DD299155A5 - Pharmazeutische zubereitungen - Google Patents

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DD299155A5
DD299155A5 DD90343663A DD34366390A DD299155A5 DD 299155 A5 DD299155 A5 DD 299155A5 DD 90343663 A DD90343663 A DD 90343663A DD 34366390 A DD34366390 A DD 34366390A DD 299155 A5 DD299155 A5 DD 299155A5
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Jutta Heim
Fredericus A M Asselbergs
Rolf Buergi
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Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf pharmazeutische Zubereitungen, die eine Kombination von zwei verschiedenen Plasminogenaktivatoren umfassen, und die zur Prophylaxe und Therapie von Thrombose eingesetzt werden.{pharmazeutische Zubereitung; Plasminogenaktivatoren; Kombination von Plasminogenaktivatoren; Prophylaxe; Therapie; Thrombose}

Description

Hierzu 7 Seiten Zeichnungen
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf pharmazeutische Zubereitungen, die eine Kombination von zwei Plasminogenaktivatoren enthalten, die sich hinsichtlich ihrer Aminosäuresequenz unterscheiden, und auf den Einsatz der genannten Zubereitungen zur Prophylaxe oder Therapie von Blutgerinnungsstörungen.
Blutgerinnsel sind ein Hauptgrund für Morbidität und Mortalität der Menschen in der entwickelten Welt. Das Netz der Blutgerinnsel besteht aus Fibrin, das aus seiner löblichen Vorstufe Fibrinogen durch die Wirkung des Enzyms Thrombin gebildet wird. Eine Reihe von Enzymen und anderen Substanzen gewährleistet, daß sich Gerinnsel normalerweise nur bilden, wenn und wo sie zur Verhinderung von Blutverlust notwendig sind.
Säugetierplasma enthält ein Enzymsystem, das fibrinolytische System, das Blutgerinnsel auflösen kann. Eine Komponente des fibrinolytischen Systems ist eine Gruppe von Enzymen mit der Bezeichnung Plasminogenaktivatoren, die Plasminogen (eine inaktive Proenzymform von Plasmin) in das proteinspaltende Enzym Plasmin umwandeln. Plasmin baut dann das Fibrinnetz der Gerinnsel zu löslichen Produkten ab. In Fällen, wo die thrombolytische Kapazität des Körpers nicht ausreicht, um intravaskuläre Thromben zu beseitigen, z. B. bei Patienten, die an Thromboemboiie oder Komplikationen nach chirurgischen>Eingriffen leiden, kann es unverzichtbar sein, exogen verabreichte thrombolytische Wirkstoffe einzusetzen.
Zwei Typen von Plasminogenaktivatoren (im folgenden als „PAs" bezeichnet) können aus Flüssigkeiten oder Zellen des menschlichen Körpers isoliert werden: Urokinase oder ein urokinaseartiger Plasminogenaktivator (im folgenden als „uPA" bezeichnet), eine Serinprotease, die z. B. im Harn und in Nierenzellen vorkommt, und ein gewebeartiger Plasminogenaktivator (im folgenden als „tPA" bezeichnet), der von endothelialen Zellen produziert wird und in einer Reihe von endokrinen Geweben vorkommt.
Sowohl tPA als auch uPA existieren in zwei Molekualrformen. Die Einzelketten- (se) oder Proenzymform ist spezifisch an Komponenten des Blutgerinnsels, wie z. B. Fibrin, gebunden und wird anschließend zur voll aktiven Zweikettenform (te) durch die Wirkung von Plasmin abgebaut. Im prozessierten tcPA ist die nichtkatalytische aminoterminale Α-Kette durch S-S-Brücken mit der katyltischen karboxyterminalen B-Kette verbunden.
Obwohl sie letzten Endes dieselbe Peptidbindung im Plasminogenmolekül spalten, zeigen tPA, scuPA und tcuPA einzigartige Eigenschaften, die weitgehend die Rate und die Spezifität dieser Reaktion beeinflussen. Obwohl sie aus immunologischer Sicht keine Floziehung zueinander und unterschiedliche Aktivierungsmechanismen haben, zeigen sowohl tPA als auch scuPA eine hohe Fibrinaffinität und aktivieren somit hauptsächlich fibringebundenes Plasminogen. Freies Plasmaplasminogen wird nur unwesentlich durch tPA oder scuPA beeinflußt. Andererseits aktiviert tcuPA aufgrund seines Mangels an Gerinnselspezifität sowohl fibringebundenes als auch Plasmaplasminogen in gleichem Maße, woraus sich eine systematische Aktivierung des fibrinolytischen Systems ergibt. Die katalytische Wirkungskonstante von tcuPA ist jedoch wesentlich höher als die von tPA. In letzter Zeit wurden durch Verfahren der Gentechnologie eine große Zahl von Hybrid-PAs hergestellt. In diesen Hybriden wurden Sequenzen, die Teile des tPA und Teile des uPA-Moleküls kodieren, zu einzelnen Chimären Molekülen rekombiniert. Einfache Hybride bestehen aus der nichtkatalytischen Α-Kette eines PA, verbunden mit der katalvtischen B-Kette des anderen PA (z.B. Europäische Patentanmeldungen NR. 155387 und 277 313). Komplexere Hybride wurden hergestellt durch die
Rekombination von DNS-Sequenzen, die diskrete Bei oiche der Α-Kette von tPA (mit einem „Finger", einem „Wachstumsfaktor" und zwei „Kringel"-Bereichen) oder von uPA (mit einem „Wachstumsfaktor" und einem „Kringer-Bereich) kodieren, mit Sequenzen, die die B-Kette von tPA oder uPA vorschlüsseln (z. B. Europäische Patentanmeldungen Nr. 231883 und 277313 oder PCT-Anmeldung Nr.88/5822). „Polykringel"-PAs, die in ihrer Α-Kette multiple Kringelstrukturen von tPA und uPA kombinieren, sind in der Europäischen Patentanmeldung Nr.213794 beschrieben worden.
Dor therapeutische Wert von tPA, uPA (besonders scuPA mit seiner hohen Fibrinspozifität) und einigen der Hybrid-PAs ist von höchster Wichtigkeit bei der Behandlung von Blutgerinnungsstörungen, wie z.B. Thrombose. Jedoch ist der thrombolytische Vorgang oft nicht schnell genug, was z. B. zu Herzstillstand bei myokardialern Infarkt fürt, oder er veräuft nicht vollständig, was einen sehr schneller Wiederverschluß des geöffneten Gefäßes zur Folge hat.
Die simultane Verabreichung von tPA und scuPAoder tPA und tcuPA, wie in der Europäischen Patentanmeldung Nr.223192 beschrieben, führt zu einem synergistischen Effekt der beiden Komponten, d.h., zu einer höheren thrombolytischen Aktivität in vivo. Bedeutender Synergismus zwischen tPA und scuPA sowie zwischen tPA und tcuPA wurde ebenfalls In vivo demonstriert von Collen und Mitarbeitern in einem quantitativen Tiermodellsystem von Thrombolyse (Jugulärvene des Kaninchens mit '25J-markiertem Fibringerinnsel; z.B. Collen et al. [1986] 74. Auflage, 838-842; Collen et Gt al. [1987] Thrombose und Hämostasis 58,943-946) und bei menschlichen Patienten, die an akutem myokardialen Infarkt leiden (Collen und Van de Werf (1987] Amer.
J. of Cardiology 60,431-434; Collen [1988] 77. Auflago, 731-735).
In-vitro-Daten wurden von anderen Autoren zusammengestellt (Gurewich und Pannell [1986] Thrombosis Research 44,217-228; Pannell ei al. [1988] J. din. Invest. 81,8b3-859). Diese Daten sagen aus, daß kleine Mengen von tPA die Gerinnsellyse durch scuPA potenzieren, indem sie die für scuPA charakteristische Lag-Phase dämpfen und einen viel früheren Übergang zur schnellen Phase der Lyse verursachen.
Wegen ihrer verschiedenen Mechanismen der Plasminogenaktivierung würde eine potentielle synergistische oder komplementäre Wirkungsweise zwischen tPA und scuPA von bedeutend am klinischen Wert sein, da sie eine Reduzierung der benötigten Gesamtmenge dieser teuren Medikamente er'aul on würde und, vorausgesetzt, die toxischen Nebenwirkungen (wie
z. B. allergische Reaktionen, anaphylaktische,- Schock, intrakranielle Hämorrhagie oder pyrogene Effekte) wären nicht additiv, die systematische fibrinolytische Aktivierung eliminiert werden könnte. Obwohl eine Reduzierung der Gesamtkonzentration der verabreichten PAs erreicht werden kann, wenn eine äquivalente thrombolytische Aktivität erhalten wird, wie in den zitierten Bezugsquellen dargelegt, sind die angewandten Dosen, besonders die für uPA, immer noch zu hoch, um die Möglichkeit negativer Nebenwirkungen wie Blutungskomplikationen verläßlich auszuschließen.
Es besteht eine klare klinische Notwendigkeit, das Problem der Nebenwirkungen bei der konventionellen Thrombosetherapie zu überwinden. Es werden hervorragende fibrinolytische Wirkstoffe benötigt, die bei relativ niedrigen Dosen effektiv sind und somit mögliche Nebenwirkungen minimieren sowie Therapiekosten sparen.
Es ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung, hervorragende fibrinolytische Wirkstoffe zur Therapie und Prophylaxe von Blutgerinnungsstörungen, wie Thrombose bereitzustellen. Dieses Ziel wird durch die Bereitstellung neuer pharmazeutischer Zubereitungen erreicht, die eine Kombination von zwei Plasminogenaktivatoren enthalten, die sich in ihrer Aminosäuresequenz unterscheiden. Es wurde überraschenderweise herausgefunden, daß die kombinierte Verabreichung der besagten zwei Plasminogenaktivatoren sogar bei geringen Dosen zu einer beachtlichen Förderung der fibrinolytischen Aktivität führt und daß die besagten zwei Plasminogenaktivatoren so zusammenwirken, daß der eine PA die Aktivität des anderen fördert (komplementäre Wirkungsweise).
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine pharmazeutische Kombinationszubereitung, die als Komponente A einen Plasminogenaktivator, der die B-Kette von tPA enthält, und als Komponente B einen Einzelkettenplasminogenaktivator, der die B-Kette von uPA enthält, umfaßt, wobei Komponente A nicht tPA sein kann, wenn Komponente B scuPA ist.
Genauer ausgedrückt bezieht sich die Erfindung auf eine pharmazeutische Kombinationszubereitung, die als Komponente A einen Plasminogenaktivator der Formel
NH2-X1-L1-Y1-COOH (I)
enthält, worin
X1 eine direkte Bindung oder eine Aminosäuresequenz ist, die alle oder diskrete Bereiche der Α-Kette des menschlichen tPA und/oder alle oder diskrete Bereiche der Α-Kette des menschlichen uPA umfaßt, worin L1 eine direkte Bindung oder eine Aminosäuresequenz ist, die Xi mit Y1 verbindet, und worin Y1 der katalytische Bereich des menschlichen tPA ist, und die als Komponente B einen Einzelketter.plasminogenaktivator der Formel
NH2-X2-Lj-Y2-COOH (II)
enthält, worin
X2 eine direkte Bindung oder eine Aminosäuresequenz ist, dio alle oder diskrete A-Ketten-Bereiche des menschlichen tPA oder diskrete A-Ketten-Bereiche des menschlichen tPA und uPA oder alle oder diskrete A-Ketten-Bereiche des menschlichen uPA umfaßt, worin
L2 eine direkte Bindung oder eine Aminosäuresequenz ist, die X2 mit Y2 verbindet und worin Y2 der katalytische Bereich des menschlichen uPA ist, zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, der dadurch gekennzeichnet ist, daß die Komponente A nicht tPA sein kann, wenn die Komponente B scuPA ist.
