter. Une quantité efficace du médicament est généralement fournie à un niveau de dose compris entre environ 0,0001 mg/kg et environ 100 mg/kg de poids corporel par jour. La plage est plus particulièrement d'environ 0,001 mg/kg à 10 mg/kg de poids corporel par jour. Les posologies des modulateurs de NCS-1 sont ajustées lorsqu'elles sont associées pour parvenir à des effets souhaités. Par contre, les posologies de ces divers agents peuvent être optimisées de manière

indépendante et associées pour obtenir un résultat synergique là où la pathologie est diminuée plus qu'elle ne l'aurait été si l'un ou l'autre de ces agent était utilisé seul.

De manière avantageuse, les composés ou les modulateurs de la présente invention peuvent être administrés en une dose quotidienne unique, ou bien la posologie quotidienne totale peut être administrée en deux, trois ou quatre prises par jour sous la forme de doses séparées. De plus, les composés ou les modulateurs de la présente invention peuvent être administrés sous une forme intranasale par l'intermédiaire de l'utilisation topique de véhicules intranasals appropriés, ou par des voies transdermiques en utilisant les formes de timbres cutanés transdermiques bien connus de l'homme commun du métier.

Pour être administrée sous la forme d'un système de délivrance transdermique, l'administration de la posologie se fera, bien sûr, en continu plus que par intermittence pendant toute la durée du schéma posologique. Pour un traitement d'association qui comprend plusieurs agents actifs et que ces derniers sont en formulations posologiques séparées, ceux-ci peuvent être administrés de manière concomitante ou bien être chacun administrés à des moments échelonnés de manière distincte.

Le schéma posologique qui utilise les composés ou les modulateurs de la présente invention est choisi en fonction de divers facteurs comprenant le type, l'espèce, l'âge, le poids, le sexe et l'état médical du patient ; la gravité de l'état à traiter ; la voie d'administration ; la fonction rénale et hépatique du patient ; et le composé spécifique qui y est utilisé. Un médecin ou un vétérinaire de connaissances générales

peut facilement déterminer et prescrire la quantité efficace du médicament nécessaire pour prévenir, contrecarrer ou stopper l'évolution de l'état. Une précision optimale pour parvenir à des concentrations de médicament dans l'intervalle produisant une efficacité sans toxicité rend nécessaire un schéma basé sur la cinétique de la disponibilité du médicament aux sites cibles. Ceci implique de prendre en considération la distribution, l'équilibre et l'élimination du médicament.

Dans les procédés de la présente invention, les composés ou les modulateurs décrits en détail dans la présente description peuvent former le principe actif et sont classiquement administrés en association dans un mélange avec des diluants, excipients ou véhicules pharmaceutiques appropriés (désignés collectivement dans la présente par matières "véhicules"), sélectionnés de manière appropriée par rapport à la forme d'administration visée, c'est-à-dire comprimés oraux, gélules, élixirs, sirops et analogues, et conformément aux pratiques pharmaceutiques habituelles.

Par exemple, pour une administration orale sous forme de comprimé ou de gélule, le composant médicamenteux actif peut être associé à un véhicule inerte pharmaceutiquement acceptable, non toxique, oral, tel que l'éthanol, le glycérol, l'eau et analogues. De plus, lorsqu'on le souhaite ou que cela est nécessaire, des liants, des lubrifiants, des délitants et des colorants appropriés peuvent aussi être incorporés au mélange. Des liants appropriés comprennent, de manière non exhaustive, l'amidon, la gélatine, des sucres naturels tels que le glucose ou le betâ-lactose, des édulcorants à base de céréales, des gommes naturelles et synthétiques telles que la gomme

arabique, la gomme adragante ou l'alginate de sodium, la carboxyméthylcellulose, le polyéthylène glycol, des cires et analogues. Des lubrifiants utilisés dans ces formes galéniques comprennent, de manière non exhaustive, l'oléate de sodium, le stéarate de sodium, le stéarate de magnésium, le benzoate de sodium, l'acétate de sodium, le chlorure de sodium et analogues. Les délitants comprennent, de manière non exhaustive, l'amidon, la méthylcellulose, la gélose (agar), la bentonite, la gomme xanthane et analogues.

Pour des formes liquides, le composant médicamenteux actif peut être associé à des agents de mise en dispersion ou de mise en suspension aromatisés de manière appropriée, tels que les gommes naturelles et synthétiques, par exemple la gomme adragante, la gomme arabique, la méthylcellulose et analogues. D'autres agents de mise en dispersion qui peuvent être utilisés comprennent la glycérine et analogues. Pour une administration parentérale, des solutions et des suspensions stériles sont souhaitées. Des préparations isotoniques, qui contiennent généralement des conservateurs appropriés, sont employées lorsqu'une administration intraveineuse est souhaitée.

Des préparations topiques contenant le composant médicamenteux actif peuvent être associées dans un mélange à diverses matières véhicules notoirement connues de l'homme du métier, telles que, par exemple, les alcools, le gel d'aloe véra, l'allantoïne, la glycérine, les huiles à vitamines A et E, l'huile de vaseline épaisse, le propionate de myristyle PPG2 et analogues pour former, par exemple, des solutions alcoolisées, des démaquillants d'application locale, des crèmes nettoyantes, des gels cutanés, des lotions

pour la peau, et des shampoings en formulations de type crème ou gel.

Les composés ou modulateurs de la présente invention peuvent également être administrés sous la forme de systèmes de délivrance avec des liposomes, tels que de petites vésicules unilamellaires, de grosses vésicules unilamellaires et de vésicules multilamellaires. Les liposomes peuvent être formés à partir de divers phospholipides, tels que le cholestérol, la stéarylamine ou les phosphatidylcholines.

Les composés de la présente invention peuvent également être délivrés au moyen d'anticorps monoclonaux utilisés en tant que véhicules individuels auxquels sont couplées les molécules du composé. Les composés ou les modulateurs de la présente invention peuvent aussi être couplés à des polymères solubles utilisés comme véhicules médicamenteux pouvant être ciblés. De tels polymères peuvent comprendre polyvinylpyrrolidone, copolymère du pyranne, polyhydroxypropylméthacrylamidephénol, polyhydroxy- éthylaspartamidephénol ou polyéthylèneoxydepolylysine à substitution par des résidus palmitoyle. Les composés ou les modulateurs de la présente invention peuvent en outre être couplés à une classe de polymères biodégradables utiles pour obtenir une libération contrôlée d'un médicament, par exemple l'acide polylactique, la polyepsiloncaprolactone, l'acide polyhydroxybutyrique, les polyorthoesters, les polyacétals, les polydihydropyrannes, les polycyanoacrylates et des copolymères séquences réticulés ou amphipathiques d'hydrogels.

Pour une administration orale, les composés ou les modulateurs peuvent être administrés sous la forme de

gélule, de comprimé ou d'embol ou, en variante, être mélangés aux aliments des animaux. Les gélules, comprimés et embols se composent du principe actif associé à un véhicule approprié tel que l'amidon, le talc, le stéarate de magnésium ou le phosphate dicalcique. Ces formes galéniques unitaires sont préparées en mélangeant intimement le principe actif avec des composants inertes réduits en poudre fine comprenant les diluants, les charges, les délitants et/ou les liants, ce qui permet d'obtenir un mélange homogène. Un composant inerte est un composant qui ne réagira pas avec les composés ou les modulateurs et qui est non toxique pour l'animal traité. Des composants inertes appropriés comprennent l'amidon, le lactose, le talc, le stéarate de magnésium, les huiles et les gommes végétales, et analogues. Ces formulations peuvent contenir une quantité très variable des composants actifs et non actifs en fonction de nombreux facteurs tels que la taille et le type de l'espèce animale à traiter et le type et la gravité du trouble.

Le principe actif peut aussi être administré sous la forme d'un additif ajouté aux aliments en mélangeant simplement le composé aux aliments ou en l'appliquant à la surface de ceux-ci. En variante, le principe actif peut être mélangé à un véhicule inerte, la composition qui en résulte pouvant ensuite soit être mélangée aux aliments, soit être administrée directement à l'animal.

Des véhicules inertes appropriés comprennent la farine de maïs, de la poudre fine d'agrumes, des résidus de fermentation, des graines de soja, des graines séchées et analogues. Les principes actifs sont intimement mélangés à ces véhicules inertes par broyage, remuage, concassage ou malaxage de sorte que la composition

finale contient de 0,001 à 5 % en poids du principe actif.

Les composés ou modulateurs peuvent en variante être administrés par voie parentérale par injection d'une formulation comprenant le principe actif dissous dans un véhicule liquide inerte. L'injection peut être intramusculaire, intraruminale, intratrachéale ou souscutanée. La formulation injectable se compose du principe actif mélangé à un véhicule liquide inerte approprié. Des véhicules liquides acceptables comprennent les huiles végétales, telles que l'huile d'arachide, l'huile de coton, l'huile de sésame et analogues, ainsi que des solvants organiques, tels que le solkétal, le glycérol formai et analogues. En variante, des formulations parentérales aqueuses peuvent aussi être utilisées. Les huiles végétales sont les véhicules liquides préférés. Les formulations sont préparées en dissolvant ou en mettant en suspension le principe actif dans le véhicule liquide pour que la formulation finale contienne de 0,005 à 10 en poids du principe actif.

Une application topique des composés ou des modulateurs est possible au moyen de l'utilisation d'un breuvage liquide ou d'un shampoing contenant les présents composés ou modulateurs sous la forme d'une suspension ou d'une solution aqueuse. Ces formulations contiennent généralement un agent de mise en suspension, tel que la bentonite, et contiendront aussi, normalement, un antimousse. Des formulations contenant de 0,005 à 10 % en poids du principe actif sont acceptables. Les formulations que l'on préfère sont celles qui contiennent de 0,01 à 5 en poids des présents composés ou modulateurs.

La présente invention concerne également un procédé pour traiter un patient nécessitant un tel traitement pour un trouble ayant pour origine NCS- 1(neuron-specific calcium sensor-1), ledit procédé comprenant l'administration d'un médicament ou d'un candidat médicament identifié ou obtenu dans l'un quelconque des procédés décrits ci-dessus. De plus, la présente invention concerne un procédé pour traiter un trouble du SNC chez un sujet ou pour améliorer la cognition d'un sujet, ledit procédé comprenant d'administrer au sujet une quantité efficace d'un agent thérapeutique afin d'augmenter le taux et/ou l'activité de NCS-1, de manière à améliorer ou à rétablir la signalisation du calcium chez le sujet.

Dans un mode de réalisation préféré des utilisations et des procédés de la présente invention, ledit trouble est ou est lié à la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, les déficits cognitifs liés à l'âge, la dépression majeure, le trouble bipolaire, les troubles de l'anxiété, les troubles de l'appétit, les troubles du sommeil, l'insomnie, le trouble du déficit d'attention avec hyperactivité ou à une perte de mémoire ou à une déficience de l'apprentissage.

Dans un autre aspect, la présente invention concerne un procédé permettant de diagnostiquer chez un sujet un état pathologique ou un risque de développer un état pathologique lié à un trouble du SNC : (a) déterminer la présence ou de l'absence d'une mutation au niveau du polynucléotide codant pour NCS- 1(neuron-specific calcium sensor-1) ; et (b) diagnostiquer un état pathologique ou un risque de développer un état pathologique sur la base de la présence ou de l'absence de ladite mutation.

Dans un autre mode de réalisation, la présente invention concerne un procédé permettant de diagnostiquer chez un sujet un état pathologique ou un risque de développer un état pathologique lié à un trouble du SNC, ledit procédé comprenant les étapes qui consistent à : (a) déterminer la présence ou la quantité d'expression d'un polypeptide de NCS-1(neuron-specific calcium sensor-1) dans un échantillon biologique ; et (b) diagnostiquer un état pathologique ou un risque de développer un état pathologique sur la base de la présence ou de la quantité d'expression du polypeptide.

Dans ces modes de réalisation, les polynucléotides, molécules d'acides nucléiques, (poly)peptide, anticorps ou composés identifiés ci- dessus de NCS-1 sont de préférence marqués de manière détectable. Diverses techniques sont disponibles pour marquer des biomolécules, sont bien connues de l'homme du métier et sont considérées comme entrant dans le cadre de la présente invention. De telles techniques sont, par exemple, décrites dans Tijssen, "Practice and theory of enzyme immuno assays", Burden, RH et von Knippenburg (Eds), Volume 15 (1985), "Basic methods in molecular biology" ; LG, Dibmer MD ; BatteyElsevier (1990), Mayer et al., (Eds) "Immunochemical methods in cell and molecular biology" Academic Press, Londres (1987), ou dans la série "Methods in Enzymology", Academic Press, Inc. Il existe de nombreux traceurs et de nombreux procédés de marquage connus de l'homme commun du métier. Des traceurs couramment utilisés comprennent, entre autres, les fluorochromes (tels que la fluorescéine, la rhodamine, le Texas Red, etc. ), les enzymes (tels que la peroxydase de raifort,

la P-galactosidase, la phosphatase alcaline), les isotopes radioactifs (tels que 32P ou 125I), la biotine, la digoxygénine, les métaux colloïdaux, les composés chimio- ou bioluminescents (tels que dioxétanes, luminol ou acridiniums). Les procédés de marquage, tels que le couplage par covalence d'enzymes ou de groupes biotinyle, les iodations, les phosphorylations, les biotinylations, l'amorçage aléatoire, les translations d'entaille (en utilisant des transférases terminales), sont bien connus de l'homme du métier. Les procédés de détection comprennent, de manière non exhaustive, l'autoradiographie, la microscopie en fluorescence, les réactions enzymatiques directes et indirectes, etc.

De plus, les composés etc. décrits ci-dessus peuvent être liés à une phase solide. Les phases solides sont connues de l'homme du métier et peuvent comprendre les billes de polystyrène, les billes de latex, les billes magnétiques, les particules de métaux colloïdaux, les surfaces et fragments de verre et/ou de silicium, les bandes de nitrocellulose, les membranes, les feuilles, les hématies d'animaux, ou les hématies privées de matière colorante, les duracytes et les parois des puits d'un plateau de réaction, de tubes en plastiques ou d'autres tubes d'essai. Des procédés appropriés pour immobiliser des anticorps, protéines, (poly)peptides, acides nucléiques de NCS-1, etc. sur des phases solides comprennent, de manière non exhaustive, les interactions ioniques, hydrophobes, covalentes et analogues. La phase solide peut retenir un ou plusieurs récepteurs supplémentaires ayant l'aptitude d'attirer et d'immobiliser la région telle que définie ci-dessus. Ce récepteur peut comprendre une substance chargée qui est de charge opposée par rapport au réactif même ou à une substance chargée conjuguée au

réactif de capture ou le récepteur peut être un partenaire de liaison spécifique quelconque qui est immobilisé sur (ou fixé à) la phase solide et apte à immobiliser le réactif comme défini ci-dessus.

Des dosages de détection d'utilisation courante peuvent comprendre des procédés radio-isotopiques ou non radio-isotopiques. Ceux-ci comprennent, entre autres, le RIA (Dosage radio-isotopique) et l'IRMA (Dosage par la méthode immunoradiométrique), l'EIA (Dosage immuno-enzymatique), l'ELISA (dosage par la méthode ELISA), le FIA (Méthode fluorométrique) et le CLIA (Dosage immunologique par chimioluminescence).

D'autres procédés de détection qui sont utilisés dans la technique sont ceux n'utilisant pas de molécules de type traceur. Un prototype de ces procédés est le test d'agglutination, basé sur la propriété d'une molécule donnée à relier au moins deux particules par un pont.

Pour un diagnostic et une quantification des (poly)peptides, polynucléotides, etc. dans des spécimens cliniques et/ou scientifiques, diverses méthodes immunologiques, telles que décrites ci-dessus, ainsi que divers procédés biologiques moléculaires, tels que les analyses par hybridation d'acides nucléiques, les analyses par PCR ou les analyses par une méthode immunoenzymatique avec de l'ADN (Mantero et al., Clinical Chemistry 37 (1991), 422-429) ont été développés et sont bien connus de l'homme du métier.

Dans ce contexte, il convient de noter que les molécules d'acides nucléiques de NCS-1 peuvent aussi comprendre les APN, qui sont des analogues de l'ADN modifiés contenant des liaisons de squelette amide. Ces APN sont utiles, entre autres, comme sondes pour l'hybridation d'ADN/ARN.

Les compositions décrites ci-dessus peuvent être utilisées pour des procédés permettant de détecter l'expression d'un polynucléotide de NCS-1 en détectant la présence d'ARNm codant pour un (poly) peptide de NCS-1, lesdits procédés comprenant, par exemple, d'obtenir de l'ARNm de cellules d'un sujet et de mettre en contact l'ARNm ainsi obtenu avec une sonde/amorce comprenant une molécule d'acide nucléique apte à s'hybrider de manière spécifique à un polynucléotide de NCS-1 dans des conditions d'hybridation appropriées, et de détecter la présence d'ARNm hybridé à la sonde/amorce.

D'autres procédés diagnostiques conduisant à la détection de molécules d'acides nucléiques dans un échantillon comprennent, par exemple, l'amplification en chaîne par polymérase (PCR), la réaction en chaîne de la ligase (LCR), le buvardage de Southern associé à une hybridation d'acide nucléique, l'hybridation génomique comparative (CGH) ou l'analyse des différences représentative (RDA). Ces procédés d'analyse de la présence de molécules d'acides nucléiques sont connus de l'homme du métier et peuvent être réalisés sans expérimentation excessive.

L'invention comprend en outre des procédés permettant de détecter la présence d'une protéine NCS-1 dans un échantillon, par exemple dans un échantillon de type cellule, ledit procédé comprenant d'obtenir un échantillon de type cellule d'un sujet, de mettre en contact ledit échantillon avec un des anticorps susmentionnés, dans des conditions permettant la liaison de l'anticorps à la protéine NCS-1, et de détecter la présence de l'anticorps ainsi lié, par exemple en utilisant des techniques de dosage immunologique telles qu'un dosage radioimmunologique ou un dosage immuno-enzymatique. De plus, l'homme du

métier peut détecter et distinguer de manière spécifique les polypeptides qui sont des protéines NCS-1 fonctionnelles des formes mutées présentant une perte ou une altération de leur activité NCS-1, en utilisant un anticorps qui reconnaît de manière spécifique un (poly)peptide doté d'une activité NCS-1 mais n'en reconnaît pas la forme inactive ou bien qui reconnaît de manière spécifique une forme inactive mais ne reconnaît pas le polypeptide correspondant doté d'une activité NCS-1.

