DD278362B5 - Verfahren zur Gewinnung von 2-Oxogluconsaeure mittels Bakterien - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft die Gewinnung von 2-Oxogluconsäure mittels Bakterien und gehört in das Gebiet der mikrowellen Produktsynthesen. Sie kann bei Prozessen angewendet werden, bei denen Kohlenstoffquellen in gelöster Form mit Hilfe von Bakterien umgesetzt werden.

Die mikrobiologische Bildung von 2-Oxogluconsäure ist bereits seit langem bekannt und ausführlich beschrieben worden. Es sind dazu eine Reihe von Mikroorganismen in der Lage, wie z. B. Acetobacter sp., Gluconbacter spec, Pseudomonas spec.

u. a. (Ind. Eng. Chem. 1626-31, 32 [12], Appl. Microbiol. Biotechnol. 20, 400-405).

Bekannt ist neben der direkten Herstellung aus Glucose (J. Agr. Chem. Soc. Japan 24, 56-59 [1950]; JP 62-166893) auch ein Verfahren, bei dem durch kombinierte mikrobiologische und chemische Schritte mit dem Stamm Acetobacter cerinus aus Glucose 2,5-Dioxogluconsäure gebildet wird, die durch eine selektive Reduktion in einem zweiten Schritt zu 2-Oxo-D-Gluconsäure überführt wird (DD 140 459 A1).

Die Oxidation von Glucose führt im Metabolismus aller untersuchten Mikroorganismen über die Giuconsäure zum Oxogluconat. Dementsprechend ist auch die Verwendung von Gluconaten als Ausgangsstoff für die 2-Oxogluconsäure möglich und in der Literatur beschrieben. So wandelt der Stamm Cyanococcus chromospirans Giuconsäure zu 2-Oxogluconat um (GB-PS 659 947). Ebenso wird Ca-Gluconat durch Acetobacter suboxidans zu 2-Oxogluconat gewandelt (Biochem. Z., 303,1940, 308).

Die Nachteile aller bekannten Verfahren zur 2-Oxogluconsäureherstellung sind darin zu sehen, dass die eingesetzten Mikroorganismen der bekannten Gattungen Pseudomonas, Gluconobacter, Acetobacter, Serratia u. a. ausnahmslos einen sehr hohen Bedarf an Supplinen haben und sehr langsam wachsen. Im allgemeinen werden komplexe Medien mit einem Gehalt an Hefeautolysat, Pepton oder anderen komplexen organischen Nährmedien von 10-20 g/I angegeben. Damit wird die

Ökonomie der Verfahren entscheidend im negativen Sinne beeinflusst.

Weiterhin wird durch diese Zusätze die Infektionsgefahr im Fermentationsprozess wesentlich vergrößert. Nachteilig ist auch die Tatsache, dass Glucosekonzentrationen über 100 g/l die Geschwindigkeit der Produktbildung und die Ausbeute stark vermindern. Durch Feeding-Techniken kann dieser Mangel zwar gemindert werden, doch erfordert die Einhaltung der entsprechenden Verfahrensbedingungen einen erhöhten Aufwand an Mess- und Regeltechnik.

Ziel der Erfindung ist deshalb ein einfaches und ökonomisches Verfahren zur 2-Oxogluconsäureherstellung, das nur einen geringen Aufwand an Meß« und Regelungstechnik erfordert.

Aufgabe der Erfindung ist ein Verfahren zur 2-Oxogluconsäureherstellung, bei dem die kultivierten Mikroorganismen keine zusätzlichen Suppline öder Hilfsstoffe benötigen und eine hohe Substratkonzentration im Nährmedium tolerieren.

Erfindungsgemäß würde die Aufgabe so gelöst, dass Bakterien, die zur 2-Oxogluconsäureproduktion befähigt sind, auf Fermentationsmedien, die der Gluconsäureherstellung mittels Acetobacter methanolicus IMET B 346 (Hinterlegungsnummer bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen DSM 7609) entstammen, kultiviert werden. Durch die Verwendung von Methanol als Wachstumssubstrat kann der Prozess unsteril geführt werden. Es werden hohe Umwandlungsgeschwindigkeiten bei sehr hohen Ausbeuten und Endkonzentrationen an 2-Oxogluconsäure erreicht. IMET B 346 (DSM 7609) ist aus DD 251 571 A1 bekannt.

Die Fermentationsmedien können Abläufe, Permeate oder Mutterlaugen der Gluconsäureherstellung sein, die Giuconsäure und/oder Gluconate in hohen Konzentrationen enthalten.

Die auf den genannten Fermentationsmedien kultivierten Bakterien sind Stämme der Gattungen Serratia, insbesondere

Serratia marcescens IMET 11312 (DSM 8104) Gluconobacter, Pseudomonas u. a..

