CZ303435B6

CZ303435B6 - 4-Pyrimidinyl-N-acyl-1-fenylalanin, meziprodukt pro jeho prípravu a farmaceutická kompozice

Info

Publication number: CZ303435B6
Application number: CZ20022351A
Authority: CZ
Inventors: Sidduri@Achyutharao; Wright Tilley@Jefferson
Original assignee: F. Hoffmann-La Roche Ag
Priority date: 1999-12-06
Filing date: 2000-11-28
Publication date: 2012-09-12
Also published as: RU2266901C2; CN1218943C; CY1106626T1; CO5080772A1; AR034401A1; CZ20022351A3; HK1054384B; MXPA02005564A; CA2392570A1; HRP20020468A2; TWI256387B; WO2001042225A8; NO20022633D0; DE60034061D1; PL207160B1; JP2003516396A; ATE357433T1; RU2002117422A; PL357601A1; YU40402A

Abstract

4-Pyrimidinyl-N-acyl-1-fenylalanin obecného vzorce I, kde obecné symboly mají specifický význam se hodí pro použití jako léciva pro lécení chorobných stavu zprostredkovaných vazbou VCAM-1 nebo VLA-4 nebo VLA-4-exprimujících bunek, zejména pro lécení revmatoidní artritidy, roztroušené sklerózy, zánetlivého strevního onemocnení a astmatu. Meziprodukt pro jeho prípravu a farmaceutická kompozice s obsahem slouceniny vzorce I.

Description

4-Pyrimidinyl-7V-acyl-l-fenylalanin, meziprodukt pro jeho přípravu a farmaceutická kompozice

Oblast techniky

Vynález se týká 4-pyrimidinyl-7V-acyl-l-fenylalaninu, jehož struktura je uvedena dále, který se hodí pro použití jako léčivo pro léčení chorobných stavů zprostředkovaných vazbou VCAM-1 nebo VLA—4 nebo VLA—4 exprimujících buněk, zejména pro léčení revmatoidní artritidy, rozío troušené sklerózy, zánětlivého střevního onemocnění a astmatu. Vynález se také týká meziproduktu pro přípravu této sloučeniny a farmaceutické kompozice s jejich obsahem.

Dosavadní stav techniky 15

Vaskulární buněčná adhesní molekula-1 („Vascular cell adhesion molecule-1“, VCAM— 1), člen rodiny imunoglobulinových (Ig) supergenů, je exprimována na aktivovaném, ale nikoliv klidovém, endotelu. Integrin VLA—4 (α₄βι), který je exprimován na mnoha typech buněk včetně cirkulujících lymfocytů, eosinofílů, basofílů a monocytů ale ne neutrofilů, je zásadním receptorem pro VCAM-1. Protilátky na kterýkoliv protein působí při infiltraci leukocytů a bránění poškození tkáně u řady živočišných modelů zánětů. Ukázalo se, že anti-VLA—4-monoklonální protilátky blokují emigraci T-buněk při artritidě vyvolané adjuvans, brání eosinofilní akumulaci a bronchokonstrikcí u modelů astmatu, a redukují paralýzu a inhibují infiltraci monocytů a lymfocytů v experimentální autoimunítní encefalitidě (EAE). Ukázalo se, že monoklonální protilátky anti25 VCAM-1 prolongují dobu přežití srdečních aloimplantátů. Nedávné studie demonstrovaly, že anti-VLA—4 mAbs mohou zabránit insulitidě a diabetů u ne-obézní diabetické myši, a výrazně zmírňují zánět u modelu kolitidy kosmanu s bavlněnou zátkou. Dále se prokázalo, že VCAM je exprimován na endotelových buňkách zanícené střevní tkáně u TNB/ethanol krysího modelu zánětlivé střevní choroby (Gastroenterology 1999, 116, 874-883).

Podstata vynálezu

Sloučeniny, které inhibují interakci mezi integriny obsahujícími ct₄ a VCAM-1 budou vhodné jako terapeutická činidla pro léčení chronických zánětlivých onemocnění, jako je revmatická artritida (RA), sclerosis multiplex (MS), astma a zánětlivé střevní onemocnění (IBD). Sloučeniny podle předloženého vynálezu mají tento účinek.

Předmětem vynálezu podle hlavního provedení i) vynálezu je 4 pyrimidinyl-A-acyl— 1-fenyl40 alanin obecného vzorce I kde

(I).

- 1 CZ 303435 B6

Ri představuje skupinu vzorce Y-l

822

kde každý z R₂₂ a R₂₃ nezávisle představuje vodík, C, ₆alkvl, Cj.₆alkoxy, cykloalkyl, aryl, arylCi_₆alkyl, nitro, kyano, C^alkylthio, Ci_6alky]sulfinyl, Ci^alkylsulfonyl, C]_6alkylkarbonyl, halogen, nebo perfluorC] ₆alkyl a alespoň jeden z R₂₂ a R₂₃ je odlišný od vodíku; a R₂₄ představuje vodík, Ci_6a1kyl, C_t6alkoxy, aryl, nitro, kyano, C, ₆alkylsulfonyl, nebo halogen; nebo

R) představuje skupinu Y-2, kterou je pěti- nebo šestičlenný heteroaromatický kruh připojený prostřednictvím atomu uhlíku ke karbonylovému zbytku amidoskupiny, přičemž výše uvedený kruh obsahuje jeden, dva nebo tři heteroatomy zvolené ze souboru sestávajícího z dusíku, kyslíku a síry a jeden nebo dva atomy tohoto kruhu jsou nezávisle substituovány substituentem zvoleným z Cj_6alkylu, cykloalkylu, halogenu, kyanoskupiny, perfluorC, ₆alkylu nebo arylu a alespoň jeden z takto substituovaných atomů přiléhá k atomu uhlíku připojenému ke karbonylovému zbytku amidoskupiny;

R₂ představuje vodík, C_{t 6}alkyI, substituovaný C^alkyl, aryl Ci_₆alkyl, nebo aryl;

R₃ představuje vodík, C^alkyl, substituovaný C]_6alkyl, aryl Ci_6alkyl, nebo aryl;

R4 představuje vodík, halogen, Ci^alkyl, substituovaný C|_6alkyl, nebo aryl;

R5 představuje vodík, Ci ₆alkyl, chlor nebo C|_6alkoxy;

Rf, představuje vodík, Cí^alky 1, C| ₆alkylkarbonyloxyC_{l ó}alkyL substituovaný C| ₆alkyl, nebo R₆ představuje skupinu vzorce P-3:

kde R32 představuje vodík nebo Ci^alkyl; R₃₃ představuje vodík, C, _ňalkyl nebo aiyl; R₃₄představuje vodík nebo Ci_6alkyl; h představuje celé číslo s hodnotou 0 až 2; g představuje celé číslo s hodnotou 0 až 2; součet čísel h a g má hodnotu 1 až 3; nebo

Ré představuje skupinu vzorce P-4:

(P-4), kde R₃₂, g, a h mají výše uvedený význam; Q' představuje O, S, -(CH₂)j-, nebo skupinu vzorce N-R₃₅; kde R₃₅ představuje vodík, C] ₆alkyl, Ci ^alkylkarbony 1, C] _óalkoxykarbony 1; j představuje číslo 0, 1 nebo 2;

nebojeho farmaceuticky přijatelné soli;

kde

-2 CZ 303435 B6 pojem „substituovaný Ci^alkyl“ znamená Ci^alkylskupinu, která je substituována jednou nebo více skupinami nezávisle zvolenými z cykloalkylu, nitroskupiny, aryloxyskupiny, arylu, hydroxyskupiny, halogenu, kyanoskupiny, Ci^alkoxyskupiny, C^alkylkarbonylu, C₁₆alkyhhioskupiny, Q «alkylsulfínylu, Ci «alkylsulťonylu, aminoskupiny a mono nebo diCi^alkylamínoskupiny; pojem „aryl“ znamená fenylskupinu nebo nafty 1 skupinu; a pojem „cykloalkyl“ znamená 3- až 7-členný karbocyklický kruh.

Přednostní provedení této sloučeniny zahrnují zejména i i) 4-pyrimidinyl-/V-acyl-l-fenylalanin podle provedení i) obecného vzorce I, kde R₂ představuje vodík, C] „alkyl, substituovaný C_t «alkyl, aryl C^alkyl, nebo aryl;

R₃ představuje vodík, Ci ₆alkvl, substituovaný C_t ^alkyl, aryl C] „alkyl, nebo aryl; a

R4 představuje vodík, Cí^alkvI, perfluorCi „alkyl, nebo aryl;

kde pojem „aryl“ znamená fenylskupinu nebo nafty I skup i nu;

iii) 4—pyrimidinyl—jV—acyl—1—fenylalanin podle provedení i) obecného vzorce I, kde R₂ představuje vodík, Cj^alkyl, substituovaný Cj ₆alkvk aryl C1 „alkyl, nebo aryl;

R₃ představuje vodík, C_t „alkyl, substituovaný C] «alkyl, nebo aryl; a

R4 představuje vodík, halogen, Cj. „alkyl, substituovaný CJ ₆alkyl, nebo aryl;

kde pojem „aryl“ znamená fenylskupinu nebo naftylskupinu;

iv) 4-pyrimidinyl-A-acyl-l -ťenylalanin podle kteréhokoliv z provedení i) až iii) obecného vzorce I, kde

R₂ představuje vodík, C^alkyl, substituovaný C1₆alkyl, aryl C_{t 6}alkyl, nebo aryl;

R₃ představuje vodík, C]_«alkyl, substituovaný C1 «alky 1, aryl C i„alkyl, nebo aiyl; a R4 představuje vodík, Cj „alkyl, perťluorCi «alkyl. nebo aryl; kde pojem „aryl“ znamená fenylskupinu nebo naftylskupinu;

v) 4-pyrimidmyl-7V-acyl-l-fenylalanin podle kteréhokoliv z provedení i) až iv) obecného vzorce I, kde

R₂ představuje vodík, C| «alkyl nebo perfluorC^alkyl;

R₃ představuje vodík, Ci_«alkyl, substituovaný C_t «alkyl, nebo aryl; a

R4 představuje vodík, Ci^alky 1, perfluorCi_«alkyl, nebo aryl;

kde pojem „aryl“ znamená fenylskupinu nebo naftylskupinu;

-3CZ 303435 B6 vi) 4-pyrimidinyl-A-acyl-l-fenylalanin podle kteréhokoliv z provedení i) až iv) obecného vzorce I, kde R] představuje skupinu vzorce Y-l, kde každý z R₂₂ až R₂₃ nezávisle představuje C, ₆ alkyl nebo halogen; a R₂₄ představuje vodík;

vii) 4 -pyrimidinyl-\-acyl-l-fenylalanin podle kteréhokoliv z provedení i) až iv) obecného vzorce I, kde R] představuje skupinu vzorce Y-l, kde každý z R₂₂ až R₂₃ nezávisle představuje vodík nebo halogen; a R₂₄ představuje Cj ₆alkoxyskupínu;

viii) 4-pyrimidinyl-/V-acyl-l-fenylalanin podle kteréhokoliv z provedení i) až iv) obecného io vzorce I:

kde R] má význam uvedený v provedení i);

R₂ představuje C, ₆alkyl:

R₃ představuje C_b^alkyl;

K, představuje vodík, perfluorC, <,alkyl nebo Ci_6alkyl;

R₅ představuje vodík nebo C]_₆alkyl; a

Ró představuje vodík, C] ₆alkyl, Cj ₆alkylkarbonytoxyCi ₆alkyk nebo

R_ó představuje skupinu vzorce P-3 definovanou v provedení i), nebo 25

R^ představuje skupinu vzorce P-4 definovanou v provedení i);

ix) 4-pyrimidinyl-V-acyl-l-fenylalanín podle provedení viii), kde Ri představuje skupinu vzorce Y-l

kde každý z R₂₂ a R₂₃ nezávisle představuje perfluorC] _₆alkyl, C[_₆alkyl nebo halogen; a R₂₄ představuje vodík;

x) 4-pyrimidinyl-jV-acyl-l-fenylalanin podle provedení ix), kde každý z R₂ a R₃ představuje 35 C| ₆alkyI; R₄ představuje vodík nebo C|_₆alky 1, a R₅ a R₆ jsou atomy vodíku;

xi) 4-pyrimidinyl-iV-acyl-l-fenylalanin podle provedení x), kterým je

Y-[(2,6-dichlorfenyl)karbonyl]-4-(l,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalanin;

-4CZ 303435 B6

A- [(2-brom-6-methylfenyl)karbonylJ^-(1.3.6 trimethyl -2,4-dioxo-5-pyrimidin\l)-L -fenylalanin;

N-[(2-ch lor-6-methyl feny l)karbonyl l,3,6-trimethy!-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalanin;

/V-f(2-ethyl-6-methylfenyl)karbonyl]-4(l,3.6-triinethyl-2.4-dioxo-5-pyrimidinyl>Lfenylalanin;

A'-[[2-(2-methylethyl)-6-methylfeny!]karbonylJ4-<b3.6-triiriethy!-2,4-dioxo-5-pyrÍmÍdÍnyl)-L-fenylalanin;

A-[(2,6-difluorfenyl)karbonyl]—4-(1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalanin;

Y-[[2-fluor-6-(trifluormethy]fenyl)fenyl]karbonyl]-4-(l,3,6-trimethyl-2,4-dÍoxo-5-pyrirnidiny I )-L-feny la 1 an i n;

A^L[[2,6-di(2-methylethyl)fenyl)karbonyl]-4-(l,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidÍnyl)-Lfenylalanin;

;V-[(2-chlor-6-ethylfenyl)karbonyl]-4-<k3,6-trimethyl-2.4-dioxo-5pyrimidinyl)-Lfenyl15 alanin;

N-[(2-chlor-6-propylfenyl)karbonyI]-4—(l,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenyIalanin;

;V-[[2-chloró-(2-methylethyl)fenyl]karbonyl]—4-(1,3,6-trimethyl-2,4~dioxo-5-pyrimidinyl)L-fenylalanin;

A-[(2,6—dichlorfenyl)karbonyl]-4-( 1,3-diethyl-6-methyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalanin; nebo

A-[(2-chlor-6—Tnethylfenyl)karbonyl]—4-( k3diethyl-6-methyl' 2,4-dioxo-5-pyritnidinyI)-Lfenylalanin;

xii) 4-pyrimidinyl-Af-acyl-l -fenylalanin podle provedení vili), kterým je

A'[_(2-chlor-6-methylťenyl)karbonyl]-4-(k3dirnethyl-2.4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fcnyl· alanin;

#-[(2-brom-6-methy Ifenyl)karbonyl]-4-( 1,3-di methy 1-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenyl30 alanin; nebo

A' [(2-brom 5-methoxyfenyl)karbonyl]—4-(l,3-dimethyl-2,4-dioxo-5~pyrimÍdinyl)-L-fenylalanin;

xiii) 4-Pyrimidinyl-A^?-acyl-l-fenylalanin podle provedení ix), kde každý z R₂ a R₃ představuje 35 C|_₆alkyl; R4 představuje vodík nebo Ci^alkyl, a R5 představuje vodík, a R« představuje vodík,

Ci_óaIkylkarbonyloxyC|_₆alkyl, Ci_₆alkyl; nebo R₆ představuje skupinu vzorce P-3;

^33

-(CHjJh-g-ÍCHjVN;

(P-3), kde R32 představuje vodík nebo Cj-^alkyl; R₃₃ představuje vodík, Ci-^alkyl nebo aryl; R₃₄ představuje vodík nebo C^alkyl; h představuje celé číslo s hodnotou 0 až 2; g představuje celé číslo s hodnotou 0 až 2; součet čísel h a g má hodnotu 1 až 3; nebo R* představuje skupinu vzorce P—4;

-<CHa)_h*-C-(C (P-4), kde

-5 CZ 303435 B6

R32, g, a h mají výše uvedený význam; Q' představuje O, S, -(CH₂)j-, nebo skupinu vzorce N-R₃₅; kde R35 představuje vodík;

přičemž pojem „aryl“ znamená fenylskupinu nebo naftyIskupinu;

xiv) 4-pyrimidinyl-7V-acyl-l-fenylalanin podle provedení xiii), kde R<, představuje Ci_₆alkyl;

xv) 4-pyrimidinyl-'V-acyl-l-fenylalanin podle provedení xiv), kterým je ethylester A-[(2,6-dichlorfenyl)karbonyl]-4-( 1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-Lfenylalaninu;

ethylester A-[(2-chlor-6-methylfenyl)karbonyl]^4—(l,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)L-fenylalaninu; nebo ethylester Λ-[(2,6—difluorťenyl)karbonyl]—4—(1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrÍmÍdinyl)-L— fenylalaninu;

xvi) 4-pyrimidinyl-2V-acyl-]-fenylalanin podle provedení xiii), kde Ró představuje C^alkylkarbony loxy C j -^alky 1;

xvii) 4-pyrimidinyl-A-acyl-l-fenylalanin podle provedení xvi), kterým je l-(acetoxy)ethylester Ά-[(2,6—dichlorfenvl)karbonyl]-4-(h3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalaninu;

1- (acetoxy)ethylester JV-[(2-ehlor-6-methylfenyl)karbonyl]-4-(1,3,6-4rinriethyl-2,4-dioxo-525 pyrimidinyl)-L-fenylalaninu nebo l~(acetoxy)ethylester JV-[(2,6-di fluor feny l)karbonyl]—4(1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenyIalaninu;

xviii) 4-pyrimidinyl-TV-acyl-l-fenylalanin podle provedení xiii), kde R<, představuje skupinu vzorce P-3, kde R₃₂ představuje vodík; každý z R₃₃ a R34 představuje C| ₆alkyl; h představuje číslo 1 a g představuje číslo 0;

xix) 4-py rimidinyl-/V-acy 1-1-feny lalanin podle provedení xviii), kterým je

2[(;V_;V-diethyl)amino]ethylester A/-[(2,6-dichlorfenyl)karbonyl]-4-(l,3,6-trimethyI-2,4-di35 oxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalaninu;

2- [(A’,.V-diethyl)aminoJethylester ;V [(2-chlor-6-methylfenyl)karbonyll—4 <1,3,6-trímethyl 2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalaninu nebo

2-[(Λζ V-diethyl)amíno]ethylester N--[(2,6--difluorfenyl)karbony 1 ]-4-( 1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalanÍnu;

xx) 4-pyrimidinyl-ÍV-acyl-l-fenylalanin podle provedení xiii), kde představuje skupinu vzorce P—4, kde R₃₂ představuje vodík; h představuje číslo 1, g představuje číslo 0 a Q' představuje O;

xxi) 4-pyrimidinyl-N-acyl-l-fenylalanin podle provedení xx), kterým je

2-(4-morfolino)ethylester .\-[(2.6-dichlorfenyl)karbonvl 4-( 1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5pyrimidinyl)-L-fenylalaninu nebo 2-(4-morfolino)ethylester jV-[(2-chlor-6-methylfenyl)karbony!] 4-(l ,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalaninu;

xxii) 4-pyrimidiny]-7V-acyl-l-fenylalanin podle provedení íx), kde každý z R₂ a R3 představuje C| ₆alkyl; R₄ představuje perfluorC]_₆alkyl, a R₅ a Rf, jsou atomy vodíku;

-6CZ 303435 B6 xxiii) 4-pyrimidinyl-A-acyll-fenylalanin podle provedení xxii), kterým je

Λ^;-[ 1 —(2,6dichlorfenyl)karbony1]-4—(1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-ó-(triflLiormeth\T)-5pyrimidinyl)-L-fenylalanin;

,Y-[(2-chlor-6rnethy Ifenv l)karbonylj—4-[ 1,3-dimethyl-2,4-dioxo-6~(trifluormethyl)-5pyrimidinyl)-L-fenylalanin; nebo

A^r-[[(2-fluor-6-(trifluormethyl)fenyl] karbony l>4-(L3-dimethyl-2,4-dioxo-6-(trifluormethyl)

5-pyrimidinyl)-L-fenylalanin;

io xxiv) 4-pyrimidinyl-A-acyI-l-fenylalanin podle provedení ix), kde každý z R₂ a R₃ představuje Ci.₆alkyl; R4 představuje vodík; R₅ představuje Ci ^alky 1 a Rf, představuje vodík;

xxv) 4-'pyrimidinyl- Y-acyl-l-fenylalanin podle provedení viii), kterým je

A-[(2-chlor-6-mcthylfeny1)karbonyl]-4-( 1,3-dimethyl-2,4-<iioxo-5-pyrimidinyl)-3-methy 1L-fenylalanin;

jV-[(2,6~dichlorfenyl)karbonyl]-4-(1,3-di methy 1-2,4-dioxo-5-pyrimid i nyl)-3 -methy 1-Lfenylalanin; nebo jV-[(2,6-dichlorfenyl)karbonyI]-4-(l,3,6-trimethyI-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-3-methyl-L20 fenylalanin;

xxvi) 4-py rimid i nyl-/V-acyl-l-fenylalanin podle provedení viii), kde každý z R₂ a R₃ představuje C, ₆alky 1; R4 představuje vodík; a R_s a R$ představují atomy vodíku;

xxvi i) 4-pyrimidinyl-A-acyl-l -fenylalanin podle provedení xxvi), kde R] skupinu vzorce Y-l;

xxviii) 4-pyrimidinyl-7V-acyl-l-fenylalanin podle provedení xxvi), kde Ri C^alkyl nebo halogen; a R₂₄ představuje vodík;

ixxx) 4-pyrimid i nyl-V-acy 1-1-fenylalanin podle provedení xxv i i), kde R| skupinu vzorce Y-l, kde každý z R₂₂ a R₂₃ nezávisle představuje vodík nebo halogen; a R₂₄ představuje Cj^alkoxyskupinu;

xxx) 4—pyrimidÍnyl-jV-acyl-l-fenylalanin podle provedení xxvi), kde R[ představuje pěti- nebo šestičlenný heteroaromatický kruh připojený prostřednictvím atomu uhlíku ke karbonylovému zbytku amidoskupiny, přičemž výše uvedený kruh obsahuje jeden, dva nebo tři heteroatomy zvolené ze souboru sestávajícího z dusíku, kyslíku a síry a jeden nebo dva atomy tohoto kruhu jsou ne závisle substituovány substituentem zvoleným z C| ₆alkylu, cykloalkylu, halogenu, kyanoskupiny, perfluoralkylu nebo arylu a alespoň jeden z takto substituovaných atomů přiléhá k atomu uhlíku připojenému ke karbonylovému zbytku amidoskupiny.

Předmětem vy nálezu je dále také (provedení vynálezu xxx i)) 4-py rimid i nyl-A-acy 1-1 -fenylalanin obecného vzorce II

R3

-7CZ 303435 B6 kde substítuenty R₂ až R₅ mají význam uvedený v provedení i), Pi představuje Zerc-butoxykarbonylskupinu (Boc) nebo benzyloxykarbonylskupinu a P₂ představuje Ci^alkyl nebo C_t6alkyl substituovaný alespoň jednou skupinou nezávisle zvolenou z cykloalkylskupiny s 3- až 7členným karbocyklickým kruhem, nitroskupiny, aryloxyskupiny, arylskupiny, hydroxyskupiny, halogenu, kyanoskupiny, C_t.<,a Ikoxy skupiny, C_{t 6}alkylkarbonylskupiny, C|_₆alky lth ioskup iny, Ci ₆alkylsulfinylskupiny, C, _₆alkylsulfonyl skupiny, aminoskupiny a mono- nebo di(Ci_₆alkyl)aminoskupiny, přičemž pod pojmem „aryl“ se rozumí fenyl nebo naftyl.

Předmětem vynálezu je dále také (provedení vynálezu xxxii) 4-pyrimidinyl-7V-acyl-l-fenylio alanin podle kteréhokoliv z provedení i) až xxx) pro použití jako léčivo.

Dále je předmětem vynálezu také (provedení vynálezu xxxiii)) farmaceutická kompozice, která obsahuje 4-pyrimidinyl-A'-acy 1-1 -fenylalanin podle kteréhokoliv z provedení i) až xxx) nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl a farmaceuticky přijatelný nosič.

Předmětem vynálezu je také (provedení vynálezu xxxiv)) 4-pyrimidinyl- V-acyl-l-íenylalanin podle kteréhokoliv z provedení i) až xxx) pro použití pri léčení chorobných stavů zprostředkovaných vazbou VCAM-1 nebo VLA-4 nebo VLA-4-exprimujících buněk, zejména pro léčení revmatoidní artritidy, roztroušené sklerózy, zánětlivého střevního o nemocnění a astmatu.

Předmětem vynálezu je dále také (provedení vynálezu xxx v)) způsob výroby farmaceutické kompozice podle provedení xxxiii), při němž se 4-pyrimidinyl-A-acyl-l-fenylalanin podle kteréhokoliv z provedení i) až xxx) nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl převede spolu s kompatibilním farmaceuticky přijatelným nosičem na galenickou formu,

Konečně je předmětem vynálezu (provedení vynálezu xxxvi)) použití 4-pyrimidinyl-V-acyl-lfenylalaninu podle kteréhokoliv z provedení i) až xxx) nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli pro výrobu léčiva pro léčení revmatoidní artritidy, roztroušené sklerózy, zánětlivého střevního onemocnění a astmatu.

Jak se používá v tomto popise, termín „halogen znamená některý ze čtyř halogenů, fluor, chlor, brom a jod, pokud není uvedeno jinak. Výhodnými halogeny jsou brom, fluor a chlor.

Termín ..C|₆alkyl, samotný nebo v kombinaci, znamená alkylovou skupinu s přímým nebo větveným řetězcem, obsahující maximálně šest atomů uhlíku, jako je methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, «-butyl, sek-butyl, isobutyl, Zm-butyl, n-pentyl, «-hexyl a podobné.

Jako příklady „substituovaného Ci-6alkylu“ je možno uvést 2-hydroxyethyl, 3-oxobutyl, kyanomethyl a 2-nitropropyl.

Termín ..perfluorC] _óalky l zahrnuje C, alkyl skupinu, kde všechny vodíky jsou substituovány fluorem, například trifluormethyl a pentafluorethyl.

Termínem „C, ₆alko\y skup ina se například označuje methoxy-, ethoxy, η-propoxy-, iso45 propoxy- η-butoxy-, íerc-butoxyskupina a podobné skupiny s přímým nebo větveným řetězcem.

Termínem C[ _₆alkylthioskupina se označuje C| ₆alkylskupina vázaná na zbytek molekuly přes dvoj vazný atom síry, například methy Imerkaptoskupi na nebo isopropylmerkaptoskupina. Termín „Ci ₆alkylsulfinyfr označuje Ci_₆alkylskupinu, jak je definována výše, vázanou na zbytek molekuly přes atom síry v sulfinylové skupině. Termín ..C|_₆alkylsulfonyl“ označuje Cj ₆alkylskpinu, jak je definována výše, vázanou na zbytek molekuly přes atom síry v sulfonylové skupině.