L'invention comprend également un procédé permettant de diagnostiquer chez un sujet une prédisposition à un trouble du SNC en rapport avec l'expression d'un allèle de NCS-1, ledit procédé comprenant d'isoler de l'ADN de personnes souffrant du trouble lié à la sous- ou surexpression d'une protéine NCS-1 ou d'une forme mutante de celle-ci ; de digérer l'ADN isolé avec au moins une enzyme de restriction ; de séparer électrophorétiquement les fragments d'ADN qui en résultent sur un gel de classement en fonction de la taille ; de mettre le gel qui en résulte en contact avec une sonde d'acide nucléique comme il a été décrit ci-dessus apte à s'hybrider de manière spécifique à l'ADN codant pour une protéine NCS-1 et marquée avec une marqueur détectable ; détecter les bandes marquées sur le gel qui se sont hybridées à la sonde marquée pour créer un motif de bande spécifique de l'ADN de personnes souffrant du trouble en rapport avec l'expression d'une protéine NCS-1 ; de préparer l'ADN du sujet conformément aux étapes mentionnées cidessus pour produire des bandes marquées détectables sur un gel ; et de comparer le motif de bande spécifique de l'ADN de personnes souffrant du trouble en rapport avec l'expression d'une protéine NCS-1 et

celui de l'ADN du sujet pour déterminer si ces motifs sont identiques ou différents et diagnostiquer par ce moyen une prédisposition au trouble lorsque les motifs sont identiques. Les marqueurs détectables de la présente invention peuvent être marqués avec des traceurs radioactifs d'utilisation courante, tels que, par exemple, 32P et 35S, bien que d'autres traceurs tels que la biotine ou le mercure, ainsi que ceux décrits ci-dessus, puissent être également utilisés. Divers procédés notoirement connus de l'homme du métier peuvent être utilisés pour marquer les marqueurs détectables. Par exemple, des séquences d'ADN et des séquences d'ARN peuvent être marquées au 32P ou au 35S en utilisant le procédé d'amorce aléatoire. Une fois obtenu un marqueur détectable approprié, divers procédés notoirement connus de l'homme du métier peuvent être utilisés pour mettre le marqueur détectable en contact avec l'échantillon d'intérêt. Par exemple, des hybridations ADN-ADN, ARN-ARN et ADN-ARN peuvent être réalisées en utilisant des modes opératoires standard. Divers procédés de détection d'acides nucléiques sont notoirement connus dans la technique considérée, par exemple le buvardage de Southern et de northern, la PCR, l'allongement d'amorces et analogues. D'autres techniques appropriées d'amplification de l'ADN sont connues dans la technique considérée et comprennent, entre autres, la réaction en chaîne de la ligase, l'amplification par déplacement de brins, l'amplification à base de séquences d'acides nucléiques (NASBA) ou la Q-betâ réplicase.

En outre, l'ARNm, l'ARNc, l'ADNc ou l'ADN génomique obtenu du sujet peut être séquence pour identifier des mutations qui peuvent être des empreintes caractéristiques de mutations de NCS-1 dans

des troubles du SNC, tels que décrits ci-dessus, en rapport avec l'expression de NCS-1 ou de versions mutées de celui-ci. La présente invention comprend de plus des procédés, dans lesquels une telle empreinte peut être générée par RFLP ou AFLP de l'ADN ou de l'ARN obtenu du sujet, l'ADN ou l'ARN pouvant éventuellement être amplifié avant l'analyse, ces procédés étant notoirement connus de l'homme du métier. Des empreintes de l'ARN peuvent être réalisées, par exemple en digérant un échantillon d'ARN obtenu du sujet avec une ARN-enzyme appropriée, par exemple la Rnase T1, la Rnase T2 ou analogues ou une ribozyme et, par exemple, en séparant électrophorétiquement et en détectant les fragments d'ARN sur gel PAGE comme décrit ci-dessus. De préférence, l'hybridation (et le lavage ultérieur) est réalisée dans des conditions stringentes ; par exemple, Sambrook et al., référence citée précédemment et plus haut.

De plus, la présente invention concerne un procédé comme décrit ci-dessus, dans lequel ledit échantillon est ou est dérivé de cheveux, de sang, de sérum, d'expectoration, d'excréments ou d'un autre liquide physiologique de l'organisme. L'échantillon à analyser peut être traité afin d'extraire, entre autres, des molécules d'acides nucléiques, des (poly)peptides ou des anticorps.

La présente invention concerne aussi des compositions en trousse contenant des réactifs spécifiques de NCS-1, tels que ceux décrits précédemment dans la présente description. Des trousses contenant de l'ADN ou de l'ARN de NCS-1, des anticorps dirigés contre le NCS-1 ou une protéine NCS-1 peuvent être préparées. De telles trousses sont utilisées pour détecter de l'ADN qui s'hybride à un acide nucléique de

NCS-1 ou pour détecter la présence d'une protéine NCS-1 ou de fragments peptidiques dans un échantillon. Une telle caractérisation sert à de nombreux objectifs comprenant, de manière non exhaustive, les analyses légales, les applications diagnostiques et les études épidémiologiques conformément aux procédés de la présente invention décrits ci-dessus.

Les molécules d'ADN, les molécules d'ARN, les anticorps et les protéines NCS-1 recombinés se prêtent à la formulation de trousses appropriées à la détection et au typage de NCS-1. Une telle trousse comprendrait typiquement un sac compartimenté approprié au maintien en confinement étroit d'au moins un récipient. Ce sac comprendrait en plus des réactifs, tels qu'une protéine NCS-1 recombinante ou des anticorps anti-NCS-1 appropriés à la détection de NCS-1. Ce sac peut aussi contenir des moyens de détection, tels que des substrats enzymatiques ou antigènes marqués ou analogues.

Ces modes de réalisation et d'autres modes de réalisation sont décrits et compris dans la description et les exemples de la présente invention. On peut rechercher et récupérer d'autre publications concernant l'un quelconque parmi les anticorps, procédés, emplois et composés à utiliser conformément à la présente invention dans des bases de données et bibliothèques publiques, en utilisant par exemple des dispositifs électroniques. On peut, par exemple, utiliser la base de données publique "Medline" disponible sur Internet, par exarple à l'adresse http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/Medline.html. D'autres bases de données et adresses, telles que http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, http://www.infobiogen.fr/, http://www.fmi.ch/biology/research tools.html, http: //www. tigr. org/, sont connues de l'homme du métier et peuvent aussi être obtenues en utilisant, par exemple, http://www.lycos.com. Une synthèse des informations relatives aux brevets dans le domaine

de la biotechnologie et un examen de sources pertinentes d'informations en matière de brevets utiles à une recherche d'antériorité et à l'obtention d'informations actuelles sont donnés dans Berks TIBTECH 12 (1994), 352-364.

La compréhension de cette description peut être meilleure prise conjointement avec les dessins joints en annexe, incorporés à la présente à titre de référence. On obtiendra par ailleurs une meilleure compréhension de la présente invention et de ses nombreux avantages en prenant connaissance des exemples suivants, donnés à titre d'illustration et non pas à titre limitatif.

Sauf mention contraire dans les exemples, toutes les techniques d'ADN recombiné sont réalisées conformément aux protocoles tels que décrits dans Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY ou dans les Volumes 1 et 2 d'Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Des procédés et matériels standard pour un travail moléculaire sur les plantes sont décrits dans Plant Molecular Biology Labfase (1993) par R. D.D. Croy, publié conjointement par BIOS Scientific Publications Ltd (Royaume-Uni) et Blackwell Scientific Publications (Royaume-Uni) Une mutagenèse dirigée a été réalisée en utilisant la trousse de mutagenèse dirigée QuickChange Site-directed Mutagenesis kit (Stratagene). Une souche Bristol de C. elegans de type sauvage (N2) a été obtenue auprès du Caenorhabditis Genetics Center (centre fondé par le "National Center for Research Resources" de l'Institut national de la santé des Etats-Unis (NIH)).

Les figures représentent :

Figure 1. Modèle d'expression du gène rapporteur ncs-1::GFP (A) L'expression du gène ncs-1 est observée au niveau amphide, plasmide, anneau nerveux et cordon nerveux ventral chez des animaux de stade Ll sous la forme d'une coloration à la GFP. Echelle graphique : 100 uM.

(B) Expression du gène ncs-1 dans la tête d'un adulte présentant une coloration avec la GFP dans des dendrites à amphides. Echelle graphique : 10 uM
Figure 2. Ce-NCS-1 : de la structure du gène au détecteur du calcium (A) Cartes physiques des gènes du type sauvage Ce- ncs-1, ncs-1(pk242::Tc1), et à délétion complète ncs- 1(qa40lte). Les cases noires représentent les exons 1- 6, les cases grises les régions non traduites 5' et 3' du gène ncs-1. Echelle graphique : 500 paires de bases.

(B) La protéine NCS-1 contient 4 sites de liaison "EF-hands" (EF 1-4), mais le premier site de liaison est dégénéré et ne peut pas se lier à Ca2+ (De Castro et al., 1995). Les positions Asp D73, D109 et D157 sont essentielles à la liaison du calcium. Le changement des trois résidus Asp (D*) en Ala inactive la liaison à Ca2+ (Putkey et al., 1989)(voir ci-dessous).

(C) Le mutant triple à perte de fonction (If) a été construit en substituant le premier résidu Asp (D*) en un Ala des trois sites de liaison "EF-Hand" EF2,3 et 4.

(D) Ce-NCS-1 est un détecteur du calcium. Le NCS-1 de type sauvage lié au calcium présentait une plus grande mobilité électrophorétique que la forme apo, alors que la mobilité de If-NCS-1 n'était pas affectée par la présence (+Ca2+) ou l'absence (+EGTA) de calcium libre. Ceci suggère que Ca2+ induit un changement

allostérique de la conformation et probablement une activité de Ce-NCS-1.

Figure 3. La signalisation de Ca2+ par l'intermédiaire de NCS-1 dans l'interneurone AIY est essentielle au comportement de traçage isotherme (A) Enregistrements de traçages isothermes (TI) individuels. Sont montrées les photographies des traînées de comportements isothermes normaux ou bouleversés de vers individuels de type sauvage (WT), de type ncs-1 (qa401te) à gène inactivé (KO), de type ncs-1 (qa401te) rattrapé avec le ncs-1 de type sauvage (RWT) , ou avec le ncs-1 à perte de fonction (RLF) , ou avec un promoteur spécifique des neurones AFD (RAFD) conduisant l'expression de NCS-1, ou avec un promoteur spécifique des neurones AIY (RAIY) conduisant l'expression de NCS-1, et de type sauvage plus ncs-1 transgénique (Tg-ncs-1). Des analyses de thermotaxie ont été réalisés comme décrit dans (Mori et Ohshima, 1995).

(B) Pourcentage (performances des groupes) de vers réalisant un comportement de TI, après avoir reçu de la nourriture toute la nuit, à 20 C. Chaque point de données représente 4-10 analyses indépendantes en utilisant approximativement 10-20 animaux par analyse.

Au moins 2-3 lignes différentes ont été générées pour chaque produit de recombinaison transgène. La loi de khi deux et le test de T (T-test) ont été utilisés pour déterminer la valeur significative des performances de comportement de TI obtenues entre les différentes souches.

La valeur P (* # 0,02) indique une différence sensible entre les animaux du type Tg-ncs-1 et les vers de type sauvage. Les valeurs P (** # 0,002) représentent des différences sensibles de performances

entre les animaux du type KO et les vers de type RWT ou RAIY. Pour ces expériences, les écarts types sont compris entre 7 et 14 % . Une traînée est considérée comme isotherme si plus de la moitié de la longueur de traînée laissée à la surface de la gélose par un seul animal est circulaire ou présente un arc de cercle proche de l'isotherme de la température de croissance.

(C) Taux de protéines Ce-NCS-1 dans les diverses souches ou lignées de type WT, KO, RWT, RLF. Une analyse par buvardage de Western en utilisant les anticorps polyclonaux anti-Ce-NCS-1 et 80 ug d'extrait de protéine totale révèle la présence du détecteur du calcium NCS-1 dans la souche de type sauvage (WT), dans les lignées de type sauvage à rattrapage NCS-1 (RWT), et dans les lignées de sauvetage avec le type à perte de fonction (RLF). Notez l'absence de NCS-1 dans la souche à gène inactivé (KO).

Figure 4. Acquisition plus rapide (apprentissage) et rétention plus longue (mémoire) pour les vers surexprimant le NCS-1 (A) L'acquisition de l'association de la nourriture à une température donnée a été évaluée pour les vers du type sauvage (WT) et pour ceux surexprimant le NCS-1 (Tg-ncs-1) en mesurant le % de vers réalisant un comportement de TI à 20 C. En bref, la croissance des vers s'est déroulée sur des plaques ensemencées à 25 C pendant au moins 12 heures, puis ces derniers ont été déplacés individuellement sur une plaque ensemencée à 20 C pendant différents intervalles de temps. Pour les deux souches, les niveaux maximum de comportement de TI (valeurs absolues) ont été atteints après l'association des stimulations conditionnantes pendant au moins 12 heures. 50 % du niveau maximum a été atteint au bout de 68 minutes pour les vers du type WT,

et au bout de 28 minutes seulement pour les vers du type Tg-ncs-1. Comme l'acquisition demi-maximale a été notée au lieu d'utiliser l'indice de TI (voir définition ci-dessous), les performances augmentées de chaque souche ont été fait l'objet d'un contrôle en interne dans cette expérience.

(B) L'extinction de cette association (nourriture à 20 C) a été déterminée pour les vers du type sauvage (WT) et pour ceux surexprimant le NCS-1 (Tg-ncs-1) . En bref, la croissance des vers s'est déroulée à 20 C en présence de nourriture pendant au moins 18 heures, ces derniers ont été lavés à 20 C, puis transférés sur une plaque non ensemencée à 20 C pendant différents intervalles de temps. Des valeurs de TI normalisées (indice de TI) ont été utilisées pour corriger les performances augmentées des vers du type Tg-ncs-1 après le conditionnement, et pour ne prendre en compte que l'extinction d'animaux entraînés. Un pourcentage de 100 % correspond aux performances moyennes atteintes au bout de 18 heures à 20 C (voir Figure 4A pour les valeurs absolues). Une extinction demi-maximale a été obtenue au bout de 3 heures avec les vers du type WT, alors que les vers du type Tg-ncs-1 ont eu une rétention prolongée et ont atteint une extinction demimaximale au bout de 7 heures environ.

Figure 5. Régulation de l'apprentissage associatif et de la mémoire par le NCS-1
La représentation schématique indique que la quantité de NCS-1 régule directement le comportement de TI. L'absence du détecteur du calcium neuronal 1 (ncs-1 KO) empêche la majorité des vers de réaliser une comportement de traçage isotherme, alors que sa présence (WT) le permet. Une surexpression de NCS-1 (Tg-ncs-1) augmente les niveaux de performances,

produit une accélération de l'apprentissage et donne une mémoire dont l'extinction est plus lente. Une extinction plus lente pourrait être le reflet d'une réactivité augmentée des neurones intégratifs AIY face aux stimulations [Ca2+]i. La quantité de NCS-1 dans les neurones AIY et la force de la stimulation par Ca2+ sont associées pour moduler l'apprentissage associatif et la mémoire chez C. elegans. Les lignes en pointillés représentent des réponses IT hypothétiques.

Figure 6. Modèle pour un rôle pré- ou postsynaptique du détecteur du calcium neuronal 1
Le NCS-1 est présent dans les neurones AFD et AIY, au niveau des terminaisons dendritiques ou axonales, et sa fonction dans les neurones AIY est essentielle à un comportement de TI. Dans ce modèle, l'interneurone AIY sert d'intégrateur des entrées nourriture et température et le détecteur du calcium NCS-1 transduit les signaux calcium et régule la force synaptique entre les cellules AIY/AIZ et AIY/RIA au niveau de l'emplacement présynaptique, ou entre les neurones AFD/AIY en un emplacement postsynaptique. Le signe + ou - indique la présence d'un synapse excitateur ou inhibiteur.

Figure 7. Expression du transgène thyl::ncs-l dans les lignées Tg26 et Tg200 (A) Une hybridation in situ en utilisant une sonde d'ARNc antisens marquée à la digoxygénine, complémentaire des régions non traduites en 3' (3'UTR) du transgène de NCS-1 de poussin (cNCS-1). Des signaux intenses sont observés dans des coupes parasagittales des lignées transgéniques Tg26 et Tg200 de souris (voir Tableau II pour une description détaillée de la distribution du cNCS-1). Tg26 se caractérise par une surexpression de NCS-1 dans l'hippocampe et la moelle

épinière, alors que Tg200 présente une distribution dans le cerveau quantitativement et spatialement plus diffuse pour le transgène cNCS-1. (B) Surexpression du cNCS-1 dans l'hippocampe de Tg26 et de Tg200.

Grossissement de la coupe montrée en (A). Notez la quantité plus importante de transcrits cNCS-1 dans Tg200. Vues au microscope des régions CAl (C) et CA3 (D). (E) Aucun signal n'est observé dans les tranches de moelle épinière lombaire préparées à partir d'homologues issus d'une portée de type WT alors que les animaux Tg26 et Tg200 montrent des signaux d'hybridation du cNCS-1 intenses. (F) Taux de protéine NCS-1 total dans les lignées de types WT, Tg26 et Tg200. Une analyse par buvardage de Western en utilisant 30 ug d'extraits de protéine hippocampique totale et un anticorps polyclonal dirigé contre le NCS-1 humain révèle une augmentation sensible du taux de NCS-1 dans Tg-26 (x par 2) et dans Tg200 (x par 6) par rapport au type WT.

Figure 8. L'augmentation de la PLT dans la région CA1 est fonction de la dose de NCS-1 (A) Modifications de la pente des potentiels postsynaptiques excitateurs (PPSE) induites par une stimulation de type bouffées thêta dans des tranches préparées à partir d'animaux de type WT (n=4), Tg26 (n=4) et Tg200 (n=4). Le niveau de PLT obtenu 30 minutes après la stimulation est de 181,81 % 9,1 (n=13) pour Tg200, de 162,62 % 5,73 (n=13) pour Tg26 et de 144,96 % 5,75 (n=41) pour le WT. L'augmentation de la PLT produite par une surexpression de NCS-1 est plus importante dans Tg200 que dans Tg26, et WT, et est statistiquement significative entre Tg200 et WT (p < 0,006), entre Tg26 et WT ou entre Tg200 et Tg26 (p < 0,03).

