DD290137A5 - Verfahren zur herstellung von pharmazeutischen zubereitungen auf liposomenbasis mit antitumor-anthracendionen als wirkkomponente - Google Patents

Abstract

Es wird eine Methode zur liposomalen Verkapselung von Antitumor-Anthracendionen angegeben. Die erfindungsgemaesz hergestellten Liposomen haben eine hohe Beladungsdichte, eine hohe Stabilitaet hinsichtlich des Austritts eingeschlossenen Anthracendions und eine im Vergleich zum freien Pharmakon verbesserte therapeutische Wirksamkeit. Hohe Beladungsdichte und hohe Stabilitaet werden erreicht durch Bindung des Anthracendions an die zur Liposomenherstellung verwendeten Lipide, vorzugsweise durch Wechselwirkung des geladenen Anthracendions mit gegenteilig geladenen Lipidbestandteilen. Dadurch sind nach der Liposomenherstellung keine Trennoperationen erforderlich und die Gesamtmenge des eingesetzten Antitumor-Anthracendion kommt zur therapeutischen Anwendung.

Description

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Anwendungsgebiet der Erfindung

Dio Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen enthaltend ein zur Vesikelbildung befähigtes Amphiphil, ein Steroid, eine geladene Lipidkomponente, ein Antitumor-Anthracondion und ggf. einen Koronarvasodilator. Liposomendispersionen aus diesen Komponenten zeigen einen verstärkten Antitumoreffekt im Vergleich zum freien Anthracendion. Anwendungsgebiet ist die Medizin bzw. die pharmazeutische Industrie.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Liposomen sind geschlossene, kugelförmige Strukturen aus Amphiphilen, die wäßrige Kompartimente einschließen. Wegen ihrer Ähnlichkeit mit Zelloberflächen dienen sie einmal als Membranmodelle, wogen ihrer Fähigkeit Pharmaka. Diagnostika einzuschließen, haben sie als Carrier Bedeutung. Nahezu alle Klassen pharmakologisch aktiver Substanzen wurden in Liposomen verkapselt. Als Ergebnis der vesikulären Vorkapselung werden in der Literatur (Knight, CG., Herausgeber, Liposomes: From physical structure to therapeutic applications, Elsevier 1981, Seite 1166) u. a. folgende Vorteile herausgestellt:

1. Liposomen können so hergestellt werden, daß sie von spezifischen Gewobon aufgenommen werden.

2. Die Pharmakokinetik von Arzneimitteln kann durch liposomalen Einschluß In günstiger Weise verändert werden.

3. Chemisch und metabolisch labile Pharmaka können durch vesikuläre Verkapselung und Reaktivierung geschützt werden.

4. Liposomen geeigneter Lipidzusammensetzung wirken als immunologische Adjuvanzien und verstärken dio immunantwort gegen ein verkapseltes Antigen.

Aufgrund dieser Vorteile wurden eine große Zahl biologisch aktiver Verbindungen in Liposomen eingeschlossen. Zu Übersichten vergleiche Gregoriadis, G. (Herausgeber) Liposome Technology, Uli, CRC Press 1984; Arndt, D., Fichtner, I.: Liposomen, Darstellung, Eigenschaften, Anwendung, Akademie Verlag 1986, Gregoriadis, G. (Herausgeber) Liposomes as drug carriersrecent trends and progress, John Wilcey & Sons 1988. Bei dar Anwendung liposomal verkapselte Antineoplastika beobachtet man häufig eine Verminderung der Toxizität bei etwa gleicher therapeutischer Wirksamkeit von liposomaler und freier Form des Antineoplastikums.

Besonders umfanoreiches Materlol existiert zur liposomalen Verkapselung von Antitumor-Antracyclinglycosiden vom Typ des üoxorubicins, bzw. Daunorubicins. May hew et al., Cancer Drug Delivery 1 (1983) 43-58, sowie Fichtner et al., Oncology 41 (1984) 363-369 beobachten eine geringere Toxizitat des liposomalen Antracyclinglycosids im Vergleich zum freien Wirkstoff. Ähnliche Ergebnisse publizierte Rahman et al., Cancer Res. 45 (1985) 796-803. Für Doxorubicln ergibt sich durch Liposomonoinschluß eine verminderte Herzkonzentration und -toxizitat sowie eine geringoro Leukoponio. In verschiedenen Patenten ist die liposomale Verkapselung von Doxorubioin beschrieben, z.B. WO 82/03769, US 4460577, DE 2842608, WO 88/06442. Ähnlichkelten hinsichtlich chemischer Struktur und biologischer Wirkungsweise bestehen zwischen Anthracyclinglykosiden und Antitumor-Anthracendionen.

