DE10030149A1 - Verwendung von Polypeptiden oder diese kodierende Nukleinsäuren zur Diagnose oder Behandlung von Hauterkrankungen oder Wundheilung sowie ihre Verwendung zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen - Google Patents

Abstract

Verwendung von Polypeptiden oder diese kodierende Nukleinsäuren zur (i) Diagnose und/oder Behandlung von Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankungen, und/oder (ii) Diagnose und/oder Behandlung bei der Wundheilung, insbesondere Wundheilungsstörungen, oder (iii) Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Polypeptiden oder diese kodierende Nukleinsäuren zur (i) Diagnose und/oder Behandlung von Erkrankungen, insbe­ sondere Hauterkrankungen, und/oder (ii) Diagnose und/oder Behandlung bei der Wundheilung, insbesondere Wundheilungsstörungen, oder (iii) Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen.

Wunden heilen im allgemeinen ohne therapeutischen Eingriff ab. Es gibt jedoch zahlreiche Erkrankungen, bei denen die Wundheilung eine Rolle spielt, wie z. B. Diabetes mellitus, arterielle Verschlußkrankheiten, Schuppenflechte (Psoriasis), Morbus Crohn, Epidermolysis bullosa, altersbedingte Hautveränderungen oder Innervationsstörungen. Wundheilungsstörungen führen zu einer verzögerten Wundheilung oder zu chronischen Wunden. Diese Störungen können durch die Art der Verwundung (z. B. großflächige Wunden, tiefgehende und mechanisch gedehnte Operationswunden, Verbrennungen, Trauma, Dekubitus), medikamentö­ se Behandlung der Patienten (z. B. mit Corticoiden) aber auch durch die Art der Erkrankung selber verursacht werden. So leiden z. B. 25% der Patienten mit Typ- II-Diabetes häufig an chronischen Ulzera ("diabetischer Fuß"), von denen etwa die Hälfte aufwendige stationäre Behandlungen erfordern und letztlich doch schlecht heilen. Der diabetische Fuß verursacht mehr Klinikaufenthalte als jede andere mit Diabetes assoziierte Komplikation. Die Zahl dieser Fälle bei Diabetes Typ I und II ist im Steigen begriffen und repräsentiert 2,5% aller Klinikeinweisungen. Zudem heilen Wunden mit zunehmendem Alter der Patienten schlechter. Oft ist auch eine Beschleunigung des natürlichen Wundheilungsprozesses wün­ schenswert, um z. B. die Gefahr von bakteriellen Infektionen oder die Liegezeiten der Patienten zu verringern.

Auch nach erfolgtem Wundverschluß kann es zu weiteren Störungen kommen. Während Wunden fötaler Haut ohne Narbenbildung heilen, kommt es nach Ver­ letzungen in der Postnatalperiode stets zu Narbenbildungen, die oft ein großes kosmetisches Problem darstellen. Bei Patienten mit großflächigen Brandwunden kann zudem die Lebensqualität dramatisch beeinträchtigt werden, zumal vernarb­ ter Haut auch die Anhangsgebilde, wie Haarfollikel, Schweiß- und Talgdrüsen fehlen. Bei entsprechender genetischer Disposition kann es auch zu Keloiden kommen, hypertrophischen Narben, die in die umgebende Haut einwuchern.

Der Vorgang der Wundheilung erfordert komplexe koordiniert ablaufende Wir­ kungen und Interaktionen verschiedener Zelltypen. Im Wundheilungsprozeß un­ terscheidet man folgende Schritte: die Blutgerinnung im Bereich der Wunde, die Rekrutierung von Entzündungszellen, die Reepithelialisierung, die Bildung von Granulationsgewebe sowie die Restrukturierung von Matrix. Die exakten Reakti­ onsmuster der beteiligten Zelltypen während der Phasen der Proliferation, der Migration, der Matrixsynthese und der Kontraktion sind, ebenso wie die Regulati­ on von Genen wie z. B. Wachstumsfaktoren, Rezeptoren und Matrixproteinen, bislang wenig bekannt.

So sind bisher nur wenig zufriedenstellende Therapien entwickelt worden, um bei Wundheilungstörungen eingreifen zu können. Etablierte Therapieformen be­ schränken sich auf physikalische Unterstützung der Wundheilung (z. B. Verbände, Kompressen, Gele) oder der Transplantation von Hautgeweben, gezüchteten Hautzellen und/oder Matrixproteinen. In den letzten Jahren sind Wachstumsfakto­ ren zur Verbesserung der Wundheilung erprobt worden, ohne jedoch die konven­ tionelle Therapie entscheidend zu verbessern. Auch die Diagnose von Wundheilungsstörungen beruht auf wenig aussagekräftigen optischen Analysen der Haut, da ein tieferes Verständnis der Genregulation während der Wundheilung bisher fehlt.

Auch für andere Störungen von regenerativen Prozessen sind bisher wenig zufrie­ denstellende Therapien entwickelt worden. Auch hier ist die Kenntnis der Genre­ gulation vorteilhaft für die Entwicklung von Diagnostika und Therapien. Es ist gezeigt worden (Finch et al., 1997, Am. J. Pathol. 151: 1619-28; Werner, 1998, Cytokine Growth Factor Rev. 9: 153-165), daß wundheilungsrelevante Gene auch bei dermatologischen Erkrankungen, die auf Störungen der Regeneration der Haut beruhen, und allgemein bei regenerativen Prozessen eine entscheidende Rolle spielen. So spielt der Wachstumsfaktor KGF nicht nur eine entscheidende Rolle bei der Regulation der Proliferation und Differenzierung von Keratinozyten wäh­ rend der Wundheilung, sondern ist auch ein wichtiger Faktor bei der Hyperpro­ liferation der Keratinozyten bei der Schuppenflechte (Psoriasis) und Regenerati­ onsprozessen im Darm (bei Morbus Crohn und ulcerativer Colitis)

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Polypeptide und diese kodie­ rende Nukleinsäuren zur Verfügung zu stellen, die an Prozessen bei (i) Erkran­ kungen von Säugetierzellen, insbesondere bei Erkrankungen von Hautzellen, und/oder (ii) der Wundheilung, insbesondere Wundheilungsstörungen, beteiligt sind, und deren Verwendung die Diagnose und/oder Behandlung sowie die Identi­ fizierung und Entwicklung von in Zusammenhang mit diesen Erkrankungen wirk­ samen Pharmazeutika entscheidend verbessert.

Bei der Analyse der Genexpression während des Wundheilungsprozesses konnten überraschenderweise Gene identifiziert werden, die bisher nicht mit Diagnose und/oder Behandlung von Erkrankungen oder mit der Diagnose und/oder Be­ handlung bei der Wundheilung oder zur Identifizierung von pharmakologisch ak­ tiven Substanzen in Verbindung gebracht wurden, deren Regulation aber für den Heilungsprozeß essentiell ist und die damit im kausalen Zusammenhang mit Diagnose und/oder Behandlung von Erkrankungen und/oder Diagnose und/oder Be­ handlung bei der Wundheilung oder zur Identifizierung von pharmakologisch ak­ tiven Substanzen stehen. Die Polypeptide dieser Gene gehören nicht zu den bisher bekannten Zielen für die Diagnose - wie beispielsweise der Indikation - und/oder der Behandlung - wie beispielsweise der Modulation - von Erkrankungen oder Wundheilung oder für die Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substan­ zen, so daß sich aus dieser Erfindung völlig neue Therapieansätze ergeben.

Die Aufgabe wird daher erfindungsgemäß durch die Verwendung eines oder meh­ rerer Polypeptide oder Varianten davon gemäß einer der SEQ ID Nr. 55 bis SEQ ID Nr. 58 und/oder diese kodierende Nukleinsäuren oder Varianten davon zur (i) Diagnose und/oder Behandlung von Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankun­ gen, und/oder (ii) Diagnose und/oder Behandlung bei der Wundheilung, insbe­ sondere Wundheilungsstörungen, oder (iii) Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen gelöst.

Der Begriff "Varianten" eines Polypeptids im Sinne der vorliegenden Erfindung umfaßt auch funktionell aktive Varianten. Unter funktionell aktiven Varianten sind Polypeptide zu verstehen, die beispielsweise wie die erfindungsgemäß ver­ wendeten Polypeptide während Erkrankung, insbesondere Hauterkrankungen, oder bei regenerativen Prozessen der Haut, insbesondere jedoch bei Wundhei­ lungsstörungen, reguliert werden. Unter "Regulation" wird beispielsweise die Erhöhung oder Erniedrigung der Menge der Polypeptide oder diese kodierende Nukleinsäuren verstanden, wobei diese Änderung beispielsweise auf trankriptio­ neller oder translationeller Ebene stattfinden kann.

Zu funktionell aktiven Varianten zählen beispielsweise auch Polypeptide, die von einer Nukleinsäure kodiert werden, die aus nicht-wundheilungsspezifischen Ge­ webe, z. B. Embryonalgewebe, isoliert werden, jedoch nach Expression in einer an der Wundheilung beteiligten Zelle die bezeichneten Funktionen besitzen.

Varianten im Sinne der vorliegenden Erfindung sind auch Polypeptide, die eine Sequenzhomologie, insbesondere eine Sequenzidentität, von ca. 70%, vorzugs­ weise ca. 80%, insbesondere ca. 90%, vor allem ca. 95% zu dem Polypeptid mit der Aminosäuresequenz gemäß einer der SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 48 und SEQ ID Nr. 55 bis SEQ ID Nr. 58 und SEQ. ID Nr. 63 bis SEQ ID Nr. 73 auf­ weisen. Beispiele solcher Varianten, die auch funktionell aktive Varianten seien können, sind demnach die entsprechenden Polypeptide, die aus anderen Organis­ men als dem Menschen bzw. der Maus, vorzugsweise aus nicht-menschlichen Säugetieren wie z. B. Affen, Schweinen und Ratten stammen. Andere Beispiele von Varianten sind Polypeptide, die durch unterschiedliche Allele des Gens, in verschiedenen Individuen oder in verschiedenen Organen eines Organismus ko­ diert werden.

Varianten des Polypeptids können auch Teile des erfindungsgemäß verwendeten Polypeptids mit mindestens 6 Aminosäuren Länge, vorzugsweise mit mindestens 8 Aminosäuren Länge, insbesondere mit mindestens 12 Aminosäuren Länge sein. Umfaßt sind auch Deletionen des erfindungsgemäß verwendeten Polypeptids im Bereich von ca. 1-60, vorzugsweise von ca. 1-30, insbesondere von ca. 1-15, vor allem von ca. 1-5 Aminosäuren. Beispielsweise kann die erste Aminosäure Me­ thionin fehlen, ohne daß die Funktion des Polypeptids wesentlich verändert wird.

Der Begriff "kodierende Nukleinsäure" bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, die für ein isolierbares bioaktives erfindungsgemäßes Polypeptid oder einen Precursor kodiert. Das Polypeptid kann durch eine Sequenz in voller Länge oder jeden Teil der kodierenden Sequenz kodiert werden, solange die spezifische, beispielsweise enzymatische Aktivität erhalten bleibt.

Es ist bekannt, daß kleine Veränderungen in der Sequenz der vorangehend be­ schriebenen Nukleinsäuren vorhanden sein können, zum Beispiel durch die Dege­ nerierung des genetischen Codes, oder daß nicht translatierte Sequenzen am 5' und/oder 3'-Ende der Nukleinsäure angehängt sein können, ohne daß dessen Aktivität wesentlich verändert wird. Diese Erfindung umfaßt deshalb auch soge­ nannte "Varianten" der vorangehend beschriebenen Nukleinsäuren.

Unter Varianten der Nukleinsäuren sind alle DNA-Sequenzen zu verstehen, die komplementär zu einer DNA-Sequenz sind, die unter stringenten Bedingungen mit der Referenzsequenz hybridisieren und eine ähnliche Aktivität aufweisen wie das von der Referenzsequenz kodierte Polypeptid.

Unter "stringenten Hybridisierungsbedingungen" sind solche Bedingungen zu verstehen, bei denen eine Hybridisierung bei 60°C in 2,5 × SSC-Puffer, gefolgt von mehreren Waschschritten bei 37°C in einer geringeren Pufferkonzentration erfolgt und stabil bleibt.

Varianten der Nukleinsäure können auch Teile der erfindungsgemäß verwendeten Nukleinsäure mit mindestens 8 Nukleotiden Länge, vorzugsweise mit mindestens 18 Nukleotiden Länge, insbesondere mit mindestens 24 Nukleotiden Länge sein.

Die genauen biologischen Funktionen der erfindungsgemäß verwendeten Poly­ peptide der SEQ ID Nr. 55 bis SEQ ID Nr. 58 sind unbekannt. Bei den Untersu­ chungen im Rahmen dieser Erfindung konnte zum ersten Mal ein Zusammenhang der erfindungsgemäßen Polypeptide mit Erkrankungen, beispielsweise Hauter­ krankungen, festgestellt werden. Die Accession Numbers der erfindungsgemäßen Polypeptidsequenzen und ihrer cDNAs soweit bekannt sind in Fig. 4 aufgelistet. Die noch nicht in öffentlichen Datenbanken zugänglichen cDNA Sequenzen der Polypeptide von Seq ID Nr. 55 bis 57 sind unter SEQ ID Nr. 50 bis 52 angeführt. Fig. 7 und Fig. 8 zeigen den Vergleich der menschlichen und murinen Poly­ peptidsequenzen.

Bei der Analyse der Genexpression während des Wundheilungsprozesses konnten weitere Gene identifiziert werden, deren bereits bekannte und beschriebene Funk­ tionen bisher nicht mit Hauterkrankungen, beispielsweise bei einer gestörten Wundheilung, in Verbindung gebracht wurden, deren Regulation aber für den Wundheilungsprozeß essentiell ist und die damit erstmals in kausalen Zusammen­ hang mit Hauterkrankungen, beispielsweise bei einer gestörten Wundheilung, gebracht wurden. Die Polypeptide dieser Gene gehören nicht zu den bisher be­ kannten Zielen von Therapien von Hauterkrankungen und/oder der Wundheilung, so daß sich aus dieser Erfindung völlig neue Therapieansätze ergeben.

Die Aufgabe der Erfindung wird weiterhin durch die Verwendung mindestens eines Polypeptids oder Varianten davon gemäß einer der SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 20 und SEQ ID Nr. 31 bis SEQ ID Nr. 48 und SEQ ID Nr. 63 bis SEQ ID Nr. 70 und/oder diese kodierende Nukleinsäuren oder Varianten zur (i) Diagnose und/oder Behandlung von Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankungen, und/oder (ii) Diagnose und/oder Behandlung bei der Wundheilung, insbesondere Wundheilungsstörungen, oder (iii) Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen gelöst.

