DD283648A5 - Verfahren zur herstellung von macrolidderivaten - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Makrolid-Derivaten. Erfindungsgemaesz werden Derivate von S541 (LL-F28249) der Formel (I) hergestellt, worin R1, R2 R3 und R4 die in der Beschreibung und in den Anspruechen angegebene Bedeutung aufweisen. Erfindungsgemaesz werden sie hergestellt durch Inkubieren einer entsprechenden 5-Ketoverbindung in einem geeigneten Medium in Gegenwart eines Mikroorganismus oder eines davon abgeleiteten Enzyms oder einer Praeparation, die von einem Mikroorganismus hergestellt wurde und das interessierende Enzym enthaelt, das in der Lage ist, die Umsetzung zu bewirken, hergestellt. Formel (I){neues Herstellungsverfahren; Antibiotika S541;, Wirkung gegen Endoparasiten; Ectoparasiten; Fungi; Insekten; Nematoden; Acariden}

Description

AP С 07 D/326 548-3 (72 026/11/37)

Verfahren zur Herstellung von Makrolid-Derivaten

Anwendungsgebiet der Erfindung

Diese ürfind-_ig betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Maicrol id-Der ivat en.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

In der GB-Patentbeschreibung 2,166,436 und in der Europäischen Patentanmeldung 170.006 wird eine Klasse von Stoffen beschrieben, die von uns als Antibiotika S541 bezeichnet wurden und die durch Fermentation von die Antibiotika S541 produzierenden Stämmen, die zu den Arten Streptomyces thermoarchaensia und Streptomyces cyaneogriseus noncyanogenus gehören, hergestellt werden können. Die Antibiotika S541 weisen eine Wirksamkeit als Antibiotika auf und haben insbesondere gegen Endoparasiten, Ectoparasiten, Fungi, Insekten, Mematoden und Acariden gerichtete Aktivitäten und sind daher von besonderem Interesse zur Anwendung in der Landwirtschaft, im Gartenbau, im Veterinärwesen und im Gesundheitswesen,

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen Verfahrens zur Herstellung von Makrolid-Derivaten, insbesondere von Derivaten der Antibiotika 3541.

Darlegung des Ѵ/еэепз der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Derivate von Antibiotika S541 durch Inkubieren einer entsprechenden iietoverbinduag mit einem liiicroorganisrnus herzustellen,

Erfindungsgemäß wird ein neues Verfahren zur Herstellung von Derivaten der Antibiotika S541 sowie chemischen Derivaten davon zur Verfügung gestellt.

So wird in einer Ausflihrungsform des erfindungsgeinäßen Verfahrens ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der

(D

1 2

worin R eine Kethyl-, Ethyl- oder Isopropylgruppe, R Wasserstoff oder eine OR -Gruppierung, in der OR·⁵ eine Hydroxylgruppe oder eine substituierte Hydroxylgruppe mit bis zu 25 Kohlen-

-5 * 2 3

stoffatoaen ist, und R ein Wasserstoff atom, oder R und R zusammen mit dem liohlenstoffatom, an das sie gebunden sind, eine > C=O-, > G=GH₂- oder > G=IIOR -Gruppierung (in der R ein kYasserstoffatom, eine C^g-Alkylgruppe oder eine C_3-8-Alkenylgruppe bedeutet und sich die Gruppe > C=IiOR in der S-Konfiguration befindet)

und R ein Wasseratoffatom oder eine biet Jay !gruppe bedeuten, zur Verfugung gestellt, das darin besteht eine Verbindung der Formel (II) _o ,

1*- T\J

IT E-

CH

(ID

12 3

worin R , R und R die Bedeutung aufv/eisen, wie sie oben definiert worden ist, in einem geeigneten Medium in Gegenwart eines Mikroorganismus oder eines Enzyms, das daraus gewonnen wurde, oder einer Präparation, die von einem Mikroorganismus gewonnen wurde und das interessierende Enzym enthält, das in der Lage ist, die Umsetzung zu bewirken, zu inkubieren«, Geeignete Mikroorganismen sowie Extrakte davon, die zur Anwendung im erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, können durch voraufgehende Experimente auf kleiner Basis identifiziert werden, die derart angelegt sind, die Fähigkeit eines Mikroorganismus oder eines Extraktes davon zu demonstrieren, Verbindungen der Formel (II) in Verbindungen der Formel (I) umzusetzen. Die Bildung von Verbindungen der Formel (I) kann durch geeignete chromatographische Analyse (z. B. Hochdruck-FlüsaigkeitsChromatographie) des Reaktionsgemisches bestätigt werden. Es wurde festgestellt, daß Mikroorganismen der Gattung Streptomyces sowie ExtraKte davon zur Anwendung im erfindungsgemäßen Verfahren besonders geeignet sind. Spezielle Mikroorganismen der Gattung otreptomyces, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind unter

