DD258626A1 - Verfahren zum nachweis einer verminderten lymphozyten-t-zellfunktion - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis einer verminderten Lymphozyten-T-Zellfunktion. Das erfindungsgemaesse Verfahren wird in medizinischen und biologischen Laboratorien angewendet. Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines einfachen Verfahrens zur Bestimmung einer speziellen Lymphozyten-T-Zellfunktion, welche bei Patienten mit erworbenen Immundefekt (acquired immune deficiency sydnroms &AIDS! ) veraendert ist. Die zu untersuchende Lymphozytenfunktion kann anhand ihrer direkten Beziehung zur Aktivitaet eines im Serum oder Plasma nachzuweisenden Enzyms beurteilt werden. Die Aktivitaet dieses Enzyms, der Dipeptidylpeptidase IV, laesst sich mit an sich bekannten Methoden im Serum oder Blutplasma bestimmen. Das erfindungsgemaesse Verfahren signalisiert mit hoher Genauigkeit das Vorhandensein einer eingeschraenkten Lymphozyten-T-Zellfunktion und ist so beschaffen, dass es mit geringem Aufwand durchgefuehrt werden kann und sich insbesondere fuer Massenuntersuchungen zur Beurteilung eines erworbenen Immundefektes acquired immune deficiency sydnrome (AIDS) eignet.

Description

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Einfach zu handhabende und genügend empfindliche Methoden sind zur Bestimmung von Lymphozyten-T-Zellfunktionen in biologischen Materialien für diagnostische Zwecke sehr nützlich.

Geänderte Lymphozyten-T-Zellfunktionen werden häufig labordiagnostisch mit immunologischen Methoden anhand veränderter Zellmembraneigenschaften mittels geeigneter Antikörper gegen spezifische T-Zell-Membrandeterminanten untersucht. Hierzu werden geeignete Antikörper gegen spezifische T-Zell-Membrandeterminanten mit Blut oder Lymphozytensuspensionen inkubiert und mit den verschiedensten üblichen Verfahren eines Immunoassays die entsprechende Antigen-Antikörperreaktion bestimmt. T-Zellfunktionsschädigungen werden auch indirekt durch die direkte Bestimmung des schädigenden Agens bzw. anhand der möglichen Immunantwort des Körpers auf dieses schädigende Agens mit entsprechenden Immunoassays nachgewiesen.

J. P. GETCHELL, J. R. ALLEN, B. KILLBOURNE, C. BOHAN, D. R. HICKS, V. S. KALYANARAMAN: Comparsion of three assays to detect antibody to HTLV III, „International conference on AIDS" (Atlanta, Georgia, USA, 14.-17.4.1985.) Die aufgeführten Verfahren der Bestimmung von T-Zellfunktionen bzw. T-Zellfunktionsschädigungen bzw. Veränderungen von T-Zellfunktionen mittels Immunoassays sind durch aufwendige Herstellungs- oder Anwendungsverfahren gekennzeichnet. Die indirekte Bestimmung der Beeinflussung einer Lymphozyten-T-Zellfunktion durch ein von außen in den Körper eingebrachtes Agens, wie beispielsweise das HTLAV 3 Virus, anhand der durch den Säugetierorganismus gebildeten Antikörper wie beispielsweise Immunglobulin A oder Immunglobulin M kann durch die zeitlich unterschiedliche Produktion dieser Antikörper durch den Säugetierorganismus zusätzlich erschwert werden.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist ein einfaches Verfahren zur Bestimmung einer speziellen Lymphozyten-T-Zellfunktion, welches sich insbesondere für Massenuntersuchungen zur Beurteilung eines erworbenen Immundefektes acquired immune deficiency syndrome (AIDS) eignet.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, den entdeckten Zusammenhang zu nutzen, der zwischen der im Serum oder Plasma vorkommenden Aktivität der Dipeptidylpeptidase IV und einer speziellen Lymphozyten-T-Funktion besteht, welche bei Patienten mit erworbenem Immundefekt acquired immune deficiency syndrome (AIDS) durch ein von außen in den Säugetierorganismus einwirkendes Agens, wie beispielsweise das HTLV HI-Virus, verursacht wird.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren als Maß einer verminderten speziellen Lymphozyten-T-Zellfunktion benutzte Dipeptidylpeptidaseaktivität ist an sich bekannt (Küllertz, G., P.Oehmeund A. Barth „Dipeptidyl-Peptidase IV — Chemie, Biochemie und physiologische Aspekte", Beiträge zur Wirkstofforschung Heft 11,1981, Herausgeber: P.Oehme, H.Löwe, E.Göres, Akademie-Industriekomplex, Π36 Berlin-Friedrichsfelde, Alfred-Kowalke-Str.4). In dieser und in anderen Literaturstellen:

