CZ300929B6

CZ300929B6 - Sloucenina pro použití pri lécení nebo prevenci estrogenem stimulované rakoviny

Info

Publication number: CZ300929B6
Application number: CZ20000531A
Authority: CZ
Inventors: P. McDonnell@Donald; Norris@John; Connor@Caroline; Wijayaratne@Ashini
Original assignee: Duke University
Priority date: 1997-08-15
Filing date: 1998-08-14
Publication date: 2009-09-16
Also published as: EE200000077A; CN1275911A; NO20000752D0; EP1019057A1; NO20000752L; US20030232795A1; CZ2000531A3; JP2001515038A; PL338555A1; IL134445A0; HUP0002852A3; NZ502738A; CA2301032C; AU8906398A; ATE411016T1; CA2301032A1; BR9811946A; KR20010022956A; EP1019057B1; EP1019057A4

Abstract

Sloucenina obecného vzorce I, ve kterém: R.sup.1.n. je skupina -(CH.sub.2.n.).sub.n.n.CR.sup.5.n.=CR.sup.6.n.R.sup.7.n.; R.sup.2.n. a R.sup.3.n. jsou atomy vodíku, skupina -CH.sub.3.n., -OH, -OCH.sub.3.n., -OCH.sub.2.n.CH.sub.3.n. nebo -CH(CH.sub.3.n.).sub.2.n.; R.sup.4.n. je skupina -CN, -NO.sub.2.n., -CH.sub.3.n., -CH.sub.2.n.CH.sub.3.n., -CH.sub.2.n.CH.sub.2.n.-Y nebo -Y; R.sup.5.n. a R.sup.6.n. jsou atom vodíku, -C.sub.1-4.n.alkylová skupina, -C.sub.2-4.n.alkenylová skupina, -C.sub.2-4.n.alkinylová skupina, -X-C.sub.1-3.n.alkylová skupina, -X-C.sub.2-4.n.alkenylová skupina, -X-C.sub.2-4.n.alkinylová skupina nebo -Y; R.sup.7.n. je skupina -C(O)OR.sup.12.n.; R.sup.12.n. je atom vodíku; X je kyslík nebo síra; Y je halogen; a n je císlo vybrané ze skupiny zahrnující 0, 1 a 2; nebo farmaceuticky prijatelná sul této slouceniny pro použití pri lécení nebo prevenci estrogenem stimulované rakoviny, pricemž tento typ rakoviny je rezistentní vuci jinému modulátoru estrogenového receptoru než je uvedená sloucenina obecného vzorce I. Použití slouceniny podle vzorce I se týká zejména lécení rakoviny prsu, delohy, vajecníku nebo tlustého streva.

Description

Vynález se týká sloučeniny obecného vzorce I

ve kterém mají symboly R^!, R², R³ a R⁴ dále specifikovaný význam, pro použití při léčení nebo prevenci estrogenem stimulované rakoviny, přičemž tento typ rakoviny je rezistentní vůči jinému io modulátoru estrogenového receptoru než je tato sloučenina. Zejména se to týká použití uvedené sloučeniny pro léčení rakoviny prsu, rakoviny dělohy, rakoviny vaječníku nebo rakoviny tlustého střeva.

Dosavadní stav techniky

Lidský estrogenový receptor (estrogen receptor, ER) je členem nukleárně receptorově superrodiny transkripčních faktorů (Evans, Science 240: 889-895 (1998)). V nepřítomnosti hormonu sídlí v jádru cílových buněk v transkripčně neaktivním stavu. Při navázání na Iigand podléhá ER konformační změně iniciující kaskádu dějů, které nakonec vedou k její asociaci s specifickými regulačními oblastmi v cílových genech (O'Malley a koí, Hormone Research 47: 1-26 (1991)). Následný účinek na transkripci je ovlivněn buněčným a promotorovým kontextem receptoru vázaného na DNA (Tóra a kol., Cell 59: 477^87 (1989); Tasset a kol., Cell 62: 1177-1187 (1990); McDonnell a kol., Mol. Endocrinol. 9: 659669(1995); Tzukerman a kol., Mol.

Endocrinol. 8: 21-30 (1994)). Tímto způsobem vyvíjí fyziologický estradiol, ER agonista, svůj biologický účinek v reprodukčním, kosterním a kardiovaskulárním systému (Clark a Peck, Female Sex Sleroids: Receptors and Functions (eds) Monographs on Endocrinology, SpringerVerlag, New York 1979); Chow a kol., J. Clin. Invest. 89: 74-78 (1992; Eaker a koí, Circulation 88; 1999-2009 (1993)).

Kromě těchto aktivit bylo zjištěno, že estrogen funguje ve většině ER-pozitivních buněk rakoviny prsu jako mitogen. Proto se léčebné režimy zahrnující antiestrogeny, což jsou syntetické látky, které působí proti účinku estrogenů, ukázaly být klinicky účinnými při zastavení nebo zpomatení progrese tohoto onemocnění (Jordán and Murphy, Endocrine Reviews 11: 578-610 (1990);

Parker, Breast Cancer Res. Treat. 26: 131-137 (1993)). Dostupnost těchto syntetických ERmodulátorů a následná disekce mechanismu jejich účinku poskytla užitečné informace o účinku ER.

Jednou z nejvíce zkoumaných látek v tomto smyslu je tamoxifen (Jordán a Murphy, Endocrine

Reviews 11: 578-610 (1990)). Tato látka působí ve většině ER-pozitivních nádorů prsu jako antagonista, vykazuje však paradoxně agonistickou aktivitu v kostech a v kardiovaskulárním systému a částečnou agonistickou aktivitu v děloze (Kedar a kol., Lancet 343: 1 318-1321 (1994); Love a kol., New Engl. J. Med. 326: 852-856 (1992); Love a kol., Ann Intern. Med. 115: 860-864 (1991)). Proto je účinek komplexu ER-tamoxifen jako agonisty/antagonisty ovlivněn tím, v jakých buňkách se nachází. Toto důležité zjištění je zjevným popřením dlouhodobých

- I GL· JWM? bO modelů, podle nichž ER existuje pouze v buňkách v aktivním nebo neaktivním stavu (Clark and Peck, Female Sex Steroids: Receptors and Functions (eds) Monographs on Endocrinology, Springer-Verlag, New York (1979)). Místo toho se ukazuje, že různé ligandy, působící přes stejný receptor, mohou vykazovat v různých buňkách různé biologické účinky. Definice mecha5 ni srnu této selektivity nejspíše posune vpřed poznání procesů, jako je rezistence vůči tamoxifenu, kterou lze pozorovat ve většině případů rakoviny prsu s přítomností ER, kdy nastávají abnormality ER-signalizace (Tonetti a Jordán, Anti-Cancer Drugs 6; 498-507 (1995)).

Při použití přístupu in vitro byl stanoven pravděpodobný mechanismus buněčně selektivního io agonistického/antagonistického účinku tamoxifenu (Tóra a kol., Cell 59; 477-487 (1989); Tasset a kol., Cell 62: 1 177-1 187 (1990) McDonnell a kol., Mot Endocrinol. 9: 659-669 (1995);

Tzukerman a kol.. Mol. Endocrinol. 8: 21-30 (1994)). Důležitá je skutečnost, že bylo prokázáno, že tamoxifen indukuje konformační změnu uvnitř ER, která se liší od změny indukované estradiolem (McDonnell a kol., Mol, Endocrinol. 9: 659-669 (1995); Beekman a kol., Mol.

Endocrinology 7: 1 266-1 274 (1993)). Navíc stanovení sekvencí uvnitř ER potřebných pro transkripční aktivitu ukazuje, jak jsou tyto specifické komplexy ligand-receptor diferenciálně rozpoznávány buněčným transkripčním aparátem. Konkrétně bylo prokázáno, že ER obsahuje dvě aktivační domény, AF-1 (Activation Function-1) a AF-2, které umožňují její interakci s transkripčním aparátem. Relativní příspěvek těchto AF k celkové účinnosti ER se liší od jedné buňky k druhé (Tóra a kol., Cell 59: 477-487 (1989); McDonnell a kol., Mol. Endocrinol. 8: 659-669 (1995); Tzukerman a kol., Mol. Endocrinol. 8: 21-30 (1994). Dále bylo zjištěno, že estradiol funguje jako agonista jak AF-1, tak i AF-2 v tom smyslu, že vykazoval maximální aktivitu bez ohledu na to, která AF byla v daném buněčném prostředí dominantní. Na druhé straně tamoxifen funguje jako antagonista AF-2, inhibující aktivitu ER v buňkách, kde je AF-2 nutná neboje dominantním aktivátorem (Tóra a kol., Cell 59; 477-487 (1989; McDonnell a kol., Mol. Endocrinol. 9; 659-669 (1995); Tzukerman et al, Mol. Endocrinol. 8: 21-30 (1994)). Naopak tamoxifen funguje jako agonista v případech, kdy je potřebný samotný AF-1 (McDonnell a kol., Mol. Endocrinol. 9: 659-669 (1995); Tzukerman a kol., Mol. Endocrinol, 8; 21-30 (1994)). Následně byly na podkladě relativní aktivity AF-1/AF-2 definovány čtyři mechanisticky odlišné skupiny modulátorů ER; úplní agonisté (tedy estradiol), dvě různé skupiny částečných agonistů, zastupované tamoxifenem a raloxifenem, a čistí antagonisté, jejichž představitelem je ICI182, 780 (McDonnell a kol,, Mol, Endocrinol. 9: 659-669 (1995); Tzukerman a kol., Mol. Endocrinol. 8: 21-30 (1994)). Tyto výsledky nabízejí mechanistické vysvětlení pozorovaných rozdílů v biologických účincích některých modulátorů ER a ukazují, že mechanismus, jímž ER působí v růz35 ných tkáních, není stejný. Zajímavé je zjištění, že agonistická aktivita, kterou vykazují modulátory ER jako estrogen a tamoxifen v těchto in vitro systémech, odráží jejich aktivitu v reprodukčních orgánech celých živočichů. Tato korelace však neplatí pro kosti, kde estradiol, tamoxifen a raloxifen, které vykazují různé stupně agonistické aktivity vůči AF-1/AF-2, účinně chrání proti úbytku kostní hmoty v krysím modelu ovariektomie. Zdá se tedy, že s výjimkou steroidních čis40 tých antíestrogenů (tedy ICI182, 780) chrání všechny známé skupiny modulátorů ER proti úbytku kostní hmoty u lidí a příslušných zvířecích modelů, zatímco vykazují různé stupně estrogenové aktivity v jiných tkáních (Chowa kol., J. Clin. Invest. 89: 74-78 (1992); Love a kot, New Engt J. Med. 326: 852-856 (1992); Draper a kot, Biochemical Markers of Bone and Lipid Metabolism in Healthy Postmenopausal Women. In; C. Christiansen a B. Biis (eds) Proceedings