Unter den Anthracendionen hat insbesondere Mitoxantron erhebliche klinische Bedeutung, in erster Linie bei der Chemothorapio des metastasierenden Mamma-Ca. Die liposomale Verkapselung von Mitoxantron ist bisher noch nicht boschrieben.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von Antitumor-Anthracendion-haltiger üposomen hoher Beladungsdichte, hoher Stabilität und Ιτ> Vergleich zum freien Pharmakon verbesserter therapeutischer Wirksamkeit.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, pharmazeutische Zubereitungen auf Liposomenbasis mit Antitumor· Anthracendionen als Wirkkomponente herzustellen, die einen hohen Anteil des eingesetzten Wirkstoffs gebunden enthalten und eine besonders gute therapeutische Wirksamkeit bei verschiedenen Tumoren ergeben. Erfindungsgemäß werden pharmazeutische Zubereitungen hergestellt enthaltend a) ein natürliches, halbsynthetisches oder vollsynthetisches Phospholipid der Formel I

CH₂ - 0 - R₁

R₂-O-CH ο _p /Η,

CHo-P- CH₉ - CH₂ - N _rCH₃

CH₃

io

worin R₍ und R₂ C,o-C₂₀-Alkanoyl, -Alkenoyl, -Alkyl, Alkenyl darstellen, b) ein Steroid der Formel Il

CH,

RO

R-H Cholesterol Fl = CH₂-CH₇-O-CHi-CH₂-OH Diethoxycholesterol

c) eine geladene Lipidkomponente.

Eine geladene Lipidkomponente ist verzugsweise das Anion des Dicotylphosphats, der Palmitinsäure, der Stearinsäure, sowie das Anion eines Phospholipids, z. B. Phosphatidylserin oder Phosphatidsäure, bzw. das Anion eines Sphingolipids, z. B. Sulfatid.

d) eine Antitumor-Anthracendion.

Eine Antitumor-Anthracendion ist vorzugsweise Mitoxantron oder Ametantron.

e) ggf. einen Koronarvasodilator,z.B.VerapamiloderNifedipin.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß zwischen basischen Substituenten der Antitumor· Anthracendionen und sauren Gruppen in den zur Vesikelbildung verwendeten Amphiphilen Wechselwirkungen bestehen. Dadurch wird eine woitgehende Bindung des Wirkstoffs an die Liposomen erreicht. Zusatzmcßnahmen zur Abtrennung des nicht vesikulär verkapselten Antitumor-Anthracendions (Dialyse, Gelchromatographie, Zentrifugation) sind daher in den meisten Fällen nicht erforderlich.

Die erfindungsgomäßen pharmazeutischen Zubereitungen zeichnen sich durch relativ einheitliche Größe (50-200 nm) und hohe Lagerstabilität aus. Die Lagerung kann dabei sowohl in flüssiger Form bei Temperaturen von +4 bis +8⁰C als auch in

lyophilisierter Form nach Zuatz von Kryoprotektoren wie Trehalose oder Saccharose erfolgen. Die Resuspendierung des

Lyophilisats durch Zugabe von destilliertem, sterilem pyrogenfrelem Wasser und einfaches Schütteln liefert ohne weitere Trennoperationen Liposomen-Wirkstoff-Komplexe, die in ihrer therapeutischen Wirksamkeit frisch hergestellten Liposomen

entsprechen.

Das zur Herstellung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen angewandte Gemisch der Phospolipide der Formel I, Steroide der Formel Il und der geladenen Llpidkomponenten steht im Molverhältnis von 1.0,3:0,1 bis 1:1:0,5. Dabei

werden die Mengen von geladener Lipidkomponente und Antitumor-Anthracendion so gewählt, daß ein Molverhältnis von 2:1 bis 10:1 besteht.

Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen liegen in steriler, wäßriger Dispersion der Liposomen in

phosphatgepufferter, isotonischer Kochsalzlösung vor, ggf. enthält die Dispersion Zusätze, die die Erhaltung der

Liposomenstruktur bei der Lyophllisierung gewährleisten, insbesondere Trehalose oder Saccharose. Die nachfolgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung ohne sie zu beschränken. Temperaturangaben erfolgen in Graden

Celsius.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1 Eine Mischung aus 1250 mg Eiphosphatidylcholin (Herstellung entsprechend Singleton et al,, J. Am. Oil Chemist's Soc. 42 (1965]

53-56). 625mo Cholesterol (entspr. AB DDR, DAB7, USPXVIII), 130mg Dicetylphosphat (Dihexadecylhydrogenphosphat), reinst, (Serva) und 50mg Mltoxantron wird in 58ml steriler, Calcium-freier, Phosphat-gepufferter (pH 7,2-7,4) Kochsalzlösung (Dulbecco) dispergiert.

Die entstandene Dispersion multischichtiger Liposomen wird bei 0-5⁰C in einem Gofäß intermittierend (gleiche Puls- und Pausenzeiten) bei 20KHz solange beschallt bis ein Trübungswert 0,1 erreicht ist. Nach 30minütigem Stehen wird bei 7°C und

10^sg eine Stunde zentrifugiert. Der Überstand wird vom Pellet abdekantiert und durch Sterilfiltration (Membranfilter 0,8; 0,45 und 0,2 pm) keimfrei gemacht. Die erhaltene Liposomendispersion ist bei 4°C lagerfähig und eignet sich zur parenteralen (i.v.)

Apllikation. Beispiel 2

Eine Mischung aus 1000 mg hydriertem Eiphosphatidylcholin (Herstellung entsprechend Nuhn et al., Pharmazie 40 [1985] 705-709), 500mg Cholesterol und 280mg Dicetylphosphat (Dihexadecylhydrogenphosphat) wird in 10 ml Cyclohexan gelöst und der nach Gefriertrocknung erhaltene Rückstand bei 50°C mit nlner Lösung von 40mg Mitoxantron in 47 ml steriler, Calcium-freier, Phosphat-gepufferter (pH 7,2-7,4) Kochsalzlösung versetzt und die Liposomendispersion bei 50-55°C nacheinander durch Filtermembranen 2,0; 1,o; 0,8; 0,4 und 0,2 μ extrudiert. Die erhaltene Liposomendispersion ist bei 4°C lagerfähig und eignet sich zu parenteralon (i.v.) Applikation.

Beispiel 3 Eine Mischung aus 250mg Diethoxycholesterol (Formel II) und 78mg Dicethylphosphat, reinst (Serva) in 15ml Cyclohexan wird

in einer Gefriertrocknungsanlage zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wird in einer Lösung von 17 mg Mitoxantron in 20ml steriler, Calcium-freier, Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei 40-50°C dispergiert.

Die entstandene Dispersion multischichtiger Liposomen wird bei 40-50°C in einem Gefäß intermittierend (gleiche Puls- und Pausenzei'en) bei 20KHz solange beschallt bis ein Trübungswert <0,1 erreicht ist. Durch Sterilfiltration (Membranfilter 0,8; 0,45

und 0,2 μητι) wird anschließend keimfrei gemacht. Die Trennung eines Aliquots an Sephadex G-50 zeigt, daß alles Mitoxantron liposomal gebunden ist. Die erhaltene Liposomendispersion ist bei 4°C lagerfähig und eignet sich zu parenteralen Applikation.

Beispiel 4

Eine Mischung aus 1000mg hydriertem Eiphosphatidylcholin (Herstellung entsprechend Nuhn et al., Pharmazie40 (1985) 705-709), 500mg Cholesterol und 210mg Dicetylphosphat (Dihexydecylhydrogenphosphat), reinst (Serva), 38mg Mitoxantron wird in 47 ml steriler, Calcium-freier, Phosphat-gepufferter (pH 7,2-7,4), Saccharosehaitiger (338mmol/l) Kochsalzlösung dispergiert und in gleicher Weise weiterbehandelt wie in Beispiel 2 beschrieben. Die Liposomendispersion wird in einer Trocknungsanlage bei 40-50⁰C unter sterilen Bedingungen 47 ml destilliertes Wasser (steril, pyrogenfrei) gegeben und das Gefäß auf einem Vortex-Mischer zehn Minuten lang geschüttelt. Die resultierende Liposomendispersion eignet sich zur parenteralen (i.v.) Applikation.