Scholz, W., R. Mentlein, H. Haymann, A. C. Feller, A. J.Ulmer, H. D. Flad, „II 2 production by human T-Lymphozyten identificated by antibodys to DD IV", Cellular. Immuno. 93 (1985), 199-212 (Zusammenfassung fürdie mündliche Wiedergabe), Walberg, Jr. E.F., S.Tauchida, D.S.Weeden, M.W.Thoma, A.Barick, K.B.McEnzire, J.P.Allison, D.G.Hixson, „Identification of DP IV on a

protein sharad by the plasma membran of hepatocytes and liver biomatrix", Exp. Cell. Res. 158 (1985), 509-19 (Zusammenfassung für die mündliche Wiedergabe), Caporale C, A. Fontanella, P.Petrelli.P.Pucci, M. F. Molinare, D.Picone, S.Auricchio, „Isolation and characterization of DP IV from human meconium, functional role of ß-casomorphine, FEBS Lett. 184 (1985), 273-278 (Zusammenfassung für die mündliche Wiedergabe), Hussain, M. M., „Reconstitution of purified DP IV, a comparision with aminopeptidase N with respect to morphology and influensesof anchoing peptide on function", Biochim.

Biophys. Acta815 (1985), 306-313 (Zusammenfassung für die mündliche Wiedergabe).

Invernizzi, R., G. Bertolino, M. Girino, P. Perseghin, M. Mizhienzi, R. Nani, „Cytochemistry of DP IV and DP Il in normal and neoplastic lymphoid cella", Blut 50 (1985), 277-287 (Zusammenfassung für die mündliche Wiedergabe), Schön, E.,

H. W. Mansfeld, H. U. Demuth, A. Barth, S. Ansorge, „The DP IV a membrane enzym involved in the proliferation of T-Lymphozytes", Biomed. Biochim. Acta 44 (1985) K₉-I₇ (Zusammenfassung für die mündliche Wiedergabe), Krapala, E., J. Vicar,

L. Ziskava, E.Kasafirek, Z.Kolar, V, Lichnovsky, „DP IV in mammalian lungs". Lung 163 (1985), 33-55 (Zusammenfassung für die mündliche Wiedergabe)

findet sich jedoch nicht der geringste Hinweis darauf, daß dieses Enzym anhand seiner Enzymaktivität im Serum oder Plasma geeignet sein könnte, Änderungen einer speziellen Lymphozyten-T-Zellfunktion, wie sie bei Patienten mit erworbenem Immundefekt acquired immune deficience syndrome (AIDS) durch ein von außen einwirkendes Agens, wie beispielsweise das HTLV HI-Virus, verursacht wird, zu erkennen.

Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden eine Serumprobe oder Plasmaprobe mit einem für die Enzymaktivitätsbestimmung des Enzyms Dipeptidylpeptidase IV geeignetem Reagenz zunächst miteinander vermischt, wobei die Reihenfolge der Vermischung nicht entscheidend ist. Die relativen Mengen von Reagenz und Serum oder Plasma zueinander sind nicht entscheidend, sollten jedoch so ausgewählt werden, daß die Katalyseaktivität des Enzyms Dipeptidylpeptidase IV gegenüber einem oder mehreren im Reagenz enthaltenen, für den Nachweis der katalytischen Aktivität des Enzyms DP IV notwendigen Enzymsubstrates mit den in der Laboratoriumsdiagnostik üblichen Nachweismethoden entweder quantitativ oder anhand einer Schwellenwertmethode nachgewiesen werden kann.