Weiterhin können die Mikroorganismenzellen fixiert oder in eine Matrix eingeschlossen werden. Auf diese Weise ist eine kontinuierliche Prozessführurtg mit einer langen Nutzungsdauer der aktiven Zellen möglich. Durch Einbettung der Mikroorganismen in bekannte Trägermaterialien wird der Umwandlungsschritt Gluconat zu 2-Oxogluconat in einem durch einen Luftstrom bewegten Wirbelbettreaktor realisiert.

Der genannte Stamm Serratia marcescens IMET11312 (DSM 8104) wurdein der Hinterlegungsstelle der ZIMET-Kulturensammlung im Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDR hinterlegt und unter der Nummer IMET 11312 registriert und in die Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig überführt.

Der Stamm ist durch folgende Merkmale charakterisiert:

gramnegative bewegliche Stäbchen, 0,5 χ 0,8 χ ϊ,Ο-2,0 μπι

nach 24 Stunden Wachstum bei 30 "C auf Pepton-Glucose-FE-HE-Agar runde, glattrandige, glänzende, konvexe Kolonien schmieriger Konsistenz, Durchmesser etwa 1 mm, nach 48 Stunden Bebrütung Durchmesser 2-3 mm mit erhabenem Koloniezentrum

Kolonien bei Wachstum bei 30 °C mit rotem Farbstoff, keine Farbstoffbildung bei 37 ⁰C anaerobes Wachstum in Nährbouillon I mit 0,1% KNO₃ und auf der Fortner-Platte Oxidase -

Katalase stark +

Methylrot-Reaktion +

Voges-Prosbauer-Reaktion +

Ornithindecarboxylase +

Lysindecarboxylase +

Arginindihydrolase -

Urease (nach Christensen, Preuß) -

- Indol-

Citratverwertung (nach Simmons) + H₂S aus Cystein (+) Phenylalanindesaminase -

- Wachstum in KCN-Medium + Säurebildung aerob und anaerob (ohne Gas!) aus:

D-Glucose +

L-Arabinose -

L-Rhamnose -

Saccharose +

Lactose -

Maltose +

Cellobiose +

D-Mannit +

Inosit +

D-Sorbit - (Abweichung!)

Zusammenfassend können die Vorteile der Erfindung wie folgt dargestellt werden:

Es ist möglich, aus Fermentationsmedien, die dem Prozess der Glucoseoxidation zu Gluconsäure mittels methylotropher

Mikroorganismen entstammen, mit Hilfe von Mikroorganismen ohne jeden Supplinzusatz 2-Oxogluconsäure in hohen Ausbeuten und Geschwindigkeiten zu bilden.

Da kein meßbarer Sauerstoffbedarf besteht, können aufwendige Belüftungseinrichtungen entfallen.

Es können Gluconatlösungen bis zu etwa 200 g/l Gluconat ohne Veränderungen der Umwandlungsgeschwindigkeit und

Ausbeute umgesetzt werden, so dass die Endkonzentration an 2-Oxogluconsäure in einem einfachen satzweisen Fermentationsverfahren im Vergleich zu reiner Glucose um das Doppelte gesteigert werden kann.

Von besonderem Vorteil ist die Verwendung eingebetteter oder anderweitig immobilisierter Zellen der 2-

Oxogluconsäurebildner, die eine kontinuierliche Prozessführung über einen langen Zeitraum erlaubt. Anhand von Ausführungsbeispielen soll die Erfindung näher erläutert werden.

Beispiel 1

Der Stamm Gluconobacter oxidans CCM 1804 wurde nach der Abimpfung vom Schrägagarröhrchen in einem Medium der folgenden Zusammensetzung kultiviert: 10 g/l Hefeextrakt (Bramsch), 20 g/l CaCOa, 100 g/l Glucose pH-Wert 6,0. Zur Kultivierung wurden 100-ml-Schüttelkolben mit einem Arbeitsvolumen von 20 ml benutzt. Die Kultur wurde bis zum Verbrauch der Glucose bei 30 °C geschüttelt (Rotationsschüttler 160 U/min).