1993. Fourth International Symposium on Osteoporosis and Consensus Development

Conference, Handelstrykkeriet, Aalborg; Wagner a kot, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93: 8 7398 744 (1996); Black a kot, J. Clin. Invest. 93: 63-69 (1994)).

-2Podstata předmětného vynálezu

Podstatu předmětného vynálezu představuje sloučenina obecného vzorce 1

ve kterém:

R' je skupina -(CH₂)„CR⁵=CR⁶R⁷;

R² a R³ jsou navzájem na sobě nezávisle atom vodíku, skupina -CH3, -OH, -OCH3, -OCH₂CH, nebo -CH(CH₃)₂;

R⁴ je skupina -CN, -NO₂, -CH,, -CH₂CH₃, -CH₂CH₂-Y nebo -Y;

R⁵ a R⁶ jsou navzájem na sobě nezávisle atom vodíku, -C^alkylová skupina, -C^alkenylová skupina, -C₂_4alkinylová skupina, -X-C|_₃alkylová skupina, -X-CX^alkenylová skupina, -X-C?^alkinylová skupina nebo -Y;

R⁷ je skupina-C(O)OR¹²;

R¹² je atom vodíku;

X je kyslík nebo síra;

Y je halogen; a n je číslo vybrané ze skupiny zahrnující 0, 1 a 2;

nebo farmaceuticky přijatelná sůl této sloučeniny pro použití při léčení nebo prevenci estrogenem stimulované rakoviny, přičemž tento typ rakoviny je rezistentní vůči jinému modulátoru estroge30 nového receptoru než je uvedená sloučenina obecného vzorce I.

Výhodné provedení zahrnuje sloučeninu výše definovaného obecného vzorce I pro použití při léčení nebo prevenci estrogenem stimulované rakoviny, kde uvedenou rakovinou je rakovina prsu, rakovina dělohy, rakovina vaječníku nebo rakovina tlustého střeva.

Další výhodné provedení zahrnuje sloučeninu výše definovaného obecného vzorce I pro použití pri léčení nebo prevenci estrogenem stimulované rakoviny, kde uvedenou rakovinou je rakovina prsu.

Další výhodné provedení zahrnuje sloučeninu výše definovaného obecného vzorce I pro použití při léčení nebo prevenci estrogenem stimulované rakoviny, kde uvedená rakovina je rezistentní na tamoxifen, idoxífen, raloxifen nebo sloučeninu 182 780, což je

Další výhodné provedení zahrnuje sloučeninu výše definovaného obecného vzorce I pro použití při léčení nebo prevenci estrogenem stimulované rakoviny, kde uvedená rakovina de novo rezistentní vůči modulátoru estrogenového receptorů.

Další výhodné provedení zahrnuje sloučeninu výše definovaného obecného vzorce 1 pro použití při léčení nebo prevenci estrogenem stimulované rakoviny, kde výše uvedená rezistence vůči uvedenému modulátoru estrogenového receptorů je získanou rezistencí.

ío Další výhodné provedení zahrnuje sloučeninu určenou k použití v kombinaci s jedním nebo více antiestrogeny, ligandem retinové kyseliny nebo retinoxickým X receptorem, antiprogestinem, antiandrogenem, vitaminem D nebojeho metabolitem, inhibitorem famesyltransferázy, peroxisomovým proliferátorem aktivovaným receptorem a (PPARa) nebo gama agonistem a inhibitorem mitogenem-aktivované proteinkinázy (MAP).

Další výhodné provedení zahrnuje sloučeninu výše definovaného obecného vzorce I pro použití při léčení nebo prevenci estrogenem stimulované rakoviny, přičemž touto sloučeninou je

Předmětný vynález je založen na identifikaci ER modulátorů, které se mechanisticky liší od modulátorů, jako je tamoxifen. Tyto modulátory mají využití v léčbě řady estrogen-dependentních onemocnění a poruch, včetně rakoviny prsu. Tyto modulátory jsou obzvláště důležité při léčbě forem rakoviny prsu, které jsou de novo rezistentní vůči tamoxifenu nebo u nichž došlo při léčbě k rozvoji rezistence.

Cíle a přednosti vynálezu jasně vyplynou z následujícího popisu.

Předmětný vynález se týká selektivních modulátorů estrogenových receptorů, které projevují tkáňově specifickou ER agonistickou aktivitu. Tyto modulátory podle vynálezu působí jako agonisté v kostech a v kardiovaskulárním systému, ne však v děloze. Tyto modulátory se mechanisticky liší například od tamoxifenu a jsou užitečné při léčbě nádorů, jako na nádoru prsu, zvláště ER pozitivních nádorů prsu, charakterizovaných de novo nebo získanou rezistencí vůči různým modulátorům estrogenových receptorů včetně tamoxifenu. Popisované modulátory se mechanisticky liší i od raloxifenu, droloxifenu, ídoxifenu a ICI 182 780.

Výhodnými modulátory podle předmětného vynálezu jsou deriváty trifenylethylénu, podle ještě výhodnějšího provedení sloučeniny obecného vzorce I definované v patentu Spojených států amerických US 5 681 835, přičemž sloučenina GW5638 ajejich deriváty, jako je například slou-4cenina GW7604, které patří mezi nej výhodnější. Tyto sloučeniny lze připravit postupem uvedeným v patentu Spojených států amerických US 5 681 835 a postupem podle autorů Wilsona a kol. (J. Med. Chem. 37: l 550 (1994)). Tyto modulátory mohou tvořit farmaceuticky přijatelné soli s kationty včetně alkalických kovů jako je sodík a draslík, nebo kationty s kovy alkalických zemin jako je vápník nebo hořčík.

Uvedených modulátorů podle předmětného vynálezu lze použít při léčbě a/nebo prevenci řady poruch nebo onemocnění, jako jsou estrogenem stimulované typy rakoviny, včetně rakoviny dělohy, rakoviny vaječníků, rakoviny tlustého střeva a rakoviny prsu, kardiovaskulárních oneío mocnění (u mužů i žen), osteoporózy a artritid. Mezi další poruchy a onemocnění, na které je možno použít modulátory podle předmětného vynálezu (jak k léčbě, tak i k prevenci), patří rakovina prostaty, neplodnost (například jako induktory ovulace), vazomotorické symptomy souvisejících s menopauzou (například „návaly horka“), vaginitida, benigní proliferativní poruchy včetně endometriózy a děložních fibrinoidů, diabetů typu II, degenerace macula densa, inkontinence močí a Alzheimerovy choroby (kognitivní funkce). Dále lze popisovaných látek použít jako kontraceptiv u žen.

Jak vyplyne jasně z následujících příkladů, jsou sloučenina GW5638 a její deriváty mechanisticky jedinečné modulátory. Očekává se, že tyto látky předčí například tamoxifen jako látku první volby a jako chemopreventivní látku u estrogenem stimulovaných typů rakoviny, zvláště rakoviny prsu, protože nevykazují uterotrofní aktivitu. Tyto látky nemají klasické účinky na ER a proto se předpokládá, že nepovedou k indukci rezistence stejného stupně jako v současnosti používané látky. Dále lze těchto látek použít k léčbě pacientů, kteří nedostatečně reagují na jiné modulátory estrogenových receptorů včetně tamoxifenu, idoxifenu, raloxifenu a 1CI 182, 780 jakož i k léčbě pacientů, kteří zpočátku na tyto modulátory reagují dobře, ale následně u nich modulátory přestávají účinkovat. Vzhledem k mechanistické jedinečnosti popisovaných látek lze očekávat, že jejich použití nepovede k nežádoucím účinkům, jako je trombóza hlubokých žil.