Das Reagenz, welches zum Nachweis der katalytischen Aktivität der Dipeptidylpeptidase IV mit Serum oder Plasma vermischt wird, besteht aus einem oder mehreren für den Nachweis der katalytischen Aktivität des Enzyms Dipeptidylpeptidase IV notwendigen Substrats, in einer wäßrigen Lösung. Zur Herstellung der Reagenzlösung wird das Substrat in Wasser oder einem Gemisch aus Wasser und einem organischen Lösungsmittel gelöst.

Das organischen Lösungsmittel kann dabei als Lösungsvermittler für das Enzymsubstrat dienen und ist z.B. Tetrahydrofuran.

Die Reagenzlösung enthält vorzugsweise auch noch ein geeignetes Puffergemisch, wie z. B. Tris-Puffer, Tricin-Puffer oder Hepes-Puffer.

Der pH-Wert der Reagenzlösung liegt im allgemeinen zwischen 6 und 8, und vorzugsweise bei pH = 7^4; diese Werte werden vorzugsweise über den pH-Wert der Reagenzlösung eingestellt. Es kann auch vorteilhaft sein, den Lösungen zur Einstellung des pH-Wertes ein geeignetes Puffergemisch zuzugeben, wie z. B. Tris-Puffer, Tricin-Puffer oder Hepes-Puffer. Die Pufferkonzentration liegt im allgemeinen zwischen 10 und 10OOmMol/l, insbesondere bei 50 bis 200mMol/l.

Als Substrate dienen Verbindungen des Typs Xaa-Ala-Y bzw. Xaa-Pro-Y in denen Xaa eine beliebige L-alpha-Aminosäure und Y ein chromophores Amin wie z. B. p-Nitroanilin 4-Phenylazophenylamin, welches zum Nachweis mittels UV-VIS-Spektroskopie geeignet ist oder ein Amin, welches nach einer geeigneten Umsetzung mit einem zweiten Reaktionspartner unter geeigneten Bedingungen einer in der Laboratoriumsdiagnostik üblichen Nachweismethode zugänglich gemacht werden kann, wie das beispielsweise für 2-Naphthylamin, 1-Naphthylamin, 4-Methoxy-2-naphthylamin oder 4-Nitroanilin mittels Azokupplung möglich ist.

Y kann auch ein der Fluoreszenzspektroskopie zugängliches Amin wie z. B. 2-Naphthylamin, 4-Methoxynaphthylamin oder 4-Methyl-7-cumarinamin sein. Die Konzentration des Substrates im Gemisch zwischen Reagenz und Serum bzw. Plasma liegt im allgemeinen zwischen 10 und 0,001 mMol/l, insbesondere bei 0,1-0,5mMol/l.

Das erfindungsgemäße Verfahren der Bestimmung der enzymatischen Aktivität der Dipeptidylpeptidase IV in Serum oder Plasma als Maß einer speziellen Lymphozyten-T-Zellfunktion, welche durch ein von außen in den Säugetierkörper eingebrachtes Agens, wie beispielsweise HTLV HI-Virus verändert werden kann, kann auch mittels Teststreifen erfolgen.

