DD302012A7 - Verfahren zur Gewinnung eines lyophilisierbaren Virusantigens derAleutenkrankheit der Nerze - Google Patents
Verfahren zur Gewinnung eines lyophilisierbaren Virusantigens derAleutenkrankheit der NerzeInfo
- Publication number
- DD302012A7 DD302012A7 DD302012A7 DD 302012 A7 DD302012 A7 DD 302012A7 DD 302012 A7 DD302012 A7 DD 302012A7
- Authority
- DD
- German Democratic Republic
- Prior art keywords
- antigen
- viral antigen
- mink
- virus
- polyethylene glycol
- Prior art date
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 34
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 34
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 34
- 230000003612 virological Effects 0.000 title claims abstract description 12
- 241001530097 Verbascum Species 0.000 title 1
- 235000010599 Verbascum thapsus Nutrition 0.000 title 1
- 201000009673 liver disease Diseases 0.000 title 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 26
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 11
- 241000772415 Neovison vison Species 0.000 claims abstract description 10
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims abstract description 10
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims abstract description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 8
- 201000003276 aleutian mink disease Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 2
- 239000004698 Polyethylene (PE) Substances 0.000 claims 1
- -1 polyethylene Polymers 0.000 claims 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 claims 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 4
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 abstract description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 230000002349 favourable Effects 0.000 abstract description 2
- AJDIZQLSFPQPEY-UHFFFAOYSA-N 1,1,2-Trichloro-1,2,2-trifluoroethane Chemical compound FC(F)(Cl)C(F)(Cl)Cl AJDIZQLSFPQPEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 230000001376 precipitating Effects 0.000 abstract 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 10
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N HCl Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001085 differential centrifugation Methods 0.000 description 2
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 2
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000000405 serological Effects 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N Ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010047814 Antigen-Antibody Complex Proteins 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N D-sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 210000004185 Liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000001165 Lymph Nodes Anatomy 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 210000000952 Spleen Anatomy 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N Sucrose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)[C@@]1(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogens Species 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- XPDWGBQVDMORPB-UHFFFAOYSA-N methyl trifluoride Chemical compound FC(F)F XPDWGBQVDMORPB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 1
- 229960005486 vaccines Drugs 0.000 description 1
Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung eines lyophilisierbaren Virusantigens der Aleutenkrankheit der Nerze zur Produktion eines serologisch aktiven Virusantigens für die Diagnose der Aleutenkrankheit der Nerze. Ziel der Erfindung ist es, e in lyophilisierbares Virusantigen der Aleutenkrankheit der Nerze unter produktionstechnisch und ökonomisch günstigen Bedingungen herzustellen. Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein neues Verfahren zur Isolierung des Virusantigens der Aleutenkrankheit der Nerze vorzuschlagen. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, dass man das Virusantigen aus einer mit infiziertem Organmaterial hergestellten Virussuspension mit Polyethylenglykol (Molekülmasse 3 000- 4 000) ausfällt und anschließend das Polyethylenglykol mit 1.1.2-Trifluortrichlorethan extrahiert wird. Das nach weiterer Ultrazentrifugation und Immunkomplexspaltung erhaltene Virusantigen kann lyophilisiert werden.
Description
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft oin Verfahren zur Gewinnung eines Virusantigens zur Diagnose der Aleutenkrankheit der Nerze.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen
Die von CHO und INGRAM (J. Immunol. Methods 4 [1974] 217-228) veröffentlichte Methode zur Herstellung eines Virusantigens zur serologischen Diagnose der Aleutenkrankheit der Nerze mittels Gegonstromelektrophorese wurde u.a. von BRUMMERSTEDT(Acta vet. Scand. 17 (1976] 395-402) undAASTED(Acta Path, and Microb. Sand. Sect. B 88, 6[ 19801323-328) zur Darstellung des Antigens benutzt.
Die Reinigung und Konzentrierung des Virusantigens aus infiziertem Organmaterial erfolgte durch technisch aufwendige Differenzialzentrifugation der antigenhaltigen Gewebesuspension.