Ein Proteinbereich ist eine strukturelle und/oder funktionelle Einheit innerhalb der Allgemeinstruktur des Gesamtproteins.
Sowohl tPA als auch uPA bestehen in ihrer wirksamen Form aus einer nichtkatalytischen A-Kette, die 4 bzw. 3 diskrete Bereiche umfaßt, die in Reihen angeordnet sind, und einer katalytischen B-Kette (katalytischer Bereich), die das aktive Zentrum enthält, das die Aminosäuregruppen His, Asp und Ser auf den Positionen 322,371 und 478 (tPA) bzw. 204.. 255 und 356 (uPA) umfaßt und das essentiell für die enzymatische Aktivität ist. Die einzelnen Bereiche sind auf dem Genomniveau durch nichtkodierende Berührungsregionen, sogenannte Introne, voneinander getrennt, die an ihren Grenzen zu Exon-Intion-Verbindungen führen.
Einzelketten-tPA kann durch die folgende Formel dargestellt worden: '1'-1'-.J1-(J J2 K1-Jj
-Λ -KeULe
Darin ist T und N-terminale Teil, der die Aminosäuren 1 bis 5 umfaßt, F ist der Fingerbereich, der die Aminosäuren 6 bis 43 umfaßt, G ist der Wachstnmsfaktorbereich, der die Aminosäuren 51 bis 84 umfaßt, K1 ist der Kringel-1 -Bereich, der die Aminosäuren 92 bis 173 umfaßt, K2 ist der Kringel-2-Bereich, der die Aminosäuren 180 bis 262 umfaßt, TPA8 ist die katalytische Serinproteaseregion (B-Kette), die die Aminosäuren 276 bis 527 umfaßt und J1 (Aminosäuren 44 bis 50), J2 (Aminosäuren 85 bis 91), J3 (Aminosäuren 174 bis 179) und J4 (Aminosäuren 263 bis 275) sind Berührungssequenzen, die die Bereichssegmente miteinander verbinden
Einzelketten-uPA kann durch die folgende Formel dargestellt werden:
τ1- υ-
I A-KeLLeA
Darin ist T'der N-terminale Teil, der die Aminosäuren 1 bis 12 umfaßt, U ist der Wachstumsfaktorbereich, der die Aminosäuren 13 bis 42 umfaßt, K ist der Kringelbereich, der die Aminosäuren 50 bis 131 umfaßt, UPAB ist die katalytische Serinproteaseregion (B-Kette), die die Aminosäuren 159 bis 411 umfaßt, und J5 (Aminosäuren 43 bis 49) und J6 (Aminosäuren 132 bis 158) sind Berührungssequenzen, die die Bereichssegmente miteinander verbinden. Die prozessierende Stelle befindet sich zwischen den Aminosäuren 275 und 276 (tPA) bzw. 158 und 159 (uPA). Es ist auch eine N-terminaler Zysteingruppe vorhanden, die in einer Schwefel-Schwefel-Br'icke an der katalytischer! Region (B-Kette) beteiligt ist.
Geeignete Plasminogenaktivatoren zum Einsatz als Komponente A sind die der Formel (I), worin X1, L1 und Y1 die folgenden Bedeutungen haben:
Xi ist zum Beispiel eine Aminosäuresequenz, die essentiell aus diskreten A-Ketten-Bereichen des menschlichen tPA oder allen A-Kntten-Bereichen des menschlichen tPA und dem Kringel-Bereich des menschlichen uPA oder dem Finger, den Kringel-1 - und Kringel-2-Bereichen des menschlichen tPA und dem Wachstumsfaktor- und/oder dem Kringelbereich des menschlichen uPA oder dem Kringel-2-Bereich des menschlichen tPAund dem Wachstumsfaktor- und/oder dem Kringelbereich des menschlichen uPA besteht.
L1 ist z. B. eine Aminosäuresequenz, die, wenn sie mit der N-terminalen Aminosäuregruppe von Yi verbunden ist, eine Plasmin prozessierende Stelle erzeugt und die zumindest eine Cys-Gruppe enthält.
Y1 ist der katalytische Bereich des menschlichen tPA, der aus den Aminosäuren 276 bis 527 des menschlichen tPA oder einem Fragment davon besteht, das die katalytische Aktivität sichert.
Der Terminus essentiell sollen zeigen, daß die Aminosäuresequenzen, die bisher und im folgendem aufgelistet wurden bzw. werden, zusätzlich weitere Sequenzen enthalten können die nicht essentiell für die enzymatische Aktivität sind und die keinerlei Einfluß auf diese haben. Nichtessentielle Sequenzen schließen Sequenzen ein, die von anderen Polypeptiden abgeleitet sind, die während der Synthese der jeweiligen Plasminogenaktivatoren zu den essentiellen Sequenzen fusioniert worden sein können. Nichtessentielle Sequenzen sind z.B. die Aminosäuren 1 bis 12 der freien, voll aktiven sauren Phosphatase (PHO5). In einer bevorzugten Ausführungsart der vorliegenden Erfindung ist X1 eine direkte Bindung oder eine Aminosäuresequenz, die essentiell aus allen A-Ketten-Bereichen des menschlichen tPA oder dem Kringel-2-Bereich des menschlichen tPA und dem Wachstumsfaktorbereich des menschlichen uPA besteht; im besonderen ist X1 eine direkte Bindung oder eine Aminosäuresequenz, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 262 des menschlichen tPA oder aus den Aminosäuren 1 bis 44 des menschlichen uPA, die in Reihe mit den Aminosäuren 176 bis 262 des menschlichen tPA verbunden sind. Ebenfalls bevorzugt sind Plasminogenaktivatoren der Formel (I), worin L1 eine Amionosäuresequenz, ist, die eine Aminosäuresequenz, bestehend aus 11 bis 40 Aminosäuren, die von tPA und/oder uPA und/oder einem anderen Polypeptid, wie z. B. freier, voll aktiver saurer Phosphatase (PHO5), abgeleitet sind, umfaßt und die zumindest eine Cys-Gruppe enthält. Im besonderen ist L, eine Aminosäuresequenz, worin die Cys-Gruppe 11 oder 12 Aminosäuren von der N-terminalen Aminosäuregruppe von Yi entfernt ist.
In der bevorzugtesten Variante ist L1 eine Aminosäuresequenz, die ausgewählt wird aus der Gruppe der Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA, der Aminosäuren 147 bis 158 der menschlichen uPA und der Aminosäuren 1 bis 12 der freien, voll aktiven sauren Phosphatase (PHO5), die in Reihe mit den Aminosäuren 256 bis 275 des menschlichen tPA verbunden sind. Bevorzugte Plasminogenaktivatoren sind die der Formel (I), worin X1 eine direkte Bindung oder eine Aminosäuresequenz ist, die ausgewählt wird aus der Gruppe der Aminosäuren 1 bis 262 des menschlichen tPA und der Aminosäuren 1 bit-. 44 des menschlichen uPA, die in Reihe mit den Aminosäuren 176 bis 262 des menschlichen tPA verbunden sind. L1 ist eine Aminosäuresequenz aus den Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA und Y1 ist der katalytische Bereich des menschlichen tPA, bestehend aus den Aminosäuren 276 bis 527 des menschlichen tPA.
Die bevorzugtesten Plasminogenaktivatoren zum Einsatz als Komponente A sind tPA oder die der Formel (I), worin X1 eine direkte Bindung ist, L1 eine Aminosäuresequenz darstellt, bestehend aus den Amionosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA, und Yi der katalytische Bereich des menschlichen tPA ist, bestehend aus den Aminosäuren 276 bis 527 des menschlichen tPA (bezeichnet als tPA-B-Kette, erweitert), oder worin X1 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 4& des menschlichen uPA, die in Reihe mit den Aminosäuren 176 bis 262 des menschlichen tPA verbunden sind, und worin L1 und Yi wie oben definiert sind (bezeichnet als uK2tPA), oder worin X1 eine direkte Bindung ist, L1 eine Aminosäuresequenz darstellt, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 12 der freien, voll aktiven sauren Phosphatase (PHO5), die in Reihe mit dan Aminosäuren 256 bis 275 des menschlichen tPA verbunden sind, und worin Y1 wie oben definiert ist (bezeichnet als tPA-B-Kette, fusioniert).
Geeignete Plasminogenaktivatoren zum Einsatz als Komponente B sind die der Formel (II), worin X2, L2, und Y2 die folgenden Bedeutungen haben:
X] ist z. B. bine Aminosäuresequenz, essentiell bestehend aus dem Finger- und/oder Kringel-2-Bereich des menschlichen tPA oder den Finger-, Wachstumsfal.tor- und Kringel-2-Bereichen des menschlichen tPA oder den Wechstumsfaktor-, Kringel-1 - und Kringel-2-Bereichen des menschlichen tPA oder dem Wachstumsfaktor- und/oder Kringelbereich des menschlichen uPA und dem Kringel-2-Bereich des menschlichen tPA.
L2 ist z. B. eine Aminosäuresequenz, die, wenn sie mit der N-terminalen Aminosäuregruppe von Y2 verbunden ist, eine Plasmin prozessierende Stelle erzeugt und die eino Cys-Gruppe enthält.
Y2 ist der katalytische Beroich des monschlichen uPA, bestehend aus den Aminosäuren 159 bis 411 des menschlichen uPA oder einem Fragment davon, das die katalytische Aktivität sichert.
In einer oevorzugten Ausführungsart der vorliegenden Erfindung ist X2 eine Aminosäuresequenz, essentiell bestehend aus dem Finger- und dem Kringel-2-Bereich des menschlichen tPA oder dem Kringel-2-Bereich des menschlichen tPA. Im besonderen ist X2 eine direkte Bindung oder eine Aminosäuresequenz, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 49 und 176 bis 262 oder den Aminosäuren 1 bis 3 und 176 bis 262 des menschlichen tPA.
Ebenfalls bevorzugt sind Plasminogenaktivatoren der Formel (II), worin L2 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus 11 bis 28 Aminosäuren und einschließlich einer Cys-Gruppe. Im besonderen ist L2 eine Aminosäuresequenz, worin din Cys-Gruppe 11 oder 12 Aminosäurer· von der N-terminalen Aminosäuregruppe von Y2 entfernt ist.
In der bevorzugtesten Variante ist L2 eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe der Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA, der Aminosäuren 147 bis 158 des menschlichen uPAund der Aminosäuren 144 bis 158 des menschlichen u PA.
Bevorzugte Einzelkettenplasminogenaktivatoren sind die der Formel (II), worir, X2 eine direkte Bindung oder eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 49 und 176 bis 262 oder den Aminosäuren 1 bis 3 und 176 bis 262 des menschlichen tPA, worin L2 eine Aminosäuresequenz ist, ausgewählt aus der Gruppe der Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA, der Aminosäuren 147 bis 158 des menschlichen uPAund der Aminosäuren 144 bis 158 des menschlichen uPA, und worin Y2 der katalytische Bereich des menschlichen uPA ist, bestohend aus den Aminosäuren 159 bis 411 des menschlichen uPA.
