CZ310562B6

CZ310562B6 - Průmyslový produkční kmen mikroorganismu Claviceps purpurea (Fr.) Tul., CCM9367

Info

Publication number: CZ310562B6
Application number: CZ2024-162A
Authority: CZ
Inventors: Vlastimil MareÄŤek; Vlastimil Ing Mareček; Josef ValĂk; Josef RNDr Valík; Lucie Knoppová; Lucie Mgr Knoppová
Original assignee: Tapi Czech Industries S.R.O
Priority date: 2024-04-24
Filing date: 2024-04-24
Publication date: 2025-12-03
Also published as: CZ2024162A3

Abstract

Řešení se týká průmyslového produkčního kmene mikroorganismu Claviceps purpurea (Fr.) Tul., CCM9367, tvořícího při parazitickém růstu na obilninách, zejména na žitě nebo triticale a na jejich sterilních analozích, sklerocia s obsahem námelových alkaloidů, zejména ergokorninu, α-ergokryptinu a β-ergokryptinu. Účelem řešení bylo získání producenta výchozí suroviny pro výrobu námelových alkaloidů ergokorninu, α-ergokryptinu a β-ergokryptinu a jejich polosyntetických derivátů s podstatně vyšší výtěžností ve srovnání s doposud známými kmeny.

Description

Průmyslový produkční kmen mikroorganismu Clavicepspurpurea (Fr.) Tul., CCM9367

Oblast techniky

Vynález se obecně týká oboru biotechnologie, mikrobiologie, mykologie a farmaceutického průmyslu, konkrétně se týká nového průmyslového produkčního kmene mikroorganismu houby Claviceps purpurea (Fr.) Tul., CCM9367, tvořícího při parazitickém růstu na žitě a jiných obilninách sklerocia s obsahem alkaloidů, zejména ergokominu, α-ergokryptinu a β-ergokryptinu s minimálním zastoupením nežádoucích doprovodných alkaloidů.

Dosavadní stav techniky

Ergokomin, α-ergokryptin a β-ergokryptin jsou ergotoxinové alkaloidy s významnými léčivými účinky. V humánní medicíně jsou používány v lékových formách buď samostatně, nebo ve směsích s jinými účinnými látkami. Lze je využít i jako výchozí látku pro přípravu polosyntetických derivátů námelových alkaloidů se specifickým spektrem účinků, jako jsou např. nicergolin, pergolid, cabergolin.

Ergokomin, α-ergokryptin a β-ergokryptin mohou být získávány ze sklerocií houby Claviceps purpurea (Fr.) Tul., kultivované paraziticky v polní kultuře na žitě nebo jiných obilninách. Pro jejich výrobu byl v ČR dosud využíván kmen popsaný např. v patentu CZ 276359 a uložený v České sbírce mikroorganismů (CCM, Masarykova univerzita, Brno) pod číslem CCM8057. Uvedený kmen při kultivaci na žitě produkoval sklerocia s průměrným obsahem 0,91% sumy alkaloidů, vztaženo na sušinu biomasy. Průměrně 93,5% sumy alkaloidů je tvořeno ergokominem, a-ergokryptinem a β-ergokryptinem v poměru 60:25:15, zbytek je tvořen doprovodnými alkaloidy. Celkově nízký obsah alkaloidů a relativně vysoký obsah doprovodných alkaloidů je hlavní nevýhodou tohoto kmene i ostatních dosud známých kmenů.

Dále se ze sklerocií houby Claviceps purpurea (Fr.) Tul., kultivované paraziticky v polní kultuře na žitě nebo jiných obilninách, mohou standardními postupy připravit deriváty ergolenu a ergolinu, jako je např. kyselina lysergová, nicergolin, pergolid, cabergolin a další.