anderem Stämme von Streptomyces thermoarchaenais, Streptomyces cyaneogriseua noncyanogenus, Streptomyces avermitiÜs und Streptomycea hygroscopicus, Unterart aurreolacrimosus. Besonders geeignete Beispiele geeigneter Stämme sind unter anderem Streptomyces thermoarchaensis ЖСІВ 12212 und 12213 (hinterlegt am 6_O März 1986 in der ständigen Kulturen-Sammlung der National Collections of Industrial and Marine Bacteria, Torry Research Station, Aberdeen, Großbritannien) sowie Mutanten dieser Stämme, Streptomyces avermitilia ATGG 31272 und 31780 und Streptomyces hygroscopicus, subsp. aureolacrimosus FERM P 1438.

Mutanten der oben genannten Stämme können spontan entstehen oder können nach einer Vielzahl von Methoden, einschließlich derer, die in der GB-PS 2,166.436 und in der EP-PS 170,006 beschrieben worden sind, hergestellt werden.

Geeignete Enzyme, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren angewendet werden können, können aus einer sehr großen Anzahl von Quellen erhalten werden. Die oben beschriebenen Mikroorganismen der Gattung Streptomyces stellen jedoch eine besonders geeignete Quelle von Enzymen dar, die in der Lage sind, Verbindungen der Formel (II) in Verbindungen der Formel (I) umzusetzen. Kach einer Ausführungsform dieser Erfindung kann die Umsetzung einer Verbindung der Formel (II) in das entsprechende 5-OR Derivat der Formel (I) durch Zugabe der Verbindung der Formel (II) in einem geeigneten Lösungsmittel zu einem Fermentationsmedium, das einen der vorher genannten Mikroorganismen enthält, in Gegenwart assimilierbarer Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und Mineralsalzen, ausgeführt werden»

Assimilierbare Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und Mineralsalzen können durch einfache oder komplexe Nährmedien zur Verfügung gestellt werden. Kohlenotoffquellen sind unter anderem Glucose, Maltose, Stärke, Glycerol, Меіаззе, Dextrin, Lactose, Saccharose, Fructose, Garbonsäuren, Aminosäuren, Glyceride, Alkohole, Alkane und Pflanzenöle» Diese Kohlenstoffquellen

werden im allgemeinen zwischen 0,5 und 10 Gew.-% des Fermentationsmediums ausmachen.

Stickstoff quellen sind unter anderem Sojabohnenmehl, Maiswaschlösungen, lösliche Destillationsrückstände, Hefeextrakte, Baumwollsamenmehl, Peptone, gemahlenes Nußmehl, Malzextrakt, Melasse, Kasein, Aminosäurengemische, Ammoniak (Gas oder Lösung), Ammoniumsalze oder Nitrate. Harnstoff und andere Amide können auch verwendet werden. Diese SticKstoffquellen werden im allgemeinen zwischen 0,1 und 10 Gew.-?o des Ferment at ionsmediums bilden. Die als Nährstoffe verwendeten Mineralsalze, die in das Kulturmedium eingearbeitet werden können, sind unter anderem die allgemein angewendeten Salze, die in der Lage sind, Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Eisen-, Magnesium-, Zink-, Nickel-, Kobalt-, Mangan-, Vanadium-, Chrom-, Kalzium-, Kupfer-, Molybdän-, Bor-, Phosphat-, Sulfat-, Chlorid- und Carbonationen zu liefern. Ein Antischaummittel kann ebenfalls anwesend sein, um ein übermäßiges Schäumen zu unterdrücken, und es kann in Intervallen zugegeben werden, wenn es benötigt wird.

Die Verbinduxigen der Formel (II) in einem Lösungsmittel, z. B. einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel (z. B. einem Alkohol wie Methanol oder Isopropanol, einem Diol wie Propan-1,2-diol oder Butan-1,3-diol, einem Keton wie Aceton, einem Hitril wie Acetonitril, einem 3ther wie Tetrahydrofuran oder Dioxan, einem substituierten Amid wie Dimethylformamid oder einem Dialkylsulfoxid wie Dimethylsulfoxid) können zu Beginn der Kultur, oder aber üblicher dann, wenn das Wachstum der Mikroorganismen begonnen hat, z. B. 2 bis 4 Tage nach dem Ansetzen der Kultur, zugegeben werden..