Erfindungsgemäß können folgende Polypeptide verwendet werden:

• - Das tumor susceptibility gene TSG101 aus Maus (SEQ ID Nr. 1) oder Mensch (SEQ ID Nr. 2), das aus WO 97/18333 und US 5,892,016 bekannt ist (Li und Co­ hen, 1996, Cell 85: 319-329; Li et al., 1997, Cell 88: 143-154). Die funktionelle Inaktivierung von TSG101 in Fibroblasten führt zur zellulären Transformation und zur Fähigkeit metastasierende Tumore zu bilden. TSG101-defiziente neopla­ stische Zellen zeigen Abnormitäten in Mitose-assoziierten Prozessen (Xie et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95: 1595-1600). Zudem wird eine Rolle als transkriptioneller Modulator vermutet (Sun et al., 1999, Cancer 86: 689-696).
• - Das aus US 5,905,023, US 5,801,001, US 5,470,970 und WO 94/05804 be­ kannte Tumorsuppressor-Protein Maspin aus Maus (SEQ ID Nr. 3) oder Mensch (SEQ ID Nr. 4) (Zou et al., 1994, Science 263, 526-529). MASPIN ist ein Serin- Protease-Inhibitor (Zhang et al., 1997, Mol. Med. 3: 49-59), der in normalen Brust- und Prostataepithelzellen exprimiert wird (Zhang et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 5673-5678) und eine wesentliche Rolle bei der Entwicklung der Brustdrüsen spielt (Zhang et al., 1999, Dev. Biol. 215: 278-287).
• - Der RNA-Polymerase I Terminationsfaktor TTF-I aus Maus (SEQ ID Nr. 5) oder Mensch (SEQ ID Nr. 6) (Evers und Grummt, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 5827-5831). Das Protein vermittelt die Termination der Transkription ribosomaler Gene (Kuhn et al., 1990, Nature 344: 559-62) sowie die transkriptio­ nelle Aktivierung der ribosomalen Gene im Chromatin (Langst et al., 1998, EMBO J. 17: 3135-45).
• - Das aus WO 91/02077 und US 7,745,381 bekannte B-raf Protoonkogen aus Maus (SEQ ID Nr. 7) oder Mensch (SEQ ID Nr. 8) (Miki et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 5167-5171; Stephens et al., 1992, Mol. Cell. Biol. 12: 3733- 3742). Das B-raf Protoonkogen gehört zur Raf-Familie, die Serin-/Threonin- Proteinkinasen umfaßt, die die Stimulation von Wachstumsfaktorrezeptoren und die Aktivierung von mitogen-aktivierten Proteinkinase koppeln (Mason et al., 1999, EMBO J. 18: 2137-48). U. a. kann B-Raf Apoptose inhibieren (Erhardt et al., 1999, Mol. Cell. Biol. 19: 5308-15).
• - Das aus US 4,716,148 und US 4,659,694 bekannte Prothymosin alpha aus Maus (SEQ ID Nr. 9) oder Mensch (SEQ ID Nr. 10) (Schmidt und Werner D.; 1991, Biochim. Biophys. Acta 1088: 442-444, Eschenfeldt und Berger, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 9403-9407). Es kodiert ein kleines acidisches Kernprotein, das eine Rolle bei der Proliferation von Zellen spielt (Tao et al., 1999, J. Cell. Physiol. 178: 154-63).
• - Der GOLGI 4-TRANSMEMBRANE SPANNING TRANSPORTER oder MTP (mouse transporter protein) aus Maus (SEQ ID Nr. 11) oder Mensch (SEQ ID Nr. 12) (Hogue et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 9801-9808; Nagase et al., 1995, DNA Res. 2: 37-43). Es ist ein stark konserviertes Membranprotein, das in Säugerzellen in Lysosomen und Endosomen lokalisiert ist. Das Protein ist für die subzelluläre Verteilung verschiedener kleiner hydrophober Moleküle verantwortlich und trägt zur Sensitivität bzw. Resistenz von Säugerzellen gegenüber bestimmten Wirkstof­ fen bei (Hogue et al., 1999, J. Biol. Chem. 274: 12877-82).
• - CCR-1 aus Maus (SEQ ID Nr. 13) oder Mensch (SEQ ID Nr. 14) (Post et al., 1995, J. Immunol. 155: 5299-5305), das ein Eosinophil-Rezeptor für das CC Che­ mokin Eotaxin ist (Gao et al., 1996, Biochem. Biophys. Res. Comm. 223: 679-84). CCR-1 wird in Herz, Milz und Lunge exprimiert (Gao und Murphy, 1995, Geno­ mics 29: 294-96).
• - das Nukleosomen-Bindeprotein HMG-14 aus Maus (SEQ ID Nr. 15) oder Mensch (SEQ ID Nr. 16) (Landsman und Bustin, 1990, Nucleic Acids Res. 18: 5311-5311; Landsman et al., 1986, J. Biol. Chem. 261: 16082-16086), das hö­ her geordnete Chromatinstrukturen öffnet und somit das Transkriptions- und Re­ plikationspotential von Chromatin erhöht (Herrera et al., 1999, Mol. Cell. Biol. 19: 3466-73).
• - Split hand/foot deleted 1 aus Maus (SEQ ID Nr. 17) oder Mensch (SEQ ID Nr. 18), das ein Kandidaten-Gen für die autosomal dominante Form der "split hand/split foot malformation disorder" ist. Es wird in den Knospen der Gliedma­ ßen, in der "cranofacial primordia" und in der Haut exprimiert (Crackower et al., 1996, Hum. Mol. Genet. 5: 571-9).
• - Der Orphan Receptor TAK1 oder TR4 aus Maus (SEQ ID Nr. 19) oder Mensch (SEQ ID Nr. 20) (Hirose et al., 1995, Gene 163: 239-242, Hirose et al., 1994, Mol. Endocrinol. 8: 1667-1680), der zur Superfamilie der nukleären Hormonrezeptoren gehört (Hirose et al., 1994, Mol. Endocrinol. 8: 1667-80). Als Homodimer beein­ flußt TR4 eine Vielzahl von Signaltransduktionswegen, darunter die von Retinol­ säure, Thyreoidhormon, Vitamin D3 und "ciliary neutrophic factor". Außerdem bildet TR4 Heterodimere mit dem Androgenrezeptor (Lee et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 14724-9).
• - Das aus WO 95/14772 bekannte BAF57 aus Maus (SEQ ID Nr. 31) oder Mensch (SEQ ID Nr. 32), das Bestandteil der Chromatin-remodellierenden SWI/SNF-Komplexe höherer Eukaryonten ist (Wang et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95: 492-498). Die SWI/SNF-Komplexe regulieren die Tran­ skription spezifischer Gene indem sie die Chromatin-vermittelte Repression der Transkription aufheben (Wolffe und Guschin, 2000, J. Struct. Biol. 129: 102-122). Außerdem wurde eine Rolle bei der Umstellung der Expression von fötalem zu adultem Globin in Mäusen gezeigt (Armstrong et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 349-54).
• - Das aus US 7,935,311 bekannte Epidermal Growth Factor Receptor Kinase Sub­ strat EPS8 aus Maus (SEQ ID Nr. 33) oder Mensch (SEQ ID Nr. 34), das EGF- abhängige mitogene Signale verstärkt (Wong et al., 1994, Oncogene 9: 3057-3061; Fazioli et al., 1993, EMBO J. 12: 3799-3808). Sowohl Überexpression als auch konstitutive Phosphorylierung von EPS8 wurden im Zusammenhang mit Tu­ morentwicklung beschrieben (Matoskova et al., 1995, Mol. Cell Biol. 15: 3805-­ 3812).
• - KIAA1247 aus Mensch (SEQ. ID Nr. 36), das laut WO 99/34004 als Marker- Protein bei Krebsmetastasen eingesetzt werden kann. Außerdem ist ein KIAA1247 Homolog aus der Ratte aus WO 98/53071 als Protein bekannt, dessen Expression in verletzten oder regenerierenden Geweben, vor allem in Nierenge­ webe der Ratte, induziert wird. Zusätzlich zu dem bekannten Polypeptid aus Mensch kann auch das in dieser Arbeit erstmals erwähnte Polypeptid aus der Maus (SEQ. ID Nr. 35) verwendet werden.
• - Der aus US 5,948,626, US 5,663,059 und US 5,811,520 bekannte Phospholipase Inhibitor GIPL aus Mensch (SEQ ID Nr. 38). Zusätzlich zu dem bekannten Poly­ peptid aus Mensch können auch das in dieser Arbeit erstmals erwähnte Polypeptid aus der Maus (SEQ ID Nr. 37) und das in dieser Arbeit erstmals erwähnte eng verwandte Polypeptid mit signifikant abweichender Sequenz (SEQ ID Nr. 45) verwendet werden.
• - Das aus WO 95/28497 bekannte EAT/MCL-1 aus Maus (SEQ ID Nr. 39) oder Mensch (SEQ ID Nr. 40), das in zahlreichen Geweben exprimiert wird (Krajewski et al., 1995, Am. J. Pathol. 146: 1309-19) und eine Rolle bei cutanen malignen Melanomen spielt (Tang et al., 1998, Clin. Cancer Res. 4: 1865-71).
• - Das aus US 5,958,690 bekannte TSC-22 (TGF beta-stimulated clone 22 gene) aus Mensch (SEQ ID Nr. 42) und Maus (SEQ ID Nr. 41) (Jay et al., 1996, Bio­ chem. Biophys. Res. Commun. 222: 821-826; Shibanuma et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 10219-10224), das zu der Familie der "Leucin-Zipper" Transkripti­ onsfaktoren gehört (Kester et al., 1999, J. Biol. Chem. 274: 27439-47). Die Transkription von TSC-22 wird durch verschiedene Stimuli wie Wachstumsinhibitoren induziert (Kester et al., 1999, J. Biol. Chem. 274: 27439-47). Außerdem wurde während der Entwicklung des Maus-Embryos eine verstärkte Expression von TSC-22 an Orten beobachtet, an denen Mesenchym-Epithel-Interaktionen statt­ finden (Dohrmann et al., 1999, Mech. Dev. 84: 147-51).
• - Das aus JP 100 57 065 und US 5,837,537 bekannte gamma-Sarcoglycan aus Mensch (SEQ ID Nr. 44) oder Maus (SEQ ID Nr. 43) (Noguchi et al., 1995, Sci­ ence 270: 819-822; Noguchi et al., 1999, Biochem. Biophys. Res. Commun. 262: 88-93). Gamma-Sarcoglycan ist eine Komponente des Sarcoglycan- Komplexes, der wiederum ein Subkomplex des Dystrophin-Gycoprotein- Komplexes ist. Dieser stellt eine Verbindung zwischen der extrazellulären Matrix und dem Aktin-Cytoskelett her (Hack et al., 2000, Microsc. Res. Tech. 48: 167-­ 80). Mutationen des gamma-Sarcoglycan wurden als primärer genetischer Defekt einer muskulären Dystrophie (SCARMD) beschrieben (Noguchi et al., 1995, Sci­ ence 270: 819-822).
• - Der aus WO 99/38882, WO 88/09384, DE 37 24 581, JP 012 02 287, JP 010 74 988 und US 5,212,297 bekannte Cystein Proteinase Inhibitor Cystatin C aus Mensch (SEQ ID Nr. 47) oder Maus (SEQ ID Nr. 46) (Abrahamson et al., 1987, FEBS Lett. 216: 229-233; Solem et al., 1990, Biochem. Biophys. Res. Commun. 172: 945-951). Cystein Protease Inhibitoren spielen eine Rolle bei Entzündungs­ krankheiten, wie z. B. Rheuma (Lenarcic et al., 1988, Biol. Chem. Hoppe Seyler 369 (Suppl.): 257-261 und bei vaskulären Krankheiten (Shi et al., 1999, J. Clin. Invest. 104: 1191-1197). Zusätzlich zu der bekannten Polypeptidvariante aus der Maus (SEQ ID Nr. 46) (Solem et al., 1990, Biochem. Biophys. Res. Commun. 172: 945-951) kann auch das in dieser Arbeit erstmals erwähnte eng verwandte Polypeptid mit abweichender Sequenz verwendet werden (SEQ ID Nr. 48).
• - Die Tyrosinkinase Fer aus Maus (SEQ ID Nr. 63) oder Mensch (SEQ ID Nr. 64) (SwissProt: P70451; Hao et al., 1989, Mol. Cell. Biol. 9: 1587-1593), die sowohl im Kern als auch im Zytoplasma lokalisiert ist (Hao et al., 1991, Mol. Cell. Biol. 11: 1180-1183). Für Fer wurde sowohl eine Rolle bei der Zell-Zell-Adhäsion (Rosato et al., 1998, Mol. Cell. Biol. 18: 5762-5770) als auch eine Rolle als Proto- Onkogen (Morris et al., 1990, Cytogenet. Cell. Genet. 53: 196-200) postuliert.
• - Das aus WO 99/28473, WO 96/34891 und WO 98/14582 bekannte C-C Cytokin MRP-3 (Macrophage Inflammatory Protein 3) aus Maus (SEQ ID Nr. 65) oder Mensch (SEQ ID Nr. 66), das auch C10, MPIF-1 (Myeloid Progenitor Inhibitory Factor-1), CK-beta-8 oder Small Inducible Cytokine A23 genannt wird (Orlofsky et al., 1991, Cell Regul. 2: 403-412; Li und Ruben, 1996, US 5,504,003). Bei chronischer Bauchfellentzündung wurde eine hohe MRP-3-Expression in Makro­ phagen beobachtet (Wu et al., 1999, Cytokine 11: 523-30). Als typisches C-C Cytokin ist MRP-3 ein Chemoattraktant für Leukozyten (Haelens et al., 1996, Immunobiology 195: 499-521), es wirkt aber auch auf Osteoclasten (Votta et al., 2000, J. Cell Physiol. 183: 196-207). Außerdem wurde beobachtet, daß MRP-3 mRNA nicht signifikant durch Stimuli, die mit Wundheilung im Zusammenhang stehen, hochreguliert wird (Orlofsky et al., Cell Regul., 1991, 2: 403-412).
• - Die Nikotinamid N-Methyltransferase NNMT aus Maus (SEQ ID Nr. 67) oder Mensch (SEQ ID Nr. 68) (Aksoy et al., 1994, J. Biol. Chem. 269: 14835-14840; Yan et al., 1997, Biochem. Pharmacol. 54: 1139-1149), die den Methyltransfer von S-Adenosylmethionin auf Nikotinamid katalysiert. Es existieren Hinweise, daß NNMT das Wachstum von Leberzellen regulieren kann (Seifert et al., 1984, Bio­ chim. Biophys. Acta 801: 259-64). Zudem wurde eine Rolle des Enzyms bei Le­ berkrebs vorgeschlagen (Hoshino et al., 1982, Biochim. Biophys. Acta 719: 518-­ 526).
• - Die Ubiquitin-Protein Ligase UBC9 aus Maus (SEQ ID Nr. 69) oder Mensch (SEQ ID Nr. 70) (Yasugi und Howley; 1996, Nucleic Acids Res. 24: 2005-2010; SwissProt: P50550), die eine wichtige Komponente des Proteosom-vermittelten Proteinabbaus darstellt (Hershko und Ciechanover, 1998, Annu. Rev. Biochem. 67: 425-479). Der Ubiqitin-abhängige Proteinabbau spielt eine Rolle in verschie­ densten Prozessen wie Zellzykluskontrolle, Signaltransduktion oder der Im­ munantwort. Es existieren Hinweise, daß UBC9 eine Rolle bei beschleunigter Alterung spielt (Kawabe et al., 2000, J. Biol. Chem.). Zudem katalysiert UBC9 die Sumoylierung von p53 und aktiviert somit seine Funktion als Transkriptions­ faktor (Rodriguez et al., 1999, EMBO J. 18: 6455-61):

Für keines dieser Polypeptide, deren kodierende Nukleinsäure oder der beschrie­ benen cDNA wurde bisher ein Zusammenhang mit Hauterkrankungen, beispiels­ weise bei einer gestörten Wundheilung, beschrieben oder nahegelegt. Es war da­ her unerwartet, daß diese Verbindungen erfindungsgemäß verwendet werden können. Die Accession Numbers der erfindungsgemäßen Polypeptide und ihrer cDNAs sind in Fig. 5 aufgeführt. Die noch nicht in öffentlichen Datenbanken zugänglichen cDNA Sequenzen der Polypeptide der SEQ ID Nr. 35 und der SEQ ID Nr. 37 sind unter SEQ ID Nr. 53 und SEQ ID Nr. 54 angeführt.

Bei der Analyse der Genexpression während des Wundheilungsprozesses konnten zusätzlich Gene identifiziert werden, deren bereits bekannte und beschriebene Funktionen bisher nicht mit der Wundheilung in Verbindung gebracht wurden, deren Regulation aber für den Wundheilungsprozeß essentiell ist und die damit erstmals in kausalen Zusammenhang mit der Wundheilung gebracht wurden. Die Polypeptide dieser Gene gehören nicht zu den bisher bekannten Zielen von The­ rapien in Zusammenhang mit der krankhaften Veränderung der Wundheilung, so daß sich aus dieser Erfindung völlig neue Therapieansätze ergeben.