Vzhledem k jedinečnému mechanismu účinku popisovaných modulátorů je možno jich použít i jako složek terapeutického „koktailu“, zvláště při léčbě rakoviny prsu. V tomto ohledu lze popisovaných modulátorů použít v kombinaci s jiným antiestrogenem, ligandem kyseliny retinové nebo retinoxíckého receptoru X, s antiprogestinem jako je RU486, s antiandrogenem, jako je casdex nebo flutamid, vitamin D (nebo jeho metabolitem), s inhibitorem famesyl transferázy, PPAR (peroxisomový proliferátor aktivovaný receptorem) nebo gama agonistou nebo inhibito35 rem MAP kinázy (mitogenem aktivovaná proteinkináza).

Jak bylo uvedeno výše, zahrnuje vynález použití popisovaných modulátorů v profylaxi, jakož i v léčbě prokázaných onemocnění nebo symptomů. Množství modulátoru potřebné k použití se bude lišit podle stavu (onemocnění/porucha) a věku a stavu pacienta, a nakonec bude záviset na ošetřujícím lékaři (nebo veterináři v případě veterinárního použití). Všeobecně je ale možno uvést, že se dávky používané při léčbě dospělých osob budou běžně pohybovat v rozmezí 0,001 mg/kg až 100 mg/kg denně. Požadovanou dávku lze výhodně podat jako jedinou dávku nebo jako dílčí dávku aplikovanou v příslušném odstupu, například jako dvě, tři, čtyři nebo více menších dávek denně.

Uvedených sloučenin je možno rovněž použít pro formulování farmaceutického prostředku obsahujícího výše popsaný modulátor nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl spolu s jedním nebo více farmaceuticky přijatelnými nosičovými látkami a případně dalšími terapeutickými a/nebo profylaktickými přísadami včetně těch, které jsou uvedeny výše.

Lékové formy výše definované sloučeniny podle předmětného vynálezu lze aplikovat standardně pro léčbu uvedených onemocnění/poruch, jako například perorálně, parenterálně, sublinguálně, transdermálnč, rektálně, inhalačně nebo bukálně. Při bukálním podání může mít přípravek formu (například jednotkovou dávkovači formu) tablety nebo pastilky připravené klasickým způsobem.

Například tablety a kapsle pro perorální aplikaci mohou obsahovat klasické pomocné látky jako

-5juuxfiy do jsou pojivové látky, plnidla, lubrí kanty, dezintegrační látky a zvlhčovadla. Tablety mohou být potahované s použitím metod dobře známých v dané oblasti techniky.

V alternativním provedení mohou být modulátory podle předmětného případně součástí perorálně 5 podávaných tekutých přípravků jako jsou vodné nebo olejové suspenze, roztoky, emulze, sirupy nebo elixíry. Kromě toho mohou být prostředky v suché formě, přičemž obsahují modulátory k rozpuštění vodou nebo jiným vhodným vehikulem před použitím. Tyto tekuté přípravky mohou obsahovat další přísady jako jsou suspendační látky, emulzifikační činidla, konzervační látky a nevodná vehikula. io

Tyto prostředky mohou být formulovány rovněž jako čípky obsahující například klasické čtpkové báze jako je kokosové máslo nebo jiné glyceridy. Inhalační přípravky lze typicky dodávat ve formě roztoků, suspenzí nebo emulzí, které lze aplikovat jako suchý prášek nebo ve formě aerosolu pomocí klasického pohonného média jako je dichlordifluormethan nebo trichlorfluormethan.

Typické transdermální přípravky obsahují klasické vodné nebo nevodné vehikulum, jako jsou krémy, masti, lotiony nebo pasty nebojsou ve formě různých typů sádrových obvazů, náplastí nebo membrán pro aplikaci léčiv.

Navíc lze tyto prostředky formulovat pro parenterální podání injekcí nebo kontinuální infúzí.

Injekční přípravky mohou mít formu suspenzí, roztoků nebo emulzí v olejovém nebo vodném vehikulu, přičemž mohou obsahovat pomocné látky jako jsou suspenzní, stabilizační a/nebo disperzní látky. V alternativním provedení může být účinná látka případně ve formě prášku k rozpuštění vhodným vehikulem (například sterilní, nepyrogenní voda) před použitím.

Tyto prostředky lze upravit i pro tzv. depotní aplikaci. Tyto přípravky s dlouhodobým účinkem lze aplikovat implantací (například subkutánně nebo intramuskulámě) nebo intramuskulámí injekcí. Pro tyto formy použití lze modulátory vynálezu připravit s vhodnými poiymemími nebo hydrofobními materiály (například jako emulze v přijatelném typu oleje), s iontovýměnnými pryskyřicemi nebo s částečně rozpustnými deriváty nebo například jako částečně rozpustná sůl.

Zjištění, ze sloučeniny GW5638 a GW7604 (viz výše uvedený patent USA) jsou látky bez klasické agonistické aktivity ukazuje, že látky, které „aktivují“ ER (to znamená látky, které způsobují uvolňování ER z proteinů tepelného šoku („heat shock proteins“) a které také nevedou k degradaci ER, lze použít pri léčbě osteoporózy. Objevení neschopnosti oddělit osteoporotické a kardioprotektivní účinky sloučenin GW5638 a GW7604 ukazuje, že libovolná látka, která váže ER a má jeden z uvedených typů účinků (osteoporotický nebo kardioprotektivní) má rovněž i druhý uvedený účinek.

Přehled obrázků na výkresech

Předmětný vynálezu bude v dalším podrobněji vysvětlen s pomocí přiložených obrázků.

Obrázky IA a 1B. GW5638 se mechanisticky liší od známých skupin modulátorů ER. Lidský promotor C3 (-1 803 až +58) úzovaný s reportérovým genem luciferázy ze světlušek byl transfekován společně s expresním plasmidem obsahujícím lidský estrogenový receptor divokého typu (ERwt) (obr. IA) nebo mutovaný ER ve kterém funkce AF-2 byla porušena (ER-TAF1) do HepG2 buněk (obr. 1B) a pak byly buňky testovány na transkripční aktivaci a přítomnost vzrůstajících koncentrací ER-modulátoru, jako je naznačeno.

Transfekce byly normalizovány na účinnost a počet buněk kotransfekcí expresního plasmidu obsahujícího β-galaktosidázu, Normalizovaná odpověď byla získána vydělením světelných jednotek aktivitou β-galaktosidázy, naměřenou pri enzymatickým testem. Transfekce byla provedena třikrát. Uvedená data jsou reprezentativní pro opakované experimenty, provedené za podob55 ných podmínek.

-6Obr. 2A-2C. Sloučeniny GW5638 a GW7604 působí proti agonistické aktivitě estradiolu, částečné agonistické aktivitě tamoxifenu a inverzní agonistické aktivitě ICI 182, 780. Obr. 2A. Schopnost sloučenin GW5638 nebo GW7604 inhibovat agonistickou aktivitu 10'⁸ M 17-p-estradiolu nebo částečnou agonistickou aktivitu vykazovanou ΙΟ”⁸ M tamoxifenu byla hodnocena v buňkách HepG2 transfekovaných ERwt. Obr. 2B. Schopnost sloučenin GW5638 nebo GW7604 inhibovat agonistickou aktivitu 10⁸ M Π-β-estradiolu nebo částečnou agonistickou aktivitu vykazovanou 10’⁸M tamoxifenu byla hodnocena v buňkách HepG2 transfekovaných ER-TAFI (McDonnell a kok, Mok Endocrinol. 9: 659-669 (1995)}. Obr. 2C. Jak sloučenina GW5638, tak sloučenina io GW7604 dokáží inhibovat inverzní ER agonistickou aktivitu ICH82,780 (ICI) projevující se na promotéru C3 při vyšetření v buňkách HepG2 při uvedených koncentracích. Transfekce byly normalizovány na účinnost a počet buněk kotransfekcí expresního plasmidů obsahujícího βgalaktosidázu. Normalizovaná odpověď byla získána vydělením světelných jednotek aktivitou βgalaktosidázy, naměřenou při enzymatickém testu. Byly provedeny reprezentativní testy, při nichž byla transfekce opakována třikrát. Sloupcové grafy pro chyby reprezentují standardní odchylku (chybu) od průměrné hodnoty (SEM).

Obrázky 3A a 3B, Sloučenina GW5638 chrání před úbytkem kostní hmoty u krys po ovariektomii (OVX). Účinek sloučeniny GW5638 na hustotu kostních minerálů (bone minerál density,

BMD) v lumbální části páteře (L1-L4) byl měřen pomocí rentgenové absorbciometrie s dvojí energií („dualenergy x-ray absorbtiometry“, DEXA), Význam rozdílu v BMD mezi krysami po OVX a s aplikací látky byl stanoven s pomocí Dunnetova testu (*p < 0,005). Je uvedeno rozmezí hustot kostních minerálů pozorované u zvířat s napodobenou operací („sham-operated“) (šrafovaný sloupec) a OVX (bílý sloupec). Obr. 3B, Účinek GW5638 na BMD v proximální metafyze tibie v krys po OVX byla měřen kvantitativní počítačovou tomografií („quantitative computerized tomography“, QCT). Význam rozdílu v BMD mezi krysami po OVX a s aplikací látky (označeno hvězdičkami) byl stanoven s pomocí Turkey-Kramerova testu (p < 0,05).

Obrázek 4. Sloučenina GW5638 suprimuje ovariektomií indukované zvýšení cholesterolu v séru.