Notez que la PLT est augmentée à partir du début et

dure au moins 70 minutes dans ces conditions expérimentales. (B) Corrélation entre les niveaux d'augmentation de la PLT et de NCS-1 dans la région CA1 30 minutes après la stimulation initiale. Il existe une forte corrélation entre la quantité de NCS-1 et la PLT résultante. Le taux de NCS-1 le plus élevé produit une augmentation de la PLT plus importante.

Figure 9. La surexpression de NCS-1 augmente la composante récepteur NMDA de réponses par bouffées (A) Augmentation de la sommation de réponses pendant les trains utilisés pour induire la PLT.

Panneau du haut : les tracés représentent les réponses déclenchées par une stimulation unique ou par le premier et le cinquième train (train) utilisés pour induire une PLT dans des tranches de type Tg200 et WT.

Le cinquième train est représenté légèrement en décalage par commodité. Panneau du bas : aire sous les réponses par bouffées que l'on exprime pour chaque train sous la forme d'un pourcentage de l'aire sous le PPSE évoqué par une seule stimulation dans des tranches de type Tg200 et WT. Une surexpression de NCS-1 se traduit par des réponses plus importantes pendant les trains augmentant en outre avec le nombre de bouffées.

(B) Panneau du haut : réponses par bouffées amorcées, du type utilisé pour induire la PLT, enregistrées avant et après l'application de l'antagoniste D-AP5 du récepteur NMDAR à 50 uM. Chaque tracé est la moyenne de quatre enregistrements consécutifs, et la différence entre les deux enregistrements reflète la composante récepteur NMDA-dépendante des réponses par bouffées.

Panneau du bas : Taille de la composante récepteur NMDA des réponses par bouffées exprimées sous la forme d'un pourcentage de l'aire sous le PPSE par bouffées dans des tranches préparées à partir de souris de type Tg200

(colonne noire, n=9) et de souris du type WT (colonne hachurée, n=8, p < 0,05).

Figure 10. L'augmentation de la facilitation avec impulsions appariées, produite par le NCS-1, est dosedépendante (A) Des réponses à des impulsions appariées ont été obtenues à un intervalle entre les impulsions de 50 ms dans la région CAl de tranches issues d'animaux de type WT et Tg200. La ligne horizontale en pointillés montre, à titre de comparaison, l'amplitude maximum du premier PPSE. Notez la facilitation augmentée dans les tranches de Tg200. Les échelles sont indiquées. (B) Degré de facilitation (moyenne erreur type de la moyenne) obtenu dans des tranches hippocampiques issues de souris de type WT (n=14), Tg26 (n=7) et Tg200 (n=5) et calculé à divers intervalles entre les impulsions sous la forme du rapport de l'amplitude de la seconde à la première réponse que l'on a obtenues par une stimulation appariée. Les différences sont statistiquement significatives pour les intervalles entre impulsions de 20-250 ms entre les types WT et Tg26/Tg200, et pour les intervalles entre impulsions de 20-100 ms entre Tg26 et Tg200. L'augmentation de la facilitation avec impulsions appariées est fonction de la dose de NCS-1.

Figure 11. Augmentation de la libération des neurotransmetteurs au niveau de la jonction neuromusculaire par le cNCS-1
Sont représentées des expériences réalisées avec les muscles hémidiaphragmiques gauche de Tg200 et WT.

Potentiels de plaque motrice (EPP) relatifs (moyennes erreur type de la moyenne ; n = 4 muscles) dans des trains de 13 stimuli à 100 Hz, appliqués une fois toutes les 6 secondes, de 5 à 12 plaques motrices étant

analysées par muscle avec une moyenne de 10 à 30 trains d'impulsions par plaque motrice. (A) Les données normalisées montrent une augmentation sensible de la fatigue synaptique avec Tg200, que l'on observe également (données non représentées) par une augmentation du Ca2+ extracellulaire. Par conséquent, la libération de quanta de neurotransmetteurs augmentée pendant les stimuli initiaux crée une déplétion dans le groupe des vésicules à transmetteurs "prêts à être sécrétés" pour les potentiels d'action ultérieurs (fatigue). (B) Représentation des potentiels de plaques motrices établis en moyenne à partir d'une plaque motrice du type WT et d'une plaque motrice transgénique. L'échelle est indiquée.

Figure 12. La mémoire spatiale dans la tâche de labyrinthe piscine de Morris est améliorée dans la lignée Tg26 surexprimant le NCS-1 (A et C) Comparaison entre la lignée Tg26 et des témoins WT homologues de portée, en matière d'acquisition d'un apprentissage spatial dans un labyrinthe piscine pour retrouver une plate-forme cachée, en utilisant des procédures d'essais espacées (3 essais/jour, intervalle entre les essais (ITI) 10 minutes). Aucune différence sensible de latence (F1,18 - 1,0, NS) ou de vitesse de nage (F1,18 - 2,3, NS) n'a été enregistrée (lere semaine). Après un intervalle de sept jours, une seconde procédure d'essais espacés a été réalisée (3eme semaine), de conception identique à la 1ère semaine. Dans cette phase d'étude, un effet de groupe principal sur le facteur latence a été noté (Fl,18 = 4,8, p < 0,05). (B) Des tests d'exploration ont été réalisés après les blocs d'essais 3 et 5 dans chaque phase d'étude, comme l'indiquent les triangles pleins. Aucun des deux

groupes n'a montré un quelconque parti pris spatial après le bloc d'essais 3 (données non représentées) lors de la 1ère semaine, toutefois, au bloc d'essais 5, la lignée Tg26 avait développé une préférence sensible pour le secteur de l'île (lignée Tg26 : F3,27 = 9,3, p < 0,01 ; WT : F3,27 = 1,5, NS). De plus, les souris de type Tg26 ont effectué sensiblement plus de traversées de l'île, reflétant une plus grande exactitude de recherche. Les tracés des trajectoires moyennes sont également représentés pour chaque groupe. (D) Les tests d'exploration réalisés pendant la 3ème semaine ont révélé les performances améliorées de la lignée Tg26 à chaque occasion, par exemple les données représentent les performances au test d'exploration réalisé après le bloc d'essais 5, où la lignée Tg26 a effectué davantage de traversées de l'île et a eu une préférence spatiale pour le secteur de l'île plus prononcée que les témoins. Après le bloc d'essais 3, seule la lignée Tg26 a eu une préférence sensible pour le secteur de l'île (lignée Tg26 : F3,27 = 11,4, p < 0,01 ; WT : F3,27 = 1,3 ; NS ; traversées de l'île : Tg26 9,2 1,0, WT 5,4 ~ 0,8, p < 0,01). (E) Le test d'exploration réalisé 5 jours après la 3ème semaine a indiqué une fois encore un meilleur rappel spatial quant à l'emplacement de la plate-forme de l'île dans la lignée Tg26 (lignée Tg26 : F3, 27 = 11, 1, p < 0,01 ; WT : F3, 27 = 2, 1, NS) .

* Figure 13. Mémoire associative améliorée (évitement actif) avec la lignée Tg26 surexprimant le NCS-1 (A) Apprentissage d'évitement actif, la lignée Tg26 montrant une acquisition augmentée par rapport au type WT (interaction génotype x bloc d'essai F9,198 = 1,9, p < 0,05). (B) La lignée Tg26 a également fait preuve de latences d'évitement sensiblement plus

faibles (effet de souche Fl,19 = 11,9, p < 0,05) bien que les latences d'échappement aient été similaires entre les groupes (interaction génotype x bloc d'essai F 9,81 = 0,8, p > 0,05).

Figure 14. Modèle pour une amélioration de la force synaptique par une surexpression de NCS-1
Le NCS-1 est surexprimé au niveau des deux terminaisons synaptiques dans les lignées de souris transgéniques Tg26 et Tg200. Dans ce modèle, le détecteur du calcium neuronal 1, sert de modulateur de la libération au niveau des vésicules synaptiques doses-dépendantes où la quantité de NCS-1 présynaptique influence proportionnellement la probabilité de libération de neurotransmetteurs. Plus la quantité de NCS-1 est élevée, plus la libération de neurotransmetteurs est importante. Résultant de cet effet de modulation de NCS-1, la dépolarisation postsynaptique est améliorée, davantage de récepteurs de type AMPA sont ouverts, davantage de récepteurs de type NMDA sont ouverts et le signal de sortie final est augmenté.

Figure 15. Produit de recombinaison de ciblage et méthodes d'analyse pour des souris présentant une inactivation du gène de NCS-1 (A) Produit de recombinaison de ciblage pour des souris présentant une inactivation du gène de NCS-1 (B) Procédé de ciblage et analyse de la recombinaison homologue avec des sondes pour un buvardage de Southern. (C) Produit de construction témoin positif en PCR. (D) Procédé de ciblage et analyse par PCR de la recombinaison homologue.

EXEMPLES

Exemple 1 : Expression du gène Ce-ncs-1
Le gène Ce-ncs-1, situé sur le bras gauche du chromosome X, code pour Ce-NCS-1, une petite protéine acide composée de 192 acides aminés (masse moléculaire de 22 kDa) qui se lie à 3 ions calcium par l'intermédiaire de 4 mains "EF-hands" généralement admises (De Castro et al., 1995). La répartition cellulaire de Ce-NCS-1 a été déterminée par des études au microscope optique et en immunofluorescence en utilisant une lignée transgénique (XA411) exprimant une protéine à fluorescensce verte (GFP) sous le contrôle de la région promotrice du Ce-ncs-1 (Figure 1).

Le gène rapporteur ncs-1:GFP a été construit en sous-clonant un promoteur de 3100 paires de base de NCS-1, comprenant la séquence de la région promotrice de NCS-1 : agctttactgtttttgaactaatcatcaattagctccacctacttttaactagat ctgttaacaacccatgtagtgatagcttccctcattttcaaaccaatcagcagtt aggtcaatctatttctaaaccaatgagcaactgactccgcctgttgtgaaccaat caacaaattagctctgccttttttgaaaaaatcaataatttgccttgaccagcag aggaaagaaaagcgacgttaatagctgattaatcttgctacacggaacacggaac aaatttcaagaaagtatattctatcaataaaaaaactattactttgtaccgagta ttgtgaaaaatcatgaatttctgtaaatgtttaatttgtagaaacatgatctgtc gccgaaatctgcgcgaaagttgtgtggatcattatttcgttaagtggaaacatga tctatttgctcttttttgatgaaagaaacattcccaattatctgggttttcctga aaacttttcagtctatgttactgctgttttaatttaatcttttactggaagtcac gtttaaaattggtttaaagattttattcaattttataagatttaaaaaaattgta ggttgaaaattttcagtcagagcttcgaaaagtttgggataccgtatatcctcta ttagtaaggcgccgttattagttttgcacctccattagttttgcatcaaattagg tgtccgaaaattagttttgcataccttactaatagaggaaatacgttttcgtttg ctccaattttttgttttttttttataaggacagagtaatttctattttttttcgt attccaataattaaaatataatcagaaaaataaaatcgtaaaaaataatatgtta cgtagacactcacaatcaggtaggcacaacgcatttgggtaatcttctgggcaaa gtttgatgcatttttcccaacccagataaaagtaaaaaaaaacatctaaaaaagt

atcaatccccaaaaaaattttgatcattttccagagctttgctctctttaaaact gctttttgatttcttattcacgtgaaacaattgatgttgctccgatgcacaatgt gaacttttgagggttttctgagccattagccactgacccaaaatgtgcagtctgg aagatattaattttttgctttttttctagaagttttcttgcagtgtttgaaagtt ttaagacctctcatttgccatcttactattagtggaatttcttcaaggaatttct caatttcaaattcctactgactggctgttttcaaaaaattacacatcatagtttt aatgaaaaatcataggtttaatcatagttgtaatggaaaaaaccaggtatattac acaagcacccaaaaaaattccagcagtggcttggttatggcgatttccggcaatc ggtcattgaccgttttcagaaaataggtttgtcacctaaaaattctaatcaggta ataataatagatttcgtgataggggataa,ttcttaatagtaaactttaaaatat ttttttctctttcaatgatatgacagattcatcttgatttccggttttgtttaag atctgaataattccaaaaacattcatagctttgatattggttagttgtgacttag cacccaaaaataatttactttagcagttttaattcaaaataaaataattctgcgt aaaatttctaaatttttcaactttttatcaagattttgtcgagtaatgctacttc atcaaaacttcttactccatcggttgctccgactttcttccaatccaaaacatgt aaactcaactatcttttctctatttttagagtcctccaaaaccatatgtctgttt gcgcgtgcgtgagatattttccccctttatgcacactcattttgtggttattcat aaaaatgaaatatacatctagagagaaaagttagagagtcgtagagaaaatagaa attgtattgcaccatgattttgtcttctttttttgccttccccttggagcaaaat cgctaatcctagctacgccagtgattgggttgctatggatctcgtgcacacttgc tctcatgtacatatgtattttctcacatattcggttttcccctttttttgatatc tatatactgccggccgccgtgcacctcatttttctctcctcgctccgcacaccat ttctgtgtgcctctgacggataaactgatgggcatccggagcttactggtgacgt ttgaggcggctcttctcccctataggaagtttggaattatggccttgagtgactg gaaaaaagaagagataactcgcataaacttcatatttccccttcattttgctcat caaatttttgcccttattttaccagagatttgcagaagaactagttagttacgat gatggaacaaaatagtcaagtcctagc'gcactgaccaagactaccgttttgcac tgaccaatttttagatctgaccaaaaattttttaagcaatagcaaaaatgttttg tttgcactgaccaacatttttagcactttattctgcaccgaccaatattctttca gatatcaactattttcctattgcaccaaagcatatcaaaatttgatacagctttc aaaatatataatgttatttatttgttcttaagttgccgagtatattaatacaact gctattttaaaatactttgccagtttacggttgcttgaacacccaagaaactgaa aaaaaaattcaattccaggtaaaaatgtattccactcaagcctcctatcctccaa aacctaagtaaattttcgaagatttagttttctttttttcctggagtttagttga

ttgtgctccctacactttgttttctttatattcttaccacttctctaccccttta taccattgagaacccgccgaaacacatcgtttttattcaattaatgtcattttat tggttctcacaccccccaatctgctttcactatattattttttttgtctagtttc cgtatttgaacgttgctactatttttattttcagataacaaaaaagagagaatca agttgcaaatcaaaattattttattagaattgt (SEQ ID NO: 1), dans un vecteur d'expression à GFP, Tu# 63, comme décrit dans Fire et al., Gene 93 (1990), 189.

Des vers transgéniques ont été générés comme précédemment décrit (Mello et al., 1991). Le marqueur rol-6 (plasmide pRF4) et le produit de recombinaison ncs-1::GFP ont été co-injectés dans les gonades d'animaux hermaphrodites. L'alignement d'images de la fluorescence de GFP sur des images Nomarski interférentielles différentielles a permis l'identification des cellules ncs-l::GFP-positives (voir tableau I).

Tableau I : Cellules NCS-1-positives et fonctions de celles-ci

<tb>
<tb> Cellules <SEP> positives <SEP> Fonction
<tb> Neurones <SEP> sensitifs <SEP> : <SEP>
<tb> AWC <SEP> (gauche, <SEP> droit) <SEP> Neurones <SEP> amphides. <SEP> Chimiotaxie <SEP> face
<tb> à <SEP> des <SEP> substances <SEP> odorantes
<tb> volatiles <SEP> (benzaldéhyde, <SEP> butanone,
<tb> alcool <SEP> isoamylique)
<tb> ASE <SEP> (G, <SEP> D) <SEP> Neurones <SEP> amphides. <SEP> Chimiotaxie <SEP> face
<tb> à <SEP> des <SEP> composés <SEP> solubles <SEP> (Na+, <SEP> C1-,
<tb> AMPc, <SEP> biotine, <SEP> lysine), <SEP> ponte
<tb> d'oeufs
<tb> AWB <SEP> (G, <SEP> D) <SEP> Neurones <SEP> amphides. <SEP> Evitement <SEP> des
<tb> substances <SEP> volatiles
<tb> BAG <SEP> (G, <SEP> D) <SEP> Neurones <SEP> sensitifs
<tb> PHB <SEP> (G, <SEP> D) <SEP> Neurones <SEP> phasmides
<tb> AWA <SEP> (G, <SEP> D) <SEP> Neurones <SEP> amphides. <SEP> Chimiotaxie <SEP> face
<tb> aux <SEP> substances <SEP> odorantes <SEP> volatiles
<tb> (diacétyle, <SEP> pyrazine, <SEP> 2,4,5triméthylthiazole)
<tb> AFD <SEP> (G, <SEP> D) <SEP> Neurones <SEP> amphides. <SEP> Comportement <SEP> de
<tb> traçage <SEP> isotherme. <SEP> Thermotaxie.
<tb>

ADF <SEP> (G, <SEP> D) <SEP> Neurones <SEP> amphides. <SEP> Formation <SEP> de
<tb> Dauer <SEP> ; <SEP> chimiotaxie <SEP> face <SEP> aux
<tb> composés <SEP> solubles <SEP> (mineure)
<tb> ASG <SEP> (G, <SEP> D) <SEP> Neurones <SEP> amphides. <SEP> Formation <SEP> de
<tb> Dauer <SEP> (mineure) <SEP> ; <SEP> chimiotaxie <SEP> face
<tb> aux <SEP> composés <SEP> solubles <SEP> (mineure)
<tb> PHA <SEP> (G, <SEP> D) <SEP> Neurones <SEP> phasmides
<tb> Interneurones <SEP> : <SEP>
<tb> AVK <SEP> (G, <SEP> D)
<tb> AIY <SEP> (G, <SEP> D) <SEP> Comportement <SEP> de <SEP> traçage <SEP> isotherme.
<tb>

Thermotaxie
<tb> Neurone <SEP> moteur <SEP> : <SEP>
<tb> RMG <SEP> Innervation <SEP> des <SEP> muscles <SEP> de <SEP> la <SEP> tête
<tb> Cellule <SEP> musculaire <SEP> : <SEP>
<tb> pml <SEP> Ouverture <SEP> des <SEP> volets <SEP> pharyngiens
<tb> métastomals
<tb>

Une confirmation de la coloration au GFP et de la présence de cellules NCS-1 positives a été obtenue avec

des anticorps dirigés contre Ce-NCS-1. Ce-NCS-1 était exprimée de manière prédominante dans les neurones sensitifs (10 paires neuronales : AWC, ASE, AWB, BAG, PHB, AWA, AFD, ADF, ASG, PHA). De plus, 2 paires d'interneurones (AVK, AIY), 1 neurone moteur (RMG) et 1 type de cellule musculaire (pml) exprimaient Ce-NCS-1 (Tableau I). La plupart des neurones exprimant le NCS-1 étaient associés à deux organes sensoriels, les amphides de tête et les phasmides de queue (Figure 1A, 1B). Une répartition sous-cellulaire au niveau du corps cellulaire, du dendrite et de l'axone a été observée avec des anticorps spécifiques dirigés contre Ce-NCS-1.