-8CZ 303435 B6

Termín „arylC_]6alkyl“ označuje C^alkylskupinu substituovanou fenylem nebo naftylem, jako je například benzyl a podobné.

Příklady heteroarylových kruhů jsou pyridin, benzimidazol, indol, imidazol, thiofen, isochinolin, chinolin a podobné.

Termínem „C₁₆alkanoyl“ se například označuje acetyl, propionyl a podobné. Termín „perfluorCi ₆alkanoyl“ označuje například a přednostně trifluormethyl nebo pentafluorethylskupinu vázanou na zbytek molekuly přes karbonylovou skupinu.

Termín „perfluorCi ₆alkanoylaminoskupina“ označuje perfluorC]_6alkanoylskupinu vázanou na zbytek molekuly přes aminoskupinu.

Termín „Cj-ůalkylkarbonylaminoskupina“ označuje C|.₆alkylkarbonylové skupiny vázané na zbytek molekuly přes atom dusíku, jako je acetylaminoskupina. Termín „C_b^alkvlaminokarbonyl“ označuje C i^alky lam i no skupiny vázané na zbytek molekuly přes karbonylovou skupinu.

Termín „aiylaminokarbonyl“ označuje ary lové skupiny definované výše vázané na aminoskupinu dále vázanou na zbytek molekuly přes karbonylovou skupinu.

Termín „aroyl“ označuje mono- nebo bicyklický aryl nebo heteroaryl vázaný na zbytek molekuly přes karbonylovou skupinu. Příklady aroylových skupin jsou benzoyl, 3-kyanobenzoyl, 2naftoyl, nikotinoyl a podobné.

Farmaceuticky přijatelné soli jsou ve stavu techniky velmi dobře známé a mohou být připraveny běžnými metodami, které jsou dány chemickou povahou sloučenin. Příklady farmaceuticky přijatelných solí pro kyselinové sloučeniny jsou alkalické kovy nebo kovy alkalických zemin, jako jsou sodné, draselné, vápenaté, hořečnaté, bazické aminy nebo bazické aminokyseliny, amonné nebo alkylamonné soli. Konkrétními vhodnými solemi sloučenin podle vynálezu jsou sodné soli, jako od kyselinové sloučeniny, kde R$ je H. Sodná sůl kyseliny podle tohoto vynálezu je snadno získaná z kyseliny zpracováním s hydroxidem sodným. Pro zásadité sloučeniny jsou příklady solí anorganických nebo organických kyselin, jako je kyselina chlorovodíková, bromovodíková, sírová, dusičná, fosforečná, citrónová, mravenčí, fumarová, ma lei nová, octová, jantarová, vinná, methansulfonová a/?-toluensulfonová.

Sloučeniny obecného vzorce II jsou vhodné jako meziprodukty pro přípravu sloučenin vzorce I.

Sloučeniny podle vynálezu inhibují vazbu VCAM-1 a fíbronektinu na VLA-4 na cirkulujících lymfocytech, eosinofilech, basofilech a monocytech („VLA-exprimující buňky“). Vazba

VCAM-1 a fíbronektinu na VLA na takových buňkách je známá, že je implikována v některých chorobných stavech, jako je revmatoidní artritida, skleróza multiplex, zánětlivé onemocnění střev, a zejména ve vazbě eosinofilů na vzdušnicový endotel, což se podílí na vzniku zánětu plic, který vyústí v astma. Proto jsou sloučeniny podle vynálezu vhodné pro léčení astmatu.

Na základě jejich schopnosti inhibovat vazbu VCAM-1 a fíbronektinu na VLA-4 na cirkulující lymfocyty, eosinofily, basofily a monocyty, mohou být sloučeniny podle vynálezu použity jako léčiva nebo jako farmaceutické prostředky, zejména vhodné pro léčení chorob, o nichž je známo, že jsou spojeny s touto vazbou, nebo zprostředkovány takovou vazbou. Příklady těchto onemocnění jsou revmatoidní artritida, skleróza multiplex, astma a zánětlivé onemocnění střev.

Sloučeniny podle předloženého vynálezu jsou přednostně použity pro léčení chorob, které zahrnují plicní záněty, jako je astma. Plic ní zánět, který vyústí v astma, se vztahuje k aktivaci aplicní infiltraci eosinofilů, monocytů a lymfocytů, které byly aktivovány určitými stavy nebo látkami spouštějícími astma.

-9CZ 303435 B6

Dále také sloučeniny podle vynálezu i nh i bují vazbu VCAM-1 a MadCAM na celulámí receptor alfa—4-beta-7, také známý jako LPAM, který je exprimován na lymfocytech, eosinofilech a T-buňkách. Ačkoliv přesná role interakce alfa4-beta-7 s různými ligandy, při zánětlivých stavech, jako je astma, není zcela zřejmá, sloučeniny podle vynálezu, které inhibují obě vazby alfa4-betal a alfa4-beta7 receptoru, jsou zejména účinné u živočišných modelů astmatu. Práce s monoklonálními protilátkami na alfa4-beta7 indikují, že sloučeniny, které inhibují alfa4-beta7 vazbu na MadCAM nebo VCAM, jsou vhodné pro léčení zánětlivých onemocnění střev. Rovněž by mohly být vhodné pro léčení jiných onemocnění, u nichž je taková vazba prokázána jako příčina zdravotního poškození nebo symptomů.

Sloučeniny podle vynálezu mohou být podávány orálně, rektálně nebo parenterálně, jako intravenosně, intramuskulámě, subkutánně, intratekálně nebo transdermálně; nebo sublingválně, nebo jako ofitalmo logické přípravky, nebo jako aerosol v případě zánětů plic. Kapsle, tablety, suspenze nebo roztoky pro orální podávání, čípky, injekční roztoky, oční kapky, balzámy nebo roztoky pro spreje jsou příklady forem podávání.

Preferovanými formami podávání jsou intravenosní, intramuskulámí, orální podávání nebo inhalacemi. Dávky, v nichž jsou sloučeniny podle vynálezu podávány v účinných množstvích, závisí na povaze konkrétní účinné látky, věku a potřebách pacienta a typu podávání. Dávky se stanoví běžnými postupy, jako klinickými testy. Vynález tedy dále zahrnuje způsob léčení hostitele trpícího chorobou, při níž je vazba VCAM-1 nebo fibronektinu na VLA-4 exprimující buňky příčinným faktorem pro symptomy choroby nebo poškození, podáváním množství sloučeniny podle vynálezu potřebného pro inhibici VCAM-1 nebo fibronektinové vazby na VLA-4exprimující buňky tak, že se uvedené symptomy nebo uvedené příznaky redukují. Obecně se dává přednost dávkám asi 0,1-100 mg/kg tělesné hmotnosti na den, se zvláště výhodnými dávkami 1-25 mg/kg na den, a ještě výhodnější jsou dávky 1-10 mg/kg tělesné hmotnosti na den.

Léčiva nebo farmaceutické kompozice (přípravky, prostředky) podle vynálezu obsahují farmaceuticky účinné množství sloučeniny podle vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič. Tyto kompozice mohou být formulovány jakýmikoliv běžnými prostředky. Tablety nebo granule mohou obsahovat řadu pojiv, plniv, nosičů nebo ředidel. Kapalné prostředky mohou být, například, ve formě roztoku mísitelného se sterilní vodou. Kapsle mohou obsahovat plniva nebo zahušťovadla spolu s účinnou složkou. Dále mohou být přítomna aditiva pro zlepšení chuti, stejně jako látky obvykle používané jako konzervační, stabilizující látky, činidla pro zadržování vlhkosti a emulgační činidla stejně jako soli pro změnu osmotického tlaku, pufry a další aditiva.

Výše uvedené nosičové materiály a ředidla mohou obsahovat jakékoliv běžně farmaceuticky přijatelné organické nebo anorganické látky, jako je voda, želatina, laktosa, škrob, stearát hořečnatý, talek, arabská guma, polyalkylenglykoly a podobné.

Orální jednotkové dávkové formy, jako jsou tablety a kapsle, přednostně obsahují od 25 do 1000 mg sloučeniny podle vynálezu.

Kromě zkratek vysvětlených v příkladech provedení se v následujícím popisu také používá následujících zkratek:

DIBAL = diisobutylaluminiumhydrid

TFA = kyselina trifluoroctová

Me = methyl

Boc = /crc-butyloxykarbonyl dba = bis(dibenzyliden)aceton

DMSO = dimethylsulfoxid

PBS = fosforečnanem pufrovaný roztok chloridu sodného

EDTA = kyselina ethylendiamintetraoctová

PMSF = fenylmethansulfonylfluoríd

- 10CZ 303435 B6

SDS = dodecylsulfát sodný.

Obecně mohou být sloučeniny podle předloženého vynálezu připraveny z vhodných fenylalaninových derivátů prostřednictvím reakce katalyzované palladiem s 5-halo-2,4-dio\opyrimidonem.

Jak je znázorněno v reakčním schématu 1, je 4-jod- nebo 4-brom-fenylalanínový derivát, jako je 1, konvertován na chráněný fenylalaninový derivát 2, v němž R5' je vodík, chlor, nižší alkyl nebo nižší alkoxyskupina, P] je standardní dusíková chránící skupina, jako je Boc, nebo karbobenzyloxyskupina, a P₂ je nižší alkyl nebo substituovaný nižší alkyl vhodně zvolený, aby sloužil jako chránící skupina nebo jako část proléčiva. Skupina P₂ může být zavedena běžnými postupy obdobnými, jako jsou prováděny v chemii peptidu. Pořadí přidávání P| a P₂ není kritické a bude záviset na konkrétním výběru reagens. Diskuse týkající se použití a v nanášení chránících skupin je uvedena v Theodora W. Greene a Peter G, M, Wuts, Protéct ing Groups in Organic Synthesis, Wiley Interscience, New York 1991. Alternativně může být konvertována sloučenina vzorce 1 na sloučeninu vzorce 4, v níž RT reprezentuje složku acylskupiny podle vynálezu. Běžnou metodou je zavedení esterové skupiny P₂ jako první, následně kuplovací reakce volného aminu s použitím běžných peptidových kup lo vacích činidel, například H BTU za přítomnosti Zerc-aminové báze, jako je diethylisopropylamin. Opět je konkrétní výběr reagens dán obměnou posloupnosti zavádění R/ a P₂. Konverze sloučeniny vzorce 2 nebo 4 na deriváty 3 nebo 5, v nichž M reprezentuje substituovaný atom cínu nebo boru, může být provedena zpracováním s vhodnými typy, např. hexamethyldicínem, hexabutyldicínem nebo tetraalkoxydiborem za přítomnosti zdroje palladia nula. Metodologie je zpracována a uvedena v F. Friedrich a P. J. Stang, ed. Metal Catalyzed Cross Coupling Reactions, Weinheim, Germany, 1998.

Reakční schéma 1

Pyrimidin-2,4-diony (deriváty uracilu) vzorce 6, kde R/ je vodík, nižší alkyl nebo perfluor-nižší alkyl, jsou v literatuře dobře známé nebo mohou být vyrobeny známými postupy. 1,3-Disubstituovaný pyrimidin-2,4-dion vzorce 7, kde R2' a R3' jsou nižší alkyl, aryl—nižší alkyl nebo aryl jsou také známé sloučeniny nebo mohou být připraveny standardními postupy. Zprávy uvádějící metody syntéz jejich sestrojení zahrnují: Shigeo Senda, a kol., Chem. Pharm. Bull. 1974, 22, 189-195, Chem. Pharm. Bull. 1972, 20, 1389-1395, a Yasuo Morita a kol., Chem. Comm. 1997, 359-360. Pro případ, kde R2' a R3'jsou nižší alkyl nebo aryl-nižší alkyl, jsou sloučeniny vzorce 7 dostupné alkylací sloučenin vzorce 6 zpracováním s alkylačním činidlem, jako je jodmethan,

- 11 CZ 303435 B6 benzylbromid, allylbromid za přítomnosti báze jako je uhličitan draselný a popřípadě katalyzátor fázového přenosu. Pro méně reaktivní alkylační činidla může být nezbytné použít silnější bázi jako je hydroxid alkalického kovu a zahřát reakční směs. Sloučeniny vzorce 6 nebo 7, jak jsou definovány výše, mohou být halogenovány na 5-pozici zpracováním s běžnými halogenačními reagens, jako je brom, JV-jodsukcinimid nebo bromsukcinimid ve vhodném rozpouštědle, jako je ledová kyselina octová nebo vodná kyselina octová za získání halogenpyrimidinů vzorce 8, X= Br nebo I, R2' a R3' jsou nezávisle vodík, nižší alkyl, aryl-nižší alkyl nebo aryl, R4' vodík, nižší alkyl nebo perfluor-nižší alkyl.

Reakční schéma 2

O

(6)

Jak je znázorněno v reakčním schématu 3, sloučenina vzorce 8 může být použita v palladiem katalyzované kuplovací reakci s fenylalaninovým derivátem vzorce 3 nebo 5. Například, pokud je M substituovaný cín, z pracování směsi 8 a fenylalaninu vzorce 3 nebo 5 se zdrojem palladia 0 jako je tetrakis(trifenylfosfin)palladium nebo bis(trifenylfosfin)palladium dichlorid, za přítomnosti inertního rozpouštědla, jako je DMF, při teplotě mezi teplotou místnosti a 100 °C poskytne sloučeninu vzorce 9 nebo 10. Sloučeniny vzorce 9 mohou být konvertovány na sloučeniny struktury 10 odstraněním chránící skupiny P, což může být doplněno běžnými způsoby v závislosti na výběru P_b Například, jestliže je P] skupina Boc, může být odstraněna zpracováním se silnou kyselinou, jakou je trifluoroctová kyselina, volitelně za přítomnosti rozpouštědla, jako je dichlormethan a čisticí činidlo. Výsledný volný amin potom může být acylován kyselinou vzorce R/COOH použitím běžných peptidových kuplovacích technik. Například zpracování s HBTU za přítomnosti terč aminové báze jako diethylisopropylaminu za přítomnosti aprotického rozpouštědla, jako je DMF, za získání sloučeniny struktury 10.

Jestliže je volná kyselina 11 požadovaným konečným produktem, může být esterová skupina P₂odstraněna běžnými postupy. Pokud je například P₂ nižší alkyl, např. methyl, může být odstraněn zpracováním s hydroxidem alkalického kovu, například hydroxidem lithným, ve vhodném rozpouštědle, např. vodném THF příp. obsahujícím methanol, aby se napomohlo rozpustnosti. Jestliže P₂ byl benzylová nebo substituovaná benzylová skupina, mohla by být rovněž odstraněna katalytickou hydrogenací nad katalyzátorem s vzácným kovem, například palladiem na uhlíku.

- 12CZ 303435 B6

Reakční schéma 3

Obdobně, jak je znázorněno v reakčním schématu 4, sloučenina struktury 8, kde X je bromid nebo jodid, může byl konvertována na typ vzorce 12, v němž M' reprezentuje substituovaný atom cínu, boru nebo zinku.

- 13 CZ 303435 B6

Reakční schéma 4

V případě derivátů cínu nebo bóru, v nichž M' reprezentuje substituovaný atom cínu nebo bóru, je konverze provedena zpracováním s vhodným typem, např. hexamethyldicínem, hexabutyl5 dicínem nebo tetraalkoxydiborem za přítomnosti zdroje palladia nula. Pro tvorbu derivátu zinku, 12, M' = Zn(halogen), může být dosaženo konverze zpracováním se sloučeninou vzorce 8, X = I, se zdrojem aktivovaného kovového zinku ve vhodném inertním rozpouštědle, např. dimethylacetamidu, při teplotě od teploty místnosti do 100 °C, až je konverze úplná za získání sloučeniny vzorce 12, M' = Zn(halogen). Tyto sloučeniny vzorce 12 mohou reagovat s 4-substituovaným io fenylalaninovým derivátem vzorce 4', v němž X' je jod, brom nebo trifluormethylsulfonyloxyskupina za přítomnosti zdroje palladia nula za získání sloučeniny vzorce 10'. V případě, že esterová skupina reprezentovaná P₂ není částí cílové sloučeniny, může být odstraněna použitím postupů esterové hydrolýzy vhodných pro konkrétní P₂. Například, kde P₂ je nižší alkyl, například methyl, může být odstraněna standardními bazickými hydrolýzami použitím hydroxidu alkalického kovu, například hydroxidu lithného. Při obměně tohoto postupu může být vhodné nést chránící skupinu přes kuplovací reakci a nahradit ji později. V tomto případě může být sloučenina vzorce 2', v níž P| je nižší aIkoxykarbony 1 neb benzyloxykarbonyl a X'je, jak je definován výše, kuplována s pyrimidindionem struktury 12 za získání sloučeniny struktury 9', která

- 14CZ 303435 B6 naopak může být konvertována na sloučeninu podle vynálezu použitím obecných postupů uvedených výše v reakčním schématu 3.

Alternativní cesta ke sloučeninám podle tohoto vynálezu, jak je znázorněno v reakčním schématu

5, který je zvláště vhodný pro sloučeniny, v nichž RV je jiný než vodík, je pro přípravu aldehydu vzorce 14. Ta může být doprovázena reakcí sloučeniny vzorce 12 se sloučeninou vzorce 13, v nichž R₅' reprezentuje nižší alkyl nebo nižší alkoxyskupinu, a X reprezentuje jodid, bromid, trifluormethylsulfonyloxyčásti a Rg reprezentuje chráněný alkohol nebo aldehyd. Pro alkoholy zahrnují vhodné chránící skupiny silylethery, benzylethery. Aldehydy mohou být chráněny jako io jejich acetalové deriváty. Sloučenina vzorce 12 může být konvertována na aldehyd vzorce 15 běžnými kroky, které, pokud Rg je alkohol, by mohly zahrnovat odstranění chránící skupiny, pokud je to nezbytné, následované oxidací. Mohou být použity jakékoliv zběžných reagens pro selektivní oxidaci primárních benzylalkoholů na aldehydy, například zpracováním s aktivovaným oxidem manganiěitým v inertním rozpouštědle. V případě, že R₈ reprezentuje chráněný aldehyd, může být konverze na aldehyd vzorce 15 prováděna vhodným odstraněním chránící skupiny, například hydrolýzou acetalu zředěnou kyselinou. Reakce 15, aby se získala dehydroaminokyselina vzorce 16, může být zajištěna zpracováním s Wittigovým reagens vzorce 17, v němž Pf je nižší alkoxykarbony 1 nebo benzyloxykarbonyl a P₂ je, jak je definován výše. Například zpracování 15 s (±)-/V-(benzyloxykarbony])-a—fosfonglycintri methyl esterem za přítomnosti vhodné báze například tetramethylguanidinu vede přímo k dehydroaminokyselině vzorce 16, P₂ methyl a P/ = benzyloxykarbonyl. Enantioselektivní redukce 16 na L-aminokyselinu 18 může být ovlivněna použitím řady redukujících Činidel vhodných pro účely například nedávno popsaného ethyl-DuPHOS rhodium-reagens (Burk, M. J., Feaster, J. E. Nugent, W. A.; Harlow, R. L. J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 10125) s využitím v podstatě učebnicového postupu. Další konverze 18 na sloučeniny podle vynálezu se může provádět použitím obecných postupů popsaných výše.

- 15CZ 303435 B6

Reakční schéma 5

V jednom provedení je Λ-acylová skupina, R/ struktury 11, odvozena od 2-substituované benzoové kyseliny. Příslušné 2-substituované benzoové kyseliny jsou buď komerčně dostupné nebo mohou být připraveny běžnými postupy. Například or/^o-substituované aryljodidy nebo triflát (trifluormethansulfonát) mohou být karbony 1 ovány za přítomnosti oxidu uhelnatého a vhodného palladiového katalyzátoru. Příprava těchto jodidových nebo trifluormethansulionových meziproduktů závisí na konkrétním požadovaném substitučním vzorci a mohou být získány přímou jodinací nebo diazotací anilinu, následovanou zpracováním se zdrojem jodu, například io jodidu draselného. Trifláty mohou být odvozeny zodpovídajících fenolů běžnými prostředky, jako je zpracování s trifluormethan-sulfon-anhydridem za přítomnosti báze, jako je triethylamin nebo diisopropylethylamin, v inertním rozpouštědle. Jak je zobrazeno v reakčním schématu 6, jeden ze způsobů získání orř&o-substituováných benzoových kyselin zahrnuje zpracování 2— methoxyfenyloxazollnového derivátu, jako je sloučenina 19, Z] a Z₂ - vodík, alkyl, chlor, per15 fluoralkyl, nižší alkoxyskupina, salkylovým Grignardovým činidlem, následované hydrolýzou oxazolinového kruhu podle obecného postupu popsaného Meyers, A. I., Gabel, R., Mihelcik, E. D., J. Org. Chem. 1978, 43, 1372-1379, za získání kyseliny vzorce 20. 2- nebo 2,6—disubstituované benzonitrily také slouží jako obvyklé prekursory odpovídajících benzoových kyselin. V případě vysoce bráněných nitrílů, například 2-chlor-6—methyl benzon i trii u, je běžná hydro lýza za kyselých nebo bazických podmínek obtížná, a lepší výsledky jsou získány Dl BAL redukcí na odpovídající benzaldehyd, následovanou oxidací s použitím oxidačních činidel na bázi chrómu, Další metody jsou doloženy příklady v Chen a kol., WO 99/10312.

- 16CZ 303435 B6

Reakční schéma 6

S odkazem na reakční schéma 7, cyklické kyseliny vzorce 23 jsou známé sloučeniny nebo mohou být připraveny standardními metodologiemi. Pro přípravu substituovaných alkyl- nebo cyklo5 alkylkarboxylových kyselin mohou být použity alkylační reakce použitím dianiontu alkalického kovu kyseliny nebo monoaniontu odpovídajícího esteru. Například ester cykloalkylkarboxylové kyseliny vzorce I může být zpracován se silnou bází, například diisopropylamidem lithným v inertním rozpouštědle, například THF, následně přidáním skupiny R^-Lv, kde R41 reprezentuje požadovaný vedlejší řetězec, jako je substituovaný benzyl, nižší alkyl, nižší alkoxy-alkyl, azido-nižší alkyl a podobné, a reprezentuje odstupující skupinu, jako je bromid, jodid, mesylát nebo podobná skupina, o níž je známo, že se účastní alkylačních reakcí esteru enolátu. Esterový produkt může být hydro lyžován na kyselinu 23 použitím hydroxidu alkalického kovu ve v hodném rozpouštědle, například bezvodém alkoholu. V závislosti na povaze R41 a eventuálním cíli, může být sloučenina 23 kuplována na amin, jako je sloučenina 1, a konvertována na cílovou přímo, nebo R4] může být subjektem pro další zpracování na vhodných místech syntézy. Například pokud R41 je azido-nižší alkylová část, může být azid redukován použitím například trialkylfosfinového reagens, následovaného funkcionalizací produktu aminu alkylací, acylací, sulfonací a podobnými postupy, odborníkovi velmi dobře známými. Jestliže R41 inkorporuje odstupující skupinu, například terminální atom bromu, může být tato skupina přemístěna příslušným nukleofilem, např. methyImerkaptídem sodným, za získání, v tomto případě, thioetheru, který může být požadovaným produktem nebo může být sám dále zpracováván, například oxidací na sulfoxid nebo sulfon použitím standardních reakčních podmínek. Jiné nukleofily, které mohou být použity pro výrobu meziproduktů vedoucích ke sloučeninám podle tohoto vynálezu, zahrnují kyanid sodný, azid sodný, morfolin a jiné. Když R41 inkorporuje ketalovou skupinu, může být tato skupina hydro lyžována na obvyklém místě syntézy za získání ketoskupiny. Tato skupina může být naopak z pracována, například redukcí na alkohol nebo konverzí na derivát, jako je oxim.

Příklady aplikace těchto metod na syntézy sloučenin vzorce 23 jsou uvedeny v Chen a kol,

WO 99/10313.

Reakční schéma 7

Obecně, or/Ao-substituovaný aromatické kyseliny potřebné pro přípravu sloučenin, v nichž R¹ = Y-l, mohou být připraveny, jak je doloženo v Chen a kol., WO99/10312.

Pro syntézu 2-chlor-6-alkylbenzoových kyselin vzorce 28, kde R43 je nižší alkyl, je zvláště vhodný postup popsaný v reakčním schématu 8. Takto je komerčně dostupný aldehyd vzorce 24 konvertován na i min 25, kde R42 je nižší alkyl, přednostně butyl, z pracováním s butylaminem

- 17 CZ 303435 B6 v inertním, hydrofobním organickém rozpouštědle, například heptanu. Získaná sloučenina vzorce 25 je z pracována s přebytkem Grignardova derivátu 26 v inertním rozpouštědle, např. THF, následně zpracována s kyselinou za získání aldehydu vzorce 27. Oxidace 27 na kyselinu vzorce 28 se může provádět běžnými postupy, například zpracováním roztoku 27 ve vhodném rozpouš5 tědle, jako je vodný acetonitril, s chloridem sodným a 30% peroxidem vodíku při nebo pod teplotou místnosti.

Reakční schéma 8

Vhodné může být připravit pro léčiva - estery sloučenin podle tohoto vynálezu, pro něž je více vyhovující zavádět esterovou část na konci syntézy. K těmto účelům může být použita řada běžných technik pro přípravu esterů z karboxy lových kyselin. Typické metody, které mohou být použity, mohou zahrnovat kuplování alkoholu na kar boxy lovou kyselinu za přítomnosti kyseliny, například chlorovodíkové kyseliny, postup běžně známý jako Fisherova esterifíkace. Alternativně může být použito diimidem zprostředkované kuplování mezi karboxy lovou kyselinou a alkoholem, s možným použitím promotoru, jako je 4,4—dimethylaminopyridin. Typickým diimidem je dicyklohexylkarbodiimid. Jinou možností je zpracovávat karboxy lovou kyselinu s reaktivními alkylhalogenidy, například alkyljodidem nebo acyloxymethylchloridem za přítomnosti báze, například hydrogenuhličitanu sodného a inertního rozpouštědla, např. DMF. Konkrétní výběr metody bude stanoven podle povahy konkrétní kombinace karboxylové kyseliny a požadované esterové částí a odborníkovi zdané oblasti techniky to je naprosto zřejmé. Esterové skupiny, které mohou tvořit proléčiva, mohou být zavedeny na kterémkoliv běžném místě syntézy. Například skupina P₂ ve vzorci 1 může reprezentovat požadovaný ester proléčiva a být zadržena ve finálním produktu.