Měření hladin cholesterolu v séru se provádělo s použitím krve odebrané skupině 90 dní starých krys po OVX, jimž byla aplikován buď estradiol nebo GW5638, jak uvedeno. Každý bod představuje průměrnou hodnotu cholesterolu v séru (±SEM) u kontrolních subjektů po OVX (n ~ 7), krys s aplikací estradiolu (n = 7) a GW5638 (n = 7), jak uvedeno. Hvězdičky označují skupiny, u nichž byl zjištěn statisticky významný rozdíl vůči kontrolním subjektům po OVX. Je uvedeno rozmezí sérového cholesterolu u zvířat po OVX (bílý sloupec).

Obrázek 5. Sloučenina GW5638 nevykazuje agonistickou aktivitu v děloze nedospělých krys. Skupinám 21 dní starých krys bylo perorálně aplikováno samotné vehikulum, sloučenina GW5638 nebo tamoxifen jako jediná látka nebo sloučenina GW5638 nebo tamoxifen v přítom40 nosti estradiolu. Uvedená data představují průměrné hodnoty (± SEM). Jsou uvedeny hodnoty naměřené u zvířat s aplikací estradiolu (šrafovaný sloupec) a u zvířat s napodobenou operací (bílý sloupec),

Obrázek 6. Účinek sloučeniny GW5638 na vlhkou hmotnost dělohy u krys po OVX. Skupinám

90 dní starých krys s napodobenou operací nebo krys po OVX bylo po dobu 28 dní aplikováno samotné vehikulum, estradiol nebo sloučenina GW5638. Uvedené výsledky představují vlhkou hmotnost dělohy (± SEM) u 7 krys v každé skupině. Jsou uvedeny hodnoty naměřené u zvířat s napodobenou operací (bílý sloupec) a u zvířat s aplikací estradiolu (šrafovaný sloupec).

Obrázky 7A-7F. Účinek sloučeniny GWS638 na histologické vyšetření dělohy u krys po OVX. Srovnávací histologické vyšetření (malé zvětšení) děloh 90 dní starých krys, u nichž byla provedena buď (obr, 7A) napodobená operace (obr. 7B) OVX, (obr. 7C), OVX s aplikací estradiolu, nebo OVX plus aplikace (obr. 7D) 1 pg/kg, (obr. 7D), 3 pg/kg nebo (obr. 7F) 10 pg/kg sloučeniny GWS638.

-7Obrázky 8A-8D. Účinek sloučeniny GWS638 na histologické vyšetření dělohy u krys po OVX. Srovnávací histologické vyšetření děloh 90 dní starých krys, u nichž byla provedena buď (obr. 8A) napodobená operace, (obr. 8B) OVX, (obr. 8C) OVX s aplikací estradiolu, nebo OVX plus aplikace 10 pg/kg sloučeniny GWS638 (obr. 8D).

Fotografie byly pořízení při 150-násobném zvětšení a následně zvětšeny na konečné 600-násobné zvětšení.

Obrázek 9. Účinek aplikace antiestrogenu na nádory rakoviny prsu MCF-7 u holých myší. Den io 0 označuje první den léčby, 2 týdny po inokulaci nádorů statistická analýza ukázala, že každá skupina léčby vykazuje významný účinek ve srovnání s kontrolními zvířaty (ANOVA, p < 0,5) a nebyl zjištěn žádný významný rozdíl mezi dvěma nej vyššími dávkami GWS638 a tamoxifenu.

Obrázek 10. Vyšetření odpovědi nadávku.

Obrázek 11. Vyšetření LCC2.

Obrázek 12. Sloučenina GW7604 působí jako antiestrogen v buňkách rakoviny prsu MCF-7,

Obrázky 13A a 13B: Analýza účinku specifických mutací ER na farmakologii antiestrogenu ukazuje dodatečnou mechanistickou komplexnost. Obr. 13A. ERwt, Obr. 13B. ER-TAF1.

Obrázky 14A a 14B: Srovnávací analýza schopnosti řady antiestrogenů inhibovat transkripční aktivitu ER(obr. 14A)aER(obr. 14B),

Obrázky 15A-15C: Analýza typu „western immunoblot“ exprese ER v cílových buňkách po aplikaci agonistu nebo antagonistů. Obr. 15A. Buňky MCF-7. Obr. 15B. Ishíkawovy buňky. Obr, 15C. Ishíkawovy buňky transfekované pRST7ER.

Obrázky 16A a 16B: Analýza typu „western immunoblot“ exprese endogenního ER v buňkách MCF-7 po krátkodobé aplikaci (obr, 16A jednohodinové a obr. 16B sedmihodinové) agonistů nebo antagonistů.

Obrázky 17A a 17B: Analýza typu „western immunoblot“ exprese endogenního ER v Ishika35 wových buňkách po krátkodobé aplikaci (obr. 17A jednohodinové a obr. 17B sedmihodinové) agonistů nebo antagonistů.

Obrázky 18A— 18C: Analýza typu „western immunoblot“ exprese endogenního ER v celých buňkách (obr. 18A), jádrech (obr. 18B) a cytoplazmě (obr. 18C) v Ishikawových buňkách po krátko40 dobé aplikaci agonistů nebo antagonistů.

Obrázky 19A-19C: Účinek E2 stimulované proliferace buněk MCF-7. Obr. 19A sloučenina ICI182, 780, Obr, 19B sloučenina GW7604. Obr. 19C 4-OH tamoxifen.

Příklady provedení vynálezu

Některé aspekty předloženého vynálezu budou popsány podrobněji v následujících konkrétních příkladech, které jsou ovšem pouze ilustrativní a nijak neomezují rozsah předmětného vynálezu. Následující konkrétní příklady uvádějí podrobnosti prováděných experimentů spolu s odkazem.

-8Biochemické aspekty

DNK a modifikační enzymy byly získány od Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN, USA), New England Biolabs (Beverly, MA, USA) nebo Promega Corp. (Madison, VI, USA). Běžná laboratorní reagencia a 17β-estradiol (E₂) byly získány od společnosti Sigma (St. Louis, MO, USA). 10182,780 byl darem společnosti Zeneca Pharmaceutica, Macclesfield, Velká Británie. Raloxifen darovala společnost Pfizer Pharmaceuticals, Groton, CT, USA. 4-OH tamoxifen byl darem společnosti Ligand Pharmaceuticals (San Diego, CA, USA). GW5638 a GW7604 byly připraveny podle výše uvedeného popisu (Wllson a kol·, J. Med. Chem. 37; 1 550-1 552 (1994)).

ío Protilátku H222 lze získat od společnosti Abbott Laboratories.

Buněčné kultury a kotransfekční testy

Buňky HepG2 byly uchovávány v médiu MEM (Modified Eagles Medium) (Life Technologies,

Grand Island, NY, USA) s plus 10% ferálního kravského séra (FCS) (Life Technologies). Buňky byly umístěny na desky s 24 jamkami (potaženými želatinou) 24 hodin před transfekci. DNK byla do buněk aplikována pomocí Lipofectinu (Life Technologies). Stručně uvedeno, transfekce byla provedena třikrát s použitím 3 pg celkové DNK. Pro standardní transfekci bylo u každého triplikátu použito 500 ng pCMV-beta-Gal (normalizační vektor), 1500 ng reportéru (různý) a 1000 ng receptoru (pRST-hER (Dana a kol., Mol. Endocrinol. 8: 1193-1207 (1994)). Inkubace buněk Lipofectinem probíhala po dobu 3 hodin, potom bylo médium odstraněno, buňky byly omyty PBS a následně indukovány příslušným hormonem rozpuštěným v médiu prostým fenolové červeně obsahujícím 10% CS stripovaným aktivním uhlím (Cyclone lne.). Inkubace hormonem pokračovala po dobu 48 hodin, poté se provedla lýza buněk a jejich vyšetření na aktivitu luciferázy a β-galaktosidázy, jak bylo popsáno výše (Norris a kol·, JBC 270; 22 777-22 782 (1995)).

Vyšetření uterotrofie u nedospělých krys.

Dvacetjedna dní staré samičky krys linie Sprague-Dawley (30 až 35 gramů) byly získány od společnosti Harlan nebo Taconic Laboratories. Zvířata byla náhodně zařazena do léčebných skupin po pěti kusech a u každé léčebné skupiny byla zaznamenána průměrná hmotnost. Hmotnost byla zaznamenávána každý den léčby. GW5638 nebo tamoxifen byly připraveny ve 100% ETOH jako zásobní roztok lOx a uchovávány při teplotě ~70°C až do dne podání dávky. V den podání dávky byla látka zředěna v 0,5% roztoku methy leelulózy, viskozita 2% při 25 ^ŮC: 400 centipoise (Sigma, St. Louis, MO, USA)). Perorální podávání vyživovací sondou (gaváž) vycházelo z celkového objemu 10 ml/kg tělesné hmotnosti. Estradiol (Sigma, St. Louis, MO, USA) byl připraven v sezamovém oleji, smíšen ve skleněném homogenizátoru (buď rozpuštěný, nebo ve formě suspenze), přičemž byl odebrán alikvotní podíl a zmrazen na -70°C až do aplikace dávky.

Při subkutánní aplikaci se vycházelo z celkového objemu 2 ml/kg tělesné hmotnosti. Zvířata byla vyživována (GW5638) nebojím byla látka aplikována injekěně (estradiol) po dobu 3 dnů. Čtvrtý den byla zvířata usmrcena udušením CO₂, byla změřena jejich tělesná hmotnost a byla jim odebrána děloha, odstraněna krev a zvážena. Data jsou uvedena jako hmotnost dělohy/tělesná hmotnost.

