DD232510A1 - Verfahren zur herstellung von lambda-blv-rekombinantenklonen - Google Patents

Abstract

Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Veterinaermedizin, speziell die Diagnose und die Immunprophylaxe der enzootischen Rinderleukose. Die Erfindung hat das Ziel, eine biotechnologische Herstellung von BLV-Proteinen zu ermoeglichen, die dann als Antigene fuer die Diagnostik und Immunprophylaxe der enzootischen Rinderleukose verwendet werden koennen. Aus permanent BLV-infizierten foetalen Lammnierenzellen wurde die DNA, die im Genom drei BLV-Proviren enthaelt, isoliert und mit der Restriktionsendonuklease EcoRI fragmentiert. Die BLV-DNA-haltigen Fragmente wurden elektrophoretisch angereichert und in die DNA des lambda-Spi-Selektionsvektors 2558 eingefuegt. Nach in vitro-Verpackung wurden die Rekombinantenphagen auf dem Selektionswirt E. coli Q359 ausplattiert. Mittels Filterhybridisierung konnten aus 500 000 Rekombinanten-Klonen vier BLV-DNA-haltige Phagenklone isoliert werden. Mit dem erfindungsgemaessen Verfahren werden BLV-DNA-Klone enthalten, die ca. 90% des BLV-Provirus und zusaetzlich 5-flankierende zellulaere Sequenzen enthalten. Diese flankierenden zellulaeren Sequenzen haben regulative Eigenschaften, die fuer eine Expression von BLV-Polypeptiden mit hoher Ausbeute notwendig sind.

Description

Abb. 1 b FGB-10-4-3' von 1 bis 226 : Teilsequenz gp30

AATTGG GAT CTG GGG CTC ACT GCC TGG CTG CGA GAA ACC ATT CATTCT Asn-Trp-Asp-Leu-Gly-Leu-Thr-Als-Trp-Val-Ars-Glu-Thr-Ile-His-Ser-GTTCTAAGCCTGTTCCTATTAGCCCTTTTTTTGCTCTTCCTGGCCCCC Val-Leu-Ser-Leu-Phe-Leu-Leu-Als-Leu-Phe-Leu-Leu-Phe-Leu-Als-Pro-

TGC CTG ATA AAA TGC TTG ACC TCT CGC CTTTTA AAG CTC CTC CGG CAG Cys-Leu-Ile-Lys-Cys-Leu-Thr-Ser-Ars-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Ars-Gln-

GCTCCCCACTTCCCTGAAATCTCCTTAACTCCTAAACCCGATTCTGAT Ala-Pro- H is-Phe-Pro-G Iu-I le-Ser- Leu -Th r-Pro-Ly s-Pro-Asp-Ser-Asp-

TAT CAG GCC TGG CTA CCA TCT GCA CCA GAG ATC Tyr-Gln-Ala-Leu-Leu-Pro-Ser-Ala-Pro-Glu-Ile-

Hierzu 1 Seite Zeichnung

Anwendungsgebiet der Erfindung

Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Veterinärmedizin, speziell die Diagnose und die Immunprophylaxe der enzootischen Rinderleukose.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Für die bereits durchgeführten molekularen Klonierungen von DNA des bovinen Leukämievirus (BLV) beschriften die einzelnen Autoren prinzipiell verschiedene Wege.

1. Liebscher et al. (WP 153893) klonierten c-DNA, die durch Umschreibung von viraler RNA mittels reverser Transkriptase erhalten worden war, sowie nichtintegrierte BLV-DNA im Plasmid pBR 322.

Sie isolierten Klone, deren BLV-DNA-Inserte max. eine Größe von 1400 Bp aufwiesen.

In dem erwähnten Patent wird weiterhin vermutet, aber nicht experimentell belegt, daß die in zellulärer DNA integrierte BLV-DNA herausgeschnitten und ebenfalls zur Klonierung von BLV-Nukleotidsequenzen verwendet werden kann.

2. Deschamps et al. (J.Virol. 40,605 [1981]) und Sagata et al. (Gene 26,1 [1983]) setzten für die Klonierung integrierte BLV-DNA ein, die aus BLV-induzierten Tumoren isoliert worden war. Das Provirus konnte in einem lambda-Vektorfast komplett kloniert werden. Es wurde jedoch gezeigt, daß aus Tumor-DNA isolierte Proviren zahlreiche Punktmutationen und auch Deletionen aufweisen, diese DNA-Sequenzen also nicht mehr denen des infektiösen Virus entsprechen.

3. Kashmiri et al. (J.Virol. 49,583 [1984]) gelang es, aus BLVnnfizierten Fledermaus-Lungenzellen nichtintegrierte provirale BLV-DNA zu isolieren und in einem lambda-Vektor zu klonieren.