Das durch diese Methode erhaltene Virusantigen war relativ instabil und mußte tiefgefroren aufbewahrt werden.
SHIMIZU u. Mitarb. (Jpn. J. Vet. Sei. 42 [1980] 717-723) entwickelten ein Herstellungsverfahren des Virusantigens der Aleutenkrankheit über Ammoniumsulfatfällung und Sephadex-G-200-Chromatografie. Dieses Verfahren war weniger zeitaufwendig, es traten jedoch verfahrensbedingt hohe Antigenverluste auf.
SLUGIN u. Mitarb, (persönl. Mitteilung 1978) entwickelten mit einem modifizierten Verfahren nach CHO und INGRAM (J.
Immunol. Methods 4 [1974] 217-228) ein Virusantigen zur serologischen Diagnose der Aleutenkrankheit.
Die Nachteile der auch von anderen Autoren benutzten Verfahren wurden durch hohen Zeitaufwand für die Außenreinigung und -konzentrierung mittels Ultrazentrifugation und niedrigtouriger Zentrifugation bedingt.
Ziel der Erfindung
Ziel der Erfindung ist es, ein lyophilisierbares Virusantigen der Aleutenkrankheit der Nerze unter produktionstechnisch und ökonomisch günstigen Bedingungen herzustellen.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein neues Verfahren zur Isolierung des Virusantigens der Aleutenkrankheit der Nerze vorzuschlagen.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß man das Vii jsant!gon aus einer mit infiziertem Organmaterial hergestellten Virussuspension mit Polyethylenglykol der Molekülmasse 3000-4000 ausfällt und anschließend das Polyethylenglykol mit I.i^.-Trifluortrichlorethan wieder extrahiert.
Das Polyethylenglykol wird der Virussuspension in fester oder gelöster Form bis zu einer Endkonzen'ration von mindestens 10% (Masse/Volumen) zugesetzt.
Die ausgefällten Antigene und Begleitproteine können einfach durch niedrigtourige Zentrifugation sedimentiert werden. Aus den resuspendierten Sedimenten wird erfindungsgemäß das Polyethylenglykol durch Behandlung mit 1.1.2.-Trifluortrichlorethan extrahiert.
Diese Kombination der Konzentrierungs- und Reinigungsschritte zur Gewinnung des Virusantigens der Aleutenkrankheit gestattet eine schnelle, reproduzierbare und verlustarme Anreicherung des Antigens und eine gleichzeitige weitgehende Entfernung des Fällungsmittels.
Das erfindungsgemäße Verfahren gestattet eine Verkürzung des Zeitaufwandes zur Antigenpräparation auf mindestens Vio im Vergleich zum Verfahren der Differentiaizontrifugation.
Das gereinigte und konzentrierte Virusantigen ist spezifisch wirksam, mit stabiler Aktivität und kann lyophilisiert werden. Die Ausbeuten an Virusantigen entsprechen dem Verfahren der Differentialzentrifugaticn.
Ausfülirungsbelsplele
Mit einem geeigneten Virusstamm der Aleutenkrankheit werden Nerze intraporitoneal infiziert. Am 9. bis 11. Tag nach der Infektion werden Milz, Leber und Mesenteriallymphknoten der infizierten Tiere gewonnen.
Nach der Herstellung eines 75%igen (Masse/Volumen) Homogenats des Organmaterials in Kochsalzlösung (150mmol/l) erfolgt dreimaliges Gefriertauen dieser Suspension.
Die Extraktion der erhaltenen Suspension wird mit 60% (Volumen/Volumen) 1.1 ^.-Trifluortrichlorethan durch Homogenisation des Gemisches vorgenommen. Durch Zentrifugation (6000g, 40C, 45min) wird die wäßrige Phase vom Sediment getrennt und gesammelt. Das Sediment wird wiederholt in Kochsalzlösung (150mmol/l) homogenisiert, zentrifugiert und der wäßrige Überstand gesammelt. Nach in der Regel dreimaliger Extraktion des Sediments mit Kochsalzlösung (150mmol/l) und Zentrifugation werden alle gewonnenen wäßrigen Überstände vareinigt und das Sediment verworfen.
