ES2312189T3

ES2312189T3 - Metodo para prevenir o tratar enfermedades y trastornos dependientes de estrogenos.

Info

Publication number: ES2312189T3
Application number: ES98940886T
Authority: ES
Inventors: Donald P. Duke University MCDONNELL; John Duke University NORRIS; Caroline Duke University CONNOR; Ashini Duke University WIJAYARATNE
Original assignee: Duke University
Current assignee: Duke University
Priority date: 1997-08-15
Filing date: 1998-08-14
Publication date: 2009-02-16
Anticipated expiration: 2018-08-14
Also published as: NO20000752D0; JP2001515038A; RU2214236C2; NO20000752L; PL338555A1; KR20010022956A; UA70925C2; US20030232795A1; EP1019057A4; CZ2000531A3; HUP0002852A3; CZ300929B6; ATE411016T1; CA2301032A1; EP1019057A1; CN1275911A; AU8906398A; EE200000077A; DE69840126D1; NZ502738A

Abstract

Un compuesto de fórmula I: (Ver fórmula) en la que R 1 es -(CH2)nCR 5 =CR 6 R 7 ; R 2 y R 3 son independientemente H, -CH3, -OH, -OCH3, -OCH2CH3 o -CH(CH3)2; R 4 es -CN, -NO2, -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2-Y o -Y; R 5 y R 6 son independientemente H, -alquilo C1 - 4, -alquenilo C2 - 4, -alquinilo C2 - 4, -X-alquilo C1 - 3, -X-alquenilo C2 - 4, -X-alquinilo C2 - 4 o -Y; R 7 es -C(O)OR 12 ; R 12 es H; X es oxígeno o azufre; Y es un halógeno; y n es un número entero seleccionado entre 0, 1 y 2; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso en el tratamiento o la prevención de un cáncer estimulado por estrógenos, cáncer que es resistente a un modulador del receptor de estrógenos distinto de dicho compuesto de Fórmula I.

Description

Método para prevenir o tratar enfermedades y trastornos dependientes de estrógenos.

Este invento se realizó, en parte, con fondos del National Institutes of Health, Subvención nº NCI P50 CA68438. El Gobierno puede poseer ciertos derechos sobre el invento.

Campo técnico

El presente invento se refiere, en general, al tratamiento de cánceres dependientes de estrógenos, particularmente el cáncer de mama, con antiestrógenos.

Antecedentes

El receptor de estrógenos (ER; del inglés, estrogen receptor) humano es un miembro de la superfamilia de receptores nucleares, que son factores de transcripción [Evans, Science 240: 889-895 (1988)]. En ausencia de hormona, reside en el núcleo de las células diana en un estado transcripcionalmente inactivo. Tras unirse al ligando, el ER experimenta un cambio conformacional que inicia una cascada de procesos que conducen finalmente a su asociación con regiones reguladoras específicas presentes en genes diana [O'Malley et al., Hormone Research 47: 1-26 (1991)]. El consiguiente efecto sobre la transcripción está influido por el contexto celular y promotor del receptor unido a DNA [Tora et al., Cell 59: 477-487 (1989); Tasset et al., Cell 62: 1177-1187 (1990); McDonell et al., Mol. Endocrinol. 9: 659-669 (1995); Tzukerman et al., Mol. Endocrinol. 8: 21-30 (1994)]. Es de este modo que el agonista fisiológico del ER, el estradiol, ejerce su actividad biológica en los sistemas reproductor, esquelético y cardiovascular [Clark y Peck (editores), "Female Sex Steroids: Receptors and Functions, Monographs on Endocrinology", Springer-Verlag, New York, EE.UU. (1979); Chow et al., J. Clin. Invest. 89: 74-78 (1992); Eaker et al., Circulation 88: 1999-2009 (1993)].

