DD250135A1

DD250135A1 - Verfahren zur mikrobiellen herstellung von phasaolotoxin und n-phosphosulfamylornithin

Info

Publication number: DD250135A1
Application number: DD29139086A
Authority: DD
Inventors: Alexander Schluttig; Joerg Nueske; Wolfgang Fritsche; Hans-Juergen Michel
Original assignee: Friedrich Schiller Uni Jena Bu
Priority date: 1986-06-18
Filing date: 1986-06-18
Publication date: 1987-09-30

Abstract

Grundlage der Erfindung ist der Mikroorganismus Pseudomonas syringae pv. phaseolicola 6/0, der unter submersen Bedingungen in synthetischen oder komplexen Naehrmedien Phaseolotoxin und N-Phosphosulfamylornithin produziert. Die Ausbeute ist gegenueber anderen Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Phaseolotoxin und N-Phosphosulfamylornithin wesentlich erhoeht. Auf Grund der biologischen Aktivitaet koennen Phaseolotoxin und N-Phosphosulfamylornithin als Herbizide, Enzyminhibitoren, als Wachstumsregulatoren und als Algizide eingesetzt werden.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Phaseolotoxin (N-Phosphosulfamylornithyl-alanylhomoarginin) und seinem Spaltprodukt N-Phosphosulfamylomithin. Beide Verbindungen hemmen die Ornithin-Carbamyl-Transferase in mikrobiellen und pflanzlichen Zellen. Demzufolge können diese beiden Verbindungen für medizinische Zwecke als Enzymhemmer, als Herbizide als Wachstumsregulatoren und als Algizide eingesetzt werden.

Charakteristikderbekannten technischen Lösungen

Bisher sind verschiedene Verfahren zur Herstellung von Phaseolotoxin und N-Phosphosulfamylornithin bekannt (MITCHELL, R.E. [1976] Phytochemistry 15,1941; MITCHELL, R.E. [1978] Phys. Plant Path. 13, 37; RUDOLPH, K. et al. [1978] Arch. Microbiol. 119,219; Bublitz, F. und Völksch, B. [1983] Z. allg. Mikrobiol. 23,485). Diese Verfahren haben allerdings den Nachteil, daß Phaseolotoxin und PhosphosuIfamyIomithin nur in sehr geringen Konzentrationen gebildet werden (1 bis 5 mg pro Liter).

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung ist die mikrobielle Herstellung von Phaseolotoxin und N-Phosphosulfamylornithin in hohen Ausbeuten.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein mikrobielles Verfahren zur Herstellung von Phaseolotoxin und N-Phosphosulfamylomithin in hohen Ausbeuten zu beschreiben. Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch ein mikrobielles Verfahren gelöst, das von einem Bakterium ausgeht, das als Pseudomonas syringae pv. phaseolicola 6/0 bezeichnet ist, von uns aus der Natur isoliert wurde und das in der Hinterlegungsstelle des Zentralinstitutes für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDR für die Hinterlegung von Mikroorganismen bei der Vornahme von Erfindungsanmeldungen unter der Nummer ZIMET 11107 hinterlegt worden ist.

Der Stamm Pseudomonas syringae pv. phaseolicola 6/0 wird unter submersen Bedingungen bei einer Temperatur von 16°C bis 22°C, einem pH-Wert von 6,0 bis 7,5 und einem Sauerstoffpartialdruck von mehr als 50% Sättigung in einem synthetischen oder komplexen Nährmedium mit oder ohne Nachdosierung von Nährstoffen 20 bis 96 Stunden kultiviert.

Das verwendete synthetische Nährmedium hat folgende Zusammensetzung: 5,5g Na₂HPO₄ 2H₂0,2,6g KH₂PO₄,1,0g Na₂SO₄, 10mg FeSO₄7H₂0,10mg MnSO₄7H₂0,100 mg MgSO₄,2,5g NH₄CI und 15g Saccharose pro Liter Wasser. Vor Unterschreiten einer Schwellenkonzentration von 0,1 g/l NH₄ ⁺ und 0,5g/l Saccharose können beide Nährstoffe kontinuierlich oder diskontinuierlich nachdosiert werden, wobei Konzentrationen von 1,7 g/l NH₄ ⁺und 25 g/l Saccharose nicht überschritten werden dürfen.

