CZ54897A3 - Dimer of trefoil peptide - Google Patents

Description

Předkládaný vynález se týká dirnerů trojlístkových peptidů, způsobu jejich přípravy, farmaceutických prostředků, které je obsahují a jejich použití pro léčení gastrointestinálních poruch.

Dosavadní stav techniky

Trojlístkové peptidy tvoří skupinu, která se vyskytuje hlavně ve spojení $ gastrointestinálním traktem Trojlístkové peptidy savců obsahují jednu nebo několik trojlístkových domén (Thim a kol. 1989), kde je každá tvořena 38 nebo 39 aminokyselinami, se šesti cysteiny spojenými v konfiguraci 1-5, 2-4 a 3-6 za vzniků Charakteristické trojlístkové struktury (Thim 1989).

Dosud známé trojlístkové peptidy savců obsahují jednu nebo dvě trojlístkové domény (přehled viz. Thim, 1994, Poulsom a Wřight, 1993; Hoffmann a Hauser, 1993). Jsou popsány žabí (Xenopus leavis) peptidy a proteiny obsahující jednu (Hauser a Hoffmann 1991), dvě (Hauser a kol. 1992a), čtyři (Hoffmann 1988) nebo šest (Hauser a Hoffmann 1992b)írojlístkových domén, Trojlístkové peptidy savců obsahující jednu doménu jsou spojeny s rakovinou prsu spojené pS2 peptidy známé z lidského .(Jakowlev a kol. 1984, Prud hornině a kol. 1985) a myšího (Lcfebvre a kol. 1993) intestinálního faktorů známého u lidí (Podolsky a kol. 1993. Hauser a kol. 1993) a krys (Sucmoria kol. 1991, Chinnery a kol. 1992)( 1.J lidí (Tomasetto a ko). 1990), prasat (Thim a kol. 1982) a myší (Tomasetto a kyol. 1990) hýl popsán spasmolytický polypeptid (SP), který obsahuje dvě trojlístkové domény. Za normálních podmínek jsou v lidském gastrointestinálním traktu tvořeny tři trojlístkové peptidy hpS2, hlTF a hSP; hSP a hpS2 ve výstelkové mukózní vrstvě žaludku (Tomasetto a kol. 1990, Rio a kol. 1988) a hlTF ve výstelkové mukózní vrstvě tenkého a tlustého střeva (Podolsky á kol. 1993).

t „w τ “ --ι.-·* Mf- ‘ ^;·ν· -djk. 4¹

J. v

Fyziologická funkce trojlíštkových peptidů není dobře známá. Za určitých podmínek jako je např.mukózní poškození při zánětu Střev (Rio a kol. 1991,

Poulsom a kol. 1992, Wright. a kol. 1993) a žaludečních vředech a vředech j dvanáctníku (Rio a kol. 1991, Hanby a kol. 1993, Wright a kol. 1990) byla pozorována zvýšená exprese trojlíštkových peptidů v trávicí soustavě. To bylo podnětem pro názor,. že troj lístkové peptidy mají mukózní regenerační funkci. Důkaz o tom byl v současné době podán Dignassem a kol. 1994, Playford a kol. 1994 a Babyatsky a kol. 1994. Mechanismus, kterým trojlístkové peptidy urychlují svou regenerační funkci, může být vazba mezi řetězy mucinglykoprotěinú za vzniku viskózního elastického gelu odolného proti trávicím * enzymům (Thim 1994, Gajhede a kol. 1993).

V patentu WO 92/14837 je popsáno klonování jedné krysí a lidské domény intěstinálního troj lístkového faktoru pro léčení poruch trávicí soustavy.

Podstata vynálezu

Byla objevena možnost přípravy dimeru trojlíštkových faktorů s pouze jedúóu třojlístkovou doménou a .se zajímavými farmakolog ickým i vlastnostmi.

Předkládaný vynález se tedy týká dimerních trojlíštkových peptidů obsahujících jednu třojlístkovou doménu.

Jak je uvedeno výše, trojlístkové peptidy se považují za příspěvek k léčbě vředů trávicího ústrojí a jiných mukózních poruch, a to stabilizací mukózní vrstvy v trávicí soustavě. Mechanismus této stabilizace není dosud známý. Rentgenová struktura porcinového pankreatického spasmoly tického i

polypeptidů (PSP) ale ukázala (srov. Gajhede a kol. 1.993), že tento má dvě trojlístkové domény a že většina Zachovaných zbytků přispívá k 8 až 1,0 A velké štěrbině, která se nachází v každé trojlístkové doméně. Předběžné spojovací pokusy ukázaly, že /é se štěrbina muže přizpůsobit části ol^ácharidového řetězce např: připojeného k mucinovému glykoprotěinú. Pokud še skutečně jedná' o'tento případ; PSP še-dvěmi takovými“štěrbinami’ je schopný spojení’ řetězců mucinů za pomoci jim k tvorbě ochranného gelu u kraje mukózního

3.

epifelu. Dosud není známo, zda trojlístkové peptidy s jednou trojlístkovou doménou (jako ITF a pS2) tvoří in vivo dimery pro uplatnění stejné funkce nebo zda mají různé mechanismy působení. Má se ale za to, že dimery takových troj lístkových peptidů mohou opravdu spojovat řetězce mucinů, a tak tvořit aktivní formu peptidu.

V jiném aspektu se předkládaný vynález týká způsobu přípravy dimeru troj lístkového peptidu obsahujícího jednu trojlístkovou doménu. Způsob zahrnuje kultivaci vhodných hostitelských buněk transformovaných DNA j sekvenčním kódováním troj lístkového peptidu obsahujícího jednu trojlístkovou doménu za podmínek připouštějících produkci peptidu a izolaci vzniklého ιί dimeru troj lístkového peptidu z kultury.

V dalším aspektu se předkládaný vynález týká farmaceutického prostředku obsahujícího dimer troj lístkového peptidu obsahujícího jednu trojlístkovou doménu spolu s farmaceuticky vhodným ředidlem nebo přísadou.

V dalším aspektu se předkládaný vynález týká dimeru troj lístkového peptidu obsahujícího jednu trojlístkovou doménu pro použití jako léku a pro přípravu léků pro profylaxi nebo léčení poruch trávicí soustavy.

F ”

Podrobný popis vynálezu

Dimer trojlístkového faktoru je konkrétně dimer střevního trojíístkového faktorii (ITF) nebo peptidu spojeného s rakovinou prsu (pS2).

Faktor je konkrétně lidský ITF s monomerní aminokyselinovou sekvencí .*

ZEYVGLSANQCAWAKDRVDCGYPPIVTPKECNNRGCCFDSRIPGVPWCFKP

LQEAECTF kde Z je Glu, Gin nebo pýrGlu nebo jeho homolog schopný dimerace a vykazující podobnou aktivitu . !*“= J**-' ·* ·**·· « * ·* » *'»-*«- 'UR»'-'·,., „ · - -> * « ......... -- *. . M nebo lidský pS2 s monomerní aminokyselinovou sekvencí

ZAQTETCTVAPRERQNCGFPCTVTPSQCANKGCCFDDTVRGVPWCFYPNTID

VPPEEEGEF kde Z je Glu, Gin nebo pyrGlu nebo jeho homolog schopný dimerace a vykazující podobnou aktivitu.

Homologa ITF nebo pS2 obsahují stejný cysteinový vzor a disulfidové uspořádání (Obr. 1) a vykazuji některé homologní sekvence (myslí še v odpovídajících pozicích buď identické aminokyseliny nebo tradiční substituce) v miste 1, 2 a. 3. Stejné sekvence v aktivních místech obsahují 1 ,až 10 aminokyselinových zbytků a počet aminokyselinových zbytků v každém místě (nehlédě na cystein) je 7 až 12, s výhodou 9 až 10.