Durch Extraktion der gewonnenen Virussuspension mit 50% (Volumen/Volumen) 1.1 ^.-Trifluortrichlorethan und nachfolgender Zentrifugation (6000g, 4°C, 45min) wird die Virussuspension nochmals gereinigt.
Unter ständigem Durchmischen erfolgt die Zugabe pulverförmiger) oder gelösten Polyothylenglykols (Molekülmasse 3000 bis
4000) bis zur Endkonzentration von mindestens 10% (Masse/Volumen) in der virusantigenhaltigen Lösung. Nach Vervollständigung der Fällung bei 4°C f ür mindestens4h wird das Material zentrifugiert (6000g, 60min, 4°C). Der Überstand wird verworfen und das Sediment mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (20mmol/l, pH 7,4) in Vw bis V« des Ausgangsvolumens resuspendiert.
Nach Extraktion der erhaltenen Lösung mit 50% (Volumen/Volumen) 1.1 ^.-Trifluortrichlorethan wird diese zentrifugiert (6000g, 60min, 40C) und der Überstand gesammelt. Die gewonnene virusantigenhaltige Lösung wird durch Ultrazentrifugation bei mindestens 100000g, 40C, in 2h konzentriert, der Überstand verworfen und die Pellets in Kochsalzlösung (150mmol/l) resuspendiert.
Die Spaltung vorhandener Immunkomplexe in der konzentrierten Lösung des Virusantigens erfolgt durch langsame, kontrollierte Senkung des pH-Wertes mittels verdünnter Salzsäure (500mmol/l) auf 2,9 bis 3,0. Ausgefällte Proteine werden abzentrifugiert (6000g, 4°C, 30min).
Das aktivierte Virusantigen wird, wie beschrieben, in der Ultrazentrifuge pelletiert, der Überstand verworfen und die Pellets in einem phosphatpufferhaltigen Stabilisator (pH 7,6 mit z.B. 2,5% Gelatine, 10% Glycerol) resuspendiert. Das erhaltene Virusantigen wird bei -2O0C aufbewahrt.
Die Gewinnung infizierten Organmaterials erfolgt analog wie in Beispiel 1.
Nach Herstellung eines etwa 20%igen (Masse/Volumen) Homogenats des Organmaterials in Kochsalzlösung (150mmol/l) erfolgt das Gefriertauen in 4 bis 6 Zyklen.
Die erhaltene Suspension wird zentrifugiert (6000g, 60min, 40C) und das Sediment verworfen. Der Überstand wird durch zweifache Extraktion mit 1 .I^.-Trifluortrichlorethan, bestehend aus der Homogenisation des Gemisches mit 50% (Volumen/ Volumen) 1 .I^.-Trifluortrichlorethan, nachfolgender Zentrifugation (6000g, 60min, 4°C) und erneuter Homogenisation des Überstandes mit dem Lösungsmittel und Zentrifugation, gereinigt.
Das Sediment wird verworfen und der Überstand, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit Polyethylenglykol gefällt und analog weiter bearbeitet.
Die Herstellung des Virusantigens der Aleutenkrankheit der Nerza erfolgt analog dem Beispiel 1 oder Beispiel 2. Die nach der Irnmunkomplexspaltung und Ultrazentrifugation erhaltenen Pellets des .^kliviorten Virusantigens werden jedoch in einem geeigneten Stabilisator für Virusimpfstoffe, z. B. mit 15% Saccharose, resuspendiert und lyophilisiert.
Claims (3)
1. Verfahren zur Gewinnung eines lyophilisierbaren Virusantigens der Aleutenkrankheit der Nerze, bei dem das Virusantigen aus einer mit infiziertem Organmaterial hergestellten Virussuspension oder vorgereinigten virusantigenhaltigen Lösung konzentriert wiro. gekennzeichnet dadurch, daß das Virusantigen mit Polyethylenglykol isoliert wird und anschließend das Polyethylenglykol mit 1.1.2.-Trifluortrichlorethan extrahiert wird.