Als Impfmaterial dienen Vorkulturen mit der gleichen Zusammensetzung von Mediums, die in 500ml Standrundkolben mit 100 ml Kulturlösung 20 Stunden bei 18⁰C auf einem FANAL-Rundschüttler mit einer Frequenz von 250 RPM kultiviert wurden. Die Vorkulturen wurden mit Schrägagarröhrchen, in denen der Mikroorganismus 24h auf einem Glycerin-Bouillon-Agar kultiviert wurde, beimpft.

Nach Beendigung der Fermentation wird die Kulturlösung durch Zentrifugation von Mikroorganismus abgetrennt. Die Reinigung von Phaseolotoxin und N-Phosphosulfamylornithin erfolgt nach bereits bekannten Verfahren.

Ausführungsbeispiele

In drei Ausführungsbeispielen soll das Verfahren näher erläutert werden.

1. Die Stammhaltung von Pseudomonassyringae pv. phaseolicola 6/0 erfolgt auf Schrägagarröhrchen mit Bouillon-Glycerin-Agar. Nach erfolgtem Bewuchs (18⁰C) werden die Kulturen bis zur nächsten Beimpfung bei +4⁰C gelagert. Eine Überimpfung erfolgtallerachtWochen. Als Dauerkonserven wurden Lyophilkonserven in Magermilch angelegt. Mit den Schrägagarröhrchen werden die Vorkulturen beimpft und 20 Stunden bei 18⁰C kultiviert. Das Vorkulturmedium entspricht dem Hauptkuiturmedium

" und hatfolgendeZusammensetzung: 5,5g Na₂HPO₄,2,6g KH₂PO₄,1,0g Na₂SO₄,10mg FeSO₄7H₂0,10mg MnSO₄7H₂0,100mg MgSO₄,4,5g NH₄CI und 30g Saccharose pro Liter Wasser.

Die Beimpfung der Hauptkultur im Fermenter erfolgt mit 20 Stunden alten Vorkulturen. Es wird mit einer Animpfdichte von 0,2 bis 0,5 g/l Biomasse gearbeitet. Die Fermentation wird bei einer Temperatur von 18⁰C und einem Sauerstoffpartialdruckvon 70%bis 100% Sättigung durchgeführt. Der pH-Wert wird mittels 1 N NaOH auf 6,8 konstant gehalten. Bei Erreichen einer Biomasse von 8g/l wird die Fermentation beendet. ·

Nach Abtrennung der Biomasse durch Zentrifugation wird der pH-Wert des Kulturfiltrates mit 2 N NaOH auf 8 bis 9 eingestellt. Anschließend erfolgt eine Hitzebehandlung bei 120⁰C im Autoklaven (10min). Die weitere Aufarbeitung und Isolierung der Wirkstoffe erfolgt nach bereits bekannten Verfahren

Es werden Ausbeuten von 130-150mg Phaseolotoxin pro Liter erzielt.

2. die Stammhaltung und die Ausführung der Vorkultivierung von Pseudomonassyringae pv. phaseolicola 6/0 erfolgte wie im Ausführungsbeispiel 1 dargestellt.

Vorkultur- und Hauptkulturmedium sind identisch und entsprechen dem Ausführungsbeispiel 1, enthalten aber 2,5g/l NH₄CI und 15g/l Saccharose.