ergolin kyselina lysergová

- 1 CZ 310562 B6

Podstata vynálezu

Podstatou předloženého vynálezu je průmyslový kmen mikroorganismu Clavíceps purpurea (Fr.) Tul., CCM9367, uložený v České sbírce mikroorganismů (Masarykova Univerzita, Přírodovědecká fakulta, Kamenice 5, 625 00 Bmo), tvořící při parazitickém růstu na obilninách, zejména na žitě (Secale cereále) nebo triticale (křížencích žita (Secale cereále) a pšenice (Triticum aestivum)) a jejich sterilních analozích sklerocia s obsahem alkaloidů, zejména ergokominu, α-ergokryptinu a β-ergokryptinu. Tento nový kmen umožňuje zefektivnit extrakční a izolační postupy při výrobě ergokominu, α-ergokryptinu a β-ergokryptinu a jejich polosyntetických derivátů podstatným zvýšením výtěžnosti těchto postupů. Zvýšená výtěžnost je dána vysokým obsahem ergokominu, α-ergokryptinu a β-ergokryptinu ve sklerociích nového kmene ve srovnání s dosud využívaným kmenem CCM8057 Obsah alkaloidů v jednotlivých sklerociích nového kmene CCM9367 dosahuje hodnot 0,7 % až 2,2 % hmotnostních při průměrném obsahu 1,6 % sumy alkaloidů v sušině biomasy v průměrném spektru alkaloidů: 68 % ergokominu, 20 % α-ergokryptinu a 12 % β-ergokryptinu. Doprovodnými alkaloidy jsou převážně ergometrin a klavinové alkaloidy. Kmen lze s výhodou použít k získávání námelové drogy pro izolaci této směsi ergotoxinových alkaloidů i pro izolaci ergokominu a ergokryptinů zvlášť. Současně došlo u tohoto kmene ke zvýšení hektarových výnosů drogy, ve srovnání s ostatními vysokoprodukčními kmeny Clavíceps purpurea (Fr.) Tul. (CCM8405 a CCM8178). Tyto výnosy se u kmene CCM9367 pohybují při recentně používané agrotechnice pěstování námele v průměru 1420 kg/ha.

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1

Příprava kmene CCM9367

Nový průmyslový kmen mikroorganismu Clavíceps purpurea (Fr.) Tul., CCM9367 byl vyšlechtěn z kmene CCM8057. V roce 2019 bylo sklerocium uvedeného kmene převedeno do saprofýtické kultury a tato byla vystavena UV záření vlnové délky 250 až 270 nm o dávce 40 J/m². Ozářené izoláty byly injekčně naočkovány na vymetané klasy žita a narostlá sklerocia byla analyzována na kvalitativní a kvantitativní obsah námelových alkaloidů. Z nich bylo vyselektováno nejzralejší sklerocium s maximálním obsahem sumy alkaloidů, které bylo převedeno do saprofýtické kultury, která byla testována pomocí maloparcelového pokusu v roce 2020. Nejvýše obsahové sklerocium bylo v následujícím roce 2021 pasážováno na žitě v měřítku poloprovozního pokusu (cca 1 ha). Nejvýše obsahové sklerocium s maximálním obsahem aergokryptinu sklizené z těchto ploch, bylo převedeno do saprofýtické kultury a byla použita pro výrobu námelové očkovací látky použitou na provozních plochách v pěstitelské sezóně 2023. Nejvýše obsahové sklerocium bylo opět převedeno do saprofýtické kultury a tato kultura byla uložena v České sbírce mikroorganismů (Masarykova univerzita, Přírodovědecká fakulta, Kamenice 5, 625 00 Bmo) pod označením CCM9367. Uvedeným mutačním zásahem došlo u kmene CCM9367 k nárůstu průměrného obsahu námelových alkaloidů ve sklerociích o 75 % proti původnímu kmeni CCM8057. Současně došlo ke zkvalitnění spektra jednotlivých alkaloidů tím, že došlo ke zvýšení obsahu žádaného ergokominu v sumě ergotoxinů z 60 % na 68 %. Dále došlo ke zvýšení výnosu námelových sklerocií z 960 kg/ha na 1420 kg/ha, tj. o 48 %.

Příklad 2

Popis vlastností kmene CCM9367

Při saprofytní kultivaci na sladinovém médiu ztuženém agarem tvoří kmen CCM9367 kolonie z typicky sfaceliového vzdušného mycelia. Mycelium je zpočátku bílé a vzdušné, po 28 dnech kultivace sametově jemně zvrásněné, bílošedé, střed narostlé plochy mycelia pigmentuje do

-2CZ 310562 B6 fialova. Mycelium je tvořeno rozvětvenými hyfami a konidiemi oválného tvaru délky přibližně 4 až 10 pm a šířky přibližně 3 až 6 pm.

Při parazitickém růstu na žitě tvoří houba tmavá, fialově pigmentovaná sklerocia o průměrné hmotnosti 30 mg. Jednotlivá sklerocia obsahují námelové alkaloidy v množství 0,7 % až 2,2 % hmota, sušiny biomasy při průměrném obsahu 1,6 % hmota, sumy alkaloidů s převahou ergokominu, α-ergokryptinu a β-ergokryptinu.