Ausgehend von dieser Vorkultur wurde im Verhältnis 1:10 eine weitere Passage in 500-ml-Schüttelkolben (Erlenmeyerkolben, Weithals) mit dem gleichen Medium wie beschrieben angeimpft. Bei ausschließlicher Schüttelkolbenkultivierung erfolgte eine Nachdosierung von Glucose bis zu einer Konzentration von 50 g/l im Medium. Der pH-Wert wurde durch Zugabe von CaCO₃ reguliert, wobei nach 8 Stunden 0,5 g pro Kolben, nach 24 Stunden weitere 1 g pro Kolben nachdosiert wurden. Fermentorkultivierungen erfolgten in Laborfermentoren mit pH-Wert-Regulation, Temperierung und Belüftung. Die pH-Wert-Regulation wurde mit 40%iger NaOH vorgenommen. Die Animpfung erfolgte ebenfalls im Verhältnis 1:10 von Schüttelkolben. Die Temperatur betrug 30 °C, die Belüftung 1-1,4 WM₁ die Rührgeschwindigkeit 1000-1500 U/min, die Gelöstsauerstoffkonzentration 40-100% der Luftsättigung. Nach 30 Stunden Fermentationszeit hatten sich 85 g 2-Oxogluconsäure gebildet. Daraus errechnet sich eine produktbezogene Ausbeute von 85% und eine Produktivität von 2.8 g/l h.

Beispiel 2

Bei einer Kultivierung entsprechend dem Beispiel 1 wurden 180 g/l Glucose vorgegeben. Nach einer Gesamtfermentationszeit von 70 Stunden hatten sich 120 g/l 2-Oxogluconsäure gebildet. Es errechnet sich daraus eine Ausbeute von 66,6% bei einer Produktivität von 1,7 g/l h.

Beispiel 3

Die Kultivierung des Stammes Gluconobacter oxidans CCM 1804 wurde nach der im Beispiel 1 beschriebenen Weise vorgenommen. 100 ml der Bakteriensuspension wurden in 1 I einer sterilisierten Nagluconat-Lösung (Handelsprodukt 99,5% Reinheit) mit einem Gehalt von 98 g/l Gluconat gegeben. In einem Fermentor wurde diese Lösung bei einer Belüftung von 0,1 l/min für 200 Stunden gerührt. Nach dieser Zeit hatten sich 12 g/l 2-Oxogluconsäure gebildet. Daraus errechnet sich eine Ausbeute von 12,2% und eine Produktivität von 0,06 g/l h.

Beispiel 4

Die Kultivierung des Stammes Gluconobacter oxidans CCM 1804 wurde nach der im Beispiel 1 beschriebenen Weise durchgeführt. Mit dieser Fermentationslösung (100 ml) wurde 11 eines sterilisierten Ablaufes der Gluconsäurefermentation mit dem Stamm Acetobacter methano/icus IMET 346 (DSM 7609) versetzt und in einem Rührgefäß mit einer Luftmenge von 0,1 l/min belüftet. Der Gehalt an Gluconat zum Beginn der Umsetzung betrug 180 g/l, der an abgetöteter Biomasse 1,8 g/l. Nach einer Reaktionszeit von 40 Stunden ist die Gluconsäure vollständig zum 2-Oxogluconat umgewandelt worden. Es wurde eine Konzentration von 171 g/l 2-Oxogluconsäure bestimmt, daraus errechnet sich eine Ausbeute von 95%, bezogen auf das eingesetzte Gluconat, und eine Produktivität von 4,2 g/l h.

Beispiel S

Nach der im Beispiel 1 beschriebenen Anzucht wurde der Stamm Serratia marcescens IMET 11312 (DSM 8104) gezüchtet. Nach dem im Beispiel 4 dargestellten Verfahren wurde 100 ml dieser Bakteriensuspension in einen sterilisierten Fermentationsablauf der Gluconatherstellung mit Acetobacter methanolicus IMET B 346 (DSM 7609 - Gehalt 192 g/l Gluconsäure) gegeben und gerührt. Nach 36 Stunden war die Gluconsäure umgesetzt. Es hatten sich 185 g/l 2-Oxogluconat gebildet. Daraus errechnet sich eine Ausbeute von 96% und eine Produktivität von 5,1 g/l h. Eine Kultivierung des Stammes nach den Bedingungen des Beispieles 3 erbrachte nur eine Umsetzung des eingesetzten Gluconats von 14%.

Beispiel 6

Nach der im Beispiel 1 beschriebenen Methode der Anzucht wurde ein Stamm Pseudomonas putida gezüchtet und nach den im Beispiel 4 genannten Bedingungen zum sterilisierten Ablauf einer Gluconatfermentation mit Acetobacter methanolicus gegeben. Auch hier erfolgte eine Umsetzung zu Oxogluconaten, wobei jedoch nach 60 Stunden Reaktionszeit eine Mischung von Oxogluconaten entstanden war (120 g/l). Eine unter gleichen Bedingungen vorgenommene Umsetzung einer Gluconatlösung aus einem käuflichen Produkt entsprechend den Bedingungen des Beispiels 3 erbrachte einen um 12% erniedrigten Gluconatgehalt.