Dieser BLV-DNA-Klon ist der erste, der die komplette und unveränderte BLV-Sequenz enthält.

Um die BLV-Sequenzen jedoch für eine biotechnologische Proteinherstellung einsetzen zu können, ist es nötig, sie in sog.

Expressionsvektoren, die u.a. geeignete Regulationssequenzen enthalten müssen, einzufügen.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, eine biotechnologische Herstellung von BLV-Proteinen zu ermöglichen, die dann als Antigene für die Diagnostik und Immunprophylaxe der enzootischen Rinderleukose verwendet werden können.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen BLV-DNA-Klon zu isolieren, der den größten Teil des BLV-Provirus sowie angrenzende zelluläre Regulationssequenzen enthält. Dieser BLV-DNA-Klon soll geeignet sein, nach Kopplung mit Vektoren, in pro-oder eukaryotischen Zellsystemen BLV-Polypeptide zu exprimieren.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von lambda-BLV-Rekombinanten zeichnet sich dadurch aus, daß man aus kultivierten fötalen Lammnierenzellen (FLK, fetal lamb kidney), die permanent mit dem bovinenLeukämiervirus infiziert sind und in ihrer zellulären DNA pro hapioidem Genom drei Proviren in integriertem Zustand enthalten, die Gesamt-DNA isoliert und mit der Restriktionsendonuklease Eco Rl fragmentiert, diese Fragmente elektrophoretisch auftrennt und die BLV-DNA enthaltende Fraktion gewinnt.

Dann wird DNA aus geeigneten lambda-Vektorphagen isoliert und ebenfalls mit Eco Rl gespalten. Anschließend werden beide Fraktionen gemischt und mit T4-Ligase ligiert, die entstandene Rekombinationen-DNA mit Verpackungsextrakten inkubiert, die dadurch gebildeten infektiösen Rekombinantenphagen auf einem geeigneten Bakterienrasen ausplattiert, auf dem Rasen entstehende Plaques mittels Filterhybridisation unter Verwendung einer radioaktiven BLV-Sonde auf Anwesenheit von BLV-DNA geprüft. Die positiven Klone werden selektiert, Ausplattierung und Filterhybridisation gegebenenfalls wiederholt. Eine besonders vorteilhafte Ausführungsform des Verfahrens besteht darin, die Phagen-DNA aus dem Spilambda-Selektionsvektor 2558 zu gewinnen und die Ausplattierung auf dem Wi rtE.coliQ359 durchzuführen. Da sich auf dem Wirt Q359 nur Spi-Vektor-Rekombinanten vermehren können, nicht aber der Vektor-Wildtyp, kann die sonst vor der Ligation der Insert-DNA mit dem Vektor nötige, sehr aufwendige Isolation der lambda-„Phagenarme" entfallen.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren werden BLV-DNA-Klone erhalten, die ca. 90% des BLV-Provirus enthalten (vom 5'-Ende ausbiszumEcoRI-Schnittort), dazu noch flankierende zelluläre Sequenzen. Der BLV-Rekombinanten-Klon Nr. HU-1 hatfolgende Eigenschaften:

— eine spezifische BLV-Sequenz von 8,1 kb Länge

— am 5'-Ende zelluläre flankierende Sequenzen von mindestens 2,4 kb Länge und

— Restriktionsorte für Sac I, Sal I, Bam H1,Xhol und Hind III.

Die inserte spezifische BLV-Sequenz enthält die in Abb. 1 a-1 c abgebildeten Sequenzen.

Die flankierenden zellulären Sequenzen am 5'-Ende haben regulative Eigenschaften, die für eine Expression von BLV-Polypeptiden mit hoher Ausbeute notwendig sind.

Die Restriktionsorte des BLV-Rekombinanten-Klons HU-1 sind in Abb. 2 dargestellt.

Der lambda-Rekombinanten-Klon HU-1 kann, g. g.f. nach erneuter Fragmentierung und Reklonierung in geeignete Expressionsvektoren, Polypeptide exprimieren. Eine Fragmentierung ist insbesondere dann zweckmäßig, wenn nicht sämtliche vom BLV-DNA-Rekombinanten-Klon HU-1 kodierten Polypeptide hergestellt werden sollen, sondern nur ausgewählte Vertreter.

Diese Polypeptide sind als Antigene für die Diagnostik und Immunprophylaxe der enzootischen Rinderleukose einsetzbar.

Der BLV-DNA-Rekombinanten-Klon HU-1 wurde in der ZIMET-Hinterlegungsstelle unter der Nr. ZIMET11 085 hinterlegt.

Ausführungsbeispiel

Die Erfindung soll nachfolgend durch ein Beispiel näher erläutert werden.