Homologa, ITF nebo pS2 mají jednu nebo několik substituovaných, vynechaných nebo přidaných aminokyselin. Tyto změny jsou výhodně takové, aby substituce významné neovlivnila stavbu a aktivitu proteinu. Typické je vynechání 1 až 3 aminokyselin v aktivním místě a 1 až 10 aminokyselin v N a C koncových částech přidání jedné amino riebo karboxy koncovky (jako aminokoncový methionin, malý spojovací peptid do 1.0 aminokyselin nebo malá část, která usnadňuje čištění jako polyhistidinová oblast), aňtigenního epitopu nebo vazebné domény (Ford a kol., Protein Expression and Purifieation 2:95-107, 1991). Příklady konzervativní substituce jsou v rámci bazických aminokyselin (arginin, lysin, histidin), kyselých (glutamová a asparágová kyselina), polárních (glutamin a asparagin), hydrofobních (leucin, isoleucin, valin), aromatických (fenylalanin, trvptofan, tyrosin) a malých aminokyselin (glycin, alanin, serin, threonin, methionin).

Odborníkům v této oblasti je zřejmé, že takovou substituci lze provést mimo rozhodující oblasti pro funkci molekuly, a ták aby výsledný polypeptid neztratil aktivitu. Aminokyseliny nezbytné pro aktivitu předkládaných trojlístkových polypéptidů, a tedy ňesubstitudyatelňé se^stanoví známými postupy jako je lokální mutageneze nebo alaninová skenovací mutágenéze (Canningham a Wells, Science 244, 1081-1085, 1989). Podle novější techniky se pro každou aminokyselinu v molekule připraví mutace a produkt se testuje na biologickou aktivitu (např. mukózní léčba a léčba vředů trávicí soustavy) za stanovení aminokyselin rozhodujících pro aktivitu molekuly.

Homologa jsou buď allelově varianty (tj. alternativní forma genu, která vzniká mutací) nebo změněné peptidy kódované mutovaným genem, ale s téměř stejnou aktivitou jako původní peptid. Proto může být mutace latentní (bez změn kódovaného peptidu), nebo kóduje peptidy se změněnými atninokyselinovými sekvencemi.

Homologa předkládaného troj lístkového peptidu mohou být i druhová homologa, tj. polypeptidy s podobnou aktivitou odvozené od jiných druhů např. myší, krys,, králíků, krav, prasat nebo žab.

Při výhodném provedení má dimer trojlíštkového peptidu v souladu s předkládaným vynálezem přibližnou molekulovou hmotnost 13 000. Dimer se skládá ze dvou monomerních troj lístkových peptidů spojených disulfidičkou vazbou mezi dvěma cysteiny v pozici 57 ITF monomerů typu ITF nebo v pozici 58 ITF monomerů typu pS2.

Dimery trojlístkových peptidů se s výhodou připravují rekombinací DNA. DNA sekvence kódující trojlístkové peptidy lze izolovat přípravou genomickě nebo cDNA knihovny a vyhledáním DNA sekvencí kódujících celý nebo část peptidu hybridizací s použitím syntetických ol igonukleotidových sond podle standardních technik (srov. Šambroók a kol., Molecular Clonning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 1989).

Pro naše účely je DNA sekvence kódující peptid s výhodou lidského původu, tj. odvozena z lidské genomickě DNA nebo cDNA knihovny.

DNA sekvenci kódující troj lístkový peptid lze také připravit standardními metodami synteticky, např. fosfoamiditovou metodou (Beaucage a Caruthers, Tetrahcdron Letters 25 (1981), 1859-1869 nebo Matthes a kol,, EMBO Journal * '3' (1984)* 801-805)** Fosfoamiditovou metodou' se^,r připraví dl igonukleotidy' '** (čištění, Ztužení, vázání, klonování na vhodné vektory v automatickém DNA syntetizátoru).

DNA sekvenci lze také připravit polymerační řetězovou reakcí s použitím specifických základů (např. US 4 683 302, Saiki a kol., Science 239 (1988), 487-491 nebo Sambróok a kol. supra,}

DNA sekvence kódující trojlístkový peptid se obvykle zavádí do rekombinantního vektoru (jakýkoliv vektor, který muže být. snadno podroben rekombináčním postupům DNA). Výběr vektoru často záleží na hostitelských buňkách, do kterých se má zavádět. Vektor tak může být autonomně replikačrií (existuje jako extrachromosomální jednotka, jejíž replikace je nezávislá na replikaci chromozómu) např. plasmid, nebo je, pokud se zavádí do hostitelských buněk, integrován do genomu hostitelských buněk a replikován spolu s chromozómy, do kterých byl zaveden..

S výhodou se zde jedná o expresní vektor, kde je DNA sekvence kódující trojlístkový peptid operativně spojena s dalším segmentem nutným pro transkripci DNA. Obecně je expresní vektor odvozen od plasmidu nebo virově DNA, nebo obsahuje prvky obou. Termín „Operativně spojena“ znamená, žé jsou segmenty uspořádány tak, že je jejich funkce správná pro jejich účel určení, tj. transkripce začíná v promotoru a pokračuje přes DNA sekvenci kódující polypeptid.

Promotorem může být jakákoliv DNA sekvence s transkripční aktivitou ve vybrané hostitelské buňce a může být odvozena z genů kódujících homologní nebo heterologní bílkoviny hostitelské buňky.

Příklady vhodných promotorů pro řízení transkripce DNA kódující trojlístkový peptid jsou SV40 proníotor (Subramani a kóí., Mol. Cell Biol. 1 (1981), 854t-864), MT-1promotor (metal othioneinový gen) (Palmiter a kol., Science 222 (1983),'8Ó9-814) nebo hlavní promotor adenóviru 2.

‘ . „-«(i,* —i ** Xl·*»· * - - ··*..·. - - . -ri» aPříklady vhodných promotorů pro použití v buňkách hmyzu jsou polyhedrinový -promotor (US 4,745,051; Vasuvedan a kol., FEBS Eett. 311, (1992) 7 - 11), * “Tip

PÍ O promotor (J.M. Vlak a kol., J. Gen. Virology 69,(988, 765-775), Autograplza enlifomiea promotor základního proteinu polýhidrózního viru Autographa californica (EP 397 485), promotor přímého raného genu 1 baciloviru (US 5;155,037; US 5,162,222) nebo promotor zpožděného raného genu bacilovi™ 39K (US 5,155,037; US 5,162,222).

Příklady vhodných promotorů pro použití v buňkách kvasinek zahrnují promotory z glykolytických genů kvasinek (Hitzeman a kol., J. Biol. Chem. 255 (1980),12073 -12080; Alber a Kawasaki, I Mol· Appl. Gen. 1 (1982), 419 -434) hebo geny alkoholdehydrogenasy (Young a kol., in Genetic Engineering of Micfoorganisms for Chemicals (Hollaendeř a kol., eds.), Plenurn Press, New York, 1982) nebo TPI1 (US 4,599,311) nebo ADH2-4c (Russell a kol., Nátuře 304 (1983), 652 - 654) promotory.

Příklady Shodných promotorů pro použití v buňkách vláknitých hub jsou např. promotor ADH3 (McKnight a kol., The EMBO J. 4 (1985), 2093-2099) nebo tpiA promotor. Příklady vhodných promotorů-jsou tyto odvozené od genu kódujícího A. óryzae TAKA amylasu, Rhizomucor miehei aspartovou proteinasu, A. higer neútrální α-amylasu, A. higer kysel inovzdornoů a-amylaSu, A. niger nebo A. awamori glukoamýlasu (gluA), Rhizomucor. miehei lipasue, A., óryzae alkalickou proteasu, A. óryzae triosa-fosfát isómerasu nebo A. niduíans acetamidasu. Vhodné jsou promotory TAKA-amylasy a gluA (uvedeny např. v EP 238 023 a EP 383 779).