Die Kultivierung der Mikroorganismen wird im allgemeinen bei einer Temperatur zwischen 20 und 50 C, vorzugsweise zwischen 25 ⁰C und 40 ⁰G, durchgeführt und wird erwünschtenmaßen mit Belüftung und Bewegung stattfinden, z. B. durch ,Schütteln oder Rühren. Das Medium капп zu Beginn mit einer Kleinen Menge einer Suspension der Mikroorganismen in Sporenform inokuliert werden, jedoch капп, um eine Jachat umsverzögerung zu verseiden, ein

vegetatives Inoculum des Mikroorganismus dadurch hergestellt werden, daß eine kleine Llenge des /Culturtnediums mit der Sporenform des Mikroorganismus inocuüert wird und das so erhaltene vegetative Inoculum dann au dem Fermentationsmedium übertragen oder, in einer bevorzugteren Variante, in eine oder mehrere Saatstufen eingesetzt wird, in denen dann das weitere Wachstum stattfindet, bevor dieses dann in das Hauptfermentationsmedium eingesetzt wird. Die Fermentation wird im allgemeinen bei einem pH-Wert im Bereich von 5,5 bis 8,5 vorzugsweise 5,5 bis 7,5 durchgeführte Sobald die Verbindung der Formel (II) zu der iCultur zugegeben worden ist, wobei im allgemeinen eine leichte Durchmischung erfolgt, wird die Kultivierung auf eine solche Art fortgesetzt, daß das gewünschte Produkt akkumuliert wird· Die Anwesenheit des Produktes in der Fermentationsbrühe kann durch Untersuchung von Extrakten der Brühe durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie und UV-Spektroskopie bei 238 nm bestimmt werden,

Die/Das Produkt(e) können aus der Gesamtfermentationsbrühe durch übliche Verfahren der Isolation oder Abtrennung isoliert werden, wie sie in den GB-PS 2,166.436 und 2.176.182 beschrieben worden sind.

Entsprechend einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahren kann die Umsetzung einer Verbindung der Formel (II) in das entsprechende 5-OR -Derivat der Formel (I) dadurchausgeführt werden, daß eine Verbindung der Formel (II) in einem geeigneten Lösungsmittel (z. B. einem mit /fesser mischbaren organischen Lösungsmittel, wie es weiter oben definiert worden ist) mit einer Präparation eines erfindungsgemäßen Snsyms vereinigt und inkubiert wird, vorzugsweise in einer gepufferten Lösung, z. B. bei 0° bis 60 ⁰G, vorzugsweise bei 20 bis 40 ⁰G, z. B, bei ungefähr 28 ⁰G₀ Diese Umsetzung wird im allgemeinen bei einem pH-V/ert im Bereich von 3,5 bis 8,5 z. B. von 5,5 bis 7,5, durchgeführt werden, чеіш es gewünscht wird, kann diese umsetzung in Gegenwart еіпез Cofaktors wie HADH oder IiADPH durchgeführt werden. Sobald die Umsetzung abgeschlossen ist, d. h. wenn die Ver-

bindung der Formel (II) nicht melar zu der erfindungsgemäßen Verbindung umgesetzt wird (wie man durch Untersuchung von Extrakten des Reaictionsgemisches durch Hochdruck-FlüssigkeitaChromatographie und UV-Spektrosicopie bei 238 nm bestimmen kann), wird da3 Produkt durch übliche Verfahren der Isolation und Abtrennung gewonnen, wie es in den GB-PS 2.166.436 und 2.176.182 beschrieben worden ist.

Das Enzym, das in dem erfindungs^emäßen Verfahren angewendet werden kann, kann z. B. durch Kultivierung eines Mikroorganismus dargestellt werden, der das Enzym in einem Nährmedium produziert. Geeignete lYährmedien und Fermentationsbedingux-gen zur Herstellung des Enzyms sind unter anderem jene, die bereits vorher bei der Herstellung einer Verbindung der Formel (I) aus einer Verbindung der Formel (II) in Gegenwart eines Mikroorganismus beschrieben worden sind. Die Zeit, nach der die gewünschte enzymatische Aktivität ein Maximum erreicht, wird natürlich in Abhängigkeit von dem verwendeten Mikroorganismus unterschiedlich sein und folglich wird die optimale Kultivierungszeit erwünschtermaßen für jeden verwendeten Stamm einzeln bestimmt. Im Falle von Mikroorganismen, bei denen das Enzym extrazellulär ist, kann das flüssige Kulturmedium oder da3 Filtrat nach der Abtrennung der ganzen Zellen als Basis für das Enzym verwendet werden. Im Falle das Enzym an eine Zelle gebunden ist, kann es durch übliche Verfahren in Freiheit gesetzt werden, з. В. durch Beschallen, Vermählen mit Glaskugeln, Homogenisieren, Behandlung mit lysierenden Enzymen oder mit Detergentien, nachdem die Zellen in einem geeigneten Puffer suspendiert worden sind. Die so hergestellte Präparation kann entweder mit oder ohne Abtrennung der Zelltrümmer als Quelle für das Enzym verwendet werden. Es wird jedoch bevorzugt, das Enzym durch übliche Verfahren weiter zu reinigen, üblicherweise können dazu Chromatographie oder Säulenchromatographie mit Cellulosen mit Ionensustauschere-genschaften oder affinitätssorbentien oder andere Sorbentien, z. B, Hydroxy!apatit, am besten verwendet werden. Zusätzlich