Zur Herstellung dieser Teststreifen werden z.B. saugfähige Träger, vorzugsweise Filterpapier, Cellulose oder Kunstfaserfliese, mit Lösungen der erforderlichen, üblicherweise zur Herstellung der Teststreifen verwendeten Reagenzien (Substrat, Puffer, gegebenenfalls Netzmittel) in leichflüchtigen Lösungsmitteln, wie z. B. Wasser, Methanol, Äthanol oder Aceton imprägniert. Dies geschieht zweckmäßig in zwei getrennten Schritten: Zunächst wird mit einer wäßrigen Lösung imprägniert, die den Puffer und andere wasserlösliche Zusatzstoffe enthält. Danach wird mit einer Lösung des für den Nachweis der enzymatischen Aktivität der Dipeptidylpeptidase IV notwendigen Substrates oder eines Substratgemisches imprägniert. Bei Nutzung der Methode der Azokupplung enthält die Substratlösung zusätzlich noch ein geeignetes Diazoniumsalz. Die Imprägnierung kann jedoch auch in einer anderen Reihenfolge bzw. mit einer anderen Zusammensetzung der beiden Imprägnierlösungen durchgeführt werden.

Die fertigen Testpapiere können als solche verwendet werden oder in an sich bekannter Weise an Griffen angeklebt oder vorzugsweise zwischen Kunststoffen und feinmaschigen Netzwerken gemäß DBP 2118455 eingesiegelt werden.

Zur Herstellung filmbeschichteter Teststreifen werden sämtliche Reagenzien in die Lösung oder Dispersion einer filmbildenden Substanz, wie z. B. Polyvinylester oder Polyamid, eingetragen und homogen vermischt. Das Gemisch wird in dünner Schicht auf einen Kunststoffträger gestrichen und getrocknet. Die filmbeschichteten Teststreifen werden nach dem Trocknen geschnitten und können als solche verwendet werden und oder in an sich bekannter Weise an Griffe angeklebt werden oder z. B. zwischen Kunststoffen und feinmaschigen Netzwerken gemäß DBP 2118455 eingesiegelt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis einer speziellen Lymphozyten-T-Zellschädigung, wie sie beispielsweise bei Patienten mit erworbenem Immundefekt acquired immune deficience syndrome (AIDS) auftritt, anhand der Bestimmung der enzymatischen Aktivität des Enzyms Dipeptidylpeptidase IV in Serum oder Plasma, läßt sich auch mittels geeigneter Reagenztabletten oder Pulvermischungen durchführen, indem die oben angeführten Bestandteile des Testes mit üblichen galenischen Zusatzstoffen versetzt und granuliert werden. Zusatzstoffe dieser Art sind z. B. Kohlenhydrate, wie z. B. Mono-, Oligo- oder Polysaccaride oder Zuckeralkohole wie z. B. Mannit, Sorbit oder Xylit oder andere lösliche inerte Verbindungen, wie Polyethylenglykole oder Polyvinylpyrrolidon. Die Pulvermischungen oderTabletten weisen im allgemeinen ein Endgewicht von ungefähr 50-200 mg, vorzugsweise 50-80 mg, auf.

Zur Herstellung von Lyophilisaten im Gesamtgewicht von jeweils etwa 5-20 mg, vorzugsweise etwa 10 mg wird eine Lösung gefriergetrocknet, die neben sämtlichen für den Test benötigten Reagenzien üblicher Gerüstbildner, wie z. B. Polyvinylpyrroliden und evtl. weitere Füllstoffe wie z. B. Mannit, Sorbit oder Xylit, enthält.

Die so hergestellten diagnostischen Mittel ermöglichen es, nach Eintauchen in die zu untersuchende oder nach Zugabe zur betreffenden Körperflüssigkeit die Aktivität der Dipeptidylpeptidase IV als Maß einer speziellen Lymphozyten-T-Zellfunktion, die bei Patienten mit erworbenem Immundefekt acquired immune deficience syndrome (AIDS) verändert ist, rasch und einfach über eine Farbbildung, die visuell oder fotometrisch, z. B. remissionsphotometrisch oder in der Küvette, beurteilt werden kann, oder über eine Änderung der Fluoreszensintensität, die entweder visuell, z. B. mittels Schwellenwertmethode, oder fluoreszensspektroskopisch in der Küvette beurteilt werden kann, nachzuweisen.