Die bevorzugtesten Einzelkettenplasminogenaktivatoren zum Einsatz als Komponente B sind die der Formel (Ii), worin X2 eine Aminosäuresequenz ist, bes'.ehend aus den Aminosäuren 1 bis 49 und 176 bis 262 des menschlichen tPA, worin L2 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA, und worin Y2 der katalytische Bereich des menschlichen uPA ist, bestehend aus den Aminosäuren 159 bis 411 des menschlichen uPA (bezeichnet als FK2IuPA), oder worin X2 eine Aminosäuresequenz ist, bestellend aus den Aminosäuren 1 bis 3 und 176 bis 262 des menschlichen tPA, und worin L2 und Y2 wie oben definiert sind (bezeichnet als K2tuPA).
Eine bevorzugte pharmazeutische Zubereitung umfaßt als Komponente A einen Plasminogenaktivator der Formel (I), worin X1 eine direkte Bindung ist, worin L1 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA, und worin Y1 der katalytische Bereich des menschlichen tPA ist, bestehend aus den Aminosäuren 276 bis 527 des menschlichen tPA (bezeichnet als tPA-B-Kette, erweitert). Die Zubereitung umfaßt als Komponente B scuPA oder einen Plasminogenaktivator der Formol (II), worin X2 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 49 und 176 bis 262 des menschlichen tPA, worin L2 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA, und worin Y2 der katalytische Bereich des menschlichen uPA ist, bestehend aus den Aminosäuren 159 bis 411 des menschlichen uPA (bezeichnet als FK2tuPA). Komponente B kann auch ein Plasminogenaktivator der Formel (II) sein, worin X2 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 3 und 176 bis 262 des menschlichen tPA, worin L2 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA, und worin Y2 der katalytische Bereich des menschlichen uPA ist, bestehend aus den Aminosäuren 159 bis 411 dos menschlichen uPA (bezeichnet als K2tuPA). Eine weitere bevorzugte pharmazeutische Zubereitung umfaßt als Komponente AtPA und als Komponente B einen Plasminogenaktivator der Formel (II), worin X2 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 49 und 176 bis 262 des menschlichen tPA, worin L2 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA, und worin Y2 der katalytische Bereich des menschlichen uPA ist, bestehend aus den Aminosäuren 159 bis 411 des menschlichen uPA (bezeichnet als FK2IuPA). Komponente B kann auch ein Plasminogenaktivator der Formel (II) sein, worin X2 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 3 und 176 bis 262 des menschlichen tPA, worin L2 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA, und worin Y2 der katalytische Bereich des menschlichen uPA ist, bestehend aus den Aminosäuren 159 bis 411 des menschlichen uPA (bezeichnet als K2tuPA). Gleichermaßen bevorzugt ist eine pharmazeutische Zubereitung, die als Komponente A einen Plasminogenaktivator der Formel (I) umfaßt, worin X1 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 44 des menschlichen uPA, die in Reihe mit den Aminosäuren 176 bis 262 des menschlichen tPA verbunden sind, worin L1 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA und worin Y1 der katalytische Bereich des menschlichen tPA ist, bestehend aus den Aminosäuren 276 bis 527 des menschlichen tPA (bezeichnet als uK2tPA), und die als Komponente B scuPA oder einen Plasminogenaktivator der Formel (II) umfaßt, worin X2 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 49 und 176 bis 262 des menschlichen tPA, worin L2 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA, und worin Y2 der katalytische Bereich des menschlichen uPA ist, bestehend aus de· Aminosäuren 159 bis 411 des menschlichen uPA (bezeichnet als FK2tuPA). Komponente B kann auch sein ein Plasminogenaktivator der Formel (II), worin X2 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 3 und 176 bis 262 des menschlichen tPA, worin L2 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA und worin Y2 der katalytische Bereich des menschlichen uPA ist, bestehend aus den Aminosäuren 159 bis 411 des menschlichen uPA (bezeichnet als K2tuPA).
Weitere pharmazeutische Zubereitungen umfassen als Komponente A einen Plasminogonaktivator der Formel (I), worin X1 eine direkte Bindung ist, worin L1 eine Aminosäuresequenz darstellt, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 12 der freien, voll aktiven sauren Phosphatase (PH 05), die in Reihe mit den Aminosäuren 256 bis 275 des menschlichen tPA verbunden sind, und worin Y1 der katalytische Bereich des menschlichen tPA ist, bestehend aus den Aminosäuren 276 bis 527 des menschlichen tPA (bezeichnet als tPA-B-Kette, fusioniert), und als Komponente B umfassen sie scuPA oder einen Plasminogonaktivatcr der
Formel (II), worin X2 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 49 und 176 bis 262 des menschlichen tPA, worin L2 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA, und worin Y2 der katalytische Bereich des menschlichen uPA ist, bestehend aus den Aminosäuren 159 bis 411 des menschlichen uPA (bezeichnet als FK2tuPA). Komponente B kann auch ein Plasminogenaktivator der Formel (II) sein, worin X2 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 3 und 176 bis 262 des menschlichen tPA, worin L2 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA und worin Y2 der katalytischo Bereich des menschlichen uPA ist, bestehend aus den Aminosäuren 159 bis 411 des menschlichen uPA (bezeichnet als KjtuPA). Die Plasminogenaktivatoren, die in den pharmazeutischen Kombinationszubereitungen enthalten sind, sind bekannte Zubereitungen oder können nach Verfahren hergestellt werden, die auf dem hier behandelten Fachgebiet gut bekannt sind. Besonders bevorzugt sind solche PAs, die nach Technologien mit rekombinanter DNS hergestellt worden sind, wie z.B. beschrieben in EP277313.EP231885, EP275856,WO88/8451,EP275606, EP273774,EP213794,WO88/5822,EP143081, EP225236, EP288435 und bei Lijnen et al. (J. Biol.Chem.263,5594-5598 [1988)). Die erfindungsgemäßen neuen Kombinationszubereitungen können am Menschen zur Verhütung oder Behandlung von Thrombose oder Krankheiten eingesetzt werden, die durch Thrombose, Arteriosklerose, myokardiale und zerebi Ie Infarkte, venöse Thrombose, Thromboembolie, Thrombose nach chirurgischen Eingriffen, Thrombophlebitis usw. hervorgerufen werden. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen können zur Behandlung der oben genannten Indikationen eingesetzt werden, wenn sie parenteral, z.B. intravenös, verabreicht werden.
Die Kombinationszubereitung kann entweder Komponenten A und Komponenten B in einer Weise enthalten, die es erforderlich macht, daß sie gleichzeitig und auf dem gleichen Weg verabreicht werden, oder sie kann die Komponenten A und B separat enthalten (kit of parts), was erlaubt, sio zu verschiedenen Zeiten und/oder auf verschiedene Art zu verabreichen. Es gibt geeignete Infusions- oder Injektionslösungen, bevorzugterweise wäßrige isotonische Lösungen oder Suspensionen, die vor dem Einsatz hergestellt werden können, z.B. aus lyophilisierten Präparaten, die den oder die aktiven Hilfsstoffe allein oder zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger enthalten, wie z. B. Mannit, Laktose, Dextrose, menschliches Serumalbumin u. ä. die pharmazeutischen Verbindungen werden sterilisiert und, falls gewünscht, mit Zusätzen gemischt, z. B. Konservierungsmitteln, Stabilisatoren, Emulgatoren, Lösungsvermittlern, Puffern und/oder Salzen (wie z. B. 0,9%iges Natriumchlorid) zur Einstellung der Isotonie. Die Sterilisation kann durch sterile Filtration durch Filter mit kleinen Poren (0,45 Mikrometer Durchmesser oder kleiner) erreicht werden, woran anschließend die Zubereitung, falls gewünscht, lyophilisiert werden kann. Es können auch Antibiotika zugegeben werden, um zur Erhaltung der Sterilität beizutragen. Es können z.B. Standardfornuilierungstechnologien eingesetzt werden, die für die Verabreichung von PAs entwickelt wurden (d.h. Europäische Patentanmeldungen Nr.93619,41766,112940 u.a.), oder neue Zusammensetzungen, die dem PA ausreichende Löslichkeit in einem gepufferten Medium bei niedrigem pH-Wert verleihen (Beispiele in Europäischer Patentanmeldung Nr. 211 592, Deutsche Offenlegungsschrift Nr.3617752,3617753,3642960). Aus Stabilitätsgründen ist es angebracht, lyophilisierte Probesubstanzen in 5%iger Dextrose oder 5%igem Mannit oder 0,9%igem Natriumchlorid u.a. zur ursprünglichen Konzentration zu lösen. Abhängig vom Typ der Krankheit und vom Alter und Zustand des Patienten liegt die tägliche Dosis für die einmalige Verabreichung zur Behandlung eint j Patienten, der ca. 70 kg wiegt, im Bereich von 5 bis 100 mg, im besonderen von 10 bis 40 mg, Komponente A, und von 5 bis 100mg, im besonderen 10 bis 40mg, Komponente B. Demgemäß kann das Gewichtsverhältnis zwischen Komponente A und Komponente B in der Zubereitung variieren, im allgemeinen zwischen 1:1 und 1:20. Ein Gewichtsverhältnis zwischen 1:2 und 1:10 wird bevorzugt gewählt.
Die pharmazeutischen Zubereitungen gemäß der vorliegenden Erfindung werden in Eindosenzubereitungen dispensiert, z. B. in Ampullen, die therapeutisch effektive Mangen sowohl von Komponente A als auch Komponente B umfassen, oder bevorzugt in Doppelampullsn, die therapeutisch effektive Mengen der Komponenten A und B separat umfassen, zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Die vorliegenden pharmazeutischen Zubereitungen werden in einer Weise produziert, die per se bekannt ist, wobei konventionelle Lyophilisierungs- oder Lösungsprozeduren angewendet werden. Es werden z. B. die Komponenten A und B und wahlweise der pharmazeutisch akzeptable Träger gemischt, und zur Herstellung eines Lyophilisats wird eine erhaltene wäßrige Lösung gefriergetrocknet. Die Zubereitungen enthalten zwischen ca. 0,1 % und 20% der aktiven Inhaltsstoffe, im besonderen ca. 1 % bis 10%, im Falle von Lyophilisaten bis zu 100%.
Die Erfindung bezieht sich auch auf den erfindungsgemäßen Einsatz der Kombinationszubereitungen zur prophylaktischen und therapeutischen Behandlung des menschlichen Körpers, besonders für die obengenannten klinischen Syndrome, im besonderen zur Prophylaxe und Therapie von Thrombose oder Krankheiten, die durch Thrombose im menschlichen Körper hervorgerufen werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung basiert auf der überraschenden Beobachtung, daß die kombinierte Verabreichung der Komponenten A und B zur Förderung der fibrinolytischen Aktivität führt. Demgemäß bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Verhütung oder Behandlung von Thrombose oder einer Krankheit, die beim Menschen durch Thrombose hervorgerufen wird, bei dem der betreffenden Person eine pharmazeutische Kombinationszubereitung verabreicht wird, die eine fibrinolytisch effektive Menge der Komponenten A und B enthält.