Die Aufgabe der Erfindung wird daher zusätzlich durch die Verwendung minde­ stens eines Polypeptids oder Varianten davon gemäß einer der SEQ ID Nr. 21 bis SEQ ID Nr. 30 und SEQ ID Nr. 71 bis SEQ ID Nr. 73 und/oder diese kodierende Nukleinsäuren oder Varianten davon zur (i) Diagnose und/oder Behandlung bei der Wundheilung, insbesondere Wundheilungsstörungen, oder (ii) Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen gelöst.

Erfindungsgemäß können folgende Polypeptide verwendet werden:

• - Das aus WO 95/04158, WO 99/12968 und EP 0 488 900 bekannte Monocyte Chemotactic Protein-3, MCP-3 aus Maus (SEQ ID Nr. 21) oder Mensch (SEQ ID Nr. 22) (Kulmburg et al., 1992, J. Exp. Med. 176: 1773-1778; Minty et al., 1993, Eur. Cytokine Netw. 4: 99-110). MCP-3 ist ein CC-Chemokin, das der Chemoat­ traktion und Aktivierung von Monocyten, T-Lymphocyten, Eosinophilen und Basophilen Granulocyten, Killerzellen und dendritischen Zellen dient. Die Akti­ vierung der Zielzellen erfolgt über die Chemokinrezeptoren CCR2 und CCR3 (Wang et al., 2000, Biochim. Biophys. Acta 1500: 41-8). MCP-3 spielt eine Rolle bei allergischen Reaktionen in der Haut (Ying et al., 1999, J. Immunol. 163: 3976- 84).
• - Die aus EP 0 475 746 und WO 98/47923 bekannte alpha-Kette des heterodime­ ren Interleukin-5-Rezeptors aus Maus (SEQ ID Nr. 23) oder Mensch (SEQ ID Nr. 24) (Takaki 1990, EMBO J. 9: 4367-4374, Tavernier et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 7041-7045). Sie vermittelt die spezifische Bindung des Li­ ganden Interleukin-5 (Van Ostade et al., 1999, Eur. J. Biochem. 259: 954-60) und wird auf der Zellmembran von Eosinophilen exprimiert (Weltman und Karim, 1998, Allergy Asthma Proc. 19: 257-61). Eine Rolle des Interleukin-5 Rezeptors bei der Atopischen Dermatitis wurde beschrieben (Taha et al., 1998, J. Allergy Clin. Immunol. 102: 245-50).
  Interleukin-5 spielt eine wesentliche Rolle in der Differenzierung, Proliferation und funktionellen Aktivierung von Eosinophilen (Iwama et al., 1999, Mol. Cell. Biol. 19: 3940-50) und, im Gegensatz zum hier beschriebenen Rezeptor, wurde eine Funktion von Interleukin-5 in der Wundheilung beschrieben (Yang et al., 1997, Am J Pathol 151: 813-9).
• - Das aus WO 99/04265 bekannte integrale Membranprotein Dad1 aus Maus (SEQ ID Nr. 25) oder Mensch (SEQ a Nr. 26) (Nakashima et al., 1993, Mol. Cell. Biol. 13: 6367-6374; Apte et al., 1995; FEBS Lett. 363: 304-306). Es ist Be­ standteil des Oligosaccharyltransferase-Enzymkomplexes, der die N- Glukosylierung einleitet (Sanjay et al., 1998, J. Biol. Chem., 273: 26094-9). Dad1 spielt eine Rolle bei der Verhinderung von Apoptose in bestimmten Zelltypen (Hong et al., 1999, J. Immunol. 163: 1888-93) und in Keloiden (Sayah et al., 1999, J. Surg. Res. 87: 209-16).
• - Das aus DE 198 13 839, US 5,776,348 und US 5,614,397 bekannte Calcium­ bindende Protein MRP-14 aus Maus (SEQ ID Nr. 27) oder Mensch (SEQ ID Nr. 28) (Odink et al., 1987, Nature 330: 80-82; Lagasse und Weissman, 1992, Blood 79: 1907-1915). Das Protein bildet Heterodimere mit MRP-8 und ist in Makropha­ gen in akut entzündeten Geweben hochreguliert (Sorg, 1992, Behring Inst. Mitt. 91: 126-37). Außerdem wurden erhöhte Mengen an MRP-14 in der Epidermis von Patienten mit Liehen planus, Lupus erythematosus und Psoriasis vulgaris beob­ achtet (Kunz et al., 1992, Arch. Dermatol. Res. 284: 386-90).
• - Das aus EP 0 905 240, EP 0 905 241, WO 98/02459, EP 0 906 954, WO 95/04158, WO 99/12968, WO 97/25427 bekannte MCP-2 (C-C chemokine mo­ nocyte chemotactic protein 2) aus Mensch (SEQ ID Nr. 30) oder Maus (SEQ ID Nr. 29) (von Coillie et al., 1997, Genomics 40: 323-331; EMBL: AB023418). MCP-2 gehört zu den C-C Chemokinen und wirkt die als Chemoattraktant für verschiedene Zellen wie Macrophagen, Basophile und Eosinophile (Taub et al., 1995, J. Clin. Invest. 95: 1370-6; Proost et al., 1996, J. Leukoc. Biol. 59: 67-74). MCP-2 ist ein Signalmolekül, das bei Entzündungsprozessen die gerichtete Mi­ gration von T-Zellen und Monocyten stimuliert und diese rekrutiert (Taub et al., 1995, J. Clin. Invest. 95: 1370-6). Zusätzlich zu der bekannten Polypeptidvariante aus dem Mensch (SEQ ID Nr. 31)(von Coillie et al., 1997, Genomics 40: 323-331) kann auch das in dieser Arbeit erstmals erwähnte eng verwandte Polypeptid mit abweichender Sequenz verwendet werden (SEQ ID Nr. 71).
• - Die aus WO 96/33278 bekannte Cystein-Protease Cathepsin C aus Maus (SEQ ID Nr. 72) oder Mensch (SEQ ID Nr. 73) (Paris et al., 1995, FEBS Lett. 369: 326-­ 330; McGuire et al., 1997, Biochim. Biophys. Acta 1351: 267-273), die in Lyso­ somen verschiedener Zellen vorkommt (Turk et al., 1997, Biol. Chem. 378: 141-­ 150). Cathepsin C spielt eine wichtige Rolle bei der Aktivierung von Granzym A und B und somit bei der Induktion von Apoptose durch cytotoxische Lympho­ zyten (Pham und Ley, 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 8627-8632). Außer­ dem wurde beobachtet, daß "loss-of-function" Mutationen im Cathepsin C Gen zu palmoplanarer Keratose und Periodonditis führen (Hart et al., 1999, J. Med. Ge­ net. 36: 881-887; Toomes et al., 1999, Nat. Genet. 23: 421-424).

Für keines dieser Polypeptide oder diese kodierende Nukleinsäuren wurde bisher ein Zusammenhang mit der Wundheilung beschrieben oder nahegelegt. Es war daher unerwartet, daß diese Polypeptide erfindungsgemäß verwendet werden können. Die Accession Numbers der erfindungsgemäßen Polypeptide und ihrer cDNAs sind in Fig. 6 aufgeführt.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide können weiterhin dadurch gekennzeichnet sein, daß diese synthetisch hergestellt werden. So kann das gesamte Polypeptid oder Teile davon zum Beispiel mit Hilfe der klassischen Synthese (Merrifield- Technik) synthetisiert werden. Teile der erfindungsgemäßen Polypeptide eignen sich insbesondere zur Gewinnung von Antiseren, mit deren Hilfe geeignete Genexpressionsbanken durchsucht werden können, um so zu weiteren Varianten des erfindungsgemäßen Polypeptids zu gelangen.

Bevorzugterweise handelt es sich bei den erfindungsgemäß verwendeten Nuklein­ säuren um DNA oder RNA, vorzugsweise eine DNA, insbesondere eine doppel­ strängige DNA. Weiterhin kann die Sequenz der Nukleinsäuren dadurch gekenn­ zeichnet sein, daß sie mindestens ein Intron und/oder eine polyA-Sequenz auf­ weist. Die erfindungsgemäß verwendeten Nukleinsäuren können auch in Form ihrer antisense-Sequenz verwendet werden.

Für die Expression des betreffenden Gens ist im allgemeinen eine doppelsträngige DNA bevorzugt, wobei der für das Polypeptid kodierende DNA-Bereich beson­ ders bevorzugt ist. Dieser Bereich beginnt mit dem ersten in einer Kozak Sequenz (Kozak, 1987, Nucleic. Acids Res. 15: 8125-48) liegenden Start-Codon (ATG) bis zum nächsten Stop-Codon (TAG, TGA bzw. TAA), das im gleichen Leseraster zum ATG liegt.

Eine weitere erfindungsgemäße Verwendung der Nukleinsäuresequenzen ist die Konstruktion von anti-sense Oligonukleotiden (Zheng und Kemeny, 1995, Clin. Exp. Immunol. 100: 380-2; Nellen und Lichtenstein, 1993, Trends Biochem. Sci. 18: 419-23; Stein, 1992, Leukemia 6: 967-74) und/oder Ribozymen (Amarzguioui, et al. 1998, Cell. Mol. Life Sci. 54: 1175-202; Vaish, et al., 1998, Nucleic Acids Res. 26: 5237-42; Persidis, 1997, Nat. Biotechnol. 15: 921-2; Couture und Stinchcomb, 1996, Trends Genet. 12: 510-5). Mit anti-sense Oligonukleotiden kann man die Stabilität von Nukleinsäuren verringert werden und/oder die Translation von Nukleinsäuren inhibiert werden. So kann durch die erfindungs­ gemäße Verwendung der Nukleinsäuresequenzen beispielsweise die Expression der entsprechenden Gene in Zellen sowohl in vivo als auch in vitro vernngert werden. Oligonukleotide können sich daher als Therapeutikum eignen. Diese Strategie eignet sich beispielsweise auch für Haut, epidermale und dermale Zel­ len, insbesondere, wenn die antisense Oligonukleotide mit Liposomen komple­ xiert werden (Smyth et al., 1997, J. Invest. Dermatol. 108: 523-6; White et al., 1999, J. Invest. Dermatol. 112: 699-705; White et al., 1999, J. Invest. Dermatol. 112: 887-92). Für die Verwendung als Sonde oder als "antisense" Oligonukleotid ist eine einzelsträngige DNA oder RNA bevorzugt.

Weiterhin kann zur Durchführung der Erfindung eine Nukleinsäure verwendet werden, die synthetisch hergestellt worden ist. So kann die erfindungsgemäß ver­ wendete Nukleinsäure beispielsweise chemisch anhand der in den Fig. 4 bis 6 beschriebenen DNA Sequenzen und/oder anhand der in diesen Figuren ebenfalls beschriebenen Proteinsequenzen unter Heranziehen des genetischen Codes z. B. nach der Phosphotriester-Methode synthetisiert werden (siehe z. B. Uhlmann, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Revievs, 90, 543-584, No. 4).

Oligonukleotide werden in der Regel schnell durch Endo- oder Exonukleasen, insbesondere durch in der Zelle vorkommende DNasen und RNasen, abgebaut. Deshalb ist es vorteilhaft, die Nukleinsäure zu modifizieren, um sie gegen den Abbau zu stabilisieren, so daß über einen langen Zeitraum eine hohe Konzentrati­ on der Nukleinsäure in der Zelle beibehalten wird (Beigelman et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23: 3989-94; Dudycz, 1995, WO 95/11910; Macadam et al., 1998, WO 98/37240; Reese et al., 1997, WO 97/29116). Typischerweise kann eine solche Stabilisierung durch die Einführung von einer oder mehrerer Internu­ kleotid-Phosphorgruppen oder durch die Einführung einer oder mehrerer Nicht- Phosphor-Internukleotide, erhalten werden.

Geeignete modifizierte Internukleotide sind in Uhlmann und Peymann (1990 Chem. Rev. 90, 544) zusammengefaßt (siehe auch Beigelman et al., 1995 Nucleic Acids Res. 23: 3989-94; Dudycz, 1995, WO 95/11910; Macadam et al., 1998, WO 98/37240; Reese et al., 1997, WO 97/29116). Modifizierte Internukleotid- Phosphatreste und/oder Nicht-Phosphorbrücken in einer Nukleinsäure, die bei einer der erfindungsgemäßen Verwendungen eingesetzt werden können, enthalten zum Beispiel Methylphosphonat, Phosphorothioat, Phosphoramidat, Phosphoro­ dithioat, Phophatester, während Nicht-Phosphor-Internukleotid-Analoge, bei­ spielsweise Siloxanbrücken, Carbonatbrücken, Carboxymethylester, Acetamidat­ brücken und/oder Thioetherbrücken enthalten. Es ist auch beabsichtigt, daß diese Modifizierung die Haltbarkeit einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die bei einer der erfindungsgemäßen Verwendungen eingesetzt werden kann, verbessert.

In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung sind die vorangehend beschriebenen Nukleinsäuren in einem Vektor, vorzugsweise in ei­ nem "shuttle" Vektor, Phagemid, Cosmid, Expressionsvektor oder gentherapeu­ tisch wirksamen Vektor enthalten. Weiterhin können die vorangehend beschrie­ benen Nukleinsäuren in "knock-out" Genkonstrukten oder Expressionskassetten enthalten sein.

Vorzugsweise enthält ein gentherapeutisch wirksamer Vektor wund- bzw. haut­ spezifische regulatorische Sequenzen, die funktionell mit der vorangehend be­ schriebenen Nukleinsäure verbunden sind.

Die Expressionsvektoren können prokaryotische oder eukaryotische Expressions­ vektoren sein. Beispiele für prokaryotische Expressionsvektoren sind für die Ex­ pression in E. coli z. B. die Vektoren pGEM oder pUC-Derivate und für eukaryotische Expressionsvektoren für die Expression in Saccharomyces cerevisiae z. B. die Vektoren p426Met25 oder p426GAL1 (Mumberg et al. (1994) Nucl. Acids Res., 22, 5767-5768), für die Expression in Insektenzellen z. B. Baculovirus- Vektoren wie in EP-B 1-0 127 839 oder EP-B 1-0 549 721 offenbart, und für die Expression in Säugerzellen z. B. die Vektoren Rc/CMV und Rc/RSV oder SV40- Vektoren, welche alle allgemein erhältlich sind.

Im allgemeinen enthalten die Expressionsvektoren auch für die jeweilige Wirts­ zelle geeignete Promotoren, wie z. B. den trp-Promotor für die Expression in E. coli (siehe z. B. EP-B1-0 154 133), den Met 25, GAL1 oder ADH2-Promotor für die Expression in Hefen (Russel et al. (1983), J. Biol. Chem. 258, 2674-2682; Mumberg, supra), den Baculovirus-Polyhedrin-Promotor, für die Expression in Insektenzellen (siehe z. 13. EP-B1-0 127 839). Für die Expression in Säugetier­ zellen sind beispielsweise Promotoren geeignet, die eine konstitutive, regulierba­ re, gewebsspezifische, zellzyklusspezifische oder metabolischspezifische Expres­ sion in eukaryotischen Zellen erlauben. Regulierbare Elemente gemäß der vorlie­ genden Erfindung sind Promotoren, Aktivatorsequenzen, Enhancer, Silencer und/oder Repressorsequenzen.

Beispiel für geeignete regulierbare Elemente, die konstitutive Expression in Euka­ ryonten ermöglichen, sind Promotoren, die von der RNA Polymerase III erkannt werden oder virale Promotoren, CMV-Enhancer, CMV-Promotor, SV40 Promotor oder LTR-Promotoren z. B. von MMTV (mouse mammary tumour virus; Lee et al. (1981) Nature 214, 228-232) und weitere virale Promotor- und Aktivatorse­ quenzen, abgeleitet aus beispielsweise HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV oder HIV.