Exemple 2 : Préparation de la souche à gène inactivé ncs-1
Pour étudier le rôle fonctionnel du Ce-NCS-1, des animaux présentant une inactivation du gène (KO) ont été générés. Une lignée mutante (ncs-1(pk242::Tc1)) comprenant l'insertion du transposon Tcl dans ncs-1 a été utilisée pour isoler une souche dérivée présentant une délétion, ncs-1 (qa401te) (Figure 2A) .

Un mutant homozygote ncs-1(pk242) avec une insertion de Tcl située en position 5231 par rapport au fragment du gène ncs-1 a été obtenu par criblage par PCR d'une banque d'insertion de Tcl, Zwaal et al., Target-selected gene inactivation in C. elegans by using a frozen transposon insertion mutant bank. Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 7431-7435. Des dérivés présentant une délétion ont été obtenus comme décrit dans (Plasterk, 1995). Une souche dans laquelle la région d'ADN génomique entre l'exon 1 et 5 du gène ncs-1 était absente a été isolée (cette délétion éliminait le premier initiateur ATG). Cette souche homozygote initiale dénommée XA401 ncs-1 (qa401te) a été

rétrocroisée cinq fois avec des animaux de type sauvage N2 (nom final XA406).

Les animaux ncs-1 nul étaient viables, leur rythme de développement était normal bien qu'il soient légèrement courtauds, et la protéine NCS-1 n'était plus présente chez ces animaux KO (Figure 3C). Etant donné que 8/10 paires de neurones NCS-1 positifs sont connus pour leur implication dans la chimiotaxie et l'évitement de substances odorantes volatiles, plusieurs catégories de réponses à des odeurs ont été mesurées avec la souche de type KO. Contre toute attente, les animaux mutants à ncs-1 nul ont eu le même comportement que les vers du type sauvage, ce qui suggère que la signalisation du calcium par l'intermédiaire de NCS-1 n'est pas impliquée dans la détection des odeurs chez C. elegans, ou que d'autres détecteurs du calcium dans les neurones olfactifs peuvent se substituer ou compenser le manque de NCS-1.

Exemple 3 : Analyse du comportement de traçage par thermotaxie
En tant qu'animal à sang froid uniquement viable et fertile à l'intérieur d'un domaine de températures restreint (-12 à 26 C), C. elegans possède des comportements thermosensoriels efficaces, dont l'évitement thermique à titre de protection contre l'exposition à une température nocive (Wittenburg et Baumeister, 1999), et la thermotaxie pour la perception de changements physiologiques (< 0,1 C) de la température locale (Mori, 1999). Les vers apprennent à associer une température donnée (la température de croissance) à la présence de nourriture pendant une période de conditionnement (acquisition) de plusieurs heures (Hedgecock et Russell, 1975). Ce conditionnement

d'association est reflété par un phénotype unique, le comportement de traçage isotherme (TI), que l'on peut observer sur des plaques non ensemencées en présence d'un gradient de température radial avec un seul animal migrant vers la température de croissance précise ( 0,2 C) (Hedgecok et Russell, 1975) et se déplaçant ensuite isothermiquement. Lorsque cette association est bouleversée (par épuisement de la nourriture), le comportement de TI est conservé pendant plusieurs heures (période d'extinction), puis un mode de recherche est activé et les vers traverseront les isothermes de manière aléatoire pour chercher de la nourriture à d'autres températures (Mori, 1999). Une variation de la température ne conduira cependant pas à un mode de recherche aléatoire, mais plutôt à une lente ré-acquisition de l'association entre la nourriture et la nouvelle température. Comme Ce-NCS-1 a été trouvé dans AFD et AIY, deux neurones du circuit nerveux de la thermotaxie, les vers KO ncs-1(qa401te) ont fait l'objet d'essais en matière de comportement de TI à 20 C (mesure sous la forme du pourcentage de vers réalisant des traînées isothermes à 20 C).

En bref, la croissance de 20-30 vers a eu lieu toute la nuit à une température constante de 20 C (le stimulus conditionné) en présence d'un tapis frais de la souche de bactéries OP50 (le stimulus non conditionné) sur une boîte de Petri de 6 cm remplie d'un milieu (NGM) comprenant gélose 1,7 %, bactopeptone 0,25 %, NaCl 50mM, phosphate de potassium 25 mM pH 6,0.

Les jeunes adultes ont ensuite été transférés sur une nouvelle plaque dénuée de bactéries pendant deux minutes. Chaque ver a ensuite été déposé sur une boîte de Petri de 9 cm contenant 9 ml du milieu NGM. Un gradient de température radial a été créé en plaçant un

flacon contenant de l'acide acétique glacial sur la partie inférieure de la plaque et en mettant cette plaque à incuber à 26 C pendant 90 minutes en présence d'une humidité constante de 60 %. Lorsque l'animal a été enlevé de la plaque, les traînées laissée à la surface de la gélose ont été photographiées.

Les enregistrements des TI de vers individuels ont été visualisés après 90 minutes sur des plaques d'essai, comme montré sur la figure 3A. Les animaux dont le gène Ce-ncs-1 était inactivé (KO) ont été anormaux, montrant une différence sensible de comportement par rapport aux animaux du type sauvage (WT) (Figure 3B). 75 % 8 des animaux du type WT (n=94) ont fait preuve d'un comportement de TI normal, alors que seulement 31 % 9% des mutants ncs- 1 (qa401te) (n=96) se sont comportés normalement. La majorité des animaux de type KO ont présenté des comportements de TI irréguliers et ont été classés, sur la base des descriptions précédentes des phénotypes de thermotaxie faites par Mori et Oshima (Mori et Oshima, 1995), en cinq catégories : 31 % étaient cryophiles, 27 % athermotactiques, 6 % thermophiles, 5 % présentaient un comportement intermédiaire (phénotypes normaux et athermotactiques mélangés) et 31 % étaient normaux. Les défauts de TI globaux des mutants en ncs-1 (pour la plupart, athermotactiques et cryophiles) étaient similaires aux phénotypes observés chez des animaux à AIY (pour la plupart, cryophiles) et à AFD (athermotactiques et cryophiles) tués au laser, ou chez des mutants en ttx-3 (pour la plupart, cryophiles) (Hobert et al., 1997), mais se distinguaient nettement d'animaux à AIZ tués au laser (pour la plupart, thermophiles) (Mori et Ohshima, 1995).

Le comportement d'évitement thermique de la souche à gène inactivé ncs-1 lors d'une exposition à une température nocive a également été testé. Une température nocive provoque un réflexe de retrait qui diffère sensiblement du comportement thermotactique, implique des neurones différents et est influencé par des mutations dans des gènes distincts (Wittenburg et Baumeister, 1999). Le comportement du mutant ncs- 1(qa401te) ne différait pas de celui des vers du type sauvage dans cette analyse.

Pour s'assurer que la diminution du comportement de TI observée chez le mutant de type KO était bien due à l'absence de Ce-NCS-1, un .sauvetage par lignée germinale de la souche KO a été réalisé en utilisant soit un transgène de fragment génomique à 7 kilobases contenant la région génomique codante pour le ncs-1 au complet plus #3 kilobases de sa séquence génomique en amont 5', soit un fragment de PCR contenant la région codante de l'ADNc de NCS-1 plus #3 kilobases de la séquence génomique en amont 5' (lignées RWT, figure 3A, B). Les deux transgènes ont été aptes à rattraper le phénotype défectueux du mutant en ncs-1, se traduisant par la restauration du comportement de TI chez 62 % 9 % des animaux (n = 92, P = 0,00001).

Exemple 4. La liaison au calcium est nécessaire à l'activité de NCS-1
Pour analyser si la fonction du Ce-NCS-1 était calcium-dépendante, une forme mutée de NCS-1, incapable de se lier au calcium (perte de fonction ou If-NCS-1) a été générée. 5 ug de If NCS-1 ou de NCS-1 de type sauvage purifié ont été soumis à une électrophorèse sur 10 % SDS-PAGE (gel de polyacrylamide (PAGE) en présence de SDS) en présence de CaCl2 5 mM ou d'EGTA 2mM. Les

protéines étaient colorées pour la visualisation avec du bleu de Coumassie (Geiser et al., 1991).

Une liaison radioactive à 45[Ca2+]est facilement détectée avec le NCS-1 de type sauvage (wt), mais ne l'est pas avec le Ce-NCS-1 à perte de fonction (If).

Une protéine témoin à coloration au rouge Ponceau est représentée. 5 pg de NCS-1 à perte de fonction (If) ou de NCS-1 de type sauvage purifié recombinant ont été soumis à une électrophorèse sur 10 SDS-PAGE (gel de polyacrylamide (PAGE) en présence de SDS), transférés par buvardage sur une membrane de nitrocellulose et mis à incuber avec 45[Ca2+], ceci étant suivi de plusieurs lavages, puis ont été visualisés par autoradiographie pendant 48 heures (Maruyama et al., 1984). NCS-lnt, les résidus Asp déterminants des trois sites de liaison au calcium "EF-hand" (positions 73,109 et 157, figure 2B) ayant été remplacés par Ala, empêchait à la fois la liaison à Ca2+ (Figure 2C) et le déplacement conformationnel Ca2±dépendant de If-NCS-1 (Figure 2D) .

Les lignées obtenues avec le transgène If-ncs-1 (RLF) ont été analysées en matière de comportement de TI (Figure 3A, B) et ont présenté un phénotype de TI défectueux (27 % 13 %, n=78), malgré l'expression de la protéine mutée If-NCS-1 (Figure 3C). Ceci indique que le comportement de TI normal est calcium-dépendant et nécessite un détecteur NCS-1 de liaison au calcium fonctionnel.

Pour déterminer le type de cellules pour lesquelles le NCS-1 est nécessaire, un rattrapage mosaïque des animaux du type KO a été réalisé en utilisant des promoteurs spécifiques des AFD (gcy-8 (Yu et al., 1997) ou des AIY ( ttx-3 (Hobert et al., 1997)) conduisant l'expression de ncs-1. Un comportement de TI rattrapé (56 % 5 %) a été observé avec le produit de

recombinaison ttx-3::NCS-1 (animaux de type RAIY, n=50, P = 0,002) à un niveau similaire au sauvetage observé dans les animaux de type RWT (Figures 3A, B). Aucun sauvetage (12,5 % 9 %) du comportement de TI n'a été obtenu avec le produit de recombinaison gcy-8: :NCS-1 (animaux de type RAFD, n=40) (Figure 3A, B). Ces données suggèrent fortement que, pour un comportement de TI normal, la fonction de NCS-1 est nécessaire dans les AIY, mais pas dans les AFD ou en d'autres neurones.

Exemple 5 : Un taux élevé de NCS-1 a une incidence sur le comportement de TI d'animaux de type WT
Après avoir généré des lignées transgéniques surexprimant le NCS-1 (Tg-ncs-1) en utilisant l'ADNc de NCS-1 sous le contrôle du promoteur de NCS-1 (présence du produit de recombinaison déterminée par PCR), l'effet en matière de thermotaxie a été mesuré. La figure 3B montre de manière remarquable qu'une surexpression de NCS-1 se traduit par une augmentation significative (P = 0,018) des performances thermotactiques de TI (90 % 10 %, n=70) par rapport au comportement d'animaux du type WT (75 % ~ 8 %). Ces résultats démontrent que le niveau d'activité de NCS-1 peut déterminer l'efficacité des performances de TI et établissent que le NCS-1 doit vraisemblablement être essentiel à ce comportement et non pas simplement permissif du TI.

Afin de caractériser en plus les vers de type Tg- ncs-1, leurs performances en matière de comportement de TI ont été étudiées dans de plus amples détails et comparées à celles des vers du type WT. Le temps nécessaire à l'acquisition (apprentissage) et la période d'extinction (mémoire) des informations associatives (présence de nourriture à la température

de 20 C) ont été déterminés. Pour les expériences relatives à l'acquisition (Figure 4A), la croissance des vers a eu lieu pendant au moins 12 heures en présence de nourriture à 25 C, puis ces derniers ont été déplacés individuellement pendant différents intervalles de temps sur une plaque ensemencée à 20 C et leur comportement de TI à 20 C a été déterminé.

Comme le montre la figure 4A, les vers du type WT avaient besoin d'approximativement 68 minutes pour atteindre 50 % de leur niveau de performances maximum, tandis que les vers du type Tg-ncs-1 atteignaient ce niveau après seulement 24 minutes. Les vers surexprimant le NCS-1 étaient donc de 2 à 3 fois plus rapides que ceux du type WT pour apprendre le nouveau paradigme de conditionnement (nourriture à 20 C). Pour les deux souches, un niveau de performances maximum était déjà atteint après approximativement 12 heures.

Pour les expériences relatives à l'extinction (Figure 4B), la croissance des vers a eu lieu sur des plaques ensemencées à 20 C pendant au moins 18 heures, les jeunes vers adultes individuels ont ensuite été lavés à 20 C, puis transférés sur des plaques non ensemencées à 20 C pendant différents intervalles de temps et leur comportement de TI à 20 C a été déterminé. Comme le montre la figure 4B, les vers du type WT entraînés avaient besoin d'approximativement 3 heures pour perdre 50 % de leur niveau de performances maximum, tandis que les vers du type Tgncs-1 ne perdaient 50 % de leur niveau maximum qu'après approximativement 7 heures. Par conséquent, la période d'extinction du paradigme associatif (nourriture à 20 C) pour les vers surexprimant le NCS-1 se prolongeait sur une période équivalant au moins à deux fois celle des vers du type WT. Pour les deux souches,

le retour à un niveau de ligne de base a été atteint après approximativement 18 heures. Prises conjointement, ces données ont indiqué q'une quantité élevée de la protéine NCS-1 détectrice du calcium augmente non seulement les performances, mais aussi les fonctions d'apprentissage et de mémoire par l'intermédiaire d'une acquisition plus rapide et d'une rétention plus longue (Figure 5).

Exemple 6. Amélioration de la potentialisation à long terme et de la cognition par l'intermédiaire de NCS-1 chez des souris 6. 1 Modes opératoires 6. 1.1 Production de souris transgénique surexprimant le NCS-1 de poussin
Des souris transgéniques Thyl-cNCS-1 ont été générées de la façon suivante : un long fragment d'ADN de 573 paires de bases codant pour la protéine complète NCS-1 de poussin (cNCS-1) (d'AUG au codon d'arrêt (Nef et al., 1995)) a été soudé aux 215 paires de bases adjacentes (SEQ ID N0:2) correspondant à la région non traduite en 3' de l'ARNm de cNCS-1. Le fragment d'ADN de cNCS-1 de 788 paires de bases qui en a résulté a été inséré dans une cassette portant un promoteur Thyl. Lors de la linéarisation, le produit de recombinaison Thyl-cNCS1 de 7 kb de long a été micro-injecté dans les pronucléi de zygotes FI de C57BL/6J - BALB/cJ en utilisant des modes opératoires établis (Hogan, 1994). La réussite de la transgénèse a été déterminée par une analyse par PCR de l'ADN génomique de queue obtenu de collatéraux hétérozygotes en utilisant les amorces oligonucléotidiques suivantes directe 5'-

ccacagaatccaagtcgg-3' (SEQ ID NO: 3) correspondait à la séquence 5' en amont du promoteur Thy-1, et inverse 5'atacgagcccgtcgtagag-3' (SEQ ID NO: 4) était homologue aux positions d'acide nucléique 553-571 de la région codante pour la cNCS-1.

6. 1.2 Distribution du transgène de cNCS-1 dans les tissus du système nerveux
Une hybridation in situ (ISH) a été réalisée comme décrit précédemment (Schaeren-Wiemers et Gerfin-Moser, 1993). En bref, des sondes d'ARN antisens marquées à la digoxygénine (ribosondes) ont été synthétisées comme indiqué dans le manuel des fabricants (DIG-RNA labelling kit, Roche Biochemicals) en utilisant des séquences des régions non traduites 3' (UTR-3') spécifiques (positions 636-750 et 501-750 d'acide nucléique) de NCS-1 de poussin en matrice pour éviter toute hybridation croisée avec les transcrits ARNm de NCS-1 de souris endogènes. Les cerveaux d'animaux de type WT et transgéniques ont été disséqués, inclus dans du Tissue Tek, immédiatement congelés dans de l'isopentane avec de la neige carbonique. Les tissus ont été maintenus à -80 C jusqu'au traitement. Des coupes épaisses de 12 m ont été préparées à -15 C avec un microtome, installées sur des lames SuperFrost Plus (Menzel-Glâser), séchées pendant 20 minutes à la température ambiante, puis ont été soit conservées à - 20 C, soit directement utilisées pour l'ISH. Suite à une postfixation dans 4 % paraformaldéhyde et solution tampon phosphate (PBS), les coupes ont été mises à incuber 2x pendant 15 minutes dans une solution tampon phosphate (PBS) contenant 0,1 % de DEPC actives, puis équilibrées pendant 15 minutes dans 5x SSC. Les coupes ont été préhybridées dans un mélange d'hybridation (50

% formamide, 5x SSC, 5x solution de Denhardt, 0,25 mg/ml d'ARNt de levure, 0,5 mg/ml d'ADN de sperme de saumon) pendant 2 heures à 65 C. Après addition de ribosondes, dénaturées à la chaleur, à 500 ng/ml, une hybridation a été réalisée o/n à 65 C. Les coupes ont ensuite été lavées à la température ambiante pendant 30 minutes dans 2x SSC, à 72 C pendant 1 heure dans 2x SSC, à 72 C pendant 30 minutes dans 0, lx SSC et ont finalement été équilibrées dans le tampon 1 (acide maléique 0,1 M, NaCl 0,15 M, pH 7,5). Les coupes ont ensuite été mises à incuber pendant 2 heures avec de la phosphatase alcaline couplée à des anticorps antidigoxygénine (Roche Biochemicals) à une dilution de 1:3000 dans le tampon 1 contenant 0,5 de réactif bloquant (Roche Biochemicals). L'excès d'anticorps a été éliminé par des lavages (2x) pendant 15 minutes dans le tampon 1, puis les coupes ont été équilibrées dans le tampon 2 (TrisHCl 0,1 M, NaCl 0,1 M, MgCl2 50 mM, pH 9,5). Un développement chromogène a été réalisé à la température ambiante dans le noir avec le tampon 2 contenant du NBT/BCIP (Gibco) et du levamisole (concentration finale de 0,24 mg/ml) et la coloration a été arrêtée par addition de Tris 10 mM, et d'EDTA 0,1 mM à pH 8. Les coupes ont ensuite été brièvement rincées dans de l'eau bi-distillée et montées avec VectaMount (Vector Laboratories). Une analyse morphologique détaillée du nombre total de synapses, de la forme et de la morphologie des plaques motrices ainsi que de la quantité de bourgeonnement nerveux a été réalisée comme décrit ailleurs (Caroni et al., 1997).