Además de estas actividades, se ha mostrado que el estrógeno actúa como un mitógeno en la mayoría de las células de cáncer de mama positivas para ER. De este modo, los regímenes de tratamiento que incluyen antiestrógenos, compuestos sintéticos que se oponen a las acciones del estrógeno, han resultado clínicamente eficaces en cuanto a detener o retrasar el progreso de la enfermedad [Jordan y Murphy, Endocrine Reviews 11: 578-610 (1990); Parker, Breast Cancer Res. Treat. 26: 131-137 (1993)]. La disponibilidad de estos moduladores de ER sintéticos y la subsiguiente disección de su(s) mecanismo(s) de acción han proporcionado ideas útiles relativas a la acción del ER.

A este respecto, uno de los compuestos más estudiados es el tamoxifeno [Jordan y Murphy, Endocrine Reviews 11: 578-610 (1990)]. Este compuesto actúa como un antagonista en la mayoría de los tumores de mama positivos para ER pero presenta una paradójica actividad agonista en el hueso y el sistema cardiovascular y una actividad agonista parcial en el útero [Kedar et al., Lancet 343: 1318-1321 (1994); Love et al., New Engl. J. Med. 326: 852-856 (1992); Love et al., Ann. Intern. Med. 115: 860-864 (1991)]. Por lo tanto, la actividad agonista/antagonista del complejo ER-tamoxifeno está influida por el contexto celular. Esta importante observación está en evidente contradicción con los modelos de toda la vida que sostienen que el ER sólo existe en la célula en un estado activo o un estado inactivo [Clark y Peck (editores), "Female Sex Steroids: Receptors and Functions, Monographs on Endocrinology", Springer-Verlag, New York, EE.UU. (1979)]. En lugar de ello, indica que los diferentes ligandos que actúan a través del mismo receptor pueden manifestar diferentes biologías en diferentes células. Es probable que la definición del mecanismo de esta selectividad permita avanzar en la comprensión de procesos tales como la resistencia al tamoxifeno, observada en la mayoría de los cánceres de mama que contienen ER, en los que están implicados anormalidades en la señalización del ER [Tonetti y Jordan, Anti-Cancer Drugs 6: 498-507 (1995)].