dazu kann das Enzym aufkonzentriert oder weiter gereinigt werden durch Molekularsieb-Verfahren, z. B. Ultrafiltration oder Aussalzen. Es ist im allgemeinen wünschenswert, den pH-'.iert während der Reinigungsverfahren im Bereich zwischen 3 und Π zu halten,, Das Enzym kann in immobÜsierter Form verwendet werden, z, B₀ durch Unlöslichmachen oder "Einfangen" (entrapment) an oder in einer geeigneten Matrix. So kann ein Extrakt des Enzyms an ein ansonsten inertes anorganisches oder organisches Polymer gekoppelt oder gebunden werden, an oder in einer Paser eingeschlossen werden, oder an oder in einer Membran oder einem Polymer wie einem Polyacrylamidgel eingeschlossen werden, an einem Ionenaustauschharz adsorbiert werden, mit einem Reagens wie GIutaraldehyd vernetzt werden oder von einer Hülle eingeschlossen v/erden, z. B. von Kugeln. ImmobÜsierte Enzyme können vorteilhalterweise sowohl in diskontinuierlichen Verfahren, nach denen das Enzym wiederverwendet werden kann, als auch in kontinuierlichen Durchflußverfahren, in denen Substrate durch eine Säule strömen, die das immobilisierte Enzym enthält, verwendet werden о

Die Gruppe R , wenn sie in den Verbindungen der Formel (I) anwesend ist, kann eine Acylgruppe darstellen, z. B. eine Gruppe

7 7 7 7

der Formel R'GO- oder R'OCO- oder R'OCS- (worin R' eine aliphatische, araliphatisch^ oder aromatische Gruppe darstellt, z. B, eine Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Cycloalkyl-, Aralkyl- oder Arylgruppe), eine Formylgruppe, eine Gruppe R , die wie für R

9· 9

oben definiert wird, eine Gruppe R SOp- (worin R^J eine G^ л~ Alkyl- oder Cg ..-.-Arylgruppe darstellt), eine Süylgruppe, eine cyclische oder acyclische Acetalgruppe, eine Gruppe -C0(CHg)_n CO₀R (worin R ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe, wie sie

7 oben für R definiert worden ist, darstellt und η 0, 1 oder 2

111? 11 12

ist) oder eine Gruppe R R HCO- (worin R und R jeweils unabhängig voneinander ein '.7asserstoffato.ni oder eine C_1-4-Alkylgruppe darstellen können).

T 8 Im Falle R und R Alkylgruppen bedeuten, können sie Z₀ B. Cj_₈-Alkylgruppen darstellen, z. B. Llethyl-, Ethyl-, n-Propyl-, Isopropyl-, η-Butyl-, i-Butyl-, t-Butyl- oder n-Heptylgruppen, wobei diese Alkylgruppen wiederum substituiert sein können» Wenn

R¹ eine substituierte Alkylgruppe darstellt, kann diese z. B₀ durch ein oder mehrere, z. B. zwei oder drei, Halogenatotne (z_o B. Chlor- oder Bromatome), oder eine Carboxyl-, C₁ ,-Alkoxy-(z. B. eine Methoxy- oder Sthoxygruppe), Phenoxy- oder Silyloxygruppe substituiert sein. vYenn R eine substituierte Alkylgruppe bedeutet, kann diese durch eine Cycloalkylgruppe, z. B. durch eine Cyclopropylgruppe, substituiert sein, 7 8

Wenn. R' und R Alkenyl- oder Alkinylgruppen bedeuten, weisen diese vorzugsweise 2 bis 8 Kohlenstoffatome auf, und wenn R und R Cycloalkylgruppen darstellen, können diese z. B₀ Со^о" Cycloalkylgruppen wie C-, .y-Cycloalkylgruppen z_o B. Cydopentylgruppen sein.