6. 1.3 Niveau de surexpression de NCS-1

Des extraits de protéine totale issus du tissu cérébral d'animaux de type WT et transgéniques ont été produits de la façon suivante : des hippocampes disséqués ont été homogénéisés dans un tampon PBS contenant des inhibiteurs des protéases (comprimés EDTA free, Roche Biochemicals) et on été traités aux ultrasons 3x pendant 5 secondes (à 10 Watts) sur de la glace en utilisant un appareil à ultrasons Vibracell (Sonics&Materials inc.). L'homogénat a été clarifié par centrifugation à 4 C pendant 30 minutes à 12. 000 g. La concentration en protéine du lysat a été déterminée par le test sur les protéines de Bradford (Bio-Rad, Hercules, Californie) en utilisant du sérum-albumine de b#uf (SAB) en étalon. 30 ug de protéine totale ont été séparés par SDS-PAGE (électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS) en utilisant des procédés standard. Les protéines ont ensuite été transférées sur des membranes en PVDF (polyfluorure de vinylidène) par électrobuvardage conformément aux indications du fabricant (Novex) et traitées par immunodétection. Les membranes en PVDF ont été mises à incuber à la température ambiante pendant 30 minutes dans un tampon Blocking (PBS contenant 5 % de lait dégraissé et 0,05 % de Tween 20), puis à la température ambiante pendant 2 heures avec un anticorps polyclonal spécifique anti-NCS-1 humaine dilué à 1:500 dans le tampon Blocking. Le complexe immun a été révélé par chimioluminescence comme décrit plus tôt (Système ECL, Amersham). Une coloration de la sous-unité a de kinase II calmoduline-dépendante avec un anticorps monoclonal anti-rat (Calbiochem) dilué à 1:2000 a été utilisée comme témoin de référence interne pour s'assurer qu'une quantité similaire de protéine était chargée, transférée et détectée. Après exposition, le

film a été balayé sur un densitomètre d'imagerie (BioRad) et les signaux de NCS-1 ont été quantifiés (logiciel Molecular Analyst, Bio-Rad).

6. 1.4 Electrophysiologie de tranches hippocampiques
Des enregistrements ont été effectués comme décrit précédemment (Muller et al., 1996). En bref, des tranches hippocampiques ont été préparées à partir de jeunes souris adultes (âgées de 2-4 mois) transgéniques (Tg26 et Tg200) et de leurs homologues du type sauvage (WT) issus d'une portée, par décapitation et débitage en coupe en utilisant un couteau à tissu. Elles ont été conservées dans une chambre d'interface sous perfusion continue avec un milieu contenant (en mM) : NaCl 124, KC1 1,6, CaCl2 2,5, MgCl2 1,5, NaHC03 24, KH2P04 1,2, glucose 10 et acide ascorbique 2 ; 7,4, température de 33 C. Des potentiels postsynaptiques excitateurs (PPSE) ont été déclenchés avec des électrodes de stimulation en fils de nichrome torsadés placées dans la voie collatérale de Schaffer et enregistrés dans la zone dendritique (stratum radiatum) de la région CA1. La PLT a été induite en utilisant une stimulation de type bouffées thêta (cinq bouffées à 5 Hz, chacune composée de 4 impulsions à 100 Hz) répétée deux fois consécutivement à 10 secondes d'intervalle. La pente des PPSE a été contrôlée en continu et les résultats ont été exprimés sous la forme du rapport des modifications observées 30 minutes et 60 minutes après stimulation vs valeurs de ligne de base. Pour analyser la composante NMDA des réponses par bouffées, des séries de 4 impulsions à 100 Hz ont été produites de manière répétitive (0,03 Hz) en utilisant un paradigme d'amorçage pour supprimer les réponses inhibitrices. Ceci a été effectué en utilisant une seconde électrode

de stimulation et en évoquant une réponse sur une entrée séparée, indépendante 200 ms avant la réponse par bouffée. La composante NMDA a ensuite été déterminée sous la forme de la différence entre les réponses par bouffées avant et après l'application de D-AP5 50 uM. La facilitation a été mesurée sous la forme du rapport des courbes des PPSE évoqués à intervalles courts (25-500 ms) en utilisant un paradigme d'impulsions appariées.

6. 1.5 Fatigue synaptique à la jonction neuro-musculaire
Des expériences ont été réalisées avec l'hémidiaphragme gauche incubé dans une solution contenant 40 % de milieu Leibovitz L-15 avec les concentrations en ions suivantes (Na+ 1 mM, K+ 1 mM, Ca2+ 2, 5 mM, Mg2+ 1 mM) à pH 7, 5 avec HEPES (acide N- (2hydroxyéthyl)pipérazine-N'-2-éthanesulfonique). Le nerf phrénique a été simulé par l'intermédiaire d'une électrode à ventouses et des enregistrements intracellulaires des potentiels de plaque motrice (EPP) ont été effectuées. Les potentiels de membrane étaient compris entre-65 et-75 mV. Une stimulation de nerf consistait en une série de 13 impulsions délivrées à 100 Hz, une fois toutes les 6 secondes. La contraction des fibres musculaires était bloquée par addition de 1- 1,5 ug/ml de d-tubocurarine. A ces concentrations, les EPP étaient compris entre 1 et 3 mV en amplitude. Les réponses à de 15 à 30 séries de stimuli consécutives ont été établies sous forme de moyenne pour chaque plaque motrice et chaque amplitude d'EPP sous forme de moyenne dans une série a été exprimée par rapport à l'amplitude de la première EPP moyenne de la même série. Pour éviter une interférence par sommation non linéaire (Martin, 1976), la collecte des données dans

une expérience a été interrompue lorsque le potentiel de membrane avait décliné de plus de 5 mV.

6. 1.6 Etudes du comportement Essais neurologiques : des groupes de Tg26, Tg200 et de leurs homologues issus d'une portée du type WT (n=12 par groupe) ont été utilisés pour évaluer les fonctions neurologiques comme décrit précédemment (Higgins et al., 2001). L'activité locomotrice a été mesurée dans des cages non familières à cellules photoélectriques (36 x 24 x 19 cm, Benwick Electronics, Royaume-Uni) et une activité tant horizontale que verticale a été enregistrée sur une période de 60 minutes.

Labyrinthe picine de Morris : Un groupe de Tg26 et leurs homologues issus d'une portée du type WT (n=10 par groupe) ont été entraînés à trouver une plate-forme fixe submergée (8 cm de diamètre, 1 cm en dessous de la surface) à l'intérieur d'une piscine circulaire (diamètre, 1 m ; 30 cm) remplie d'eau laiteuse (profondeur 20 cm ; 21 1 C). L'emplacement de la plate-forme était équilibré au sein des groupes. Des repères visuels externes étaient placés autour de la piscine pour que les animaux retrouvent leur chemin facilement. Chaque souris a suivi 1 séance d'entraînement par jour pendant 5 jours consécutifs (trois essais par séance), au cours de laquelle on les plaçait face au mur de la piscine et on les laissait localiser la plate-forme cachée. Le temps nécessaire à la souris pour situer la cible (latence d'échappement), le trajet à la nage et la vitesse de nage ont été mesurés en utilisant un système de mobilité vidéo automatisé (HVS Image, Hampton, Royaume-Uni). Un essai

durait au maximum 60 secondes. Une évaluation de l'apprentissage spatial a été réalisée dans des essais d'exploration effectués 1 heure après la séance 3 et 5. Dans la seconde expérience, le test d'exploration a également été réalisé 5 jours après la dernière séance d'entraînement. Les données de latence d'échappement ont été analysées avec une analyse de variance (ANOVA) à deux voies, avec le génotype en tant que facteur indépendant et les séances d'entraînement en tant que mesures répétées. Les données du test d'exploration ont été analysées avec une ANOVA à une voie. A la suite de cela, des comparaisons ont été effectuées en utilisant le test de Newmann Keuls.

Essais d'évitement actif et de seuil de choc : Tg26 et leurs homologues du type WT issus d'une portée (n=12 par groupe) ont été testés. Le test d'évitement actif a été réalisé dans quatre boîtes identiques à deux chambres (Gemini II avoidance system, San Diego Instruments, Etats-Unis). Chaque boîte était équipée d'un sol en grille métallique, d'une lumière de stimulation située au plafond de chaque compartiment et d'une porte à glissières automatique séparant les deux chambres, cette porte étant maintenue ouverte pendant l'entraînement. Les animaux ont reçu 20 essais par jour (bloc d'essais) effectués sur 10 jours consécutifs.

Chaque séance d'entraînement commençait par une phase d'acclimatation de 5 minutes et les animaux étaient entraînés à éviter un stimulus de 0,2 mA en répondant à une lumière de signal visuel située dans chaque chambre. Un intervalle entre les essais (ITI) de 20 secondes a été utilisé. Si la souris ne traversait pas dans les 10 secondes de la présentation du signal, un choc (0,2 mA) était délivré jusqu'à ce que l'animal

soit passé de l'autre côté (réponse d'échappement) ou après que 10 secondes se soient écoulées. Un seuil de choc a été déterminé pour Tg26 et WT (n=6 par groupe).

Chaque souris a été testée dans une chambre opérante (14 cm x 14 cm x 13 cm ; MedAssociates, Vermont) comportant un sol en grille métallique et a reçu manuellement des chocs intenses de 1 seconde.

L'intensité du choc de départ était de 0,05 mA, puis les chocs augmentaient d'intensité par paliers de 0,05 mA, avec respect d'un intervalle de 30 secondes entre les chocs, jusqu'à ce qu'à la fois tressaillement (tout réponse détectable) et vocalisation aient été induits. Une analyse des données d'évitement actif a été réalisée par ANOVA à deux voies avec le génotype en tant que facteur indépendant et les séances d'entraînement en tant que mesures répétées. A la suite de cela, des comparaisons ont été effectuées en utilisant le test de Newmann Keuls.

Essais d'exploration lumière/obscurité et de sursaut : Dix souris de type Tg26 et dix souris de type WT ont été testées dans l'essai de lumière-obscurité tel que décrit précédemment (Kew et al., 2000). Le temps passé dans chaque compartiment, le nombre de tentatives pour pénétrer dans le compartiment éclairé et le nombre de passages du compartiment obscur au compartiment éclairé ont été enregistrés pendant la période d'essai de 5 minutes. Les différences entre les lignées ont été comparées avec le t-test de Student. L'essai de sursaut a été réalisé dans des dispositifs à réflexes (SR-LAB, San Diego Instruments, Etats-Unis) comme décrit précédemment (Kew et al, 2000). Chaque séance commençait par une période d'acclimatation de 5 minutes suivie de cinq essais successifs à 110 dB. Ces essais

n'ont pas été inclus dans l'analyse. Dix types d'essai différents ont ensuite été présentés : impulsion de sursaut seule (ST110, 110 dB/40 ms) ; six essais de pré-impulsions de type différent dans lesquels des stimuli à 74,82 ou 90 dB de 20 ms étaient présentés seuls (P74, P82 et P90) ou précédaient de 100 ms l'impulsion à 110 dB (PP74, PP82 et PP90) ; et finalement un essai dans lequel seul le bruit de fond était présenté afin de mesurer le mouvement de ligne de base dans les cylindres. Tous les essais ont été présentés dans un ordre pseudo-aléatoire, l'intervalle moyen entre les essais étant de 15 secondes. Une analyse des données a été réalisée avec une ANOVA à deux voie avec le génotype en tant que facteur indépendant et les stimuli en tant que mesures répétées.

6. 2 Génération et sélection de souris transgéniques surexprimant NCS-1
Plusieurs lignées de souris transgéniques (Tg) ont été élaborées en utilisant la séquence codante complète du détecteur du calcium neuronal 1 de poussin (cNCS-1) et une petite région de sa région non traduite en 3' placée sous le contrôle du promoteur Thyl. Ce promoteur conduit la transcription neurone-spéficique du transgène uniquement à partir des stades postnataux P6- 10 (Caroni, 1997 ; et al., 1994), ce qui diminue donc fortement les problèmes potentiels associés à la surexpression d'un transgène pendant le neurodéveloppement embryonnaire. L'expression spécifique du produit de recombinaison génique thyl::cNCS-1 a été déterminée par des hybridations in situ (ISH) de coupes sériées de moelle épinière et de cerveau dérivées de souris Tg adultes. Afin de différencier d'avec les

transcrits de NCS-1 de souris endogènes, la région non traduite en 3' de l'ADNc de NCS-1 de poussin a été utilisée comme sondes antisens (Figure 7A). Sur la base des taux d'expression et des distributions de transcrits de cNCS-1 dans le cerveau, deux lignées transgéniques indépendantes, dénommées Tg26 et Tg200, ont été sélectionnées. Les distributions globales et spécifiques dans le cerveau de signaux cNCS-1-positifs pour les deux lignées Tg sont décrites sur la figure 7 et dans le tableau II.

La surexpression de cNCS-1 chez Tg-26 n'a été observée que dans deux régions principales 1) l'hippocampe, avec les couches cellulaires pyramidales de la région CA1-2-3-4 et la couche cellulaire granuleuse du corps godronné (dentate gyrus), et 2) la moelle épinière, avec les neurones moteurs et peu de noyaux sensoriels dans le bulbe rachidien (Figure 7A, Tableau II). Un marquage faible, mais cependant détectable dans Tg26 a également été observé dans le colliculus supérieur et les noyaux cérébelleux profonds. Avec Tg200, toutefois, la surexpression de cNCS-1 a été sensiblement plus forte dans l'hippocampe et les neurones moteurs et a été observée dans plusieurs autres régions du cerveau. En fait, un marquage de modéré à fort du cNCS-1 a été observé dans le néocortex, la protubérance annulaire, des parties du cortex limbique, dans les systèmes olfactifs, auditifs et visuels, le thalamus et l'hypothalamus ainsi que dans le cervelet (voir Figure 7A et Tableau II). Les signaux de cNCS-1 dans l'hippocampe ont été clairement plus intenses chez Tg200 que chez Tg26 (Figure 7B, 7C et 7D) et, ce qui n'est pas étonnant, correspondaient à une quantité supérieure de protéine NCS-1 totale dans l'hippocampe (Figure 7F). Une analyse par balayage de l'intensité de buvardage de Western a indiqué que, lorsqu'on la comparait

au taux endogène de WT, la quantité de NCS-1 était deux fois plus élevée chez Tg26 et six fois plus élevée chez Tg200. Une surexpression de NCS-1 était également plus forte dans les neurones moteurs de Tg200 en comparaison de Tg26 (Figure 7E). Dans l'ensemble, l'expression de thyl::cNCS-1 était plus forte et plus large dans les structures glutamatergiques et cholinergiques que dans les structures monoaminergiques. Pour les deux lignées Tg26 et Tg200, aucune surexpression de cNCS-1 n'a pu être détectée dans la substance blanche.

Tableau II. Comparaison des lignées transgéniques Tg26 et Tg200 en matière de distribution des transcrits de NCS-1

<tb>
<tb> Structures <SEP> du <SEP> système <SEP> nerveux <SEP> Tg26 <SEP> Tg200
<tb> Cerveau <SEP> antérieur
<tb> Bulbe <SEP> olfactif
<tb> Tuberculeolfactif
<tb> Bulbe <SEP> olfactif <SEP> accessoire- <SEP> +
<tb> +
<tb> Néocortex
<tb> Couche <SEP> I
<tb> Couches <SEP> II-VI <SEP> +++
<tb> Cortex <SEP> limbique
<tb> Amygdale- <SEP> ++
<tb> Nucleusaccumbens
<tb> Hippocampe <SEP> (CAI-CA4) <SEP> ++ <SEP> +++
<tb> Dentate <SEP> gyrus <SEP> ++ <SEP> +++
<tb> Globus <SEP> pallidus- <SEP> ++
<tb> Ventral <SEP> pallidus- <SEP> ++
<tb> Cortex <SEP> piriforme- <SEP> ++
<tb> Striatum <SEP> - <SEP> Cerveau <SEP> moyen
<tb> Thalamus
<tb> Thalamic <SEP> nuclei- <SEP> +
<tb> Subthalamic <SEP> nuclei- <SEP> +
<tb> Hypothalamus
<tb> Hypothalamus <SEP> antérieur- <SEP> +
<tb> Hypothalamuspostérieur
<tb> Pituitaire
<tb> Protubérance <SEP> annulaire
<tb> Colliculus <SEP> inférieur- <SEP> ++
<tb> Colliculus <SEP> supérieur <SEP> + <SEP> +++
<tb> Substance <SEP> grise <SEP> péri-épendymaire
<tb>

<tb>
<tb> du <SEP> mésencéphale <SEP> +
<tb> Noyau <SEP> rouge <SEP> ++
<tb> Bulbe <SEP> rachidien <SEP> ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ <SEP> ~~~~~~~~
<tb> Noyaux <SEP> du <SEP> pont <SEP> + <SEP> ++
<tb> Noyau <SEP> du <SEP> nerf <SEP> facial <SEP> ++
<tb> Reticularis
<tb> gigantocellularis <SEP> nuclei <SEP> + <SEP> ++
<tb> Trigeminal <SEP> nuclei <SEP> + <SEP> ++
<tb> Noyaux <SEP> vestibulaires <SEP> + <SEP> ++
<tb> Cervelet
<tb> Couche <SEP> moléculaire <SEP> du <SEP> cortex
<tb> cérébelleux
<tb> Noyaux <SEP> cérébelleux <SEP> profonds <SEP> + <SEP> ++
<tb> Cellules <SEP> de <SEP> Purkinje <SEP> +
<tb> Moelle <SEP> épinière
<tb> Neurones <SEP> moteurs <SEP> + <SEP> ++
<tb> Substance <SEP> blanche <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb>
- Absence de signal ; + Transcrits de cNCS-1 détectés, signal faible ; ++ Transcrits de cNCS-1 détectés, signal modéré ; +++ cNCS détecté, signal fort
Les animaux cNCS-1 Tg semblaient normaux et en bonne santé, leur durée de vie a été comparable à leurs homologues de portée du type WT et ne présentaient pas de grosses différences neurologiques ou locomotrices apparentes. Des analyses au microscope optique et histologiques de Tg26 et Tg200 n'ont pas révélé de différences anatomiques ou cellulaires majeures dans le système nerveux, et l'architecture de l'hippocampe et celle de la moelle épinière étaient normales. Une analyse détaillée des changements survenant au niveau de la NMJ de Tg26 et Tg200 au cours du développement post-natal a indiqué que le nombre total de synapses, la forme et la morphologie des plaques motrices, ainsi que la quantité de bourgeonnement nerveux étaient similaires chez leurs homologues de portée du type WT.