Utilizando un planteamiento in vitro, se ha determinado el probable mecanismo de la actividad agonista/antagonista celularmente selectiva del tamoxifeno [Tora et al., Cell 59: 477-487 (1989); Tasset et al., Cell 62: 1177-1187 (1990); McDonell et al., Mol. Endocrinol. 9: 659-669 (1995); Tzukerman et al., Mol. Endocrinol. 8: 21-30 (1994)]. Es importante señalar que se ha mostrado que el tamoxifeno induce en ER un cambio conformacional que es distinto del inducido por el estradiol [McDonell et al., Mol. Endocrinol. 9: 659-669 (1995); Beekman et al., Molecular Endocrinology 7: 1266-1274 (1993)]. Además, la determinación de las secuencias de ER necesarias para la actividad transcripcional indica cómo estos complejos de ligando-receptor específicos son diferencialmente reconocidos por la maquinaria transcripcional celular. Específicamente, se ha mostrado que ER contiene dos dominios de activación, AF-1 (Función 1 de Activación; del inglés, Activation Function-1) y AF-2, que permiten su interacción con el aparato de transcripción. La contribución relativa de estos AFs a la eficacia global del ER difiere de célula a célula [Tora et al., Cell 59: 477-487 (1989); McDonell et al., Mol. Endocrinol. 9: 659-669 (1995); Tzukerman et al., Mol. Endocrinol. 8: 21-30 (1994)]. Se determinó que el estradiol actúa como agonista tanto de AF-1 como de AF-2 ya que presentaba una actividad máxima independientemente de cuál AF fuera dominante en un ambiente celular dado. Por otra parte, el tamoxifeno actúa como un antagonista de AF-2, inhibiendo la actividad de ER en las células en que AF-2 es necesario o es el activador dominante [Tora et al., Cell 59: 477-487 (1989); McDonell et al., Mol. Endocrinol. 9: 659-669 (1995); Tzukerman et al., Mol. Endocrinol. 8: 21-30 (1994)]. Por el contrario, el tamoxifeno actúa como un agonista cuando sólo se requiere AF-1 [McDonell et al., Mol. Endocrinol. 9: 659-669 (1995); Tzukerman et al., Mol. Endocrinol. 8: 21-30 (1994)]. Posteriormente, basándose en sus actividades AF-1/AF-2 relativas, se definieron cuatro grupos de moduladores de ER distintos en cuanto al mecanismo: agonistas completos (es decir, el estradiol), dos clases distintas de agonistas parciales, representadas por el tamoxifeno y el raloxifeno, y los antagonistas puros, de los cuales el ICI 182.780 es un miembro representativo [McDonell et al., Mol. Endocrinol. 9: 659-669 (1995); Tzukerman et al., Mol. Endocrinol. 8: 21-30 (1994)]. Estos resultados proporcionan una explicación, relativa al mecanismo, de las diferencias observadas en las actividades biológicas de ciertos moduladores de ER e indican que los mecanismos por los que actúa ER en los diferentes tejidos no son idénticos. Resulta interesante que la actividad agonista mostrada por los moduladores de ER, tales como el estrógeno y el tamoxifeno, en estos sistemas in vitro refleja su actividad en los tractos reproductores de animales completos. Sin embargo, esta correlación no se extiende al hueso, donde el estradiol, el tamoxifeno y el raloxifeno, que presentan diferentes grados de actividad agonista de AF-1/AF-2, protegen eficazmente de la pérdida de hueso en el modelo de rata sometida a ovariectomía. De esta manera, con la excepción de los antiestrógenos esteroides puros (es decir, ICI 182.780), parece que todas las clases conocidas de moduladores de ER protegen de la pérdida de hueso en seres humanos y en modelos animales relevantes, aunque presentan grados diferentes de actividad estrogénica en otros tejidos [Chow et al., J. Clin. Invest. 89: 74-78 (1992); Love et al., New Engl. J. Med. 326: 852-856 (1992); Draper et al., "Biochemical Markers of Bone and Lipid Metabolism in Healthy Postmenopausal Women", compilado por C. Christiansen y B. Biis, "Proceedings 1993. Fourth International Symposium on Osteoporosis and Consensus Development Conference", Handelstrykkeriet, Aalborg; Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8739-8744 (1996); Black et al., J. Clin. Invest. 93: 63-69 (1994)].

Sumario del invento

El presente invento se basa en la identificación de moduladores de ER que, desde el punto de vista del mecanismo, son distintos de moduladores tales como el tamoxifeno. Estos moduladores son particularmente importantes en el tratamiento de cánceres de mama que son resistentes de novo al tamoxifeno o que se vuelven resistentes con el tratamiento.

De esta manera, el presente invento proporciona un compuesto de fórmula I:

1

en la que

\quad: R^{1} es -(CH_{2})_{n}CR^{5}=CR^{6}R^{7};

\quad: R^{2} y R^{3} son independientemente H, -CH_{3}, -OH, -OCH_{3}, -OCH_{2}CH_{3} o -CH(CH_{3})_{2};

\quad: R^{4} es -CN, -NO_{2}, -CH_{3}, -CH_{2}CH_{3}, -CH_{2}CH_{2}-Y o -Y;

\quad: R^{5} y R^{6} son independientemente H, -alquilo C_{1-4}, -alquenilo C_{2-4}, -alquinilo C_{2-4}, -X-alquilo C_{1-3}, -X-alquenilo C_{2-4}, -X-alquinilo C_{2-4} o -Y;

\quad: R^{7} es -C(O)OR^{12};

\quad: R^{12} es H;

\quad: X es oxígeno o azufre;

\quad: Y es un halógeno; y

\quad: n es un número entero seleccionado entre 0, 1 y 2;

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso en el tratamiento o la prevención de un cáncer estimulado por estrógenos, cáncer que es resistente a un modulador del receptor de estrógenos distinto de dicho compuesto de Fórmula I.

