DD228739A1

DD228739A1 - Verfahren zur gewinnung zellulaer-partikulaerer risistenzfaktoren

Info

Publication number: DD228739A1
Application number: DD25038983A
Authority: DD
Inventors: Peter Solisch; Helmut Bergmann; Harald Granzow
Original assignee: Friedrich Loeffler Inst Insel
Priority date: 1983-04-29
Filing date: 1983-04-29
Publication date: 1985-10-23

Abstract

Das erfindungsgemaesse Verfahren zur Herstellung zellulaer-partikulaerer Resistenzfaktoren (ZEPARE) als Biotherapeutikum (ZEPARETH) ist eine Erfindung auf dem Gebiet der Zytologie mit dem Ziel physiologische Zellprodukte zur Substitutionstherapie in der Human- und Veterinaermedizin einzusetzen. ZEPARE sind charakterisiert durch Morphologie, Morphogenese, therapeutische Wirksamkeit sowie durch Unschaedlichkeit. Das aus embryonalen, aviaeren und kultivierten Zellen durch Reinigungs- und Anreicherungsverfahren hergestellte ZEPARETH findet Anwendung zur Therapie von Virus- und Tumorerkrankungen in der Human- und Veterinaermedizin.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft die Nutzbarmachung eines neuen biologischen Wirkungsprinzips: Verfahren zur hochgereinigten Gewinnung von zellulär-partikulären Resistenzfaktoren (ZEPARE) und ihre Anwendung in der Human- und Veterinärmedizin als zellulär-partikuläres Resistenzfaktoren-Therapeutikum (ZEPARETH).

Charakteristika der bekannten technischen Lösungen

Die vorliegenden Wirtschaftspatente mit Erfindungsansprüchen analoger Zielsetzung sind: DD 125 748, DD 137 785, DD 144 359, DD 145 705 und DD 156 667. Die in den genannten Erfindungen angegebenen Lösungswege wurden als Verfahren bezeichnet, die zur Gewinnung von Viren und von löslichen fetalen Proteinen geeignet sind. Ein wesentlicher Schritt dieser Verfahren ist die Anwendung von Detergenzien.

Ziel der Erfindung

Oer nützliche Effekt der Erfindung, der im Vergleich zu den bereits bekannten Lösungen erreicht wird, besteht in Folgendem: ZEPARE werden insbesondere aus aviären, embryonalen, kultivierten oder aus permanenten, durch virale bzw. biochemische Stimuli angeregte Zellen oder anderen eukaryotischen Zellen gewonnen, gereinigt und zu einem Therapeutikum (ZEPARETH) aufgearbeitet, wobei Detergenzienbehandlung und infektiöse aber auch immunisierende Wirkungen von Viren weitgehend oder völlig vermieden werden muß. Diesem Vorgehen liegt die Absicht zugrunde ZEPARETH zur Behandlung von Tumor- und Viruserkrankungen des Menschen und der Nutztiere einzusetzen und Unschädlichkeit zu garantieren.

Im Gegensatz zu bekannten Lösungen wird die Wirksamkeit durch die Anwendung physiologischer Substanzen und die Unschädlichkeit durch das Fehlen von dem Organismus fremden Informationsträgern (viraler Nukleinsäuren) bedingt.