Příklady provedení vynálezu:

Příklady, které následují, jsou pro účely ilustrace a nejsou v žádném případě určeny pro omezení vynálezu.

Obecné metody:

Teploty tání byly stanoveny na Thomas-Hooverově zařízení a jsou nekorigované. Optické rotace byly stanoveny na polarimetru Perkin-Elměrově modelu 241. 'H-NMR spektra byla zaznamenána na spektrometrech Varian XL-200, Mecura-300 nebo Unityplus 400 MHz, použitím tetramethylsilanu (TMS) jako vnitřního standardu. Hmotnostní spektra elektronovými nárazy (El, 70 eV) a bombardováním rychlými atomy (FAB) byla získána na VG Autospec nebo VG

70E-HF hmotnostních spektrometrech. Silikagel použitý pro chromatografií na koloně byl Mallinkrodt SiliCar 230-400 mesh silikagel pro mžikovou chromatografií; kolony byly spuštěny pod tlakem 0 až 5 psi (0-34475 Pa) dusíku pro podporu průtoku. Chromatogramy na tenké vrstvě probíhaly na skleněných tenkovrstvých deskách potažených silikagelem, jak jsou dodávány firmou E. Merck (E. Merck č. 1.05719) a byly vizualizovány pozorováním pod UV světlem 254 nm v prohlížecím boxu, vystavením působení I₂ par, nebo postřikem buď kyselinou fosfomolybdenovou (PMA) ve vodném methanolu, nebo po vystavení působení Cl₂, s 4,4'-tetramethyldiaminodifenylmethanovým reagens připraveným podle E. Von Arx, M. Faupel a M. Brugger, J. Chromatography, 1976, 120, 224-228. Vysokotlaká kapalinová chromatografie s reverzní fází (RP-18CZ 303435 B6

HPLC) byla prováděna použitím Rainin H PLC použitím kolony 41,4 x 300 mm, 8 μΜ, Dynamax™ C-l 8 při průtoku 49 ml/min použitím gradientu aceton i trii: voda (každý obsahuje 0,75 % TFA) typicky od 5 do 99 % acetonitrilu po 35^40 min. HPLC podmínky jsou typicky popsány ve formátu (5-95-35-214); to se vztahuje na lineární gradient od 5 % do 95 % acetonitrilu ve vodě po 35 min při monitorování odtoku UV detektorem při vlnové délce 214 nm.

Methylenchlorid (dichlormethan), 2-propanol, DMF, THF, toluen, hexan, ether a methanol byly stupněm Fisherova nebo Bakerova reagens a byly použity bez další purifikaci s uvedenými výjimkami, acetonitril byl Fisherovým nebo Bakerovým H PLC stupněm a byl použit, jak je.

io

Definice zde jsou použity takto:

THF je tetrahydrofuran,

DMF je ACV-d i methyl formám id.

DMA je Α',Λ'-dimethylacetamid.

is HOBT je 1-hydroxybenzotriazol,

BOP je [(benzotriazol-1-yl)oxy]-(dimethylamino)fosfonium hexafluorofosfát,

HATU je O-benzotriazol-W V'V-tetramethyluronium hexafluorofosfát,

HBTU je O—bcnzotriazol-A'A.ACV-tetramethyluronium hexefluorofosfát,

DIPEA je diisopropylethanamin,

DMAP je 4-(;VA^r-dimethylamino)pyridin,

DPPA je difenylfosforyl, azid,

DPPP je 1,3-bis(difenylfosfino)propan,

DBU je l,8-diazabicyklo[5.4.0]undec-7-en,

NaH je hydrid sodný, solanka je nasycený roztok vodného chloridu sodného,

TLC je chromatografie na tenké vrstvě,

LDA je diisopropylamid lithný,

BOP-C1 je bis(2-oxo-3-oxazolidinyl)fosfin-chlorid,

NMP je A-methylpyiTolidinon,

Lawessonovou reagens je [2,4-bis(4-methoxyfenyl)-l,3-dithia-2,4-difosfetan-2,4-disu]fíd], NIS je V-jodsukcinanhydrid.

Silikagelová chromatografie na Biotage kolonách se vztahuje k použití systému mžikové chromatografie dodávaného Biotage Division od Dyax Corporation použitím balení 40g (40s kolony),

90g (40m kolony) nebo 800g (75m kolony). Promývání se provádí směsmi hexanu-ethylacetátu pod tlakem dusíku 10 až 15 psi (1 psi = 6,895 kPa).

Příklad 1

TV—[(1,1 -dimethy lethoxy)karbony l]-4-[(tr i butyl )stannyl]-L-fenylal ani n-methyl ester

- 19CZ 303435 B6

Mol. hmotn. :405,23 Mol. hmotn. .568,3 8

Roztok A-[(hl—dimethylethoxvjkarbonyl]—4-jod—L—fenyl alanin—methylesteru (5,3 g, 13 mmol) a hexabutyldicínu (27,5 ml, 54 mmol) v toluenu (50 ml) byl odkysličen střídavým mražením směsi v lázni tekutého dusíku pod vakuem a táním pod argonem (3x). Bylo přidáno tetrakis5 (trifenylfosfin)palladium (280 mg, 0,22 mmol) a reakční směs byla zahřívána k refluxu po 54 min až se barva změnila ze žluté na černou. TLC (1:6) indikovala přítomnost určitého výchozího jod idu a byl přidán další podíl (140 mg, 0,11 mmol) katalyzátoru. Reflux pokračoval po 1 hodinu. Směs byla ponechána ochladit a potom byla koncentrována. Zbytek byl odebrán v hexanu (200 ml) a triethylaminu (30 ml), míchán po 30 min a byl filtrován. Filtrát byl koncentrován a chromaío tografován na koloně přes silikagel obsahujícím 150 g silikagelu a promývání hexanem pokračovalo 1:6 ethylacetátem: hexanem za získání 2V-[( 1,1-dímethylethoxy)karbonyl]-4-[( tributy 1)stannyll—L—fenyl alanin—methylesteru (5,7 g, 77%) jako čirého oleje. LR (+) LSIMS (C27H47NO₄Sn): m/z 1081 (2M-C4H9) 570 (M+H).

Příklad 2 ,V-[(2—chlor—6—methylíenyl)karbonyl]-4-(l,3-dimeth\T2,4 dioxo 5 pyrirnidirnl) I. fenylalanin

a) Příprava 5-joduracilu

H

C₄H₄N₂O₂

Mol, hmotn.: 112,09

C₄H₃IN₂O₂Mol. hmotn. :237,9 8

Směs uracilu (28,6 mmol, 3,2 g) a chloridu jodného (49,2 mmol, 7,988 g) v methanolu (120 ml) byla refluxována 40 hod. Roztok byl odstraněn ve vakuu a zbytek krystalizoval z ethanolu:vody (1 : 1, 150 ml) a byl ponechán v chladničce po 3 hod. Získané jehličky byly spojeny filtrací a promyty ethanolenrrvodou (1:1 směs, 50 ml), vodou (30 ml), hexanem (30 ml) a následně vysušeny ve vzduchu za získání 5,47g (80 %) 5-joduracilu jako bílých jehliček (t.t. 278 až 282 °C, Lit. 274-276 °C, Synthetic Communication 1988, 18, 855-867). EI-HRMS m/e vypočt. pro C₄H₃IN₂O₂ (M) 237,9239, nalezeno 237,9244.

-20 CZ 303435 B6

b) Příprava 1,3-dimethyl-5-joduracilu

C4H3IN ₂O₇ c₆h₇in₂o₂

Mol. hmotn.: 237,98 MoL hmotn. :266,04

Směs 5-joduracilu (22,2 mmol, 5,28 g) a práškového uhličitanu draselného (60 mmol, 10,3 g) v DMF (188 ml) byla míchána 24 h při teplotě místnosti a následně byl přidán methyljodid (53,3 mmol, 3,33 g). Následně byla reakční směs míchána po další 72 h při teplotě místnosti a byla nalita do vody (150 ml) a ethylacetátu (150 ml). Vrstvy byly odděleny a vodná vrstva byla extrahována ethylacetátem (2 x 100 ml). Spojené extrakty byly promyty roztokem solanky a vysušeny nad bezvodým síranem horečnatým. Filtrace vysušeného činidla a koncentrování rozpouštědla poskytlo surovou pevnou látku, která krystalizovala z ethanolu:vody (3:1, 150: 50 ml) a byla uložena v chladničce pres noc. Pevné látky byly spojeny filtrací a promyty směsí ethanolu:vody (3 : 1, 120 ml), vodou (30 ml), hexanem (30 ml) a vysušeny pod vakuem za získání 4,61 g (78 %) 1,3-dimethyljoduracilu jako bílých jehliček (t.t. 226 až 228 °C. Lit. 225 až 227 °C, Synthetic Comtnunication 1988, 18, 855-867)· EI-HRMS m/e vypočt. pro C₆H₇IN₂O₂ (M⁺) 266,0021, nalezeno 266,0023.

c) Příprava /V-[(l2-dimethyloxy)karbonylJ^4-[1.3-dirriethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidiny])J-Lfenylalanin-methylesteru

C15H2OINO4 Mol. hm.: 405,23

Do suspenze zinkového prachu (30 mmol, 2,0 g) v THF (3,0 ml) byl přidán 1,2-dibromethan (2,0 mmol, 0,174 ml) při teplotě místnosti. Tato suspenze byla zahřívána na 60 až 65 °C vysoušečem, dokud bylo pozorováno uvolňování plynného ethylenu. Tento postup byl opakován třikrát. Následně byla suspenze ochlazena na teplotu místnosti a byl přidán trimethylchlorsilan (1,0 mmol, 0,15 ml) a směs byla míchána 10 minut. Horký roztok (jodová sloučenina nebyla moc rozpuštěná v žádném rozpouštědle a vysrážela se při chlazení na teplotu místnosti) 5-jod-l ,3-dimethyluracilu (11,0 mmol, 2,92 g) v THF (3,0 ml) a DMA (10 ml) byl přidán do zinkové suspenze. Po přidání byla směs ohřátá na 73 °C. Vnitřní teplota reakční směsi se zvýšila na 77 až 78 °C díky exotermické reakci. Reakční směs byla míchána v lázni o teplotě 73 °C 1,5 hodiny a následně byla ochlazena na teplotu místnosti a míchána další 1,5 hodiny. ‘H-NMR hydrolyzátu

-21 CZ 303435 B6

0,25 ml alikvotu směsi indikovala přítomnost stop výchozího materiálu a jodolýza 0,25 ml alíkvótu směsi poskytla jodid zpět. Reakční směs byla ohřátá na 70 °C a míchána dalších 30 minut. Po ochlazení na teplotu místnosti byla reakční směs zředěna THF (5 ml) a přebytek zinu byl ponechán se usadit po 30 až 60 minut.

Výše připravená sloučenina zinku (5,5 mmol) byla přidána do suspenze Pd(dba)₂ (0,07 mmol, 40 mg), trifurylfosfinu (TFO) (0,26 mmol, 66,6 mg) a Boc^4-jodo-L-fenylalanin-methylesteru (4,5 mmol, 1,823 g) v THF (10 ml) při teplotě místnosti a světle žlutá směs byla míchána 15 hodin. Směs byla nalita do nasyceného roztoku chloridu amonného a byla extrahována ethylío acetátem (3 x 50 ml). Kombinované extrakty byly promyty roztokem solanky a sušeny nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrování sušicího činidla a koncentrování roztoku poskytlo suroý produkt, který byl purifikován chromatografii na koloně za získání 0,80 g (43 %) V-[(l,ldimethylethoxy)karbonyl |—4—[l,3-dimethyl-2,4-dioxo-5—pyrimidinyl)]—L—fenylalanin-methylsteu jako bílé pevné látky: t.t. 65 až 69 °C. EI-HRMS m/e vypoč. pro C21H27N3O6 (M⁺)

418,1978, nalezeno 418,1965.

d) Příprava 4—(1,3-dimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalanin-methylesteru

C2lH₂7N₃O₆Mol. hm. :417,46

C16H19N3 O4 Mol. hm.:353,84

Roztok V-[(l,l-dimethyloxy)karbonyt] 4 [1,3 dimethy 1-2,4-dioxo-5-pyrimidinyI)]-L-fenyΙΣΟ alanin-methylesteru (1,92 mmol, 0,811 g) v dioxanu (5 ml) byl zpracován s 4,ON (5 ml, 20 mmol) kyselinou chlorovodíkovou v dioxanu při teplotě místnosti a roztok byl míchán 0,5 hodiny. V této době se pomalu tvořila světle žlutá sraženina. Pevné látky byly spojeny filtrací a byly promyty hexanem za získání 412 mg (60% výtěžek), t.t. 187 až 193 °C. Matečná tekutina byla koncentrována pod vakuem a zbytek byl rozetřen s dichlormethanem. Kombinované pevné látky, které obsahovaly některé výchozí látky, byly spojeny a rozpuštěny v methanolu. Hlavní podíl methanolu byl odpařen a byl přidán dichlormethan, aby se vytvořila sraženina. Pevné látky byly spojeny a vysušeny za získání 330 mg (48 %) 4-(l,3-dimethyl-2,4-dioxo-pyrimidinyl)-Lfenylalanin methylesteru, hydrochloridové soli (t.t. 187 až 193 °C). EI-HRMS m/e vypoč, pro C ,₆H ₁₉N₃O₄ (M+H) 318,1447, nalezeno 318,1447.

e) Příprava A-|(2 chloro 6- niethylfenyl)karhonyl|—4_[1,3-dimethyi-2,4-dioxo-5-pyrimÍdinyl)]-L-fenylalanin-methylesteru

-22CZ 303435 B6

Do suspenze 4-(l ,3-dimethvl-2,4-dioxo-5-pyrimidiny]}-L-fenylalaninmethylesteru hydrochloriové soli (0,5 mmol, 0,180 g) 2-chloro-6-m ethyl benzoové kyseliny (0,55 mmol, 0,084 g) a HBTU (0,6 mmol, 0,227 g) v DMF (4 ml) byl přidán diisopropylethylamin (3,0 mmol, 0,52 ml) při teplotě místnosti. Po 1 min. vše přešlo do roztoku a žlutý čirý roztok byl míchán 15 hod. při teplotě místnosti. V tomto čase se změnil roztok na hnědý a byl zředěn ethylacetátem (25 ml). Ethylcetátová vrstva byla postupně promyta vodou (2x 20 ml), nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (25 ml) a roztokem solanky (25 ml) a byla sušena nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrace sušicího činidla a koncentrování rozpouštědla poskytlo surový produkt, ío který byl purifikován na silikagelu chromatografií na koloně za získání 151,5 mg (72% výtěžek)

A''-[(2-chlor-6-methylfěn\l)karbonyl]^4-[l ,3-dÍmethyl-2,4-dioxo~5-pyrimidinyl)]-L-fenylalanin-methylesteru jako bílé pevné látky: t.t. 155 až 157 °C. EI-HRMS m/e vypoč. C₂₄H₂₄N₃O₅CI (M⁺) 470,1483, nalezeno 470,1484.

(f) Příprava A--[(2-chlor-6-methylťenyl)karbonyl]—4-[ 1,3-dimethyl-2.4-dioxo-5pyrimidinyl)]-L-fenylalaninu

C₂4H₂₄CIN₃O₅

Mol hm..469,92

C₂₃H₂₂C1NjO₅Mol. hm.:455,90

Do suspenze A-[(2-chlor-6-methylfényl)karbonyl]^l-[l ,3-dimethyl-2,4-dioxo~5-pyrimidinyl)]-L-fenylalaninmethylesteru (0,278 mmol, 131 mg) v ethanolu (4 ml) byl přidán l,0N vodný hydroxid sodný (3 ml) při teplotě místnosti. Směs byla zahřívána na 40—45 °C a výsledný čirý roztok byl míchán 2 až 3 hodiny. Ethanol byl odstraněn pod sníženým tlakem a zbytek byl zředěn vodou (20 ml) a NaOH (3 ml, l,0N), aby se rozpustila sodná sůl. Vodný roztok byl promyt etherem (50 ml), aby se odstranily neutrální nečistoty. Vodná vrstva byla okyselena l,0N HC1 a produkt byl extrahován v ethylacetátu (2 x 50 ml). Kombinované organické extrakty byly

-23CZ 303435 B6 promyty roztokem solanky a byly sušeny nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrace sušicího činidla a koncentrování filtrátu poskytlo 107 mg (85 %) /V-[(2-chlor-6-methylfenyl)karbonyl]4-[l,3-dimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)]-L-fenylalanin-methylesteru jako bílé pevné látky: t.t. 234 až 236 °C. EI-HRMS m/e vypoč. C₂₃H₂₂N₃O₅C1 (M+H) 456,1326, nalezeno 456,1326.

Příklad 3

Příprava 4-( 1,3-dimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)]-7V-[[l~(2-methoxyethyl)cyklopentyl]karbony l]-L-fenylalaninu

C₂₄H₃₁N₃O₆Mol. hm:457,52 i o 4-( 1,3-dimethy l-2,4-dÍoxo-5-pyrimidiny l)]-ŤV-[[ 1 -(2-methoxyethy l)cyklopenty 1]karbony 1]—L— fenylalanin byl připraven z 4-(l,3-dimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)]-L-fenylalanin-methylesteru a l -(2-methoxyethyl)cyklopentankarboxy!ové kyseliny (viz WO 99/10312) použitím obecných postupů popsaných v příkladu 2. EI-HRMS m/s vypoč. pro C₂4H₃iN₃O₅ (M+M) 458,2292, nalezeno 458,2279.

Příklad 4

Příprava 7V-[(2-brom-6-methylfenyl)karbonyl]-4-(l,3-dimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-Lfenylalaninu

C 23ΪΙ22ΒΓΝ3 O5 Mol. hni.; 500,34

-24CZ 303435 B6

A^ř-[(2-brom-6-methylfenyl)karbonyl]—4-(b3-dimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalanin byl připraven z 4 (1 J -dimethyl-2,4-dioxo- 5- pyrimidinyl)]-L-fenylalaninu a 2brom

6-methyl benzoové kyseliny použitím obecných postupů popsaných v příkladu 2. EI-HRMS m/e vypoč. pro C₂₃H₂2N₃O₅Br (M+H) 500,0822, nalezeno 500,0825.

Příklad 5 io

Příprava A-[(2-brom-5-methoxyfenyl)karbonyl]—4-(1,3-dimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)L-fenylalaninu

C ₂ 3 Eí 22S fN₃Mol. hm.: 516,34

A-[(2-brom-5-methoxyfenvl)k.arbonyl]-4-( 1,3-dimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-feny1alanin byl připraven z 4-[l,3-dimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalanin-methylesteru a 2-brom-5-methoxybenzoové kyseliny použitím obecných postupů popsaných v příkladu 2.

EI-HRMS m/s vypočt. pro C₂₃H₂₂N₃O₆Br (M+H) 516,0770, nalezeno 516,0780.

Příklad 6

A^ř-[(2,6-dichlorofenyl)karbonyl]—1-(1,3,6-tri methy 1-2,4—dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalanin

a) Příprava 5-jod-l,3,6-trimethyluraci1u

K2CO3, Mel, DMF, r.t., 76 h O^N^O

C5H5IN2O2 C7H9IN2O2

Mol. hm.: 252,01 Mol. hm.: 280,06

Směs 5-jod-6-methyluracilu (22,18 mmol, 5,58 g) a práškového uhličitanu draselného 25 (60 mmol, 8,29 g) v DMF (188 ml) byla míchána 24 hod při teplotě místnosti a následně byl přidán methyljodid (90,6 mmol, 3,33 ml), Reakční směs byla míchána po dalších 76 hodin při teplotě místnosti a byla nalita do vody (150 ml) a ethylacetátu (150 ml). Vrstvy byly separovány a vodná vrstva byla extrahována ethylacetátem (2 x 100 ml). Kombinované extrakty byly promyty roztokem solanky (150 ml) a vysušeny nad bezvodým síranem horečnatým. Filtrace sušicího činidla a koncentrování rozpouštědla poskytlo surovou pevnou látku, která krystalizovala z ethanolu:vody (3 : 1, 150 : 50 ml) a byla skladována v ledničce přes noc. Pevné látky byly spojeny

-25CZ 303435 B6 filtrací a promyty ethanolem : vodou (3 : 1, 120 ml), vodou (30 ml), hexanem a sušeny pod vysokým vakuem za získání 5,8 g (93% výtěžek) 5-jod-l,3,6-trimethyluracilu jako bílé pevné látky: t.t. 155 až 157 °C. EI-HRMS m/e vypoč. C₇H₉IN₂O₂ (M⁺) 279,9709, nalezeno 279,9709.

b) Příprava 2V-[( 1,1 -dimethyloxy)karbonyl]-4-{ 1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidiny))-Lfenylalanin-methylesteru

OMe

c₂₂h₂₉n₃o₆

Mol. hm.: 431,48

Do suspenze zinečnatého prachu (800 mmol, 52,29 g) v THF (26,0 1) byl přidán 1,2-dibromethan (53,2 mmol, 4,58 ml) pri teplotě místnosti. Tato suspenze byla zahřívána na 60 až 65 °C tepelným vysoušečem, dokud bylo pozorováno uvolňování ethylenového plynu. Suspenze byla ochlazena na teplotu místnosti, byl přidán trimethylchlorsilan (26,6 mmol, 3,38 ml) a směs byla míchána po 15 minut. Suspenze 5-jod-l,3,6-trimethyluracilu (266 mmol, 74,6 g) v DMA (225 ml) byla ohřátá za získání čirého roztoku a byla přidána v jedné dávce do reakční směsi. Po přidání byla směs zahřáta na 70 °C. Vnitřní teplota reakční směsi vzrostla na 80 až 85 °C s ohledem na exotermní reakci. Reakční směs byla míchána pri 70 °C po 3—4 hodiny, po této době TLC podílu, který byl zchlazen nasyceným chloridem amonným, indikovala nepřítomnost výchozího materiálu. Reakční směs byla zředěna THF (140 ml), byla ochlazena na teplotu místnosti a přebytek zinečnatého prachu byl ponechán usadit po 2 až 3 hodiny.

Tento roztok obsahující zinečnatou sloučeninu (266 mmol) byl přidán do roztoku Pd(dba)₂(8 mmol, 4,6 g), tri-o-tolylfosfinu [P(Tol)₃] (29,6 mmol, 9,0 g) a /V-[(l,l-dimethylethoxy)karbonyl]—4-jod-L-ťcnylalanin-metliylesteru (186 mmol, 75,56 g) v THF (280 ml) při teplotě místnosti a světle žlutá směs byla míchána po 48 hodin pri 50 až 55 °C. Reakční směs byla nalita do nasyceného roztoku chloridu amonného a byla extrahována ethylacetátem (3 x 750 ml). Spojené extrakty byly promyty roztokem solanky (1,5 1) a sušeny nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrace sušicího činidla a koncentrování poskytly surový produkt, který byl purifikován chromatografií na koloně silikagelu použitím kolony Biotage (75 ml) za získání 576,88 g (72% výtěžek) Λ/-[( 1, l-dimethylethoxy)karbonyl]-4-( 1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalanin-methylesterů jako amorfní bílé pevné látky. EI-HRMS m/e vypoč. C₂₂H₂₉N₃O₆ (M⁺) 431,2056, nalezeno 431,2054.

c) Příprava 4-(l,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalanin-methylesteru, hydrochloridové soli

-26CZ 303435 B6

C₂₂H₂₉N₃O₆ CpH^ClNA

MoL hm: 431,48 ^MoL hm,: 367,87

Podíl pevné látky 7V-[( 1,1-dimethylethoxy)karbonyl]^l·-(l,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidiny l)-L-feny lalan i n-methy le steru (17,15 mmol, 7,4 g) získaný výše, byl zpracován s 4N chlorovodíkovou kyselinou v dioxanu (68 mmol, 17 m 1) při teplotě místnosti a roztok byl míchán po 1 hodinu až se vytvořila bílá sraženina. Směs byla zředěna diethyletherem a supematant byl děkan to ván a zbytek byl sušen nejprve na rotační odparce a potom pod vysokým vakuem za získání 6,28 g (99% výtěžek) 4-(1,3,6-trimethyl-2,4-díoxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalaninmethylesteru, hydrochloridové soli jako amorfní žluté pevné látky. FAB-HRMS m/e vypoč. pro C₁₇H₂₁N3O4 (M+H) 332,1617, nalezeno 332,1617.

d) Příprava .V-[(2,6—dichlorofenyl)karbonylJ 4 ( 1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)L-feny lalan i n-methy le steru

Do suspenze 4-(l ,3.6-trimethyl-2,4-dioxo-5pyriinidinyl)-L-fenylalan i n-methy lesteru. hydrochloridové soli (3,12 mmol, 1,15 g) a 2,6-dichlorbenzoytchloridu (3,51 mmol, 0,735 g) v dichlormethanu (40 ml) byl pří teplotě místnosti přidán diisopropylethy lamin (9,36 mmol, 1,63 ml). Po 1 minutě vše přešlo do roztoku a čirý žlutý roztok byl míchán po 20 hodin pří teplotě místnosti. Získaný hnědý roztok byl zředěn dichlormethanem (50 ml). Dichlormethanová vrstva byla promyta postupně IN chlorovodíkovou kyselinou (2 x 50 ml), nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (50 ml), roztokem solanky (50 ml) a byla sušena nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrace sušicího činidla a koncentrování rozpouštědla poskytlo surový produkt, který byl purifikován chromatografií na silikagelu použitím kolony Biotage (40m) za získání 1,46 g (93% výtěžek) _;V[(2,6 dichlorofenyl)karbony[]—4—(l,3,6-trimethyl-2,4'-dioxo-5-pyrimid i nylý-L-fenylal ani n-methy 1 esteru jako amorfní bílé látky. FAB-HRMS m/e vypoč. pro C24H23 CI2N3O5 (M+H) 504,1093, nalezeno 504,1083.

e) Příprava A-[(2,6-dichlorofcnyl)karbonylJ—4-(l ,3,6-trimethyl-2,4-dioxo~5-pyrimidinyl)L-feny lalan inu

-27CZ 303435 B6

U24H23CI2N3O5

Mol. hnu: 504,36 θ23^21θ'ζ^3θ5 Mol. hm; 490_f34

Do suspenze A-[(2,6-dichlorfenyl)karbonyi]—4-J1,3,6~trimethyl-2,4—dioxo-5-pyrimidinyl)-Lfenylalanin-methylesteru (2,2 mmol, 1,11 g) v ethanolu (12 ml) byl přidán vodný l,0N hydroxid sodný (8,8 ml) pri teplotě místnosti. Směs byla zahřívána na 45 až 50 °C a získaný čirý roztok byl míchán po přibližně 2 hodiny. Ethanol byl odstraněn za sníženého tlaku a zbytek byl zředěn vodou (50 ml) a NaOH (5 ml, l,0N), aby se rozpustila sodná sůl. Vodný roztok byl promyt diethyletherem (50 ml), aby se odstranily neutrální nečistoty. Vodná vrstva byla okyselena l,0N HC1 a produkt byl extrahován do ethylacetátu (2 x 75 ml). Spojené organické extrakty byly promyty roztokem solanky (100 ml) a byly sušeny nad bezvodým síranem hořeěnatým. Filtrace io sušicího činidla a koncentrování filtrátu poskytlo 970 mg (90% výtěžek) .V-[(2,6 dichlorfenyl)karbonyl]^4-(1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalaninu jako bílé pevné látky, t.t. 225-227 °C. FABHRMS m/e vypoč. pro C₂₃H₂₁CI₂N₃O₅ (M+H) 490,0937, nalezeno

490,0940.