DNA sekvence kódující trojlístkový peptid může být také Spojena s vhodným ukončením jako je ukončení lidského růstového hormonů (Palmiter a kol., Science 222, 1983, 809-814) nebo (pro houbovité hostitele) TPH (Alber a Kawaski, J Mol. Appl. Gen. 1, 1982 , 419-434) nebo ADH3 (McKnight a kol., The Embo J. 4, 1985, 2093-2099) ukončení. Vwktory mohou dále obsahovat prvky jako polyadeňylační signály (např. z oblasti SV40 nebo adenoviru 5 Elb), sekvenci transkripčního zlepšení (např. SV40 promotor) a translačního zlepšení (např. kódující RNÁaďenoy iřu VARN A)’ *'- -rj.*-»

Rekombinované vektory dále obsahují DNA sekvence umožňující vektoru replikaci v příslušných hostitelských buňkách. Příkladem takové sekvence (pro savčí buňky) je SV40 počátek replikace SV40.

Pokud jsou hostitelské buňky kvasinky, jsou vhodné sekvence umožňující vektoru replikaci kvasinkové plasmidy 2μ replikačního genu REP 1-3 a počátek replikace.

Vektor také obsahuje volitelný značkovač (např. gen, jehož produkt doplňuje defekt v hostitelských buňkách) jako gen kódující dihydrofolátreduktasu (DHFR) nebo Schizosaccharomyces/xwiůe TPI gen (viz. P. R: Russell, Gene 40, 1985, 125-130) nebo gen způsobující odolnost proti lékům např. ampicilinu, kanamycinu, tetracyklinu, chloramfenykolu, neomyeinu, hygťomycinu nebo methotrexatu. Pro vláknité houby jsou volitelné značkovače amdS, pyrG, argB, nieD nebo-sC

Pro zavedení troj lístkového peptidů v souladu s předkládaným vynálezem do sekrečního kanálu hostitelské buňky lze v rekombinačním vektoru zajistit sekreční signální sekvenci (známou i jako řídící, repro nebo pre sekvenci). Tato sekreční signální sekvence je spojena s DNA sekvencí kódující trojlístkový peptid ve správné čtecí části. Sekreční signální sekvence je obyčejně v pozici 5' k DN A sekvenci kódující peptid. Sekreční signální sekvence může být normál nespojena s peptidem, nebo tvořit gen kódující jiný sekreční protein.

Produkci kvasinkami kóduje sekreční signální sekvence jakýmkoliv signálním peptidem, který zajišťuje účinhé zavedení trojlístkového peptidů do sekrečního kanálu buňky. Signální peptid je přírodní forma, jeho část nebo. syntetický peptid. Vhodně signální peptidy jsou α-faktor signální peptidy (srovnej US 4870008), signální peptid amylasy myších slin (srovnej O. Hagenbuchle a kol., Nátuře 289, 1981, 643 646), modifikovány signální peptid karboxy peptidasv (L. A. Vallas a kol:, Cell 48, 1987, 887-897), signální peptid kvasinek BARI (WO , 87/02670)„nebo, signální.peptid,aspartové. proteasy, 3 kvasinek (YAP3),(M.

Egel-Mitani a kol . , Yeast 6, 1990, 127-137).

Pro účinnou produkci kvasinkami lže sekvenci kódující řídící peptid zavést i za signální sekvenci a nad DNA sekvenci kódující troj lístkový peptid. Funkce řídícího peptidu je produkovaný peptid zavést ž ertdbplazmatického řétikula do Golgiho aparátu a dále do sekreční dutiny pro sekreci do kultivačního média (tj. export trojlístkovčho peptidu přes buněčnou stěnu nebo alespoň pres buněčnou membránu do .periplasmického prostoru buňky kvasinky). Řídící peptid je např. α-faktor řídící peptid kvasinek (jehož použití je popsáno např. v US 4546082, US 4870008, EP 16201, EP 123294, EP 123544 a EP 363529). Alternativně je řídící peptid syntetický, tj. nevyskytující se v přírodě.. Syntetický řídící peptid lže konstruovat např. podle WO 89/02463 nebo WO 92/11378.

Pro použití u vláknitách hub lze signální peptid pohodlně odvodit od genu kódujícího Áspergillus sp.. amylasu nebo glukoamylasu, genu kódujícího Rkizomucór miehei lipasu nebo proteasu nebo Humicola lanuginosa lipasu. Signální peptid je s výhodou odvozen od genu kódujícího A. oryiae TAKA amylasu, A. niger neutrální o.-amylasu, A. niger kyselirtostálou amylasu nebo A. niger glukoamylasu. Vhodné signální peptidy jsou uvedeny např v EP 238 023 a EP 215 594.

Pro použití v buňkách hmyzu lze signální , peptid pohodlně odvodit od genu hmyzu (cf. WO 90/05783) jako je adipokineticky hormonální prekurzor signálního genu motýla Manduca sexta (US 5,023,328).

Postupy použité přo vázání DNA sekvencí kódujících trojlístkový peptid, promotoru a volitelně ukončení a/nebó sekreční signální sekvence a jejich zavedení do vhodného vektoru obsahujícího informaci nezbytnou pro replikaci jsou Odborníkům v této oblasti dobře známé (např. Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989).

Hostitelská buňka, do které se zavádí DNA sekvence kódující trójlístkový peptid, je jakákoliv buňka schopná produkce peptidu v dimerní formě a ► zahrnuje buňky,kvasinek, hub a.vyšší eukaryotické buňky. .

Příklady vhodných spojení savčích buněk jsou ČOS (A-TCC CRL 1650), BHK (ATCC CRL 1632, ATCC CCL 10), CHL (ATCC CCL39) nebo CHO (ATCC CCL 61). Způsoby transfekce savčích buněk a exprese DNA sekvencí zavedených do buněk popsali např. Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol. 159 (1982), 601-621; Southern a Berg. J. Mol. Appl. Genet.l {1982), 327-341; Loyter a kol., Proč. Nati Acad. Sči. USA 79 (1982), 422 - 426; Wigler a kol , Cell 14 (1978), 725; Corsaro a Pearson, Somatic Cell Genelics 7 (1981), 603, Graham a van der Eb, Virology 52 (1993), 456; a Neumann a kol., EMBO J; 1 (1982), 841- 845.

Příklady vhodných buněk kvasinek jsou Šaccharomycés spp. nebo Schizosacháromyčés spp:, zejména pak kolonie Šaccharomycés cerevisiae or SacčAtíro/íiyces ř/«yven. Způsoby transformace kvasinek heterologní DNA a následná produkce heterologních polypeptidu je popsána v US 4599311, US 4931373, US 4870008, 5037743 a US 4845075 uvedených zde jako reference.

:t ' ' '

Transformované buňky se vyberou podle fenotypu stanoveného volitelným značkovačem, běžné odolnosti proti lékům a schopnosti růstu bez přítomnosti jednotlivých živin např. leučinu. Výhodný vektor pi o použití u kvasinek je POTÍ uvedený v US 4,931,373. DNA sekvence kódující trojlístkový peptid je předcházena signální sekvencí a volitelné např. výše zmíněnou· řídící sekvencí.