Beispiele für regulierbare Elemente, die regulierbare Expression in Eukaryonten ermöglichen, sind der Tetracyclinoperator in Kombination mit einem entspre­ chenden Repressor (Gossen M. et al. (1994) Curr. Opin. Biotechnol. 5, 516-20).

Vorzugsweise erfolgt die Expression von wundheilungsrelevanten Genen unter der Kontrolle von gewebespezifischen Promotoren, wobei hautspezifische Pro­ motoren wie beispielsweise der humane K10 Promotor (Bailleul et al., 1990. Cell 62: 697-708), der humane K14 Promotor (Vassar et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1563-67) oder der bovine Cytokeratin IV Promotor (Fuchs et al., 1988; The biology of wool and hair (Hrsg.: G. E. Rogers, et al.), S. 287-309. Chapman und Hall, London/New York) besonders zu bevorzugen sind.

Weitere Beispiele für regulierbare Elemente, die gewebsspezifische Expression in Eukaryonten ermöglichen, sind Promotoren oder Aktivatorsequenzen aus Promo­ toren oder Enhancern von solchen Genen, die für Proteine kodieren, die nur in bestimmten Zelltypen exprimiert werden.

Beispiele für regulierbare Elemente, die zellzyklusspezifische Expression in Euka­ ryonten ermöglichen, sind Promotoren folgender Gene: cdc25A, cdc25B, cdc25C, Cyclin A, Cyclin E, cdc2, E2F-1 bis E2F-5, B-myb oder DHFR (Zwicker J. und Müller R. (1997) Trends Genet. 13, 3-6). Die Verwendung von zellzyklusregu­ lierten Promotoren ist besonders bevorzugt in Fällen, in denen die Expression der erfindungsgemäß verwendeten Polypeptide oder Nukleinsäuren auf proliferieren­ de Zellen beschränkt werden soll.

Beispiele für regulierbare Elemente, die metabolischspezifische Expression in Eukaryonten ermöglichen, sind Promotoren, die durch Hypoxie, durch Glukose­ mangel, durch Phosphatkonzentration oder durch Hitzeschock reguliert werden.

Um die Einführung von den vorangehend beschriebenen Nukleinsäuren und damit die Expression des Polypeptids in einer eu- oder prokaryotischen Zelle durch Transfektion, Transformation oder Infektion zu ermöglichen, kann die Nuklein­ säure als Plasmid, als Teil eines viralen oder nicht-viralen Vektors vorliegen. Als virale Vektoren eignen sich hierbei besonders: Baculoviren, Vakziniaviren, Ade­ noviren, adenoassoziierte Viren und Herpesviren. Als nicht-virale Vektoren eignen sich hierbei besonders: Virosomen, Liposomen, kationische Lipide, oder po­ ly-Lysin konjugierte DNA.

Beispiele von gentherapeutisch wirksamen Vektoren sind Virusvektoren, bei­ spielsweise Adenovirusvektoren oder retroviralen Vektoren (Lindemann et al., 1997, Mol. Med. 3: 466-76; Springer et al., 1998, Mol. Cell. 2: 549-58). Eukaryo­ tische Expressionsvektoren eignen sich in isolierter Form für die gentherapeuti­ sche Anwendung, da nackte DNA bei topischer Applikation in Hautzellen ein­ dringen kann (Hengge et al., 1996, J. Clin. Invest. 97: 2911-6; Yu et al., 1999, J. Invest. Dermatol. 112: 370-5).

Gentherapeutisch wirksame Vektoren lassen sich auch dadurch erhalten, daß man die vorangehend beschriebenen Nukleinsäure mit Liposomen komplexiert, da da­ mit eine sehr hohe Transfektionseffizienz, insbesondere von Hautzellen, erreicht werden kann (Alexander und Akhurst, 1995, Hum. Mol. Genet. 4: 2279-85). Bei der Lipofektion werden kleine unilamellare Vesikel aus kationischen Lipiden durch Ultraschallbehandlung der Liposomensuspension herstellt. Die DNA wird ionisch auf der Oberfläche der Liposomen gebunden, und zwar in einem solchen Verhältnis, daß eine positive Nettoladung verbleibt und die Plasmid-DNA zu 100% von den Liposomen komplexiert wird. Neben den von Felgner et al. (1987, supra) eingesetzten Lipidmischungen DOTMA (1,2-Dioleyloxpropyl-3- trimethylammoniumbromid) und DPOE (Dioleoylphosphatidylethanolamin) wur­ den inzwischen zahlreiche neue Lipidformulierungen synthetisiert und auf ihre Effizienz der Transfektion verschiedener Zellinien getestet (Behr et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6982-6986; Gao und Huang (1991), Biochim. Biophys. Acta 1189, 195-203; Felgner et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 2550-­ 2561). Beispiele der neuen Lipidformulierungen sind DOTAP N-[1-(2,3- Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumethylsulfat oder DOGS (TRANSFECTAM; Dioctadecylamidoglycylspermin). Hilfsstoffe, die den Trans­ fer von Nukleinsäuren in die Zelle erhöhen, können beispielsweise Proteine oder Peptide, die an DNA gebunden sind oder synthetische Peptid-DNA-Moleküle, die den Transport der Nukleinsäure in den Kern der Zelle ermöglichen, sein (Schwartz et al. (1999) Gene Therapy 6, 282; Brandén et al. (1999) Nature Bio­ tech. 17, 784). Hilfsstoffe umfassen auch Moleküle, die die Freisetzung von Nu­ kleinsäuren in das Cytoplasma der Zelle ermöglichen (Planck et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 12918; Kichler et al. (1997) Bioconj. Chem. 8, 213) oder beispiels­ weise Liposomen (Uhlmann und Peymann (1990) supra). Eine andere besonders geeignete Form von gentherapeutischen Vektoren läßt sich dadurch erhalten, daß man die vorangehend beschriebene Nukleinsäure auf Goldpartikeln aufbringt und diese mit Hilfe der sogenannten "Gene Gun" in Gewebe, bevorzugt in die Haut, oder Zellen schießt (Wang et al., 1999, J. Invest. Dermatol., 112: 775-81, Tuting et al., 1998, J. Invest. Dermatol. 111: 183-8).

Eine weitere Form eines gentherapeutisch wirksamen Vektors läßt sich durch das Einbringen von "nackten" Expressionsvektoren in eine biokompatible Matrix, beispielsweise eine Kollagenmatrix, herstellen. Diese Matrix kann in Wunden eingebracht werden, um die einwandernden Zellen mit dem Expressionsvektor zu transfizieren und die erfindungsgemäßen Polypeptide in den Zellen zu exprimie­ ren (Goldstein und Banadio, US 5,962,427).

Für die gentherapeutische Anwendung der vorangehend beschriebenen Nuklein­ säure ist es auch von Vorteil, wenn der Teil der Nukleinsäure, der für das Poly­ peptid kodiert, ein oder mehrere nicht kodierende Sequenzen einschließlich Intronsequenzen, vorzugsweise zwischen Promotor und dem Startcodon des Poly­ peptids, und/oder eine polyA-Sequenz, insbesondere die natürlich vorkommende polyA-Sequenz oder eine SV40 Virus polyA-Sequenz, vor allem am 3'-Ende des Gens enthält, da hierdurch eine Stabilisierung der mRNA erreicht werden kann (Palmiter et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 478-482; Jackson, 1993, Cell 74: 9-14).

Knock-out Genkonstrukte sind dem Fachmann zum Beispiel aus den US-Patenten 5,625,122; US 5,698,765; US 5,583,278 und US 5,750,825 bekannt.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Wirtszelle, insbe­ sondere eine Hautzelle, die mit einem der vorangehend beschriebenen Vektoren oder knock-out Genkonstrukt transformiert ist. Wirtszellen können sowohl proka­ ryotische als auch eukaryotische Zellen sein, Beispiele für prokaryotische Wirts­ zellen sind E. coli und für eukaryotische Zellen Saccharomyces cerevisiae oder Insektenzellen.

Ein besonders bevorzugte transformierte Wirtszelle ist eine transgene embryonale nichtmenschliche Stammzelle, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie mindestens ein knock-out Genkonstrukt und/oder mindestens eine Expressionskassette, wie vorangehend beschrieben, enthält. Verfahren zur Transformation von Wirtszellen und/oder Stammzellen sind dem Fachmann gut bekannt und umfassen zum Bei­ spiel Elektroporation oder Mikroinjektion.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein transgenes nichtmenschliches Säu­ getier, dessen Genom mindestens ein knock-out Genkonstrukt und/oder minde­ stens eine Expressionskassette, wie vorangehend beschrieben, enthält. Transgene Tiere zeigen im allgemeinen eine gewebespezifisch erhöhte Expression der Nu­ kleinsäuren und/oder Polypeptide und lassen sich zur Analyse von Wundheilungs­ störungen verwenden. So weist beispielsweise eine Activin A transgene Maus eine verbesserte Wundheilung auf (Munz et al., 1999, EMBO J. 18: 5205-15) wäh­ rend eine transgene Maus mit dominant negativem KGF Rezeptor eine verzögerte Wundheilung aufweist (Werner et al., 1994, Science 266: 819-22).

Verfahren zur Herstellung von transgenen Tieren, insbesondere von transgenen Mäusen, sind dem Fachmann ebenfalls aus der DE 196 25 049 und den US 4,736,866; US 5,625,122; US 5,698,765; US 5,583,278 und US 5,750,825 be­ kannt und umfassen transgene Tiere, die beispielsweise über direkte Injektion von Expressionsvektoren (s. o.) in Embryonen oder Spermatozyten oder über die Transfektion von Expressionsvektoren in embryonale Stammzellen erzeugt werden können (Polites und Pinkert: DNA Microinjection and Transgenic Animal Produktion, Seite 15 bis 68 in Pinkert, 1994: Transgenic animal technology: a laboratory handbook, Academic Press, London, UK; Houdebine, 1997, Harwood Academic Publishers, Amsterdam, The Netherlands; Doetschman: Gene Transfer in Embryonic Stern Cells, Seite 115 bis 146 in Pinkert, 1994, supra; Wood: Retro­ virus-Mediated Gene Transfer, Seite 147 bis 176 in Pinkert, 1994, supra; Mona­ stersky: Gene Transfere Technology: Alternative Techniques and Applications, Seite 177 bis 220 in Pinkert, 1994, supra).

Werden die vorangehend beschriebenen Nukleinsäuren in sogenannte "Targeting" Vektoren oder "knock-out" Genkonstrukte integriert (Pinkert, 1994, supra) kön­ nen nach Transfektion von embryonalen Stammzellen und homologer Rekombi­ nation beispielsweise knock-out Mäuse generiert werden, die im allgemeinen als heterozygote Mäuse verringerte Expression der Nukleinsäure zeigen, während homozygote Mäuse keine Expression der Nukleinsäure mehr aufweisen. Auch die so erzeugten Tiere lassen sich zur Analyse von Wundheilungsstörungen verwen­ den. So weisen beispielsweise die eNOS- (Lee et al., 1999, Am. J. Physiol. 277:H1600-H1608), Nf-1 (Atit et al., 1999, J. Invest. Dermatol. 112: 835-42) und Osteopontin (Liaw et al., 1998, J. Clin. Invest. 101: 967-71) knock-out Mäuse eine verschlechterte Wundheilung auf. Auch hier ist eine gewebespezifische Reduktion der Expression wundheilungsrelevanter Gene, beispielsweise in hautspezifischen Zellen unter Verwendung des Cre-loxP Systems (stat3 knock-out, Sano et al., EMBO J. 1999 18: 4657-68), besonders zu bevorzugen. So erzeugte transgene und knock-out Zellen oder Tiere lassen sich auch zum Screening und zur Identifizie­ rung von pharmakologisch aktiven Substanzen bzw. gentherapeutisch aktiven Vektoren verwenden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung ei­ nes Polypeptids zur (i) Diagnose und/oder Behandlung von Erkrankungen, insbe­ sondere Hauterkrankungen, und/oder (ii) Diagnose und/oder Behandlung bei der Wundheilung, insbesondere Wundheilungsstörungen, oder (iii) Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen in einer geeigneten Wirtszelle, das da­ durch gekennzeichnet ist, daß mindestens eine der vorangehend beschriebenen Nukleinsäuren verwendet wird.

Das Polypeptid wird beispielsweise durch Expression der vorangehend beschrie­ benen Nukleinsäuren in einem geeigneten Expressionssystem, wie oben bereits erwähnt, nach dem Fachmann allgemein bekannten Methoden hergestellt. Als Wirtszellen eignen sich beispielsweise die E, coli Stämme DHS, HB101 oder BL21, der Hefestamm Saccharomyces cerevisiae, die Insektenzellinie Lepidopte­ ran, z. B. von Spodoptera frugiperda, oder die tierischen Zellen COS, Vero, 293, HaCaT, und HeLa, die alle allgemein erhältlich sind.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins zur (i) Diagnose und/oder Behandlung von Erkrankungen, insbe­ sondere Hauterkrankungen, und/oder (ii) Diagnose und/oder Behandlung bei der Wundheilung, insbesondere Wundheilungsstörungen, oder (iii) Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen in einer geeigneten Wirtszelle, bei dem mindestens eine der vorangehend beschriebenen Nukleinsäuren verwendet wird.

Hergestellt werden hierbei Fusionsproteine, die die oben beschriebenen Polypep­ tide enthalten, wobei die Fusionsproteine selbst bereits die Funktion eines Poly­ peptids der Erfindung aufweisen oder erst nach Abspaltung des Fusionsanteils die spezifische Funktion aufweisen. Vor allem zählen hierzu Fusionsproteine mit ei­ nem Anteil von ca. 1-300, vorzugsweise ca. 1-200, insbesondere ca. 1-100, vor allem ca. 1-50 fremden Aminosäuren. Beispiele solcher Peptidsequenzen sind prokaryotische Peptidsequenzen, die z. B. aus der Galactosidase von E. coli ab­ geleitet sein können. Weiterhin können auch virale Peptidsequenzen, wie zum Beispiel vom Bakteriophagen M13 verwendet werden, um so Fusionsproteine für das dem Fachmann bekannte "phage display"-Verfahren zu erzeugen.

Weitere bevorzugte Beispiele für Peptidsequenzen für Fusionsproteine sind Pepti­ de, die die Detektion der Fusionsproteine erleichtern, hierzu zählen beispielsweise "Green-fluorescent-protein" oder Varianten davon.

Zur Aufreinigung der vorangehend beschriebenen Proteine kann ein weite­ res/weiterer Polypeptid ("tag") angefügt sein. Erfindungsgemäße Protein-tags erlauben beispielsweise die hochaffine Absorption an eine Matrix, stringentes Waschen mit geeigneten Puffern, ohne den Komplex in nennenswertem Maße zu eluieren und anschließend gezielte Elution des absorbierten Komplexes. Beispiele der dem Fachmann bekannten Protein-tags sind ein (His)₆-tag, ein Myc-tag, ein FLAG-tag, ein Hämagglutinin-tag, Glutathion-Transferase (GST)-tag, Intein mit einem Affinitäts-Chitin-binding-tag oder Maltose-binding protein (MBP)-tag. Diese Protein-tags können sich N-, C-terminal und/oder intern befinden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung ei­ nes Antikörpers oder Antikörperfragments, vorzugsweise eines polyklonalen oder monoklonalen Antikörpers zur (i) Diagnose und/oder Behandlung von Erkran­ kungen, insbesondere Hauterkrankungen, und/oder (ii) Diagnose und/oder Be­ handlung bei der Wundheilung, insbesondere Wundheilungsstörungen, oder (iii) Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen, bei dem ein Polypeptid oder eine Varianten davon, wie vorangehend beschrieben, verwendet wird.