Příklad 7

Příprava Λ-[[ 1,1—(2-methoxyethyl)cyklopentyl]karbonyl]—4—(1,3,6—trimethyl—2,4—dioxo-5— pyrimidinyl)-L-fenylalaninu

a) Příprava Λ-[ 11,1 -(2-methoxyethy l)cyklopentyl] karbony I]—4—(1,3,6—trimethyl—2,4—dioxo— 5-pyrimidinyl> L fěnylalanin rnethylesteru

Do suspenze 4-(l,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidÍnyl)-L-fenylalanin-methylesteru, hydro25 chloridové solí (0,4 mmol, 173 mg), BHTU (0,5 mmol, 189 mg) a l-(2-methoxyethyl)cyklopentankarboxylové kyseliny (0,5 mmol, 86 mg) v DMF (2 ml) byl přidán pri teplotě místnosti diisopropylethylamin (1,2 mmol, 0,29 ml). Po 5 minutách vše přešlo do roztoku a čirý žlutý roztok byl míchán po 24 hodiny při teplotě místnosti. Získaný tmavě hnědý roztok byl zředěn ethylacetátem (30 ml). Ethylacetátová vrstva byla postupně promyta IN chlorovodíkovou kysel i-28CZ 303435 B6 nou (2 x 30 ml), nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (30 ml), roztokem solanky (30 ml) a byla sušena nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrace sušicího činidla a koncentrování rozpouštědla poskytlo surový produkt, který byl purifikován chromatografií na silikagelu použitím kolony Biotage (40m) za získání 139 mg (72% výtěžek) JV-[[l,l-(2-methoxy5 ethyl)cyklopentvI]karbonylJ4-(l ,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalaninmethylesteru jako amorfní bílé látky. FAB-HRMS m/e vypoč. pro C26H35N3O6 (M+H) 486,2604, nalezeno 486,2606.

b) Příprava N- [[ 1,1 -(2-methoxyethyÍ)cyklopentyl]karbonyl 3—4—(1,3,6-trimethyl-2,4—dioxo10 5-pyrimidinyl)-L-fenylalaninu

Do suspenze 7V-[[l,l-(2-methoxyethyl)cyklopentyl]karbonyl]-4-(l,3,6~trimethyl-2,4-dioxo-5pyrimidinyl)-L-fenylaianin-methylesteru (0,273 mmol, 133 mg) v ethanolu (3 ml) byl přidán vodný 1,0N hydroxid sodný (1,5 ml) při teplotě místnosti. Směs byla zahřívána na 40 až 45 °C a získaný čirý roztok byl míchán 15 hodin. Ethanol byl odstraněn za sníženého tlaku a zbytek byl zředěn vodou (25 ml) a NaOH (3 ml, l,0N), aby se rozpustila sodná sůl. Vodný roztok byl promyt diethyletherem (50 ml), aby se odstranily neutrální nečistoty. Vodná vrstva byla okyselena l,0N HCI a produkt byl extrahován do ethylacetátu (2 x 25 ml). Spojené organické extrakty byly promyty roztokem solanky (50 ml) a byly sušeny nad bezvodým síranem hořečnatým. Filt20 race sušicího činidla a koncentrování filtrátu poskytlo 121 mg (94% výtěžek) JV-[[l,l-(2methoxyethy!)cyklopentyl]karbonyl]-4-(l,3,6--triiTiethyl-2,4-dioxo-5-pyrimÍdÍny1)-L-fenylalaninu jako amorfní bílé pevné látky, t.t. 225 až 227 °C. FAB-HRMS m/e vypoč. pro C25H33N3O6 (M+H) 472,2488, nalezeno 472,2467.

Příklad 8: Příprava A-[(2brom-6-methy lfenv l)karbonvl]—4-(1,3,6-trimethy 1-2,4-dioxo-5 pyrimidinyl)-L-fenylalaninu

C₂₄H₂₄BrN₃O₅Mol· hm. :514,37

A -[(2 brom-6-melhylfenyl)karbonvlJ -4-( 1,3.ó -trimethyI- 2,4--dioxo—5-pyrimidinyl)-L-fenylalanin byl připraven z 4-(l,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalaninu-methylesteru a kyseliny 2-brom-6-m ethyl benzoové použitím obecných postupů popsaných v příkladu 7, a byl získán jako bílá pevná látka: t.t.: 240 až 242 °C. FAB-HRMS m/e vypoč. pro

C₂₄H₂₄BrN₃O₅ (M+H) 514,0978, nalezeno 514,0965.

Příklad 9: Příprava 2V-[(2-chlor-6-methylfenyl)karbonyl]—4-( 1.3,6-trimethyl-2.4—dioxo-5pyrimidinyl)-L-fenyIalaninu

CH. i ³

C^CI^O, Mol. hm.: 469,92 io .\--[(2-ehlor-6—methy lfeny l)karbonyl]-4—(1,3,6-trimethy 1-2,4—dioxo-5-pyrimidinyl)—L-fenyl· alanin byl připraven z 4-(l,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalanin-methylesteru a kyseliny 2-chlor-6-methylbenzoové použitím obecných postupů popsaných v příkladu 7, a byl získán jako bílá pevná látka: t.t. 238 až 240 °C. FAB-HRMS m/e vypoč. pro C₂₄H₂₄CIN₃O₅ (M+H) 470,1483, nalezeno 470,1489.

Příklad 10: Příprava A-[(2-ethyl 6 methyl feny t)karbonyl] 4( 1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5pyrimidinyl)-L·-fenylalaninu

Mol. hm463,53

AZ—[(2—ethyl—6—methy]fenyl)karbonvl] 4 (1.3.6 trirnethyl 2,4 dioxo 5 pyrimidinyl)—I.-fenylalanin byl připraven z 4-( 1,3,6—trimethyl-2,4-díoxo—5-pyrimidinyl)—L-fenylalaninu—methylesteru a kyseliny 2-ethyl-6-methylbenzoové použitím obecných postupů popsaných v příkladu 7, a byl získán jako bílá pevná látka: t.t.: 127 až 133 °C. ES-HRMS m/e vypoč. pro C₂₆H₂₉N₃O₅(M+Na) 494,1498, nalezeno 494,1501.

Příklad 11: Příprava /V-[[2-(2-methylethyl)-6-methylfenyl)karbonyl]-4-( 1,3,6-trimethyl-2,4dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalaninu

-30CZ 303435 B6

c₂₇h₃₁n₃o₅

Mot hm.: 477_ť55

A'[[2-(2-mcthylethyl)-6-methylfenyl)karbonyl]^-(l ,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinylý-L-fenylalanin byl připraven z 4-{ 1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalaninu-methylesteru a kyseliny 2-(2-methylethyl)-6-methylbenzoové použitím obecných postupů popsaných v příkladu 7, a byl získán jako amorfní bílá pevná látka: ES-HRMS m/e vypoč. pro C27H31N3O5 (M+Na) 500,2156, nalezeno 500,2160.

Příklad 12: Příprava A-[(2,6-difluorfenyl)karbonyl]-4 -( 1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5pyrimίdinyl)-L·-fenylalaninu

^23^21^2^3^5

MoL hm.; 457,43 /V-[(2,6-difluorfenyl)karbonyl]^l-(l,3,6-trimethyl-2,4-dioxO“5-pyrimidinyl)-L-fenylalanin byl připraven z 4-< 1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalaninu-metbylesteru a kyseliny 2,6-difluorbenzoové použitím obecných postupů popsaných v příkladu 7, a byl získán jako amorfní bílá pevná látka: ES-HRMS m/e vypoč. pro C23H21N3O5 (M+Na) 480,1483, nalezeno 480,1489.

Příklad 13: Příprava Λ'-f[2-fluor--6-(trifluormethyl)fenv 1Jkarbony 1Μ-( 1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalaninu

MoL hm.: 507,43

AT—[(2—6—(tri fl uormethy 1 )feny 1 )karbony 1 ]—4-( 1,3,6-tr i methy 1—2,4—d ioxo-5-pyr i m i d í n y 1)—L— fenylalanin byl připraven z 4-(l,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyI)-L-fenylalaninmethylesteru a kyseliny 2,6-fluor—6—(tr i fl uormethy l)benzoové použitím obecných postupů popsaných v příkladu 7, a byl získán jako bílá pevná látka: t.t.: 218 až 220 °C. ES—HRMS m/e vypoč. pro C25H23F4N3O5 (M+Na) 530,1310, nalezeno 530,1317.

Příklad 14: Příprava TV-[ [2,6-di-(2-methylethyl)fenyl] karbony I]—4—(1,3,6-trimethy 1-2,4dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalaninu

Ρ29^35^3θ5 MoL hm.: 505,61

A-[[2,6—di-(2-methylethyl)fenyl)karbonyl]—4—(1,3,6—trimethy 1-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)—Lfenylalanin byl připraven z 4-(l,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrÍmÍdinyl)-L-fenyIalaninmethylesteru a kyseliny 2,6—di—(2-methvlethyl)benzoové použitím obecných postupů popsaných v příkladu 7, a byl získán jako amorfní bílá pevná látka. ES-HRMS m/e vypoč. pro C₂<4135N3O5 (M+Na) 530,1310, nalezeno 530,1317.

Příklad 15: Příprava A-[(2-chlor-6-ethylfenyl)karbonyl]-4-( 1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5pyrimidinyl)-L-fenylalaninu

a) Příprava TV-(2-chlor-6-fluorbenzyliden)butylaminu (Ro 50-5007/000, 30935-229)

C_nH₁₃CIFN MoL hm: 213,68

Do suspenze 2-chlor-6-fluorbenzaldehydu (416 mmol, 66 g) v heptanu (200 ml) byl přidán 25 n-butylamin (460 mmol, 45,5 ml) při teplotě místnosti. Po přidání exotermní reakce rozpustila pevné látky úplně. Roztok byl míchán po 3 hodiny pří teplotě místnosti, pak byl přenesen do děl íčky, promyt roztokem solanky (200 ml), a byl sušen nad bezvodým síranem horečnatým.

Filtrace sušidla a koncentrování poskytly žlutý olej, který byl purifikován destilací pod vysokým vakuem (t.v. 95 až 98 °C/4,5 mm Hg (600 Pa) za získání 86,31 g (97% výtěžek) Á-(2—chIor-6— fluorbenzyliden)buty laminu jako žlutého oleje. EI-HRMS m/e vypoč. pro CnHuCIFN (M+)

213,0720, nalezeno 213,0714.

b) Příprava 2-chlor-6-ethylbenzaldehydu

-32 CZ 303435 B6

CgHgClO Mol. hm.:168,62

Do roztoku /V-(2-chlor-6-fluorbenzyliden)butylaminu (15 mmol, 3,21 g) v THF (20 ml) byl přidán po kapkách roztok ethylmagneziumbromidu (30 mmol, 30 ml, 1M) v THF při udržování teploty na 5 až 15 °C. Po přidání byla reakční směs ponechána ohřát na 20 °C a byla míchána po

5 hodin. Potom byla ochlazena na 0 °C (ledová lázeň) a po kapkách byl přidáván 20% HC1 ve vodě (50 ml) při udržování teploty pod 15 °C ochlazováním v ledové lázni. Po přidání byla směs ponechána ohřát na teplotu místnosti a byla míchána po 15 hodin. Potom byla zředěna vodou (75 ml) a extrahována ethylacetátem (2 x 40 ml). Spojené extrakty byly promyty roztokem solanky (100 ml) a sušeny nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrace sušidla a koncentrování io poskytly 2,27 g (90% výtěžek) 2-chlor-6-ethylbenzaldehydu jako žlutého oleje. EI-HRMS m/e vypoč. pro C9H9CIO (M+) 167,0264, nalezeno 167,0263.

c) Příprava 2-chlor-6~ethylbenzoové kyseliny

C9H₉C1O₂Mol. hm.: 184,62

Do suspenze 2-chlor-6-ethylbenzaldehydu (13,5 mmol, 2,27 g) o teplotě místnosti v acetonitrilu (25 ml) byl přidán roztok hydrogenuhličitanu sodného (3,4 mmol, 0,465 g) ve vodě (7,5 ml) a následně peroxid vodíku (1,8 ml, 30 %). Potom byl přidán roztok chloridu sodného (23,7 mmol, 2,15 g) ve vodě po kapkách při 0 °C při udržování teploty pod 3 °C. Po přidání byla žlutá suspenze míchána po 15 hodin při 0 °C až teplotě místnosti. V této době analýza TLC směsi indikovala nepřítomnost výchozího materiálu. Potom byl přidáván po kapkách roztok bisulfitu sodného (20,5 mmol, 2,8 g) ve vodě (10 ml), dokud nezmizelo žluté zabarvení (ΚΙ-papír pozitivní). Chlazení je nezbytné pro regulaci exotermní reakce. Po 1 hodině bylo rozpouštědlo odstraněno pod vakuem. Neutrální nečistoty byly extrahovány diethyletherem (200 ml). Potom byl bazický vodný roztok neutralizován 10% HC1 na pH kolem 1. Vysrážena bílá pevná látka byla spojena filtrací a sušena na vzduchu za získání 2,415 g (97% výtěžek) 2-chlor-6-ethylbenzoové kysel iny jako amorfní bílé pevné látky. EI-HRMS m/e vypoč. pro C9H9CIO2 (M+), 184,0291, nalezeno 184,0295.

d) Příprava methylesteru V-[(2-chlor-6-ethylfenyl)karbonyl]^HU,6-trimethyl-2,4-dioxo5-pyrimidinyl)-L-fenylalaninu

C₂₆H₂₈C1N₃O₅Mol.hm.:497,98

-33CZ 303435 B6

Do suspenze methylesteru 4-(l,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalaninu, hydrochloridové soli (0,5 mmol, 184 mg), HBTU (0,7 mmol, 265 mg) a 2—chlor-6—ethyl benzoové kyseliny (0,7 mmol, 129 mg) v DMF (2 ml) byl přidán diisopropylethylamin (1,25 mmol, 0,22 ml) při teplotě místnosti. Po 5 minutách vše přešlo do roztoku a čirý žlutý roztok byl míchán po 15 hodin při teplotě místnosti. Výsledný tmavě hnědý roztok byl zředěn ethylacetátem (30 ml). Ethylacetátová vrstva byla promyta postupně IN chlorovodíkovou kyselinou (2 x 30 ml), nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (30 ml) a roztokem solanky (30 ml) a byla sušena nad bezvodým síranem sodným. Filtrace sušidla a koncentrování rozpouštědla poskytly surový produkt, který byl purifikován chromatografií na silikagelu použitím kolony Biotage (40 m) za získání 175 mg (70% výtěžek) methylesteru A-|(2-chlor-6—ethylfenyl)karbonyl]—4(l,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-~L~fenylalaninu jako amorfní bílé pevné látky. ESHRMS m/e vypočt. pro C20H28CIN3O5 (M+Na) 520,1611, nalezeno 520,1613.

e) Příprava /V-[(2—chlor—6—ethylťenyl)karbonylj—4(1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalaninu

C₂₅H₂6C1N₃O₅

Mol. hm.: 483,94

Do suspenze methylesteru A'-[(2-chlor-6—ethyl feny l)karbonyl]—4-(1,3,6-tri methy 1-2,4—dioxo— 5-pyrimidinyI)-L-fenylaIaninu (0,33 mmol, 164 mg) v ethanolu (2 ml) byl přidán vodný l,0N hydroxid sodný (0,7 ml) při teplotě místnosti. Směs byla míchána po 3 hodiny při teplotě místnosti. Ethanol byl odstraněn za sníženého tlaku a zbytek byl zředěn vodou (30 ml). Vodný roztok byl promyt diethyletherem (30 ml), aby se odstranily neutrální nečistoty. Vodná vrstva byla okyselena l,0N HC1 a produkt byl extrahován do ethylacetátu (2 x 35 ml). Spojené organické extrakty byly promyty roztokem solanky (50 ml) a byly sušeny nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrace sušidla a koncentrování rozpouštědla poskytly 138 mg (87% výtěžek) ,V-[(2-chlor-6—ethylfenyl)karbonyl]—4-( 1,3,6—trimethyl2,4dioxo—5-pyrimidinyl)—L-fenylalaninu jako bílé pevné látky, t.t.: 187 až 190 °C. ES-HRMS m/e vypoč. pro C25H26CIN3O5 (M+Na) 506,1459, nalezeno 506,1455.

Příklad 16. Příprava A^L[(2-ehlor-6-propylfenyl)karbony 1 ]- 4—( 1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5pyrimidinyl)-L-fenylalaninu

a. Příprava 2—chlor—6—propylbenzoové kyseliny

ČC

2-chlor-ó-propylbenzoová kyselina byla připravena z 2-fluor-6-chlorbenzylidenbutylaminu a propylmagneziumbromidu použitím obecného postupu popsaného v příkladu 15.

-34CZ 303435 B6

b. Příprava A'[(2-chlor-6-propyl fenyl jkarbonyl]-4-( 1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalaninu

C₂₆H₂₈C1N₃O₅

Mol. hm.: 497,97

7V-[(2-chlor—6—propylfenyl)karbonyl]—4—(l,3,6-trimethyl-2,4-dioxo~5-pyrimidÍnyl)-L—fenyl5 alanin byl připraven z methyl esteru 4-(l,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalaninu a kyseliny 2—chIor-6-propylbenzoové použitím obecných postupů popsaných v příkladu 15 a byl získán jako bílá pevná látka: t.t. 225 až 227 °C. ES-HRMS m/e vypočt. pro C20H28CIN3O5 (M+Na) 520,1611, nalezeno 520,1615.

Příklad 17. Příprava 7V-[[2-chlor-6-(2-methylethyl)fenyljkarbonyl]—4-(1,3,6-trimethyl-2,4dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalanmu

a. Příprava 2 -chlor-6-{2 methy]ethyl)benzoové kyseliny

CO₂H Mol. hm.: 155,56

Mol. vzorec:C7H4C!O2

2-chloro-6—(2-methylethyl)benzoová kyselina byla připravena z 2-fluor—6-chlorbenzyliden)butylaminu a isopropylmagneziumbromidu použitím obecného postupu popsaného v příkladu 15.

b. Příprava V-[[2-chlor-6-(2-methylethyl)feny 1 Jkarbony 1 j—4—(1.3,6-trimethyl-2,4-dioxo 5 pyrimidinyl)-L-fenylalaninu

C₂₆H₂₈C1N₃O₅Mol. hm. :497,97

A'-[[2--chlor-6-(2-methylethyl)fenyl]karbonylj-4-(l,3,6-trimethyl-2.4-dioxo5pyrimidin\l) Lfenyl alanin byl připraven z 4-(l,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidÍnyl)-L-fenylaIanin methytesteru a 2 chlor-6-(2-methylethyl)benzoové kyseliny použitím obecných postupů

-35 CZ 303435 B6 popsaných v příkladu 15 a byl získán jako bílá pevná látka: t.t. 205 až 209 °C. ES-HRMS m/e vypočt. pro C26H28CIN3O5 (M+Na) 520,1611, nalezeno 520,1617.

Příklad 18. Příprava ;V-[(2,6-dichlorfenyl)karbonyl]-4-(l,3-dimethyl-6-methyl-2,4-dioxo-5pyrimidinyl)-L-fenylalanin

a) Příprava 5-jod-l ,3-diethyl-6-methyluracilu

Ογ^γΟ

ΗΝγ<_ι

CH,

Mot. hm.: 308,12

C₅H₅IN₂O₂Mol. hm.: 252,01

Do suspenze 5—jod—6—methyl uráčil 11 (20,97 mmol, 5,45 g) a práškového uhličitanu draselného (60 mmol, 8,29 g) v DMF (188 ml) byl přidán ethyljodid (83,88 mmol, 6,7 ml). Reakční směs byla míchána po 15 hodin při teplotě místnosti a byla nalita do vody (150 ml) a ethylacetátu (150 ml). Vrstvy byly odděleny a vodná vrstva byla extrahována ethylacetátem (2 x 100 ml). Spojené extrakty byly promyty roztokem solanky (150 ml) a byly sušeny nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrace sušidla a koncentrování poskytly surový produkt, který byl rozetřen s dichlormethanem/diethyletherem/hexanem za získání 3,89 g (60% výtěžek 5-jod-l,3-diethyl6-methyluracilu jako bílé krystalické pevné látky: t.t. 159 až 161 °C. El—HRMS vypočt. pro C9H13IN2O2 (M⁺) 308,00022, nalezeno 308,0018.

b) Příprava N— [(1,1—dimethoxyethyl)karbonyl ]—4—(1,3—diethyl—6—methyl—2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L—fenylalaninu, methylesteru

^24^33^3θ6 Mol. hm.: 459,54

Do suspenze zinkového prachu (33 mmol, 1,96 g) v THF (3 ml) byl přidán 1,2-dibromethan (3 mmol, 0,261 ml) při teplotě místnosti. Tato suspenze byla zahřívána na 60 až 65 °C se tepelným usměrňováním, dokud byl pozorován vývin plynného ethylenu. Suspenze byla ochlazena na teplotu místnosti, byl přidán trimethylchlorsilan (1,5 mmol, 0,19 ml) a směs byla míchána po 15 minut. Suspenze 5-jod-l J-diethyl-ó-methvluraeilu (11 mmol, 3,39 g) v DMA (6 ml) byla ohřívána za získání čirého roztoku a byla přidána v jedné dávce do reakční směsi. Po přidání byla směs zahřívána na 70 °C. Vnitřní teplota reakční směsi vzrostla na 75 °C díky exotermní reakci. Reakční směs byla udržována při 70 °C po 15 hodin, a v této době analýza alíkvotu reakční směsi, která byla zchlazena nasyceným roztokem chloridu amonného, indikovala nepřítomnost

- 36CZ 303435 B6 výchozího materiálu. Reakční směs byla zředěna THF (6 ml) a reakční směs byla ochlazena na teplotu místnosti. Přebytečný zinkový prach byl ponechán usadit.

Roztok obsahující výše připravenou sloučeninu zinku (11 mmol) byl přidán do roztoku Pd(dba)₂(0,14 mmol, 80 g), tri fůry Ifosfinu (TFP) (0,52 mmol, 134 mg) a 7V-[(l,l-dimethylethoxy)karbonyl]-4-jod-L-ťenylalanin-methytesteru (9 mmol, 3,65 g) v THF pri teplotě místnosti a světle žlutá směs byla míchána po 72 hodiny při 50 až 55 °C. Reakční směs byla nalita do nasyceného roztoku chloridu amonného (100 ml) a byla extrahována ethylacetátem (3 x 75 ml). Spojené extrakty byly promyty roztokem solanky (150 ml) a sušeny nad bezvodým síranem horečnatým. Filtrace sušidla a koncentrování poskytly surový produkt, který byl purifikován chromatografií na koloně silikagelu použitím Biotage kolony (40 m) za získání 1,78 g (53% výtěžek) Λ-[( 1, l-dimethoxyethyl)karbonyl]^t-( 1,3-dimethyl-6-methyl-2,4-dioxo-5pyrimidinyl)-L-fenylalaninu, methylesteru, jako amorfní bílé pevné látky. ES-HRMS m/e vypočt. pro C₂4H₃₃N₃O₆ (M+Na) 482,2262, nalezeno 482,2262.

c) Příprava hydrochloridové soli 4—(l,3-diethyl-6-methyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-Lfenylalanin—methylesteru

C₁₉H₂₆C1N₃O4 Mol. hm.: 395,92

Do roztoku ΛΓ-[( 1,1 -d i methoxy ethy l)karbonyI]-4-( 1,3-diethyl-6-methy l-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalaninu, methylesteru (3,87 mmol, 1,78 g) vdioxanu (10 ml) byla přidána 4N kyselina chlorovodíková v dioxanu (20 mmol, 5 ml) pri teplotě místnosti a roztok byl míchán po 1 hodinu. Roztok byl koncentrován a byl zředěn diethyletherem za získání bílé pevné látky. Matečná kapalina byla děkan to vána a zbytek byl sušen na rotační odparce a potom pod vysokým vakuem za získání 0,72 g (47% výtěžek) 4-(l,3-diethyl-6-methyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)L-fenylalanin-methylesteru, hydrochloridové soli jako amorfní pevné látky. ES-HRMS m/e vypočt. pro Ci₉H₂₅N₃O4 (M+Na) 382,1737, nalezeno 382,1736.

d) Příprava A-[(2.6dichlorťenyl)karbonylJ^4-( 1,3-diethyl-ó~methyl-2,4-dioxo-5-pyriml· dinyl)-L-fenylalanin-methylesteru

C₂₆H₂₇C1₂N₃O₅Mol. hm.: 532,42

Do suspenze hydrochloridové soli 4(1,3-diethyl—6—methyl-2,4-dioxc>--5-pyrimidinyl)-L-feny]a lan in-methyl esteru (0,76 mmol, 0,3 g) a 2,6-dichlorbenzoylchloridu (0,84 mmol, 0,175 g) v dichlormethanu (2 ml) byl přidán diisopropylethylamin (3,03 mmol, 0,53 ml) pri teplotě místnosti. Po 5 minutách vše přešlo do roztoku a čirý žlutý roztok byl míchán 15 hodin při teplotě

-37CZ 303435 B6 místnosti. Výsledný hnědý roztok byl zředěn dichlormethanem (25 ml). Dichlormethanová vrstva byla promyta postupně IN kyselinou chlorovodíkovou (2 x 25 ml), nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (25 ml) a roztokem solanky (25 ml) a byla sušena nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrace sušidla a koncentrování rozpouštědla poskytly surový produkt, který byl purifikován chromatografií na silikagelu s použitím kolony Biotage (40) za získání 0,40 g (99% výtěžek) ;Y[(2,6-dichlorfenyl)karbonyl]-4-(1,3-diethyl-6-methy 1-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)L-feny lalanin-methy testeru jako amorfní bílé pevné látky. ES-HRMS m/e vypočt. pro C₂₆H₂₇C1₂N₃O₅ (M+Na) 554,1221, nalezeno 554,1229.

io e) Příprava Λ-[(2,6—dichlorfenyl)karbonvlj—4-(l ,3—diethyl-6-methyl-2,4—dioxo—5-pyrimidiny l)-L-fenylalan inu

Do suspenze 7V-[(2,6-dichlorfenyl)karbonyl]—4-( 1,3-d i ethy 1-6-methy 1-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalanin-methytesteru (0,77 mmol, 0,41 g) v ethanolu (2 ml) byl přidán vodný l,0N hydroxid sodný (1,5 ml) při teplotě místnosti. Směs byla zahřívána na 50 °C a získaný čirý roztok byl míchán po 2 hodiny. Potom byl methanol odstraněn za sníženého tlaku a zbytek byl zředěn vodou (25 ml) a NaOH (2 ml, 0,IN), aby se rozpustila sodná sůl. Vodný roztok byl promyt diethyletherem (30 ml), aby se odstranily neutrální nečistoty. Vodná vrstva byla okyselena l,0N HC1 a produkt byl extrahován do ethylacetátu (2 x 25 ml). Spojené organické extrakty byly promyty roztokem solanky (50 ml) a byly sušeny nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrace sušidla a koncentrování filtrátu poskytly 320 mg (80% výtěžek) V-[(2,6-dichlorfenyl)karbonyl]4-( 1,3-diethyl—6-methy 1-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)—L—feny lalaninu jako amorfní bílé pevné látky. ES-HRMS m/e vypočt. pro C^ChNjOs (M+Na) 541,3921, nalezeno 541,3925.