Die Abbildungen 1 bis 7 sind Diagramme, die die Aktivität der Gerinnungslyse der verschiedenen Kombinationen von Plasminogenaktivatoren zeigen.
Abb. 1: stellt die komplementäre Wirkungsweise von tPA und K2IuPA dar.
Abb. 2: stellt die komplementäre Wirkungsweise von tPA und FK2tuPA dar.
Abb.3: stellt die komplementäre Wirkungsweise von uK2tPA und scuPA dar.
Abb.4: stellt die komplementäre Wirkungsweise von uK2tPA und K2tuPA dar.
Abb. 5: stellt die komplementäre Wirkungsweise der B-Kette von tPA (fusioniert) und scuPA dar.
Abb.6: stellt die additive Wirkungsweise von tPA und uK2tPA dar.
Abb. 7: stellt die additive Wirkungsweise von K2tuPA und FK2tuPA dar.
Die folgenden Beispiele illustrieren die Erfindung, ohne irgendeine Begrenzung zu bedeuten.
Beispiel 1
Konstruktion eines Hefeexpressionsplasmids, das die B-Ketto von tPA (fusioniert) kodiert Die Nukleotidsequenz, die die B-Kette von tPA kodiert (He 276-Pro527), wird vom Plasmid p31/PH05-TPA 18 (Europäische Patentanmeldung Nr. 143081) isoliert, das die komplette Kodierungssequenz des fertigen tPA enthält. p31/PH05-TPA18 ist ein von pBR322 abgeleitetes Plasmid mit einem BamHI/Hindlll-Abschnitt, enthaltend den PH05 Promotor, die PH05-Signalsequenz, die Kodierungssequenz von tPA und die PH05-Transkriptionsabbruchsignale, orientiert entgegen dem Uhrzeigersinn. p31/ PH05-TPA18 wird mit Seal und Hindill digeriert, und das resultierende 1 kb-Fragment verschlüsselt die Aminosäuren Cys256bis Pro 527 von tPA.
Das Plasmid p29 (Haguenauer-Tsapis et al. [1984], Mol. Cell. Biol.4,2668-2675) ent , jlt die Hefegene für die repress!eibaren und konstituiven sauren Phosphatasen (PH05 und PH 03) in einer Tandemanordnung auf einem 3,9kb-BamHI-Hpal-Fragment (Bajwa et al. 119841, Nucleic Acids Research 12,7721-7739). Das DNS-Fragment wird vom Plasmid ρ30 isoliert (Europäische Patentanmeldung Nr. 143081, deponiert als DSM 4 297) und in pBR 322 zwischen BamHI und Pvull im Uhrzeigersinn kloniert, was zum Plasmid ρ29 führt. Ein Accl-Restriktionsdigest, eine fillin-Reaktion mit Klenow-DNS-Polymerase und einem BamHI-Restriktionsdigest führt zu einem 626bp-Fragment, das den PH05-Promotor, die Signalsequenz und eine 34-Nukleotidextension in die Kodierungssequenz der vollständigen PH05 enthält.
Das 1 kb-Scal/Hindlll-Fragment von p31/PH05-TPA18 und das 626bp-Fragment von ρ29 werden über ihre stumpfen Enden verbunden und in den Hefevektor pJDB207 kloniert (Beggs [1981), in: Molecular Genetics in Yeast, Alfred Benzon Symposium, Munksgaard, von Wettstein et al. (eds). Band 16,383-390), getrennt mit BamHI und Hindlll.
Das resultierende Hefeexpressionsplasmid pJDB 207/PH 05-TPA B hat die folgende in frame-Fusion der Aminosäuren 1 bis 12 der freien, voll aktiven sauren Phosphatase zu Cys256 von tPA:
DNA-FusionspunkL
(J(JT ACC ATT CCC TTA GGC ΛΑΛ CTA GCC GAT GTC GAC TGT GAT GIy Tin- He Pro Leu GIy Lys Leu Ala Asp VaI Asp Cys Asp 2 λ Ί b 6 7 H 9 10 il 12
P HO 5
2b6 2b7
LPA A
GTC CCC TCC TGC TCC ACC TGC GGC CTG AGA CAG TAC AGC CAG CCT VaI Pro üer Cys Ser Thr Cys GIy Leu Arg GIn Tyr Ser GLn Pro 2b8 2b9 260 261 262 263 264 26b 266 267 268 269 270 27 1 272
. LPA Λ
CAG TTT CGC ATC AAA CCG
Gin Phe Arg lie Lys Pro
273 2Vl 27b ,276. 277 527 * LPA B f«i φ*
ρ = prozessierende S' ?!le
Das entsprechende Protein wird mit B-Kette von tPA (fusioniert) bezeichnet.
Beispiel 2
Transformation des Saccharomyces cerevif iee-Stamms HT246 mit pJDB 207/PH 05-TPA B Der Saccharomyces cerevlsiae-Stamm HT24G (a, leu 2-3, leu 2-112, prb; DSM 4C84) wird mit dem Plasmid pJDB 207/PH05-TPA B transformiert, wobei das Transformationsprotokoll benutzt wird, das von Hinnen et al. beschrieben wurde (Proc.Natl.Acad.Sci.USA75,1929 [1978)). Transformierte Hefezellen werden auf Leucinmangel-Hefeminimalmedienplatten selektiert. Einzelne transformierte Hefekolonien werden isoliert und als Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB 207/PH05-TPA B bezeichnet.
Beispiel 3
Fermentation von Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/PH05-TPA B
Saccharomyces cerevisiae HT 246/pJDB 207/PH 05-TPA B enthält ein Plasmid mit dem PH 05-Promotor voller Länge und erfordert die Derepression des Promotors zur Expression der B-Kette von tPA. Zellen der S. cerevisiae HT246-Transformanten werden
gezüchtet in 1OmI Hefeminimalmedium (Difco-Hefestickstoffbase ohne Aminosäuren unter Zugabe von 2%iger Glukose und 20mg/l L-Histidin) in einem 50-ml-Erlenmeyerkolben unter Schütteln bei 3O0C für 24h, bis eine Dichte von 5-7 χ 107 Zellen/ml erreicht ist. Die Zellen der Vorkultur werden dann in 0,9%igem NaCI gewaschen, und 20% der Vorkulturzellen werden benutzt, um 50ml eines niedrigen Pj-Minimalmediums zu impfen, das entsprechend dem Rezept des Difco-Hefestickstoffbasenmediums (ohne Aminosäuren) hergestellt wurde, aber 0,03 g/l KH2PO4,10g/l L-Asparagin anstelle von (NH4J2SO4,20g/l Glukose und 1 g/l L-Histidin enthält. Die Kulturen werden bei 300C bis zu 48h lang bei 180U/min gerührt. Am Ende werden Dichten von 5 x 107 Zellen/ml (A OD6O0 = 4-5) erreicht.
Beispiel 4
Rückgewinnung der R-KeMo von tPA (fusioniert) aus Hefekulturüberständen Die rekombinante tPA-B-Kette (fusioniert) von Hefe wird aus einer 30-l-Fermentation des Stamms HT246/pJDB 207/PH 05-TPA B in niedrigem Phosphatmedium hergestellt.
Zu 301 Überstand werden nach 60h Fermentation DE-3 Sepharose-Perlen (EP 112122) zugegeben. Die Suspension wird 1 h lang bei 4°C gerührt. Die Perlen werden dann auf eine Säule übertragen und mit 1M NaCI, 1OmM Natriumphosphat, pH 7,0, und 0,1%igemTween 80 gewaschen. Die Elution der tPA-B-Kette (fusioniert) von der Säule wird mit 1,6M NH4SCN in einem Puffer erreicht, bestohend aus 1OmM Natriumphosphat pH 7,0 und 0,05%igem Tween 80.
Die Reinheit der rekombinanten tPA-B-Kette (fusioniert) von Hefe nach 2 aufeinanderfolgenden Chromatographiezyklen auf DE-3 ist größer als 90%, wie abgeschätzt durch SDS-Gelelektrophorese. Das Molekül migriert mit einem scheinbaren Molekulargewicht von > 12OkD, das auf ca. 33 kD reduziert wird durch Behandlung mit Endoglukosidase H (Trimble et al. {1984] Anal. Biochem. 141,515-522). Das zeigt, daß die sekretierte tPA-B-Kette (fusioniert) von Hefe hochglukosyliert ist, wobei die Glukosierung 75% des Gesamtmolekularyewichts erbringt.
Die Aktivität der rekombinanten tPA-B-Kette (fusioniert) von Hefe wird mit einer fluorometrischen Analyse erfaßt (Zimmermann et al. [1978] Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75,750). Die spezifische Aktivität der tPA-B-Kette (fusioniert) beträgt 150 000 FU/mg Protein (zum Vergleich: Die Aktivität des rekombinanten tPA von Hefe, wie beschrieben in EP100 561, beträgt 125000 FU/mg).
Beispiel 5
Rückgewinnung von scuPA aus Saccharornyces cerevlslae
Die Expression rekombinanten Hefe-scuPA erfolgt wie in der Europäischen Patentanmeldung Nr.288435 beschrieben.
Der S.cerevlslae-Stamm HT246/pJDB207/GAPDL-l-UPA wird in einem Komplexmedium gezüchtet, bestehend aus (g/l): Pepton 5, Hefeextrakt 10, Glukose 20, Sukrose 40, (NH4I2SO4 3, KH2PO4 2, MgSO4 0,5, NaCI 0,1, CaCI2 0,1, Biotin 10 Mikrogramm/I.
Ungefähr 1 χ 109 Zellen/ml (A OD600 40-45) werden nach 48h Inkubation bei 3O0C und 200'J/min erreicht.
Die Kultur wird zentrifugiert, und die Zellen werden resuspendiert in Lysepuffer, bestehend aus 66mM Kaliumphosphat pH 7,4, 4 mM Zwittergent (Calbiochem.), und in einer Dyno-Mühle (Braun-Meisungen) zerstört. Der Überstand der Suspension der zerstörten Zellen wird auf 500ml eingestellt mit 25 mM Kaliumphosphat pH 7,4,0,5%igem Tween 80. 50g vorgequollener Anionenaustauscher DE 52 (Whatman, Springfield, England) werden zugegeben, und die Suspension wird 30min lang bei 40C geschüttelt. Die Perlen werden unter Benutzung eines Buchner-Trichtors von der Lösung separiert, und die Lösung wird mit HCI, (1 mol/l), auf einen pH-Wert von 4 eingestellt. Die Leitfähigkeit sollte idealerweise 10 bis 11 mS (milliSiemens) betragen. 50g (Naßgewicht) des Kationenaustauschers S-Sepharose Schnellfluß (Pharmacia, Uppsala, Schweder.) werden zugegeben, und die Suspension wird 1 h lang bei 4°C geschüttelt. Nach dem Waschen werden die Perlen auf eine Säule mit 10mm Durchmesser übergeführt, und scuPA wird eluiert mit 10OmM Tris-HCI pH 8,5,0,05%igem Tween 80. Die Fraktionen, die scuPA enthalten, werden unverzüglich auf eine Anti-Urokinase-lgG-Sepharose-4-B-Säule gebracht (gereinigter polyklonaler Kaninchenantikörper ilgG-Fraktion], eingestellt gegen menschliche Harnurokinase), gewaschen mit 2 Volumen desselben Puffers und dann eluiert mit 0,5 M NaCI, 0,2 M Glyzin-HCI, pH 2,5. In Hefe produzierter scuPA wird in einer reinen Form eluiert, wie durch SDS-Polyakrylamid-Geleiektrophorese geprüft. Hefe-scuPA migriert als ein Einzelband von ungefähr 54 bis 55KD Molekulargewicht unter reduzierenden Bedingungen.