7 8 Wenn R' und R Aralkylgruppen sind, v/eisen diese vorzugsweise 1 bis 6 Kohlenstoffatome in der Alkylgruppierung auf und die Arylgruppe(n) können carbocyclische oder heterocyclische Gruppierungen sein und vorzugsweise 4 bis 15 Kohlenstoffatome enthalten, z. B. Phenylgruppen. Beispiele für diese Gruppen sind unter anderem Phenyl-C. /--alkylgruppen, z. B. Benzylgruppen.

7 8 ™

Wenn R und R Arylgruppen darstellen, können diese carbocyclisch oder heterocyclisch sein unu vorzugsweise 4 bis 15 Kohlenstoffatome aufweisen, z. B. Phenylgruppen.

C Q

Br eine Gruppe R SOp- darstellt, kann es sich z. B,

um

eine Methylsulfonyl- oder p-Toluensulfonylgruppe handeln, 7/enn R eine cyclische Acetylgruppe darstellt, icann es 2. B. eine mit 5 bis 7 Ringatomen sein wie in der Tetrahydropyranylgruppe.

iienn R⁵ eine Süylgruppe darstellt oder R einen Süyloxy-Substituenten aufweist, kann die Silylgruppe drei Gruppen tragen, die gleich oder verscnieden voneinander sein 'könxien und die

unter Alkyl-, Alkoxy-, Cycloalkyl-, Aralkyl-, Aryl- und Aryloxygruppen ausgewählt sein können. Diese Gruppen können wie die oben definiert sein und inabesondere Methyl-, t-Butyl- und Phenylgruppen darstellen. Spezielle Beispiele fur solche Silylgruppen sind Trimethylsilyl- und t-Butyldimethylsüylgruppen.

Wenn R eine Gruppe -CO(CH₂^CO₂R darstellt, kann es sich z_o

B. um eine Gruppe -COCOORi⁰ oder -COCH₀CH₀COOR¹⁰ handeln, worin

10 R ein V/asser stoff atom oder eine G₁, .-Al ky !gruppe, z_o B₀ eine Methyl- oder Ethylgruppe, darstellte»

Wenn R^ eine Gruppe R¹¹R¹²UCO darstellt, können R¹¹ und R¹² z. B. jeweils unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine Methyl- oder Ethylgruppe bedeuten,,

Wenn R eine C. „-Alkylgruppe bedeutet, kann es z. B. eine Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, Isopropyl-, η-Butyl-, Isobutyl- oder t-Butylgruppe sein, ist jedoch vorzugsweise eine Liethylgruppe·

Wenn R eine C. g-Alkenylgruppe darstellt, kann es z. 3. eine Allylgruppe sein₀

Bevorzugte Verbindungen der Formel (I), die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden können, sind unter anderem Verbindungen, in denen R eine Isopropylgruppe bedeutet. Wichtige Verbindungen der Formel (I), die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt v^erden können, sind unter anderem jene, in denen R eine Hydroxyl- oder Ethoxygruppe darstellt und

3 2 3

R^ ein Wasserstoffatom bedeutet; oder worin R und R^ jeweils

2 3 ein tfasserstoffatom bedeuten} oder worin H und R zusammen rait dem Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind, eine ) C=O-,

Ь C=CH₂- oder > C=lTOGHo-Gruppierung darstellen. Besonders wichtige Verbindungen der Formel (I), die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt v/erden können, sind jene, in denexi

1 2 3

R eine Isopropylgruppe, R und R^J zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind, eine ^ G=lTOGHo-Gruppe darstellen und R⁴ ein V/aaserstoffatom bedeutet;

R eine Isopropylgruppe darstellt und R , R^ und R '.Yasserstoffatome bedeuten; und

Л О О А

R eine Isopropylgruppe, R eine Hydroxylgruppe und R^ und R V/asserstoffatome darstellen.

Verbindungen der Formel (II), in denen R eine Methyl-, Ethyl- oder Isopropylgruppe darstellt, R eine Hydroxylgruppe und R ein Wasserstoffatom bedeuten, werden in der GB-PS Nr. 2.187o742A beschrieben* Die anderen Verbindungen der Formel (II) werden in der EP-PS 0238.258 A beschrieben.