Für jede Reihe zu testender, unbekannter Serum- oder Plasmaproben werden zur Kontrolle vorbestimmte äquivalente Normalserum- bzw. Normalplasmaproben und entsprechende Proben von Patienten mit erworbenem Immundefekt acquired immune deficience syndrome (AIDS) unter identischen Bedingungen untersucht. Typischerweise zeigt für den speziellen Ansatz und das spezielle Analysenverfahren wie in Beispiel 1 aufgeführt das Normalserum beispielsweise eine Dipeptidylpeptidaseaktivät von mehr als 30μΜοΙ/Ι · min. Das Serum bzw. Plasma von Patienten mit einem erworbenen Immundefekt acquired immune deficience syndrome (AIDS) zeigt typischerweise beispielsweise weniger als 20μΜοΙ/Ι min. Seren, bei denen die Enzymaktivität innerhalb des hohen Bereiches liegen, werden als normal betrachtet. Die Seren, bei denen die Bestimmung der Dipeptidylpeptidaseaktivität unter den speziellen Bedingungen wie in Beispiel 1 aufgeführt eine Aktivität unterhalb 20μΜοΙ/Ι · min ergibt, werden als von Patienten mit einem erworbenem Immundefekt acquired immune deficience syndrome (AIDS) betrachtet.

Wenn Enzymaktivitätsmessungen in der Nähe der Grenzen der vorstehend erwähnten Bereiche liegen, sollten die betreffenden Untersuchungen wiederholt werden. Wenn keine exakte Bestimmung gemacht werden kann, ist das Serum oder Plasma als „nicht zuzuordnen" zu betrachten.

Durch die Untersuchung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein Überprüfungstest zum Diagnostizieren des Vorhandenseins seiner speziellen Lymphozyten-T-Zellfunktion, wie sie bei Patienten mit erworbenem Immundefekt acquired immune deficience syndrome (AIDS) gestört sein kann, zur Verfugung gestellt, der eine Zuverlässigkeit von etwa 80% hat, wie aus den Angaben in den nachstehenden Beispielen hervorgeht.

Diese Beispiele zeigen auch, daß das Vorhandensein von anderen Erkrankungen und körperlichen Problemen kaum einen wesentlichen Einfluß auf die Ergebnisse des erfindungsgemäßen Verfahrens hat. Nur bei Patienten mit Leberzellschäden oder einer Alteration der Gallenwege sind infolge der verstärkten Freisetzung einer Leber- oder Galienwege spezifischen Dipeptidylpeptidase IV-Aktivität in das Blut, Minderungen der Aktivität des Enzyms, wie sie als Maß einer speziellen Lymphozyten-T-Zellfunktion, die durch ein von außen auf den Säugetierorganismus einwirkendes Agens wie z. B. des HTLV Ill-Virus eintreten können, durch die gleichzeitige Erhöhung der Dipeptidylpeptidasegesamtaktivität des Blutes falsch negative Ergebnisse zu erwarten.

Es ist gegenwärtig nicht bekannt, in welcher Stufe der Einwirkung des von außen in den Säugetierorganismus eingetretenen Agens, wie z. B. das Virus HTLV III, die durch das Virus hervorgerufene Veränderung der speziellen Lymphozyten-T-Zellfunktion anhand der Dipeptidypeptidase IV-Aktivität im Serum oder Plasma erstmalig nachgewiesen wird. Wie aus den Beispielen hervorgeht, die HTLV HI-positiven Personen wiesen noch keine typische klinische Symptomatik auf, scheint die Untersuchung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eine frühe Erkennung des Vorhandenseins eines erworbenen Immundefektes acquired immune deficience syndrome (AIDS) zu ermöglichen, wodurch beispielsweise die Chance für frühzeitige Therapieversuche bzw. die aktive Übertragung des von außen einwirkenden Agens, beispielsweise des HTLV HI-Virus auf andere Person, z. B. durch Blutübertragungen, vermieden werden kann.

Bei den insgesamt 1999 untersuchten Personen wurden selbst unter Einbeziehung von Personen, die auf Grund anderer Erkrankungen niedrige DP IV-Aktivitäten im Serum oder Plasma aufwiesen, nur 112 möglicherweise falsch positive Befunde erhoben (Tab.1); das sind etwa 6%.