Beispiel 7

Nach den im Beispiel 1 genannten Methoden wurde der Stamm Gluconobacter oxidans CCM 2371 gezüchtet und entsprechend dem Beispiel 4 mit einer Gluconatlösung aus dem Fermentationsprozess der Gluconsäureherstellung umgesetzt. Nach 47 Stunden hatte sich aus 173 g/l Gluconat 59 g/I 2-Oxogluconsäure gebildet. Daraus errechnet sich eine Ausbeute von 92% und eine Produktivität von 3,38 g/l h für die Bildung von 2-Oxogluconat. Die Kontrollreaktion mit einer Gluconatlösung aus einem käuflichen Produkt ergab nach 180 Stunden eine Umsetzung von 13%.

Beispiel 8

Nach den in Beispiel 1 beschriebenen Methoden wurde eine Kultur des Stammes Serratia marcescens IMET11312 (DSM 8104) gezüchtet. Nach den Methoden des Beispiels 4 wurde eine sterilisierte Lösung eines gluconathaltigen zellfreien Permeates, das auf einen Gluconatgehalt von 150 g/l verdünnt worden war, umgesetzt. Nach 30 Stunden Reaktionszeit wurde kontinuierlich mit der Zugabe des Permeates begonnen, das 480 g/l Gluconat enthielt, die Zudosierungsgeschwindigkeit betrug 10 ml/h. Nach 70 Stunden hatten sich in der Fermentationslösung 210 g/l 2-Oxogluconat gebildet.

Beispiel 9

Nach den in Beispiel 1 aufgeführten Bedingungen wurde zuerst in Schüttelkolben, danach in einem 1-l-Fermentor eine Kultur von Serratia marcescens IMET 11312 (DSM 8104) gezüchtet. Die Fermentationslösung wurde zentrifugiert und die gewonnene Biomasse zur Einbettung in eine Matrix verwendet. Als Beispiel für eine Anwendung fixierter Mikroorganismen wurde die Einbettung in Polygalakturonat gewählt. Es wurde 3 g Galakturonsäure in 60 ml Wasser gelöst. Nach dem über Nacht erfolgten Quellen wurde in 2N NaOH ein pH-Wert von 7 eingestellt. Die einzubettende Biomasse wurde in 20 ml aufgenommen und mit der Galakturonatlösung auf 100 ml aufgefüllt. Über eine Kapillare wurde unter Druck (N₂ = 0,05 M Pa) die Lösung in 400 ml CaCb-Lösung eingepresst. Von den entstandenen Perlen wurden je 25 g in Schüttelkolben (500 ml) gegeben und 100 ml einer Gluconatlösung aus dem Acetobacter-methanoHcus-Prozess mit einem Gehalt von 80 g/l Gluconsäure hinzugegeben. Bei 30 °C wurde der Kolben bei einer Frequenz von 60 pro Minute geschüttelt. Nach 64 Stunden hatten sich 37 g/l 2-Oxogluconsäure gebildet.

Beispiel 10

Die Anzucht von Zellen des Stammes S. marcescens IMET11312 (DSM 8104) erfolgte analog den im Beispiel 8 aufgeführten Bedingungen, ebenso erfolgte die Einbettung der Zellen in Galakturonat wie dort beschrieben. Die Perlen mit den eingebetteten Zellen wurden in einen Wirbelbettreaktor von 200 ml Arbeitsvolumen mit einer Vorrichtung zum Betreiben in kontinuierlicher Prozessführung gegeben. Die Perlen wurden durch einen Luftstrom von 30 l/Stunde bewegt. Die Zudosierung der Gluconatlösung aus dem Acetobacter methanolicus-Prozess erfolgte so, dass sich eine Durchflussrate von D = 0,024 l/h ergab. Nach 4 Tagen war ein Maximum von 50 g/l 2-Oxogluconsäure erreicht worden. Der Prozess wurde bereits 10 Tage aufrecht erhalten, dabei betrug die im Auslauf bestimmte 2-Oxogluconsäuremenge zwischen 40-50 g/l.

Claims (5)

1. Patentansprüche:

   1. Verfahren zur Gewinnung von 2-Oxogluconsäure mittels Bakterien, gekennzeichnet dadurch, dass zur 2-Oxogluconsäureproduktion fähige Bakterien auf Fermentationsmedien, die der Glucoseoxidation mittels Acetobacter methanolicus IMET B 346 (DSM 7609) entstammen, kultiviert werden.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, dass die Fermentationsmedien sterilisiert werden.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, dass Bakterien der Gattung Serratia, Gluconobacter und Pseudomonas eingesetzt werden.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, dass der Stamm Serratia marcescens IMET 11312 (DSM 8104) kultiviert wird.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, dass die Mikroorganismenzellen der zur 2-Oxogluconsäureproduktion fähigen Bakterien fixiert oder in eine Matrix eingeschlossen werden.