Příklad 19

Příprava V-[(2—chlor—6-methy lfenyl)karbonyl]—4-(l,3-diethy 1-6-methy 1-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalaninu

a) Příprava V-[(2-chlor-6-methy I fenyl) karbonyl]—1—( 1,3-dÍethyl-6-methyl-2,4-dioxo—5pyrim idinyl)—L—feny lalanin-methy testeru

C27H30CIN3O5 Mol. hm.: 512,00

Do suspenze hydrochloridové soli 4-(l,3-diethyl-6-methyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalanin-methylesteru (0,758 mmol, 300 mg), HBTU (0,84 mmol, 318 mg) a 2-chlor-6-methylbenzoové kyseliny (0,84 mmol, 12 mg) v DMF (2 ml) byl přidán diisopropylethylamin (1,9 mmol, 0,33 ml) při teplotě místnosti. Po 5 min. vše prošlo do roztoku a čirý žlutý roztok byl míchán po 48 hodin při teplotě místnosti. Výsledný temně hnědý roztok byl zředěn ethylacetátem (30 ml). Ethylacetátová vrstva byla postupně promyta IN kyselinou chlorovodíkovou (2 x 30 ml), nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (30 ml) a roztokem solanky (30 ml) a byla sušena nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrace sušidla a koncentrování poskytly surový produkt, kteiý byl purifikován chromatografií na silikagelu za použití Biotage (40 io m) kolony za získání 380 mg (98% výtěžek) V-[(2-chlor-6-methylfenyl)karbonyl]-4-(l,3diethyl-6-methyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalanin-methylesteru jako amorfní bílé pevné látky. ES-HRMS m/e vypočt. pro C27H30CIN3O5 (M+Na) 535,1026, nalezeno 535,1024.

b) Příprava V-[(2-chlor-6-methylfenyI)karbony lpLý 1,3~diethyl-6-methyl-2,4-dioxo-515 pyrimidiny l>-L-feny lalan inu

Do suspenze V-[(2-chlor-6-methylfenyl)karbonylJ-4-(l ,3-diethyl-6-methyI-2.4dioxo-5pyrimidinyl)-L-fenylalanin-methylesteru (0,82 mmol, 420 mg) v ethanolu (2 ml) byl přidán vodný l,0N hydroxid sodný (1,6 ml) při teplotě místnosti. Směs byla zahřáta na 50 °C a získána čirý roztok byl míchán po 2 hodiny. Ethanol byl odstraněn za sníženého tlaku a zbytek byl zředěn vodou (25 ml) a NaOH (3 ml, l,0N), aby se rozpustila sodná sůl. Vodný roztok byl promyt diethyletherem (30 ml), aby se odstranily neutrální nečistoty. Vodná vrstva byla okyselena l,0N HC1 a produkt byl extrahován do ethylacetátu (2x25 ml). Spojené organické extrakty byly promyty roztokem solanky (50 m 1) a byly sušeny nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrace sušidla a koncentrování filtrátu poskytly 277 mg (68% výtěžek). A'-[(2--chlor-6-methylfenyl)karbonylJ 4-(1,3- diethy!-6-methyl-2,4-dioxo- 5 pyrimidinyl>-I-fenylalaninu jako amorfní bílé pevné látky. ES-HRMS m/e vypočt. pro C26H₂8C1N₃O₅ (M+Na) 520,1611, nalezeno 520,1616.

Příklad 20: Příprava 4-( 1,3-díethyl-6-methyl-2,4-dioxo~5-pyrimidinyl)-V-[[ 1 -(2-methoxyethyl)cyklopentyl]karbonyl]-L-fenylalanin

C27H37N3O6 Mol. hm.:499,60

4- ( 1,3-diethyl-6-methyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-/V-[[ 1 -(2-methoxyethyl)cyklopentyl]karbonyl]-L-fenylalanin byl připraven z 4-{l ,3-diethy l6--methy 1-2,4-dioxo—5-pyrimidinyl)— L-fenylalanin-methylesteru a 1 -(2-methoxyethyl)cyklopentankarboxylové kyseliny použitím obecných postupů popsaných v příkladu 19 a byl získán jako amorfní bílá pevná látka.

ES-HRMS m/e vypočt. pro C₂7H₃7N₃O₆ (M+Na) 522,2575, nalezeno 522,2581.

Příklad 21: 7V-[ 1 -(2,6-dichlorfenyl)karbonyl]-4-( 1,3-dimethyl-2,4-dioxo-6-(trifluormethyl)5— pyrimidinyl)—L-fenylalanin io a) Příprava 3-methyl-6-(trifluormethyl)uracilu f₃c WA ch₃nco ⁺ >=^ h₂n

C₆H₅F₃N₂O₂Mol. hm.: 194,11

Do předem smíšeného roztoku methoxidu sodného (55 mmol, 2,97 g) a ethyl-3-amino~4,4,4-trifluorkrotonátu (55 mmol, 10,0 g) v DMSO (19 ml, vysušeného nad molekulárními síty) byl přidán methylisokyanát (55 mmol, 3,2 g) v DMSO (2,5 ml) po 15 minut při 20 °C. Roztok byl míchán po 15 minut a potom byla přidána další část methoxidu sodného (27,5 mmol, 1,34 g). Po míchání 15 min při 20 °C byl při této teplotě přidán methylisokyanát (14 mmol, 0,8 g). Po dalších 15 min byla reakční směs ponechána ohřát na teplotu místnosti a byla míchána přes noc. Získaná žlutá suspenze byla nalita do vody (50 m 1) za získání světle žlutého roztoku. Neutrální nečistoty byly extrahovány do diethyletheru (3x 50 ml). Vodná vrstva byla okyselena koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou za získání bílé pevné látky. Pevné látky byly spojeny filtrací a byly promyty vodou. Po sušení vzduchem bylo získáno 6,79 g (93% výtěžek) 3-methyl-6-(trif]uormethyl)uracilu jako bílé pevné látky: t.t. 235 až 237 °C, EI-HRMS m/e vypočt. pro C6H5F3N2O2 (M+) 194,0303, nalezeno 194,0303.

b) Příprava l,3-dimethyl-6-(trifluormethyl)uracilu

C₇H₇F₃N₂O₂ cf₃

Mol. hm.: 208,14

Do suspenze 3-methyl-6-(trifluormethyl)uracilu (20,6 mmol, 4,0 g) a práškového uhličitanu draselného (41,2 mmol, 5,7 g) v DMF (30 ml) byl přidán methyljodid (82,4 mmol, 5,13 ml). Potom byla reakční směs refluxována po 4 h, přičemž TLC analýza reakční směsi indikovala absenci výchozího materiálu. Reakční směs byla ochlazena na teplotu místnosti a byla zředěna vodou (50 ml). Potom byl DME odstraněn za sníženého tlaku za získání bílé suspenze. Pevné látky byly spojeny filtrací a promyty vodou. Po sušení vzduchem bylo získáno 3,55 g (83% výtěžek) 1,3dimethyl-6-(trifluormethyl)uracilu jako bílé pevné látky: t.t. 85 až 87 °C. EI-HRMS m/e vypočt. pro C₇H₇F₃N₂O₂ (M+) 208,0459, nalezeno 208,0460.

c) Příprava 1.3-dimethyl-5-jod-6-(trifluormethyl)uracilu

-40CZ 303435 B6

CFC7H₇F₃N₂O₂Mol. hm.: 208,14

NIS, CFjCC^H, (CF₃CO)₂O

->

reflux, 15 h

C₇itf₃m₂O₂Mol. hm.: 334,03

Směs 1,3-(dimethyl-6-(trifluormethyl)uracilu (16,91 mmol, 3,52 g), trifluoroctové kyseliny (20 ml) a trifluoracetanhydridu (5 ml) byla refluxována po 5 min. Potom byl přidán NIS (16,90 mmol, 3,8 g) a získaná směs byla míchána po 15 h, přičemž TLC analýza reakční směsi indikovala přítomnost výchozího materiálu. Byla přidán další část NIS (8,45 mmol, 1,9 g) a reflux pokračoval po dalších 5 hodin. Reakční směs byla ochlazena na teplotu místnosti a byla nalita pomalu do nasyceného roztoku uhličitanu draselného (100 ml). Potom byl přidán roztok thiosiřičitanu sodného, aby se odstranit přebytek barevného jodu. Získané pevné látky byly spojeny filtrací a promyty vodou. Po usušení vzduchem bylo získáno 3,73 g (66% výtěžek) 1,310 dimethyl-5-jod-6-(trifluormethyt)uracilu jako bílé pevné látky: t.t.: 149 až 151 °C. EI-HRMS m/e vypočt. pro C7H₆F₃IN₂O₂ (M+) 333,9426, nalezeno 333,9436.

d) Příprava 7V-[( 1,1 -dimethylethoxy)karbonyl]-4-( 1,3-dimethyl-2,4-dioxo-6-(trifluormethyl)-5-pyrimidinyl)-L-fenylalanin-methylesteru

C^F^CL, Mof.hm.. 334*03

Do suspenze zinkového prachu (33 mmol, 1,96 g) v THF (3 ml) byl přidán 1,2-dibromethan (3 mmol, 0,261 ml) při teplotě místnosti. Tato suspenze byla zahřáta na 60 až 65 °C s vývinem tepla, dokud bylo pozorováno vyvíjení plynného ethylenu. Suspenze byla ochlazena na teplotu místnosti, byl přidán trimethylchlorsilan (1,5 mmol, 0,19 ml) a směs byla míchána po 15 minut. Suspenze l,3-dimethyl-5-jod-6-(trifluormethyl)uracilu (10 mmol, 3,34 g) v DMA (8 ml) byla ohřátá za získání čirého roztoku a byla přidána v jedné dávce do reakční směsi. Po přidání byla reakční směs zahřívána na 70 °C. Vnitřní teplota reakční směsi se zvýšila na 75 °C díky exotermní reakci. Reakční směs byla míchána při 70 °C po přibližně 3 h, přičemž TLC analýza alikvotu, který byl zchlazen nasyceným chloridem amonným, indikovala absenci výchozího materiálu. Reakční směs byla zředěna THF (5 ml), ochlazena na teplotu místnosti a přebytečný zinkový prach byl ponechán usadit. Výše uvedený roztok sloučeniny zinku (10 mmol) byl přidán do roztoku Pd(dba)₂ (1,0 mmol, 520 mg), trifurylfosfinu (TFP) (4,0 mmol, 0,93 g) a A-[(l,l-dimethylethoxy)karbonyl]-4-jod-L-fenylalanin-methylesteru (7 mmol, 2,84 g) v THF (10 ml) při teplotě místnosti a světle žlutá směs byla míchána po 12 hodin při 45 °C. Reakční směs byla nalita do nasyceného roztoku chloridu amonného (100 ml) a byla extrahována ethylacetátem (3 x 75 mm). Spojené extrakty byly promyty roztokem solanky (150 ml) a byly sušeny nad bezvodým síranem horečnatým. Filtrace sušidla a koncentrování poskytly surový produkt, který

-41 CZ 303435 B6 byl purifikován chromatografií na silikagelu použitím Biotage (40m) kolony za získání 1,45 g (42% výtěžek) TV—[(1, l-(dimethylethoxy)karbonyl]-4-( 1,3-diethy 1-2,4-dioxo-6-(trifluormethyl)-5-pyrimidinyl)-L-fenylalanin-methylesteru jako amorfní bílé pevné látky. ES—HRMS m/e vypočt. pro C22H20NF3N3O6 (M+Na) 508,1666, nalezeno 508,1670.

e) příprava hydrochloridové soli 4—(1,3—dimethyl-2,4-dioxo-6—(trifluormethyl)—5-pyrimidiny 1 )-L-feny 1 alan i n-methy lesteru

C₁₇H₁₉C1F₃N₃O4 Mol. hm.:421,80

Pevný JV-[( 1,1 -(d i methyl ethoxy )karbony 1]—4-( 1,3-diethy 1-2,4-dioxo-6-( trifluormethyl )-510 pyrimidinyl)-L-fenylalanin-methy lesteru (2,92 mmol, 1,42 g) byl zpracován se 4N kyselinou chlorovodíkovou v dioxanu (28 mmol, 7 ml) při teplotě místnosti a roztok byl míchán po 2 hodiny. Reakční směs byla zředěna dichlormethanem (5 ml) a byla koncentrována za sníženého tlaku na rotační odparce. Zbytek byl zředěn diethyletherem za vzniku světle hnědé pevné látky. Pevné látky byly spojeny filtrací a promyty dichlormethanem. Po sušení bylo získáno 1,21 g (91% výtěžek) 4-(l,3-dimethyl—2,4-dioxo—6—(trifluormethyl)-5—pyrimidinyl)—L-feny 1 alan i nu— methylesteru, hydrochloridové soli, jako světle hnědé pevné látky: t.t. 244 až 247 °C. ES-HRMS m/e vypočt. pro C17H18F3N3O4 (M+H) 386,1322, nalezeno 386,1319.

f) Příprava ;V- [(2,6—dichlorfeny l)karbony I]—4-( 1,3—dimethyl-2,4—dioxo—6—(trifhiormethyl)20 5-pyrimidinyl)-L-fenylalanÍn-methy lesteru

Do suspenze 4-(l,3-dimethyl-2,4-dioxo-6-(trifluormethyl)-5-pyrimidÍny])-L-fenylalanÍnmethylesteru, hydrochloridové soli, (1,0 mmol, 421 mg) a 2,6—dichlorbenzoylchloridu (1,1 mmol, 0,235 g) v dichlormethanu (3 ml) byl přidán diisopropylethylamin (4,4 mmol,

0,622 ml) při teplotě místnosti. Po 1 minutě vše přešlo do roztoku a světle hnědý roztok byl míchán po 72 hodiny při teplotě místnosti. Získaný tmavě hnědý roztok byl zředěn dichlormethanem (25 ml). Dichlormethanová vrstva byla postupně promyta IN kyselinou chlorovodíkovou (2 x 25 ml), nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (25 ml) a roztokem solanky (25 ml) a byla sušena nad bezvodým síranem horečnatým. Filtrace sušidla a koncentrování rozpouštědla poskytly surový produkt, který byl purifikován chromatografií na silikagelu použitím Biotage (40) kolony za získání 0,541 g (97% výtěžek) A' [l--(2.6 (dichlorleny0karbonyl] 4-(1,3dimethyl-2,4-dioxo-6-4trifluormethyl)-5-pyrimidinyl)-L-fenylalanin-methylesteru jako bílé

-42CZ 303435 B6 amorfní pevné látky. ES-HRMS m/e vypočt. pro C24H20CI2F3N3O5 (M+Na) 580,0624, nalezeno 580,0629.

g) příprava ?/-[(2,6-(dichlorfenyl)karbonyl]-4-( 1,3-dimethyl-2,4-dioxo-6-(trÍfluormethyI)5-pyrimÍdinyl)-L-fenylalaninu

C₂₃H₁₈C1₂F₃N₃O₅Mol. hm.:544,31

Do suspenze 7V-[l-(2,6-(dich1orfenyl)karbonyl]-4-(l ,3-dimethyI-2,4-dioxo-6-(trifluormethyl)-5-pyrimidinyl}-L-fenylalanin-methylesteru (0,422 mmol, 0,236 g) v pyridinu (15 ml) byl přidán jodid lithný (4,22 mmol, 0,571 g) při teplotě místnosti. Směs byla zahřívána k refluxu po 15 h. Reakční směs byla ochlazena na teplotu místnosti, zředěna IN kyselinou chlorovodíkovou a extrahována ethylacetátem. (2 x 25 ml). Spojené organické extrakty byly promyty roztokem solanky (50 ml) a byly sušeny nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrace sušidla a koncentrování filtrátu poskytly 201 mg (87% výtěžek) A-[l-(2,6—(dichlorfenyl)karbonyl]-4(l,3-dímethyl-2,4-dioxo-6-(trifIuormethyl)-5-pyrimidinyl)-L-fenylalaninu jako žluté pevné látky: t.t. 125 až 128 °C. ES-HRMS m/e vypočt. pro C₂3i8Cl₂F3N3O₅ (M+Na) 566,0469, nalezeno 566,0468.

Příklad 22. Příprava A-[(2-chlor-6-methylfenyl)karbonyl]-4-( 1.3-dimethyl 2.4-dioxo ó-(trifluormethyl)-5-pyrimidinyl)-L-fenylaIaninu

Mok hm.: 523,89

Mok vzorec:C24H2 1C1F3N3O5

Roztok 2—chlor-6-methylbenzoové kyseliny (190 mg, 1,14 mmol) v dichlormethanu (7 ml) obsahujícího DMF (4 kapky) byl zpracován s oxalylchloridem (0,42 ml, 4,8 mmol) a směs byla míchána po 2 h. Směs byla koncentrována, azeotropicky zpracována s toluenem, aby se odstranily stopy oxalylchloridu a zbytek byl použit přímo v dalším kroku.

-43CZ 303435 B6

Směs výše připraveného chloridu kyseliny, 4-(l .3—dimethyl-2,4—dioxo-6—(trifluormethyl)—5pyrimidinyI)-L-fenylalaninu-methylesteru, hydrochloridové soli (423 mg, 1,003 mmol) v dichlormethanu (5 ml) byla zpracována s DIPEA (0,625 ml, 4,46 mmol) a získaný světle hnědý roztok byl míchán po 3 dny. Směs byla koncentrována, zředěna ethylacetátem, promyta s IN HC1 a roztokem solanky a byla sušena nad síranem hořečnatým. Filtrace a odpařování poskytly zbytek, který byl purifikován chromatografií na silikagelu použitím kolony Biotage (40s) za získání Ά- [(2 -chlor—6-methy l fenyl )karbonyl]-4-( 1,3-dimethy I-2,4-dioxo-6-(trifluormethy 1)5-pyrimidinyl)-L-fenylalanÍn-methylesteru jako bílé pěny (179 mg, 33 %). ES-HRMS m/e vypočt. C₂₅H₂₃C1N₃O₅ (M+Na) 560,1171, nalezeno 560,1172.

Roztok A-[ (2-chlor-6-methylfenyl)karbony 1]—4-( 1,3-dimethy 1-2,4-dioxo-6-(trifluormethyl)5-pyrimidinyl]—L-fenylalanin-methylesteru (260 mg, 0,48 mmol), získaného ve výše u vedeném experimentu, a jodid lithný (6534 mg, 4,8 mmol) v pyridinu (14 ml) byly zahřívány k refluxu přes noc. Směs byla zředěna s IN HC1 a extrahována ethylacetátem. Spojené extrakty byly pro15 myty roztokem solanky a sušeny nad síranem hořečnatým, filtrovány a odpařeny. Zbytek byl rozetřen s etherem, hexanem a dichlormethanem za získání 3V-[(2-chlor-6-methylfenyl)karbonyl]^4-(l ,3-dimethy 1-2,4-dioxo-6-Jtrifluormethyl)-5-pyrimidinyl]-L-fenylalaninu (205 mg, 81 %) jako bílé pevné látky: t.t. 243 až 247 °C. ES-HRMS m/e vypočt. pro C₂₄H₂,CIF₃N3O₅ (M+Na) 546,1014, nalezeno 546,1013.

Příklad 23: /V-[[2-fluor-6-(trifluormethyl)fenyl]karbonyl]-4-(l,3-dimethyl-2,4-dioxo-6-(trifluormethyl)-5—pyrimidinyl)-L-fenylalaninu

CE,

Xco₂h >

CR

X^COCI >

MH-226,56 Mol. vz. : C8H3C1F4O

MH=559,44

Mol. vz.: C25H20F7N3 04

Roztok 2-fluor-6-trifluormethylbenzoové kyseliny (125 mg, 0,60 mmol) (Aldrich 33080-9) v dichlormethanu (3 ml) obsahujícím DMF (2 kapky) byl zpracován s oxalylchloridem (0,21 ml, 2,4 mmol) a směs byla míchána po 2 h. Směs byla koncentrována, azetropicky zpracována s toluenem, aby se odstranily stopy oxalylchloridu a zbytek byl použit přímo v dalším kroku.

Směs výše připraveného chloridu kyseliny, 4-( L3—dimethyl-24—dioxo—6-(trifluormethyl)-5pyrimidinyl)-L—fenylalanin—methylesteru, hydrochloridové solí (210 mg, 0,50 mmol) v dichlormethanu (3 ml) byla zpracována s DIPEA (0,336 ml, 2,4 mmol) a získaný světle hnědý roztok byl míchán po 3 dny. Směs byla koncentrována, zředěna ethylacetátem, promyta s IN HCI a roztokem solanky a byla sušena nad síranem hořečnatým. Filtrace a odpařování poskytly zbytek, který byl purifikován chromatografií na silikagelu použitím kolony Biotage (40s) za získání A-[[2-fluor 6-(trifluormethyl)fenyl]karbonyl]- 4 (1,3 dimethy 1-2,4—dioxo-6-(trifluormethy])-5-pyrimidinyl)-L-fenyIalanin-methylesteru jako bílé pěny (179 mg, 62 %). ES-HRMS m/e vypočt. C₂5H₂oF₇N₃0₅ (M+Na) 589,1183, nalezeno 598,1186.

Roztok N--[[2--fluor-6-(trifluormethyl)fenyl]karbonylj—4-(1,3-dimethyl-2,4-dioxo-6-(trifluormethyl)-5-pyrÍmidinyl)-L-fenylalanin-methylesteru (266 mg, 0,46 mmol), získaného ve výše

-44CZ 303435 B6 uvedeném experimentu, a jodid lithný (624 mg, 4,6 mmol) v pyridinu (14 ml) byly zahřívány k refluxu přes noc. Směs byla zředěna s IN HC1 a extrahována ethylacetátem. Spojené extrakty byly promyty roztokem solanky a sušeny nad síranem hořečnatým, filtrovány a odpařeny. Zbytek byl rozetřen s etherem a dichlormethanem za získání 2V-[[2-fluor-6-(trifluormethyl)fenyl]5 karbony I]—4—(1,3-dimethyl-2,4-dioxo-6-(trifluormethyl)-5-pyrimidinyl)-L-fenylalanÍnu (167 mg, 64 %) jako bílé pevné látky: t.t. 122-125 °C. ES-HRMS m/e vypočt. pro C24H18F7N3O5 (M+Na) 584,1027, nalezeno 584,1028.