2. Verfahren gemäß Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß Polyethylen mit der Molekülmasse 3000 bis 4000 verwendet wird.
3. Verfahren gemäß Punkt 1 und Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß Polyethylenglykol in fester oder gelöster Form der Virussuspension oder Lösung bis zu einer Endkonzentration von mindestens 10% (Masse/Volumen) zugegeben wird.
Family
ID=
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2592232C1 (ru) * | 2015-08-24 | 2016-07-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Биолого-почвенный институт Дальневосточного отделения Российской академии наук (ФГБУН БПИ ДВО РАН) | Способ получения диагностической сыворотки для выявления вируса алеутской болезни норок |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2592232C1 (ru) * | 2015-08-24 | 2016-07-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Биолого-почвенный институт Дальневосточного отделения Российской академии наук (ФГБУН БПИ ДВО РАН) | Способ получения диагностической сыворотки для выявления вируса алеутской болезни норок |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE2433883C2 (de) | Verwendung von physiologisch aktiven Polypeptiden | |
| DE2848965A1 (de) | Verfahren zur herstellung von membranproteinen aus neisseria meningitidis und diese enthaltende vaccine | |
| DE2333883B2 (de) | Verfahren zur Herstellung von hochgereinigtem Humanalbumin | |
| Hamlyn | Electron microscopy of mossy fibre endings in Ammon's horn | |
| EP1124575B1 (de) | Verfahren zur herstellung eines antiviralen mittels | |
| DE3587391T2 (de) | Verfahren zur Rückgewinnung von gereinigten Wachstumshormonen aus genetisch modifizierten Mikro-organismen. | |
| DE3014189A1 (de) | Verfahren zur herstellung eines immunogenen membranproteinaggregats von influenza-, parainfluenza- und rhabdo-viren | |
| CH652030A5 (de) | Verfahren zur herstellung eines faktor-viii-hochkonzentrates aus blutplasma. | |
| DE69021729T2 (de) | Verfahren zur gewinnung von natürlich hergestelltem chymosin. | |
| DE2733565A1 (de) | Verfahren zum isolieren und gewinnen von aus hypophysegeweben stammenden proteinhormonen | |
| EP0245267B1 (de) | Verfahren zur gewinnung von insulin-vorläufern aus reaktionsgemischen, die bei der faltung von insulin-vorläufern aus den entsprechenden s-sulfonaten anfallen | |
| DD302012A7 (de) | Verfahren zur Gewinnung eines lyophilisierbaren Virusantigens derAleutenkrankheit der Nerze | |
| DE1617332C3 (de) | Verfahren zum Isolieren eines wasserlöslichen Protein-Metall-Chelats mit antiphlogistischer Wirkung | |
| DE2829089A1 (de) | Subunit-vakzine | |
| DE69411038T2 (de) | Wasserunlösliche vernetzte polycarbonsäure-zusammensetzungen | |
| DE1642612A1 (de) | Die Verwendung von Erythrozyten zur Gewinnung bzw.Isolierung eines Plasminogen-Aktivators | |
| DE1617605C3 (de) | Verfahren zum Herstellen eines Pertussis-Antigens | |
| DE2306072C2 (de) | Verfahren zur Gewinnung oder Reinigung von Orgotein durch enzymatische Behandlung von Protein-Gemischen | |
| DE3005495C2 (de) | Herstellung von Fragmenten von Viren mit Lipidhülle und sie enthaltende Arzneimittelzubereitungen | |
| DE2403065A1 (de) | Verfahren zur herstellung therapeutischer blutfraktionen | |
| DE967241C (de) | Verfahren zum Trennen von lebendem Virus von virusfremden Eiweissstoffen | |
| DE3750330T2 (de) | Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs gegen Hepatitis B. | |
| EP0321606A1 (de) | Zelluläre amphipatische Proteine in aggregierten Formen und Verfahren zur Herstellung und Reinigung diese Proteine | |
| DE1802386C2 (de) | Verfahren zur Gewinnung von cytobiotischen Globulinen | |
| DD225621A1 (de) | Verfahren zur herstellung von zelloberflaechen-antigenen aus pilzen |