Ausfähraagsbei3Piel

Die Erfindung wird nachstehend an einigen Beispielen näher erläutert·

Alle Temperaturen sind in ⁰C angegeben und "1" bezieht sich auf Liter. In den folgenden Beispielen~ffi?I»G (Hochdruck-FlüssigkeitsChromatographie) wurde an einer Säule aus Spherisorb S50D3-2 (150 mm + 2,1 mm) unter Verwendung von Acetonitril Wasser wie 3 J 1 als Elutionsmittel mit einer Geschwindigkeit von 0,5 ml/min durchgeführt, wenn nichts anderes angegeben ist, Die au3 der Säule ablaufende Lösung wurde über eine Interface-Einheit mit einem Transportband von Finnigen sur Charakterisierung mit dem Massenspektrometer in ein Massenspektrometer F'innigan ЫАТ45ОО unter E.I.-Bedingungen eingegeben. Die Verbindungen der folgenden Präparation werden unter Bezugnahme auf den bekannten .ausgangs-ⁿFaktor", Faktor A, bezeichnet, Faktor A, der in der GB-PS 2.166.436 beschrieben wird, ist eine Ver-

bindung der Formel (I), in der R eine Isopropylgruppe,

о 3 4

R eine Hydroxylgruppe und R und R V/asserstoffatome bedeuten.

Zwjschenprodukt 1

5-Keto-Faktor A, hergestellt wie in Веізріеі 2 der GB-PS 2.137o742A.

Zwischenprodukt 2

5,23-Diketo-Paktor A, hergestellt wie іл Веізріеі 2 der EP-A1 238,258ο

Zwischenprodukt 3

5-Keto-l?aktor Δ-23-ethylether, hergestellt wie in Beispiel 7 der ΕΡ-Δ1 238.258.

Zwischenprodukt 4 ^-lieto-Faktor A-23-hemioxalat

330 mg 5-iieto-Faktor A, 200 mg fein verteiltes Calciumcarbonat und 0,07 ml Oxalylchlorid wurden in 10 ml trockenem Dichlormethan wurden zusammen 10 Minuten gerührt«, Danach wurden 4 ml 2 ii Salzsäure und 5 Minuten danach Easigsäure-ethylester zugegeben. Die organische Phase wurde abgetrennt, getrocknet und eingedampft» Der Rückstand wurde in Diisopropylether gelöst. Durch Verdünnen dieser Losung mit Petrolether (Kp = 40-60 ⁰G) wurde die iitel-

verbindung als weißer, floc&iger Pest stoff gefällt (262 mg), 24 _{+ 120}o _{(G 0>6) сно1з)і} д. EtOH _{я 240 nmU}, _425)j у

_{+ 120 (G 0>6) сно1з)і max}

(GHBr₃)= 3440 (OH), 1800 (GOOH, Dimer), 1720 (Ester) und 1676 cm"' (α-,β-ungesättigtes Keton), Cf(GDGl₃) unter anderem 6.52 (eng m, 1H), 5.07 (q, 3Hz, 1H), 3,78 (s, 1H), 1.83 (a, 3H) und 0,71 (d, 7Hz, 3H).

Zwis chenorodukt 5

5-Keto-23 [eJ-methoxyimino-Pa:<:tor A wurde hergestellt, wie ез im Beispiel 16 der δΡ-Α1 233_a258 beschrieben worden ist»

Beiapiel 1

(a) 0,1 ml einer Sporensuspension von Streptomyces thermo ar chaensis NGIB 12213 (hergestellt, wie es far Streptomyces thermoarchaensia UCIB 12015 in Beispiel 2 der GB-PS 2.187.742 A beschrieben worden ist) wurden verwendet, um einen kolben mit 2,5 ml des kediums A zu inokulieren:

LIedium A; D-Glucose 2,5 g/l

LIalsdextrin juD 303 (Roquette Ltd., GB) 25,0 g/l

Агкааоу 50 (British. Arkady Go. Ltd.) 12,5 g/1

Melassen 1,5 g/1

K₂HPO₄ 0,125 g/1

Caloiumcarbonat 1,25 g/1.

MOPS (H-Morpholino-propansulfonsäure) 21,0 g/1 Destilliertes Y/asser bis 11, pH-Wert

eingestellt auf 6,5 mit 5 H Natronlauge vor dem Autoklavieren,

Diese Kultur wurde 4 Tage bei 31° auf einem Rotationsschüttler bei 250 U/min inkubiert, wonach 1 mg Zwischenprodukt 1 in 0,05 ml Dimethylsulfoxid augegeben wurde. Die iCultur wurde v/eitere 24 h bei 31 ⁰C inkubiert, anschließend zentrifugiert (ungefähr 10000 U/10 min) der überstand abgetrennt und 1,8 ml i'uetnanol zu dem Rückstand zugegeben. Die dadurch hergescellte Suspension wurde 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehen gelassen und danach zentrifugiert. Der überstand wurde durch HLPC analysiert, wodurch durch Vergleich mit einer authentischen Probe, die in der GB-PS iir. 2.166.436 beschrieben worden ist, in der zu untersuchenden Probe die Anwesenheit der Verbindung der

1 2

Formel (I), in der R eine Isopropylgruppe, R eine Hydroxylgruppe, R ein Wasserstoffatom und R ein «'asserstoffatoa bedeuten, nachgewiesen wurde (3,3 .·>» ausgedrückt in _/0 des .-.Us₀E^sstoffes, der zugesetzt worden war und zum Produkt umgesetzt wurde).