Příklad 24: /V-[[2-chlor-6-methylfenyl)karbonyl]-4~(l,3-dimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-3-methyl-L-fenylalanin

a) Příprava 4-[( 1,1 -dimethy lethoxy)karbonyI]amíno-3-methyIbenzylalkohoIu

OjN

OH

0^03 Mol, hm,: 167*16

Boc₂O, Hj. Pd/C BocHNx^L

-*

EtOAc, r.t., 2 h c₁₃h_I9no₃

Mol. hm237,29

Směs 4-nitro-3-methylbenzylalkoholu (56,53 mmol, 9,45 g), di-Zcrc-butyldikarbonátu (63 mmol, 13,74 g) a palladia na dřevěném uhlí (450 mg) v ethylacetátu (240 ml) byla hydrogenována po 2 h při teplotě místnosti. Potom byla reakční směs filtrována přes podložku z celitu promýváním s ethylacetátem (50 ml). Filtrát byl koncentrován pod vakuem za získání 10,18 g (76% výtěžek) 4-[(l,l-dimethylethoxy)karbonyl]amino-3-methylbenzvlalkoholu jako světle žluté pevné látky. EI-HRMS m/e vypočt. pro C13H19NO3 (M+) 237,0126, nalezeno 237,0129.

b) příprava 4-[[( 1,1 -dimethylethoxy)karbonyl]amino]-3-methylbenzaldehydu

MnO₂, CHjC^ 4A MS, r.t., 15 h

Do roztoku 4-[( 1,1 -dimethylethoxy)karbony1]amino-3-methylbenzylalkoho1u (42,9 mmol, 25 10,18 g) v dichlormethanu (85 ml) byl přidán oxid manganičitý (138 mmol, 12 g) a 4Á (0,4 nm) molekulární síta (6 g) pri teplotě místnosti. Reakční směs byla míchána po 76 hodin při teplotě místnosti a byla filtrována přes podložku z celitu promýváním s dichlormethanem. Filtrát byl koncentrován za sníženého tlaku a zbytek byl purifikován chromatografií na silikagelu použitím

Biotage (40m) kolony za získání 7,82 g (77% výtěžek) V-[[( 1,1-dimethy lethoxy)karbonyl]30 amino]-3-methylbenzaldehydu jako bílé pevné látky: t.t. 109 až 111 °C. EI-HRMS m/e vypočt.

pro C13H17NO3 (M+) 235,1208, nalezeno 235,1207.

c) příprava A-(benzyloxykarbonyl)-4-[[(l ,l-dimethylethoxy)karbonyl]an]ino]-3-methyldehydro feny lalan i n-methylesteru

-45CZ 303435 B6

C24H2SN2O6 Mol. hm. :440,49

Do roztoku A-(benzyloxykarbonyl)-a-fosfonglyc i n-tri methyl esteru (18 mmol, 5,96 g) (Aldrich Chemical Company) v dichlormethanu (30 ml) byl přidán tetramethylguanidin (18 mmol, 2,07 g) pri teplotě místnosti. Reakční směs byla míchána po 1 h pri teplotě místnosti a byla ochlazena na

-30 °C. Potom byl najednou přidán roztok 4-[[(l,l-dimethylethoxy)karbonyl]amino]-3-methylbenzaldehydu (15 mmol, 3,52 g) v dichlormethanu (12,5 ml). Po 30 min při této teplotě byla reakční směs ponechána ohřát na teplotu místnosti a byla míchána 15 h. Potom byla reakční směs zředěna diethyletherem (100 ml) a postupně byla promyta 0,5N kyselinou chlorovodíkovou (2x50 ml), nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (100 ml), roztokem solanky (100 ml) a byla sušena nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrace sušidla a koncentrování poskytly surový produkt, který byl purifikován chromatografií na silikagelu použitím Biotage (40 m) kolony za získání 3,87 g (58% výtěžek) 7V-(benzy loxy karbony l)-4-[[(l,l-dimethylethoxy)karbonyl]amino]-3-methyl-dehydrofenylalanin-methyletheru jako bílé pevné látky. EI-HRMS m/e vypočt. pro C24H₂₈N₂O₆ (M+) 440,1527, nalezeno 4400,1524.

d) příprava 7V-(benzy loxy karbony l)-4-[[( 1,1 -dimethylethoxy)karbonyl]amino]-3-methy 1-Lfenylalanin-methylesteru

C24H30N2O6 Mol. hm. :442,50

Proud argonu procházel skrz roztok /V-(benzyloxykarbonyl}-4-[[(l,l-dimethylethoxy)karbonyI]20 amino]-3-methyl-dehydrofenylalanin-methylesteru (8,0 mmol, 3,56 g) v methanolu (25 ml) v Parrově tlakové nádobě přes noc. Potom byl přidán pod proudem argonu v rukávovém boxu katalyzátor, (+)-l 2-bis(2.S',5.Sj-2.5-dimethyltbsf'olan)benzen-(cyklooktadien)rhodný trifluormethansulfonát [[Rh(COD)(S,S)-(me)DuPHOS] + TfÓ-] (asi 40 mg). Roztok byl míchán pod tlakem vodíku (60 psi) (413,7 kPa) při teplotě místnosti po 22 hodin. Získaný roztok byl koncen25 trován a surový produkt byl purifikován chromatografií na silikagelu použitím Biotage (40m) kolony za získání 2 g (55% výtěžek) /V-(benzy]oxykarbonyl)-4-[[(l,l-dimethylethoxy)karbonyl]amino]-3-methyl-L-fenylalanin-methylesteru jako amorfní bílé pevné látky. EI-HRMS m/e vypočt. pro C₂₄H3oN₂0₆ (M+) 442,1627, nalezeno 442,1629.

e) příprava A-(benzyloxykarbony])-4-amino-3-methyl-L-fenylalanin-methylesteru, hydrochloridové soli

-46CZ 303435 B6

C_I9H₂₃C1N₂O4 Mol. hm.: 378,85

Do roztoku jV-(benzy loxykarbonyl)-4-[[( 1,1 -dimethylethoxy)karbonyl]amino]-3-methyl-fenylalan i n-methyl esteru (4,52 mmol, 2 g) v dioxanu (12 ml) byla přidána 4N chlorovodíková kyselina v dioxanu (48 mmol, 2 ml) při teplotě místnosti a roztok byl míchán po přibližně 2 h, až se vytvořila bílá sraženina. Pevné látky byly zředěny diethyletherem, matečná kapalina byla dekantována a zbytek byl sušen nejprve na rotační odparce a potom pod vysokým vakuem za získání 1,487 g (87% výtěžek) 7V-(benzyloxykarbonyl)-4-amino-3-methyl~L-fenylalanin-methylesteru, hydrochloridové soli, jako amorfní žluté pevné látky. FAB-HRMS m/e vypoět. pro C₁₉H₂₂N₂O₄ (M+H) 343,0142, nalezeno 343,0144.

f) příprava /V-(benzyloxykarbonyl)-^-jodo-3-methyI-L-fenylalanin-methylesteru

C19H20FNO4 Mol. hm.:453,27

Suspenze kyseliny sírové (0,3 ml), vody (36 ml) a /V-(benzyloxykarbonyl)-4-amino-3-methylL-fenylalanin-methylesteru, hydrochloridové soli (2,9 mmol, 1,1 g) byla zahřívána za získání čirého roztoku. Potom byla ochlazena na -1 °C (ledová lázeň) a po kapkách byl přidán roztok dusitanu sodného (5,8 mmol, 400 mg) ve vodě (8 ml). Reakční směs byla míchána po 30 min a byl přidán roztok jodidů draselného (8,7 mmol, 1,5 g) ve vodě (6 ml) za získání hnědé suspenze. Po míchání 30 min byla reakční směs ponechána ohřát na teplotu místnosti a byla míchána po 1 h. Potom byla reakční směs zředěna vodou (100 ml) a byla extrahována ethyl20 acetátem (3x50 ml). Spojené extrakty byly promyty nasyceným roztokem hydrogen s i řičí tanu sodného (100 ml) a roztokem solanky (100 ml) a byly sušeny nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrace sušidla a koncentrování poskytly surový produkt, který byl purifikován chromatografií na silikagelu použitím Biotage (40m) kolony za získání 0,84 g (64% výtěžek) /V-(benzyloxykarbonyl)-4~jodo-3-methyl-L-fenylalanin-methylesteru jako amorfní bílé pevné látky. ES-HRMS m/e vypoět. pro Ci9H₂₀INO₄ (M+Na) 476,0329, nalezeno 476,0336.

g) příprava A-(benzyloxykarbonyl)-4-( 1,3-dimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-3-methylL-fe ny lal an i n-methy lesteru

-47CZ 303435 B6

c₂₅h₂₇n₃o₆

Mol. hm.: 465,50

Do suspenze práškového zinku (15 mmol, 0,98 g) v THF (1,5 ml) byl přidán 1,2-dibromethan (1 mmol, 0,13 ml) při teplotě místnosti. Tato suspenze byla zahřívána na 60 až 65 °C za tepelného ohřevu, dokud bylo pozorováno vyvíjení plynného ethylenu. Potom byla suspenze ochlazena na teplotu místnosti a byl přidán trimethylchlorsilan (0,5 mmol, 70 μΐ) a směs byla míchána po 15 min. Suspenze 5-jod-l,3-dimethyluracilu (2,5 mmol, 665 mg) v DMA (2 ml) byla ohřátá za získání čirého roztoku a byla přidána v jedné dávce do reakční směsi. Po přidání byla reakční směs zahřáta na 70 °C. Reakční směs byla míchána při 70 °C po přibližně 3 h, přičemž TLC analýza alikvotu, který byl zchlazen nasyceným chloridem amonným, indikovala absenci výchoio zího materiálu. Směs byla zředěna THF (2 ml), ponechána ochladit na teplotu místnosti a přebytek zinkového prachu byl ponechán usadit.

Výše připravený roztok sloučeniny zinku (2,5 mmol) byl přidán do roztoku Pd(dba)₂ (0,05 mmol, 27 mg), tri fůry Ifosfinu (TFP (0,2 mmol, 50 mg) a TV-(benzyloxy karbony 1 )-4-jodo-3-methy I-L15 fenylalanin-methylesteru (0,5 mmol, 227 mg) v THF (2 ml) při teplotě místnosti a výsledná světle žlutá směs byla míchána po 15 h při 45 °C. Potom byla reakční směs nalita do nasyceného roztoku chloridu amonného a byla extrahována ethylacetátem (3x30 ml). Spojené extrakty byly promyty roztokem solanky (50 ml) a sušeny nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrace sušidla a koncentrování poskytly surový produkt, který byl purifi kován chromatografíi na silikagelu použitím Biotage (40m) kolony za získání 161 mg (69% výtěžek) 7V-( benzyloxy karbony lý-4(1,3-dimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-3-methyl-L-fenyla1anin-methylesteru jako amorfní bílé pevné látky. ES-HRMS m/e vypočt. pro C25H27N3O6 (M+Na) 488,1792, nalezeno 488,1801.

h) příprava 4-( 1,3-dimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-3-methyl-L-fenylalanin-methyl25 esteru

C₁₇H₂iN₃O₄MoL hm. :331,37

Směs .V-(benzyloxykarbonyl) 4 (1.3-dimethy 1-2.4^dioxo-5 pyrimidinyl)-3-mcthyl-L-fcnylalanin-methylesteru (0,34 mmol, 159 mg), cyklohexanu (1 ml) a 10% palladia na uhlíku (100 mg) v ethanolu (3 ml) byla zahřívána k refluxu po 20 min. Potom byla zfiltrována přes podložku zcelitu a podložka byla promyta ethanolem (10 ml). Spojený filtrát byl koncentrován a zbytek byl sušen pod vysokým vakuem za získání 96 mg (85% výtěžek) 4-(L3-dimethyl-2,4dioxo-5-pyrimidinyl)-3-methyl-L-fenylalanin-methylesteru jako lepivé žluté pevné látky. ES-HRMS m/e vypočt. pro C₁₇H₂,N₃O4 (M+Na) 354,1424, nalezeno 354,1424.

-48CZ 303435 B6

i) příprava A-[(2ehlor-6—methy lfeny l)karbonyl]~4-( 1,3-dimethyl-2,4-dioxo-5-py rimidinyl)-3 -methy 1-L-fenylalanin-methylesteru

C₂₅H₂₆C1N₃O₅Mol. hm.:483,94

Do suspenze 4-( 1,3-dimethv 1-2,4 dioxo-5-pvrimidinyl)--3 methyl-L-fenylalanin-rnethylesteru 5 (0,125 mmol, 46 mg), HBTU (0,125 mmol, 47,5 mg) a 2-chlor-6-methylbenzoové kyseliny (0,137 mol, 25 mg) v DMF (2 ml) byl přidán diisopropylethylamin (0,312 mmol, 44 μΙ) při teplotě místnosti. Po 5 min, vše přešlo do roztoku a čirý roztok byl míchán po 72 h při teplotě místnosti. Výsledný temně hnědý roztok byl zředěn ethylacetátem (30 ml). Ethylacetátová vrstva byla postupně promyta IN kyselinou chlorovodíkovou (2 x 30 ml), nasyceným roztokem hydroio genuhličitanu sodného (30 ml), a roztokem solanky (30 ml) a byla sušena nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrace sušidla a koncentrování rozpouštědla poskytly surový produkt, který byl purifikován chromatografií na silikagelu použitím Biotage (40s) kolony za získání 42 mg (70% výtěžek) A-[(2-chlor-6-methylfenyl)karbonyl]—4-(l,3-dimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-3methy 1-L-fenylalanin-methylesteru jako olejového zbytku. ES-HRMS m/e vypočt. pro

C₂₅H₂₆C1N₃O₅ (M+Na) 506,1454, nalezeno 506,1459.

j) příprava A-[(2^hlor'6-methy líenv l)karbonyl]^l< 1,3-dimethy l-2.4-dioxo-5-pyri midiny 1 )-3-methy 1-L-feny lalan inu

C₂4H₂4C1N₃O₅Mol. hm.:469,92

Do suspenze .V-[(2-chlor-ó-methyl feny l)karbonyl]-4-(l,3-d i methy l-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-3-methy 1-L-fenylalanin-methylesteru (0,086 mmol, 40 mg), v ethanolu (1 ml) byl přidán vodný l,0N hydroxid sodný (0,2 ml) při teplotě místnosti. Potom byl ethanol odstraněn za sníženého tlaku a zbytek byl zředěn vodou (5 ml). Vodný roztok byl promyt diethyletherem (20 ml), aby se odstranily neutrální nečistoty. Vodná vrstva byla okyselena l,0N HC1 a produkt byl extrahován do ethylacetátu (2x25 ml). Spojené organické extrakty byly promyty roztokem solanky (50 ml) a byly sušeny nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrace sušidla a koncentrování filtrátu poskytly 34 mg (87% výtěžek) A'-[(2-chlor-6-methylfenyl)karbonyl]-4-(F3-dimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-3-methyl-L-fenylalaninu jako amorfní bílé pevné látky. ES-HRMS m/e vypočt. pro C₂₄H₂4C1N₃O₅ (M+Na) 492,1295, nalezeno 492,1301.

-49CZ 303435 B6

Příklad 25: Příprava A-[(2,6-dichlorfěnyl)karbony 14-( 1,3-dimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-3-methyl-L-fenylalaninu

a) příprava A-[(2.6--dichtorfenyl)karbonyl ]^4-( 1,3-dimethyl-2.4—dioxo-5-pyrimidinyl)—3methy 1-L-fe ny 1 alan i n-methy lesteru

C24H23CI2N3O5 Mol. hm.:504,36

Do suspenze 4^1,3-dimethy 1-2,4-dioxo—5-pyrimidinyl)-3-methyl-I .-feny lalanin-methy lesteru (0,128 mmol, 47 mg) a 2,6-dichlorbenzoylchloridu (0,153 mmol, 32 mg) v dichlormethanu (1 ml) byl přidán diisopropylethylamin (0,45 mmol, 77 μΐ) při teplotě místnosti. Po 5 min. vše přešlo do roztoku a čirý žlutý roztok byl míchán po 15 h při teplotě místnosti. Získaný hnědý roztok byl zředěn dichlormethanem (25 ml). Dichlormethanová vrstva byla postupně promyta IN kyselinou chlorovodíkovou (2x25 ml), nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (25 ml) a roztokem solanky (25 ml) a byla sušena nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrace sušidla a koncentrování poskytly surový produkt, který byl purifíkován chromatografíi na silikagelu použitím Biotage (40 m) kolony za získání 52 mg (81% výtěžek) /V-[(2,6-dichlorfenyl)karbonyl]-4-( 1,3-dimethy 1-2,4-dioxo-5-pvrimidinyl)-3-methyl-L-feny lalanin-methy lesteru jako amorfní bílé pevné látky. ES-HRMS m/e vypočt. pro C24H23CI2N3O5 (M+Na) 526,0907, nalezeno 526,0912.

b) příprava A-[(2,6—dichlorfcnyl)karbonyl] 4 (1,3-dimethyl-2,4-díoxo-5-pyrimidínyl)-3methyl-L-fenylalaninu

C23H2 1 CI2N3O5 Mol. hm. :490,34

Do suspenze A-[(2.6-dichlorfenyl)karbonvl]—4-( 1,3-dimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidÍnyl)-3methyl-L-fenylalanin-methylesteru (0,1 mmol, 59 mg) v ethanolu (1 ml) byl přidán vodný l,0N hydroxid sodný (0,2 ml) při teplotě místnosti. Směs byla míchána po 2 h při teplotě místnosti. Ethanol byl odstraněn za sníženého tlaku a zbytek byl zředěn vodou (10 ml). Vodný roztok byl promyt diethyl etherem (20 ml), aby se odstranily neutrální nečistoty. Vodná vrstva byla okyselena l,0N HCl a produkt byl extrahován do ethylacetátu (2x15 ml). Spojené organické extrakty byly promyty roztokem solanky (50 ml) a byly sušeny nad bezvodým síranem hořečnatým. Filt30 race sušidla a koncentrování filtrátu poskytly 20 mg (41% výtěžek) Y-|(2,6-dichlorfenyl)karbonvl j 4-( 1,3-dimethy 1-2.4-dioxo-5-pyrimidinyl) 3 methy 1-L- fenylalaninu jako amorfní

-50 CZ 303435 B6 bílé pevné látky. ES-HRMS m/e vypočt. pro C23H21CI2N3O5 (M+Na) 512,0752, nalezeno 512,0754.

Příklad 26: Příprava/V-[(2,6-dichlorfenyl)karbony l]-4-( 1,3,6-trimethy 1-2,4-d ίοχο-5-pyrimidinyl)-3-methyl-L-fenylalanin

a) příprava A-(benzy Ioxy karbony 1]—4—( 1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5~pyrimidinyl)-3-methylL-fenylal an in-methy le steru

C₂₆H₂₉N₃O₆Mok hm.: 479,53

Do suspenze zinkového prachu (15 mmol, 0,98 g) v THF (1,5 ml) byl přidán 1,2-dibromethan (1 mmol, 0,13 ml při teplotě místnosti. Tato suspenze byla zahřívána na 60 až 65 °C, dokud bylo pozorováno uvolňování plynného ethylenu. Potom byla suspenze ochlazena na teplotu místnosti a byl přidán trimethylchlorsilan (0,5 mmol, 70 μΐ) a směs byla míchána po 15 min. Suspenze

5-jod-l,3,6-trimethyluracilu (2,5 mmol, 700 mg) v DMA (2 ml) byla ohřátá za získání čirého roztoku a byla přidána do reakční směsi v jedné dávce. Reakční směs byla míchána při 70 °C po 3 až 4 hodiny, přičemž TLC analýza alikvotu, který byl zchlazen nasyceným chloridem amonným, indikovala absenci výchozího materiálu. Potom byla reakční směs zředěna THF (3 ml) a přebytek zinkového prachu byl ponechán usadit.

Výše připravený roztok obsahující sloučeninu zinku (2,5 mmol) byl přidán do roztoku Pd(dba)₂(0,05 mmol, 27 mg), trifurylfosfínu (TFP) (0,2 mmol, 50 mg) a 7V-(benzyloxykarbonyl)-4-jod3-methyl-L-fenylalanin-methylesteru (0,5 mmol, 227 mg) v THF (2 ml) při teplotě místnosti a světle žlutá směs byla míchána po 15 h při 45 °C. Potom byla reakční směs nalita do nasyceného roztoku chloridu amonného a byla extrahována ethylacetátem (3x30 ml). Spojené extrakty byly promyty roztokem solanky (50 ml) a byly sušeny nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrace sušidla a koncentrování poskytly surový produkt, který byl purifikován chromatografií na silikagelu použitím kolony Biotage (40m) za získání 71 mg (30% výtěžek) A-( benzyl o xy karbony 1)-4-( 1,3,6-tri methy 1-2,4-dioxo-5-pyrimidinv l)-3-methy 1-L-fenyl30 alan i n-methyl esteru jako žlutého oleje. ES-HRMS m/e vypočt, pro C₂6H29N₃O₆ (M+Na)

502,2173, nalezeno 502,2174.

b) příprava 4-(l ,3,6-trimethyI-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-3-methyl-L-fenyialanin-methylesteru

-51 CZ 303435 B6

Ci₈H₂₃N₃O₄Mol.hm.:345,40

Směs A'-(benzyloxykarbonyl)-4-(k3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-3-methyl-Lfenylalan in-methyl esteru (OJ 45 mmol, 70 mg), cyklohexenu (1 ml) a 10% palladia na uhlíku (100 mg) vethanolu (2 ml) byla zahřívána krefluxu po 15 h. Potom byla zfiltrována přes podložku zcelitu a podložka byla promyta ethanolem (10 ml). Spojený filtrát byl koncentrován za sníženého tlaku. Zbytek byl sušen pod vysokým vakuem za získání 36 mg (72% výtěžek) 4-(l,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-3-methyl-L-fenylalanin-methylesteru jako světle žluté pevné látky, ES-HRMS m/e vypočt. pro Ci₈H₂₃N₃O4 (M+Na) 368,1327, nalezeno 368J321.

io

c) příprava /V-[(2,6-dichlorfenyl)karbonyl]-4-(l ,3₎6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-3methyl-L-fenylalanin-methylesteru

C₂₅H₂₅C1₂N₃O₅Mol. hm.:518,39

Do suspenze 4-( 1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-3-methyl-L-fenylalanin-methyl15 esteru (0,089 mmol, 34 mg) a 2,6-dichlorbenzoylchloridu (OJ mmol, 21 mg) v dichlormethanu (2 ml) byl přidán diisopropylethylamin (0,4 mmol, 70 μΐ) při teplotě místnosti. Po 5 min. vše přešlo do roztoku a čirý žlutý roztok byl míchán po 15 h při teplotě místnosti. Získaný hnědý roztok byl zředěn dichlormethanem (25 ml). Dichlormethanová vrstva byla postupně promyta IN chlorovodíkovou kyselinou (2x25 ml), nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (25 ml) a roztokem solanky (25 ml) a sušena nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrace sušidla a koncentrování rozpouštědla poskytly surový produkt, který byl purifikován chromatografií na silikagelu použitím kolony Biotage (40m) za získání 22 mg (48% výtěžek) A-[(2,6-dichlorfeny1)karbonyl]--4-(1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-3-methyl-L-fenylalaninmethylesteru jako viskózního oleje. ES-HRMS m/e vypočt. pro C₂5H₂₅N₃O₅ (M+Na) 541J065, nalezeno 541,1063.

d) příprava V- [(2,6 <Jichlorfenyl)karbonyl]-4 ( 1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-3methyl-I-feny lalan inu

-52CZ 303435 B6

C₂₄H₂₃C1₂N₃O₅Mol. hm..504,36

Do suspenze A-[(2.6-dichlorfenyl)karbonyl]^l-( 1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-3methyl-L-fenylalanin-methylesteru (2 ml) byl přidán vodný l,0N roztok hydroxidu sodného (0,5 ml) při teplotě místnosti. Směs byla míchána po 2 h při teplotě místnosti. Ethanol byl odstraněn za sníženého tlaku a zbytek byl zředěn vodou (10 ml). Vodný roztok byl promyt d i ethyl etherem (20 m 1), aby se odstranily neutrální nečistoty. Vodná vrstva byla okyselena l,0N HC1, produkt byl extrahován do ethylacetátu (2x15 ml). Spojené organické extrakty byly promyty roztokem solanky (50 ml) a byly sušeny nad bezvodým síranem horečnatým. Filtrace sušidla a koncentrování filtrátu poskytly 20 mg (93% výtěžek) JV-[(2,6-dichlorfenyl)karbonyl]-4ío (l,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-3-methyl-L-fenylalaninu jako amorfní bílé látky.

ES-HRMS m/e vypočt, pro C23H₂₁Cl2N₃O₅ [(M-H)+2Na] 548,0725, nalezeno 548,0733.

Příklad 27: 7V-[(2,6-dichlorfenyl)karbony1]^l-(l ,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L15 feny lalanin—methy lesteru

C₂₅H₂₅C1₂N₃O₅Mol. hm.:518,39

Do suspenze V-[(2,6-dichlorfenyl)karbonyl]*4-(l,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-320 methyl-L-fenylalaninu (0,6 mmol, 300 mg) a hydrogenuhličitanu sodného (3,6 mmol, 302 mg) v DMF (4 ml) byl přidán při teplotě místnosti jodethan (3,6 mmol, 039 ml). Směs byla míchána po 72 h při teplotě místnosti. Potom byla reakční směs nalita do vody (50ml)abyla extrahována ethylacetátem (3x20 ml). Spojené extrakty byly promyty roztokem solanky (60 ml) a byly sušeny nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrace sušidla a koncentrování filtrátu poskytly surový pro25 dukt, který byl purifíkován chromatografií na silikagelu použitím kolony Biotage (40m) za získání 155 mg (50% výtěžek) /V-[(2,6-dichlorfenyl)karbonyl]-4-(l,3,6-trimethy]-2,4-dioxo5-pyrimidínyl)-L-fenylalanin-ethylesteru jako krystalické bílé pevné látky: t.t. 262 až 265 °C. ES-HRMS m/e vypočt. pro C₂₅H₂₅C1₂N₃O5 [(M+Na] 540,1062, nalezeno 540,1049.

-53 CZ 303435 B6

Příklad 28: ;V-[(2.6-dichlorfenyl)karbonylJ-4-(],3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-Lfenylalanínu 2—[(Λ',/V—diethyl)amino)ethylesteru

C29H34CI2N4O5

Mol. hm. .589,51

Směs V-[(2,6-dichlorfenyI)karbonyl]-4-(l,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrÍmidinyl)-L-fenyI5 alaninu (320 mg, 0,65 mmol), 2-[(AriV-diethyl)amino]ethy]chloridu hydrochloridu (579 mg,

3,26 mmol) a uhličitanu draselného (451 mg, 3,27 mmol) v ethylacetátu (5 ml) a vodě (5 ml) byla přes noc pří teplotě místnosti. Vrstvy byly odděleny a vodná vrstva byla extrahována ethylacetátem. Spojené extrakty byly promyty solankou, byly sušeny nad síranem hořečnatým a koncentrovány za získání V-[(2,6-dichlorfenyl)karbonyl]-4-(l,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)10 L-fenylalanin 2-[(/V_TA^r-diethyl)amino]ethylesteru (190 mg, 49 %) jako amorfní bílé pevné látky. ES-HRMS m/e vypoět. pro C^HmC^Os [M+H] 589,1976, nalezeno 589,1980.

Okyselení vodné vrstvy poskytlo regenerovaný /V-[(2,6—dichlor fenyl )karhonyl]-4-( 1,3,6-trimethyl—2,4-dioxo-5—pyrimidinyl)-L—fenylalanin (167 mg).

Příklad 29: A-[(2-chlor—6-methyÍfenyl)karbonyl]—4-( 1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalaninu 2-[(A',A'—diethyl)amino]ethylester

C₃₀H₃₇ClN4O₅Mol. hm.:569,09

A' f(2 -chlor 6 methyl fenyl )karbonvl |-4-( 1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalanin 2-[(A/A^r-diethyl)amino]ethylester byl připraven z A^/-[(2-chlor—6-methy Ífeny l)karbonyl]4-(l,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalaninu a 2-[(A^r,A^í-diethyl)-amino]ethylchloridu hydrochloridu použitím obecného postupu popsaného v příkladu 28 a byl získán jako amorfní bílá pevná látka. ES-HRMS m/e vypočt. pro C30HV7CIN4O5 (M+H) 569,2525, nalezeno

569,2530.

-54CZ 303435 B6

Příklad 30: Příprava .V-[(2-chlor—6—methylfenyl)karbonylj—4 -{1,3,6- trimethyl 2,4-dioxo-5pyrimÍdinyl)-L-fenylalanin-ethy!esteru

V^H3

c₂₆h₂₈cin₃o₅

Mol. hm. :497,97

V-[(2-chlor-6-methyl feny l)kar bony l]-4-( l,3,6-trÍmethyl-2,4-dÍoxo-5-pyrimidinyl)-L-fenyl· alanin ethylester byl připraven z V-[(2-chlor-6-methylfenyl)karbonyl]-4-(l,3,6-trimethyl-2,4dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalaninu a jodethanu použitím obecného postupu popsaného v příkladu 27 a byl získán jako amorfní bílá pevná látka. ES-HRMS m/e vypočt. pro C₂₆H_2gCIN₃O₅ (M+Na) 520,1610, nalezeno 520,1591.