Beispiel 6
Rückgewinnung von Hybridplasminogenaktivatoren aus Überständen von CHO-Zellkulturen Hybridplasminogenaktivatoren werden in CHO-Zellen expressiert, wie offenbart in Europäischer Patentanmeldung Nr.277313. Die Hybridplasminogenaktivatoren, in EP277313 bezeichnet als UK2TPAB (BC), K2UPA" (BC) und FK2UPA" (BC), sind mit den Hybriden uK2tPA und K2tuPA bzw. FK2tuPA identisch.
Die Medien, die uK2tPA, FK2tuPA bzw. K2tuPA enthalten, werden durch Mikrofiltration geerntet (KrosFlo II, 0,2 Mikrometer-Hohlfasermodul von Microgen, Kalifornien). Die zellfreien Medien werden 20- bis 50fach durch tangentiale Flußultrafiltration (Pellicon-Kassette Typ PLGC10'OOO NMWL von Millipore) konzentriert. Dieses Rohmaterial wird in jedem Fall durch Affinitätschromatographie gereinigt.
6a:uK2tPA
uK2tPA wird auf DE-3 durch Chromatographie gereinigt, verbunden mit durch Zyanbromid aktivierte Sepharose (Pharmacia). DE-3 ist ein Trypsininhibitor von Erythrina latisslma (Ch. Heussen, Universität von Kapstadt, Dissertation 1982). DE 3-Sepharoso wird den konzentrierten Medien zugegeben, die uK2tPA enthalten, und die Suspension wird 45min lang bei 40C gerührt. Die Perlen werden dann auf eine Säule übertragen und mit 1M NaCI, 1OmM Natriumphosphat pH 7,0,0,1 %igem Tween 80 gewaschen. Die Elution des Enzyms wird mit 1,6M NH4SCN in einem Puffer erreicht, bestehend aus 1OmM Natriumphosphat pH 7,0 und 0,05%igem Tween 80. Das Eluat der DE 3-Säule wird auf eine G 75-Medium-Säule (Pharmacia) gebracht, mit 1OmM Tris/HCI pH 8,5,0,05%igem Tween 80 äquilibriert und mit dem Äquilibrationspuffer entwickelt. Die Fraktionen, die uK2tPA enthalten, werden vereinigt und auf eine Mono-Q-Säule (1ml Bettvolumen; Pharmacia) gebracht, äquilibriert mit 1OmM Tris/HCI pH 8,5,0,05%igem Tween 80. Nach dem Waschen mit Äquilibrationspuffer wird uK2tPA eluiert mit einem linearen Gradienten des Äquilibrationspuffers und dem Puffer B, bestehend aus 1 M NaCI, 1OmM Tris/HCI pH 8,5,0,05%igem Tween 80.
Der auf diese Art und Weise produzierte uK2tPA migriert als ein Doppelband von 44kD bzw. 4k kD Molekulargewicht bei SDS-Polyakrylamid-Gelelektrophoreseunter nichtreduzierenden Bedingungen, wobei die niedrige Molekulargewichtsform ca. 70% des Gesamtproteins beträgt. Markierungsexperimente mit 'S6J-Concanavalin A zeigen, daß die hohe Molekulargewichtsform nicht nur in der B-Kette, sondern auch in der „Kringel"-Rogion glukosyliert ist.
6b: FK2tuPAundK2tuPA
Den konzentrierten Medien, die FK2tuPA bzw. K2tuPA enthalten, wird anti-Urokinase-lgG-Sepharose zugegeben (gereinigter polyklonaler Kaninchenantikörper (IgG-Fraktion), eingestellt gegen menschliche Harnurokinase), und die Suspension wird 45min lang bei 4°C gerührt. Die Perlen werden dann auf eine Säule transferiert und mit 1 M NaCI, 1OmM Natriumphocphat pH 7,0,0,057oigem Tween 80 gewaschen. Der jeweilige PA wird mit 15OmM e-Aminokapronsäure, 5OmM Glyzerin pH 2,2, 0,05%igem Tween 80 eluiert. Die Fraktionen, die Protein enthalten, werden mit NaOH (1 mol/l) auf einen pH-Wert von 5 eingestellt. Das Eluat der Antikörpersäule wird auf eine Mono-S-Säule gebracht (1ml Bettvolumen; Pharmacia), äquilibriert mit 5OmM Natriumphosphat pH 5,0,0,05%igem Tween 80. Nach dem Waschen mit Puffer A, der Äquilibrationspuffer auf einem pH-Wert von 6,0 enthält, wird PA mit einem linearen Gradienten von Puffer A und Puffer B eluiert, der 50OmM NaCI, 5OmM Natriumphosphat pH 7,0,0,05%iges Tween 80 enthält. Nach diesem Verfahren tritt FK2tuPA mit drei Peaks bei 35% B, 45 % B bzw. 55% B auf, wobei der Peak von 55% B der hauptsächliche ist (ca. 60 bis 70% der Gi samtmeiige von FKjtuPA). Dieser dritte Peak hat die erwartate N-terminale Sequenz.
Markierungsexperimente mit 126-J-Concanavalin A zeigen die Anwesenheit von Karbohydrat in der B-Kette von FK2tuPA, während in der Kringelregion kein Karbohydrat entdeckt wird. Der auf diese Art und Weise produzierte FK2tuPA migriert als ein Einzelband von ungefähr 42 kD Molekulargewicht in SDS-Polyakrylamidge.1 unter nichtreduzierenden Bedingungen.
Der erhaltene FK2UiPA hat eine Reinheit von ca. 95% oder mehr, entsprechend SDS-Polyakrylamid-Gelelektrophorese unter reduzierenden Bedingungen und RP-HPLC-Analyse. Die Fraktion der Zweikettenform im Endpräparat beträgt 10 bis 15%, entsprechend direkter amidolytischer Analyse.
Der auf die gleiche Art und Weise produzierte K2tuPA migriert als ein diffuses Band von ca. 4OkD Molekulargewicht in SDS-Polyakrylamidgel unter nichtreduzierenden bedingungen. Maikierungsexperimente mit 126J-Concanavalin A zeigen Karbohydrat nur in der B-Kette des Enzyms. Der erhaltene K2tuPA hat eine Reinheit von ca. 95% oder mehr, festgestellt durch SDS-Polyakrylamid-Gelelektrophorese und RP-HPLC-Analyse. Die Fraktion der Zweikettenform im Endpräparat beträgt 10 bis 15%, entsprechend direktor amidolytischer Analyse.
Beispiel 7
Ex vivo-Gerinnsellyse In menschlichem Plasma
Menschliches Blut wird direkt in eine 3,8%ige Natriumzitratlösung aufgezogen (Verhältnis Blut/Zitratlösung 9:1). Das Gemisch wird 10min lang mit 10OOU/min zentrifugiert, um Zitratplasma zu erhalten.
Zu 1 ml menschlichem Zitratplasma werden 20 Mikroliter 1 M CaCI2-Lösung in H20,10 Mikroliter menschliches 1!6J-Fibrinogen (Amersham, ca. 300000cpm) und 10 Mikroliter (= 0,4 U) menschliches Thrombin (ßoehringer, Mannheim) zugegeben. Die Mischung wird schnell in eine verfügbare 1-ml-Spritze gegossen, deren Spitze mit einer Rasierklinge entfernt wurde. Man läßt die Mischung 20 min lang gerinnen, preßt sie aus der Spritze und läßt sie sich 40min lang in 5OmM Phosphatpuffer ablagern. Das aus 1 ml Plasma erhaltene wurmartige Gerinnsel wird in 4 gleiche Stücke geschnitten, jedes Stück wird in ein 10-ml-Röhrchen gegeben, in das 2ml frisches, unkoaguliertes Zitratplasma gegeban wird.
Die Gerinnsellysereaktion wird durch die Zugabe entweder nur eines Plasminogenaktivators oder einer Kombination von zwei Plasminogenaktivatoren ausgelöst.
Referenz-tPA wird von American Diagnostica, New York gekauft oder aus einer menschlichen Melanomzellinie isoliert, wie in Europäischer Patentanmeldung Nr. 112122 offenbart. Rekombinanter scuPA von Hefe kann entweder von American Diagnostica bezogen oder nach Beispiel 5 hergestellt werden. Die B-Kette von tPA (fusioniert) und die Hybridplasminogenaktivetoren uKitPA, K2tuPA und FK2tuPA werden nach den Verfahren gereinigt, die in Beispiel 4 bzw. 6 beschrieben werden.
Es werden Experimente mit Blut von verschiedenen Blutspendern durchgeführt. Die Standardmenge von PA (oder der Kombination von zwei verschiedenen PAs), die zur Erreichung eines bestimmten Prozentsatzes der Lyse benötigt wird, kann dementsprechend um den Faktor 2 bis 2,5 variieren (siehe Abbildungen 1 bis 7).
Nach Zugabe des entsprechenden PA oder der PA-Kombination werden die Röhrchen bei 370C leicht rotiert, und 100 Mikroliter Plasmaprobe werden in verschiedenen Zeitintervallen entnommen. Die Radioaktivität in den Proben, die während der Lyse aus dem Gerinnsel abgegeben wird, wird mit einem γ-Zähler gemessen und mit % Lyse berechnet, verglichen mit einer Kontrolle ohne Plasminogenaktivator. Die Resultate werden in den Abbildungen 1 bis 7 gezeigt.
7 a: Kombination von tPA mit K2UiPA
70ng/ml tPA oder 280ng/ml K2tuPA werden entweder allein oder in Kombination dem geronnenen Plasma zugegeben. Das Resultat wird in Abbildung 1 gezeigt. Die komplementäre und nicht einfach additive Wirkungsweise ist am deutlichsten zu frühen Zeitpunkten zu beobachten, wenn tPA die Lag-Phase zu Beginn der K2tuPA-vermittelten Lyse verkürzt.
7b: Kombination von tPA mit FK2tuPA
35ng/ml tPA oder 140ng/ml FK2tuPA werden entweder allein oder in Kombination dem geronnenen Plasma zugegeben. Das Resultat wird in Abbildung 2 gezeigt.
7c: Kombination von uK2tPA mit scuPA
140ng/ml uK2tPA oder 280ng/ml scuPA werden entweder allein oder in Kombination dem geronnenen Plasma zugegeben. Das Resultat wird in Abbildung 3 gezeigt.
7d: Kombination von uK2tPA mit K2tuPA
70ng/ml uK2tPA oder 70ng/ml KjtuPA werden entweder allein oder in Kombination dem geronnenen Plasma zugegeben. Das Resultat wird in Abbildung 4 gezeigt.
7β: Kombination der B-Kette von tPA (fusioniert) mit scuPA
70ng/ml B-Kette von tPA (fusioniert) oder 280ng/ml scoPA werden entweder allein oder in Kombination dem geronnenen Plasma zugegeben. Das Resultat wird in Abbildung 5 gezeigt.