6. 3 Augmentation de la potentialisation à long terme hippocampique chez Tg26 et Tg200
Lors d'une stimulation de type bouffées thêta des collatéraux de Schaffer, les neurones pyramidaux en CA1

dans des tranches préparées à partir de l'hippocampe subissent un phénomène dit potentialisation à long terme (PLT). Pour étudier le rôle éventuel d'une surexpression de NCS-1 dans la facilitation synaptique, les niveaux de PLT chez Tg26, Tg200 et les homologues de portée WT ont été mesurés et comparés. Les tranches surexprimant NCS-1 ont eu une PLT sensiblement plus importante (Figure 8A). Comme mesurée 30 minutes après le stimulus initial, l'augmentation de la PLT était supérieure chez Tg200, par rapport à Tg26, et sensiblement plus importante chez Tg26 par rapport à WT. Ces observations pourraient être directement rattachées à la quantité relative de NCS-1 présent dans l'hippocampe (Figure 8B). Ces données laissaient fortement penser que l'augmentation de PLT observée dans les neurones de CAl était fonction de la dose de NCS-1, la quantité de NCS-1 la plus élevée se traduisant par une PLT plus importante. De plus, l'augmentation statistiquement significative de la PLT était présente depuis la survenue de la PLT et a duré aussi longtemps que 70 minutes après la stimulation initiale, ce qui laisse penser que l'effet de la surexpression de NCS-1 se produisait déjà pendant les premières phases de PLT.

Comme on sait que le déclenchement de la PLT dépend d'une manière déterminante de l'activation de récepteur NMDA (Bliss et Collingridge ; Nicoll et Malenka, 1995), un essai a été conduit afin de déterminer si l'augmentation de la PLT produite par le NCS-1 était ou non exercée par l'intermédiaire d'une régulation vers le haut de potentiels postsynaptiques excitateurs (PPSE) NMDAR-dépendants. Lorsque les réponses par bouffées, utilisées pour induire la PLT en la présence ou l'absence de l'antagoniste D-AP5 du

récepteur NMDA ont été analysées, une différence sensible sur les PPSE pouvait être observée entre Tg200 et les homologues de portée du type WT. La sommation des réponses à l'intérieur des bouffées était largement
5 plus importante chez Tg200 que chez WT (Figure 9A). La différence était particulièrement importante lorsque l'on comparait les dernières bouffées du train parmi les 5 utilisés pour induire une PLT. En résultat à ceci, la taille de la composante NMDA de ces réponses 10 par bouffées était également proportionnellement augmentée chez Tg200 (Figure 9B), indiquant que l'effet de NCS-1 sur la PLT était probablement exercé par l'intermédiaire d'une activation plus efficace des récepteurs NMDAR pendant la stimulation de bouffées 15 (Figures 9A et 9B). Cette observation laissait clairement penser à une modulation présynaptique de la facilitation par NCS-1. Comme représenté sur la figure 10, une facilitation avec des impulsions appariées s'est en fait avérée être augmentée d'une 20 manière qui dépendait de la dose de NCS-1, Tg200 étant meilleur que Tg26, lui-même meilleur que WT (Fig. 10A et 10B). Les différences observées étaient statistiquement significatives. L'augmentation de la facilitation était observée à tous les intervalles de 25 temps testés et n'était pas associée à un changement dans le déroulement de la facilitation (Figure 10B). Ce dernier résultat suggérait fortement un rôle présynaptique pour NCS-1. Prises conjointement, ces données suggéraient que l'augmentation de la PLT 30 hippocampique dans la région CAl et celle de la facilitation avec impulsions appariées entre les neurones de CA3 et de CA1 étaient fonction de la quantité de NCS-1 présente au niveau présynaptique.

De manière similaire, une quantité plus élevée de NCS-1 dans les neurones moteurs pourrait également contribuer à une augmentation de la libération des neurotransmetteurs au niveau de la NMJ. Pour vérifier cette hypothèse, des analyses des amplitudes des potentiels de plaque motrice (EPP) ont été réalisées avec Tg200, la lignée qui présentait le taux le plus élevé de NCS-1 au niveau de la NMJ. A des conditions physiologiques normales, une série de stimuli appliqués à un nerf moteur évoquera une dépression des amplitudes d'EPP pendant la série, un phénomène dénommé fatigue synaptique provoqué par la déplétion dans le groupe de vésicules prêtes à la fusion avec la membrane synaptique pour la libération des neurotransmetteurs.

En réponse à des séries de stimuli identiques, Tg200 a présenté, après normalisation, une dépression plus sévère que les témoins de type WT en utilisant la préparation de NMJ diaphragmique (Fig. 11A et 11B). Ces données indiquaient que la surexpression de NCS-1 augmentait la libération de neurotransmetteurs présynaptique et provoquait une déplétion rapide du groupe de vésicules synaptiques prêtes à être sécrétées au niveau de la NMJ. Le même phénomène de déplétion des vésicules à neurotransmetteurs se produit lorsque la concentration de calcium dans le bain extracellulaire est augmentée. Ces résultats laissaient supposer que la surexpression présynaptique de NCS-1 avait un effet similaire à une augmentation de la concentration en ions calcium extracellulaire et par la suite, à une augmentation de la signalisation du calcium intracellulaire.

6. 4 Amélioration des comportements d'apprentissage et de mémoire avec Tg26

Les études électrophysiologiques ont indiqué que NCS-1 facilitait la PLT dans l'hippocampe, une forme de plasticité synaptique qui joue un rôle majeur dans les processus d'apprentissage et de mémoire. Par conséquent, Tg26, Tg200 et les homologues de portée du type WT ont été étudiés en matière de fonctions neurologiques et cognitives. Des examens initiaux n'ont révélé aucun phénotype neurologique manifeste et les souris tant des lignées Tg26 que Tg200 présentaient une bonne santé générale et une croissance de poids corporel normale par rapport au type WT. Aucune différence de coordination motrice, d'aptitude à la nage, de fonctions musculaires et d'équilibre n'a été détectée et, de plus, aucune différence sensible n'a été notée entre les trois groupes en termes d'activité générale en champ libre.

Dans une expérience préliminaire dans un labyrinthe piscine en utilisant un protocole d'essais relativement intensif (c'est-à-dire 3 essais/bloc, 2 blocs/jour), tant les témoins de type WT que la lignée Tg26 ont montré un apprentissage spatial et de repérage équivalent, bien que la lignée Tg200 ait montré un déficit moyen en matière d'apprentissage spatial comme l'a révélé un essai d'exploration réalisé immédiatement après l'entraînement. Fait important, l'apprentissage indicé et les vitesses de nage étaient similaires entre les groupes. Il a donc été décidé de se concentrer sur la lignée Tg26, dans laquelle la surexpression de NCS-1 était davantage limitée à l'hippocampe, en spéculant sur le fait que l'expression plus large et quantitativement plus importante de NCS-1 chez Tg200 pouvait être préjudiciable aux performances cognitives. En utilisant un protocole d'essais espacés dans un labyrinthe piscine chez des souris

expérimentalement naïves, (c'est-à-dire 2 essais/blocs, 1 bloc/jour, 5 jours) , tant les souris de type WT que Tg26 ont présenté un niveau d'acquisition similaire (Figure 12A). Toutefois, un essai d'exploration réalisé 1 heure après le 5ème bloc d'essai a révélé une meilleure préférence spatiale pour l'emplacement de l'île dans la lignée transgénique Tg26 (Figure 12B).

Cinq autres blocs d'essais ont été réalisés (3ème semaine ; Figure 12C) et, à cette occasion, la lignée Tg26 était sensiblement plus rapide que les témoins du type WT en termes de latence pour localiser la plateforme de l'île. Les essais d'exploration réalisés après les 3ème et 5ème blocs pendant cette phase étaient cohérents avec un apprentissage amélioré chez les souris de type Tg26 (Figure 12D). Un essai d'exploration final a été réalisé 5 jours après la seconde phase (3eme semaine) et a indiqué une fois encore de meilleures performances chez les souris de type Tg26 par rapport au type WT (Figure 12E). A ce stade, les souris de type Tg26, mais pas les témoins du type WT, présentaient encore une préférence significative pour le secteur de l'île, ce qui révélait de meilleures aptitudes de rétention chez les animaux du type Tg26.

Pour étudier davantage les différences d'aptitude en matière d'apprentissage entre les souris de type Tg26 et WT, un test d'évitement actif conditionné a été réalisé. Un autre groupe de souris expérimentalement naïves a été testé en matière d'évitement face à un choc intense signalé par un stimulus visuel conditionné. Une fois encore, les souris de type Tg26 ont présenté de meilleures performances d'apprentissage pendant l'entraînement par rapport aux souris du type WT (Figure 13A). Les plus grandes différences entre les

deux lignées ont été détectées au 3ème et 4ème bloc d'essais. A la 5ème séance, les souris de type Tg26 avaient presque atteint un niveau de performances maximum, alors que les souris du type WT atteignaient un niveau de performances similaire au Sème bloc d'essais. Les souris de type Tg26 ont également présenté des latences d'évitement sensiblement plus faibles par rapport aux souris du type WT (Figure 13B).

Par contre, aucune différence en matière de latences d'échappement n'a été détectée entre les souris de type WT et Tg26, ce qui était cohérent avec le fait que les deux groupes présentaient des réponses similaires face à la secousse électrique. Pour évaluer en plus les éventuelles différences de perception de la douleur entre les deux lignées, une analyse de seuil de choc a été réalisée à la fin du test d'évitement actif. Les niveaux de choc pour lesquels pour la première fois les souris de type WT et Tg26 détectaient le choc (tressaillement) ou émettaient des vocalisations étaient similaires (tressaillement : WT = 0,15 0,0 mA et Tg26 = 0,14 0,1 mA ; vocalisations : WT = 0,42 0,0 mA et Tg26 = 0,40 0,1 mA). Ceci laisse penser que l'aptitude d'apprentissage améliorée des souris de type Tg26 n'est pas une conséquence de variations au niveau de la perception de la douleur provoquées par une surexpression de NCS-1.

Comme des différences d'anxiété ou de réactivité au stress pourraient être une cause sous-jacente à des différences en matière de performances d'apprentissage entre les souris de type Tg26 et WT, des réponses à des stimuli provoquant l'aversion ont également été déterminées et comparées. Tout d'abord, le comportement d'évitement inné des souris de type Tg26 et WT a été étudié pour un environnement lumineux en utilisant le

test de lumière-obscurité. Aucune différence dans les mesures d'anxiété n'a été détectée entre les- deux lignées. Le temps passé dans le compartiment éclairé et le nombres de passages entre le compartiment éclairé et le compartiment sombre étaient comparables pour les deux lignées. Les réactions de défense des animaux ont également été comparées face à divers stimuli acoustiques (74,82, 90 et 110 dB). Une fois encore, les souris de type Tg26 et WT ont présenté un seuil de réflexe de sursaut similaire. Dans le même mode opératoire, nous avons étudié si la surexpression de NCS-1 avait ou non une influence sur l'inhibition d'une pré-impulsion (PPI) de sursaut acoustique, qui dépend aussi d'une fonction hippocampique. PPI est la modulation du réflexe de sursaut par une faible préimpulsion et est considérée comme un indice du mécanisme de fermeture et d'ouverture des canaux ioniques sensorimoteur qui est le procédé par lequel des voies inhibitrices filtrent des stimuli multiples et permettent la concentration de l'attention sur un stimulus. Aucune différence n'a été détectée dans les niveaux de PPI entre les souris de type Tg26 et leurs homologues de portée de type WT à n'importe laquelle des intensités de pré-impulsion testées, 74,82 et 90 dB.

6. 5 Résumé
Dans les expériences décrites ci-dessus, ont été testées deux lignées de souris transgéniques, Tg26 et Tg200, surexprimant le détecteur du calcium neuronal 1 des vertébrés pour étudier la plasticité synaptique et la mémoire et l'apprentissage associatif. La lignée Tg26 a été sélectionnée parce que le taux de surexpression de NCS-1 est moyen et se limite en grande

partie à l'hippocampe, alors que la lignée Tg200 a été sélectionnée parce que la surexpression de NCS-1 atteignait un niveau beaucoup plus élevé et avait une distribution plus ample. Fait intéressant, Tg26 a montré une amélioration de la PLT, et un meilleur apprentissage spatial, lors de l'utilisation du labyrinthe piscine de Morris et des tests d'évitement actifs, par rapport au type WT. Les animaux de type Tg26 font preuve d'une acquisition plus rapide d'apprentissage d'évitement actif par rapport aux témoins homologues de portée du type WT. Au niveau cellulaire, la surexpression de NCS-1 s'est traduite par une augmentation dose-dépendante de la PLT dans la région CA1 de l'hippocampe. Il est tentant d'associer les meilleures aptitudes à apprendre des souris de type Tg26 à l'augmentation durable de l'efficacité synaptique révélée dans l'hippocampe. Bien que cette augmentation de la PLT n'ait été déterminée que dans la région CAl de l'hippocampe, il est fort vraisemblable que la facilitation NCS-1-dépendante puisse aussi avoir lieu dans le dentate gyrus, et dans des neurones d'autres régions CA de l'hippocampe où NCS-1 était surexprimé. Les présentes découvertes prolongent des études précédentes décrivant des souris habiles qui ont un taux modifié d'expression de composants synaptiques clé importants au déclenchement ou au maintien de la potentialisation à long terme, tels que la sous-unité NR2B du récepteur de type NMDA (Tang et al., 1999), l'activateur du plasminogène de type tissu (tPA) (Madani et al., 1999), la protéine GAP-43 associée à la croissance (Routtenberg et al., 2000), la calcineurine (Malleret et al., 2001), où une augmentation de la PLT était corrélée à des performances améliorées dans les tâches d'apprentissage spatial. De plus, les données

obtenues conformément à la présente invention étayent de nombreuses autres observations où des souris présentant une altération ou un bouleversement génétique d'éléments synaptiques cruciaux tels que aCaMKII, CREB ou NR1, présentaient une PLT plus faible, voire absente, conjointement avec des aptitudes en matière d'apprentissage et de mémoire défectueuses (Giese et al., 1998 ; et al., 1996 ; et al., 1992 ; et al., 1992)(Bourtchuladze et al., 1995) (Tsien et al., 1996 ; et al., 1996).

Toutefois, les données obtenues avec d'autres souris génétiquement ciblées ont mis en doute le lien entre la PLT hippocampique et les performances en matière de tâches d'apprentissage spatial. En fait, les animaux à inactivation de AMPA récepteur GluRl, GluR2, PSD-95, OFQ ou PTP delta ont été décrits dans lesquels une expression altérée de la PLT n'avait pas été associée à de plus faibles performances dans l'apprentissage hippocampique-dépendant (Jia et al., 1996) (Zamillo et al., 1999) (Migaud et al., 1999) (Koster et al. 1999 ; Uetani et al., 2000 ; Wei et Xie, 1999) (revu dans (Picciotto et Wickman, 1998)). Par exemple, dans les souris de type Tg200 qui présentaient une surexpression plus forte et plus large de NCS-1 dans le cerveau, l'augmentation de la PLT en CA1 ne corrélait pas avec des performances d'apprentissage spatial améliorées qui dépendent d'interactions fonctionnelles complexes (compétition et synergisme) entre l'hippocampe et d'autres structures cérébrales (pour rappel, voir (Kim et Baxter, 2001 ; et Ammassari-Teule, 1998) ). Il est donc possible que les performances d'apprentissage limitées de la lignée Tg200 ait pu être liée à la surexpression de NCS-1 dans d'autres structures corticolimbiques connues pour exercer un

contrôle inhibiteur sur le traitement des informations spatiales.

Fait intéressant, l'ampleur de la facilitation de la PLT était corrélée à la quantité de NCS-1 présent dans l'hippocampe. Cette augmentation NCS-1-dépendante de la PLT pourrait très vraisemblablement être exercée par l'intermédiaire d'un mécanisme présynaptique (Figure 14). Des observations similaires ont été obtenues avec C. elegans dans les exemples 3 à 5. Un effet présynaptique de NCS-1 était également mentionné au niveau de la NMJ de mouches et de grenouilles (Olafsson et al., 1995 ; et al., 1994). Au niveau de la NMJ, toutefois, une dépression synaptique est induite par une diminution progressive du nombre moyen de libération de quanta transmetteurs par des potentiels d'action. Soit la déplétion dans le groupe de vésicules libérables (Mallart et Martin, 1968), soit la modulation de la libération à partir du l'extrémité présynaptique par l'adénosine (Redman et Silinsky, 1994) a été proposé pour médier la dépression synaptique au niveau de la NMJ. Les présentes données sont par conséquent cohérentes avec l'idée selon laquelle, dans les terminaisons nerveuses présynaptiques des neurones moteurs surexprimant NCS-1, le flux/transmission des signaux de Ca2+ est augmenté, ou la séquestration de Ca2+ est altérée par rapport à WT. Le nombre augmenté de libération de quanta transmetteurs pendant les potentiels d'action initiaux est techniquement difficile à déterminer au niveau de la NMJ des vertébrés, mais il est vraisemblable qu'il induise une fatigue synaptique ultérieure et des réponses diminuées. Des mécanismes de transmission de signaux calcium augmenté par NCS-1 pourraient aussi être en jeu pendant la PLT dans des tranches

hippocampiques d'animaux NCS-1 transgéniques, comme montré ici. De plus, les présentes données suggèrent un rôle présynaptique pour NCS-1, mais n'excluent pas un effet postsynaptique, puisque NCS-1 est clairement présent des deux côtés de nombreuses synapses (Martone et al., 1999). En l'absence de voies cellulaires ou moléculaires NCS-1-dépendantes prouvées in vivo, les mécanismes proposés représentent encore une hypothèse de travail. La NO-synthase, la PDE, la calcineurine sont parmi les cibles connues pour être régulées par le NCS-1 in vitro (Schaad et al., 1996). Il a également été montré que le NCS-1 interagissait avec une phosphatidylinositol 4-OH kinase (Zhao et al., 2001) et se substituait aux canaux du potassiun CaM-dépendants in vivo (Schaad et al., 1996). Tout ceux-ci représentent donc des cibles potentielles responsables d'une médiation de l'effet de NCS-1 observé in vivo. De plus, un étude très récente a impliqué le NCS-1 dans la régulation de canaux de calcium Ca2+ de type P/Q par l'intermédiaire d'une tyrosine kinase de famille Src dans des cellules cultivées (Weiss et Burgoyne, 2001).