Příklad 31: A-[(2,6—diehlorfenyl)karbonyl]—4-( 1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-Lfenylalanin 2-(4-morfolin)ethy(ester

a) Příprava jV-[(1 ,l-dimethylethoxy)karbonyl]-4-(l ,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrÍmÍdin15 yl)-L-fenylalaninu

C21H27N3O6 Mol. hm. :417,46

Do suspenze 7V-[( 1, l-dimethylethoxy)karbonyl] 4 {1,3,6-trímethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)L-fenylalanin-methylesteru (8,8 mmol, 3,79 g) v ethanolu (20 ml) b yl přidán vodný l,0N hydroxid sodný (17,57 ml) při teplotě místnosti. Směs byla míchána po 2 h při teplotě místnosti.

Potom byla směs zředěna vodou (50 ml) a ethanol byl odstraněn za sníženého tlaku. Vodný roztok byl promyt diethyletherem (100 ml), aby se odstranily neutrální nečistoty. Vodná vrstva byla okyselena l,0N HC1 a produkt byl extrahován do ethylacetátu (2x100 m 1). Spojené organické extrakty byly promyty roztokem solanky (200 ml) a byly sušeny nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrace sušidla a koncentrování filtrátu poskytly 3,44 g (94% výtěžek)

7V-[( 1,1-dimethylethoxy)karbon\T]^4-( 1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-l.-fenylalaninu jako světle hnědé pěnové pevné látky. ES-HRMS m/e vypočt. pro C_2]H₂₇N₃O₆ (M+Na) 440,1792, nalezeno 440,1792.

b) příprava V-[( 1,1 -d i methv let hoxy) karbony l]—4-( 1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidin30 yl)-L-fenylalanin 2-(4-morfolin)ethylesteru

-55CZ 303435 B6

C₂₇H₃₈N₄O₇

Mol. hm.:530,61

Do roztoku Λ-[( 1,l-dimethylethoxy)karbonyl]^l-(l,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)L-fenylalaninu (1,21 mmol, 505 mg) a 2-(4-morfolin)ethanolu (2,42 m mol, 318 mg) v THF (8 ml) byl přidán di-isopropylkarbodiimid (DIC) (1,82 mmol, 0,287 ml) a 4-dimethyIamino5 pyridin (0,6 mmol, 74 mg) při teplotě místnosti. Získaný roztok byl míchán po 72 h. Potom byla reakční směs nalita do vody (50 ml) a byla extrahována ethylacetátem (3 x 50 ml). Spojené extrakty byly promyty vodou (2 x 50 ml) a roztokem solanky (100 ml) a byly sušeny nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrace sušidla a koncentrování filtrátu poskytly surový produkt, který byl purifikován chromatografíi na silikagelu použitím kolony Biotage (40m) za získání io 428 mg (67% výtěžek) TV—[(1 ,l-dimethylethoxy)karbony]]-4-(l,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5pyrimidinyl)-L-fenylalanin 2-(4~morfolin)ethylesteru jako amorfní bílé pevné látky. ES-HRMS m/e vypočt. pro C27H38N4O7 (M+Na) 553,2633, nalezeno 553,2636.

c) příprava 4-(l ,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyI)-L-fenylalaninu 2-(4-morfolin)15 ethylesteru, hydrochloridové soli

C₂₂H₃ iCIN₄O₅Mol. hm. :466,96

Pevný A-[( 1, l-dimethylethoxy)karbonyl]^4-( 1,3₅6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-Lfenylalanin 2-(4-morfolin)ethylester (1,6 mmol 0,85 g) byl zpracován s 4N kyselinou chlorovodíkovou v dioxanu (16,02 mmol, 4 ml) při teplotě místnosti a roztok byl míchán po 3 hodiny, až se vytvořila bílá sraženina. Pevné látky byly zředěny diethyletherem. Matečná kapalina byla dekantována a zbytek byl sušen nejprve na rotační odparce a potom pod vysokým vakuem za získání 0,75 g (99% výtěžek) 4-( 1,3,6-trimethy 1-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenyl alanin 2(4-morfolin)ethyfesteru, hydrochloridové soli, jako amorfní žluté pevné látky. ES-HRMS m/e vypočt. pro C22H3₀N₄O₅ (M+H) 431,2289, nalezeno 431,2292.

d) příprava TV-[(2,6-dichlorfenyl)karbonyl ]-4-( 1,3.6 trimethy 1-2.4-dioxo-5 -pyrimidinvl)-I fenylalanin 2-(4-morfolin)ethylesteru

-56CZ 303435 B6

C29H32CI2N4O6

Mol. hm. :603,49

Do suspenze 4-( 1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimÍdÍnyl)-L-fenylalaninu 2-(4-morfolin)ethylesteru, hydrochloridové soli (0,85 mmol, 399 mg) a 2,6-dichlorbenzoylchloridu (0,95 mmol, 0,201 g) v dichlormethanu (4 ml) byl přidán di ísopropylethylamin (4,75 mmol, 0,66 ml) při teplotě místnosti. Po 5 min. vše přešlo do roztoku a čirý žlutý roztok byl míchán po 48 h při teplotě místnosti. Výsledný žluto-hnědý roztok byl zředěn dichlormethanem (50 ml). Dichlormethanová vrstva byla postupně promyta IN chlorovodíkovou kyselinou (2 x 50 ml), nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (50 ml) a roztokem solanky (50 ml) a byla sušena nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrace sušidla a koncentrování poskytly surový produkt, který byl purifikován chromatografii na silikagelu použitím kolony Biotage (40m) za získání 0,427 g (75% výtěžek) V-[(2,6-dichlorfenyl)karbonyl]—4-( 1,3,6-trimethy!-2.4-dioxo-5-pyrimidinyl)L-fenylalanin 2-(4-morfolin)ethylesteru jako bílé pevné látky: t.t.: 90 až 94 °C. ES-HRMS m/e vypočt. pro C₂₉H3₂CI₂N₄O₆ (M+H) 603,1772, nalezeno 603,1782.

Příklad 32. Příprava jV-[(2-chlor-6-methylfenyl)karbonyl]-4-(l,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5pyrimidinyl)-L-fenylalanin 2-(4-morfolin)ethylesteru

C₃oH₃₅CIN₄06 Mol. hm. :583,07 /V-[(2-chlor-6-methylfenyl)karbonyl]^l-(l,3,6-trimethyl-2,4-<lioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenyl20 alanin 2-(4-morfolin)ethylester byl připraven z 4-(l,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)L-fenylalaninu 2-{4-morfolin)ethy testeru a 2-chlor-6-methylbenzoylchloridu použitím obecných postupů popsaných v příkladu 31 a byl získán jako amorfní bílé pevná látka. ES-HRMS m/e vypočt. pro C30H35CIN4O6 (M+H) 583,2318, nalezeno 583,2326

Příklad 33: Příprava iV-[(2,6-dichlorfenyl)karbonyl]-4-( 1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidiny l)-L-fenylalanin 1 -(acetoxy)ethy 1 esteru

a) příprava A-[( 1,1-dimethylethoxy)karbonyl]-4-( 1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidi30 nyl)-L-fenylalanin l-(acetoxy)ethylesteru

-57CZ 303435 B6

C25H33N3O8

Mol. hm.:503,56

Do suspenze .V-j( 1, 1-dimethy lethoxy)karbonyl]-4-( 1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)L-fenylalanin (1,006 mmol, 420 mg) a hydrogenuhličitanu sodného (5,03 mmol, 422 mg) v DMF (8 ml) byl přidán 1-chlorethylacetát (5,03 mmol, 616 mg) při teplotě místnosti. Reakční směs byla míchána 48 h. Potom byla nalita do vody (50 ml) a extrahována ethylacetátem (3x50 ml). Spojené extrakty byly promyty vodou (2x50 ml) a roztokem solanky (100 ml) a byly sušeny nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrace sušidla a koncentrování filtrátu poskytly surový produkt, který byl purifikován chromatografií na silikagelu použitím kolony Biotage (40m) za získání 390 mg (77% výtěžek) A-[(l,l-dimethvlethoxy)karbonyl]—4-(1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5pyrimidinyl)-L-fenylalanin l-(acetoxy)ethylesteru jako amorfní bílé pevné látky. ES-HRMS m/e vypočt. pro C25H33N3O8 (M+Na) 526,2160, nalezeno 526,2143.

b) příprava 4-( 1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalanin l-(acetoxy)ethylesteru, hydrochloridové soli

C₂₀H₂oC1N₃0₆Mol. hm.:439,90

Pevný 2V-[( 1,1 -dimethy lethoxy)karbonyl]-4-( 1,3,6-trimethy l-2,4-dioxo-5-pyrimidiny 1)-Lfenylalanin l-(acetoxy)ethylester (1,4 mmol, 0,705 g) byl zpracován se 4N kyselinou chlorovodíkovou v dtoxanu (20 mmol, 5 ml) při teplotě místnosti a roztok byl míchán po 2 h, až se vytvořila bílá sraženina. Směs byla zředěna diethyletherem a dichlormethanem a pevné látky byly spojeny filtrací promýváním s diethyletherem. Po sušení na vzduchu bylo získáno 0,63 g 4-(l,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl}-L-fenylalanin l-(acetoxy)ethy lesteru, hydrochloridu jako amorfní šedé pevné látky. ES-HRMS m/e vypočt. Pro C20H26N3O6 (m+H) 404,4816, nalezeno 404,1818.

c) příprava /V-[(2,6—dichlorfenyl)karbonyl]—4-(1,3,6-tri methy 1—2,4—dioxo-5—pyrim idinyl)- L— fenyl alanin l-(acetoxy)ethy lesteru

C₂7H₂7C1₂N₃O₇Mol. hm.:576,42

-58CZ 303435 B6

Do suspenze 4-(1,3.6--trimethyl-2.4-dioxo-5-pyrimidinyl}-L-fenylalanin l-(acetoxy)ethylesteru, hydrochloridové soli (0,723 mmol, 399 mg) a 2,6-dichlorbenzoylchloridu (0,8 mmol, 0,17 g) v dichlormethanu (5 ml) byl přidán diisopropylethylamin (3,2 mmol, 0,45 ml) při teplotě místnosti. Po 5 min. vše přešlo do roztoku a čirý žlutý roztok byl míchán po 48 hodin při teplotě místnosti. Získaný světle hnědý roztok byl zředěn dichlormethanem (50 ml). Dichlormethanová vrstva byla postupně promyta IN chlorovodíkovou kyselinou (2 x 50 ml), nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (50 ml) a roztokem solanky (50 ml) a byla sušena nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrace sušidla a koncentrování rozpouštědla poskytly surový produkt, který byl dále purifikován chromatografií na silikagelu s použitím kolony Biotage (40s) za získálo ní 0,312 g (67% výtěžek) jV-[(2,6-dichíorfeny 1) kar bony l]-4-( 1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L—fenylalanin l-(acetoxy)ethylesteru jako bílé pevné látky: t.t. 168 až 170 °C.

ES-HRMS m/e vypočt. pro C27H27 CI2N3O7 (M+Na) 598,1118, nalezeno 598,1122.

Příklad 34. Příprava iV-[(2-chlor-6-methylfenyl)karbonyl]-4-(l,3,6-trimethyl-2,4-dÍoxo-5py r i m id i ny 1 )-L-feny lal an in 1 -(acetoxy)ethy lesteru

C₂₈H₃₀ClN₃O₇Mol. hm.:556,01 jV-[(2-chlor-6-methylfenyl)karbonyl]^4-( 1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L--fenylalanin l-(acetoxy)ethylester byl připraven z 4-(l,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L20 fenylalanin 1 (acetoxy)ethylesteru a 2-chlor-6-methylbenzoylchloridu použitím obecných postupů popsaných v příkladu 33 a byl získán jako bílá pevná látka: t.t 84 až 88 °C. ES-HRMS m/e vypočt. pro C28H30CIN3O7 (M+Na) 576,1664, nalezeno 578,1665.

Příklad 35. Příprava L-prolyl-4-(l,3,6-trimethyl-2,4—dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalaninu a) příprava L-[( 1,1 d i methyl ethoxv)karbony lj-proly 1-4-( 1,3,6-trimethy 1 2,4-dioxo5-py ri-

Do suspenze 4-(l,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalanin methylesteru, hydrochloridové solí (7 mmol, 2,57 g), HBTU (8,75 mmol, 3,32 g) a L-[(l,l-dimethylethoxy)-59CZ 303435 B6 karbonyl]prolinu (8,75 mmol, 1,88 g) v DMF (28 ml) byl přidán diisopropylethylamin (21 mmol, 3,65 ml) při teplotě místnosti. Po 2 min. vše přešlo do roztoku a čirý žlutý roztok byl míchán po 48 hodin při teplotě místnosti. Získaný tmavě hnědý roztok byl zředěn ethylacetátem (100 ml). Ethylacetátová vrstva byla postupně promyta IN chlorovodíkovou kyselinou (2 x 50 ml), nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (100 ml) a roztokem solanky (100 ml) a byla sušena nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrace sušidla a koncentrování rozpouštědla poskytly surový produkt, který byl purifikován kolonovou chromatografií s použitím kolony Biotage (40m) za získání 2,5 g (67%) výtěžek) L-[(l,l-dimethylethoxy)karbonyl]-proly 1-4-( 1,3,6trimethy 1-2,4-dioxo-5-pyrimidiny l)-L-fenyl alanin methylesteru jako bílé amorfní látky. ESio HRMS m/e vypočt. pro C₂7H₃₆N4O7 (M+Na) 551,2476, nalezeno 551,2476.

b) příprava L—[(1,1 -dimethy lethoxy)karbonyl]-prolyl—4-( 1,3,6—trimethyl—2,4-dioxo-5—pyri-

OMe

C27H3GN4O7 Mol. hm.; 528*60

Do suspenze L-[( 1,1 -dimethylethoxy)karbonyl]-proly 1-4-( 1,3,6-trimethy 1-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalanin methylesteru (1,51 mmol, 800 mg) v ethanolu (8 ml) byl přidán vodný l,0N hydroxid sodný (5 ml) pri teplotě místnosti. Směs byla zahřáta na 45 až 50 °C a získaný čirý roztok byl míchán po 3 hodiny. Ethanol byl odstraněn za sníženého tlaku a zbytek byl zředěn vodou (25 ml). Vodný roztok byl promyt diethyletherem (50 ml), aby se odstranily neutrální nečistoty. Vodná vrstva byla okyselena l,0N HC1 a produkt byl extrahován do ethylacetátu (2 x 50 ml). Spojené organické extrakty byly promyty roztokem solanky (50 ml) a byly sušeny nad bezvodým síranem horečnatým. Filtrace sušidla a koncentrování filtrátu poskytly 640 mg (83% výtěžek) L-[( 1,1 -dimethy lethoxy)karbonyl]proly 1—4-( 1,3,6-trimethy l-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalaninu jako amorfní bílé pevné látky. ES-HRMS m/e vypočt. pro C26H34N4O7 (M+Na) 537,2320, nalezeno 537,2321.

c) příprava L-proly 1-4-( 1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalaninu

-60CZ 303435 B6

Pevný L-[( 1,1-dimethy(ethoxy)karbonyl Jprolvl—4-( 1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidiny 1)L-fenylalanin (0,89 mmol, 462 mg) byl zpracován se 4N kyselinou chlorovodíkovou v dioxanu (16 mmol, 4 ml) při teplotě místnosti a roztok byl míchán po 3 h. Potom bylo rozpouštědlo odstraněno ve vakuu a zbytek byl sušen pod vysokým vakuem za získání surového produktu, který byl rozetřen s dichlormethanem, diethyletherem a acetonitrilem za získání 395 mg (99% výtěžek) L-prolyM-( 1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalaninu, hydrochloridové soli jako amorfní světle žluté pevné látky. ES-HRMS m/e vypočt. pro C21H26N4O5 (M+H) 415,1976, nalezeno 415,1976.

Příklad 36. A-[(2.6—difluorfenyl)karbonyl]^4-( i ,3,6-trimethy 1-2,4-dioxo-5- pyrirnidinylfL fenylalanin ethylesteru

C25H25F2N3O5 Mol. hni.:485,49

Do suspenze A-[(2.6-difluorfenvl)karbony 1)^4-(1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L15 fenylalaninu (0,743 mmol, 340 mg) a hydrogenuhličitanu sodného (5,94 m mol, 499 mg) v DMF (3,8 ml) byl přidán jodethan (5,94 mmol, 0,475 ml) při teplotě místnosti. Směs byla ,míchána po 48 h při teplotě místnosti. Potom byla reakční směs nalita do vody (100 ml) a byla extrahována ethylacetátem (3 x 25 m 1). Spojené extrakty byly promyty roztokem solanky (80 ml) a byly sušeny nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrace sušidla a koncentrování filtrátu poskytly surový produkt, který byl purifikován chromatografií na silikagelu s použitím kolony Biotage (40m) za získání 335 mg (93% výtěžek) A-[(2.6-difluorfenyl)karbonyl]—4-( 1,3,6-trimethyl—2,4dioxo—5—pyrimidinyl)—L—fenylalanin ethylesteru jako bílé krystalické pevné látky: t.t. 218 až 219 °C. ES-HRMS m/e vypočt. pro C25H25F2N3O5 (M+Na) 508,1654, nalezeno 508,1660.

Příklad 37. Příprava A'-|(2,6 difluorfenyl)karbonyl]^1- (1,3,6-trimethyl“2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalanin 2-[(X/V-diethyl)amino]ethylesteru

C29H34F2N4.O5 Mol.hm, :556,61

Směs /V-[(2,6-difluorfenyl)karbonyl]-4-( 1,3,6-trimethy 1-2,4-dioxo~5-pyrimidinyl)-L-fenyl30 alaninu (1,0 mmol, 460 mg), 2-[(jV,A-+iiethyl)amino]ethylchlorid hydrochlorid (8,05 mmol,

1,43 g) a uhličitanu draselného (8,05 mmol, 1,11 g) v ethylacetátu (5 ml) a vody (5 ml) byla míchána při teplotě místnosti přes noc. Vrstvy byly odděleny a vodná vrstva byla extrahována

-61 CZ 303435 B6 ethylacetátem (2 x 40 ml). Spojené extrakty byly promyty solankou (50 ml) a sušeny nad bezvodým síranem sodným. Filtrace sušidla a koncentrování filtrátu poskytly surový produkt, který byl purifikován chromatografií na silikagelu s použitím kolony Biotage (40m) za získání 426 mg (76% výtěžek) A'-[(2,6-diťluorfenyl)karbony] j—4-(l,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimi5 d i nyl)-L-fenyl alanin 2-[(;V,;Vdiethyl)am i no] ethyle steru jako bílé amorfní pevné látky. ESHRMS m/e vypoět. pro C29H34F2N4O5 (M+H) 557,2570, nalezeno 557,2575.

Příklad 38. A-[(2.6—dif1uorfenyl)karbonyl]—4—(1,3,6-trimethyl—2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-Lfenylalanin l-(acetoxy)ethylester

C27H27F2N3O7 Mol. hm.:543,53

Do suspenze A-[(2,6—difluorfeny l)karbony l]-4-( 1,3,6—trimethy 1-2,4—dioxo—5-pyrimidiny l)-Lfenylalaninu (0,743 mmol, 340 mg) a hydrogenuhličitanu sodného (5,94 mmol, 499 mg) v DMF (3,0 ml) byl přidán 1-chlorethylacetát (5,94 mmol, 0,73 g) při teplotě místnosti. Směs byla míchána pri teplotě místnosti po 48 h. Potom byla reakční směs nalita do vody (50 ml) a byla extrahována ethylacetátem (3 x 25 ml). Spojené extrakty byly promyty roztokem solanky (80 ml) a byly sušeny nad bezvodým síranem sodným. Filtrace sušidla a koncentrování filtrátu poskytly surový produkt, který byl purifikován chromatografií na silikagelu s použitím kolony Biotage (40m) za získání 265 mg (66% výtěžek) A-[(2.6 difluorfenyl)karbonyl] 4 -( 1,3,6-trimethy 1-2,420 dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalanin l-(acetoxy)ethylesteru jako bílé amorfní pevné látky. ES-HRMS m/e vypočt. pro C27H27F2N3O7 (M+Na) 566,1079, nalezeno 566,1710.

Příklady biotestů

Příklad A

VLA—4/VCAM-l screening testy

Aktivita antagonisty VLA—4, definovaná jako schopnost ucházet se o vazebnost na imobilizovaný VCAM-1, byla kvantifikována použitím duální protilátkové ELISA, s pevnou fází. VLA—4 (ct4pl integrin) vázaný na VCAM-1 byl detekován komplexem anti-integrinu βΐ protilátky: HRP-konjugovaný anti-myší IgG: chromogenní substrát (K-Blue). Nejprve bylo potřeba potažení 96miskových ploten (Nunc Maxisorp) rekombinantním lidským VCAM-1 (0,4 pg ve 100 μΙ

PBS), utěsnění každé plotny a potom ponechání ploten stát při 4 °C po asi 18 h. Plotny potažené VCAM byly postupně blokovány 250 μΐ 1% BSA/0,02% NaN₃, aby se redukovala nespecifická vazebnost. V den testování byly všechny plotny promyty dvakrát VCAM testovacím pufrem (200 μΙ/misku 50mM Tris-HCl, lOOmM NaCl, lmM MnCL, 0,05% Tween 20; pH 7,4). Testované sloučeniny byly rozpuštěny ve 100% DMSO a potom byly zředěny 1 : 20 ve VCAM testovacím pufru doplněném 1 mg/ml BSA (tedy finální DMSO = 5 %). Prováděla se série ředění 1 : 4, aby se dosáhlo koncentračního rozmezí 0,005ηΜ-1,563μΜ pro každou testovanou sloučeninu. Do VCAM-potažených desek bylo přidáno 100 μΐ na misku každého ředění, následovalo 10 μΐ VLA—4 odvozeného z Ramosových buněk. Tyto plotny byly postupně míchány na platformovém

-62 CZ 303435 B6 mísiči po 1 min, inkubovány po 2 h při 37 °C a potom byly promyty čtyřikrát 200 μΙ/misku VCAM testovacím pufrem. Do každé misky bylo přidáno 100 μΐ protilátky myšího antíhumánního integrinu βΐ (0,6 pg/ml ve VCAM testovacím pufru + 1 mg/ml BSA) a ponecháno inkubovat po 1 h pří 37 °C. Na závěr této inkubační periody byly všechny plotny promyty čtyřikrát VCAM testovacím pufrem (200 μΙ/misku). Potom byla do každé misky přidána odpovídající druhá protilátka, HRP-konjugovaný kozí anti-myší IgG (100 μΐ na misku a 1 : 800 zředění ve VCAM testovacího pufru + 1 mg/ml BSA), následovala 1 hodinová inkubace při teplotě místnosti a byla zakončena třemi promytími (200 μΙ/misku) VCAM testovacího pufru. Vznik barvy byl iniciován přidáním 100 μΐ K-Blue na misku (15 min inkubace, teplota místn.) a zakončena přidáním 100 μΐ Red Stop pufru na misku. Všechny desky potom byly Čteny UV/Vis spektrofotometrem při 650 nm. Výsledky byly vypočteny jako % inhibice celkových vazeb (tedy VLA-4 + VCAM-1 za nepřítomnosti testované sloučeniny). Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce I (A=IC₅₀ < 1 nM, B - IC₅₀ < 10 nM):

Tabulka 1

Sloučenina z příkladu	Aktivita v testu VCAM/VLA-4 ELISA
2	A
3	B
4	A
5	A

Příklad B

Testovací protokol na Ramos (VLA-4)/VCAM-l buňkách založeného screeningu

Materiály:

Rozpustný rekombinantní lidský VCAM-1 (směs 5- a 7-Ig domén) byl purifikován z CHO buněčného kultivačního média imunoafinitní chromatografií a byl udržován v roztoku obsahujícím 0,lM Tris-glycin (pH 7,5), 0,lMnCl₂ 5mM EDTA, ImM PMSF, 0,02% NaN₃ a 10pg/ml leupeptinu. Calcein-AM byl získán od Molecular Probes Inc.

Metody:

Aktivita antagonisty VLA^l (α4β1 integrin), definovaná jako schopnost ucházet se s buněčněpovrchovým VLA-4 o vazebnost na imobilizovaný VCAM-1, byla kvantifikována použitím testu Ramos-VCAM-1 buněčné adheze, Ramos buňky nesoucí buněčně-povrchový VLA—4 byly označeny fluorescenčním barvivém (Calcein-AM) a ponechány vázat VCAM-1 za přítomnosti nebo absenci testovaných sloučenin. Snížení intenzity fluorescence spojení s připojenými buňkami (% inhibice) odráželo kompetitivní inhibici VLA-4 zprostředkované buněčné adheze testovanou sloučeninou.

Nejprve bylo potřeba potažení 96miskových ploten (Nunc Maxisorp) rekombinantním lidským VCAM-1 (100 ng ve 100 μΐ PBS), utěsnění každé plotny a potom ponechání ploten stát při 4 °C po asi 18 h. Plotny potažené VCAM byly postupně dvakrát promyty s 0,05% Tween-20 v PBS potom blokovány po 1 h (teplota místnosti) 200 μΐ blokovacího pufru (1% BSA/0,02% thime45 rosal), aby se redukovala ne-specifická vazebnost. Po inkubaci blokovacím pufrem byly plotny invertovány, blottovány a zbývající pufr byl nasát. Potom byla každá plotna promyta 300 μΐ PBS, invertována a zbývající PBS byl odsát.