Wesen der Erfindung

Der Erfindung liegt die ultrastrukturelle Beobachtung zugrunde, daß sich differenzierende, embryonale, permanente, blbphysikalfsch-biochemisch geschädigte ün’d virusinfizierte eukäryotische Zellen ZEPARE produzieren. ZEPARE werden repräsentiert durch 20 bis 60 nm große, sphärische Partikeln mit fakultativem elektronendichtem Innenkörper. Die Partikeln sind eingeiagert in eine wenig strukturierte oder stark elektronendichte Matrix und befinden sich in zytoplasmatischen Vakuolen. Die Bildung von ZEPARE scheint an den Membranen oder in deren Nähe zu erfolgen. Durch Öffnung der zytoplasmatischen Vakuolen / . oder durch Zellzerstörung gelangen ZEPARE in den extrazelluiären Raum, in einigen Fällen eingebettet in Zellresten. ZEPARE werden in ihrer Unversehrtheit durch Chioroformbehandlung verändert (Schädigung der Hülle). Ihre Reindarstellung ist durch Negativkantrastierung im Elektronenmikroskop feststellbar. Die Reindarstellung erfolgt nach Zelldestruktion, Abtrennung von andersartigen Zellbestandteiien und Konzentration. Ultrastrukturelle Vergleichsbeobachtungen (ZEPARE in Kapillarendothelzeilen des Myokard [Schwein, Schaf] bei Virusinfektion [Schweinepest, Rinderleukose], in BHK-21-Zellen nach MKS-Virusinfektion und Glukoseshift, in van der Maaten-Zeilen bei Reolikation von Rinderleukosevirus u. a.) und Therapieversuche (SOUSCH, P., BERGMANN, H., LIEBERMANN, H., HNO-Praxis 8, 113-117, 1983) führten zu der Bezeichnung „ZEPARE" und zu folgender Hypothese ihrer Funktion: ZEPARE sind hormonartige Sekretionsprodukte zur Wahrung bzw. Wiedererlangung des physiologischen intrazellulären Informationstransfer. Von der Zelle abgegeben dienen sie allen Zelien im System. ZEPARE bilden ein phylogenetisch ursprüngliches Prinzip zur Sicherung des physiologischen Ablaufes der Embryogenese, des Schutzes vor Onkogenen, Viren und anderen das zelluläre Informationssystem verändernder Einflüsse. Sie werden im Verlaufe der gesamten Labensspanne bei Säugern u. a. von Endothelzellen produziert. ZEPARE besitzen Interspezies-Wirksamkeit, ihre therapeutische Anwendung stellt eine biogene Substitutionstherapie dar.

Die Indikation für ZEPARETH lautet: Virusbedingte und tumoröse Erkrankungen. Es wurde gefunden, daß insbesondere aviäre, embryonale, kultivierte und stimulierte permanente Zellen ZEPARE in großen Mengen produzieren, daß diese mit Hilfe biophysikalischer und biochemischer Verfahren (Fällungen, Ultrazentrifugation u. a.) hochgereinigt dargesteilt und daß das zur Anwendung fertiggestelite Therapeutikum durch zusätzliche Inaktivierungsmaßnahmen von unerwünschten endogenen biologischen Informationsträgern freigehalten werden können.

Anwendungsbeispiele ZEPARETH wird biotechnisch hergesteilt aus: A) Entenvollembryonen B) Kälbernieren C) BHK-21-Zellen D) van der Maaten-Zeilen

Das Herstellungsverfahren kann folgende Einzelschritte umfassen: Fragmentierung der Gewebe; Anlage von Zellkulturen in Rollereinrichtung; Bebrütung über das Schließen des Zellrasens hinaus; stimulierende Virusinfektion (z. B. apathogene Picornaviren) oder Glukoseshift bei permanenten Zellen (z. B. BHK-21 -Zellen); Ernte und Sedimentierung der Kulturzellen; Aufnahme des Sediments in serumfreier gepufferter Lösung; Aufschließung der Kulturzellen; Abtrennung unerwünschter Zellbestandteiie durch Gefrier-Tau-Zyklus oder anderer Verfahren und Zentrifugation; ZEPARE in der wäßrigen Phase; Ultrazentrifugation; Aufnahme des ZEPARE-Sediment in Tris-Puffer; Abtrennung letzter Fremdbestandteile durch Zentrifugation; Aufnahme des Überstandes; Inaktivierung; Annullierung von ZEPARETH; Prüfung auf Freisein von mikrobiellen Kontaminanten insbesondere von Viren; Prüfung auf Erhaltungszustand und Menge von ZEPARE im ZEPARETH. Gegenüber diesen einfachen Präparationsschritten sind auch moderne Verfahren derTrennung biogener Stoffe geeignet (HOSTETTMANN, K.r Naturwissenschaften 70,186-189, 1983).