Příklad 3

Příklady využití kmene CCM9367

a) Z potřebného množství trvanlivé suché námeloviny kmene CCM9367, vyrobené postupem podle patentu CZ 276530, se připravila vodná suspenze konidií. Touto suspenzí konidií se pomocí očkovacího stroje naočkovaly klasy žita ve fázi metání tak, že se na plochu 1 ha použilo 5xl0ⁿ klíčivých konidií rozdělených do dvou dávek s odstupem minimálně dvou dní v průběhu metání. V době zrání žita (zasychání klasů), kdy se začínají sklerocia uvolňovat z lůžka, tj. za cca 55 dnů, se provedla sklizeň narostlých sklerocií kombajnem. Z 1 ha bylo takto získáno v průměru 1420 kg tmavě fialově pigmentovaných sklerocií, obsahujících v průměru 1,6 % hmota, sumy alkaloidů a tato suma je tvořena z 97 % ergokominem, a-ergokryptinem a β-ergokryptinem. Získaná droga byla vyextrahována a extrakty byly použity pro výrobu substancí ergotoxinového typu a pro výrobu polosyntetických námelových alkaloidů.

b) Z potřebného množství trvanlivé suché námeloviny kmene CCM9367, vyrobené postupem podle patentu CZ 276530, se připravila vodná suspenze konidií. Touto suspenzí konidií se pomocí postřikového stroje naočkovaly klasy žita ve fázi kvetení tak, že se na plochu 1 ha použilo 5xl0ⁿ klíčivých konidií rozdělených do minimálně tří dávek během kvetení. V době zrání žita (zasychání klasů), kdy se začínají sklerocia uvolňovat z lůžka, tj. za cca 55 dnů, se provedla sklizeň narostlých sklerocií kombajnem. Z 1 ha bylo získáno 1420 kg tmavě fialově pigmentovaných sklerocií, obsahujících v průměru 1,6 % hmota, sumy alkaloidů a tato suma byla tvořena z 97 % ergokominem, α-ergokryptinem a β-ergokryptinem. Získaná droga byla vyextrahována, extrakty byly použity pro výrobu substancí ergotoxinového typu a pro výrobu polosyntetických námelových alkaloidů.

c) Při použití triticale a sterilních analogů žita i triticale v experimentech uspořádaných shodně s výše popsanými bylo dosaženo shodných výtěžků alkaloidů, konkrétně ergokominu, aergokryptinu a β-ergokryptinu.

d) Ze sklerocií kmene CCM9367 byly izolovány standardními postupy, které jsou odborníkovi známé, přirozené námelové alkaloidy jako je ergokomin, α-ergokryptin a β-ergokryptin, případně další, které byly dále využity pro přípravu léčivých přípravků ergotoxinového typu, nebo k přípravě kyseliny lysergové a polosyntetických derivátů námelových alkaloidů.

Průmyslová využitelnost

Kmen CCM9367 je využitelný ve farmaceutickém průmyslu jako nový zdroj námelových alkaloidů s vysokým obsahem ergokominu, α-ergokryptinu a β-ergokryptinu pro výrobu jak ergotoxinových substancí a lékových forem, tak pro výrobu polosyntetických derivátů.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Izolovaný kmen houby Clavícepspurpurea (Fr.) Tul., uložený v České sbírce mikroorganismů Masarykovy Univerzity v Brně pod přírůstkovým č. CCM9367.
2. Izolovaný kmen houby podle nároku 1, tvořící při parazitickém růstu na obilninách, zejména žitu, Secale cere ale. nebo triticale, kříženci žita a pšenice, Trítícum aestivum, a jejich sterilních analozích, sklerocia, která obsahují sumu alkaloidů od 0,7 % hmotnostních do 2,2 % hmota., průměrně 1,6 % hmota., vztaženo na sušinu biomasy sklerocia.
3. Izolovaný kmen houby podle nároku 1 nebo 2, kde je průměrně 97 % sumy alkaloidů tvořeno ergokominem, a-ergokryptinem a β-ergokryptinem.
4. Kultura z kmene houby podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 na žitu, jeho kultivarech a genetických liniích, nebo na triticale, jejich dalších křížencích, kultivarech a genetických liniích.
5. Sklerocia kmene houby podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4.
6. Použití kmene houby podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 nebo kultury podle nároku 4 nebo sklerocií podle nároku 5 pro výrobu přirozených námelových alkaloidů a/nebo jejich polosyntetických derivátů.
7. Použití podle nároku 6, kde námelové alkaloidy jsou vybrány ze skupiny obsahující ergokomin, α-ergokryptin a β-ergokryptin, kyselinu lysergovou a z nich připravené polosyntetické deriváty.
8. Použití podle nároku 7, kde námelovým alkaloidem je ergokomin, aergokryptin a β-ergokryptin.