Další příklady vhodných kvasinek jsou kolonie Kluyveromyces jako K. lactis, Hansenula, např. H.polymorpha nebo Pichia, např. P. ptíSZ<?/žy (Gleeson et al.,

J. Gen. Microbiol. 132,1986, 3459-3465; US 4,882,279).

Dalšími příklady jsou vláknité houby, např. Aspergillus spp., Neurospora spp., Fusarim spp. nebo Trichoderma spp., zejména kolonie A. oryzae, A. nidulans nebo A. niger. Použití Aspergillus spp. pro expresi proteinů je popsáno v např.

EP 272 277, EP 238 023, EP 184 438. Transformaci F. pxysponum lže např. provést podle Malardiéra a kol., 1989, Gene 78; 147-136. Transformaci Trichoderma spp. lze např. provést podle EP 244 234.

Pokud se jako hostitelské buňky použijí vláknité houby, mohou být transformovány*pomocí -DNA ’v souladu*· s - předkládaným vynálezemto pohodlně integrací konstrukční DNA chromosomu hostitelské buňky za získání rekombinovarié formy. Tato integrace je výhodná, protože DNA Sekvence je ii pak v hostitelské buňce stabilnější. Integraci konstrukční DNA hostitelského chr.omosomu lze provést konvenčně např. homologní nebo heteralogní rekombinací.

Transformaci buněk hmyzu a produkci hcterologních polypeptidů lze pak provádět podle US 4,745,051; US 4,879,236; US 5,155,037; 5,162,222; EP 397485, které jsou zde uvedeny jako reference. Buňky hmyzu, které lze použít jsou např. Lepidopiera jako Spodoptera jugiperda nebo Trichoplusia iii (US 5,077,214). Vhodné podmínky kultivace jsou uvedeny např. v WÓ 89/01029 nebo WO 89/01028 nebo v dříve uvedených pracích.

Výše popsané transformované hostitelské buňky se pák kultivují ve vhodné výživě za podmínek dovolujících expresi trojlístkového peptidu. Potom lze veškerý nebo část výsledného peptidu získat z kultury v dimerní formě. Médium použité přo kultivaci buněk je běžný materiál - jednoduché nebo složené médium obsahující vhodné doplňky. Vhodná média jsou komerčně dostupná nebo připravitelná podle publikovaných předpisů (např. American Type Culture

Collection). Trojlístkový peptid vyprodukovaný buňkami se pak ž kultury získává běžnými postupy zahrnujícími separaci hostitelských buněk z média odstředěním nebo filtrací, srážení bílkovinných složek roztoku nebo filtrátu solemi (např. síran amonný) a čištění různými chromatografickými technikami (např. iontově výměnná, gelová, afinitní, atd. chromatografie) podlé příslušného typu polypeptidu.

Ve farmaceutickém prostředku v souladu ; s předkládaným vynálezem je trojlístkový dimerní peptid v různých farmaceutických formách popsaných např.

v Remington 's Pharmaceutical Science, 1985. Prostředek je ve formě vhodné pro soustavné podávám v injekcích nebo infuzích, a tedy se sterilní vodou nebo izotonickým nebo glukózovým roztokem. Prostředky lze sterilizovat běžnými technikami. Výsledný vodný roztok lze balit pro použití nebo filtrovat za aseptických podmínek a lýofilizovat. Lyofilizováný prostředek lze . před pod á váním,, kombi nova t. se. sterilním vodným, roztokem. # Prostředek... obsahuje, ₄ » farmaceuticky vhodné přísady podle požadavků na napodobení fyziologických podmínek jako pufry, tonika, atd, např. octan sodný, laktát sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý, atd.

Farmaceutický prostředek v souladu s předkládaným vynálezem lze přizpůsobit i pro nosní, transdermální a rektální podávání. Jako fannaceuticky vhodný nosič nebo ředidlo prostředku lze použít jakýkoliv běžný pevný nosič. Příklady pevných nosičů jsou laktosa, terra alba, sacharosa, mastek, želatina, agar, pektin, klovatina, stearát horečnatý a kyselina stearová. Nosič nebo ředidlo podobně obsahuje živiny uvolňující látky jako glycerylmónostearát nebo glyceryldistearát nebo jejich směs s voskem. Množství pevného nosiče je 25 mg až 1 g.

Koncentrace troj lístkového peptidu v prostředku je 5 až 100 % hmotnostních. Výhodná je koncentrace 50 až 100 % hmotnostních. Podávaná jednotka prostředků je 1 až 200 mg, s výhodou 25 až 75 mg, nej výhod něj i 50 mg

Jak je uvedeno výše, dimer trojlístkového peptidu v souladu s předkládaným vynálezem se považuje za aktivní formu peptidu, a takto se považuje za výhodné jeho použití pro prevenci nebo léčení poruch trávicí soustavy. Konkrétněji je určen pro léčení žaludečních vředů a vředů trávicího ustrojí, zánětu střev, Grohnovy choroby nebo poruch trávicího ústrojí způsobených léčením zářením, bakteriálních nebo jiných infekcí atd. Dávkování polypeptidu podávaného pacientům záleží na typu a závažnosti léčených poruch, ále obecné je 0,1 až 1 mg na kg váhy těla,

Přehled obrázků na výkresech

Předkládaný vynález je dále detailněji popsán na příkladech. s odkazem na připojené obrázky , kde je:

Obr. l navržená struktura lidského trojlístkového faktoru 1TF. Primární

4- Wc aminokyselinová sekvence je převzata od Hausera -a koL . .1993,, a.

disulftdická vazba- umístěna hómologně podle PSP a pS2 (Tliim,

1988).

Obr. 2 HPLC roztoku z kvasinek HW756 pro expresi krysího ÍTF na reverzní fázi - koloně Vydac 214TP54

Obr. 3 iontově výměnná chromatografie na Fast Flo.w SP-sefarose částečně čištěného lidského ITF. Množství hlTF (monomeru) a hlTF (dimeru) bylo stanoveno analytičkou HPLC. Čárky značí frakce spojené pro další čištění monomeřní a dimerní formy. Čárkovaná Čára značí koncentraci NaCl v elučním roztoku.

Obr. 4 reverzní HPLC Čištěného krysího ITF dimeru (A), lidského ITF monomeru (B) a lidského ITF dimeru (C) na koloně Vydac 214TP54 Č4. Čárkované čáry značí koncentraci ačetonitrilu v elučním roztoku.

Obr. 5 rekonstruované hmotnostní spektrum čištěného krysího ITF dimeru (A), lidského ITF monomeru (B) a lidského ITF dimeru (C)

Obr: 6 struktura dimerní formy lidského ITF

Obr? 7 mapa omezení plasmidu KFN 1003

Obr. 8 struktura plasmidu pHW756

Obr. 9 struktura plasmidu pHWJ066

Příklady provedení vynálezu

MATERIÁLY A METODY

Klonování krysího ITF (rITF) a lidského ITF (hlŤF)

Klonování krysího a lidského ITF bylo prováděno podle WO 92/14837 a

Suemori a kol., 1991 a Chineri a kol,, 1992 (krysí ITF) a Podolsky a kol., 1993 a

Hausera'kolTl993 (lidský ITF)*Tvorba rITF á hlTF expresních plasmidu

Expresní plasmidy pHW?56 pro sekreci krysího ITF a pHW 1066 pro secreci lidského ITF byly vytvořeny jak je uvedeno na obr. 7-9. Kvasinkový expresní vektor pKFN 1003 (WO 90/10075) je odvozen ód plasmidu CPOT (Kawasaki, G. International Coníerence on Yeast Genetics and Molecular Biology, Sept. 1724, 1984, Edinburgh, Scotland, Abstr. str. 15.) Jako výběrový značkovač (Russell, PR., Gene 40 (1985), 125 130) má Schizóšaecharpmyces pombe TPI gen (POT), jako promotor S.cerevisiae triosalósfátisomerasu (TPI) a ukončení pro kontrolu exprese (Alber, T. and Kawasaki, G. J.Mol.Appl.Genet. 1 (1982),419-434).