Claims

- 1 - 503 89

Erfindungsanspruch:

Verfahren zur Gewinnung zellulär-partikulärer Resistenzfaktoren als Therapeutikum gegen Virus- und Tumorerkrankungen, gekennzeichnet dadurch, daß eukariotische Zellen, insbesondere aviäre, embryonale kultivierte und durch Virusinfektion oder Giucoseshift stimulierte permanente Zellen in an sich bekannter Weise isoliert und gereinigt, vorzugsweise in Roiler- oder Suspensionskultur gewonnen, mit Ultraschall destruiert, anschließend in gepufferter physiologischer Salzlösung resuspendiert und von unerwünschten Zellbestandteilen durch Zentrifugation befreit werden, und daß das Sediment aus dem Überstand durch Ultrazentrifugation oder andere Trennungsverfahren abgetrennt und in gepufferte physiologische Salzlösung eingeleitet wird.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft die Nutzbarmachung eines neuen biologischen Wirkungsprinzips: Verfahren zur hochgereinigten Gewinnung von zellulär-partikulären Resistenzfaktoren (ZEPARE) und ihre Anwendung in der Human- und Veterinärmedizin als zellulär-partikuläres Resistenzfaktoren-Therapeutikum (ZEPARETH).

Charakteristika der bekannten technischen Lösungen

Die vorliegenden Wirtschaftspatente mit Erfindungsansprüchen analoger Zielsetzung sind: DD 125 748, DD 137 785, DD 144 359, DD 145 705 und DD 156 667. Die in den genannten Erfindungen angegebenen Lösungswege wurden als Verfahren bezeichnet, die zur Gewinnung von Viren und von löslichen fetalen Proteinen geeignet sind. Ein wesentlicher Schritt dieser Verfahren ist die Anwendung von Detergenzien.

Ziel der Erfindung

Der nützliche Effekt der Erfindung, der im Vergleich zu den bereits bekannten Lösungen erreicht wird, besteht in Folgendem: ZEPARE werden insbesondere aus aviären, embryonalen, kultivierten oder aus permanenten, durch virale bzw. biochemische Stimuli angeregte Zellen oder anderen eukaryotischen Zellen gewonnen, gereinigt und zu einem Therapeutikum (ZEPARETH) aufgearbeitet, wobei Detergenzienbehandlung und infektiöse aber auch immunisierende Wirkungen von Viren weitgehend oder völlig vermieden werden muß. Diesem Vorgehen liegt die Absicht zugrunde ZEPARETH zur Behandlung von Tumor- und Viruserkrankungen des Menschen und der Nutztiere einzusetzen und Unschädlichkeit zu garantieren.

Im Gegensatz zu bekannten Lösungen wird die Wirksamkeit durch die Anwendung physiologischer Substanzen und die Unschädlichkeit durch das Fehlen von dem Organismus fremden Informationsträgern (viraler Nukleinsäuren) bedingt.