(b) Die Wieserholung des Versuches unter (a) mit Streptomyces avermitüis ATGC 31780 und der Zwischenstufe 1 ergab einen Extrakt, der bei der HPLC-Analyse die Anwesenheit der Verbindung

1 ρ

der Formel (I), in der R eine Tsopropylgruppe, R eine Hydroxylgruppe, R^ ein Y/asserstoffatom und R^ ein Wasserstoffatom darstellen, aufwies (8,6 %, ausgedrückt wie im Teil a).

(c) Auf die gleiche Art und »'/eise, wie es im Teil (a) beschrieben worden ist, wurde das Zwischenprodukt 1 mit Streptomyces thermoarchaensis JiCIB 12212 inkubiert, außer daß die Kultur aus einer Sporensuspension hergestellt wurde, die zu Liedium A zugegeben wurde, jedoch mit 3 Tagen Inkubieren, wie ез beschrieben worden ist, von der aann 0,1 ml verwendet wurde, um einen frischen Ansatz von 2,5 ml des gleichen Mediums zu inokulieren, iiach 2 Tagen wurde zu dieser Kultur 1 mg Zwischenprodukt 1 in 0,05 ml Dimethylsulfoxid zugegeben und die Kultur anschließend weitere zwei Tage inkubiert, bevor sie geerntet, extrahiert und analysiert wurde, wie es im Teil (a) beschrieben worden ist_o Die Untersuchung einer Probe mittels HPLc wies die Anwesenheit der Verbindung der Formel (I), in der R eine Isopropylgruppe,

2 3 4

R eine Hydroxylgruppe, R ein Wasserstoffatom, und R ein Wasserstoffatom bedeuten, nach (5»1 > - % ausgedrückt wie in Teil a).

BeisDiel 2

(a) 0,4 ml einer Sporensuspension von Streptomyces thermoarchaensis IiCIB 12213 (hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben) wurden zur Animpfung von 25 ml Medium A in einem 250 ml Schüttelkolben verwendet. Diese Kultur wurde 2 Tage bei 28 ⁰C auf einem Rotationsschüttler bei 250 U/LIin inkubiert, iiach zwei Tagen wurde eine 5 ml-Probe dieser Kultur in einen 50 ml cchüttelkolben gegeben und 50/ul einer Lösung von 20 mg/ml Zwischenprodukt 2 in methanol zugegeben. Die Kultur wurde weitere 2 bis 3 Tage unter cen gleichen Bedingungen inkubiert und danach mit dsm

gleichen Volumen Methanol versetzt. Die so hergestellte Suspension wurde 1 Stunde geschüttelt und aann zentrifugiert. Der überstand wurde durch HPLC/Massenspektrometrie analysiert. Sin peakmit einer Retentionszeit von 3 kinuten hatte eine biassenspektrum, das charakteristisch für die Verbindung der Formel (I), in der

1 2 "?

R eine Isopropylgruppe, R und R^ zusammen mit dem liohlenstoff-

atom, an das sie gebunden sind, eine * C=O-Gruppe und R^ ein V/asserstoffatom bedeuten, ist und durch Vergleich mit einer authentischen Probe, die in der GB-PS 2.176.182 beschrieben worden ist, bestätigt wurde.

(b) Eine Wiederholung des Teils (a) dieses Versuches mit Streptomyces thercioarchaensis IiGIB 12213 und dem Zwischenprodukt 3 ergab einen Extrakt, der durch HPLC/Massenspektrometrie analysiert wurde und die Anwesenheit einer Verbindung der Formel (I), in

1 2—3

der R eine Isopropylgruppe, R eine Ethoxygruppe, R ein wasserstoff atom, und R ein Y/asserstoffatom bedeuten, durch Vergleich mit einer authentischen Probe, die in der GB-Patentschrift Ur. 2.176,182 beschrieben worden ist, bestätigt wurde.

(c) Eine Wiederholung des Teils (a) dieses Versuches mit Streptomyces thermoarchaensis JtfGIB 12213 und dem Zwischenprodukt 4 ergab einen Extrakt, der durch HPLC analysiert wurde und in dem die Anwesenheit einer Verbindung der Formel (I), in der R eine

2 3

Isopropylgruppe, R eine Gruppe -OGOGOOH, R ein Y/asserstoffatom und R ein Wasserstoffatom bedeuten, durch Vergleich mit einer authentischen Probe, die in der ^B-PS 2.176.182 beschrieben worden ist, bestätigt wurde.