Krysí ITF gen byl nejdříve klonován do Bluescript II KS(-) (Stratagene), ze kterého byl propagován podle obr. 8. Pomocný vektor pSX54 zajišťující klonovací polohy se skládá z pUClB a pDN1050 (Dideríchšen, B,, Poulsen, G B., Jořgensen, S.T. Plasmid 30 (1993), 312-315). Syntetická DNA Spojka

Ncol-PflMl má následující sekvenci:

- 1858 5' -CATGGCTGAA.AGATTGGAAAÁGAG ACA AGAGTTCGTTGGTTTGT

CTCCATCCCAATGT-3' 58 bp

1862 : 5'-TTGrGGATGGAGACAAACCAACGAACTCTTGTCTCTTTCCAAT

CTTTCAGC-3' 51 bp

Spojka kóduje C-koncové (8) aminokyseliny pro řídící sekvenci jak popsali Thim, L., Norris, K.., Norris, F., Nielsen, P.F., Bjorn, S., Christensen, M., Petersen, J. FEBS Letí. 318, (1993), 345-352, s několika změnami ve výběru kodónu a N-koncovoučást krysího ITF genu: QEFVGLSPŠQC. Řídící a signální aminokyselinová sekvence je popsána tamtéž.:

Lidský ITF gen byl klonován do PUC 19 a propagován podle obr. 9. Syntetická DNA spojka Neol-BsaA 1 má následující sekvenci:

t·*» -aga - i * < 'MU —«l.||,W -^,r*· + - 2292 : S^ČAŤGGCTGAAAGÁTTGGAAAAGAGAAGAATAC^’ 34 bp

2287 ; ^'-GTATTCTTCTCTCTTTTCCAATCZ^TTCAGC-S' 30 bp

Spojka kóduje C-koncové (8) aminokyseliny pro řídící sekvenci, jak je popsáno pro řITF tvorbu a 3 N-koncové aminokyseliny pro hlTF gen: EEY. Řídící a signální aminokyselinová sekvence je stejná jako výše.

Expresní plasmidy byly transformovány do S.cerevisiae MT 663 (E2-7B X EU-36 a/α, Atpi/tpi, pep 4-3/pep 4-3) výběrem pro růst na glukose jako živné

Transformované kvasinky pro expresi krysího a lidského 1TF byly nazvány

W756 aTIW 1066.

Fermentacf

Výše popsané transformované buňky byly kultivovány při 30 °C 72 h ve kvasinkové peptóriové dextrose (Shermaňa kol., 1981) doplněné dalším kvasinkovým extraktem (60 g/1). na konci fermentace byly dosaženy pro HW756 (rlTF) a HW1066 (hlTF) OD hodnoty 153 á 232 při 660 nm. Na konci fermentace bylo pH upraveno pomocí 1M kyseliny fosforečné na 2.5 a kvasinky byly separovány odstředěním při 3000 ot/min po dobu 15'min.

Čištění recombinantii rlTF

Koncentrace rlTF ve fermentačním extraktu kvasinek a frakcích získaných během čištění byla měřena analytickou HPLC. Alikvoty (obvykle 50-200 pl) byly nastřikovány na Vydac 214TP54 reverzní C4 HPLC colonu <0.46 x. 25 cm) temperovanou na 30 °C při průtoku 1,5 ml/min $ 0,1 % (objemově) TFA v 15 % (Objemové) acetonitrilu. Po 10 min isokratické eluce byla koncentrace acetonitrilu v eluéním roztoku zvýšena během 40 min na 55 % objemových. Absorbance byla měřena při 214 nm. Diníerní formu rlTF reprezentovaly tři píky (Žó^min* 27:3’ min; 28,2*min)Cviz. obr¹2*Kvantita' byla“stanovenapomocí kalibrovaného hSP standardu (Thim a kol·., 1993).

Expresní úroveň pro rekombinant krysího ITF byla v předkládaném, systému 113 mg/1.

Z 1.0 1 fermentoru bylo odstředěním získáno 8,7 1 fermentačního roztoku, který byl zředěn 14,8 1 destilované vody na menší vodivost. Vzorek byl čerpán na Past Flow S-sefarosovou kolonu (Pharmacia) 5 x 42 cm při průtoku 600 ml/h. Před použitím byla kolona vyrovnána 50 mM pufrem (kyselina mravenčí) na pH

3,7 Krysí ITF byl vymýván z kolony 50 mM kyselinou mravenčí (pH 3,7) obsahující 50 mM NaCl. Při průtoku 600 ml/h byly odebírány a na obsah rITF. analyzovány 100 ml frakce. Frakce z předešlého kroku obsahující rITF byly spojeny (2,3 I) a čerpány na Amberchromovou (G-71) kolonu 5 x 10 cm. Před použitím byla kolona vyrovnána při průtoku 0,1 l/h na pH 4,8 pomocí 10 mM (octan amonný) pufru obsahujícího 60 % objemových ethanolu. Byly odebírány 10 ml frakce a spojeny podle obsahu rITF. Koncentrace ethanolu byla ve spojeném roztoku přidáním dvou objemů ethanolu (99,99 % objemových) zvýšena ze 60 % objemových na 87 % objemových a rITF byl vysrážen ochlazením směsi na - 25 °C po dobu 16 h.

Sraženina byla odstředěna (lh, 10 000 g, - 25 °C) a při laboratorní teplotě rozpuštěna ve 130 ml mravenčí kyseliny (20 mM) s pH 3,0. Vzorek byl čerpán na Fast Flow S-sefarosovou kolonu (Pharmacia) 5 x 20 cm při průtoku 50 ml/h.

Před použitím byla kolona vyrovnána na pH 3,0 pomocí 20 mM kyseliny mravenčí. Peptidy byly z kolony vymyty lineárním gradientem (1,5 1 50mM kyseliny mravenčí, pH 3,0 až 1,5 I 50mM kyseliny mravenčí, pil 3,0 obsahující 0,5 M NaCl). Při průtoku 80 ml/h byly. odebírány 10 ml frakce a absorbance byla měřená při 280 nm. Frakce byly testovány na Obsah rITF a podle něj spojeny.

Krysí ITF byl dále čištěn preparativní HPLC. Spojené frakce (900 ml) byly čerpány na preparativní HPLC kolonii Vydac 214TP54 C4 (2,2 x 25 cm) vyrovnanou v 0/1 % (objemových) TFA. Peptidy byly.vymyty při 25 °C a průtoku 5 ml/min lineárním gradientem (540 ml) vytvořeným z MeCN/ILO/TFA _r (10 :,89,9,: 0,l,objemově) a_rMeCN/H₂O/TFA..(65 /34,9 /0,1 .objemově)· JTV* absorbce byla Sledována při 280 nm a byly odebírány frakce po 10 ml a analyzovány na obsah rITF. Frakce Obsahující rITF byly spojeny a objem zmenšen vakuovou centrifugou na 30 %. Z výsledného roztoku byl rlTF izolován ..lyofilizací. Celkový výtěžek ίΠΤ z 8,7 1 fermentačního média byl 236 mg odpovídající celkovému výtěžku čištění 24%.

Čištění reeombinaritu hlTF

Koncentrace rlTF ve fermentačnim extraktu kvasinek a frakcích získaných bčhcm čištěni byla měřena HPLC systémem stejným jako u rlTF. Pomocí tohoto systému byly hmotnostní spektrometrií a sekvenční analýzou identifikovány dva píky (21,2 min a 27,1 min) jako dimer a monomer hlTF. Expřesňí úroveň pro rekombinánt lůidského ITF byla v předkládaném systému 90mg/l.