Breve descripción de los dibujos

Figuras 1A y 1B. GW5638 es distinto de clases conocidas de moduladores de ER, desde un punto de vista del mecanismo. Se transfectaron células HepG2 con el promotor de C3 humano {-1807 a +58} fusionado con el gen informador de luciferasa de luciérnaga, junto con un plásmido de expresión que contenía (Figura 1A) el receptor de estrógenos humano de tipo silvestre (ERwt; del inglés, wild-type ER) o (Figura 1B) un ER mutado en que se había alterado la función de AF-2 (ER-TAF1) y se analizó la actividad transcripcional en presencia de concentraciones crecientes de modulador de ER, según se indica. Las transfecciones fueron normalizadas en cuanto a la eficacia y el número de células al cotransfectar con un plásmido de expresión que contenía \beta-galactosidasa. Se obtuvo la respuesta normalizada al dividir las unidades lumínicas por la actividad de la \beta- galactosidasa según se mide en un ensayo enzimático. Las transfecciones se llevaron a cabo por triplicado. Los datos mostrados son representativos de múltiples experimentos llevados a cabo bajo condiciones similares.

Figuras 2A-2C. GW5638 y GW7604 se oponen a la actividad agonista del estradiol, la actividad agonista parcial del tamoxifeno y la actividad agonista inversa de ICI 182.780. Figura 2A: En células HepG2 transfectadas con ERwt, se evaluó la capacidad de GW5638 o GW7604 para inhibir la actividad agonista de 17-\beta-estradiol 10^{-8} M o la actividad agonista parcial mostrada por tamoxifeno 10^{-8} M. Figura 2B: En células HepG2 transfectadas con ER-TAF1 [McDonnell et al., Mol. Endocrinol. 9: 659-669 (1995)], se evaluó la capacidad de GW5638 o GW7604 para inhibir la actividad agonista de 17-\beta-estradiol 10^{-8} M o la actividad agonista parcial mostrada por 4-OH-tamoxifeno 10^{-8} M. Figura 2C: Tanto GW5638 como GW7604 pueden inhibir la actividad agonista inversa de ER del ICI 182.780 (ICI) manifestada sobre el promotor de C3 cuando se analiza en células HepG2 en las concentraciones indicadas. Las transfecciones fueron normalizadas en cuanto a la eficacia y el número de células al cotransfectar con un plásmido de expresión que contenía \beta-galactosidasa. Se obtuvo la respuesta normalizada al dividir las unidades lumínicas por la actividad de la \beta- galactosidasa según se mide en un ensayo enzimático. Se muestran ensayos representativos en que se llevaron a cabo transfecciones por triplicado. Las líneas de error representan el error estándar de la media (SEM; del inglés, standard error of the mean).

Figura 5. GW5638 no presenta actividad agonista de ER en el útero de ratas inmaduras. Grupos de ratas de 21 días de edad fueron tratados oralmente con vehículo solo, GW5638 o tamoxifeno como agentes únicos, o GW5638 o tamoxifeno en presencia de estradiol. Los datos mostrados representan el valor medio (\pm SEM). Se indican los rangos de las mediciones realizadas en animales tratados con estradiol (barra sombreada) y en animales simuladamente operados (barra clara).

Figura 6. Efecto de GW5638 sobre el peso uterino en estado húmedo de ratas sometidas a ovariectomía. Grupos de ratas de 90 días de edad simuladamente operadas o sometidas a ovariectomía fueron tratados durante 28 días con vehículo solo, estradiol o GW5638. Los resultados mostrados representan el peso uterino medio (\pm SEM) en estado húmedo para 7 ratas por grupo. Se indican los rangos de las mediciones realizadas en animales simuladamente operados (barra sombreada) y en animales sometidos a ovariectomía (OVX) (barra clara).

Figuras 7A-7F. Efecto de GW5638 sobre la histología uterina de ratas sometidas a ovariectomía. Histología comparativa (bajo aumento) de úteros de ratas de 90 días de edad que habían sido simuladamente operadas (Figura 7A), sometidas a ovariectomía (Figura 7B), sometidas a ovariectomía más estradiol (Figura 7C), o sometidas a ovariectomía más 1 \mug/kg (Figura 7D), 3 \mum/kg (Figura 7E) o 10 \mug/kg (Figura 7F) de GW5638.