Überraschenderweise kann tPA, wie in den Abbildungen 3,4 und 5 demonstriert, entweder durch uK2tPA oder die B-Kette von tPA (fusioniert) in Kombination mit scuPA oder einem seiner Substituenten ersetzt werden, um den gleichen Effekt zu erzielen.
7f: Kombination von tPA mit uKjtPA
70ng/ml tPAoder 70ng/ml uK2tPA werden entweder allein oder in Kombination dem geronnenen Plasma zugegeben. Das Resultat wird in Abbildung 6 gezeigt.
7g: Kombination von K2tuPA mit FK2tuPA
70ng/ml K2tuPAoder 140ng/ml FK2tuPA werden entweder allein oder in Kombination dem geronnenen Plasma zugegeben. Das Resultat wird in Abbildung 7 gezeigt.
Wie in den Abbildungen 6 und 7 demonstriert, wird keine komplementäre Stimulation der Gerinnsellyse beobachtet, weder mit tPA, kombiniert mit uK2tPA, noch mit K2tuPA, kombiniert mit FK2tuPA. In beiden Fällen ist die Lyse einfach additiv.
Beispiele
Pharmazeutische Zubereitungen zur ρ jrenteralen Verabreichung
Die pharmazeutische Kombinationsz'jbereitung bestehet aus sechs Fläschchen, von denen jedes 5mg lyophilisierten tPA als Komponente A und 300mg Dextrose enthält, und sechs Fläschchen, von denen jedes 20mg FK2tuPA als Komponente B und 300mg Dextrose enthält.
Eine Lösung zur parenteralen Verabreichung von tPA oder FK2tuPA wird hergestellt, indem der Inhalt jedes der sechs Fläschchen in einer 10-ml-Ampulle mit sterilem, pyrogenfreiem Lösungsmittel gelöst wird, das 10OmM Ammoniumazetatpuffer enthält, der mit Essigsäure auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt ist.
Anstelle von tPA und FK2tuPA können auch äquivalente Mengon anderer PAs als Komponente A und B eingesetzt werden, z. B.
die B-Kette von tPA (fusioniert), die B-Kette von tPA (erweitert) oder uK2tPA als Komponente A und K2tuPA als Komponente B.
Deponierung von Mikroorganismen
Die folgenden Mikroorganismen wurden bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Mascheroder Weg 1 b, D-3300 Braunschweig (BRD) deponiert.
Mikroorganismus Deponierungsdatum Zugangsnummer
Saccharomyces
cerevisiaeHT 246 15. April 1987 DSM 4084
E.COÜHB101/P30 23. Oktober 1987 DSM 4297
E.coliHBIOI/pSI/
PH0 5-TPA18 19. Dezember 1988 DSM 5118

Claims (68)

1. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Kombinationszubereitung, die als Komponente A einen Plasminogenaktivator umfaßt, der die B-Kette des tPA umfaßt, und die als Komponente B einen Einzelkettenplasminogenaklivator umfaßt, der die B-Kette des uPA umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß Komponente A nicht tPA sein kann, wenn Komponente B scuPA ist und der Prozeß das Mischen der Komponenten A und B und wahlweise des pharmazeutisch akzeptablen Trägers und zur Herstellung eines Lyophilisats das Gefriertrocknen einer erhaltenen wäßrigen Lösung umfaßt.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutische Kombinationszubereitung als Komponente A einen Plasminogenaktivator der Formel
NH2-X1-L1-Y1-COOH v (I)
umfaßt, worin
X1 eine direkte Bindung oder eine Aminosäuresequenz ist, umfassend alle oder diskrete Bereiche der Α-Kette des menschlichen tPA und/oder alle oder diskrete Bereiche der Α-Kette des menschlichen uPA, worin
L1 eine direkte Bindung oder eine Aminosäuresequenz ist, die X1 mit Y1 verbindet, und worin Y1 der katalytische Bereich des menschlichen tPA ist und als Komponente B einen Einzelkettenplasminogenaktivator der Formel
NH2-X2-L2-Y2-COOH (II)
umfaßt, worin
X2 eine direkte Bindung oder eine Aminosäuresequenz ist, umfassend alle oder diskrete Bereiche der Α-Ketten des menschlichen tPA und des menschlichen uPA oder alle oder diskrete Bereiche der Α-Kette des menschlichen uPA, worin
L2 eine direkte Bindung oder eine Aminosäuresequenz ist, die X2 mit Y2 verbindet, und worin Y2 der katalytische Bereich des menschlichen uPA ist, zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, dadurch gekennzeichnet, daß Komponente A nicht tPA sein kann, wenn Komponente B scuPA ist.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutische Zubereitung als Komponente A einen Plasminogenaktivator der Formel (I) umfaßt, worn X1 eine Aminosäuresequenz ist, essentiell bestehend aus diskreten Bereichen der A-KeUe des menschlichen tPA oder allen Bereichen der Α-Kette des menschlichen tPA und dem Kringelbereich des menschlichen uPAoder den Finger-, Kringel-1- und Kringel-2-Bereichen des menschlichen tPA und dem Wachstumsfaktor und/oder dem Kringelbereich des menschlichen uPA oder dem Kringel-2-Bereich des menschlichen tPA und dem Wachstumsfaktor und/oder dem Kringelbereich des menschlichen uPA.
4. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutischeZubereitung als Komponente A einen Plasminogenaktivator der Formel (I) umfaßt, worin X1 eine Aminosäuresequenz ist, essentiell bestehend aus allen oder diskreten Bereichen der Α-Kette des menschlichen tPA oder dem Kringei-2-Bereich des menschlichen tPA und dem Wachstumsfaktorenbereich des menschlichen uPA.
5. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutische Zubereitung als Komponente A einen Plasminogenaktivator der Formel (I) umfaßt, worin X1 eine direkte Bindung oder eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 262 des menschlichen tPA oder den Aminosäuren 1 bis 44 des menschlichen uPA, die in Serien mit den Aminosäuren 176 bis 262 des menschlichen tPA verbunden sind.
6. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutische Zubereitung als Komponente A einen Plasminogenaktivator der Formel (I) umfaßt, worin L1 eine Aminosäuresequenz ist, die, wenn sie mit der N-terminalen Aminosäuregruppe von Y1 verbunden ist, eine Plasminverarbeitungsstelle erzeugt und zumindest eine Cys-Gruppe enthält.
7. Verfahren gemäß Anspruch 6 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung, worin L1 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus 11 bis 40 Aminosäuren.
8. Verfahren gemäß Anspruch 6 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung, worin die Cys-Gruppe 11 oder 12 Aminosäuren von der M-terminalen Aminosäuregruppe von Y1 entfernt ist.
9. Verfahren gemäß Anspruch 6 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung, worin L1 eine Aminosäuresequenz ist, die ausgewählt wurde aus der Gruppe der Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA, der Aminosäuren 147 bis 158 des menschlichen unAund der Aminosäuren 1 bis 12 der aktiven Säurephosphatase (PH05), die in Serien mit den Aminosäuren 256 bis 275 des menschlichen tPA verbunder sind.
10. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutische Zubereitung als Komponente A einen Plasminogenaktivator der Formel (I) umfaßt, worin Y1 der katalytische Bereich des menschlichen tPA ist, bestehend aus den Aminosäuren 276 bis 527 des menschlichen tPA oder einem Fragment davon, das die katalytische Aktivität sichert.
11. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutische Zubereitung als Komponente A einen Plasminogenaktivator der Formel (I) umfaßt, worin X1 eine direkte Bindung oder eine Aminosäuresequenz ist, ausgewählt aus der Gruppe der Aminosäruen 1 bis 262 des menschlichen tPA und der Aminosäuren 1 bis 44 des menschlichen uPA, die in Reihe mit den Aminosäuren 176 bis 262 des menschlichen tPA verbunden sind, worin L1 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA oder den Aminosäuren 1 bis 12 der freien, voll aktiven sauren Phosphatase (PH 05), die in Reihe mit den Aminosäuren 256 bis 275 des menschlichen tPA verbunden sind, und worin Y1 der katalytische Bereich des menschlichen tPA ist, bestehend aus den Aminosäuren 276 bis 527 des menschlichen tPA.
12. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutische Zubereitung als Komponente A einen Plasminogenaktivator der Formel (I) umfaß, worin X1 eine direkte Bindung ist, worin L1 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA, und worin Y1 der katalytische Bereich des menschlichen tPA ist, bestehend aus den Aminosäuren 276 bis 527 des menschlichen tPA.
13. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutische Zubereitung als Komponente A tPA umfaßt.
14. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutische Zubereitung als Komponente A einen Plasminogtenaktivator der Formel (I) umfaßt, worin X1 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 44 des menschlichen uPA, die in Reihe mit den Aminosäuren 176 bis 262 des menschlichen tPA verbunden sind, worin L1 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA, und worin Y1 der katalytische Bereich des menschlichen tPA ist, bestehend aus den Aminosäuren 276 bis 527 des menschlichen tPA (uK2tPA).
15. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutische Zubereitung als Komponente A einen Plasminogenaktivator der Formel (I) umfaßt, worin X1 eine direkte Bindung ist, worin L1 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 12 der freien, voll aktiven sauren Phosphatase (PH05), die in Reihe mit den Aminosäuren 256 bis 275 des menschlichen tPA verbunden sind, und worin Y1 der katalytische Bereich des menschlichen tPA ist, bestehend aus den Aminosäuren 276 bis 527 des menschlichen tPA (B-Kette von tPA, fusioniert).
16. Verfahren gembi5 Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutische Zubereitung als Komponente B einen Plasminogenaktivator der Formel (II) umfaßt, worin X2 eine Aminosäuresequenz ist, essentiell bestehend aus dem Finger und/oder Kringel-2-Bereich des menschlichen tPA oder den Finger-, Wachstumsfaktor- und Kringel-2-Bereichen des menschlichen tPA oder den Wachstumsfaktor-, Kringel-1- und Kringel-2-Bereichen des menschlichen tPA oder dem Wachstumsfaktor und/oder dem Kringelbereich des menschlichen uPA und dem Kringel-2-Bereich des menschlichen tPA.
17. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutische Zubereitung als Komponente B einen Plasminogenaktivator der Formel (II) umfaßt, worin X2 eine Aminosäuresequenz ist, essentiell bestehend aus dem Finger oder dem Kringel-2-Bereich des menschlichen tPA oder dem Kringel-2-Bereich des menschlichen tPA.
18. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutische Zubereitung als Komponente B einen Plasminogenaktivator der Formol (II) umfaßt, worin X2 eine direkte Bindung oder eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 49 und 176 bis 262 oder den Aminosäuren 1 bis 3 und 176 bis 262 des menschlichen tPA.
19. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutische Zubereitung als Komponente B einen Plasminogenaktivator der Formel (II) umfaßt, worin L2 eine Aminosäuresequenz ist, die, wenn sie mit der N-terminalen Aminosäuregruppe von Y2 verbunden ist, eine Plasmin prozessierende Stelle erzeugt und eine Cys-Gruppe enthält.
20. Verfahren gemäß Anspruch 19 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung, worin L2 eine Aminosäuresequenz aus 11 bis 28 Aminosäuren ist.
21. Verfahren gemäß Anspruch 19 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung, worin die Cys-Gruppe 11 oder 12 Aminosäuren von der N-terminalen Aminosäuregruppe von Y2 entfernt ist.