Beispiel 5 Eine Mischung aus 1000mg hydriertem Eiposphatidylcholin (Herstellung entsprechend Nuhn et al., Pharmazie 40 (1985]/05-709),

500 mg Cholesterol und 280mg Dicetylphosphat (Dihexadecylhydrogenphosphat) wird in 10ml Cyclohexan gelöst und der nach

Gefriertrocknung erhaltene Rückstand bei EO⁰C mit einer Lösung von 40mg Mitoxantron und 10mg Verapamil in 47 ml steriler, Calcium-freier, Phosphat-gepufferter (pH 7,2-7,4) Kochsalzlösung versetzt und die Liposomendispersion bei 50-55⁰C

nacheinander durch Filtermembran^n 2,0; 1,0; 0,8; 0,4 und 0,2 pm extrudiert. Die erhaltene Liposomendispersion ist bei 4⁰C lagerfähig und eignet sich zur parenteralen (i.v.) Applikation.

Die nach den Beispielen 1-5 hergestellten Liposomendispersionen ergeben im Tierversuch an tumortragenden Mäusen (P388, L1210, Lewis Lung, B16 Melanom) eine größere Lebenszeitverlängerung als das freie Anthracendion.

4- 29(M 37

CHo-O-

Ro-O-

CH

CH₀-P- CH₉ - CHp - N -CH₃

Il

CH

N-CH

R₂ C_1Q-C₂₀-Alkanoyl, -Alkenoyl,

-Alkyl, -Alkenyl

RO

CH-*

II

R=H Cholesterol

R = CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-OH Diethoxyoholeaterol

Claims (5)

1. Verfahren zur Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen enthaltend

a) ein natürliches, halbsynthetisches oder vollsynthetisches Phoopholipid der Formel I

b) eine Steroid der Formel Il

c) eine geladene Lipidkomponente.

Eine geladene Lipidkomponente ist vorzugsweise das Anion des Dicetylphosphats, der Palmitinsäure, der Stearinsäure, sowie das Anion eines Phospholipids, z. b. Phosphatidylserin oder Phosphatidsäure, bzw. das Anion eines Sphingolipids, z. b. Sulfatid.

d) ein Antitumor-Anthracendion.

e) ggf. einen Koronarvasodilator

f) eine Trägerflüssigkeit und zusätzliche Hilfsstoffe

und dadurch gekennzeichnet, daß man zwischen Wirkstoff und Phospholipic* system Affinitätserhöhung induziert und daß man in an sich bekannter Weise aus den unter a-e genannten Komponenten Liposomendispersionen herstellt und nach der Liposomenherstellung bzw. der Resuspendierung lyophilisierter Präparate keine Trennoperationen durchführt und die Gesamtmenge des Eingesetzten Antitumor-Anthracendions zur therapeutischen Anwendung kommt.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1 zur Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen enthaltend Phospholipide der Formel I, Steroide der Formel Il und eine geladene Lipidkomponente, dadurch gekennzeichnet, daß das Molverhältnis der Einzelkomponenten im Bereich von 1:0,3:0,1 bis 1:1:0,5 liegt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 und 2 zur Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen, dadurch gekennzeichnet, daß das Molverhältnis von geladener Lipidkomponente und Antitumor-Anthracendion zwischen 2:1 und 10:1 liegt.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1-3 zur Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen, dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise den Prozeß zur Herstellung der Liposomendispersionon so gestaltet, daß der Versikeldurchmesser zwischen 30-250 nm, vorzugsweise 80-130nm liegt.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1-4 zur Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen, dadurch gekennzeichnet, daß die Liposomen neben dem Antitumor-Anthracendion ggf. noch einen Koronarvasodilator, vorzugsweise Verapamil oder Nifedipin enthalten.