Figuras 8A-8D. Efecto de GW5638 sobre la histología uterina de ratas sometidas a ovariectomía. Histología comparativa de úteros de ratas de 90 días de edad que habían sido simuladamente operadas (Figura 8A), sometidas a ovariectomía (Figura 8B), sometidas a ovariectomía más estradiol (Figura 8C), o sometidas a ovariectomía más 10 \mum/kg (Figura 8D) de GW5638. Se tomaron las fotografías con un aumento de 150X y posteriormente se ampliaron hasta un aumento final de 600X.

Figura 9. Efecto del tratamiento con antiestrógenos sobre tumores de cáncer de mama MCF-7 en ratones inmunodeprimidos. El día 0 indica el primer día de tratamiento. 2 semanas después de la inoculación de los tumores, un análisis estadístico reveló que cada grupo de tratamiento ejercía un efecto significativo con respecto al testigo (ANOVA; p < 0,5) y que no había diferencia significativa alguna entre las dos dosis máximas de GW5638 y tamoxifeno.

Figura 10. Estudio de dosis-respuesta.

Figura 11. Estudio con LCC2.

Figura 12. GW7604 actúa como un antiestrógeno en células de cáncer de mama MCF-7.

Figuras 13A y 13B. Un análisis del efecto de mutaciones específicas de ER sobre la farmacología de antiestrógenos revela una adicional complejidad en cuanto al mecanismo. Figura 13A: Er wt; Figura 13B: ER-TAF1.

Figuras 14A y 14B: Un análisis comparativo de la capacidad de una diversidad de antiestrógenos para inhibir la actividad transcripcional de ER\alpha (Figura 14A) y ER\beta (Figura 14B).

Figuras 15A-15C: Análisis de la expresión de ER, por inmunotransferencia Western, en células diana después del tratamiento con agonistas o antagonistas. Figura 15A: células MCF-7; Figura 15B: células Ishikawa; Figura 15C: células Ishikawa transfectadas con pRST7ER.

Figuras 16A y 16B: Análisis de la expresión de ER endógeno, por inmunotransferencia Western, en células MCF-7 después de tratamientos de corta duración (Figura 16A: 1 h; Figura 16B: 4 h) con agonistas o antagonistas.

Figuras 17A y 17B: Análisis de la expresión de ER endógeno, por inmunotransferencia Western, en células Ishikawa después de tratamientos de corta duración (Figura 17A: 1 h; Figura 17B: 4 h) con agonistas o antagonistas.

Figuras 18A-18C: Análisis de la expresión de ER endógeno de célula completa (Figura 18A), nuclear (Figura 18B) y citoplásmico (Figura 18C), por inmunotransferencia Western, en células Ishikawa después de tratamientos de corta duración con agonistas o antagonistas.

Figuras 19A-19C: Efecto sobre la proliferación de células MCF-7 estimuladas con E2. Figura 19A: ICI 182.780; Figura 19B: GW7604; Figura 19C: 4-OH-tamoxifeno.

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Descripción detallada del invento

El presente invento se refiere a moduladores selectivos del receptor de estrógenos, que poseen actividad agonista de ER tisularmente específica. Los moduladores del invento actúan como agonistas en el hueso y en el sistema cardiovascular, pero no en el útero. Desde el punto de vista del mecanismo, estos moduladores son distintos de, por ejemplo, el tamoxifeno y son útiles en el tratamiento de tumores, tales como los tumores de mama, particularmente los tumores de mama positivos para ER, caracterizados por una resistencia de novo o adquirida a diversos moduladores del receptor de estrógenos, incluyendo el tamoxifeno. Los presentes moduladores son también distintos del raloxifeno, droloxifeno, idoxifeno e ICI 182.780 en cuanto al mecanismo.