Das Verfahren erfolgt nach dem Fachmann allgemein bekannten Methoden durch Immunisieren eines Säugetiers, beispielsweise eines Kaninchens, mit dem ge­ nannten Polypeptid oder Varianten davon, vorzugsweise mit Teilen davon, mit mindestens 6 Aminosäuren Länge, vorzugsweise mit mindestens 8 Aminosäuren Länge, insbesondere mit mindestens 12 Aminosäuren Länge, gegebenenfalls in Anwesenheit von z. B. Freunds Adjuvant und/oder Aluminiumhydroxidgelen (siehe z. B. Diamond, B. A. et al. (1981) The New England Journal of Medicine, 1344-1349). Die im Tier aufgrund einer immunologischen Reaktion entstandenen polyklonalen Antikörper lassen sich anschließend nach allgemein bekannten Methoden leicht aus dem Blut isolieren und z. B. über Säulenchromatographie reini­ gen. Monoklonale Antikörper können beispielsweise nach der bekannten Methode von Winter & Milstein (Winter, G. & Milstein, C. (1991) Nature, 349, 293-299) hergestellt werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Antikörper oder Anti­ körperfragment zur (i) Diagnose und/oder Behandlung von Erkrankungen, insbe­ sondere Hauterkrankungen, und/oder (ii) Diagnose und/oder Behandlung bei der Wundheilung, insbesondere Wundheilungsstörungen, oder (iii) Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen, der gegen ein erfindungsgemäßes Po­ lypeptid gerichtet ist und mit den erfindungsgemäßen Polypeptiden spezifisch reagiert, wobei die oben genannten Teile des Polypeptids entweder selbst immu­ nogen sind oder durch Kopplung an geeignete Träger, wie z. B. bovines Serumal­ bumin, immunogen gemacht bzw. in ihrer Immunogenität gesteigert werden kön­ nen. Dieser Antikörper ist entweder polyklonal oder monoklonal, bevorzugt ist ein monoklonaler Antikörper. Unter dem Begriff Antikörper oder Antikörperfragment versteht man gemäß der vorliegenden Erfindung auch gentechnisch hergestellte und gegebenenfalls modifizierte Antikörper bzw. antigenbindende Teile davon, wie z. B. chimäre Antikörper, humanisierte Antikörper, multifunktionelle Antikör­ per, bi- oder oligospezifische Antikörper, einzelsträngige Antikörper, F(ab)- oder F(ab)₂-Fragmente (siehe z. B. EP-B1-0 368 684, US 4,816,567, US 4,816,397, WO 88/01649, WO 93/06213, WO 98/24884).

Die erfindungsgemäßen Antikörper oder Antikörperfragmente können zur (i) Dia­ gnose und/oder Behandlung von Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankungen, und/oder (ii) Diagnose und/oder Behandlung bei der Wundheilung, insbesondere Wundheilungsstörungen, oder (iii) Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen verwendet werden.

So kann beispielsweise die lokale Injektion von monoklonalen Antikörpern gegen TGF beta 1 im Tiermodell die Wundheilung verbessern (Ernst et al., 1996, Gut 39: 172-5).

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Arz­ neimittels zur (i) Behandlung von Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankun­ gen, und/oder (ii) Behandlung bei der Wundheilung, insbesondere Wundheilungs­ störungen, bei dem mindestens eine Nukleinsäure, mindestens ein Polypeptid oder mindestens ein Antikörper, wie vorangehend beschrieben, zusammen mit geeig­ neten Zusatz- und Hilfsstoffen kombiniert wird.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein nach diesem Verfahren herge­ stelltes Arzneimittel zur (i) Behandlung von Erkrankungen, insbesondere Hauter­ krankungen, und/oder (ii) Behandlung bei der Wundheilung, insbesondere Wund­ heilungsstörungen, das mindestens eine Nukleinsäure, mindestens ein Polypeptid oder mindestens einen Antikörper, wie vorangehend beschrieben, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen, enthält. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung dieses Arzneimittels zur (i) Behandlung von Erkran­ kungen, insbesondere Hauterkrankungen, und/oder (ii) Behandlung bei der Wundheilung, insbesondere Wundheilungsstörungen.

Die Therapie (i) von Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankungen, und/oder (ii) bei der Wundheilung, insbesondere von Wundheilungsstörungen, kann auf her­ kömmliche Weise, z. B. durch Verbände, Pflaster, Kompressen oder Gele erfol­ gen, die die erfindungsgemäßen Arzneimittel enthalten. So ist es möglich, die geeignete Zusatz- oder Hilfsstoffe, wie z. B. physiologische Kochsalzlösung, entmineralisiertes Wasser, Stabilisatoren, Proteinaseinhibitoren, Gelformulierun­ gen, wie z. B. weiße Vaseline, dünnflüssiges Paraffin und/oder gelbes Wachs, etc., enthaltenden Arzneimittel topisch und lokal zu verabreichen, um die Wundhei­ lung sofort und unmittelbar zu beeinflussen. Die Verabreichung der erfindungs­ gemäßen Arzneimittel kann weiterhin gegebenenfalls in Form von Liposomenkomplexen bzw. Goldpartikelkomplexen ebenfalls topisch und lokal im Bereich der Wunde erfolgen. Weiterhin kann die Behandlung mittels eines transdermalen therapeutischen Systems (TTS) erfolgen, das eine zeitlich gesteuerte Abgabe der erfindungsgemäßen Arzneimittel ermöglicht. Die Behandlung mittels der erfin­ dungsgemäßen Arzneimittel kann aber auch über orale Dosierungsformen, wie z. B. Tabletten oder Kapseln, über die Schleimhäute, zum Beispiel der Nase oder der Mundhöhle, oder in Form von unter die Haut implantierten Dispositorien er­ folgen. TTS sind zum Beispiel aus den EP 0 944 398, EP 0 916 336, EP 0 889 723 oder EP 0 852 493 bekannt.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Diagnostikums zur Diagnose von Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankungen und/oder zur Diagnose bei der Wundheilung, das dadurch gekennzeichnet ist, daß mindestens eine Nukleinsäure, mindestens ein Polypeptid oder mindestens ein Antikörper, wie vorangehend beschrieben, gegebenenfalls zusammen mit geeig­ neten Zusatz- und Hilfsstoffen, verwendet wird.

Beispielsweise kann gemäß der vorliegenden Erfindung anhand einer der be­ schriebenen Nukleinsäure ein Diagnostikum auf der Basis der Polymeraseketten­ reaktion (Beispiel 2, PCR-Diagnostik, z. B. gemäß EP 0 200 362) oder eines RNase-Protection-Assays (siehe z. B. Sambrook et al., supra Kapitel 7, Seite 7.71-­ 7.78; Werner et al., 1992, Growth Factors and Receptors: A Practical Approach 175-197; Werner, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 6896-6900) hergestellt werden. Diese Tests beruhen auf der spezifischen Hybridisierung einer Nuklein­ säure mit ihrem komplementären Gegenstrang, üblicherweise der entsprechenden mRNA oder ihrer cDNA. Die vorangehend beschriebenen Nukleinsäuren können hierbei auch modifiziert sein, wie z. B. in EP 0 063 879 offenbart. Vorzugsweise wird ein solches DNA-Fragment mittels geeigneter Reagenzien, z. B. radioaktiv mit α-P³²-dCTP oder nicht-radioaktiv mit Biotin oder Digoxigenin, nach allge­ mein bekannten Methoden markiert und mit isolierter RNA, die vorzugsweise vorher an geeignete Membranen aus z. B. Cellulose oder Nylon gebunden wurde, inkubiert. Bei gleicher Menge an untersuchter RNA aus jeder Gewebeprobe kann somit die Menge an mRNA bestimmt werden, die spezifisch durch die Sonde markiert wurde. Alternativ kann die Bestimmung der mRNA Menge auch direkt in Gewebeschnitten mit Hilfe der in situ Hybridisierung (siehe z. B. Werner et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 6896-900) erfolgen.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Diagnostikums kann somit auch in vitro die Expressionsstärke des jeweiligen Gens in einer Gewebeprobe spezifisch gemessen werden, um beispielsweise eine Wundheilungsstörung oder dermatologische Er­ krankungen sicher diagnostizieren zu können (Beispiele 1 bis 3). Insbesondere eignet sich ein solches Verfahren zur frühzeitigen Prognose von Störungen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Diagnostikum zur Diagnose von Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankungen oder Diagnosti­ kum bei der Wundheilung, das mindestens eine Nukleinsäure, mindestens ein Polypeptid oder mindestens einen Antikörper, wie vorangehend beschrieben, ge­ gebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen, umfaßt.

Ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Diagnostikum enthält das beschriebene Poly­ peptid bzw. die oben näher beschriebenen immunogenen Teile davon. Das Poly­ peptid bzw. die Teile davon, die vorzugsweise an eine Festphase, z. B. aus Ni­ trocellulose oder Nylon, gebunden sind, können beispielsweise mit der zu unter­ suchenden Körperflüssigkeit, z. B. Wundsekret, in vitro in Berührung gebracht werden, um so beispielsweise mit Autoimmunantikörper reagieren zu können. Der Antikörper-Peptid-Komplex kann anschließend beispielsweise anhand markierter Antihuman-IgG- oder Antihuman-IgM-Antikörper nachgewiesen werden. Bei der Markierung handelt es sich beispielsweise um ein Enzym, wie Peroxidase, das eine Farbreaktion katalysiert. Die Anwesenheit und die Menge an anwesenden Autoimmunantikörper kann somit über die Farbreaktion leicht und schnell nach­ gewiesen werden.

Ein weiteres Diagnostikum, das Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, ent­ hält die erfindungsgemäßen Antikörper selbst. Mit Hilfe dieser Antikörper kann beispielsweise eine Gewebeprobe leicht und schnell dahingehend untersucht wer­ den, ob das betreffende Polypeptid in einer erhöhten Menge vorhanden ist, um dadurch einen Hinweis auf eine mögliche Erkrankung, insbesondere Hauterkran­ kungen und Wundheilungsstörung zu erhalten. In diesem Fall sind die erfin­ dungsgemäßen Antikörper beispielsweise mit einem Enzym, wie oben bereits beschrieben, markiert. Der spezifische Antikörper-Peptid-Komplex kann dadurch leicht und ebenso schnell über eine enzymatische Farbreaktion nachgewiesen werden.

Ein weiteres erfindungsgemäßes Diagnostikum umfaßt eine Sonde, vorzugsweise eine DNA-Sonde, und/oder Primer. Dies eröffnet eine weitere Möglichkeit, die beschriebenen Nukleinsäuren, zum Beispiel durch die Isolierung aus einer geeig­ neten Genbank, beispielsweise aus einer wundspezifischen Genbank, anhand einer geeigneten Sonde zu erhalten (siehe z. B. J. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning. A Laboratory Manual 2^nd edn., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY Kapitel 8 Seite 8.1 bis 8.81, Kapitel 9 Seite 9.47 bis 9.58 und Kapitel 10 Seite 10.1 bis 10.67).

Als Sonde eignen sich beispielsweise DNA- oder RNA-Fragmente mit einer Län­ ge von ca. 100-1000 Nukleotiden, vorzugsweise mit einer Länge von ca. 200-500 Nukleotiden, insbesondere mit einer Länge von ca. 300-400 Nukleotiden deren Sequenz aus den Polypeptiden gemäß den SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 48, SEQ ID Nr. 55 bis SEQ a Nr. 58 und SEQ ID Nr. 63 bis SEQ ID Nr. 73 des Sequenz­ protokolls und/oder anhand der cDNA Sequenzen der in den Fig. 4 bis 6 an­ gegebenen Datenbankeinträge oder anhand des Sequenzprotokolls gemäß einer SEQ ID Nr. 50 bis SEQ ID Nr. 54 abgeleitet werden kann.

Alternativ können anhand der abgeleiteten Nukleinsäuresequenzen Oligonukleoti­ de synthetisiert werden, die sich als Primer für eine Polymerase Kettenreaktion eignen. Mit diesen kann die vorangehend beschriebene Nukleinsäure oder Teile dieser aus cDNA, beispielsweise wundspezifischer cDNA, amplifiziert und iso­ liert werden (Beispiel 2). Als Primer eignen sich beispielsweise DNA-Fragmente mit einer Länge von ca. 10 bis 100 Nukleotiden, vorzugsweise mit einer Länge von ca. 15 bis 50 Nukleotiden, insbesondere mit einer Länge von 20 bis 30 Nu­ kleotiden deren Sequenz aus den Polypeptiden gemäß den SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 48 und SEQ ID Nr. 55 bis SEQ ID Nr. 58 und SEQ ID Nr. 63 bis SEQ ID Nr. 73 des Sequenzprotokolls und/oder anhand der cDNA Sequenzen der in den Fig. 4 bis 6 angegebenen Datenbankeinträge oder anhand des Sequenzproto­ kolls gemäß einer SEQ ID Nr. 50 bis SEQ ID Nr. 54 abgeleitet werden kann.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung des erfindungs­ gemäßen Diagnostikums zur (i) Diagnose von Erkrankungen, insbesondere Hau­ terkrankungen, und/oder (ii) Diagnose bei der Wundheilung, insbesondere Dia­ gnose bei Wundheilungsstörungen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung ei­ nes Tests zur Auffindung von Interaktoren in Zusammenhang mit Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankungen und/oder in Zusammenhang mit Wundheilung, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Nukleinsäure, mindestens ein Poly­ peptids oder mindestens ein Antikörper oder Antikörperfragment, wie vorange­ hend beschrieben, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfs­ stoffen, zur Herstellung des Tests verwendet wird.

Unter dem Begriff "Interaktoren" im Sinne der vorliegenden Erfindung sind alle diejenigen Moleküle, Verbindungen und/oder Zusammensetzungen und Stoffge­ mische zu verstehen, die mit den vorangehend beschriebenen Nukleinsäuren, Po­ lypeptiden, Antikörpern oder Antikörperfragment, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen, unter geeigneten Bedingungen in Wechsel­ wirkung treten können. Mögliche Interaktoren sind einfache chemische organi­ sche oder anorganische Moleküle oder Verbindungen, können aber auch Peptide, Proteine oder Komplexe davon umfassen. Die Interaktoren können aufgrund ihrer Wechselwirkung die Funktion(en) der Nukleinsäuren, Polypeptide oder Antikör­ per in vivo oder in vitro beeinflussen oder auch nur an die vorangehend beschrie­ benen Nukleinsäuren, Polypeptiden, Antikörpern oder Antikörperfragmenten bin­ den oder mit ihnen andere Wechselwirkungen kovalenter oder nicht-kovalenter Weise eingehen.

Die Erfindung umfaßt weiterhin einen erfindungsgemäß hergestellten Test zur Identifizierung von Interaktoren in Zusammenhang mit (i) Erkrankungen, insbe­ sondere Hauterkrankungen, und/oder (ii) Wundheilung, insbesondere Wundhei­ lungstörungen, der mindestens eine Nukleinsäure, mindestens ein Polypeptid oder mindestens einen Antikörper oder Antikörperfragment gemäß der vorliegenden Erfindung, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen, umfaßt.

Ein geeignetes System läßt sich beispielsweise durch die stabile Transformation von epidermalen bzw. dermalen Zellen mit Expressionsvektoren, die selektierbare Markergene und die beschriebenen Nukleinsäuren enthalten, herstellen. Bei die­ sem Verfahren wird die Expression der beschriebenen Nukleinsäuren in den Zel­ len so verändert, daß sie der pathologisch gestörten Expression in vivo entspricht. Auch anti-sense Oligonukleotide, die die beschriebenen Nukleinsäure enthalten, können zu diesem Zweck eingesetzt werden. Von besonderem Vorteil für diese Systeme ist es daher, das Expressionsverhalten der Gene bei gestörten regenerati­ ven Prozessen, wie in dieser Anmeldung offengelegt, zu kennen. Oft kann so das pathologische Verhalten der Zellen in vitro nachgeahmt werden und es können Substanzen gesucht werden, die das normale Verhalten der Zellen wieder herstel­ len und die ein therapeutisches Potential besitzen.