Vyšetření hustoty kostních minerálů

Příprava zvířat. Krysy Sprague-Dawley, 90 dní staré, byly anestetizovány izofluranem (4% při indukci, 2% při udržování anestézie), byla provedena ovariektomie (OVX) nebo napodobená so operace (sham operation, SO) a zvířata byla náhodně zařazena do skupin (n = 7), u nichž se od prvního do 28. dne po operaci prováděla perorální výživa sondou (gaváž) samotným vehikulem, estradiolem, nebo GW5638 v 0,5% methylcelulóze. Zahubení se provádělo eutanázií s použitím

CO₂, přičemž byla zaznamenána tělesná hmotnost a děloha byla vyjmuta a zvážena. Děloha, vagína a tkáň mléčných žláz byly fixovány v 10% neutrálním pufrovaném formalinu. Vzorky pro histologické zpracování byly odebrány z prostředí části každého rohu dělohy. Vzorky tkáně byly

-9c/. juuvzv ho fixovány v parafinu, obarveny hematoxylinem a eosinem a vyšetřeny pod mikroskopem. Byla provedena excize lumbálních obratlů a levé i pravé tibie. Byl změřen celkový cholesterol v krví (Roche Biomedical Laboratories).

Rentgenová absorpcíometrie s dvojí energií (duál energy X-ray absorptiometry, DEXA).

K analýze pomocí DEXA byl použit kostní denzitomer Hologic QDR-2000 spolu s regionálním softwarovým vybavením s vysokým rozlišením. „Default“ skanová délka, šířka obrázku, odstupy linek a bodová rozlišitelnost byly nastaveny na 2; 0,75; 00,01 a 0,005 palců (v pořadí, jak uvedeio no). Denzítormetr byl denně kalibrován pomocí hydroxyapatitové platformy. Excidované tibie byly umístěny ve vodní lázni o hloubce 1 cm, přičemž tibie a fibula byly uloženy horizontálně.

Pro in vivo snímky byly krysy anestetizovány izofluranem a položeny tak, aby páter vedla souběžně s dlouhou osou stolu pro denzitometrii. Vyšetřovaná noha byla páskou fixována do polohy souběžně s dlouhou osou stolu a tibie byla vyšetřena v místě spojení s femurem. Oblast zájmu (region of interest, ROI) byla analyzována s použitím subregionálního software se zaměřením na mm širokou zónu počínaje 3 mm distálně od růstové desky.

Periferní kvantitativní počítačová tomografie (peripheral quantitative compured tomography, pQCT).

Tomogramy byly provedeny s použitím přístroje PQCT (XCT-960A, Norland). Řezy o tloušťce 4 až 5 milimetry byly vyšetřeny při velikosti voxelu E (0,148 mm) a s odstupem 0,5 mm. Řez až 5 milimetrů distálně od růstové desky byl analyzován metodou „contmode“, „2/peelmode“, „5/cortmode“. Dále byla provedena měření hustoty minerálů všech kostí, trabekulů a kůry,

Excidované tibie byly umístěny do vodní lázně o hloubce 1 cm, přičemž tibie a fibula byly uloženy horizontálně, aby bylo možno pořídit obrázek vertikálně. Krysy byly anestetizovány izofluranem a noha byla položena tak, aby bylo možno obrázek na spojení femur-tibie a tibie—fibula předběžně lokalizovat a použít jako značky pro tomogramy.

Příklad 1

Identifikace nových ER modulátorů

Byla vyvinuta řada in vitro kritérií, které umožňují zařazení ER modulátorů do čtyř mechanisticky odlišných skupin (Tzukerman a kol., Mol. Endocrinol. 8: 21-30 (1994)). Konkrétně, bylo provedeno vyšetření jatemích buněk HepG2, kdy se schopnost látky regulovat transkripční aktivitu na estrogen reagujícího komplementu 3 (C3) hodnotí v přítomnosti buď divokého typu ER (wild type ER, ERwt), nebo receptorového mutantu, ER-TAF1, v němž byla eliminována funkce

AF-2, S použitím těchto vyšetření bylo možno odvodit „otisky prstů“ (fingerprints) známých ER modulátorů (McDonnell a kol., Mol. Endocrinol. 9: 659-669 (1995)). I když tato vyšetření přesně neodpovídají prostředí ER in vivo, postačuje chování těchto látek při těchto vyšetřeních ktomu, aby bylo možno je rozdělit do skupin, z nichž každá vykazuje jedinečné aktivity in vivo.

Synteticky byla připravena řada ER ligandů odvozených od tri fenyl ethy lénu (Willson a kol., JMed. Chem. 37: 1550-1552 (1994)). Předběžná analýza těchto látek invivo ukázala, že relativní aktivita těchto látek v kostech a v děloze není shodná, což je důsledkem možných mechanistických rozdílů (Willson a kol, JMed. Chem. 37: 1 550-1 552 (1994)). Byla proto „naslepo“ provedena analýza těchto sloučenin na ERwt v buňkách HepG2 na promotéru C3 a zjistilo se, že, že všechny látky až na dvě byly z mechanistického hlediska neodlišitelné od tamoxifenu. Dvě látky, GW5638 a GW7604, však v tomto systému vykazovaly dostatečně odlišný profil od ostatních ER ligandů; tento jev bylo nutno dále zkoumat. Je zajímavé, že tyto látky jsou strukturálně vzájemně shodné až na to, že GW7604 je hydroxylovanou verzí GW5638 (viz dále uvedená tabulka 1). Při použití in vitro kompetitivního testu na radioligandové vazby se prokázalo, že obě tyto látky vykazují vysokou afinitu vůči interakcím ER. Konkrétně u GW5638

- 10činila hodnota Ki 50,4 nM (+/-5,4) a u GW7604 dosahovala Kj hodnoty 15,5 nM (+/- 1,4),

Ukázalo se, že za stejných podmínek dosahuje K_; u 17-p-estradiolu hodnoty 6,3 nM (+/- 0,4).

I když metabolismus GW5638 nebyl zkoumán, je pravděpodobné, že se konvertuje na látku

GW7604 s vyšší afinitou in vivo stejným způsobem, jako se tamoxifen konvertuje na metabolit 5 4-OH tamoxifen s vyšší afinitou (Jordán a kol., J. Endocrinology 75:305-316 (1977)). Srovnání agonistické aktivity těchto látek s reprezentativními členy každé ze čtyř vytvořených skupin

ERIigandů je na obrázku 1A, v tomto testu působí tamoxifen jako částečný agonista ER při analýze s promotérem C3 a dosahuje 45% účinnosti estradiolu. Pokud se analyzují stejným způsobem raloxifen a čistý antagonista ICÍ182, 780, nevykazují agonistickou aktivitu, ale inhibuio jí bazální transkripční aktivitu promotoru C3. Nedávno bylo zjištěno, že bazální aktivita promotéru C3 je ER-dependentní, i když nezávislá na ligandu (Norris a kol., Mol. Endocrinol. 10: 1 6051616 (1996)). Protože jak raloxifen, tak i ICI 182, 780 inhibují ligand-dependentní a ligand— independentní aktivaci ER, zdá se, že v tomto prostředí působí jako „inverzní agonisté“. GW5638 ajeho předpokládaný metabolit GW7604 však nevykazují žádnou agonistickou ani antagonistic15 kou aktivitu vůči tomuto promotéru, u kterého byl zjištěn zatím nepozorovaný „otisk prstu“ („fingerprint“). Lze tedy dospět k závěru, že v prostředí, kde tamoxifen vykazuje částečnou agonistickou aktivitu, jsou analoga tamoxifenu GW5638 a GW7604 funkčně neaktivní.

I když se raloxifen a ICI 182, 780 chovaly k ERwt analogicky, jsou z mechanistického hlediska 20 odlišné (McDonnell a kol., Mol. Endocrinol. 9: 659-669 (1995); Dauvois a kol., Proč. Nati,

Acad, Sci. USA 89: 4 037-4 041 (1992); Dauvois a koí, J. Cello Sci. 106: 1 377-1 388 (1993)).

Při testu sER mutantem ER (ER-TAF1)), kdy byla aktivační sekvence AF-2 přerušena, se raloxifen chová jako tamoxifen, a vykazuje 40% agonistickou aktivitu estradiolu (obr. 1B). V tomto testu jsou ICI182, 780, GW5638 a GW7604 funkčně neaktivní. Tato data ukazují, že

GW5638 (a GW7604) fungují způsobem, který se liší od jíž dříve popsaných skupin ERsmíšených agonistů a antagonistů (McDonnell a kol., Mol. Endocrinol. 9: 659-669 (1995)).