22. Verfahren gemäß Anspruch 19 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung, worin L2 eine Aminosäuresequenz ist, ausgewählt aus der Gruppe der Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA, der Aminosäuren 147 bis 158 das menschlichen uPA und der Aminosäuren 144 bis 158 des menschlichen uPA.
23. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutische Zubereitung als Komponente B einen Plasminogenaktivator der Formel (II) umfaßt, worin Y2 der kjtalytische Bereich des menschlichen uPA ist, bestehend aus den Aminosäuren 159 bis 411 des menschlichen uPA oder einem Fragment davon, das die katalytische Aktivität sichert.
24. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutische Zubereitung als Komponente B einen Plasminogenaktivator der Formel (II) umfaßt, worin X2 eine direkte Bindung oder eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 49 und 176 bis 262 oder den Aminosäuren 1 bis3und 176 bis 262 des menschlichen tPA, worin L2 eine Aminosäuresequenz ist, ausgewählt aus der Gruppe der Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA, der Aminosäuren 147 bis 158 des menschlichen uPA und der Aminosäuren 144 bis 158 des menschlichen uPA, und worin Y2 der katalytische Bereich des menschlichen uPA ist, bestehend aus den Aminosäuren 159 bis 411 des menschlichen uPA.
25. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutische Zubereitung als Komponente B einen Plasminogenaktivator der Formel (II) umfaßt, worin X2 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 49 und 176 bis 262 des menschlichen tPA, worin L2 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA, und worin Y2 der katalytische Bereich des menschlichen uPA ist, bestehend aus den Aminosäuren 159 bis 411 des menschlichen uPA (FK2tuPA).
26. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutische Zubereitung als Komponente B einen Plasminogenaktivator der Formel (II) umfaßt, worin X2 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 3 und 176 bis 262 des menschlichen tPA, worin L? eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA, und worin Y2 der katalytische Bereich des menschlichen uPA ist, bestehend aus den Aminosäuren 159 bis 411 des menschlichen uPA (K2UjPA).
27. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutische Zubereitung als Komponente B scuPA umfaßt.
28. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutische Zubereitung als Komponente A einen Plasminogenaktivator der Formel (I) umfaßt, worin X1 eine direkte Bindung ist, worin L1 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA, und worin Y1 der katalytische Bereich des menschlichen tPA ist, bestehend aus den Aminosäuren 276 bis 527 des menschlichen tPA (B-Kette von tPA, erweitert), und als Komponente B scuPA oder einen Plasminogenaktivator der Formel (II), worin X2 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 49 und 176 bis 262 des menschlichen tPA, worin L2 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA und worin Y2 der katalytische Bereich des menschlichen uPA ist, bestehend aus den Aminosäuren 159 bis 411 des menschlichen UPA(FK2UjPA). Komponente B kann auch ein Plasminogenaxtivator der Formel (II) sein, worin X2 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 3 und 176 bis 262 des menschlichen tPA, worin L2 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus dei, Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA, und worin Y2 der katalytische Bereich des menschlichen uPA ist, bestehend aus den Aminosäuren 159 bis 411 des menschlichen uPA (K2tuPA).
29. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutische Zubereitung als Komponente A tPA umfaßt und als Komponente B einen Plasminogenaktivator der Formel (II), worin X2 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 49 und 176 bis 262 des menschlichen tPA, worin L2 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 263
bis 275 des menschlichen tPA, und worin Y2 dar katalytische Bereich des menschlichen uPA ist, bestehend aus den Aminosäuren 159 bis 411 des menschlichen uPA (FK2tuPA). Komponente B kann auch ein Plasminogenaktivator der Formel (II) sein, worin X2 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 3 und 176 bis 262 des menschlichen tPA, worin L2 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA, und worin Y2 der katalytische Bereich des menschlichen uPA ist, bestehend aus den Aminosäuren 159 bis 411 des menschlichen uPA (K2tuPA).
30. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutische Zubereitung als Komponente A einen Plasminogenaktivator der Formel (I) umfaßt, worin X1 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 44 des menschlichen uPA, die in Reihe mit den Aminosäuren 176 bis 262 des menschlichen tPA verbunden sind, worin L1 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA, und worin Yi der katalytische Bereich des menschlichen tPA ist, bestehend aus den Aminosäuren 276 bis 527 des menschlichen tPA (uK2tPA), und als Komponente B scuPA oder einen Plasminogenaktivator der Formel (II), worin X2 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 49 und 176 bis 262 des menschlichen tPA, worin L2 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 263 bis 2"1^ des menschlichen tPA, und worin Y2 der katalytische Berrich des menschlichen uPA ist, bestehend aus den Aminosäuren 159 bis 411 des menschlichen uPA (FK2tuPA). Komponente B kann auch ein Plasminogenaktivator der Formel (II) sein, worin X2 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 3 und 176 bis 262 des menschlichen tPA, worin L2 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA, und worin Y2 der katalytische Bereich des menschlichen uPA ist, bestehend aus den Aminosäuren 159 bis 411 des menschlichen uPA (K2UiPA).
31. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutische Zubereitung als Komponente A einen Plasminogenaktivator der Formel (I) umfaßt, worin X1 eine direkte Bindung ist, worin L1 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 12 der freien, voll aktiven sauren Phosphatase (PH05), die in Reihe mit den Aminosäuren 256 bis 275 des menschlichen tPA verbunden sind, und worin Y1 der katalytische Bereich des menschlichen tPA ist, bestehend aus den Aminosäuren 276 bis 527 des menschlichen tPA (B-Kette von tPA, fusioniert), und als Komponente B scuPA oder einen Plasminogenaktivator der Formel (II), worin X2 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 49 und 176 bis 262 des menschlichen tPA, worin L2 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA, und worin Y2 der katalytische Bereich des menschlichen uPA ist, bestehend aus den Aminosäuren 159 bis 411 des menschlichen uPA (FK2UiPA). Komponente B kann auch ein Plasminogenaktivator der Formel (II) sein, worin X2 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 3 und 176 bis 262 des menschlichen tPA, worin L2 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA, und worin Y2 der katalytische Bereich des menschlichen uPA ist, bestehend aus den Aminosäuren 159 bis 411 des menschlichen uPA (K2tuPA).
32. Verfahren gemäß Anspruch 1 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewichtsverhältnis von Komponente A zu Komponente B zwischen 1:1 und 1:20 liegt.
33. Verfahren gemäß Anspruch 1 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewichtsverhältnis von Komponente A zu Komponente B zwischen 1:2 und 1:10 liegt.
34. Pharmazeutische Kombinationszubereitung, umfassend als Komponente A einen Plasminogenaktivator, der die B-Kette des tPA umfaßt und als Komponente B einen Einzelkettenplasminogenaktivator, der die B-Kette des uPA umfaßt, worin Komponente A nicht tPA sein kann, wenn Komponente B scuPA ist.
35. Pharmazeutische Kombinationszubereitung nach Anspruch 34, die als Komponente A einen Plasminogenaktivator der Formel
NH2-X1-L1-Y1-COOH (I)
umfaßt, in der
X1 eine direkte Bindung oder eine Aminosäuresequenz ist, die alle oder diskrete Bereiche der Α-Kette des menschlichen tPA und/oder alle oder diskrete Bereiche des menschlichen uPA umfaßt, in der
L1 eine dirkete Bindung oder eine Aminosäuresequenz bedeutet, die X1 InItY1 verbindet, und in der Y1 der katalytische Bereich des menschlichen tPA ist, und die als Komponente B einen Einzelkettenplasminogenaktivator der Formel
NH2-X2-L2-Y2-COOH (III)
umfaßt, in der
X2 eine direkte Bindung oder eine Aminosäuresequenz ist, die alle oder diskrete A-Kettenbereiche des menschlichen tPA oder diskrete A-Ketten-Boreiche des menschlichen tPA und des menschlichen uPA oder alle oder diskrete A-Ketten-Bereiche des menschlichen uPA umfaßt, in der L2 eine direkte Bindung oder eine Aminosäuresequenz ist, die X2 mit Y2 verbindet und in der Y2 der katalytische Bereich des menschlichen uPA ist, zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, worin Komponente A nicht tPA sein kann, wenn die Komponente B scuPA ist.
36. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 35, die als Komponente A einen Plasminogenaktivator der Formel I, in der X1 eine Aminosäuresequenz ist, die essentiell aus diskreten A-Ketten-Bereichen des menschlichen tPA oder allen A-Ketten-Bereichen des menschlichen tPA und dem Kringel-Bereich des menschlichen uPA oder dem Finger-, dem Kringel-1-nd den Kringel-2-Bereichen des menschlichen tPA und dem Wachstumsfaktor- und/oder dem Kringel-Bereich des menschlichen uPA oder dem Kringel-2-Bereich des menschlichen tPA und dem Wachstumsfaktor und/oder dem Kringel-Bereich des menschlichen uPA besteht.
37. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 35, die als Komponente A einen Plasminogenaktivator der Formel I umfaßt, in der X1 eine Aminosäuresequenz ist, die essentiell aus allen oder diskreten A-Ketten-Bereichen des menschlichen tPA oder dem Kringel-2-Bereich des menschlichen tPA und dem Wachstumsfaktor-Bereich des menschlichen uPA bestoht.
38. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 35, die als Komponente A einen Plasminogenaktivator der Formel I umfaßt, in der X1 eine direkte Bindung oder eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 262 des menschlichen tPA oder den Aminosäuren 1 bis 44 des menschlichen uPA, die in Reihe mit den Aminosäuren 176 bis 262 des menschlichen tPA verbunden sind.
39. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 35, die als Komponente A einen Plasminogenaktivator der Formel I umfaßt, in der L1 eine Aminosäuresequenz bedeutet, die, wenn sie mit der N-terminalen Aminosäuregruppe von Y1 verbunden ist, eine Plasmin-Prozessing-Stelle erzeugt und die mindestens eine Cys-Gruppe enthält.
40. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 39, in der L1 eine Aminosäuresequenz, bestehend aus 11 bis 40 Aminosäuren, bedeutet.
41. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 39, in der die Cys-Gruppe 11 oder 12 Aminosäuren von der N-terminalen Aminosäuregruppe von Y1 entfernt ist.
42. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 39, in der L1 eine Aminosäuresequenz bedeutet, ausgewählt aus der Gruppe der Aminosäuren 263 bis I j des menschlichen tPA, der Aminosäuren 147 bis 158 des menschlichen uPA und der Aminosäuren 1 bis 12 der reifen sauren Phosphatase (PH05), die in Reihe mit den Aminosäuren 256 bis 275 des menschlichen tPA verbunden sind.
43. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 35, die als Komponente A einen Plasminogenaktivator der Formel I umfaßt, in der Y1 der katalytische Bereich des menschlichen tPA ist, bestehend aus den Aminosäuren 276 bis 527 des menschlichen tPA oder eines Fragments davon mit der katalytischen Aktivität.
44. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 35, die als Komponente A einen Plasminogenaktivator der Formel I umfaßt, in der X1 eine direkte Bindung oder eine Aminosäuresequenz ist, ausgewählt aus der Gruppe der Aminosäuren 1 bis 262 des menschlichen tPA und der Aminosäuren 1 bis 44 des menschlichen uPA, die in Reihe mit den Aminosäuren 176 bis 262 des menschlichen tPA verbunden sind, in der L1 eine Aminosäuresequenz bedeutet, bestehend aus den Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA oder der Aminosäuren 1 bis 12 der reifen sauren Phosphatase (PH05), die in Reihe mit den Aminosäuren 256 bis 275 des menschlichen tPA verbunden ist und in der Y1 der katalytische Bereich des menschlichen tPA ist, bestehend aus den Aminosäuren 276 bis 527 des menschlichen tPA.
45. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 35, die als Komponente A einen Ptasminogenaktivator der Formel I umfaßt, in der Χι eine direkte Bindung ist, L1 eine Aminosäuresequenz bedeutet, bestehend aus den Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA und in der Y1 der katalytische Bereich des menschlichen tPA ist, bestehend aus den Aminosäuren 276 bis 527 des menschlichen tPA (tPA-B-Kette, erweitert).
46. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 35, die als Komponente A tPA umfaßt.
47. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 35, die als Komponente A einen Plasminogenaktivator der Formel I umfaßt, in der X1 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 44 des menschlichen uPA, die in Reihe mit den Aminosäuren 176 bis 262 des menschlichen tPA verbunden sind, in der L1 eine Aminosäuresequenz bedeutet, bestehend aus den Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA, und in der Y1 der katalytische Bereich des menschlichen tPA, bestehend aus den Aminosäuren 276 bis 527 des menschlichen tPA (uK2tPA), ist.
48. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 35, die als Komponente A einen Plasminogenaktivator der Formel I umfaßt, in der X1 eine direkte Bindung ist, L1 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 12 der reifen sauren Phosphatase (PH05) die in Reihe mit den Aminosäuren 256 bis 275 des menschlichen tPA verbunden sind, und in der Y1 der katalytische Bereich des menschlichen tPA ist, bestehend aus den Aminosäuren 276 bis 527 der menschlichen tPA (tPA-B-Kette, fusioniert).
49. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 35, die als Komponente B einen Plasminogenaktivator der Formel Il umfaßt, in d6r X2 eine Aminosäuresequenz ist, die essentiell aus dem Finger- und/oder dem Kringel-2-Bereich des menschlichen tPA oder dem Finger-, dem Wachstumsfaktor- und dem Kringel-2-Bereich des menschlichen tPAoder dem Wachstumsfaktor-, dem Kringel-1- und dem Kringel-2-Bereich des menschlichen tPA oder dem Wachstumsfaktor- und/oder dem Kringel-Bereich des menschlichen uPA und dem Kringel-2-Bereich des menschlichen tPA besteht.
50. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 35, die als Komponente B einen PlaSi."iinogenaktivator der Formel Il umfaßt, in der X2 eine Aminosäuresequenz ist, die essentiell aus dem Finger- und dem Kringel-2-Bereich des menschlichen tPA oder dem Kringel-2-Bereich des menschlichen tPA besteht.
51. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 35, die als Komponente B einen Plasminogenaktivator der Formel Il umfaßt, in der X2 eine direkte Bindung oder eine Aminosäuresequenz ist, die aus Aminosäuren 1 bis 49 und 176 bis 262 oder Aminosäuren 1 bis 3 und 176 bis 262 des menschlichen tPA besteht.
52. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 35, die als Komponente B einen Plasminogenaktivator der Formel Il umfaßt, in der L2 eine Aminosäuresequenz bedeutet, die, wenn sie mit der N-terminal Aminosäuregruppe von Y2 verbunden ist, eine Plasmin-Prozessing-Stelle erzeugt und die eine Cys-Gruppe enthält.
53. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 52, in der L2 eine Aminosäuresequenz, bestehend aus 11 bis 28 Aminosäuren, bedeutet.
54. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 52, in der die Cys-Gruppe 11 oder 12 Aminosäuren von der N-terminalen Aminosäuregruppe von Y2 entfernt ist.
55. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 52, in der L2 eine Aminosäuresequenz bedeutet, die aus der Gruppe bestehend au > Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA, Aminosäuren 147 bis 158 des menschlichen uPA und Aminosäuren 144 bis 158 des menschlichen uPA ausgewählt wird.
56. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 35, die als Komponente B einen Plasminogenaktivator der Formel Il umfaßt, in der Y2 der katalytische Bereich des menschlichen uPA ist, bestehend aus den Aminosäuren 159 bis 411 des menschlichen uPA oder einem Fragnent davon mit der kataiytischen Aktivität.
57. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 35, die als Komponente B einen Plasminogenaktivator der Formel Il umfaßt, in der X2 eine direkte Bindung oder eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 49 und 176 bis 262 oder Aminosäuren 1 bis 3 und 176 bis 262 des menschlichen tPA, in der L2 eine Aminosäuresequenz bedeutet, die aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA, den Aminosäuren I47 bis 158 des menschlichen uPA und den Aminosäuren 144 bis 158 des
menschlichen uPA ausgewählt wird, und in der Y2 der katalytische Bereich des menschlichen uPA ist, bestehend aus den Aminosäuren 159 bis 411 des menschlichen uPA.
58. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 35, die als Komponente B einen Plasminogenaktivator der Formel Il umfaßt, in der X2 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 49 und 176 bis 262 des menschlichen tPA, in der L2 eine Aminosäuresequenz, bestehend aus den Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA, bedeutet und in der Y2 der katalytische Bereich des menschlichen uPA bestehend aus den Aminosäuren 159 bis 411 des menschlichen uPA (FK2tuPA) ist.
59. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 35, die als Komponente B einen Plasminogenaktivatorder Formel Il umfaßt, in der X2 eine Aminosäuresequenz, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 3 und 176 bis 262 des menschlichen tPA ist, in der L2 eine Aminosäuresequenz, bestehend aus den Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA ist und in der Y2 der katalytische Bereich des menschlichen uPA, bestehend aus den Aminosäuren 159 bis 411 des menschlichen UPA(K2TuPA) ist.
60. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 35, die als Komponente B scuPA umfaßt.
61. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 35, die als Komponente A einen Plasminogenjktivatorder Formel I1 in derXi eine direkte Bindung ist, L1 eine Aminosäuresequenz, bestehend aus den Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA bedeutet und in der Y1 der katalytische Bereich des menschlichen tPA, bestehend aus den Aminosäuren 276 bis 527 des menschlichen tPA (tPA-B-Kette, erweitert) ist und die als Komponente B scuPA oder einen Plasminogenaktivatorder Formel Il umfaßt, in derX2 eine Aminosäuresequenz, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis49und 176 bis 262 des menschlichen tPAist, in derL2eine Aminosäuresequenz bestehend aus den Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA iot und in der Y2 der katalytische Bereich des menschlichen uPA bestehend aus den Aminosäuren 159 bis 411 des menschlichen uPA (FK2tuPA) ist oder die als Komponente B einen Plasminogenaktivator der Formel Il umfaßt, in der X2 eine Aminosäuresequenz, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 3 und 176 bis 262 des menschlichen tPA ist, in der L2 eine Aminosäuresequenz bestehend aus den Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA bedeutot und in der Y2 der katalytische Bereich des menschlichen uPA bestehend aus den Aminosäuren 159 bis 411 des menschlichen uPA (K2tuPA) ist.
62. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 35, die als Komponente A tPA und als Komponente B einen Plasminogenaktivatorder Formel Il umfaßt, in der X2 eine Aminosäuresequenz, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 49 und 176 bis 262 des menschlichen tPA ist, in der L2 eine Aminosäuresequenz, bestehend aus den Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA ist und in der Y2 der katalytische Bereich des menschlichen uPA, bestehend aus den Aminosäuren 159 bis 411 des menschlichen uPA (FK2tuPA) ist oder als Komponente B einen Plasminogenaktivator der Formel Il umfaßt, in der X2 eine Aminosäuresequenz, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 3 und 176 bis 262 des menschlichen tPA ist, in der L2 eine Aminosäuresequenz, bestehend aus den Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA bedeutet und in der Y2 der katalytische Bereich des menschlichen uPA bestehend aus den Aminosäuren 159 bis 411 des menschlichen uPA (K2tuPA) ist.
63. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 35, die als Komponente A einen Plasminogenaktivator der Formel I, in der Χι eine Aminosäuresequenz, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 44 des menschlichen uPA ist, die in Reihe mit den Aminosäuren 176 bis 262 des menschlichen 'PA verbunden sind, in der Li eine Aminosäuresequenz, bestehend aus den Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA bedeutet und in der Yi der katalytische Bereich des menschlichen tPA, bestehend aus den Aminosäuren 276 bis 527 des menschlichen tPA (uK2tPA) ist und als Komponente B scuPA oder einen Plasminogenaktivator der Formel Il umfaßt, in der X2 eine Aminosäuresequenz, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 49 und 176 bis 262 des menschlichen tPA ist, in der L2 eine Aminosäuresequenz, bestehend aus den Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA bedeutet und in der Y2 der katalytische Bereich des menschlichen uPA, bestehend aus den Aminosäuren 159 bis 411 des menschlichen uPA (FK2tuPA) ist oder als Komponente B einen Plasminogenaktivator der Formel Il umfaßt, in der X2 eine Aminosäuresequenz, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 3 und 176 bis 262 des menschlichen tPA ist, in der L2 eine Aminosäuresequenz, bestehend aus den Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA bedeutet und in der Y2 der katalytische Bereich des menschlichen uPA, bestehend aus den Aminosäuren 159 bis 411 des menschlichen uPA (K2tuPA) ist.
64. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 35, die als Komponente A einen Plasminogenaktivator der Formel I, in der X1 eine direkte Bindung ist, L1 eine Aminosäuresequenz ist, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 12 der reifen, sauren Phosphatase (PH05), die in Reihe mit den Aminosäuren 256 bis 275 des menschlichen tPA verbunden ist, und in der Y1 der katalytische Bereich des menschlichen tPA, bestehend aus den Aminosäuren 276 bis 527 des menschlichen tPA (tPA-B-Kette, fusioniert) ist und die als Komponente B scuPA oder einen Plasminogenaktivatorder Formel Il umfaßt, in der X2 eine Aminosäuresequenz, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 49 und 176 bis 262 des menschlichen tPA ist, in der L2 eine Aminosäuresequenz bestehend aus den Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA und in der Y2 der katalytische Bereich des menschlichen uPA, bestehend aus den Aminosäuren 159 bis 411 des menschlichen uPA (FK2tuPA) oder die als Komponente B einen Plasminogenaktivator der Formel Il umfaßt, in der X; eine Aminosäuresequenz, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 3 und 176 bis 262 des menschlichen tPA ist, in der L2 eine Aminosäuresequenz, bestehend aus den Aminosäuren 263 bis 275 des menschlichen tPA bedeutet und in der Y2 der katalytische Bereich des menschlichen uPA, bestehend aus den Aminosäuren 159 bis 411 des menschlichen uPA (K2tuPA) ist.
65. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 34, worin das Masseverhältnis von Komponente A zu Komponente B zwischen 1:1 und 1:20 beträgt.
66. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 34, worin das Masseverhältnis von Komponente A zu Komponente B zwischen 1:2 und 1:10 beträgt.
67. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 34 für die Verwendung in der Prophylaxe oder Behandlung von Thrombose oder Krankheiten, die durch Thrombose, Arteriosklerose, myokardiale und zerebrale Infarkte, venöse Thrombose, Thromboembolie, Thrombose nach chirurgischen Eingriffen oder Thrombophlebitis verursacht werden.
68. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 34 für die Verwendung in der Prophylaxe oder Behandlung von myocardialem Infarkt.
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