Für diese Testsysteme eignen sich z. B. HaCaT-Zellen, die allgemein erhältlich sind, und der Expressionsvektor pCMV4 (Anderson et al., 1989, J. Biol. Chem. 264: 8222-9). Die vorangehend beschriebene Nukleinsäure kann dabei sowohl in sense als auch in anti-sense Orientierung in die Expressionsvektoren integriert werden, so daß die funktionelle Konzentration an mRNA der entsprechenden Ge­ ne in den Zellen entweder erhöht, oder durch Hybridisierung mit der antisense- RNA erniedrigt wird. Nach der Transformation und Selektion stabiler Transfor­ manden zeigen die Zellen in Kultur im allgemeinen ein verändertes Proliferations- Migrations, und/oder Differenzierungsverhalten im Vergleich zu Kontrollzellen. Dieses Verhalten in vitro ist häufig mit der Funktion der entsprechenden Gene bei regenerativen Prozessen im Organismus korreliert (Yu et al., 1997, Arch. Derma­ tol. Res. 289: 352-9; Mils er al., 1997, Oncogene 14: 15555-61; Charvat et al., 1998, Exp Dermatol 7: 184-90; Werner, 1998, Cytokine Growth Factor Rev. 9: 153-65; Mythily et al., 1999, J. Gen. Virol. 80: 1707-13) und läßt sich mit einfa­ chen und schnell durchzuführenden Tests nachweisen, so daß man darauf basie­ rend Testsysteme für pharmakologisch aktive Substanzen aufbauen kann. So läßt sich das Proliferationsverhalten von Zellen sehr schnell durch z. B. den Einbau von markierten Nukleotiden in die DNA der Zellen (siehe z. B. Savino und Dar­ denne, 1985, J. Immunol. Methods 85: 221-6; Perros und Weightman, 1991, Cell Prolif. 24: 517-23; de Fries und Mitsuhashi, 1995, J. Clin. Lab. Anal. 9: 89-95), durch Anfärbung der Zellen mit spezifischen Farbstoffen (Schulz et al., 1994, J. Immunol. Methods 167: 1-13) oder über immunologische Verfahren (Frahm et al., 1998, J. Immunol. Methods 211: 43-50) nachweisen. Die Migration läßt sich ein­ fach durch den "Migration Index" Test (Charvat et al., supra) und vergleichbare Testsysteme (Benestad et al., 1987, Cell Tissue Kinet. 20: 109-19, Junger et al., 1993, J. Immunol. Methods 160: 73-9) nachweisen. Als Differenzierungsmarker eignen sich z. B. Keratin 6, 10 und 14 sowie Loricrin und Involucrin (Rosenthal et al., 1992, J. Invest. Dermatol. 98: 343-50), deren Expression z. B. über allgemein erhältliche Antikörper leicht nachzuweisen ist.

Ein anderes geeignetes Testsystem basiert auf der Identifikation von Interaktionen mit dem sogenannten "Two-Hybrid System" (Fields und Sternglanz, 1994, Trends in Genetics, 10, 286-292; Colas und Brent, 1998 TIBTECH, 16, 355-363). Bei diesem Test werden Zellen mit Expressionsvektoren transformiert, die Fusionsproteine aus dem erfindungsgemäßen Polypeptid und einer DNA- Bindungsdomäne eines Transkriptionsfaktors wie beispielsweise Gal4 oder LexA exprimieren. Die transformierten Zellen enthalten außerdem ein Reportergen, des­ sen Promotor Bindungsstellen für die entsprechende DNA Bindungsdomäne ent­ halten. Durch Transformation eines weiteren Expressionsvektors, der ein zweites Fusionsprotein aus einem bekannten bzw. unbekannten Polypeptid mit einer Akti­ vierungsdomäne, beispielsweise von Gal4 oder Herpes simplex Virus VP16, ex­ primiert, kann die Expression des Reportergens stark gesteigert werden, wenn das zweite Fusionsprotein mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid interagiert. Diese Expressionssteigerung kann man ausnutzen, um neue Interaktoren zu identifizie­ ren, beispielsweise indem man zur Konstruktion des zweiten Fusionsproteins eine cDNA-Bibliothek aus sich regenerierenden Gewebe herstellt. Zudem läßt sich dieses Testsystem zum Screening von Substanzen ausnutzen, die eine Interaktion zwischen dem erfindungsgemäßen Polypeptid und einem Interaktor inhibieren. Solche Substanzen verringern die Expression des Reportergens in Zellen, die Fu­ sionsproteine des erfindungsgemäßen Polypeptids und des Intreraktors exprimie­ ren (Vidal und Endoh, 1999, Trends in Biotechnology, 17: 374-81). So lassen sich schnell neue Wirkstoffe identifizieren, die zur Therapie von Störungen regenerati­ ver Prozesse eingesetzt werden können.

Interaktoren der erfindungsgemäßen Polypeptide können auch Nukleinsäuren sein, die über Selektionsverfahren, wie beispielsweise SELEX (siehe Jayasena, 1999, Clin. Chem. 45: 1628-50; Klug und Famulok, 1994, M. Mol. Biol. Rep. 20: 97-107; Toole et al., 1996, US 5,582,981) isoliert wereden. Im SELEX- Verfahren werden typischerweise aus einem großen Pool unterschiedlicher, ein­ zelsträngige RNA Moleküle durch wiederholte Amplifikation und Selektion die­ jenigen Moleküle isoliert, die an ein Polypeptid mit hoher Affinität binden (Aptamere). Aptamere können auch in ihrer spiegelbildlichen Form, beispielswei­ se als L-Ribonukleotid, synthetisiert und selektioniert werden (Nolte et al., 1996, Nat. Biotechnol. 14: 1116-9; Klussmann et al., 1996, Nat. Biotechnol. 14: 1112-5).

So isolierte Formen haben den Vorteil, das sie nicht von natürlich vorkommenden Ribonukleasen abgebaut werden und daher größere Stabilität besitzen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines auf einem Trägermaterial fixierten Arrays zur Analyse in Zusammenhang mit (i) Er­ krankungen, insbesondere Hauterkrankungen und/oder (ii) Wundheilung, insbe­ sondere Wundheilungsstörungen, bei dem mindestens eine Nukleinsäure, minde­ stens ein Polypeptid oder mindestens ein Antikörper oder Antikörperfragment, wie vorangehend beschrieben, zur Herstellung verwendet wird.

Verfahren zur Herstellung von solchen Arrays sind zum Beispiel aus der US 5,744,305 mittels Festphasenchemie und photolabilen Schutzgruppen bekannt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein auf einem Trägermaterial fixiertes Array zur Analyse in Zusammenhang mit (i) Erkrankungen, insbesondere Hauter­ krankungen und/oder (ii) Wundheilung, insbesondere Wundheilungsstörungen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es mindestens eine Nukleinsäure und/oder mindestens ein Polypeptid und/oder oder mindestens einen Antikörper oder Anti­ körperfragment, wie vorangehend beschrieben, umfaßt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung umfaßt einen DNA-Chip und/oder Prote­ in-Chip zur Analyse in Zusammenhang mit (i) Erkrankungen, insbesondere Hau­ terkrankungen und/oder (ii) Wundheilung, insbesondere Wundheilungsstörungen, der mindestens eine Nukleinsäure, mindestens ein Polypeptid, und/oder minde­ stens einen Antikörper oder Antikörperfragment, wie vorangehend beschrieben, umfaßt. DNA-Chips sind zum Beispiel aus der US 5,837,832 bekannt.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Arzneimittel zur Indika­ tion und Therapie, das eine Nukleinsäure oder ein Polypeptid, wie vorangehend beschrieben, und gegebenenfalls geeignete Zusatz- oder Hilfsstoffe enthält und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Arzneimittels zur Behandlung von dermatologischen Erkrankungen, insbesondere von Wundheilungsstörungen, bei dem eine Nukleinsäure oder ein Polypeptid, wie vorangehend beschrieben, mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger formuliert wird.

Für die gentherapeutische Anwendung beim Menschen ist vor allem ein Arznei­ mittel geeignet, das die beschriebenen Nukleinsäure in nackter Form oder in Form eines der oben beschriebenen gentherapeutisch wirksamen Vektoren oder in mit Liposomen bzw. Goldpartikeln komplexierter Form enthält. Der pharmazeutische Träger ist beispielsweise eine physiologische Pufferlösung, vorzugsweise mit ei­ nem pH von ca. 6,0-8,0, vorzugsweise von ca. 6,8-7,8. Insbesondere von ca. 7,4 und/oder einer Osmolarität von ca. 200-400 milliosmol/Liter, vorzugsweise von ca. 290-310 milliosmol/Liter. Zusätzlich kann der pharmazeutische Träger geeig­ nete Stabilisatoren, wie z. B. Nukleaseinhibitoren, vorzugsweise Komplexbildner wie EDTA und/oder andere dem Fachmann bekannte Hilfsstoffe enthalten.

Die Verabreichung der beschriebenen Nukleinsäure gegebenenfalls in Form der oben näher beschriebenen Virusvektoren oder als Liposomenkomplexe bzw. Goldpartikelkomplex erfolgt üblicherweise topisch und lokal im Bereich der Wunde. Es ist auch möglich, das Polypeptid selbst mit geeigneten Zusatz- oder Hilfsstoffen, wie z. B. physiologische Kochsalzlösung, entmineralisiertes Wasser, Stabilisatoren, Proteinaseinhibitoren, Gelformulierungen, wie z. B. weiße Vaseli­ ne, dünnflüssiges Paraffin und/oder gelbes Wachs, etc., zu verabreichen, um die Wundheilung sofort und unmittelbar zu beeinflussen.

Die Nukleinsäuren der beschriebenen Polypeptide wurden aus cDNA Bibliothe­ ken isoliert, die aus intakter und verwundeter Haut hergestellt wurden. Dabei wurden die cDNAs ausgewählt, die unterschiedliche Häufigkeiten in gut heilen­ den im Vergleich zu schlecht heilenden Wunden aufwiesen (Beispiele 1 und 3) und/oder unterschiedliche Häufigkeiten in Wunden von jungen im Vergleich zu alten Mäusen aufwiesen. Dies geschah beispielsweise mit Hilfe von subtraktiver Hybridisierung (Diatchenko et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 6025-30) und/oder mit dem vergleichenden Auszählen von Klonen in cDNA Bibliotheken mittels Analyse von Restriktionsfragmentmustern (Halle et al., 1999, EP 0965642 A1) und/oder mit Hilfe von "Differential Display RT-PCR" (Liang et al., 1992, Cancer Res. 52: 6996-6998; Liang und Pardee, 1992, Science 257: 967-971; Prashar und Weissman, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 659-663). Die so ausgewählten cDNAs entstammen Genen, die bei Wundheilungsstörungen entwe­ der stärker oder schwächer exprimiert werden als bei normal verlaufender Wund­ heilung.

Allgemein ist die Analyse von differentiell exprimierten Genen in Geweben mit deutlich mehr Fehlern in Form von falsch positiven Klone behaftet, als bei der Analyse von Zellkultursystemen. Da bei der Wundheilung eine Vielzahl von ver­ schiedenen Zelltypen beteiligt sind, deren Zusammensetzung und deren Genex­ pressionsmuster sich während des gesamten Wundheilungsprozesses ständig än­ dert, ergibt sich hier bei der Analyse von differentiell exprimierten Genen eine besonders niedrige Trefferquote. Diese kann nicht durch die Verwendung eines definierten Zellkultursystems umgangen werden, da ein solches auf Grund der Komplexität der Wundheilung nicht zur Verfügung steht. Zudem gibt es enorme Variabilitäten des Wundzustands zum Zeitpunkt einer möglichen Biopsie des Pa­ tienten beim Erstkontakt mit dem Arzt.

Daher wurde zur Identifikation der vorangehend beschriebenen Nukleinsäuren ein Tiermodell verwendet. Es wurden BALB/c Mäuse verwundet und zu verschiede­ nen Zeitpunkten Wundbiopsien entnommen. Dieses Verfahren hat den Vorteil, das sich die Randbedingungen wie genetischer Hintergrund, Art der Wunde, Zeit­ punkt der Biopsie etc. exakt kontrollieren lassen und so erst eine reproduzierbare Analyse der Genexpression erlauben. Selbst unter den definierten Maus- Bedingungen ergeben sich weitere methodische Probleme wie Redundanz der analysierten Klone und Unterrepräsentation von schwach exprimierten Genen, die die Identifikation von relevanten Genen erschweren.

Bei der vorliegenden Analyse der Genexpression wurden während des Wundhei­ lungsprozesses neben Genen, deren Funktion bisher gänzlich unbekannt war, auch Gene identifiziert, die bisher nicht mit Wundheilungsstörungen in Verbindung gebracht wurden. Von zwei der bekannten Gene wurden weiterhin neuartige Vari­ anten mit Sequenzen identifiziert, die signifikant von den bisher veröffentlichten und/oder patentierten Sequenzen abweicht.

Von dem bisher nicht mit Wundheilungsstörungen in Zusammenhang gebrachten Teil der identifizierten Gene war bisher bekannt, daß sie eine Funktion bei der Proliferation (Tsg101: Xie et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95: 1595-­ 1600; MASPIN: Sager et al., 1997, Adv. Exp. Med. Biol. 425: 77-88; B-Raf: Ma­ son et al., 1999, EMBO J. 18: 2137-48; Ikawa et al., 1988, Mol. Cell Biol. 8: 2651- 2654; Prothymosin alpha: Tao et al., 1999, J. Cell. Physiol. 178: 154-163; Eps8: Wong et al., 1994, Oncogene 9: 3057-3061; KIAA1247: WO 9934004; EAT/MCL- 1: Tang et al., 1998, Clin. Cancer Res. 4: 1865-1871; TSC-22: Kester et al., 1999, J. Biol. Chem. 274: 27439-47; Fer: Morns et al., 1990, Cytogenet. Cell. Genet. 53: 196-200), Differenzierung (MASPIN: Zhang et al., 1999, Dev. Biol. 215: 278- 87; Split hand/foot deleted 1: Crackower et al., 1996, Hum. Mol. Genet. 5: 571-9), Zell-Migration (MRP-3: Haelens et al., 1996, Immunobiology 195: 499-521; MCP-3: Taub et al., 1995, J. Clin. Invest. 95: 1370-6; MCP-2: Taub et al., 1995, J. Clin. Invest. 95: 1370-6) und/oder Apoptose (B-Raf: Erhardt et al., 1999, Mol. Cell. Biol. 19: 5308-15) haben. Diese Gene wurden bisher jedoch nicht mit Wund­ heilung in Verbindung gebracht.

Zusätzlich zu den bekannten Polypeptiden von Mensch Phospholipase Inhibitor GIPL (US 5,948,626), MCP-2 (von Coillie et al., 1997, Genomics 40: 323-331) und Maus Cystatin C (Solem et al., 1990, Biochem. Biophys. Res. Commun. 172: 945-951) wurden eng verwandte Polypeptide mit signifikant abweichender Sequenz identifiziert. Von den bekannten Polypeptiden von Mensch Phospholipa­ se GIPL (US 5,948,626) und Mensch KIAA1247 (WO 99/34004) wurden erst­ mals die Sequenzen des entsprechenden Polypeptids der Maus identifiziert.

Die Polypeptide dieser Gene gehören nicht zu den bisher bekannten Zielen von Therapien von Wundheilungsstörungen, so daß sich aus dieser Erfindung völlig neue Therapieansätze ergeben. Von den restlichen identifizierten Genen existiert noch keine Funktionsbeschreibung (Fig. 4).