Jedním možným, i když nepravděpodobným vysvětlením těchto počátečních výsledků je, že uvedené látky byly metabolizovány (nebo nějakým způsobem jim bylo zabráněno v navázání se na receptor), což by vysvětlovalo jejich neaktivitu v tomto testu. Tato otázka byla zkoumána posouzením' schopnosti GW5638 a GW7604 inhibovat agonistický účinek estradiolu na ERwt a tamoxifenu na ER-TAF1, a zrušit inverzní agonistickou aktivitu ICI182, 780. Jak ukazuje obr. 2A, fungoval estradiol jako úplný agonista a tamoxifen jako částečný antagonista ERwt při vyšetření s promotéru C3 v buňkách HepG2. Zajímavé je, agonistická aktivita, kterou projevoval tamoxifen nebo estradiol, byla inhíbována jak GW7604, tak GW5638. Tyto látky tedy působily jako antagonisté receptorů způsobem odlišným od tamoxifenu. Podobná analýza byla provedena s použitím ER-TAF1 místo ERwt (obr. 2B). Jak se předpokládalo, jak GW5638, tak i GW7604 dokázaly inhibovat estradiolem a tamoxifenem indukovanou transkripční aktivitu ER-TAF1. Je zajímavé, že raloxifen inhibuje částečně agonistickou aktivitu ER-TAF1 (obr. 1B), což je akti40 vita inhibovaná jak GW5638, tak i GW7604. Souhrnně tato data ukazují, že GW5638 a jeho předpokládaný in vitro metabolit GW7604 představují z mechanistického hlediska jedinečné modulátory ER, které nevykazují in vitro agonistickou aktivitu, ale které dokáží inhibovat agonistickou aktivitu estradiolu, tamoxifenu a raloxifenu. I když jejich profil se v některých testech podoba profilu skupiny čistě antagonisticky působících ligandů, liší se tyto látky od steroidních antagonistů jako je 1CI182, 780 tím, že nevykazuj í inverzní agonistickou aktivitu (obr. 1 A).

Aby se potvrdila mechanistická odlišnost GW5638 a GW7604 od ICI 182 780 měřila se schopnost těchto sloučenin dosáhnout zrušení inverzní agonistické aktivity prokázanou ICI 182 780. Výsledky této analýzy jsou na obr. 2C. Konkrétně bylo pozorováno, že bazální aktivita lidského so promotéru C3 byla po přidání ICI182 780 potlačena desetinásobně a že bylo možno ji úplně zrušit současným přidáním GW7604 a částečně zrušit pomocí GW5638.

Jedním zmožných vysvětlení pozorovaných mechanistických odlišností je to, že GW5638 aGW7604 na sebe navzájem působí $ ER a inhibují jeho schopnost interakce s DNK. Toto je přičítáno použití modifikovaného ER (ER-VP16) k určení nukleární lokalizace a DNA vazebné- li Ι Λ JUUVZy Bť) ho statutu ER v buňce po navázání ligandu. Tento modifikovaný protein se ve všech směrech chová přesně jako ER s tou výjimkou, že aktivuje transkripci po interakci s elementem reagujícím na estrogen „estrogen response element“ (ERE) nezávisle na povaze navázaného ligandu (McDonnell a kol., Mol. Endocrinol 9: 659-669 (1995)). S pomocí této reakční látky bylo zjištěno, že všechny skupiny ER ligandu, včetně ICII82, 780, GW5638 a GW7604, usnadňují účinné interakce ER s cílovou DNK (McDonnell a kol., Mol. Endocrinol. 9: 659-669 (1995)).

In vivo tedy dochází k interakci mezi GW5638 a GW7604 na jedné straně a ER na straně druhé, přičemž vykazují farmakologické vlastnosti, odlišné od vlastností dalších známých ER moduláio torů. Z toho lze usuzovat, že jedinečné vlastnosti GW5638 a GW7604 se projevují na některém stupni vazby DNK směrem dolů. Vzhledem k jedinečným vlastnostem těchto látek byla zahájena řada studií u celých zvířat s cílem zjistit jejich aktivitu v kosterním, kardiovaskulárním a reproduktivním systému.

Příklad 2

Prevence ovariektomií indukovaného úbytku kostní hmoty u krys.

Dnes jsou k dispozici poměrně jednoznačné důkazy o tom, že jak tamoxifen, tak i raloxifen zabraňují úbytku kostní hmoty v preklinických modelech osteoporózy po menopauze (Love akoí, New Engl. J. Med. 326: 852-856 (1992); Love a kol., Ann. Jntern. Med. 115: 860—864 (1991); Black a kol., J. Clin. Invest. 93: 63-69 (1994)). Mechanismus účinku těchto látek v kostech však zatím nebyl zjištěn. Osud kostí pacientů léčených čistým antagonistou ICI182,

780 není v současné době jasný, i když data z preklinických modelů u krys nasvědčují tomu, že v dané tkáni nepůsobí jako agonista (Gallagher a kol., Endocrinology 133: 2787-2791 (1993)). To vedlo k vypracování hypotézy, že k ochraně kostí je nutná částečná agonistická aktivita tamoxifenu a raloxifenu (Love a kol., New Engl. J. Med. 326: 852-856 (1992); Black a kol., J. Clin. Invest. 93: 63 69 (1994)). Dřívější práce prokazující, že jak tamoxifen, tak i raloxifen mohou v kontextu některých buněk a promotérů působit jako stejně účinní agonisté tuto představu podporují (McDonnell a kol., Mol. Endocrinol. 9: 659-669 (1995); McDonnell a kol., Mol, Endocrinol. 9: 659 669 (1995)). GW5638 však představuje nový nástroj, s nímž se lze touto otázkou zabývat. Tato látka, která v žádné z in vitro analýz nevykazuje klasickou agonistickou aktivitu, byla zkoušena z hlediska schopnosti inhibovat úbytek kostní hmoty u krys po ovariek35 tom i i (OVX). Konkrétně byla u 90 dní starých krys po ovariektomií hodnocena hustota kostních minerálů (bone minerál density, BMD) jak v lumbální části páteře, tak i v tibii po perorálním podávání buď 17-p-estradiolu, nebo zvyšujících se dávek GW5638 po dobu 28 dní. Výsledky na obr. 3 A ukazují, že k významnému úbytku kostní hmoty došlo v lumbální části páteře u zvířat po OVX v průběhu 28denní studie ve srovnání s kontrolními zvířaty, u nichž byla napodobena ope40 race, zatímco hodnota BMD u krys po OVX, jimž byl podáván estradiol, zůstala zachována. Významné je zjištění, že látka GW5638 vykazovala na dávce závislou protektivní aktivitu vůči kosti, přičemž v koncentraci 3 μιηοΙ/kg (1 mg/kg) byla stejně účinná jako estradiol. Tato dávka je podobná dávce tamoxifenu, potřebné k ochraně kostí ve stejném modelu (Love a kol., New Engl. J. Med. 326: 852-856 (1992); Black a kol., J. Clin. invest. 93: 63-69 (1994); Yang a kol.,

Endocrinology 137; 2 075-2 084 (1996)). Pozorovaná aktivita ve smyslu ochrany kostí se neomezovala na lumbální část páteře, protože obdobné výsledky byly získány při hodnocení BMD v tibii (obr. 3B). Konkrétně se pri použití stejného experimentálního protokolu prokázalo, že látka GW5638 je účinná při zachování celkové kostní hmoty s velmi výrazným účinkem v trabekulámím kompartmentu. To je zajímavé zjištění, pokud si uvědomíme, že v případě estrogenů bylo již dříve prokázáno, že reguluje kostní obrat v tomto kompartmentu (Gallagher a kol., Endocrinology 133; 2 787-2 791 (1993)). Dohromady vzato tato data ukazují, že GW5638, což je látka bez klasické ER agonístické aktivity, pokud se analyzuje in vitro, působí jako v kosti jako účinný agonista ER.

-12Podle vynálezu bylo zjištěno, že látky, které působí jako agonisté ER v kosti, jako je estradiol, tamoxifen a raloxifen, dokáží i potlačit zvýšení hladin cholesterolu v séru, k němuž dochází v souvislostí s OVX {Love a kol., Ann. Íntern. Med 115: 86(1-864 (1991); Black a kol., J Clin. ínvest. 93; 63-69 (1994)). Toto pozorování vedlo k představě, že mechanismus ER aktivity v kosti a v kardiovaskulárním systému je velmi podobný. 1 když zatím není jasné, zda pozorovaná suprese hladin cholesterolu v séru stačí k vysvětlení snížení mortality na kardiovaskulární onemocnění u postmenopauzálních žen při estrogenové substituční terapii, je přijímána jako ukazatel účinku estrogenu v kardiovaskulárním systému. K osvětlení této otázky byla hodnocena hladina celkového cholesterolu v séru krys po OVX, jimž byl podáván estradiol nebo GW5638 ío po dobu 28 dní, Výsledky na obr. 4 ukazují, že dokonce i při nejnižší ověřované koncentraci byla látka GW5638 stejně účinná jako estradiol ve snižování hladin cholesterolu v séru.

Příklad 3

GW5638 jako dělohu šetřící ER modulátor

V snaze rozšířit vyšetření tkáňové specificity GW5638 byla provedena komplexní analýza uterotrofní aktivity této látky. V počáteční sérii experimentů byla srovnávána aktivita GW5638 a tamoxifenu v děloze 21 denních nedospělých krys. V této analýze byla použita vlhká hmotnost dělohy jako měřítko ER agonistické aktivity v této tkáni (obr. 5). Po perorálním podání jako jediná látka nevykazovala látka GW5638 žádnou významně vyšší aktivitu ve srovnání s kontrolními pokusy. Zvláště je třeba si uvědomit, že tato látka je v této analýze neaktivní při dávce 10 pm/kg/den, což je trojnásobkem dávky nutné k ochrannému účinku v kostech (obr. 3). Naproti tomu tamoxifen vykazoval uterotrofní aktivitu při dávkách již 0,1 pmol/kg/den. Tyto studie byly rozšířeny o další vyšetření a ukázalo se, že GW5638, ne však tamoxifen, dokáže úplně inhibovat agonistickou aktivitu estradiolu u těchto kiys, což potvrzuje, že tato látka je čistým agonistou v této tkáni za podmínek analýzy.