Beispiel 1:

Bevölkerungsgruppe der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren im nachstehenden Beispiel untersuchten Patienten Patienten, männlich und weiblich, aus allen sozialen Schichten wurden gemäß Beispiel 1 untersucht. Die meisten der Patienten waren in der Altersgruppe zwischen 30 und 70. Einige der Patienten waren jedoch erst 13 und andere 92 Jahre alt.

Serum wurde durch Zentrjfugation des gewonnenen Vollblutes, Plasma durch Zentrifugation des mit Antikoagulans, wie EDTA oder Heparin, versetzten Vollblutes gewonnen. Serum bzw. Plasma wurde entweder sofort, d. h. noch am gleichep Tag, nach Lagerung bei Raumtemperatur, dem erfindungsgemäßen Verfahren unterworfen, oder nach Lagerung bei -20⁰C. Das Serum oder Plasma konnte bei -20°C mehrere Wochen lang und bei tiefen Temperaturen (-100⁰C) noch länger gelagert werden.

Normalserum, bzw. Plasmaproben und Serum bzw. Plasma von Personen mit einem erworbenen Immundefekt acquired immune deficience syndrome (AIDS) wurden ausgewählt und angewendet, um den Bereich der Enzymaktivität für sowohl Normalserum- oder plasmaproben, als auch für Serum- oder Plasmaproben von Patienten mit erworbenem Immundefekt acquired immune deficience syndrome (AIDS) festzulegen.

Das Enzymsubstrat Gly-L-Pro-4-Nitroanilid hatte im Messansatz eine Konzentration von 7,5 χ 10~⁴Mol/l.

Zur Herstellung der Reagenzlösung wurden 17,7g Tricin-Puffer in 100ml Wasser gelöst und mit frischer Kalilauge auf pH7,4 gebracht. In dieser Lösung wurden 61,6mg Glycyl-L-Prolyl-4-nitroanilid aufgelöst und die gesamte Lösung mittels Wasser auf 250ml aufgefüllt.

Zur Durchführung des Testes wurden 500 μΙ Reagenzlösung auf 37 ⁰C temperiert und die enzymatische Reaktion durch Hinzugabe von 20μΙ Serum oder Plasma, bei anschließender Vermischung beider Lösungen, gestartet. Die enzymatische Reaktion wurde bei405nm an einem registrierenden Spektralphotometer mit einer Dauer von 3 Minuten für eine Einzelmessung nach dem Starten der Probe quantitativ ausgewertet. Die Enzymaktivitäten wurden entsprechend Formel 1 berechnet:

Formel 1: 2620 χ E = μΜοΙ/Ι · min

E steht für Extinktionsdifferenz pro Minute

Wie in Tabelle 1 gezeigt wird, konnten bei allen untersuchten Patienten quanitative DP IV-Aktivitäten im Serum oder Plasma nachgewiesen werden. Stark erniedrigte DP IV-Aktivitätswerte traten nur bei den Patienten auf, die einen erworbenen Immundefekt acquired immune deficience syndrome (AIDS) aufwiesen.

Von den untersuchten zwei Patienten mit erworbenem Immundefekt ergab die Prüfung eine verminderte Dipeptidylpeptidaseaktivität im Serum bei zwei Patienten eine Übereinstimmung mit dem immunologischen Test des Nachweises von Antikörpern gegenüber dem HTLV Ill-Virus. Etwa 5% der Patienten, bei denen kein immunologischer Test auf HTLV Ill-Viruskörper durchgeführt werden konnten, wiesen verminderte Gesamtdipeptidylpeptidaseaktivitäten im Serum oder Plasma auf.