(d) Eine Wiederholung des Teils (a) dieses Versuches mit Streptomyces thermoarchaensis Ж5ІВ 12213 und dem Zwischenprodukt 5 ergab einen Extrakt, bei dem die Analyse durch HrLG die Anv/esenhe it einer Verbindung der Formel (I), in der R eine Isopropyl-

2 3

gruppe, R und R zusammen mit dem xiohlenstoffatom, an das sie

gebuaden sind, eine ) C=IiOCH,-Gruppe darstellen und R ein Wasserstoff atom ist, durch Vergleich mit einer authentischen Probe, die in der GB-PS 2.192.630 A beschrieben ist, gezeigt wurde.

Die E.I. Massenapektroskopie einer Probe, die aus der analytischen HPLC isoliert worden war, wies einen Molekülpeak bei 639 auf und hatte charakteristische Fragmente bei 621, 527, 511, 496, 448, 434, 368, 264, 248 und 151.

Claims (3)

1. A? С 07 D/326 548-3 (72 026/11)

   Patentansprüche

   Verfahren zur Herstellung von kakroÜd-Derivaten der Formel (I)

   (D

   worin R eine Methyl-, Ethyl- oder Iaopropylgruppe bedeutet; R ein Wasserstoffatora oder eine Gruppe OR darstellt (in der OR eine Hydroxylgruppe oder eine substituierte Hydrosylgruppe mit bis zu 25 Kohlenstoffatomen ist) und R^ ein

   2 3

   Wasserstoffatom bedeutet, oder worin R und R zusammen mit dem Kohlenstoffatom, ал das sie gebunden sind, eine > C=O, >C=CH₂- oder > C=HOR -Gruppierung darstellen (worin R ein iVasserstoffatom, eine C. o-Alicylgruppe oder eine C^ Q-Alkenylgruppe bedeutet und die Grup-

   pierung > C=IJOR in der E-Konfiguration vorliegt) und worin R ein Wasserstoffatom oder eine Hethylgruppe darstellt, gekennzeichnet dadurch, daß eine Verbindung der Porrnel (II)

   CH

   (II)

   12 3

   (worin R , R und R^ wie oben definiert sind) in einem geeigneten Medium in Gegenwart eines Mikroorganismus oder eines davon erhaltenen Enzyms oder einer Präparation, die von einem Mikroorganismus hergestellt wurde und das interessierende Enzym enthält, das in der Lage ist, die Umsetzung zu bewirken, inkubiert wird.

   2, Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß der Mikroorganismus ein Stamm von Streptomyces thermoarchaensis, Streptomyces cyaneogriseus noncyanogenus, Streptomyces avermitiüs oder Streptomyces hygroscopicus subsp. aureolacrimosus ist,

   3. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß der Mikroorganismus Streptomyces thermoarchaensis UCIB 12212 und 12213 sowie Mutanten dieser Stämme, Streptomyces avermitilis ATCC 31272 oder 31730 oder Streptomyces hygroscopicus subsp_o aureolacrimoaus ЖЗКМ P 1433 ist»

   4ο Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Verbindung der Formel (II) in einem geeigneten Lösungsmittel zu dem Fermentationsmedium, das den Mikroorganismus enthält, in Gegenwart assimilierbarer Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und Mineralsalzen zugegeben wird«

   5« Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß es bei einem pH-Wert zwischen 5,5 und 7,5 und einer Temperatur zwischen 25 und 40 ⁰G durchgeführt wird«
2. 6. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß R in der Formel (I) und in der Formel (II) eine Isopropylgruppe darstellt.

   7· Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß in

   der Formel (I) und in der Formel (II) R eine Hydroxyl- oder Ethoxygruppe und R ein Wasserstoffatom bedeuten,

   2 3

   oder R und R jeweils ein Wasserstoffatom darstellen

   2 3

   oder R und R zusammen mit dem kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind, eine ^ C=O-, > C=GHp- oder ^> C=ITOCH.,-Gruppierung bedeuten.
3. 8. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß in der Formel (I)

   1 2 3

   R eine Isopropylgruppe, R und R zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an aas sie gebunden 3ind, eine C=IiOCH₇-

   Gruppierung und R ein Wasderstoffatom bedeuten;

   R eine Isopropylgruppe, R , R und R jev/еііз ./asserstoffatome darstellen, oder

   12 3

   R eine Isopropylgruppe, R eine Hydroxylgruppe und R und R '«asserstoffatome darstellen»