Z 10 1 fermentoru bylo odstředěním získáno 8,0 1 fermentačního roztoku. Vzorek byl třikrát dialyžován (vždy 24 hjproti 40 1 10 mM kyseliny mravenčí s pH 2,5. Vzorek byl čerpán (0,25 1/h) na Fast Flow S-sefarosovou kolonu (Pharmacia) 5 x 40 cm při průtoku 600 ml/h. Kolona bylá promyta 5 1 20 mM pufrem (kyselina mravenčí) s pH 2,5 a vymyta lineárním gradientem tvořeným 5 1 20 mM pufrem (kyselina mravenčí) s pH 2,5 a 5 1 20 mM pufrem (kyselina mravenčí) s pH 2,5 Obsahující 1 M NaCl. Byly odebírány a na obsah hlTF analyzovány 100 ml frakce (obr. 3). Z kolony byly vymyty dvě formy hlTF: jedna reprezentovala monomer hlTF (vymyta 0,5 M NaCl) a druhá dimer (vymyta 0,78 M NaCl), Frakce obsahující stejnou formu byly spojeny.

Každá frakce byla rozdělena na tři stejné díly po 700 ml a čerpána na kolonu Vydac 214TP54 Č4 (2,2 x 25 cm) vyrovnanou v 0,1 % objemové TFA. Peptidy byly vymyty při průtoku 4 ml/min lineárním gradientem (540 ml) vytvořeným z MeCN/H₂O/TFA. (10 : 89,9 : 0,1 objemově) á MeCN/H₂O/TFA (65 : 34,9 : 0,1 objemově). UV absorbce byla sledována při 280 nm a byly odebírány frakce po 10 ml a analyzovány na obsah hlTF.

Frakce z předešlého kroku obsahující hlTF (monomer) a MTF (dimer) bylý odděleně spojeny a pH upraveno na 3,0. Vzorky byly odděleně čerpány na SPsefarosovou HiLoad 16/10 (Pharmacia) kolonu (1,6 x 10 cm) pomocí 20 mM kyseliny mravenčí (pH 3,0) obsahující 40 % objemových ethanolu. Kolona byla promyta 80 ml vyrovnávacího pufru a vymyta lineárním gradientem při 4 ml/min tvořeným 200 ml 20 mM kyseliny mravenčí s pH 3,0; 40 % objemových ethanolu a 200 ml 20 mM kyseliny mravenčí s pH 3,0; 40 % objemových ethanolu obsahující 1 M NaCl. Byly odebírány a na obsah bJTF analyzovány 5 ml frakce.

'Frakce obsahující stejnou formu byly Spojeny a peptid vysrážen zvýšením koncentrace ethanolu na 90 % objemových a ochlazením směsi ha - 25 °C po dobu 72 h. Sraženina byla odstředěna á lýofiíizována. Celkový výtěžek z 8 1 fermentačního roztoku byl 256 mg hlTF (monomer) a 133 mg hlTF (dinier); což odpovídá celkovému výtěžku čištění 50 % pro monomer a 65 % pro dirner.

Charakterizace rekombinantů rITF a hlTF

Po hydrolýze v 6 M HCI při 110 °C ve vakuu těsné zkumavce po dobu 24, 48 a 96 h byly 50 pg vzorky analyzovány na automatickém Beckmatiově (model 121 MB) aminokyselinovém analyzátoru. Půlcystein byl po redukci disulfidických vazeb tribiitylfosfínern (Ruegg & Rudinger, 1974) a následném spojení se 4-vinylpyridinem (Friedman a kol., 1-978) stanoven jako S-p-(4-pyridylethyl) derivát. Hydrolýza vzorků 4-vmyl'pyridiňderivátů byla provedena 4 M methansulfonovou kyselinou nebo.3 M merkaptoethansulfonovou kyselinou při 110 °C po dobu 24 h (viz. výše). Analýza aminokyselinové sekvence bylaprovedena na automatickém Edmanově analyzátoru s použitím Applied Biosystems Model 470A sekventoru v plynné fázi (Thim a kol., 1987).

Hmotnostní spektra byla měřena na API III LC/MS/MS (Sciex, Thornhill, Ont.,

Canada). Přístroj s trojitým kvadrupólem má m/z rozsah 2400 a je.osazen pneumatickým elektrošprej (ioh-sprej) interface (Bruins et al.,1987; Covey a kok, 1988). Vzorky byly nastřikóvány stříkačkovou infuzní pumpou (Sage Instruments, Cambridge, MA) přes žhavenou kapiláru (75 μιη) při průtoku «*·» · v.. ‘ kapaliny·0-5’až^el*pf/miní Stupnice-(m/z) přístroje*byla kalibrována amonným— - * *· aduktem póly propy lengly kolů (PPG) s nábojem 1 při jednotkovém rozlišení.

Přesnost měření hmotnosti je obecně lepší než 0,02.% .

•19

Obr. 4 uvádí analytické HPLC Chromatogramy čištěného rITF (obr. 4A) and hlTF (obr. 4B a 4C). Rekombinovaný rITF obsahuje směs 3 velmi příbuzných peptidů, které jsme se nepokoušeli rozdělit. Při analýze elektrosprejovou MS byly nalezeny tři hlavní molární hmotnosti odpovídající 13112,2; 13096,6 a 13078.8 (obr. 5A). Vypočtená molární hmotnost monomeru rITF, kde Čys-57 obsahuje volnou SH skupinu, je 6558.3. Vypočtená molární hmotnost dimeru rITF (s S-S můstkem mezi Cys-57) je 13114.5. Z nalezených molárních hmotností rekombinovaného rITF je zřejmé, že všechny 3 peptidy reprezentují dimerní formu rITF. Z jiných trojlístkových peptidů s Gin jako N-koncovou aminokyselinou např. PSP (Thim a kol., 1985 a Tomasetto a kol., 1990) je známé, že tyto zbytky mají tendenci kcyklizaei za vzniku pýrrolidonové carboxy lové kyseliny (pyrGlu). V případě rITF s předpovídanou N-koncovou sekvencí Gln-Glu-Phc-Val-Gly se jeví logické předpokládat, že N-koncový Gin mohl rovněž cyklizovat ha pyrGlu formu. Takové změna by vedla ke snížení molární hmotnosti rITF dimeru o 17 (1 pyrGlu) nebo 34 (2 pyrGlu) jednotek. Pozorované, molární hmotnosti 13096,6 a. 13078,8 (obr. 5) odpovídají dimeru.. rITF s jedním resp. dvěma zcyklizovanými Nrkoncovými Gin. Vypočtená molární hmotnost těchto forem je 13097,6 a 13080,6 a je v dobré shodě š experimentálními údaji/ Závěrem z HPLC (obr. 4A) a MS analýzy (obr. 5A) tedy je, že rekombinovaný rITF obsahuje 3 různé dimery: první s dvěma Nkoncovými Gin, druhý s jedním N-koncovým Gin a jedním N-koncovým pyrGln a třetí šc dvěma N-koncovými pyrGln. Tabulka I uvádí aminokyselinové složení rITF v dobré shodě s očekávanými hodnotami.

Obr. 5A a 5B ukazují čistotu monomeru a dimeru hlTF podle analytické HPLC. Dimer (obr. 5C) je poměrně čistý zatímco monomer (Obr. 5B) vykazuje znečištění látkami vymytými před peptidem, ale i po opětovně chromatografii látky s hlavním pikem byl získán podobný chromatogram (není uveden). Ťo ukazuje spíše než na nečistoty na atypické chování monomeru hlTF na reverzní fázi. Dříve jsme pozorovali podobné Chování vysoce čištěného porcinu PSP a rekombinovaného hSP (Thim a kol!*’1993).