Ve druhé sérii experimentů byla uterotrofní aktivita po 28denní aplikací buď GW5638, nebo estradiolu hodnocena u 90 dní starých krys po OVX. Výsledky této analýzy, které jsou uvedeny na obr. 6A, ukazují, že při dávkách až třikrát vyšších, než je dávka nutná k ochrannému účinku v kostech, vykazuje GW5638 minimální uterotrofní aktivitu. Zajímavé je však zjištění, že nebyly pozorovány žádné statisticky významné rozdíly v celkové tělesné hmotnosti krys po OVX s apli35 kácí GW5638 versus zvířat s napodobenou operací. Ve srovnání s OVX bylo zjištěno velmi malé, na dávce nezávislé, zvýšení vlhké hmotnosti dělohy. Podobné zjištění uváděli jiní autoři u krys po aplikaci raloxifenu, kdy byla aktivita připisována zvýšení vodního nasakování {Kedar a kol., Lancet 343: 1318-1321 (1994); Love a kol, Ann. íntern. Med. 115: 860—864 (1991); Black a kol, J. Clin. Ínvest. 93; 63-69 (1994)).

Kromě měření vlhké hmotnosti dělohy bylo provedeno histologické vyšetření děloh odebraných od stejných zvířat (obr. 7A-7F (malé zvětšení) a obr. 8A-8D (velké zvětšení)). V této analýze vykazovaly buňky děložního epitelu u krys s aplikací GW5638 na dávce závislou hypertrofii, zatímco u stromatu bylo zjištěno nepatrné zvýšení intraceluíámího pojivá a základní látky.

Při nejvyšších dávkách GW5638 (trojnásobek dávky nutné k ochraně kostí) byla pozorovaná hypertrofie epitelu srovnatelná s hypertrofii dělohy po aplikaci estradiolu, zatímco odpověď stromatu a infiltrace eozinofilů byla menší, než hodnoty zjištěné u krys po aplikaci estradiolu (srovnej obr. 8C a 8D).

Souhrnně tato data ukazují, že GW5638 vykazuje marginální ER -agonistickou účinnost v děloze, zatímco v kostech funguje jako ER agonista. GW5638 je tedy jedinečným ER modulátorem, který projevuje ER agonistickou a antagonistickou aktivitu tkáňově selektivním způsobem.

-13Příklad 4

Vliv aplikace antiestrogenu na nádory při rakovině prsu u nahých myší 5

Tato studie byla provedena s použitím nádorových buněk odvozených od buněčné linie MCF-7 rakoviny prsu. Tato linie je na estrogen a progesteron receptor pozitivní, dependentní na hormonu a senzitivní vůči antihormonům. Nádorové buňky byly inokulovány do boku atymických BALB/c Urd nun myší po OVX. Myším byly suplementovány estrogenovými peletami s pozvolit) ným uvolňováním. Zvířata dostávala denně subkutánní injekce podle následujícího schématu:

skupina 1: kontrolní (kukuřičný olej) skupina 2: 0,3 mg GW5638 skupina 3: 0,6 mg GW5638 skupina 4: l,0mgGW5638 skupina 5: 1,0 mg tamoxifenu.

S pomocí kaliperu byly změřeny dva rozměry nádorů, přičemž plocha nádoru byla 1/2 x w/2 x π. Výsledky jsou na obr. 9.

Příklad 5

Studie odpovědi na dávku

Cílem této studie bylo srovnat maximálně účinnou dávku GW5638 stamoxifenem z hlediska schopnosti inhibovat růst nádorových buněk MCF-7 rakoviny prsu u nahých myší.

Deseti dárcům, myším po OVX, bylo injikováno 5 miliónů buněk MCF-7. Výsledné nádory byly 30 transplantovány myším příjemcům. Všechna zvířata dostávala estrogenové pelety s pozvolným uvolňováním.

Když se u experimentálních myší objevil měřitelné nádory, bylo zahájeno každodenní dávkování subkutánními injekcemi o objemu 0,1 ml podle následujícího schématu:

skupina 1: kontrolní (kukuřičný olej) skupina 2: 0,3 mg GW5638 skupina 3: 0,6mgGW5638 skupina 4: 1,0 mg GW5638 skupina 5: 1,0 mg tamoxifenu.

Nádory byly měřeny denně kaliperem a plocha byla vypočítána následujícím způsobem:

plocha = 1/2 x w/2 x π.

Po 8 týdnech byl růst nádorů srovnán mezi skupinami. U všech skupin s aplikací byla zjištěna ínhibice růstu nádoru (statisticky významná) ve srovnání s kontrolami. Dvě horní dávky GW5638,0,6 mg a 1,0 mg, byly nerozeznatelné od tamoxifenu v dávce 1,0 mg (viz obr. 10).

- 14Příklad 6

Studie LCC2.

MCF-7/LCC2 je buněčná linie (z Lombardi Cancer Centre), která je na estrogenu nezávislá, i když vůči němu senzitivní, a tamoxifen rezistentní. Tento experiment se prováděl s cílem stanovit schopnost GW5638 zpomalit růst této buněčné linie u nahých myší ve srovnání s kontrolními nádory nebo s nádory po aplikaci amoxifenu.

K přijetí buněk bylo připraveno 40 myší po OVX, zvířata byla zařazena do následujících skupin:

skupina 1: kontrolní skupina 2: estrogenové pelety skupina 3: 1,0 mg tamoxifenu skupina 4: 1,0 mg látky 563 8

Kontrolní zvířata nedostávala nic a skupiny 3 a 4 dostávaly injekce s 0,1 ml kukuřičného oleje každé tři dny. Nádory byly měřeny každé tři dny kaliperem a plocha byly vypočítána následujícím způsobem:

plocha = 1/2 X w/2 X π.

Po 8 týdnech byl růst nádorů porovnán mezi skupinami. Na rozdíl od očekávání se zdálo, že nádor na estrogen nereaguje.

Kromě toho se nádor zdá senzitivní vůči tamoxifenu, pres veškeré předpovědi o jeho rezistenci vůči tamoxifenu. Jak tamoxifen, tak i GW5638 dokázaly stejně inhibovat růst tohoto nádoru (viz obr. 11).

Příklad 7

GW7604 působí jako antiestrogen v buňkách MCF-7 rakoviny prsu.

Buňky lidské rakoviny prsu MCF-7 byly přechodně kotransfekovány 0,9 pg/ml expresního vektoru lidského ER spolu s2 pg/ml reportérového plasmidu C3-Luc a 0,1 mg/ml expresního vektoru pRSV-p-galaktosidázy (jako interní kontrolou účinnosti transfekce). Po transfekci byly buňky inkubovány po dobu 48 hodin v přítomnosti 17-p-estradiolu a zvyšujících se koncentrací každého antagonisty, jak uvedeno. Následně byly transfekované buňky analyzovány na aktivitu luciferázy a β-galaktosidázy. Normalizovaná aktivita luciferázy byla vypočítána vydělením surové luciferázy (x 10⁴ jednotek) pro každý bod aktivitou β-galaktosidázy (A415x 10⁵/čas v minutách). Na obr. 12 každý bod dat v tomto experimentu reprezentuje průměr trojího měření transkripční aktivity za daných experimentálních podmínek. Průměrný koeficient variace při každé koncentraci hormonu byl < 10 %.

Příklad 8

Analýza účinku specifických ER mutací na farmakologií antiestrogenů ukazuje na dodatečnou so mechanistickou komplexitu

Buňky lidského hepatocelulámího karcinomu HepG2 byly přechodně transfekovány 0,9 pg/ml vektoru exprimujícího buď lidský ER (pRST7ER) (viz obr. 13A), nebo ER mutant (ER-TAF1) (viz obr. 13B), v němž byla funkce AF-2 deaktivována (ER-TAF1 spolu s2 pg/ml promotoru

-15komplementu 3 (C3) responsivního na estrogen fúzovaný s genem luciferázy; 0,1 pg/ml vektoru exprimujícího pRSV-p-galaktosidázu (jako interní kontrolou účinnosti transfekce). Po transfekci byly buňky inkubovány po dobu 48 hodin v přítomnosti samotného rozpouštědla nebo zvyšujících se koncentrací estrád iolu nebo anti estrogenů, jak uvedeno. Následně byly transfekované buňky analyzovány na aktivitu luciferázy nebo β-galaktosidázy. Každý bod dat v tomto experimentu reprezentuje průměr trojího měření transkripční aktivity za daných experimentálních podmínek. Průměrný koeficient variace při každé koncentraci hormonu byl < 10%. Data na obr. 13A a 13B ukazují, že většina známých antiestrogenů vykazuje agonistický účinek na mutované estrogenové receptory. Skutečnost, že GW5638 nevykazuje agonistický účinek na dosud io žádný vyšetřený ER mutant znamená, že tato látka je vhodná pro léčbu nádorů prsu refraktomích vůči tamoxifenu.