Die Beimpfung der Kultur im Fermenter erfolgt mit 20 Stunden alten Vorkulturen. Es wird mit einer Animpfdichte von 0,5g Biomasse/l gearbeitet. Nach Erreichen einer Biomassekonzentration von 4g/l werden wiederum 2,5 g NH₄CI und 15g Saccharose pro Liter Kulturlösung dosiert. Die weiteren Dosierungen erfolgen mit den gleichen Mengen NH₄CI und Saccharose bei Biomassekonzentrationen von 8,5g/l, 13g/l und 17g/l oder bei Saccharoserestkonzentrationen von 3g/l. Nach Erreichen einer Biomassekonzentration von 20 bis 25g/l wird der Fermenter abgelassen und die Biomasse in einer Kühlzentrifuge separiert. Während der Fermentation wird der pH-Wert durch automatische Titration mit 2 N NaOH auf pH 6,8 konstant geregelt. Der Sauerstoffpartialdruckwird durch Regelung der Luftzufuhr und der Rührerdrehzahl auf 70 bis 80% Sättigung gehalten. Die Kultivierungstemperatur beträgt 18°C.

Die Isolierung der Wirkstoffe aus dem Kulturfiltrat erfolgt nach bekannten Verfahren. Der Stamm produziert unter diesen Bedingungen 480 bis 550mg Phaseolotoxin pro Liter Kulturfiltrat.

3. Stammhaltung von Pseudomonas syringae pv. phaseolicola 6/O und Vorkultur erfolgen wie im Ausführungsbeispiel 1.

Die Beimpfung der Fermenter erfolgt mit 20 Stunden alten Vorkulturen. Es wird mit einer Animpfdichte von 0,2 bis 0,5 g Biomasse pro Liter gearbeitet. Die synthetische Nährlösung enthält zu Beginn der Kultivierung 4,0 g NH₄CI und 25 g Saccharose pro Liter.

Bei Erreichen einer Biomassekonzentration von 7g/l wird ein Substratgemisch, bestehend aus 20,4g NH₄CI und 162 g Saccharose auf 650ml Wasser, mit einer Pumpgeschwindigkeit von 7ml/h/l Kulturvolumen kontinuierlich zudosiert, bis eine Biomassekonzentration von 15g/l erreicht ist. Bei Erreichen dieser Biomassekonzentration beträgt die gebildete Phaseolotoxinmenge 430mg/l.

Der pH-Wert wird während der Fermentation mittels 2 N NaOH konstant auf 6,8 gehalten. Die Fermentätionstemperatur beträgt 18°C. Der Sauerstoffpartialdruckwird durch Regelung der Luftzufuhr und der Rührerdrehzahl auf 70 bis 80% Sättigung eingestellt.

Die Abtrennung der Biomasse und die Isolierung der Wirkstoffe erfolgt wie in Ausführungsbeispiel 1.

Claims

1. Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Phaseolotoxin und N-Phosphosulfamy !ornithin unter submersen, aeroben Bedingungen, in einem Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthaltenden Nährmedium, gekennzeichnet dadurch, daß ein Bakterienstamm Pseudomonas syringae pv. phaseolicola 6/0 unter submersen Bedingungen in einem synthetischen oder komplexen Medium bei pH-Werten von 6,0 bis 7,5, einer Temperatur von 16°C bis 22⁰C und einem Sauerstoffpartialdruck von mehr als 50% Sättigung 20 bis 96 Stunden kultiviert wird, wobei eine Nachdosierung der Kohlenstoffquelle und der Ammoniumionen erfolgen kann.

2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Konzentration der Ammoniumionen vor Beginn der Fermentation auf Werte zwischen 0,15g/l und 1,7 g/l eingestellt wird.

3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Konzentration der Kohlenstoff- und Energiequelle vor Beginn der Fermentation auf Werte zwischen 3 g/l und 30g/l eingestellt wird.

4. Verfahren nach Punkt 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß die Anfangskonzentration an organischem Phosphat im Bereich von 0,1 g/l bis 5,0g/l eingestellt wird.

5. Verfahren nach Punkt 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß die Nachdosierung der Kohlenstoff- und Energiequelle und der Ammoniumionen so erfolgt, daß die aktuelle Konzentration der Kohlenstoff- und Energiequelle aufwerte zwischen 0,5g/! und 25g/l und die aktuelle Konzentration der Ammoniumionen aufwerte zwischen 0,1 g/l und 1,7 g/l kontinuierlich oder diskontinuierlich eingestellt wird.