MS analýza monomeru hlTF molárni hmotnost hlavního píku 6694.0 (obr. 5B).

Molárni hmotnost vypočtená pro aminokyselinovou sekvenci (obr. 1)

S předpokladem volné SH skupiny na Cys-57 je 6574,4. Analýza aminokyselinové sekvence v tabulce II ukazuje očekávanou N-koncovou Sekvéiíci Glu-Glu-Tyr-Val-Gíy. Analýza aminokyselinového složení (tabulka í) ukazuje kromě přítomnosti 7,3 (8) cysteinů očekávané hodnoty. Další cystein připojený.k Cys-57 hlTF monomeru zvýší molárni hmotnost na 6694,7, což je velmi blízko experimentální hodnotě 6694,0. Proto předpokládáme disulfidické spojení Cys-57 monomeru hlTF s dalším cysteinem. Minoritní pík v hmotnostním Spektru (obr. 5B) může reprezentovat jiný derivát Cys-57 nebo nečistotu.

Vypočítaná molárni hmotnost dimeru hlTF, kde jsou dva dimery spojeny disuifidiekou vazbou mezi dvěma Cys-57 zbytky je 13146,8. To je v dobré

Λ shodě s experimentální hodnotou 13147 (Obr. 5C), Další pík v hmotnostním spektru (13169) pravděpodobně reprezentuje Na⁺ adukt dimeru hlTF. Sekvenční analýza (tabulka I) i analýza aminokyselinového složení (tábulka II) jsou rovněž v dobré shodě s očekávanými hodnotami.

' ί» ,» '»Λ·

Tabulka I

Aminokyselinové složem' dimeru rlTF, monomeru hlTF a dimeru hlT

Amiňokys.	rlTF (dimer)	hlTF (monomer)	hlTF (dimer)
Asx	11.92	(12)	6.00	(6)	12,01 .	(12)
Thf	8.00	(8)	2.03	(2)	4.01	(4)
Ser1	9.86	(10)	2.04	(2)	4.01 -	(4)·
Gbí	15,98	(16) ;	6;92	(7) ·:	14.00	(14)
Pro”	12.48	(12) (6)	n.d/	(6)	n.d/	(12)
Gly	6.02 .	4.20	(4)	8109	(8)
Ala	2.04	(2)	3:91	(4)	7.90	. (8)
Val	11.92	(12)	4,92	(5)	9.86	(10)
Met	1,80	(2)	0.00	(Q)	0.00	(θ)
De	1.98	(2) i (4)	1.17	(i)	2.13	(2)
Leu	3.92	2.03	(2)	3.99	(4)
Ty?	2,02	(2)	1.94	(2)	3.92	(4)
Phe	' 7.88	(8)	2.93	(3)	5.94	(6)
Lys	2.14	(2)	3-07	(3) ;	6.09	(6)
His	0.00	(0)	0.99	(D	2.03	(2)
Trp ,	2,16	(2)	n.d/	.. (1) .	n.d/	(2)
Arg	3.94	(4)	2.96	(3)	6.05	(6)
PE-Cys”	12.70	(14)	750	(7)	13.80	(14)
Celkem		(118)		(59)’		(118)

Hodnoty v závorkách jsou odvozeny z cDNA: rlTF (Čhiriery a kol., 1992), hlTF (Hauser a kol., 1993).

^stanoveno extrapolací na počátek hydrolýzy ^stanoveno hydrolýzou ve 4 M methansulfonové kyselině ^c)nebyló stanoveno r — Vn

Tabulka II

Automatizované Edman-odbourání dimeru fITF, monomeru hlTF a dimeru hlTF

Cyklus č.	rITF (dimer)	hlTF (monomer)	hlTF (dimer)
PTA-AA	Výtěžek (pflWl;	PTH-AA	Výtěžek . ipmol; :	Výtěžek ,	junol)
i	Gin	989	.Glu	1517	Glu	2227
'2	Glu	731	Glu	1998	' Glu	2361
3	Phe	967	Tyr	. 2205	Tyr	2528 ,
4	Val	1072	Val	2409	Val '	2431
5	Gty	701	Gly	1625	Gly	1803
6 .,	Leu	838	Leu	2318	Leu	2253
7 .	Ser	497	Ser	852	Ser	904
8	Pro	965	Ala	1729	Ala	1712
9	Ser	406	Asn	1394	Asn	1518
10	Gin	820	Gin	. -1494 .	Gin	1499
11	(Cys)	n.d.	(Cys)	n.d.	(Cys)	n.d.
12	* Met	581	Ala	1243	Ala	1377
13	Val	971	Val	1468	Val	1356
40	Pro	962	Pro	:1223	Pro	1195
15	Ala	529	Ala	1248	Ala	1249
’ ’16' ’	Asn	791	Lyš	1270 937	Lys	1050 ,
17	Val	952	Asp	Asp	991
18	Arg	.331 .	Arg	891	Arg	964
19	Val	956	Val	1002	Val	1069
20	Asp	476	Asp	847	Asp	932
21	(Cys)	níd.	(Cys). .	n.d.	Cys	n.d.
22	Gly	381	Gly	709	Gly	703
23	Tyr	352	Tyr	894	Tyr	792
24	Pro	927	Pro	766	Pro	701
25	Thr	498	His	309	His	236
26	Val	812	Val	'755	Val	670
27	Thr	510	Thr	505 .	Thr	576
28	Ser	225	Pra	•458	Pró	473
29 ;	Glu	398	Lys	444	Lys	321 :
30	Gin	499	Glu	219	Glu	304
31	(Cys)	n.d.	(Cys)	.. n.d.	(Cys)	n.d.
32	Asn	557	Asn	312	Asn	300
33	Asn	591	Asn	464	Asn	503
34	Arg	196	Arg	325 .	Arg	294 ;
35	Gly	'222	Gly	. 239	Gly	. 273
36	(Cys)	n.d.	(Cýs)	n.d.	(Cýs)	n.d.,
37 38 ' '	(Cys) ’ >phé^ -	n.d. 335”	(Cys) * * Phe	n.d. 189	; .(Cys) „ Phe	- 174
39	Asp	275 :	Asp	133	Asp	137
40	Sér	164	Ser	49	Ser	43
RY.		97.0%		93.2% ’		925%

Průmyslová využitelnost

Předkládaný vynález se týká dimeřů trojlístkových peptidů, způsobu jejich přípravy, farmaceutických prostředků, které jé obsahují a jejich použití pro léčení gastrointestinálníeh poruch. Za určitých podmínek jako je např. mukózní poškození při zánětu střev (Rio a kok 1991, Poulsoin a kok 1992, Wright a kol. 1993). a žaludečních vředech a vředech dvanáctníku (Rio a kok 1991, Hanby a kol. 1993, Wright a kol. 1990) byla pozorována zvýšená exprese trojlístkových peptidů v. trávicí, soustavě. To bylo podnětem pro názor, že trojlístkové peptidy mají mukózní regenerační funkci, o čemž byl v současné době podán důkaz Dignassem a kol, 1994, Playford a kok 1994 a Babýatsky a kok 1994.

τ φΐ· '7- F^· _t '*··+** *‘l“>

Odkaz na literaturu

Babyatsky, M.W., Thim, L, Podolsky, D.K. (1994) Gasrróehtěrology 106, A43 (abstract).

Bruins, A.P., Covey, T.R., & Heriion, J.D. (1987) AnaL Chem. 59, 2642-2646.

Čhínery, R., Poulsom, R., Rogers, LA, Jeffery, R.E. Longcróft, J.M,, Hanby, A.M., & Wright, NA. (1992) Biochem I. 285, 5-8.