Příklad 9

Komparativní analýza schopnosti různých antiestrogenů inhibovat ER a ER transkripční aktivitu

Buňky HeLa byly transfekovány buď vektorem exprimujícím ER (viz obr. 14A), nebo vektorem exprimujícím ER (viz obr. 14B) spolu s reportérovým konstruktem estrogen-responsivní

ERE-TK-luciferázy. Následně byla hodnocena schopnost různých koncentrací antagonisty inhibovat estradiolem (IO^-9) aktivovanou transkripci. Výsledky jsou na obr. 14A a 14B a ukazují, že s výjimkou idoxifenu vykazují všechny antiestrogeny přibližně stejný účinek na ERa, zatímco v případě ER3 nevykazuje ani raloxifen ani idoxifen silnou antagonistickou aktivitu. Tato data navíc ukazují, že GW7604 je silným pan-antagonistou obou forem receptoru pro lidský estrogen.

Příklad 10

Analýza typu „western immunoblot“ exprese ER v cílových buňkách po aplikaci agonistu nebo antagonistu

Vybrané linie buněk byly inkubovány po dobu 48 hodin v přítomnosti rozpouštědla nebo 10 nM estradiolu nebo antiestrogenů, jak uvedeno. Byly připraveny extrakty jader, přičemž vzorky byly separovány technikou denaturační PAGE, načež byly přeneseny na nylonovou membránu a relativní exprese ER po těchto krocích byla stanovena analýzou typu „western immunoblot“ s použitím ER specifické monoklonální protilátky H222. Obr. 15A ukazuje endogenní jádrový ER-obsah buněk MCF-7 (10 g/linii). Obr. 15B ukřižuje obsah endogenních jádrových ER Ishikawových buněk (100 g/linii). Obr. 15C ukazuje Ishikawovy buňky přechodně transfekované 0,9 g/ml ER (pEST7ER), k detekci bylo použito extraktu jader v množství 10 g/linii. Hladiny ER byly kvantifikovány denzitometrickým vyšetřením imunoblotu. Výsledky na obr. 15A-15C jsou reprezentativní pro opakované experimenty prováděné za stejných podmínek.

Příklad 11

Analýza typu „western Immunoblot“ exprese endogenních ER v buňkách MCF-7 po krátkodobé aplikaci agonistu nebo antagonistů

Buňky MCF-7 rakoviny prsu u člověka byly indukovány po dobu 1 hodiny (obr. I6A) nebo

4 hodin (obr. 16B) v přítomnosti solventu nebo 10 nM estradiolu nebo antiestrogenů, jak uvedeno. Byly připraveny extrakty jader, přičemž vzorky byly separovány technikou denaturační PAGE, načež byly přeneseny na nylonovou membránu a relativní exprese ER po těchto krocích byla stanovena analýzou typu „western immunoblot“ s použitím ER specifické monoklonální protilátky H222. Hladiny ER byly kvantifikovány denzitometrickým vyšetřením imunoblotu.

-16Výsledky na obr. 16A a 16B jsou reprezentativní pro opakované experimenty prováděné za stejných podmínek.

Příklad 12

Analýza typu „western Immunoblot“ exprese endogenních ER v Ishikawových buňkách (kultivované děložní buňky) po krátkodobé aplikaci agonistů nebo antagonistu

Ishikawovy buňky lidského endometriálního adenokarcinomu byly inkubovány po dobu 1 hodiny (obr. 17A) nebo 4 hodin (obr. 17B) v přítomnosti rozpouštědla nebo 10 nM estradiolu nebo antiestrogenu, jak uvedeno. Byly připraveny extrakty jader, přičemž vzorky byly separovány technikou denaturační PAGE, načež byly přeneseny na nylonovou membránu a relativní exprese ER po těchto krocích byla stanovena analýzou typu „western immunoblot“ s použitím ER specifické ís monoklonální protilátky H222. Hladiny ER byly kvantifikovány denzitometrickým vyšetřením imunoblotů. Výsledky na obr. 17A a 17B jsou reprezentativní pro opakované experimenty prováděné za stejných podmínek.

Příklad 13

Analýza typu „western Immunoblot“ exprese endogenních ER v celých buňkách, jádrech a cytoplazmě Ishikawových buněk po krátkodobé aplikaci agonistů nebo antagonistu

Ishikawovy buňky lidského endometriálního adenokarcinomu byly indukovány po dobu I hodiny v přítomnosti rozpouštědla nebo 10 nM estradiolu nebo antiestrogenu. Byly připraveny extrakty celých buněk (obr. 18A), jader (obr. 18B) a cytoplazmy (obr. 18C), přičemž vzorky byly separovány technikou denaturační PAGE, načež byly přeneseny na nylonovou membránu a relativní exprese ER po těchto krocích byla stanovena analýzou typu „western immunoblot“ s použitím

ER specifické monoklonální protilátky H222. Hladiny ER byly kvantifikovány denzitometrickým vyšetřením imunoblotů. Výsledky na obr. 18A-18C jsou reprezentativní pro opakované experimenty prováděné za stejných podmínek.

Příklad 14

GW7604 inhibuje E2 stimulovanou proliferaci buněk MCF-7

Cíl: Stanovit schopnost GW5638 inhibovat estrogenem stimulovanou proliferaci buněk rakoviny

4o prsu MCF-7 in vivo.

Provedení experimentu: na 24jamkové destičky bylo umístěno 25 000 až 50 000 buněk na jamku. Buňky jsou uloženy v médiu prostém fenolové červeně. Po zachycení byly buňky stimulovány buď samotným antiestrogenem, nebo estrogenem a antiestrogenem. Doba indukce se pohybuje mezi 12 a 48 hodinami podle experimentu.

Do každé jamky se přidá 4 lambda (4gCi) tymidinu, [metyl-³H].

Inkubuje se při 37 °C po dobu 2 až 4 hodin.

Odsaje se médium a opláchne se dvakrát ledovým PBS.

Opláchne se jednou ledovou 10% TCA, kyselinou trichloroctovou.

Do každé jamky se přidají 2 mililitry 10% TCA.

-17Inkubuje se při 4 °C po dobu I až 2 hodin.

Opláchne se jednou TCA.

Přidá se 1 ml 0,2N NaOH.

Přenese se obsah každé jamky do scintilační lahvičky obsahující 2 ml scintilační tekutiny, i o Odstředí se a spočítá se ³H.

Výsledky ukáží schopnost různých látek inhibovat estrogenem indukovanou a bazální proliferaci buněk MCF-7 (viz obr. 19A-19C).

Všechny dokumenty, citované shora jsou zde celým svým obsahem uvedeny jako odkazové materiály,

Každý odborník pracující vdaném oboru je schopen na základě výše uvedeného popisu najít v rámci rozsahu předmětného vynálezu různé variace a změna detailních provedení, aniž by to změnilo rozsah vynálezu.

- 18tabulka

lamoxllen

Claims

1. Sloučenina obecného vzorce I:

ve kterém

R¹ je skupina ~{CH,)_nCR⁵=CR⁶R⁷;

io R^{2 3} a R³ jsou navzájem na sobě nezávisle atom vodíku, skupina -CH₃, -OH, -OCH₃, -OCH₂CH₃nebo-CH(CH₃)₂;

R⁴ je skupina -CN, -NO₂, -CH₃, -CH₂CH₃, -CH₂CH₂-Y nebo -Y;

15 R^s a R⁶ jsou navzájem na sobě nezávisle atom vodíku, -Ci^alkylová skupina, -C₂^alkenylová skupina, -C₂₄al kiny lová skupina, -X-C_r.₃alkylová skupina, -X-Í\₄alkenylová skupina, -X-C_{2 4}alkinylová skupina nebo -Y;

R⁷ je skupina-C(O)OR¹²;

R¹² je atom vodíku;

X je kyslík nebo síra;

25 Y je halogen; a n je číslo vybrané ze skupiny zahrnující 0, 1 a 2;

nebo farmaceuticky přijatelná sůl této sloučeniny pro použití při léčení nebo prevenci estrogenem

30 stimulované rakoviny, přičemž tento typ rakoviny je rezistentní vůči jinému modulátoru estrogenového receptoru než je uvedená sloučenina obecného vzorce I.

2. Sloučenina podle nároku 1, kde uvedenou rakovinou je rakovina prsu, rakovina dělohy, rakovina vaječníku nebo rakovina tlustého střeva.

3. Sloučenina podle nároku 2, kde uvedenou rakovinou je rakovina prsu.

-204. Sloučenina podle některého z nároků 1 až 3, kde uvedená rakovina je rezistentní na tamoxifen, idoxifen, raloxifen nebo sloučeninu 182780, což je

5. Sloučenina podle některého z nároků 1 až 4, kde je uvedená rakovina de novo rezistentní

5 vůči modulátoru estrogenového receptoru.

6. Sloučenina podle některého z nároků 1 až 4, kde tato rezistence vůči uvedenému modulátoru estrogenového receptoru je získanou rezistencí.

io

7. Sloučenina podle některého z nároků 1 až 6, určená k použití v kombinaci sjedním nebo více antiestrogeny, ligandem retinové kyseliny nebo retinoxickým X receptorem, antiprogestinem, antiandrogenem, vitaminem D nebo jeho metabolitem, inhibitorem famesyltransferázy, peroxisomovým proliferátorem aktivovaným receptorem a (PPARa) nebo gama agonistem a inhibitorem mitogenem-aktivované proteinkinázy (MAP).

8. Sloučenina podle některého z nároků 1 až 7, přičemž touto sloučeninou je