Wesen der Erfindung

Der Erfindung liegt die ultrastrukturelle Beobachtung zugrunde, daß sich differenzierende, embryonale, permanente, biöphysikalisch-biochemisch geschädigte "und virusinfizierte eukaryotische Zellen ZEPARE produzieren. ZEPARE werden repräsentiert durch 20 bis 60 nm große, sphärische Partikeln mit fakultativem elektronendichtem Innenkörper. Die Partikeln sind eingelagert in eine wenig strukturierte oder stark elektronendichte Matrix und befinden sich in zytoplasmatischen Vakuolen. Die Bildung von ZEPARE scheint an den Membranen oder in deren Nähe zu erfolgen. Durch Öffnung der zytoplasmatischen Vakuolen . odsr durch Zellzerstörung gelangen ZEPARE in den extrazellulären Raum, in einigen Fällen eingebettet in ZeNresten. ZEPARE werden .in ihrer Unversehrtheit durch Chioroformbehandlung verändert (Schädigung der Hülle). Ihre Reindarstellung ist durch Negativkantrastierung im Elektronenmikroskop feststellbar. Die Reindarsteliung erfolgt nach Zeildestruktion, Abtrennung von andersartigen Zallbestandteilen und Konzentration. Ultrastrukturelle Vergieichsbeobachtungen (ZEPARE in Kapillarendothelzeilen des iVtyokard [Schwein, Schaf] bei Virusinfektion [Schweinepest, Rinderleukose], in BHK-21 -Zellen nach MKS-Virusinfektion und Glukoseshift, in van der Maaten-Zeilen bei Replikation von Rinderleukosevirus u. a.) und Therapieversuche (SOLISCH, ?., BERGMANN, H., LIEBERMANN, H., HNO-Praxis8, 113-117, 1983) führten zu der Bezeichnung „ZEPARE" und zu folgender Hypothese ihrer Funktion: ZEPARE sind hormonartige Sekretionsprodukte zur Wahrung bzw. Wiedererlangung des physiologischen intrazellulären Informationstransfer. Von der Zelle abgegeben dienen sie allen Zelien im System. ZEPARE bilden ein phylogenetisch ursprüngliches Prinzip zur Sicherung des physiologischen Ablaufes der Embryogenese, des Schutzes vor Onkogenen, Viren und anderen das zelluläre Informationssystem verändernder Einflüsse. Sie werden im Verlaufe der gesamten Lebensspanne bei Säugern u. a. von Endothelzellen produziert. ZEPARE besitzen Interspezies-Wirksamkeit, ihre therapeutische Anwendung stellt eine biogene Substitutionstherapie dar.

Die Indikation für ZEPARETH lautet: Virusbedingte und tumoröse Erkrankungen. Es wurde gefunden, daß insbesondere aviäre, embryonale, kultivierte und stimulierte permanente Zeilen ZEPARE in großen Mengen produzieren, daß diese mit Hilfe biophysikalischer und biochemischer Verfahren (Fällungen, Ultrazentrifugation u. a.) hochgereinigt dargestellt und daß das zur Anwendung fertiggestellte Therapeutikum durch zusätzliche Inaktivierungsmaßnahmen von unerwünschten endogenen biologischen Informationsträgern freigehalten werden können.

Anwendungsbeispiele

ZEPARETH wird biotechnisch hergestellt aus:

A) Entenvollembryonen

B) Kälbernieren

C) BHK-21-Zellen

D) van der Maaten-Zellen

Das Herstellungsverfahren kann folgende Einzelschritte umfassen: Fragmentierung der Gewebe; Anlage von Zelikulturen in Rollereinrichtung; Bebrütung über das Schließen des Zellrasens hinaus; stimulierende Virusinfektion (z. B. apathogene Picornaviren) oder Glukoseshift bei permanenten Zellen (z. B. 8HK-21-Zellen); Ernte und Sedimentierung der Kulturzellen; Aufnahme des Sediments in serumfreier gepufferter Lösung; Aufschließung der Kulturzellen; Abtrennung unerwünschter Zellbestandteiie durch Gefrier-Tau-Zykius oder anderer Verfahren und Zentrifugation; ZEPARE in der wäßrigen Phase; Ultrazentrifugation; Aufnahme des ZEPARE-Sediment in Tris-Puffer; Abtrennung letzter Fremdbestandteile durch Zantrifugation; Aufnahme des Überstandes; Inaktivierung; Ampullierung von ZEFARETH; Prüfung auf Freisein von mikrowellen Kontaminanten insbesondere von Viren; Prüfung auf Erhaltungszustand und Menge von ZEPARE im ZEPARETH. Gegenüber diesen einfachen Präparationsschritten sind auch moderne Verfahren der Trennung biogener Stoffe geeignet (HOSTETTMANN, K., Naturwissenschaften 70, 186-189, 1983).