Covey, T.R., Bonner, R.F., Shushan, B.L, & Henion, J.D. (1988) Rapid Commun. Mass Spectrom. 2, 249-256.

Dignass, A, Lynch-Devaney, K., Kindon, H., Thim, L, &. Podolsky, D.K. (1994) 7. Clin. Invest, (in press).

Friedman, M., KnilJ, LH.,. Cavins, J.F. (1970), J. BioL Chem 245, 3868-387L

Gajhede, M., Petersen, T.N., Henriksen, A., Petersen, J.F.W., Dauter, Z., WQson,

K.S., & Thim, L (1993) Structure 1, 253-262.

Hanby, AM., Poulsom, R., Elia, G., Singh, S., Longcroft, J.M., & Wright, NA (1993) 7. PathoL 169, 355-360.

Hauser, F., & Hoffmann, W. (1991) 7. BioL Chem 265,21206-21309.

' Hauser, F., Roeben, C., & Hoffmann, W. (1992a) 7. Biol Chem 267, 14451-14455.

Hauser, F^ & Hoffmann, W. (1992b) 7. BióL Chem. 267, 24620-24624.

>*·-*-»-· “ -Hauser, F., Poulsom, R“ Chinery/R;;* Rogers,' LA,*Hanby,' AM., Wright,' NA,r & * Hoffmann, W. (1993) Proč. HatL Acad, Sci. 90,6961-6965.

Hoffmann, W. (1988) 7 Biol. Chem. 263, 7686-7690.

Hoffmann, W., &. Hauser, F. (1993) Trends Biochem. Sci 7, 239-243.

Jakówíew, S.B., Breathnach, R., Jeltsch, J.-M.,Masiakowski, P., Chambon, P. (1984) Nucleic Acid Res. 12, 2861-2878.

Lefebvre, O., Wolf, C., Kédinger, M., Chenard, M.-P., Tomasetto, C., Chambon, P., & Rio, M.C. (1993) 7 Cell. BioL 722,191-198.

Playford, R.J., Marchbank, T., Chinery, R., Evison, R., Pignattelli, M., Bolton, R., Thim, L,& Hanby, A.M. (1994) Gastroenterology (ín press).

Podolsky, D.K., Lynch-Devaney, ÍC, Stow, J.L·, Oates, P., Murgue, B., DeBeaumoňt, M., Sands, B.E., & Makida, Y.R. (1993) 7 Biol Chem. 268, 6694-6702.

Poulsom, R., Chinery, R., Sarraf, C., Lalani, E.-N., Stamp, E-, Elia, G., Wright, N. (1992) Gastroenterology 27, 17-28.

Poulsom, R., & Wright, H.A (1993) Am. 7 Physiol 265, G205-G213.

Pruďhomme, J.F., Fridlansky, F., Le Cunfí, M., Atger, M., Mercier-Bodart, C, Pichon, M.-R, & Milgrom, E. (1985) DNA 4,11-21.

Rio, M.C., Bellocq, J.P., Daniel, J.Y., Tomasetto, C., Lathe, R., Chenard, M.P., Batzenschlager, A., &. Chambon, P. (1988) Science 241, 705-708.

Rio., M.-C., Chenard, M.-P., Wolf, C., Marcellin, L, Tomasetto, C., Lathe, R., Belloeq, J.-P., &. Chambon, P. (1991) Gastroenterology 100, 375-379.

·. 4

Lřťv-WL·?“- ‘-Ί* - s * “Μ».*⁵· ^Λ <·. *' * ⁴ -

Růegg, U. Th., & Rudinger, J. (1974) Δγ. 7 Chem 12, 391-401.

Shermán, F.^;, Fink, G.R., & Hicks, J.B. (1981) Methods in yeast genetics, Colď Spring

Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

Suemori, S., Lynch-Devaney, K., & Podolsky, D.K. (1991) Proč. Nati. Acad. Sci. 88, 11017-11021.

Thim, L., Jergenšen, K.H., &. Jsrgensen, K.D. (1982) ReguL Peptides 3, 221-230.

Thim, L., Thómsen, J., Christensén, M., & Jergensen, K.H. (1985) Biochem. Biophys. Acta 827, 410-418.

Thim, L., Hansen, M.T., Norris, K., Hoegh, L, Boei, E., Forstrom, J., Ammerer, G., & Fiil, L. (1986) Proč. NatL Acad. Sci 83, 6766-6770.

Λ

Thim, L., Hansen, M.T., & Soerensen, A.R. (1987) FEBS Lett. 212, 307-312.

Thim, L. (1989) FEBS Leu. 250, 85-90.

Thim, L, Norris, K., Norris, F., Nielsen, P.F., Bjom, S.E., Christénsen, M., Petersen, J. (1993) FEBS Leu 318, 345-352.

Thim, L. (1994) Ďigéstion 55, 353-360.

Tomasetto, C., Rio, ML, Gautier, C., Wolf, C., Hařeuveni, M., Chambon, P., & Lathe, R. (1990) Z 9, 407-414.

Wright, N.A., Pike, C., & Elia, G. (1990) Ha ture 343, 82-85.

Wright, N.A., Poulsom, R., Stamp, G., van Norden, S., Sarraf, C., Elia, G., Ahnen,

D., Jeffery, R,, Longcroft, J., Pike, C., Rio, ML, & Chambon, P. (1993) 'GastroenteřologyLQ4,*122QF' · —

Claims (13)

1. PATE N Τ O V É N Á R O K Y

   1. Trojlístkový peptid v dimerní formě obsahující jednu trojlístkovou oblast.
2. 2. Peptid podle nároku 1, který je intestinální trojlístkový faktor (IT F)
3. 3. Peptid podle nároku 2, který je lidský ITF.
4. 4. Peptid podle nároku 2 který má molekulovou hmotnost 13 000.
5. 5. Peptid podle nároku 2, kde se ITF dimer skládá že dvou ITF monomerů spojených mezi cysteinovými zbytky obou monomerů v pozici 57 disulfídičkou vazbou.
6. 6. Peptid podle nároku 1, který je peptid spojený s rakovinou prsu (pS2).
7. 7. Peptid podle nároku 6, který je lidský pS2.
8. 8. Peptid podle nároku .7, kde se pS2 dimer skládá, ze. dvou pS2. monomerů . . spojených mezi cysteinovými zbytky obou monomerů vpozici 58 disulfídičkou vazbou.
9. 9. Způsob přípravy dimeru trojlístkověho peptidu obsahujícího jednu trojlístkovou doménu vy z n a č u j í c í se tím, že Zahrnuje kutivaei vhodných hostitelských buněk transformovaných DNA sekvencí kódující trojlístkový peptid obsahující jednu trojlístkovou oblast za podmínek dovolujících produkci peptidu a získání vzniklého dimerního trojlístkověho peptidu z kultury.
10. 10. Farmaceutický prostředek v y z n a č u j ící S e tím, ž e obsahuje dimer trojlístkověho peptidu Obsahující jednu trojlístkovou oblast v kombinaci s farmaceuticky vhodným ředidlem nebo přísadou.
11. 11. Farmaceutický prostředek podle nároku 10 v ý Z nač u j í c í s e •η.-ρπν,’^ζ'ε obsahuje peptid podle kteréhokoliv i nároků 2-8. *
12. 12. Dimer trojlístkového peptidu obsahující jednu trojlístkovou oblast použitelný jako léčivo.
13. 13. Použití dimem trojlístkového peptidu obsahujícího jednu trojlístkovou Oblast vyznačující se tím , že se jedná o přípravu léčiva pro profylaxi nebo léčení poruch trávicí soustavy.