Tabelle 1:

Ergebnisse der Bestimmung der Dipeptidylpeptidase IV-Aktivität bei verschiedenen Patientengruppen, bei denen immunologisch kein HTLV Ill-Suchtest durchgeführt wurde

Mittelwert

Patient bzw. Art	Patien	niedrigster	höchster	51	72	Testergebnis	negativ	%
der Krankheit	tenzahl		DP IV-Aktivität in μΜοΙ/Ι · min	30	37	positiv	600	100
Gesunde Blutspender	600	28	40	72	0	19	83
Multiple Sklerose	23	15	27	68	4	239	100
Cholecystolithiasis	239	24	62	126	0	98	90
Cholecystitis	109	17	35	59	11	65	100
Choledocholithiasis	65	22			0	66	89
Gastroduodenalulzera	74	16	70	122	8
verschied. Leber						26	100
erkrankungen	26	31	23	49	0
Magen-Darm-Malignom						181	79
ohne Lebermetastasen	228	8	47	145	47
Magen-Darm-Malignom			23	34		99	93
mit Lebermetastasen	106	14	50	•67	7	4	44
Cephagus-Malignom	9	7	23	51	5	32	100
Colorectale Polypen	32	28	42	61	0	7	70
Colitis u Icerosa	10	8	33	51	3	10	83
Polyposis	12	12			2	35	76
Rheumatoid Arthritis	46	12			11
Gravide der 8. bis 38.			30	42
Schwangerschafts			51	71		283	94
woche	300	18	17	118	98
Hypertoniker	120	2	2

Tabelle 2:

Ergebnisse der Bestimmung der Dipeptidylpeptidase IV-Aktivität bei zwei unterschiedlichen Patientengruppen, bei denen immunologische HTLV Ill-Suchteste durchgeführt wurden.

Patientengruppe	DP IV-Aktivität
	ΐημΜοΙ/lmin
Haemophile:
Pat. Nr. 1	46
2	24
3	45
4	39
5	52
6	72
7	72
8	6
9	59
10	66
11	70
12	58
Homosexuelle:
1	40
2	37
3	30
4	39
5	68
6	32
7	31
8	37
9	11

HTLV Ill-Suchtest	педг
positiv	ja
nein	ja
nein	ja
nein	ja
nein	ja
nein	ja
nein	ja
nein	nein
ja	ja
nein	ja
nein	ja
nein	ja
nein	ia
nein	ja
nein	ja
nein	ja
nein	ja
nein	ja
nein	ja
nein	ja
nein	nein
ja

Betspiel 2:

Bevolkerungsgruppe der nach dem erfindungsgemaßen Verfahren im nachstehenden Beispiel untersuchten Patienten — Patienten, männlich und weiblich, aus allen sozialen Schichten wurden gemäß Beispiel 2 untersucht Die meisten der Patienten waren in der Altersgruppe zwischen 30 und 70 Jahren Einige der Patienten waren jedoch erst 13 und andere 92 Jahre alt Blut wurde entsprechend den in der klinischen Laboratonumsdiagnostik an sich üblichen Bedingungen aus der Fingerbeere in mit Heparin imprägnierte Glaskapillaren, wie das zur Bestimmung des Hamatokritwertes an sich allgemein üblich ist, gewonnen Pro Patient wurde eine Glaskapillare gewonnen und entsprechend den fur die Hamatokntbestimmung üblichen Bedingungen nach Verschließen dereinen Kapillarseite zentrifugiert Nach dem Zentrifugieren wurde durch Zerbrechen der Glaskapillare in Plasma und korpuskulare Bestandteile getrennt und der gewonnene Plasmateil tropfenformig auf Filterpapier aufgetragen Das aufgetrocknete Plasma war so fur die Zwecke des erfindungsgemaßen Verfahrens mindestens 5 Tage bei Raumtemperatur lagerfähig Die eigentliche Bestimmung wurde wie folgt ausgeführt