Beispiel 1:

Alle Methoden wurden, falls nicht anders erwähnt, so wie von Maniatis et al. (Molecular Cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. [1982]) beschrieben, durchgeführt. Präparation hochmolekularer FLK-DNA

Aus einer permanent BLV-infizierten fötalen Lammnierenzellinie (FLK, von der Maaten-Zellinie), die pro hapioidem Genom drei BLV-Proviren enthält und kontinuierlich BLV produziert, wurde nach BHn und Stafford (Nucleic Acids Research 3,2303 [1976]) hochmolekulare DNA mit einer durchschnittlichen Kettenlänge von « 80-100 kb präpariert. Dazu wurden die FLK-Zellen mit Natriumdodecylsulfat lysiert, mit Proteinase K behandelt, dann mit Phenol und Phenol/Chloroform ausgeschüttelt, mit RNase inkubiert, nochmals mit Phenol und Phenol/Chloroform ausgeschüttelt und schließlich die DNA mit Äthanol gefällt. Aus 10⁹FLK-Zellen wurden etwa 2,5 mg DNA erhalten

Southern-Hybridisationsanalyse:

Die hochmolekulare FLK-DNA wur ie mit der Restriktionsendonuklease Eco Rl (Boehringer, Mannheim GmbH) vollständig gespalten. Mit einem Aliquot wurde eine Elektrophorese in 0,5 %igerAgarose durchgeführt. Anschließend erfolgte ein Southern-Transfer und eine Hybridisation mit ³²P-BLV-DNA. BLV-DNA konnte im Bereich von ca. 8 bis 12 kb (3 Banden) nachgewiesen werden.

Isolation der BLV-DNA-haltigen Eco Rl-Fragmente

Mit der vollständig Eco Rl-gespaltenen FLK-DNA wurde eine präparative Elektrophorese in 0,5%iger niedrigschmelzender Agarose (Miles Labroatories, Stoke Poges) durchgeführt. Die Fraktion von 8 bis 12 kb wurde herausgeschnitten, bei 65⁰C geschmolzen, mit Puffer verdünnt und die DNA-Fragmente mit Äthanol gefällt. Aus 110^g EcoRI-gespaltener DNA konnten 2^g BLV-DNA-haltige DNA-Fragmente isoliert werden

Vektor:

Für die KSonierung wurde der lambda-spiTSelektionsvektor 2 558 benutzt (von Kam und Brenner konstruiert, unpubliziert). Der Vektor wurde in E. coli Q 358 vermehrt (2.1O¹⁰ pfu/ml), gereinigt, die DNA isoliert und mit Eco Rl gespalten.

-3- 704 63

Ligation:

Die BLV-DNA-haltigen Eco Rl-Fragmente wurden mit der Eco Rl-gespaltenen Vektor-DNA im Verhältnis 1:4 gemischt und mittels T4-DNA-Ligase (Boehringer, Mannheim GmbH) verknüpft.

in vitro-„Verpackung"

Mittels der in vitro-„Verpackungs"-Reaktion wird lambda-DNA mit Phagenhüllen versehen und es entstehen infektiöse Partikel.

Das dazu nötige Frier- und Tau-Lysat wurde aus induzierten E.coli BHB2671-Zellen und das Ultraschall-Lysat aus induzierten E.coli BHB2673-Zellen präpariert. Die Verpackungsreaktion erfolgte in einem speziellen ATP-haltigen Puffer nach Zugabe der ligierten Vektor-DNA, des Frier- und Tau-Lysates und des Ultraschall-Lysates. Die entstandenen Rekombinantenphagen werden mittels einer Cäsiumchlorid-Gradientenzentrifugation gereinigt und konzentriert. Aus 1 μg ligierter Vektor-DNA werden etwa 5.

10^svermehrungsfähige Rekombinantenphagen erhalten.

Screening:

Die Rekombinanten werden auf dem Selektionsstamm E.coli Q359 ausplattiert und die entstandenen Phagenplaques mittels Filterhybridisation getestet. Die Zellulosenitrat-Filter (SM 11306, Sartorius GmbH, Göttingen) werden in wäßriger Lösung für 15 Std. bei 65⁰C mit³²P-BLV-DNA hybridisiert (spez. Aktivität 1 · 10⁸ cpm/jug DNA). Röntgenfilm (HS 11, ORWO Wolfen) wurde unter Verwendung von Intensivierungsfolie (Perlux Extra rapid, VEB Kalichemie Berlin) mit den Zellulosenitratfiltern drei bis fünf Tage bei -7O⁰C exponiert. Die durch Filmschwärzung lokalisierten BLV-positiven Phagenklone wurden durch wiederholtes ausplattieren und darauffolgender Filterhybridisation angereichert und gereinigt. Es wurden etwa 500000 Rekombinatenklone geprüft und vier BLV-positive Klone isoliert.