-63 CZ 303435 B6

Testované sloučeniny byly rozpuštěny ve 100 % DMSO a potom byly zředěny 1:25 ve VCAM buněčném adhezním testovacím pufru (4mM CaCI₂, 4mM MgCl₂ v 50mM TRIS-HC1, pH 7,5) (finální DMSO- 4%). Prováděla se série osmi ředění 1:4 pro každou sloučeninu (obecné koncen5 trační rozmezí lnM—12 500nM). Do VCAM-potažených desek bylo přidáno 100 μΙ/misku každého ředění, následovalo 100 μί Ramos buněk (200 000 buněk/misku v 1% BSA/PBS). Plotny obsahující testované sloučeniny a Ramos buňky byly ponechány inkubovat po 45 min. při teplotě místnosti, potom bylo přidáno 165 μΙ/misku PBS. Plotny byly invertovány, aby se odstranily nepřipojené buňky, vysáty, a bylo přidáno 300 μΙ/misku. Potom byly plotny opět invertovány, io vysáty a zbývající pufr byl jemně odsát. Do každé misky bylo přidáno 100 μΐ lýzového pufru (0,1% SDS v 50mM Tris-HCl, pH 8,5) a míšeno po 2 min. na rotační třepací platformě. Potom byla odečtena fluorescenční intensita ploten na fluorescenčním měřicím systému Cytofluor 2300 (Millipore) (excitace = 485 nm, emise = 530 nm). Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce

II, kde (A = IC₅₀ < 10 000 nM):

-64CZ 303435 B6

Tabulka 2

Sloučenina	Aktivita v testu VCAM/VLA-4 Ramos
z příkladu	buněk
2	A
3	A
4	A
5	B
6	A
7	A
8	A
9	A
10	A
11	A
12	A
13	A
14	B
15	A
16	A
17	A
18	A
19	A
20	A
21	A
22	A
23	A
24	B
25	A
26	B
27	B
28	A
29	A
30	B
31	B
32	B
33	B
34	B
35 I .	A

-65 CZ 303435 B6

Příklad C

Protokol Alfa4—beta 7 testu 5

Den dva týdny před testem byly Nunc vysokovazebné F96 Maxisorp imunoplotny, č. 442404 nebo č. 439454, potaženy 25 ng/misku (0,25 pg/ml) MadCAM v objemu 100 pg/misku. Plotny byly pokryty uzávěrem a obaleny, následovala inkubace v chladničce po alespoň 24 hodiny. Použitým povlékacím pufrem bylo: lOmM uhličitanového / hydrogenuhličitanového pufru připraveío ného z : 0,8 g/l uhličitanu sodného a 1,55 g/l hydrogenuhličitanu sodného upraveného na pH 9,6

1NHC1.

Testovací pufry se skládaly z následujících:

Promývací pufr: Blokovací pufr: Značkovací pufr: Buněčný pufr: Vazebný pufr:

Ředicí pufr:

0,05%Tween 20 v PBS

1% Sušené mléko bez tuku v PBS

PBS

RPMI 1640 medium (bez přísad) l,5mM CaCl₂

0,5mM MnCl₂

50mM TRIS-HCI; přidat NaOH po kapkách na pH 7,5;

doplnit do objemu v H₂O upravit na pH 7,5

4% DMSO ve vazebném pufru

Plotny byly promyty 2x promývacím pufrem a potom blokovány při teplotě místnosti po alespoň 1 hodinu blokovacím pufrem. Utěsněné plotny byly někdy blokovány přes noc v chladničce. Potom byly plotny promyty PBS a ručně vysáty. Zbývající kapalina byla z misek odsáta.

Vhodné RPMI 8866 buňky pro testování byly odebrány z dávky (2xl0⁶ buněk/ml a 10 ml/plotnu x počet ploten) a vloženy do zkumavky odstředivky. Zkumavky byly naplněny do objemu s PBS a byly odstřeďovány při 200 x G po 8 minut. Pufr byl vylit a buňky byly resuspendovány na 10 x 10⁶/ml v PBS, a zásobní roztok calceinu v DMSO (5 mg/ml) byl přidán při 5 pl/ml buněčné suspenze. Suspenze byla inkubována po 30 min. při 37 °C ve tmě. Potom byly buňky promyty

PBS. PBS bylo vylito a buňky byly resuspendovány v buněčném pufru při koncentraci 2 x 10⁶ buněk/ml pro povlékání v testu.

Byl připraven zásobní roztok testovaných sloučenin při požadovaném prvním 25násobném ředění ve 100% DMSO. První ředění byl standard, stejně jako testované sloučeniny, byly 1 : 25 přímo ve vazebném pufru, zatímco zbývající série ředění byly v edicím pufru (vazebný pufr/4% DMSO). Zásobní koncentrace a ředění sloučenin pro screening byly stanoveny předpokládanou aktivitou.

Pro testování bylo 129 pl vazebného pufru vneseno do první řady misek a 100 pl ředicího pufru bylo vneseno do zbývajících misek. 5,4pl podíly každé sloučeniny byly pipetovány do příslušných označených misek, vždy třikrát. Potom byly sloučeniny dále ředěny na plotnách (34pl + 100pl => 4násobné ředění). Pro kontrolní vzorky bylo 100 pl ředicího pufru + 100 pl buněčného pufru vloženo do nespecifikovaných základních misek (žádné buňky, žádná sloučenina) a 1 00 pl ředicího pufru; 100 pl buněk bylo vloženo do všech vazebných misek (žádná sloučenina = 100% vazebnost). Do každé misky obsahující sloučeninu byly vneseny označené buňky v množství 2 x 10⁶ buněk/ml, 100 pl/misku (= 2 x 10⁵ buněk/misku). Plotny byly uzavřeny a inkubovány ve tmě po 45 minut při teplotě místnosti. Po inkubování byly nevázané buňky odstraněny přidáním 150 pl PBS/misku. Plotny byly invertovány, odsáty na papírových ubrouscích a jemně promyty

-66CZ 303435 B6 přidáním 200 μΐ PBS do misky a opět vysáty. Zbývající pufr byl z misek opatrně odsát. Do každé misky bylo nakonec přidáno 100 μΐ PBS.

Potom byla odečtena fluorescenční intensita ploten na fluorescenčním měřicím systému 5 Cytořluor 2300 (Millipore) (excitace - 485 nm, emise = 530 nm). Hodnoty IC₅₀ každé sloučeniny byly stanoveny lineární regresní analýzou. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce III.

Tabulka 3

Sloučenina z příkladu	Aktivita v testu MadCAM/RPMI buněk (A=IC₅o<IOOnM,B=IC_5ft<10000nM,C=lC_J<( <5000nM)
6	A
7	A
8	A
9	A
10	B
11	C
12	A
13	B
14	C
15	B
16	B
17	B
18	A
19	B
20	B
21	B
22	B
23	B
24	B
25	B
26	B
27	B

-67CZ 303435 B6

Claims

1. 4-Pyrimidinyl-A-acyl-l-fenylalanin obecného vzorce I

HN—CO,R.

kde

Ri představuje skupinu vzorce Y-l (Υ-Ό, kde každý zR₂₂ a R₂₃ nezávisle představuje vodík, Cj.«alkyl, Q «alkoxy, cykloalkyl, aryl, aiylCi_6alkyl, nitro, kyano, C| alkylthio, Ci_«alkyIsulfinyl, Ci_«alkylsulfonyl, Ci^alky 1karbonyl, halogen, nebo perfluorCi ₆alkyl a alespoň jeden z R₂₂ a R₂3 je odlišný od vodíku; aR₂₄ představuje vodík, C^alkyl, C^alkoxy, aryl, nitro, kyano, Ci .«alky lsulfonyl, nebo halogen; nebo

R] představuje skupinu Y-2, kterou je pěti- nebo šestičlenný heteroaromatický kruh připojený prostřednictvím atomu uhlíku ke karbonylovému zbytku amidoskupiny, přičemž výše uvedený kruh obsahuje jeden, dva nebo tri heteroatomy zvolené ze souboru sestávajícího z dusíku, kyslíku a síry a jeden nebo dva atomy tohoto kruhu jsou nezávisle substituovány substituentem zvoleným z Q ₆alkviu, cykloalkylu, halogenu, kyanoskupiny, perfluorCi ₆alkylu nebo arylu a alespoň jeden z takto substituovaných atomů přiléhá k atomu uhlíku připojenému ke karbonylovému zbytku amidoskupiny;

R₂ představuje vodík, Cj .«alkyl, substituovaný C^alkyl, aryl C_b«alkyl, nebo aryl;

R₃ představuje vodík, C.'i ₆alkyl, substituovaný Ci «alkyl, aryl Cj «alkyl, nebo aiyl;

R₄ představuje vodík, halogen, C| «alkyl, substituovaný C^alkyl, nebo aryl;

R₅ představuje vodík, C i -«alky 1, chlor nebo Cj «alkoxy;

R« představuje vodík, C^alkyl, C| ₍₎alky(karbonyloxyC] ₍₎alkyk substituovaný C]-«alkyl, nebo R« představuje skupinu vzorce P-3:

³⁴ (P-3),

-68CZ 303435 B6 kde R₃₂ představuje vodík nebo Ci ₆alkvl; R₃₃ představuje vodík, C_t «alkyl nebo aryl; R₃₄představuje vodík nebo Ci^alkyl; h představuje celé číslo s hodnotou 0 až 2; g představuje celé číslo s hodnotou 0 až 2; součet čísel h a g má hodnotu 1 až 3; nebo

Ré představuje skupinu vzorce P—4:

(P-4), kde R₃₂, g, a h mají výše uvedený význam; Q' představuje O, S, -(CH₂)j- nebo skupinu vzorce N-R₃₅; kde R₃₅ představuje vodík, C] ₆alkyf Ci_6alkylkarbonyl, C|_éalkoxykarbonyl; j představuje číslo 0, 1 nebo 2;

nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli;

kde pojem „substituovaný Cí^alky 1“ znamená C^alkylskupinu, která je substituována jednou nebo více skupinami nezávisle zvolenými z cykloalkylu, nitroskupiny, aryloxyskupiny, arylu, hydroxyskupiny, halogenu, kyanoskupiny, Ci_₆alkoxyskupiny, Ci «alkylkarbonylu, C, ₆alkylthioskupiny, C, ₆alkylsulfinylu. Ci^alkylsulfonylu, aminoskupiny a mono nebo diCi^alkylaminoskupiny; pojem „aryl“ znamená fenylskupinu nebo naftylskupinu; a pojem „cykloalkyl“ znamená 3- až 7-členný karbocyklický kruh.

2. 4-pyrimidinyl-A-acyl-l -fenylalanin podle nároku 1 obecného vzorce I, kde

R₂ představuje vodík, Ci ₆alkyl, substituovaný Ci^alkyl, aryl Ci^alkyl, nebo aryl;

R₃ představuje vodík, C|_6alkyl, substituovaný C ₍ <,alkyl, aryl C^alkyl, nebo aryl; a

R₄ představuje vodík, C _{b 6}alky 1, perfluorC,₆alkyl. nebo aryl;

kde pojem „aryl“ znamená fenylskupinu nebo naftylskupinu.

3. 4-Pyrimidinyl-A^L-acyl-l-fenylalanin podle nároku 1 obecného vzorce I, kde

R₂ představuje vodík, C|_₆alkyl, substituovaný C m,alkyl, nebo aryl;

R₃ představuje vodík, C^alkyl, substituovaný Ci^alkyl, nebo aryl;

a

R4 představuje vodík, halogen, Ci-^alkyl, substituovaný C,_₆alkyl. nebo aryl;

kde pojem „aryl“ znamená fenylskupinu nebo naftylskupinu.

4. 4-Pyrimidinyl-A'-acyl-1-fenylalanin podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 obecného vzorce I, kde

R₂ představuje vodík, Ci_₆alkyl, substituovaný C^alkyl, nebo aryl;

-69CZ 303435 B6

R₃ představuje vodík, C| «alkyl, substituovaný C_b «alkyl, nebo aryl; a R4 představuje vodík, C^alkyl, perfluorC]«alkyl, nebo aryl;

5 kde pojem „aryl“ znamená fenylskupinu nebo naftylskupinu.

5. 4-Pyrimidinyl-;V-acyl-l-fenvlalanin podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 obecného vzorce I, kde

10 R₂ představuje vodík, Ci^alky 1 nebo perftuorC]«alkyl;

R₃ představuje vodík, C_b «alkyl, substituovaný C_b«alkyl, nebo aryl; a

R4 představuje vodík, Q «alkyl, perfluorC] «alkyl, nebo aryl;

kde pojem „aryl“ znamená fenylskupinu nebo naftylskupinu.

6. 4-Pyrimidinyl-7V-acyl-l-fenylalanin podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 obecného vzorce I, kde R] představuje skupinu vzorce Y-l, kde každý z R₂₂ až R₂₃ nezávisle představuje Ci_« alkyl

20 nebo halogen; a R₂₄ představuje vodík.

7. 4-Pyrimidinyl-jV-acyl-l-fenylalanin podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 obecného vzorce I, kde R| představuje skupinu vzorce Y-l, kde každý z R₂₂ až R₂₃ nezávisle představuje vodík nebo halogen; a R₂₄ představuje Cj.«alkoxvskupinu.

8. 4-Pyrimidinyl-2V-acyl-l-fenylalanin podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 obecného vzorce I:

kde Rj má význam uvedený v nároku 1;

30 R₂ představuje Ci_«alkyl;

R₃ představuje C|_«alkyl;

R₄ představuje vodík, perťluorCi «alkyl nebo C]_«alkyl;

Rs představuje vodík nebo C]_«alkyl; a

R« představuje vodík, Cj «alkyl, C[ «alkyl karbony loxyC] «alkyl, nebo 40 R« představuje skupinu vzorce P-3 definovanou v nároku 1, nebo

R« představuje skupinu vzorce P-4 definovanou v nároku 1.

9. 4—Pyrimidinyl-Y-acyl—1 -fenylalanin podle nároku 8, obecného vzorce I, kde R] představuje 45 skupinu vzorce Y-l

-70CZ 303435 B6 kde každý z R₂₂ a R₂? nezávisle představuje perfluorC] _₆alkyl, C]_₆alkyl nebo halogen; a R₂4 představuje vodík.

5 10. 4—Pyrimidinyl-V-acvl-l-fenylalanin podle nároku 9, obecného vzorce I, kde každý z R₂ a

R₃ představuje C, ₆alkyl; R4 představuje vodík nebo C, ₆alkyk a R₅ a R^ jsou atomy vodíku.

11. 4-Pyrimidinyl-A-acyl-l-fenylalanin podle nároku 10, obecného vzorce I, kterým je

10 N-[(2,6-dichlorfenyl)karbonyl]-4-( 1,3,6-trimethy 1-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-feny]alanÍn;

A-[(2-brom—6—methyl ťenyl)karbonylJ~-4-(l ,3,6-trimethy 1-2,4-dioxo-5~pyrim id iny] )-L-fenylalanin;

A-[(2-chlor-6-methylfenyl)karbonyl]-4-(l,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalanin;

15 A'-[(2-ethyl-6-methyIfěnyl)karbonylJ^t-( 1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyI)-L-fenylalanin;

jV-[[2-(2-methy1ethyl)—6-methylfenyl]karbonyl]—4—(l,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrÍmídinyl)-L-fenylalanin;

TV—[(2,6—difluorfenyl)karbonyl]^-(l,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalanin;

20 7V-[[2-fluor—6-(trifluormethylfenyl)fenyl]karbonyl]-4-(l,3,6-trÍmethyl-2,4-dioxo-5pyrimídinyl)-L-fenylalanin;

,V-|[2,6—di(2-methylethyl)fenyl)karbonylj—4-( 1,3.6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-Lfenylalanin;

N-[(2-chlor-6-ethylfenyI)karbonyl]-4-(l,3,6-4rimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-’L-fenyl25 alanin;

N-[(2-chlor-6-propylfenyl)karbonyl]-4-(l,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-Lfenylalanin;

jV-[[2-chlor-6-(2-methy1ethyl)fenyl]karbonyl]-4-(l,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidÍnyl)—

L-fenylalanín;

30 N--[(2,6-dichlorfenyl)karbonyl ]—4—(1,3-diethyl-6-methyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-Lfenylalanin; nebo

A-[(2ehlor-6-methylfenyl)karbonyl]-4-(l,3-diethyl-6-methyl-2,4~dioxo-5-pyrimidinyl)-Lfenylalanin;

35 12. 4-Pyrimidinyl-/V-acyl-l-fenylalanin podle nároku 8, obecného vzorce I, kterým je

A' [(2—chlor- 6-methylťenyl)karbonylJ 4 -(1.3-dirnethy! 2.4-dioxo-5-pyrimidinyl)—L-fenylalanin;

A' [(2-brom 6-methylfenyl)karbonylJ -4 -(l .3-dirnethyl-2,4 dioxo-5-pyrimidinyl)—L-fenyl40 alanin; nebo

A'[(2-brom-5-methoxyfěnyl)karbonyl]-4--(1.3-dimethyl-2,4-dioxo—5-pyrimidÍnyl)—L-fenylalanin.

13. 4-Pyrimidinyl-A^r-acyl-l-fenylalanin podle nároku 9 obecného vzorce I, kde každý z R₂

45 a R3 představuje Cj ó^lkyl; R4 představuje vodík nebo Cj.^alkyl, a R₅ představuje vodík, a R.₆představuje

-71 CZ 303435 B6 vodík, Cj ₆alkylkarbonyloxyC] ₆alkyl, C| ₆alkyl; nebo Ró představuje skupinu vzorce P—3:

?32 fyCHátrg(P-3), kde R₃₂ představuje vodík nebo C^alkyl; R₃₃ představuje vodík, C^alkyl nebo aryl; R₃₄ představuje vodík nebo Cj.₆alkyl; h představuje celé číslo s hodnotou 0 až 2; g představuje celé číslo s hodnotou 0 až 2; součet čísel h a g má hodnotu 1 až 3; nebo Ró představuje skupinu vzorce P-4:

(P-4),

R₃₂, g, a h mají výše uvedený význam; Q' představuje O, S, ~(CH₂)j—, nebo skupinu vzorce N-R₃₅; kde R₃₅ představuje vodík;

přičemž pojem „aryl“ znamená fenylskupinu nebo naftylskupinu.

14. 4-Pyrimidinyl-TV-acyl-l-fenylalanin podle nároku 13 obecného vzorce I, kde Ró představuje C, ₆alkyl.

15. 4-Pyrimidiny1-?V-acyl-]-fenylalanin podle nároku 14 obecného vzorce I, kterým je ethylester ;V-[(2,6—dichlorfcnyl)karbonyl]-4( 1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-Lfenylalaninu;

ethylester A-[(2-chlor-6-methylfenyl)karbonyl]-4-( 1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)L-fenylalaninu; nebo ethylester A-[(2,6-difluorfényl)karbonyl]-4-( 1,3,6-trÍmethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-Lfenylalaninu.

16. 4-Pyrimidinyl-A^ř-acyl-l-fenylalanin podle nároku 13 obecného vzorce I, kde Ró představuje Ci_óalkylkarbonyloxyCi_óalkyl.

17. 4-Pyrimidinyl-/V-acyl-l-fenylalanin podle nároku 16, obecného vzorce I kterým je

1 -(acetoxy)ethylester A'-[(2,6—dichlorfenyl)karbonyl ]—4—(1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5pyrimidinylj-L-fenylalaninu;

1- (acetoxy)ethylester A'-[(2-chlor-6—methylfenyl)karbonyl j—4-(1,3,6-tri methy 1-2,4-dioxo-5pyrimidinylj-L-fenylalaninu nebo l-(acetoxy)ethylester A'-[(2,6difluorfenyl)karbonylH(l,3,6-trimethyl-2,4-dÍoxo-5-pyrimÍdinyl)-L-fenylalanÍnu.

18. 4- Pyrimidinyl-A'-acyT-1-fenylalanin podle nároku 13 obecného vzorce I, kde Ró představuje skupinu vzorce P-3, kde R₃₂ představuje vodík; každý z R₃₃ a R₃₄ představuje C[ ₆alkyl; h představuje číslo 1 a g představuje číslo 0,

19. 4 Pyrimidinyl-A'- acyl-] fenylalanin podle nároku 18 obecného vzorce I, kterým je

2— [ (Λ/ diethy I )am ino ]ethy lester A-|(2.6—dichlorfenyljkarbonyl]—4—(l,3.6-trirnethyl-2.4dioxo—5-pyrimidinyl)-L-fenylalaninu;

2-[(/V,A^ř-diethyl)amino]ethylester A-[(2—chlor-6—methy lťenyl)karbonyl ]—4—(1.3,6-tri methyl

2.4-dioxo- 5-pyrimidinyl)-L-fenylalaninu nebo

- 72CZ 303435 B6

2-[(YY-diethyl)amino]ethylester \-[(2,6—difluorfenyl)karbonyl]-4-(l,3,6-trimethyl-2.4-dioxo-5-py r i m i d i ny 1 )-L-feny la 1 an i n u.

20. 4-Pyrimidinyl .'V-acy 1-1-fenylalanin podle nároku 13 obecného vzorce I, kde představu5 je skupinu vzorce P-4, kde R₃₂ představuje vodík; h představuje číslo 1, g představuje číslo 0 a

Q' představuje O.

21. 4-Pyrimidinyl-N-acy 1-1 -fenylalanin podle nároku 20 obecného vzorce I, kterým je i o 2-(4-morfoI ino)ethy lester A-[(2,6—dichlorfeny l)karbony 1 ]—4—(1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5pyrimidinyl)-L-fenylalaninu nebo 2-(4-morfol i no)ethy lester A-[(2-chlor-6—methylfenyl)karbonyl]—4-(1,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-L-fenylalaninu.

22. 4-PyrÍmÍdinyl-'V-acyl-l-fenylalanin podle nároku 9 obecného vzorce I, kde každý z R₂ a

15 R₃ představuje Ci-ealkyl; R4 představuje perfluorCi_₆a1kyl, a R₅ a R₆ jsou atomy vodíku.

23. 4-Pyrimidinyl-A^í-acyl-l-fenylalanin podle nároku 22 obecného vzorce I, kterým je

7V-[l-(2,6-dichlorfenyl)karbonyl]-4-(l,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-6-(trifluormethyl)-520 pyrimidinyl)-L-fenylalanÍn;

Y-[(2-chlor-6-methylfenyl)karbonyl]-4-[l,3-dimethyl-2,4-dioxo-6-(trifluormethyl)-5pyrimidinyl)-L-fenylalanin; nebo

V-[[(2-fluor-6-(trifluonnethyl)fenyl]karbonyl]-4-(l,3-dimethyl-2,4-dioxo-6-(trÍfluormethyI)5-pyrimidinyl)-L-feny1alanin.

24. 4-Pyrimidinyl-V-acyl-l-fenylalanin podle nároku 9 obecného vzorce I, kde každý z R₂ a R₃ představuje C, ₆alkyl; R4 představuje vodík; R₅ představuje C^alkyl a R<, představuje vodík.

25. 4-Pyrimidinyl-V-acyll-fenylalanin podle nároku 8, obecného vzorce I, kterým je

A-[(2-chlor6methy Ifenyl )karbony l]-4-(l,3-dimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-3-methylL-fenyl alanin;

A^/-[(2,6-dichlorfenyl)karbonyl]-4-(l,3-dimethyl-2,4-dÍoxo-5-pyrimidmyl)-3-methyl-Lfenylalanin; nebo

35 A^r-[(2,6-dichlorfenyl)karbonyl]-4-(l,3,6-trimethyl-2,4-dioxo-5-pyrimidinyl)-3-methy]-Lfenylalanin.

26. 4-Pyrimidinyl-A'acyl-l-fenylalanin podle nároku 8 obecného vzorce I, kde každý z R₂a R₃ představuje C^alkyl: R4 představuje vodík; a R , a R₆ představují atomy vodíku.

27. 4-Pyrimidinyl-A-acyl-l-fenylalanin podle nároku 26 obecného vzorce I, kde R] představuje skupinu vzorce Y-l.

28. 4-Pyriinidinyl-A-aeyl- l -fenylalanin podle nároku 26 obecného vzorce I, kde R_t představu45 je skupinu vzorce Y-l, kde každý z R₂₂ a R₂₃ nezávisle představuje Ci^alkyl nebo halogen; a R₂₄ představuje vodík.

29. 4-Pyrimidinyl-.\-acyl-l -fenylalanin podle nároku 27 obecného vzorce I, kde Rj představuje skupinu vzorce Y-l, kde každý z R₂₂ a R₂₃ nezávisle představuje vodík nebo halogen; a R₂₄

50 představuje Ci-fjalkoxyskupinu.

30. 4-Pyrimidinyl-A-acyl-l-fenylalanin podle nároku 26 obecného vzorce I, kde R] představuje pěti- nebo šestičlenný heteroaromatický kruh připojený prostřednictvím atomu uhlíku ke karbonylovému zbytku amidoskupiny, přičemž výše uvedený kruh obsahuje jeden, dva nebo tři

-73 CZ 303435 B6 heteroatomy zvolené ze souboru sestávajícího z dusíku, kyslíku a síry a jeden nebo dva atomy tohoto kruhu jsou ne závisle substituovány substituentem zvoleným z C^alkylu, cykloalkylu, halogenu, kyanoskupiny, perfluoralkylu nebo arylu a alespoň jeden z takto substituovaných atomů přiléhá k atomu uhlíku připojenému ke karbonylovému zbytku amidoskupiny.

31. 4-Pyrimidinyl-TV-acyl-l-fenylalanin obecného vzorce II kde substítuenty R₂ až R₅ mají význam uvedený v nároku 1, Pi představuje Zerc-butoxykarbony 1skupinu Boc nebo benzyloxykarbonylskupinu a P₂ představuje C^alkyl nebo C^alkyl substituoio váný alespoň jednou skupinou nezávisle zvolenou z cykloalkylskupiny s 3- až 7-členným karbocyklickým kruhem, nitroskupiny, aryloxyskupiny, arylskupiny, hydroxyskupiny, halogenu, kyanoskupiny, Ci^alkoxyskupiny, C,^alkyl karbony Iskup iny, C i^alky Ithioskupiny, C|__óalkylsulfinylskupiny, Ci_6alkylsulfonylskupiny, aminoskupiny a mono- nebo di(Ci₆alkyl)aminoskupiny, přičemž pod pojmem „aryl“ se rozumí fenyl nebo naftyl.

32. 4-Pyrimidinyl-/V-acyl-l-fenylalanin podle kteréhokoliv z nároků 1 až 30 obecného vzorce I, pro použití jako léčivo.

33. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje 4-pyrimidinyl-Aacyl-l-fenylalanin podle kteréhokoliv z nároků 1 až 30 obecného vzorce I nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl a farmaceuticky přijatelný nosič.

25

34. 4-Pyrimidinyl-jV-acyl-l-fenylalanin podle kteréhokoliv z nároků 1 až 30 obecného vzorce I pro použití pří léčení chorobných stavů zprostředkovaných vazbou VCAM-1 nebo VLA—4 nebo VLA-4-exprimujících buněk, zejména pro léčení revmatoidní artritidy, roztroušené sklerózy, zánětlivého střevního onemocnění a astmatu.

30 35. Způsob výroby farmaceutické kompozice, vyznačující se tím, že se 4—pyrimídinyl-A-acyl-l-fenylalanin podle kteréhokoliv z nároků 1 až 30 obecného vzorce I nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl převede spolu s kompatibilním farmaceuticky přijatelným nosičem na galenickou formu.

35 36. Použití 4—pyrimidinyl—V-acyl-l-fenylalaninu podle kteréhokoliv z nároků 1 az 30 obecného vzorce I nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli pro výrobu léčiva pro léčení revmatoidní artritidy, roztroušené sklerózy, zánětlivého střevního onemocnění a astmatu.