Malgré la fatigue synaptique révélée par enregistrement d'électrophysiologie au niveau de NMJ, il a été découvert que les deux lignées transgéniques avaient des performances motrices générales normales comme déterminé en utilisant la force musculaire, l'activité locomotrice ou les aptitudes à la nage. Les changements neurophysiologiques produits par une surexpression de NCS-1 semblent par conséquent trop subtil pour être détectés au niveau du comportement. Il devrait également être souligné que chez les souris de lignée Tg26, la surexpression de NCS-1 n'a eu aucun effet sur les comportements émotionnels. Ces souris présentaient des réactions de défense normales face à des stimuli

acoustiques et des réponses néophobiques normales dans le test de lumière-obscurité. Ceci implique que la meilleure aptitude à apprendre des souris de type Tg26 n'est pas une conséquence de variations de la réactivité au stress provoquées par la surexpression de NCS-1 dans l'hippocampe. Cette observation est importante étant donné le rôle central de l'hippocampe dans la modulation des comportements liés au stress et à l'anxiété (Gray, 1982). Il semble donc que dans l'hippocampe, NCS-1 puisse être un composant essentiel du circuit nerveux favorisant les processus d'apprentissage et de mémoire. En accord avec cette hypothèse, il a récemment été montré que l'induction de l'ARNm de NCS-1 fait partie de la réponse transcriptionnelle associée à la plasticité neuronale activité-dépendante in vivo (Genin et al., 2001).

Considérées conjointement, les présentes découvertes suggéreraient que la surexpression de NCS-1 dans l'hippocampe puisse faciliter les processus d'apprentissage et de mémoire en influençant de nombreuses fonctions neuronales d'importance comprenant la libération de neurotransmetteurs, la transmission de signaux intracellulaires, la plasticité synaptique et les réactions en cascade d'expression génique nécessaires à la formation de nouvelles mémoires.

Exemple 7 : Souris à inactivation du gène de NCS-1 7. 1 Modes opératoires 7.1.1 Production de souris à inactivation du gène de NCS-1
L'exon 1 du gène de NCS-1 de souris a fait l'objet d'une disruption en étant remplacé par une cassette à

gène rapporteur LacZ. Le produit de recombinaison de ciblage est représenté sur la figure 15A. La figure 15B montre le ciblage d'exon 1 ainsi que la localisation des sondes utilisées pour la détermination d'une recombinaison homologue réussie par buvardage de Southern. Sur la figure 15C, le produit de recombinaison de contrôle PCR-positif est représenté. La figure 15D montre une fois encore le ciblage avec la localisation des amorces Neol et Ctl5 pour l'analyse par PCR d'une recombinaison homologue réussie.

7.1.2 Etude du comportement
Des souris présentant une inactivation de gène sont testées pour en contrôler les anomalies de comportement dans des tests comprenant le labyrinthe piscine de Morris, le conditionnement de peur, l'évitement actif et passif comme décrit ci-dessous. De plus, leurs niveaux généraux en matière de, par exemple, activité locomotrice, cognition, mémoire, apprentissage, peur, anxiété sont évalués. Les souris ont été pesées toutes les semaines et leur apparence générale contrôlée. Toutes les souris sont logées individuellement.

Tests neurologiques
Activité locomotrice : Les souris sont placées pendant une période de 1 heure dans une nouvelle chambre d'essai, comprenant une boîte en Plexiglas (20 cm x 20 cm x 27 cm) avec une litière de sciure au sol. Le mouvement des animaux est enregistré en utilisant un système de surveillance électronique (Omnitech Electronics Inc., Columbus, Ohio, EtatsUnis). Le mouvement de l'animal se traduit par une interruption d'un alignement de photo-faisceaux à

partir de sources infrarouges situées verticalement et horizontalement, placées autour de la chambre d'essai. La distance totale parcourue (cm) et le nombre de fois où la souris se dresse sont mesurés.

Man#uvre sur fil métallique : les souris sont placées par les pattes de devant sur une tige métallique en hauteur et la latence à la chute est notée. Le temps limite est de 60 secondes et la meilleure notation à partir de 3 tentatives est enregistrée.

Force de préhension : on force les souris à tirer sur une jauge de contrainte et le point du lâchement est enregistré. La meilleure notation à partir de 5 tentatives est enregistrée.

Essai de nage sur 1 mètre : les souris sont placées dans un bassin rectiligne (1 m de long x 6 cm de large). La latence pour nager la distance et grimper sur la plate-forme est notée. Les souris reçoivent 3 essais sur 3 jours consécutifs et le temps le plus rapide est enregistré.

Tige tournante : Les souris sont placées sur une tige tournant à vitesse constante et la latence jusqu'à la chute est notée. Le temps maximum est de 120 secondes et la meilleure notation à partir de 3 essais est relevée. 2 vitesses sont utilisées : 16 tr/min, 32 tr/min.

De plus, la température corporelle, l'aspect du pelage, les signes sécrétoires, la posture du corps sont également notés.

Labyrinthe en Y
Des souris sont placées dans un labyrinthe en Y fait en "perpex" noir (chaque bras fait 53 cm de long, 15 cm de large et 30 cm de haut) pendant 5 minutes. Une caméra est placée au dessus du labyrinthe et l'expérimentateur observe l'animal sur un écran dans une pièce adjacente. Le nombre d'entrée dans un bras et leur séquence d'entrée sont notés pour calculer une mesure d'alternance.

Labyrinthe piscine de Morris
Le labyrinthe piscine comprend un bassin circulaire gris (1 m de diamètre) rempli d'eau rendue opaque par addition d'une solution de latex (E-308 ; Induchem, Voletswil, Suisse). La température de la piscine est maintenue à 21 1 C. Pour la tâche de plate-forme cachée, la plate-forme d'échappement (8 cm de diamètre) est positionnée 1 cm en dessous du niveau de l'eau au centre d'un des secteurs de type quadrant de la piscine. Pour les tâches indicées, la position de la plate-forme est signalée par addition d'un petit drapeau noir positionné au centre de la plate-forme submergée. Les parois entourant le labyrinthe piscine comportent des affiches et des drapeaux qui servent d'indices visuels et sont visibles pendant tous les stades de l'entraînement et des essais. Le déplacement de la souris à l'intérieur de la piscine est suivi et analysé avec un système de traçage vidéo informatisé (HVS Image, Hampton, Royaume-Uni).

Pour l'entraînement indicé, les souris sont placées dans la piscine en face du bord au niveau d'une de quatre positions de départ (NE, SE, SO, NO) et doivent localiser la plate-forme comportant un drapeau dont la position varie avec les essais. Chaque souris

reçoit un total de 12 essais (trois essais par bloc, 2 blocs par jour, durée : 2 jours). Les intervalles entre les essais durent en moyenne 10 minutes et la longueur d'essai maximum est de 60 secondes. Si des souris ne parviennent pas à trouver la plate-forme dans les 60 secondes, elles sont guidées vers l'emplacement de celle-ci par l'expérimentateur. On laisse les souris rester sur la plate-forme pendant une période de 10 secondes avant de les enlever et de les replacer dans leur cage. La tâche indicée est suivie de la tâche de positionnement, dans laquelle les souris doivent localiser une plate-forme cachée submergée dont la position est invariable pendant tout l'entraînement.

L'emplacement de la plate-forme est équilibré au sein des groupes. Chaque souris reçoit 8 blocs d'essais d'entraînement sur quatre jours consécutifs (trois essais par bloc, temps comme pour le test indicé) dans lesquels elles sont placées dans la piscine au niveau d'une des quatre positions de départ. On les laisse localiser la plate-forme cachée. Une évaluation de l'apprentissage spatial est réalisé dans des essais d'exploration effectués à la fois 30 minutes après le 4ème bloc et 24 heures après le dernier essai. Dans chaque essai d'exploration, la plate-forme est enlevée de la piscine et le trajet à la nage parcouru par chaque souris est enregistré sur une période de 60 secondes.

Evitement actif
Des souris sont placées dans une chambre à 2 compartiments à l'intérieur de laquelle elles peuvent passer librement entre les compartiments (San Diego Instruments, Etat-Unis). Chaque essai commence du côté alors occupé par la souris que l'on éclaire avec une

lumière de 10 secondes (CS), cette lumière étant utilisée pour signaler un choc intense (0,2 mA) d'une durée maximum de 20 s (NB. Les souris ne reçoivent jamais cette durée de choc, car soit elles s'échappent au cours de la 1ère seconde dans l'autre compartiment (sans choc), soit elles apprennent à éviter complètement le choc). Ceci est suivi d'une période de repos variable (20 s en moyenne, intervalle entre 15 et 25 s) (pas de lumière) pendant laquelle la souris peut explorer librement la chambre. Suite à cette période de repos, l'essai suivant commence. Un choc peut être évité soit en s'abritant en passant dans le compartiment d'à côté pendant la période CS, (c'est-àdire évitement), soit en s'échappant à un moment quelconque pendant la présentation du choc. Dix séances d'essai quotidiennes sont exécutées, chaque séance comprenant 20 essais. La mesure dépendante est le % d'évitement.

7. 2 Résumé
Comme la surexpression de NCS-1 augmente la potentialisation à long terme (PLT) et améliore les phénotypes cognitifs avec des aptitudes d'apprentissage et de mémoire meilleures (sur la base d'analyses électrophysiologiques et comportementales), on s'attend à ce qu'une lignée de souris dans laquelle l'expression du gène de NCS-1 est absente (souris à inactivation de gène ncs-1) ait le phénotype inverse comprenant moins de mémoire et d'apprentissage, et des niveaux de PLT plus faibles ou modifiés.

18 souris chimères présentant de 10 à 95 % de chimérisme ont été obtenues. Ces souris ont été croisées pour obtenir des fondateurs hétérozygotes.

Dans ces souris, l'exon 1 du gène ncs-1 endogène est

rompu ("disrupted") et n'est donc plus fonctionnel.

Ceci provoquera l'absence de la protéine NCS-1 dans le cerveau. Ces souris sont testées en matière d'anomalies de comportement (c'est-à-dire labyrinthe piscine de Morris, conditionnement de peur, évitement actif et passif) et évaluées pour leur niveaux généraux d'activité locomotrice, de cognition, de mémoire, d'apprentissage, de peur, d'anxiété, que l'on compare au niveau de souris de type sauvage et de souris NCS-1 transgéniques. Leur niveau de PLT/LTD (dépression à long terme) dans l'hippocampe et d'autres régions du cerveau est déterminé et comparé avec les animaux de type sauvage et NCS-1 transgéniques. De plus, les souris à inactivation du gène de NCS-1 sont utilisées pour explorer le rôle de NCS-1 dans le développement et la synaptogénèse, et pour déterminer sa fonction biochimique, par exemple la confirmation et caractérisation de ses partenaires de liaison.

Références Bartlett, S. E., Reynolds, A. J., Weible, M., Jeromin, A., Roder, J., et Hendry, I. A. (2000). Ptdlns 4kinasebeta and neuronal calcium sensor-1 co-localize but may not directly associate in mammalian neurons. J.

Neurosci Res 62,216-24 Bliss, T. V., et Collingridge, G. L. (1993) A synaptic model of memory : potentiation in the hippocampus. Nature 361,31-9.

Bourne, Y., Dannenberg, J. Pollman, V., Marchot, P., et Pongs, O. (2001). Immunocytochemical localization and crystal structure of human frequenin (neuronal calcium sensor 1). J Biol Chem 276,11949-55.

Bourtchuladze, R., Frenguelli, B., Blendy, J., Cioffi, D., Schutz, G., et Silva, A.J. (1995). Deficient longterm memory in mice with a targeted mutation of the cAMP-responsive element-binding protein. Cell 83,979- 92.

Braunewell, K., Riederer, P., Spilker, C., Gundelfinger, E. D., Bogerts, B., et Bernstein, H.G. (2001). Abnormal localization of two neuronal calcium sensor proteins, visinin-like proteins (vilips)-1 and-3, in neocortical brains areas of Alzheimer disease patients. Dement Geriatr Cogn Disord 12, 110-6.

Braunewell, K. H., et Gundelfinger, E.D.(1999).

Intracellular neuronal calcium sensor proteins : a family of EF-hand calcium-binding proteins in search of a function. Cell Tissue Res 295,1-12.

Burgoyne, R. D., et Weiss, J.L. (2001). The neuronal calcium sensor family of Ca2±binding proteins. Biochem J 353, 1-12.

Caroni, P. (1997). Overexpression of growth-associated proteins in the neurons of adult transgenic mice. J Cell Biol 136,679-92.

Caroni, P., Aigner, L., et Schneider, C. (1997).

Intrinsic neuronal determinants locally regulate extrasynaptic and synaptic growth at the adult neuromuscular junction. J Cell Biol 136, 679-92.

Cox, J. A., Durussel, I., Comte, M., Nef, S., Nef, P., Lenz, S. E., et Gundelfinger, E. D. (1994). Cation binding and conformational changes in VILIP and NCS-1, two neuron-specific calcium-binding-proteins. J Biol.

Chem. 269, 32807-13.

De Castro, E., Nef, S., Fiumelli, H., Lenz, S.E., Kawamura, S., et Nef, P. (1995). Regulation of rhodopsin phosphorylation by a family of neuronal calcium sensors. Biochem Biophys Res Commun 216, 133- 40.

Fontana, G., et Blaustein, M.P. (1993). Calcium buffering and free Ca2+ in rat brain synaptosomes. J Neurochem 60,843-50.

Geiser, J.R., van Tuinen, D., Brockerhoff, S. E., Neff, M.M., et Davis, T.N. (1991). Can calmodulin function without binding calcium ? 65,949-59.

Genin, A., Davis, S., Meziane, H., Doyere, V., Jeromin, A., Roder, J. Mallet, J., et Laroche, S. (2001).

Regulated expression of the neuronal calcium sensor-1 gene during long-term potentiation in the dentate gyrus in vivo. Neuroscience 106, 571-7.

Giese, K. P., Fedorov, N. B., Filipkowski, R. K., et Silva, A.J. (1998). Autophosphorylation at Thr286 of the alpha calcium-calmodulin kinase II in LTP and learning. Science 279, 870-3.

Gomez, M., De Castro, E., Guarin, E., Sasakura, H., Kuhara, A., Mori, I., Bartfai, T., Bargmann, C.I., et Nef, P. (2001) . Ca(2+) Signaling via the Neuronal Calcium Sensor-1 Regulates Associative Learning and Memory in C. elegans. Neuron 30,241-8.

Gray, J.A. (1982). The Neuropsychology of Anxiety : enquiry into the function of the septo-hippocampal System." (Oxford: Oxford University press).

Hedgecock, E. M., et Russell, R. L. (1975). Normal and mutant thermotaxis in the nematode Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A 72,4061-5.

Hendricks, K.B., Wang, B. Q., Schnieders, E. A., et Thorner, J. (1999). Yeast homologue of neuronal frequenin is a regulator of phosphatidylinositol-4-OH kinase. Nat Cell Biol 1, 234-41.

Higgins, G.A., Grottick, A.J., Ballard, T.M., Richards, J. G., Messer, J., Takeshima, H., Pauly-Evers, M., Jenck, F. , Adam, G. , et Wichmann, J. (2001) . Influence of the selective ORL1 receptor agonist, Ro64-6198, on

rodent neurological function. Neuropharmacology 41,97- 107.

Hobert, 0., Mori, I., Yamashita, Y., Honda, H., Ohshima, Y., Liu, Y., et Ruvkun, G. (1997). Regulation of interneuron function in the C. elegans thermoregulatory pathway by the ttx-3 LIM homeobox gene. Neuron 19, 345-57.

Hogan, B., Beddington, R., Costantini, F., et Lacy, E.

(1994). Manipulating the Mouse Embryo: A laboratory Manual., C. S.H.L. Press, ed. (Cold Spring Harbor, NY.

Iacovelli, L., Sallese, M., Mariggio, S., et de Blasi, A. (1999). Regulation of G-protein coupled receptor kinase subtypes by calcium sensor proteins. Faseb J 13, 1-8.

Jia, Z., Agopyan, N., Miu, P., Xiong, Z., Henderson, J., Gerlai, R., Taverna, F.A., Velumian, A., MacDonald, J., Carlen, P., Abramow-Newerly, W., et Roder, J. (1996). Enhanced LTP in mice deficient in the AMPA receptor GluR2. Neuron 17, 945-56.

Kelley, K.A., Friedrich, V.L., Jr., Sonshine, A., Hu, Y., Lax, J., Li, J., Drinkwater, D., Dressler, H., et Herrup, K. (1994). Expression of Thy-1/lacZ fusion genes in the CNS of transgenic mice. Brain Res Mol Brain Res 24,261-74.

Kew, J. N., Koester, A., Moreau, J. L., Jenck, F., Ouagazzal, A.M., Mutel, V., Richards, J. G., Trube, G., Fisher, G., Montkowski, A., Hundt, W., Reinscheid, R. K., Pauly-Evers, M., Kemp, J.A., et Bluethmann, H.

(2000). Functional conséquences of reduction in NMDA receptors glycine affinity in mice carrying targeted point mutations in the glycine binding site. J Neurosci 20,4037-49 Kim, J. J., et Baxter, M.G. (2001). Multiple brainmemory systems: the whole does not equal the sum of its parts. Trends Neurosci. 24,324-30.

Koster, A., Montkowski, A., Schulz, S., Stube, E.M., Knaudt, K., Jenck, F., Moreau, J. L., Nothacker, H.P., Civelli, 0., et Reinscheid, R. K. (1999). Targeted disruption of the orphanin FQ/nociceptin gene increases stress susceptibility and impairs stress adaptation in mice. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 10444-9.

Madani, R., Hulo, S., Toni, N., Madani, H., Steimer, T., Muller, D., et Vassalli, J.D. (1999). Enhanced hippocampal long-term potentiation and learning by increased neuronal expression of tissue-type plasminogen activator in transgenic mice. Embo J 18, 3007-12.

Mallart, A., et Martin, A. R. (1968). The relation between quantum content and facilitation at the neuromuscular junction of the frog. J Physiol 196, 593- 604.

Malleret, G., Haditsch, U., Genoux, D., Jones, M.W., Bliss, T.V., Vanhoose, A.M., Weitlauf, C., Kandel, E. R., Winder, D. G., et Mansuy, I.M. (2001). Inducible and reversible enhancement of learning, memory and long-term potentiation by genetic inhibition of calcineurin. Cell 104, 675-86.