Restriktionsanalyse des lambda-BLV-Klons HU-1:

Einer der vier positiven Klone wurde in E.coli Q359 vermehrt, die DNA isoliert und eine Restriktionsanalyse durchgeführt.

Die Spaltung mit Eco Rl zeigt, daß das klonierte Insert etwa 10,5 kb lang ist. Bei der Spaltung mit weiteren fünf Restriktionsendonukleasen (Sacl, Sail, Bam Hl, Xhol, Hind IM) entstanden die in Tab. 1 aufgelisteten Fragmente. Durch Vergleich mit den Daten der Restriktionsanalyse des Monierten nichtintegrierten BLV (Kashmiri et al., J. Virol. 43,583 (1984) ergibt sich, daß der Klon lamdba-BLV HU-1 8,1 kb (90%) des BLV-Provirus sowie 2,4 kb 5'-flankierende zelluläre Sequenzen enthält.

Partielle Sequenzanalyse:

Von einem Teil des Klons HU-1 wurde die DNA-Sequenz bestimmt (Abb. 1 a-1 c).

Claims (2)

1. -1- /U4G3

   Patentansprüche

   1. Verfahren zur Herstellung von lambda-BLV-Rekombinantenklonen, gekennzeichnet dadurch, daß man

   a) aus kultivierten fötalen Lammnierenzellen, die permanent mit dem bovinen Leukämievirus infiziert sind und in ihrer zellulären DNA das Provirus in integriertem Zustand enthalten, die Gesamt-DNA isoliert und mit der Restriktionsendonuclease Eco Rl fragmentiert, diese Fragmente elektrophoretisch auftrennt und die BLV-DNA enthaltende Fraktion gewinnt,

   b) die DNA aus geeigneten lambda-Phagen isoliert und ebenfalls mit EcoRI spaltet, beide Fraktionen mischt und mit T4-Ligase ligiert, die entstandene Rekombinanten-DNA mit Verpackungsextrakten inkubiert, die dadurch gebildeten infektiösen Rekombinantenphagen auf einem geeigneten Bakterienrasen ausplattiert, auf dem Rasen entstehende Plaques mittels der Filterhybridisationstechnik unter Verwendung einer radioaktiven BLV-Sonde auf Anwesenheit von BLV-DNA prüft, die positiven Klone selektiert und die Ausplattierung gegebenenfalls wiederholt.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1,dadurch gekennzeichnet, daß die Phagen-DNA aus dem spi-lambda-Selektionsvektor 2558

   gewonnen wird und die Ausplattierung auf dem Wirt E. coli Q 359(ZIMET11085) erfolgt. · _

   Abb. 1 a~FBG-1Ö-4-"5' von 1 bis 200TTeiisequenz gp51

   GGA TCC TTT TAT GTC AAT CAT CAG ATT TTA TTC CTG CAT CTT AAA CAA Gly-Ser-Phe-Tyr-Val-Asn-His-Gln-lle-Leu-Phe-Leu-His-teu-Lys-Gln-TCT CAT GGA ATT TTC ACT CTA ACC TGG GAG ATA TGG GGA TAT GAT CCC Cys-His-Gly-Ile-Phe-Thr-Leu-Thr-Trp-Glu-Ile-Trp-Gly-Tyr-Asp-Pro-CTG ATC ACC TTT TCT TTA CAT AAG ATC CCT GAT CCC GCT CAA CCC GAC Leu-Ile-Thr-Phe-Ser-Leu-His-Lys-Ile-Pro-Asp-Pro-Pro-Gln-Pro-Asp-TTT CCC CAG TTG AAC AGT GAC TGG GTT CCC TCT GTC AGA TCA TGG GCC Phe-Pro-Gln-Leu-Asn-Ser-Asp-Trp-Val-Pro-Ser-Val-Ars-Ser-Trp-Als-CTG-CTT
   Leu-Leu-Abb. 1cFXG-10-4-5'von 1 bis 291 : Teilsequenz x-Region

   CTCGAGCCGC AACCTCCCTTTC I I TT CCACCCTCGC AAGGCCCCGG GTTCTGAGCC CCCTAACGGA GGTTCAAAAT TTCCTCTACT AGGGGATGCT CGGGTCCAAG TGTGCACAAT ATCTCTTCCAAAAGGTCCTG ATGAACGTCTTCCCATGTAA CAAGCCCCAG CAGAGACATT CCAGCCACAT CCAGCAGCAT TTGGGCCGCC TTTTCTAAGA GTGCCCATAA AGTCCCTTCC GTTTCCACAA GGCCTGCCTC TGCATCTTCT ATTTCCACCT CGGCACCCAC T