Los moduladores del invento, como se definen en la Reivindicación 1, son derivados de trifeniletileno, que son representados por una subfórmula de compuestos de Fórmula I como se definen en el documento USP 5.681.835; son muy preferidos GW5638 y derivados del mismo, tal como GW7604. Estos compuestos pueden ser preparados del modo descrito en el documento USP 5.681.835 y por Willson et al. [J. Med. Chem. 37: 1550 (1994)]. Los moduladores pueden formar sales farmacéuticamente aceptables con cationes, incluyendo cationes de metales alcalinos, tales como sodio y potasio, y de metales alcalinotérreos, tales como calcio y magnesio.

Los moduladores del presente invento se utilizan en el tratamiento y/o la prevención de cánceres estimulados por estrógenos, cánceres que son resistentes a un modulador del receptor de estrógenos distinto de dicho compuesto de Fórmula I. Estos cánceres incluyen cáncer uterino, cáncer ovárico, cáncer de colon y cáncer de mama. El cáncer puede ser resistente, por ejemplo, al tamoxifeno, idoxifeno, raloxifeno o ICI 182.780. El cáncer puede ser resistente de novo al modulador del receptor de estrógenos. La resistencia al modulador del receptor de estrógenos puede ser adquirida.

En una realización del presente invento, el modulador es uno de los compuestos siguientes:

2

Como resultará claro de los Ejemplos que vienen a continuación, el GW5638 y derivados del mismo son moduladores únicos desde el punto de vista del mecanismo. Se espera que estos agentes sean superiores a, por ejemplo, el tamoxifeno como una terapia de primera línea y como agentes quimiopreventivos para cánceres estimulados por estrógenos, particularmente para el cáncer de mama, ya que carecen de actividad uterotrófica. Estos agentes no tienen la clásica actividad sobre el ER, y, por lo tanto, se prevé que no inducirán resistencia hasta el mismo grado que los compuestos actuales. Además, estos agentes pueden ser usados para tratar a pacientes que responden mal a otros moduladores del receptor de estrógenos, incluyendo el tamoxifeno, idoxifeno, raloxifeno e ICI 182.780, así como a aquellos que inicialmente responden bien a dichos moduladores pero posteriormente dejan de hacerlo. A la vista de la excepcionalidad de los presentes agentes en cuanto al mecanismo, se prevé que su uso no dará lugar a efectos secundarios negativos, tal como la trombosis de venas profundas.

A causa del mecanismo único de acción de los moduladores presentes, también se contempla su uso como componente de un "cóctel" terapéutico, particularmente para el tratamiento del cáncer de mama. A este respecto, los moduladores presentes pueden ser utilizados en combinación con uno o más de un antiestrógeno, un ligando del receptor del ácido retinoico o del receptor X de retinoides, una antiprogestina tal como RU486, un antiandrógeno tal como casodex o flutamida, vitamina D (o un metabolito de la misma), un inhibidor de la farnesil transferasa, un agonista de PPAR alfa o gamma y un inhibidor de MAP cinasa.

Como se indicó anteriormente, el invento incluye el uso de los presentes moduladores en la profilaxis así como en el tratamiento de enfermedades o síntomas establecidos. La cantidad de modulador necesaria para el uso variará con el estado (enfermedad/trastorno) y con la edad y la salud del paciente, y finalmente dependerá del juicio del médico encargado (o del veterinario en el caso de aplicaciones veterinarias). Sin embargo, en general, las dosis empleadas para el tratamiento de seres humanos adultos estarán típicamente en el intervalo de 0,001 mg/kg a 100 mg/kg al día. La dosis deseada puede ser convenientemente presentada en una sola dosis o como dosis divididas administradas a intervalos apropiados, tal como, por ejemplo, dos, tres, cuatro o más subdosis al día.

También se describen composiciones farmacéuticas que comprenden el modulador anteriormente descrito, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables y, opcionalmente, otros ingredientes terapéuticos y/o profilácticos, incluyendo los anteriormente descritos.