Mittels einer Stanze wurde aus dem aufgetrockneten Plasmafleck ein Papierdiskus von etwa 4,3 mm Durchmesser ausgestanzt und auf eine saubere Piakrylunterlage gelegt, auf die schachbrettartig bis zu 50 g solcher Papierblattchen passen Auf eine zweite Piakrylunterlage wurden spiegelbildlich zur ersten Unterlage Reagenztropfen von je 10μΙ so aufgetragen, daß beim vorsichtigen Zusammenlegen beider Platten Reagenztropfen und Papierdiskus jeweils separat zusammenkommen Zur Vermeidung von Verdunstungseffekten wurde die so gebildete Kammer in einen wasserdampfgesattigten Reaktionsraum, der Raumtemperatur aufwies, gegeben Nach einer Reaktionszeit von Minuten wurden beide Piacrylplatten vorsichtige voneinander angehoben und ein nichtselbstfluoreszierendes oder die Fluoreszenz löschendes Filterpapier wie Filterpapier FN 11 gegeben und beide Piacrylplatten noch einmal in der gleichen geometrischen Lage so aneinandergedruckt, daß die schachbrettartig angeordneten, mit Reaktionslosungen getränkten Papierdisken spiegelbildlichen kreisrunde feuchte Flecke auf dem dazwischen gelegten Filterpapier abbilden

Nach Entnahmen des Filterpapiers wurde das Papier im Trockenschrank getrocknet und anschließend die Fluoreszens visuell gegenüber einem Schwellenwert unter einer UV-Lampe beobachtet Als Schwellenwert verwendeten wir Serum, welches entsprechend den Bedingungen in Beispiel 1 etwa 25μΜο!/Ι min Dipeptidylpeptidaseaktivitat aufwies Die Reaktionslosung setzte sich wie folgt zusammen

Substrat	Gly-Pro-2-Naphthylamid	2 χ	10~4Mol/l
Puffer	Hepes	0,1	Mol/l
pH:	mit KOH eingestellt	7,4

Als positiver Testausfall wurden alle die Seren gewertet, die gegenüber dem Schwellenwert eine verminderte Fluoreszens aufwiesen Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefaßt

Tabelle 3

Ergebnisse der Beurteilung des Dipeptidylpeptidaseaktivitat anhand eines Schwellenwertverfahrens bei gesunden Personen (Blutspender) bei denen bisher kein HTLV Ill-Suchtest durchgeführt wurde und bei Personen, bei denen ein HTLV Ill-Suchtest durchgeführt wurde

Patientenkollektiv Anzahl positiver immunologischer positiver DP IVTestausfall

HTLV Ill-Suchtest in % quantitativ

Blutspender 134 kein Test durchgeführt 1 0,7

Haemophile 11 0 0 0,0

Homosexuelle 8 0 0 0,0

HTLV III positive Patienten 2 2 2 100,0

Claims (1)

1. Verfahren zum Nachweis einer verminderten Lymphozyten T-Zellfunktion, gekennzeichnet dadurch, daß die Aktivität der Dipeptidylpeptidase IV (E. C. 3.4.14.5.) in bekannter Weise im Serum oder Blutplasma bestimmt wird, wobei ein Teststreifen eine Reagenzlösung oder Tablette oder eine Pulvermischung, enthaltend ein typisches Substrat der Dipeptidylpeptidase IV mit der allgemeinen Formel Xaa-Pro-Y, wobei Y einen chromophoren, fluorogenen oder mit Diazoniumsalzen kupplungsfähigen Rest darstellt, sowie Hilfsstoffe zur Einstellung geeigneter Bedingungen für die Aktivitätsmessung, verwendet wird.

   Anwendungsgebiet der Erfindung

   Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung einer speziellen Lymphozyten-T-Zellfunktion in biologischen Materialien, wie sie z. B. in der Laboratoriumsdiagnostik anfallen.

   Die Bestimmung der gegenüber einem gesunden Referenzkollektiv im Serum oder Plasma verminderten Enzymaktivität gegenüber den spezifischen Substraten des Enzyms Dipeptidylpeptidase IV (DP IV) kann als Maß einer veränderten speziellen Lymphozyten-T-Zellfunktion benutzt werden. Diese Bestimmung kann bei Patienten mit erworbenem Immundefekt acquired immune deficiency syndroms (AIDS) diagnostische Bedeutung haben.