Nach der primären Identifikation der Gene ist es notwendig, die wundheilungs­ spezifische Expression durch eine weitere Methode zu bestätigen. Dies erfolgte mit Hilfe von sogenannten "Reverse Northern Blots" oder "TaqMan Assays". Mit diesen Methoden wurde die Menge an mRNA in Gewebeextrakten aus verschie­ denen Wundheilungszuständen von 10 Wochen alten Mäusen und/oder von alten und jungen Mäusen und/oder von Mäusen mit Diabetes bestimmt. So wurde bei­ spielsweise die wundspezifische Expression der Klone in einer subtraktiven cDNA Bibliothek mit Hilfe eines "Reverse Northern Blots" ermittelt (Beispiel 1). Es zeigte sich, das ca. 20% aller Klone in den Bibliotheken unterschiedliche Si­ gnale mit Hybridisierungssonden aus Wund-cDNA im Vergleich zu Sonden aus intakter Haut zeigten (Fig. 1). Nach der Identifikation der Klone wurden diese teilweise sequenziert, redundante Klone aussortiert, und die Sequenz mit Se­ quenz-Datenbanken mit dem Ziel abgeglichen, Vollängen Sequenzen der Maus- Gene und der menschlichen Gene zu identifizieren. Die Sequenzierung und Red- undanzanalyse der positiven Klonen ergab, daß mehr als 75% der Klone mehrfach vorhanden waren und somit nur ca. 5% aller Ausgangsklone weiter verwendet werden konnten. Eine Minderheit von diesen wundspezifischen Genen zeigte wiederum eine verminderte Expression in schlecht heilenden Wunden. Von diesen konnte bei ca. 50% die differentielle Expression im "TaqMan Assay" bestätigt werden (Beispiel 2).

Zur Überprüfung bzw. Generierung von Vollängen cDNA Sequenzen der voran­ gehend beschriebenen Nukleinsäuren wurden Vollängen-Klone mit Hilfe von Kolonie-Hybridisierung (Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, Kapitel 8-10) und/oder PCR basierten Methoden ("RACE", Frohman et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8998-9002, Chenchik et al., 1996, in A Laboratory Guide to RNA: Isolation, Analysis, and Synthesis, Ed. Krieg, Wiley-Liss, Seiten 272-321; "LDPCR", Barnes, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2216-20) so­ wohl für die Maus-Gene als auch für die menschlichen Gene generiert und die Sequenz diese Klone bestimmt.

Die Erfindung soll nun im folgenden anhand der Figuren und Beispiele weiter verdeutlicht werden, ohne daß die Erfindung hierauf eingeschränkt wird.

Beschreibung der Tabellen, Figuren und Sequenzen

Fig. 1: Autoradiogramme der Hybridisierungen von Membranen (Maus ATLAS Array, Clontech Laboratories GmbH, Heidelberg) mit glei­ chem Muster von aufgebrachten cDNA-Fragmenten mit vier ver­ schiedenen Sonden. Alle Sonden wurden aus cDNAs hergestellt, die aus subtraktiven Hybridisierungen stammten. A: wundspezifische Sonde (Subtraktion Wunde versus intakte Haut), B: hautspezifische Sonde (Subtraktion intakte Haut versus Wunde), C: Sonde spezifisch für schlecht heilende Wunden (Subtraktion Wunde Dexamethason be­ handelte Tiere versus Wunde Kontrolltiere), D: Sonde spezifisch für gut heilende Wunden (Subtraktion Wunde Kontrolltiere versus Wunde Dexamethason behandelte Tiere). Die Positionen der TTF-1 cDNAs (jeweils doppelt aufgetragen) sind mit Pfeilen gekennzeichnet.

Fig. 2: Tabellarische Aufstellung der veränderten Expression verschiedener wundheilungsrelevanter Gene in Wunden von 10 Wochen alten BALB/c Mäusen und in Wunden von jungen (4 Wochen alt) und alten (12 Monate) Mäusen.

Fig. 3: Tabellarische Aufstellung der veränderten Expression verschiedener wundheilungsrelevanter Gene in Mäusen mit Diabetes.

Fig. 4: Tabellarische Übersicht über die bei der Analyse der Genexpression während des Wundheilungsprozesses identifizierten Polypeptidse­ quenzen mit unbekannter biologischer Funktion und ihre cDNAs und Accession Numbers oder SEQ ID Nummern.

Fig. 5: Tabellarische Übersicht über die bei der Analyse der Genexpression während des Wundheilungsprozesses identifizierten Polypeptidse­ quenzen mit bereits bekannten und beschriebenen Funktionen und ihre cDNAs und Accession Numbers.

Fig. 6: Tabellarische Übersicht über die bei der Analyse der Genexpression während des Wundheilungsprozesses zusätzlich identifizierten Poly­ peptidsequenzen mit bereits bekannten und beschriebenen Funktionen und ihre cDNAs und Accession Numbers oder SEQ ID Nummern.

Fig. 7: Vergleich der Polypeptidsequenz der identifizierten Proteine von SW1136 aus Maus und Mensch. Abweichungen zur humanen Se­ quenz von SW1136 sind markiert.

Fig. 8: Vergleich der Polypeptidsequenz der identifizierten Proteine von SW1295 aus Maus und Mensch. Abweichungen zur humanen Se­ quenz von SW1295 sind markiert.

SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 58 und SEQ ID Nr. 63 bis SEQ ID Nr. 73 zeigen die erfindungsgemäßen Polypeptid- oder cDNA-Sequenzen aus Mensch oder Maus.

SEQ ID Nr. 59 bis SEQ ID Nr. 62 und SEQ ID Nr. 75 bis SEQ ID Nr. 76 zeigen DNA-Sequenzen von Oligo 13820 00070 552 001000280000000200012000285911370900040 0002010030149 00004 13701nukleotiden, die für die Versuche der vorliegenden Erfindung verwendet wurden.

SEQ ID Nr. 74 zeigt den Teil der cDNA Sequenz von humanem MRP-14, aus dem die Sonde für die in situ Hybridisierung hergestellt wurde.

Beispiele Beispiel 1 Anreicherung von wundrelevanter cDNA mittels subtraktiver Hybridi­ sierung und Identifizierung von TTF-1 als wundrelevantes Gen

Aus intakter Haut und aus Wundgewebe (Verwundung am Rücken 1 Tag vor Ge­ webeentnahme durch Scherenschnitt) von BALB/c Mäusen wurde durch Stan­ dardmethoden (Chomczynski und Sacchi, 1987, Anal. Biochem. 162: 156-159, Chomczynski und Mackey, 1995, Anal. Biochem. 225: 163-164) Gesamt-RNA isoliert. Um Gewebe von Mäusen mit schlecht heilenden Wunden zu gewinnen, wurden BALB/c Mäuse vor der Verwundung mit Dexamethason (Injektion von 0,5 mg Dexamethason in isotonischer Salzlösung pro kg Körpergewicht zwei mal pro Tag für 5 Tage) behandelt. Die RNAs wurden dann mit Hilfe einer reversen Transkriptase in cDNA umgeschrieben. Die cDNA Synthese erfolgte mit dem "SMART PCR cDNA Synthesis Kit" der Firma Clontech Laboratories GmbH, Heidelberg, nach Anweisungen des entsprechenden Manuals.

Um diejenigen cDNAs zu identifizieren, die mit unterschiedlicher Häufigkeit in den cDNA Pools vorkamen, wurde eine subtraktive Hybridisierung (Diatchenko et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 6025-30) durchgeführt. Dies er­ folgte mit dem "PCR-Select cDNA Subtraction Kit" der Firma Clontech Labora­ tories GmbH, Heidelberg, nach Anweisungen des entsprechenden Manuals, wobei die Abtrennung überschüssiger Oligonukleotide nach der cDNA Synthese über Agarose-Gelelekrophorese erfolgte. Es wurden vier für wundrelevante Gene ange­ reicherte cDNA Pools angelegt, wobei ein Pool für cDNA Fragmente angereichert war, die im Wundgewebe im Vergleich zu intakter Haut stärker exprimiert sind ("wundspezifischer cDNA Pool"), ein Pool war angereichert an cDNA Fragmen­ ten, die in intakter Haut im Vergleich zu Wundgewebe stärker exprimiert sind ("hautspezifischer cDNA Pool"), ein Pool war angereichert an cDNA Fragmen­ ten, die in gut heilenden Wunde im Vergleich zu schlecht heilenden Wunden stär­ ker exprimiert sind ("gut heilender cDNA Pool") und ein Pool war angereichert an cDNA Fragmenten, die in schlecht heilenden Wunden im Vergleich zu gut hei­ lenden Wunden stärker exprimiert sind ("schlecht heilender cDNA Pool").

Um diejenigen Gene zu identifizieren, die in den wundheilungsrelevanten cDNA- Pools enthalten waren, wurde das Vorhandensein der entsprechenden cDNAs in den Pools im "Reverse Northern Blot" analysiert. Hier werden cDNA-Fragmente auf Membranen in Form von Arrays von vielen verschiedenen cDNAs fixiert, und mit einem komplexen Gemisch radioaktiv markierter cDNA hybridisiert (Sam­ brook et al., 1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, kapitel 9 Seite 9.47 bis 9.58 und kapitel 10 Seite 10.38 bis 10.50; Anderson and Young: Quantitative filter hybridi­ sation; in: Nucleic Acids Hybridisation, A Practical Approach, 1985, Eds. Hames and Higgins, IRL Press Ltd.; Oxford, Kapitel 4, Seite 73 bis 112). Beispielsweise wurden kommerziell erhältliche Membranen verwendet (Maus ATLAS Array, Clontech).

Zur Herstellung geeigneter Hybridisierungssonden wurden die subtrahierten cDNA Pools mit der Restriktionsendonuklease RsaI behandelt und über Agarose­ gelelektrophorese gereinigt (Sambrook et al., supra, Kapitel 6, Seite 6.1 bis 6.35), um die cDNA- Synthese- und Amplifikationsprimer (siehe Manual "PCR-Select cDNA Subtraction Kit", Clonetech) abzutrennen. Die cDNAs wurde dann mit der "random-hexamer priming" Methode (Feinberg und Vogelstein, 1983, Anal. Bio­ chem. 132: 6-13) radioaktiv markiert, um Hybridisierungssonden herzustellen.

Die Membran wurde für 30 min bei 65°C in 25 ml Hybridisierungslösung vorin­ kubiert (25 mM Natriumphosphat, pH = 7,5, 125 mM NaCl, 7% SDS). Die Hy­ bridisierungssonde wurde 10 min bei 100°C denaturiert, anschließend auf Eis ab­ gekühlt, ca. 100 CPM ("counts per minute") pro ml zur Hybridisierungslösung gegeben und die Hybridisierung für 16 Stunden bei 65°C im Hybridisierungsofen durchgeführt. Danach wurde die Membran zweimal für 10 min mit der Hybridi­ sierungslösung ohne Sonde bei 65°C gewaschen. Anschließend wurde die Mem­ bran mehrfach für jeweils 10 min in Waschlösung (2,5 mM Natriumphosphat, pH = 7,5, 12,5 mM NaCl, 0,7% SDS) bei 65°C gewaschen, bis in der abgegossenen Lösung keine Aktivität mehr nachgewiesen werden konnte. Die radioaktiven Si­ gnale wurden mit einem Phosphoimager (BioRad, Quantitiy One®) ausgewertet (Fig. 1). Danach wurden diejenigen cDNAs ausgewählt, die mit den verschiede­ nen Sonden unterschiedliche Signalintensitäten ergaben. Dabei ergab sich an der Position von TTF-1 auf der Membran eine deutlich stärkere Signalintensität mit der Hybridisierungssonde des hautspezifischen cDNA Pools im Vergleich zum wundspezifischen cDNA Pool (Fig. 1A, B). Die Analyse des Experiments, bei dem parallel Hybridisierungen mit dem "schlecht heilenden cDNA Pool" (s. o.) und dem "gut heilenden cDNA Pool" (s. o.) durchgeführt wurden, ergab, daß die Hybridisierungssonde des "schlecht heilenden cDNA Pools" an der Position von TTF-1 signifikant stärker hybridisierte (Fig. 1C, D). Somit wurde in zwei unter­ schiedlichen Wundheilungszuständen eine differentielle Expression von TTF-1 beobachtet.

Beispiel 2 Verifikation des Expressionsmusters von TTF-1 mittels "real time quantitative RTPCR"

Eine Verifikation der differentiellen Expression der vorangehend beschriebenen Nukleinsäuren als auch die Untersuchung weiterer Wundheilungszustände er­ folgte über eine real-time RTPCR im ABI Prism 7700 Sequence Detection Sy­ stem (PE Applied Biosystems). Das Gerät war mit der ABI Prism 7200/7700 SDS-Software Version 1.6.3 (1998) ausgestattet. Der Nachweis von PCR Pro­ dukten erfolgte während der Amplifikation der cDNA mit Hilfe des Farbstoffs SYBR Green 1, dessen Fluoreszenz durch Bindung an doppelsträngige DNA stark erhöht wird (Karlsen et al. 1995, J. Virol. Methods. 55: 153-6; Wittwer et al., 1997, BioTechniques 22: 130-8, Morrison et al., 1998, BioTechniques 24: 954-­ 62). Basis für die Quantifizierung ist der PCR Zyklus ("threshold cycle", CT- Wert), der erreicht ist, wenn das Fluoreszenzsignal einen definierten Schwellen­ wert übersteigt. Die Auswertung erfolgt über die Δ-CT-Methode (User Bulletin #2, Relative Quantitation of Gene Expression, PE Applied Biosystems, 1997). Die Abundanzen der cDNAs wurden relativ zu einer endogenen Referenz (GAPDH) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 und 3 dargestellt.

Um Gewebe von Mäusen mit schlecht heilenden Wunden zu gewinnen, wurden BALB/c Mäuse vor der Verwundung mit Dexamethason (Injektion von 0,5 mg Dexamethason in isotonischer Salzlösung pro kg Körpergewicht zwei mal pro Tag für 5 Tage) behandelt. Um Gewebe von jungen und alten Mäusen zu gewinnen, wurden 1-Tageswunden von 4 Wochen alten und 12 Monate alten BALB/c Mäu­ sen verwendet. Um Wundgewebe von Mäusen mit Diabetes zu erhalten, wurden 1 Tageswunden von 10 Wochen alten C57BL/Ks-db/db/Ola Mäuse verwendet. Ge­ samt-RNA wurde wie oben beschrieben aus Haut und Wundgewebe gewonnen und 1 µg Gesamt-RNA wurde mit dem TaqMan Reverse Transcription Reagents Kit (Perkin Elmer) nach den Empfehlungen des Herstellers (SYBR Green PCR and RT-PCR Reagents-Protokol, Perkin Elmer Applied Biosystems, 1998) in ei­ nem Thermocycler (GeneAmp PCR-System 9700, PE) revers transkribiert. Die Primer für die Amplifikation der TTF-1 cDNA (TTF-1-Primer 1: CGAGCGCTACATTGTCGCT (SEQ ID Nr. 59), TTF-1-Primer 2: GTCTTAAATTTGCTTGTGCCCC (SEQ ID Nr. 60) und der Referenz (GAPDH- Primer1: ATCAACGGGAAGCCCATCA (SEQ a Nr. 61), GAPDH-Primer2: GACATACTCAGCACCGGCCT (SEQ ID Nr. 62)) wurden anhand der vorange­ hend beschriebenen Nukleinsäure und der bekannten Sequenz von GAPDH mit der Primer-Express-Software für Macintosh PPC Version 1.0 (PE Applied Biosy­ stems, P/N 402089, 1998) ausgewählt. Für die PCR wurde das SYBR Green PCR Core Reagents Kit (4304886, PE Applied Biosystems) verwendet. Die Konzentration der Primer in der PCR wurde zunächst im Bereich von 50 nM bis 600 nM optimiert und die Spezifität der PCR durch Analyse der Länge der amplifizierten Produkte in einer Agarose-Gel Elekrophorese geprüft. Anschließend wurde mit­ tels einer Verdünnungsreihe die Effizienz der PCR-Systeme ermittelt (User Bulletin #2, Relative Quantitation of Gene Expression, PE Applied Biosystems, 1997). Dabei ergab sich, daß für beide cDNAs die Effizienz der Amplifikation bei 100% lag, d. h. bei jeder 1 : 2 Verdünnung der cDNA wurde ein Zyklus mehr be­ nötigt, um den Fluoreszensschwellenwert zu überschreiten.