Martin, A.R. (1976). The effect of membrane capacitance on non-linear summation of synaptic potentials. J Theor Biol 59, 179-87.

Martone, M. E., Eldelmann, V. M., Ellisman, M.H. et Nef, P. (1999). Cellular and subcellular distribution of the calcium-binding protein NCS-1 in the central nervous system of the rat. Cell Tissue Res 295, 395-407.

Maruyama, K., Mikawa, T., et Ebashi, S. (1984).

Detection of calcium binding proteins by 45Ca autoradiography on nitrocellulose membrane after sodium dodecyl sulfate gel electrophoresis. J. Biochem (Tokyo) 95, 511-9.

Mayford, M., Bach., M. E., Huang, Y.Y., Wang, L., Hawkins, R. D., et Kandel, E. R. (1996). Control of memory formation through regulated expression of a CaMKII transgene. Science 274,1678-83.

McFerran, B. W., Graham, M. E., et Burgoyne, R. D. (1998).

Neuronal Ca2+ sensor 1, the mammalian homologue of frequenin, is expressed in chromaffin and PC12 cells and regulates neurosecretion from dense-core granules.

J Biol Chem 273,22768-72 Mello, C. C., Kramer, J.M., Stinchcomb, D., et Ambros, V. (1991). Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and intégration of transforming séquences. Embo J 10, 3959-70.

Migaud, M., Charlesworth, P., Dempster, M. Webster, L. C., Watabe, A.M., Makhinson, M., He, Y., Ramsay, M.F., Morris, R. G., Morrison, J.H., O'Dell, T. J., et

Grant, S.G. (1999). Enhanced long-term potentiation and impaired learning in mice with mutant postsynaptic density-95 protein. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 435- 40.

Milner, B., Squire, L. R., et Kandel, E. R. (1998). Cognitive neuroscience and the study of memory. Neuron 20,445-68.

Mori, I. (1999). Genetics of chemotaxis and thermotaxis in the nematode Caenorhabditis elegans. Annu Rev Genet 33,399-422.

Mori, I., et Ohshima, Y. (1995). Neural regulation of thermotaxis in Caenorhabditis elegans. Nature 376,344- 8.

Muller, D., Wang, C., Skibo, G., Toni, N., Cremer, H., Calaora, V., Rougon, G., et Kiss, J.Z. (1996). PSA-NCAM is required for activity-induced synaptic plasticity.

Neuron 17,413-22.

Nef, S., Fiumelli, H., de Castro, E., Raes, M. B., et Nef, P. (1995). Identification of neuronal calcium sensor (NCS-1) possibly involved in the regulation of receptor phosphorylation. J Recept Signal Transduct Res 15, 365-78.

Nef., P. (1996). Neuron spécifie binding calcium sensors: The NCS subfamily. In Guidebook to the calcium-binding proteins, M. R. Celio, ed. (Oxford: Sambrook and Tooze Publication), pp 94-98,112-114.

Nicoll, R. A., et Malenka, R. C. (1995). Contrasting properties of two forms of long-term potentiation in the hippocampus. Nature 377,115-8.

Olafsson, P., Wang, T., et Lu, B. (1995). Molecular cloning and functional characterization of the Xenopus Ca(2+)-binding protein frequenin. Proc Natl Acad Sci U S A 92, 8001-5.

Paterlini, M., Revilla , V., Grant, A. L., et Wisden, W.

(2000). Expression of the neuronal calcium sensor protein family in the rat brain. Neuroscience 99, 205- 16.

Plasterk, R. H. (1995). Reverse genetics : fromgene séquence to mutant worm. Methods Cell Biol 48,59-80.

Picciotto, M. R., et Wickman, K. (1998). Using knockout and transgenic mice to study neurophysiology and behavior. Physiol Rev 78,1131-63.

Pongs, 0., Lindemeier, J., Zhu, X.R., Theil, T., Engelkamp, D., Krah-Jentgens, I., Lambrecht, H.G., Koch, K.W., Schwemer, J., Rivosecchi, R., et al.

(1993). Frequenin - a novel calcium-binding protein that modulates synaptic efficacy in the Drosophila nervous system. Neuron 11, 15-28.

Poulain, C., Ferrus, A., et Mallart, A (1994).

Modulation of type A K+ current in Drosophila larval muscle by internal Ca2+; effects of the overexpression of frequenin. Pflugers Arch 427,71-9.

Putkey, J.A., Sweeney, H.L., et Campbell, S.T. (1989). Site-directed mutation of the trigger calcium-binding sites in cardiac troponin C. J Biol Chem 264, 12370-8.

Redman, R. S., et Silinsky, E.M. (1994). ATP released together with acetylcholine as the mediator of neuromuscular depression at frog motor nerve endings. J Physiol 477,117-27.

Rivosecchi, R., Pongs, 0., Theil, T., et Mallart, A.

(1994). Implication of frequenin in the facilitation of transmitter release in Drosophila. J Physiol 474,223- 32.

Rossi-Arnaud, C., et Ammassari-Teule, M. (1998). What do comparative studies of inbred mice add to current investigations on the neural basis of spatial behaviors ? Exp Brain Res 123, 36-44.

Routtenberg, A., Cantallops, I., Zaffuto, S., Serrano, P., et Namgung, U. (2000). Enhanced learning after genetic overexpression of a brain growth protein. Proc Natl Acad Sci U S A 97,7657-62.

Schaad, N. C., De Castro, E., Nef, S., Hegi, S., Hinrichsen, R., Martone, M.E., Ellisman, M.H., Sikkink, R., Rusnak, F., Sygush, J., et Nef, P. (1996). Direct modulation of calmodulin targets by the neuronal calcium sensor NCS-1. Proc Natl Acad Sci U S A 93, 9253-8.

Schaeren-Wiemers, N., et Gerfin-Moser, A. (1993). A single protocol to detect transcripts of various types and expression levels in neural tissue and cultured

cells : in situ hybridisation using digoxigenin-labelled cRNA probes. Histochemistry 100,431-40.

Schnurra, I., Bernstein, H.G., Riedered, P., et Braunewell, K.H. (2001). The Neuronal Calcium Sensor Protein VILIP-1 Is Associated with Amyloid Plaques and Extracellular Tangles in Alzheimer's Disease and Promotes Cell Death and Tau Phosphorylation in Vitro : Link between Calcium Sensors and Alzheimer's Disease ? Neurobiol Dis 8,900-9.

Silva, A., J., Paylor, R., Wehner, J.M., et Tonegawa, S. (1992). Impaired spatial learning in alpha-calciumcalmodulin kinase II mutant mice. Science 257,206-11.

Silva, A., J., Stevens, C.F., Tonegawa, S., et Wang, Y.

(1992). Deficient hippocampal long-term potentiation in alpha-calcium-calmodulin kinase II mutant mice. Science 257,201-6 Tang, Y.P., Shimizu, E., Dube, G. R., Rampon, C., Kerchner, G.A., Zhuo, M., Liu, G., et Tsien, J.Z.

(1999). Genetic enhancement of learning and memory in mice. Nature 401,63-9.

Tsien, J. Z., Chen, D. F., Gerber, D., Tom, C., Mercer, E. H., Anderson, D. J., Mayford, M., Kandel, E. R., et Tonegawa, S. (1996). Subregion- and cell typerestricted gene knockout in mouse brain. Cell 87,1317- 26.

Tsien, J. Z., Huerta, P.T., et Tonegawa, S. (1996). The essential role of hippocampal CA1 NMDA receptor-

dependent synaptic plasticity in spatial memory. Cell 87,1327-38.

Uetani, N., Kato, K., Ogura, H., Mizuno, K., Kawano, K., Mikoshiba, K., Yakura, H., Asano, M., et Iwakura, Y. (2000). Impaired learning with enhanced hippocampal long-term potentiation in PTP delta-déficient mice.

Embo J 19, 2775-85.

Wei, W.Z., et Xie, C. W. (1999).Orphanin FQ suppresses NMDA receptor-dependent long-term depression and depotentiation in hippocampal dentate gyrus. Learn Mem 6, 467-77.

Weiss, J. L., et Burgoyne, R. D. (2001). Voltageindependent inhibition of P/Q-type Ca2+ channels in adrenal chromaffin cells via a neuronal Ca2+ sensor-1dependent pathway involves Src-family tyrosine kinase.

J Biol Chem 2,2.

Wittenburg, N., et Baumeister, R. (1999). Thermal avoidance in Caenorhabditis elegans: an approach to the study of nociception. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 10477-82.

Yazejian, B., Sun, X.P., et Grinnell, A.D. (2000).

Tracking presynaptic Ca2+ dynamics during neurotransmitter release with Ca2±activated K+ channels. Nat Neurosci 3,566-71.

Yu, S., Avery, L., Baude, E. , et Garbers, D.L. (1997). Guanylyl cyclase expression in spécifie sensory neurons: a new family of chemosensory receptors. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 3384-7.

Zamanillo, D., Sprengel, R., Hvalby, 0., Jensen, V., Burnashev, N., Rozov, A., Kaiser, K.M., Koster, H.J., Borchardt, T., Worley, P., Lubke, J., Frotscher, M., Kelly, P.H., Sommer, B., Andersen, P., Seeburg, P.H., et Sakmann, B. (1999). Importance of AMPA receptors for hippocampal synaptic plasticity but not for spatial learning. Science 284,1805-11.

Zhao, X., Varnai, P., Tuymetova, G., Balla, A., Toth, Z. E., Oker-Blom, C., Roder, J., Jeromin, A., et Balla, T. (2001). Interaction of neuronal calcium sensor-1 (NCS-1) with phosphatidylinositol 4-kinase beta stimulates lipid kinase activity and affects membrane trafficking in COS-7 cells. J Biol Chem 28,28.

Il sera clair que l'invention peut être mise en pratique autrement que comme spécifiquement décrit dans la description et les exemples susmentionnés. De nombreuses modifications et variantes de la présente invention sont possibles à la lumière des enseignements ci-dessus et entrent donc dans le cadre des revendications jointes en annexe.

Claims

REVENDICATIONS

1. Composition pharmaceutique comprenant un agoniste/activateur ou un antagoniste/inhibiteur de NCS-1(neuron-specific calcium sensor-1), et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

2. Utilisation d'un agoniste/activateur ou d'un antagoniste/inhibiteur de NCS-1(neuron-specific calcium sensor-1) ou d'un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci pour la préparation d'une composition pour le traitement d'un trouble du SNC ou pour améliorer la cognition d'un sujet, ou pour moduler la libération de neurotransmetteurs.

3. Utilisation selon la revendication 2, dans laquelle ledit trouble du SNC est la schizophrénie, la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la dépression majeure, le trouble bipolaire, les troubles de l'anxiété, les troubles de l'appétit, les troubles du sommeil, l'insomnie, le trouble du déficit d'attention avec hyperactivité ou l'hyperactivité.

4. Composition pharmaceutique selon la revendication 1 ou utilisation selon la revendication 2 ou 3, dans laquelle l'agoniste/activateur est ou est dérivé d'un polypeptide de NCS-1, d'un anticorps antiNCS-1, d'un régulateur de transcription du gène ncs-1, d'une molécule de liaison à un ligand, d'une substance mimétique du calcium ou d'un dérivé d'un activateur de la calmoduline.

5. Composition pharmaceutique selon la revendication 1 ou l'utilisation selon la revendication 2 ou 3, dans laquelle l'antagoniste/inhibiteur est ou est dérivé d'un polypeptide de NCS-1, d'un anticorps antiNCS-1, d'une molécule d'acide nucléique antisens de ncs-1, d'une molécule de liaison à un ligand, d'un

chélateur du calcium ou d'un inhibiteur de la calmoduline.

6. Composition pharmaceutique selon la revendication 1, 4 ou 5 ou utilisation selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, dans laquelle ledit agoniste/activateur facilite et ledit antagoniste/inhibiteur parasite l'action de liaison au calcium de NCS-1 ou change la conformation/fonction de NCS-1.

7. Procédé pour identifier et obtenir un candidat médicament destiné au traitement d'un trouble du comportement ou à améliorer l'apprentissage et /ou la mémoire d'un sujet, ledit procédé comprenant les étapes qui consistent à : (a) cribler une cellule, un tissu ou un animal non humain avec un composé à cribler dans des conditions permettant l'activité de NCS-1(neuron-specific calcium sensor-1) ; et (b) déterminer l'activité de NCS-1 de ladite cellule, dudit tissu ou dudit animal non humain traité, une différence d'activité de NCS-1 par rapport à une cellule, un tissu ou un animal témoin correspondant étant indicatrice d'un candidat médicament ; et éventuellement (c) obtenir le candidat médicament déterminé comme modifiant l'activité de NCS-1 à l'étape (b).

8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel ladite activité de NCS-1 est la liaison au calcium ou un changement de conformation/fonction.

9. Procédé selon la revendication 7 ou 8, dans lequel ladite cellule, ledit tissu ou ledit animal non humain est une cellule, un tissu ou un animal non humain transgénique qui présente un taux d'activité sensiblement diminué ou augmenté de NCS-1(neuron-

specific calcium sensor-1) par rapport à un animal du type sauvage correspondant.

10. Procédé selon la revendication 9, dans lequel pour ledit animal non humain transgénique ladite différence d'activité de NCS-1 se traduit par une différence de comportement.

11. Procédé selon la revendication 9 ou 10, dans lequel ledit animal non humain transgénique présentant un taux diminué d'activité de NCS-1(neuron-specific calcium sensor-1) comprend au moins un allèle mutant du gène codant pour le NCS-1 ou un allèle trans-dominant correspondant d'un gène différent.

12. Procédé selon la revendication 11, dans lequel ledit animal non humain transgénique est un animal à inactivation génique, ncs-1 (NCS-1 knock-out animal).

13. Procédé selon la revendication 11 ou 12, dans lequel ledit animal non humain transgénique est C. elegans et ledit comportement est un traçage isotherme (TI), ou ledit animal non humain transgénique est la souris et ledit comportement correspond aux performances d'apprentissage et de mémoire dans le labyrinthe piscine de Morris et des tâches d'évitement actif .

14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 13, dans lequel ledit composé à cribler est dérivé d'un polypeptide de NCS-1, d'une molécule antisens NCS-1, d'un anticorps anti-NCS-1, d'un régulateur de transcription du gène ncs-1, d'une molécule de liaison à un ligand, d'une substance mimétique du calcium ou d'un dérivé d'un activateur de la calmoduline.

15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 14, dans lequel ledit médicament candidat est un composé chef de file.

16. Procédé de fabrication d'un médicament comprenant les étapes du procédé de l'une quelconque des revendications 7 à 15 ; et (i) la synthèse du candidat médicament identifié à l'étape (b) ou obtenu à l'étape (c) ou d'un analogue ou dérivé de celui-ci en une quantité suffisante pour fournir ledit médicament en une quantité thérapeutiquement efficace à un sujet ; et/ou (ii) la combinaison du candidat médicament identifié à l'étape (b) ou obtenu à l'étape (c) ou d'un analogue ou dérivé de celui-ci avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

17. Composition pharmaceutique comprenant un médicament ou un candidat médicament identifié ou obtenu au moyen du procédé de l'une quelconque des revendications 7 à 16 ou un racémate, énantiomère, diastéréoisomère, tautomère, mélanges de diastéréoisomères ou sel pharmaceutiquement acceptable de l'un quelconque de ceux-ci, dans laquelle ledit médicament ou candidat médicament est un modulateur de l'activité de NCS-1.

18. Composition pharmaceutique selon la revendication 17, dans laquelle ledit médicament facilite ou entrave la liaison de NCS-1 au calcium ou change la conformation de NCS-1.

19. Animal non humain transgénique tel que défini dans l'une quelconque des revendications 11 à 13 ou tissu ou cellule transgénique de celui-ci.

20. Utilisation du NCS-1(neuron-specific calcium sensor-1) ou d'un fragment biologiquement actif de celui-ci, d'une molécule d'acide nucléique codant pour le NCS-1 ou d'une molécule d'acide nucléique d'au moins 15 nucléotides de long s'hybridant à un gène ncs-1, d'un anticorps anti-NCS-1, d'une cellule selon la

revendication 9, ou d'une analyse d'activité de NCS-1 pour un procédé permettant d'obtenir, d'identifier et/ou d'établir le profil d'un candidat médicament pour le traitement d'un trouble du SNC ou pour moduler la cognition d'un sujet.

21. Utilisation d'une cellule, d'un tissu, d'un animal non humain et/ou d'un candidat médicament pour le procédé de l'une quelconque des revendications 7 à 16.

22. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 2 à 4 ou 20, ou procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 16, dans laquelle ledit trouble est ou est lié à la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, aux déficits cognitifs liés à l'âge, ou à la perte de mémoire ou à une déficience de l'apprentissage.

23. Trousse utile pour le procédé de l'une quelconque des revendications 7 à 16, ladite trousse comprenant NCS-1(neuron-specific calcium sensor-1) ou un fragment biologiquement actif de celui-ci, une molécule d'acide nucléique codant pour le NCS-1 ou une molécule d'acide nucléique d'au moins 15 nucléotides de long s'hybridant à un gène ncs-1, un anticorps antiNCS-1, une cellule selon la revendication 9, ou une cellule, un tissu ou un animal non humain.

24. Trousse utile pour le procédé permettant de diagnostiquer chez un sujet un état pathologique ou un risque de développer un état pathologique lié à un trouble du SNC : (a) déterminer la présence ou de l'absence d'une mutation au niveau du polynucléotide codant pour le NCS-1(neuron-specific calcium sensor-1) ; et (b) diagnostiquer un état pathologique ou un risque de développer un état pathologique sur la base

de la présence ou de l'absence de ladite mutation, ou pour le procédé permettant de diagnostiquer chez un sujet un état pathologique ou un risque de développer un état pathologique lié à un trouble du SNC, ledit procédé comprenant les étapes qui consistent à : (a) déterminer la présence ou la quantité d'expression d'un polypeptide du NCS-1(neuron-specific calcium sensor-1) dans un échantillon biologique ; et (b) diagnostiquer un état pathologique ou un risque de développer un état pathologique sur la base de la présence ou de la quantité d'expression du polypeptide, ladite trousse comprenant NCS-1(neuron-specific calcium sensor-1) ou un fragment biologiquement actif de celui-ci, une molécule d'acide nucléique codant pour le NCS-1 ou une molécule d'acide nucléique d'au moins 15 nucléotides de long s'hybridant à un gène ncs-1, un anticorps anti-NCS-1 ou une cellule selon la revendication 9.

25. Trousse selon la revendication 23, comprenant C. elegans présentant un taux d'activité de NCS-1 diminué ou augmenté, et éventuellement un animal témoin correspondant.