Für die Quantifizierung wurden je Ansatz cDNA aus 10 ng revers transkribierter Gesamt-RNA in einem Gesamtvolumen von 25 µl amplifiziert. Die Laufbedin­ gungen für die PCR entsprachen den Angaben des Herstellers (PE Applied Biosy­ stems, SYBR Green PCR and RT-PCR Reagents Protocol, 1998). Die CT-Werte wurden analysiert und die Abundanz von TTF-1 relativ zu GAPDH wurde be­ rechnet. Dabei bestätigte sich zum Einen die Abnahme von TTF-1 in Wunden im Vergleich zu intakter Haut von Kontrolltieren als auch von jungen Mäusen (Fig. 2, vergleiche Fig. 1A, B). Zum Anderen wurde wiederum eine verstärkte Ex­ pression von TTF-1 in schlecht heilenden Wunden von mit Dexamethason behan­ delten Mäusen im Vergleich zu gut heilenden Wunden von Kontrolltieren beob­ achtet (Fig. 2, vergleiche Fig. 1B, C). Außerdem konnte eine Abnahme von TTF-1 in_Wunden von Mäusen mit Diabetes gemessen werden Fig. 3). Somit konnte die Regulation der Expression von TTF-1 in unterschiedlichen Wundhei­ lungszuständen verifiziert werden.

Beispiel 3 Identifizierung von MCP-2 als wundrelevantes Gen mittels verglei­ chendem Auszählen von Klonen in cDNA Bibliotheken durch Analyse von Re­ striktionsfragmentmustern

BALB/c Mäuse wurden mit Dexamethason (Injektion von 0,5 mg Dexamethason pro kg Körpergewicht zwei mal pro Tag für 5 Tage) behandelt und anschließend verwundet um Gewebe von Mäuse mit schlecht heilenden 1-Tageswunden zu gewinnen. Die Herstellung der cDNA aus der aus dem Gewebe isolierten Gesamt- RNA, sowie alle weiteren Schritte wurden wie in EP 0 965 642 beschrieben durchgeführt: die cDNA wurde gerichtet in einen geeigneten Vektor kloniert und die erhaltenen Plasmide in einen geeigneten E. coli Stamm transformiert. Je 100 E. coli Klone wurden gemischt und die Plasmid-DNA isoliert. Die DNA wurde in 3 Portionen aufgeteilt und anschließend mit der Restriktionsendonuklease BglI hydrolysiert und mit je einem Fluoreszenz-Farbstoff markiert. Jede Portion wurde anschließend auf 2 Portionen aufgeteilt und dann mit je einer der Restriktionsen­ donukleasen BfaI, DpnI, RsaI, DdeI, AluI und HinfI hydrolysiert. Die portionier­ ten Nukleinsäuren wurden elektrophoretisch aufgetrennt und das Muster der auf­ getrennten Nukleinsäuren analysiert. Die Restriktionsfragmentmuster der Klon­ gemische wurde mit dem Muster von cDNA Einzelklonanalysen verglichen und die cDNAs somit identifiziert. Es wurden diejenigen Nukleinsäuren ausgewählt, deren Restriktionsfragmentmuster unterschiedlich häufig in cDNA-Pools schlecht heilender und gut heilender Wunden identifiziert wurde. Bei der Analyse von 37000 cDNAs konnte beispielsweise 3 mal das Muster von MCP-2 (DdeI: 196,23 ± 0,3 Basenpaare; AluI: 67,51 ± 0,5 Basenpaare; Hinif: 349,88 ± 0,7 Basen­ paare; BfaI: 531,02 ± 2,0 Basenpaare; DpnI: 245,02 ± 0,3 Basenpaare; RsaI: 254,23 ± 0,3 Basenpaare) im cDNA-Pool schlecht heilender Wunden identifiziert werden, während das Muster im cDNA-Pool gut heilender Wunden nicht beob­ achtet wurde.

Beispiel 4 Analyse der Expression von MRP-14 in Gewebeschnitten von huma­ nen Wunden

Die Expression von MRP-14 in Wunden wurde durch in situ Hybridisierung ana­ lysiert. Die Herstellung der Sonde mittels des DIG RNA Labelling Mix (Boehrin­ ger) als auch die weiteren Hybridisierungsschritte wurden im Wesentlichen nach den Angaben des Herstellers durchgeführt. Ein 364 bp langes Fragment der hu­ manen MRP-14 cDNA (SEQ ID Nr. 74) wurde über PCR aus humaner cDNA mittels PCR amplifiziert. An die spezifischen Primersequenzen waren die Pro­ motorsequenzen von SP6-Polymerase (MRP-14 Primer 1: AATTAACCCTCACTAAAGGGGGTGGCTCCTCGGCTTTGACA (SEQ ID NR. 75)) und von T3-Polymerase (MRP-14 Primer 2: ATTTAGGTGACACTATAGAATACCCCGAGGCCTGGCTTATGGT(SEQ ID Nr. 76)) angefügt. Das Amplifikat wurde durch Sequenzierung verifiziert und als Vorlage für eine Synthese von Digoxigenin-markierten RNA- Hybridisierungssonden (cRNA als auch Kontroll-RNA) verwendet. Mit diesen Sonden wurden Paraffinschnitte von humanen 5-Tages-Wunden von gesunden Probanden und Patienten mit diabetischem und venösem Ulcus hybridisiert. Es zeigte sich, daß das MRP-14 Gen in den suprabasalen Zellschichten des hyper­ proliferativen Epithels am Wundrand gesunder Probanden exprimiert wird, wäh­ rend sich keine Expression in intakter Haut dieser Probanden und eine veränderte Expression in Wunden der Patienten nachweisen ließ. Dies ist in sehr guter Über­ einstimmung mit der verstärkten Expression von MRP-14 in Wunden von Mäusen im Vergleich zu intakter Haut (Fig. 2 und Fig. 3).

Claims (33)

1. Verwendung mindestens eines Polypeptids oder einer Variante davon ge­ mäß einer der SEQ ID Nr. 55 bis SEQ ID Nr. 58 und/oder diese kodierende Nukleinsäure oder Variante davon zur (i) Diagnose und/oder Behandlung von Erkrankungen, und/oder (ii) Diagnose und/oder Behandlung bei der Wundheilung, oder (iii) Identifizierung von pharmakologisch aktiven Sub­ stanzen.

2. Verwendung mindestens eines Polypeptids oder einer Variante davon ge­ mäß einer der SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 20 und SEQ ID Nr. 31 bis SEQ ID Nr. 48 und SEQ ID Nr. 63 bis SEQ ID Nr. 70 und/oder diese kodierende Nukleinsäure oder Variante davon zur (i) Diagnose und/oder Behandlung von Hauterkrankungen, und/oder (ii) Diagnose und/oder Behandlung bei der Wundheilung, oder (iii) Identifizierung von pharmakologisch aktiven Sub­ stanzen.

3. Verwendung eines Polypeptids oder einer Variante davon gemäß einer der SEQ ID Nr. 21 bis SEQ ID Nr. 30 und SEQ ID Nr. 70 bis SEQ ID Nr. 73 und/oder diese kodierende Nukleinsäure oder Variante davon zur (i) Dia­ gnose und/oder Behandlung bei der Wundheilung, oder (ii) Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen.

4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure eine DNA oder RNA, vorzugsweise eine DNA, insbe­ sondere eine doppelsträngige DNA ist.

5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz der Nukleinsäure mindestens ein Intron und/oder eine po­ lyA-Sequenz aufweist.

6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure ihre antisense-Sequenz aufweist.

7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure synthetisch hergestellt worden ist.

8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid synthetisch hergestellt worden ist.

9. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid ein Fusionsprotein ist.

10. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure in einem Vektor, vorzugsweise in einem Plasmid, shuttle Vektor, Phagemid, Cosmid, Expressionsvektors oder gentherapeu­ tisch wirksamen Vektor enthalten ist.

11. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure in einem knock-out Genkonstrukt oder einer Expressi­ onskassette enthalten ist.

12. Wirtszelle, transformiert mit einem Vektor oder einem knock-out Genkon­ strukts gemäß einem der Ansprüche 10 oder 11.

13. Wirtszelle nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine Hautzelle handelt.

14. Transgene embryonale nichtmenschliche Stammzelle, dadurch gekenn­ zeichnet, daß sie ein knock-out Genkonstrukt oder eine Expressionskassette gemäß Anspruch 11 enthält.

15. Verfahren zur Herstellung eines transgenen nicht-menschlichen Säugetiers, dadurch gekennzeichnet, daß eine embryonale nichtmenschliche Stamm­ zelle gemäß Anspruch 14 zu einem transgenen nicht-menschlichen Säugetier regeneriert wird.

16. Transgenes nichtmenschliches Säugetier, dadurch gekennzeichnet, daß sein Genom ein knock-out Genkonstrukt oder eine Expressionskassette gemäß Anspruch 11 enthält.

17. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids zur (i) Diagnose und/oder Be­ handlung von Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankungen, und/oder (ii) Diagnose und/oder Behandlung bei der Wundheilung, insbesondere von Wundheilungsstörungen, oder (iii) Identifizierung von pharmakologisch ak­ tiven Substanzen in einer geeigneten Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 und 10 oder 11 exprimiert wird.

18. Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins zur (i) Diagnose und/oder Behandlung von Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankungen, und/oder (ii) Diagnose und/oder Behandlung bei der Wundheilung, insbesondere von Wundheilungsstörungen, oder (iii) Identifizierung von pharmakologisch ak­ tiven Substanzen in einer geeigneten Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 und 10 oder 11 exprimiert wird.

19. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers oder Antikörperfragments, vorzugsweise eines polyklonalen oder monoklonalen Antikörpers oder An­ tikörperfragments zur (i) Diagnose und/oder Behandlung von Erkrankun­ gen, insbesondere Hauterkrankungen, und/oder (ii) Diagnose und/oder Be­ handlung bei der Wundheilung, insbesondere von Wundheilungsstörungen, oder (iii) Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen, dadurch gekennzeichnet, daß ein Antikörper produzierender Organismus mit einem Polypeptid oder einer Variante davon gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 und 8 oder 9 immunisiert wird.

20. Antikörper oder Antikörperfragment zur (i) Diagnose und/oder Behandlung von Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankungen, und/oder (ii) Diagnose und/oder Behandlung bei der Wundheilung, insbesondere von Wundhei­ lungsstörungen, oder (iii) Identifizierung von pharmakologisch aktiven Sub­ stanzen, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper oder das Antikörper­ fragment gegen ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 und 8 oder 9 gerichtet ist.

21. Verwendung eines Antikörpers oder Antikörperfragments gemäß Anspruch 20 zur (i) Diagnose und/oder Behandlung von Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankungen, und/oder (ii) Diagnose und/oder Behandlung bei der Wundheilung, insbesondere von Wundheilungsstörungen, oder (iii) Identifi­ zierung von pharmakologisch aktiven Substanzen.

22. Verfahren zur Herstellung eines Diagnostikums zur (i) Diagnose von Er­ krankungen, insbesondere Hauterkrankungen, und/oder (ii) Diagnose bei der Wundheilung, insbesondere von Wundheilungsstörungen, dadurch gekenn­ zeichnet, daß mindestens eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 und 10 oder 11, mindestens ein Polypeptid gemäß einem der Ansprü­ che 1 bis 3 und 8 oder 9 oder mindestens ein Antikörper oder Antikörper­ fragment gemäß einem der Ansprüche 19 oder 20, gegebenenfalls zusam­ men mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen kombiniert wird.

23. Diagnostikum zur (i) Diagnose von Erkrankungen, insbesondere Hauter­ krankungen, und/oder (ii) Diagnose bei der Wundheilung, insbesondere von Wundheilungsstörungen, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 und 10 oder 11, minde­ stens ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 und 8 oder 9 oder mindestens einen Antikörper oder ein Antikörperfragment gemäß einem der Ansprüche 19 oder 20, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen, enthält.

24. Diagnostikum nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Son­ de, vorzugsweise eine DNA-Sonde, enthält.

25. Verwendung eines Diagnostikums nach einem der Ansprüche 22 bis 24 zur (i) Diagnose von Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankungen, und/oder (ii) Diagnose bei der Wundheilung, insbesondere von Wundheilungsstörun­ gen.

26. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur (i) Behandlung von Er­ krankungen, insbesondere Hauterkrankungen, und/oder (ii) Behandlung bei der Wundheilung, insbesondere von Wundheilungsstörungen, dadurch ge­ kennzeichnet, daß mindestens eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprü­ che 1 bis 7 und 10 oder 11, mindestens ein Polypeptid gemäß einem der An­ sprüche 1 bis 3 und 8 oder 9 oder mindestens ein Antikörper oder Antikör­ perfragment gemäß einem der Ansprüche 19 oder 20 zusammen mit geeig­ neten Zusatz- und Hilfsstoffen kombiniert wird.

27. Arzneimittel zur (i) Behandlung von Erkrankungen, insbesondere Hauter­ krankungen, und/oder (ii) Behandlung bei der Wundheilung, insbesondere von Wundheilungsstörungen, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 und 10 oder 11, mindestens ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 und 8 oder 9 oder mindestens einen Antikörper oder ein Antikörperfragment gemäß ei­ nem der Ansprüche 19 oder 20, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen, enthält.

28. Verwendung eines Arzneimittels nach Anspruch 27 zur (i) Behandlung von Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankungen, und/oder (ii) Behandlung bei der Wundheilung, insbesondere von Wundheilungsstörungen.

29. Verfahren zur Herstellung eines Tests zur Auffindung von Interaktoren in Zusammenhang mit (i) Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankungen, und/oder (ii) Wundheilung, insbesondere Wundheilungsstörungen, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Nukleinsäure gemäß einem der An­ sprüche 1 bis 7 und 10 oder 11, mindestens ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 und 8 oder 9 oder mindestens ein Antikörper oder Anti­ körperfragment gemäß einem der Ansprüche 19 oder 20 zusammen mit ge­ eigneten Zusatz- und Hilfsstoffen kombiniert wird.

30. Test zur Identifizierung von Interaktoren in Zusammenhang mit (i) Erkran­ kungen, insbesondere Hauterkrankungen, und/oder (ii) Wundheilung, insbe­ sondere Wundheilungsstörungen, dadurch gekennzeichnet, daß er minde­ stens eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 und 10 oder 11, mindestens ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 und 8 oder 9 oder mindestens einen Antikörper oder ein Antikörperfragment gemäß ei­ nem der Ansprüche 19 oder 20, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen, enthält.

31. Verfahren zur Herstellung eines auf einem Trägermaterial fixierten Arrays zur Analyse in Zusammenhang mit (i) Erkrankungen, insbesondere Hauter­ krankungen, und/oder (ii) Wundheilung, insbesondere Wundheilungsstö­ rungen, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 und 10 oder 11, mindestens ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 und 8 oder 9 oder mindestens ein Anti­ körper oder Antikörperfragment gemäß einem der Ansprüche 19 oder 20 auf einem Trägermaterial fixiert wird.

32. Auf einem Trägermaterial fixiertes Array zur Analyse in Zusammenhang mit (i) Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankungen, und/oder (ii) Wund­ heilung, insbesondere Wundheilungsstörungen, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 und 10 oder 11 und/oder mindestens ein Polypeptid gemäß einem der An­ sprüche 1 bis 3 und 8 oder 9 und/oder mindestens einen Antikörper oder ein Antikörperfragment gemäß einem der Ansprüche 19 oder 20 enthält.

33. DNA-Chip und/oder Protein-Chip zur Analyse in Zusammenhang mit (i) Erkrankungen, insbesondere Hauterkrankungen, und/oder (ii) Wundheilung, insbesondere Wundheilungsstörungen, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 und 10 oder 11 und/oder mindestens ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 und 8 oder 9 und/oder mindestens einen Antikörper oder ein Antikör­ perfragment gemäß einem der Ansprüche 19 oder 20 enthält.