Las formulaciones del presente invento pueden ser administradas de manera estándar para el tratamiento de las enfermedades/trastornos indicados, tal como oral, parenteral, sublingual, transdérmica o rectalmente, por inhalación o mediante administración por vía bucal. Para administración bucal, la composición puede tener la forma (por ejemplo, una forma unitaria de dosificación) de una tableta o pastilla formulada de un modo convencional. Por ejemplo, las tabletas y cápsulas para administración oral pueden contener excipientes convencionales tales como agentes aglutinantes, cargas, lubricantes, agentes disgregantes y agentes humectantes. Las tabletas pueden ser revestidas de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica.

Alternativamente, los moduladores del presente invento pueden ser incorporados a preparaciones líquidas orales tales como suspensiones, disoluciones, emulsiones, jarabes o elixires acuosos u oleosos. Además, las formulaciones que contienen estos moduladores pueden ser presentadas en forma de un producto seco para constitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso. Dichas preparaciones líquidas pueden contener aditivos convencionales tales como agentes suspendedores, agentes emulsivos, conservantes y vehículos no acuosos.

Dichas preparaciones pueden ser también formuladas en forma de supositorios que, por ejemplo, contienen bases convencionales para supositorios, tales como manteca de cacao u otros glicéridos. Las composiciones para inhalación pueden ser típicamente proporcionadas en forma de una disolución, suspensión o emulsión que puede ser administrada en forma de polvo seco o en forma de aerosol utilizando un propulsor convencional tal como diclorodifluorometano o triclorofluorometano. Las formulaciones transdérmicas típicas comprenden vehículos acuosos o no acuosos convencionales, tales como cremas, ungüentos, lociones o pastas, o están en forma de un emplasto, parche o membrana medicinal.

Adicionalmente, las composiciones del presente invento pueden ser formuladas para administración parenteral por inyección o por infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden tener formas tales como suspensiones, disoluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes suspendedores, estabilizadores y/o dispersivos. Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para constitución con un vehículo adecuado (por ejemplo, agua estéril y exenta de pirógenos) antes de su uso.

La composición de acuerdo con el invento puede ser también formulada como una preparación para depósito. Dichas formulaciones de acción prolongada pueden ser administradas por implantación (por ejemplo, subcutánea o intramuscularmente) o por inyección intramuscular. En consecuencia, los moduladores del invento pueden ser formulados con materiales polímeros o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable), o resinas de intercambio iónico, o como derivados poco solubles o como una sal poco soluble, por ejemplo.

En los Ejemplos que vienen a continuación se describen con mayor detalle ciertos aspectos del presente invento.

Ejemplos

En los Ejemplos específicos que aparecen más adelante se hace referencia a los siguientes detalles experimentales.

Productos bioquímicos

El DNA y las enzimas de modificación se obtuvieron de Boehringer Mannheim (Indianápolis, Indiana, EE.UU.), New England Biolabs (Beverly, Massachusetts, EE.UU.) o Promega Corp. (Madison, Wisconsin, EE.UU.). Los reactivos de laboratorio generales y el 17\beta-estradiol (E_{2}) fueron adquiridos a Sigma (St. Louis, Missouri, EE.UU.). ICI 182.780 fue un obsequio de Zeneca Pharmaceuticals, Macclesfield, Reino Unido. El raloxifeno fue un obsequio de Pfizer Pharmaceuticals, Groton, Connecticut (EE.UU.). El 4-OH-tamoxifeno fue un obsequio de Ligand Pharmaceuticals (San Diego, California, EE.UU.). GW5638 y GW7604 fueron preparados del modo previamente descrito [Willson et al., J. Med. Chem. 37: 1550-1552 (1994)]. El anticuerpo H222 es asequible de Abbott Laboratories.

Ensayos de cultivo celular y cotransfección

Se mantuvieron células HepG2 en medio Eagles modificado (MEM; Life Technologies, Grand Island, New York, EE.UU.) más suero de ternera fetal (FCS; del inglés, fetal calf serum) (Life Technologies) al 10%. Se sembraron las células en placas de 24 pocillos (revestidos con gelatina) 24 horas antes de la transfección. Se introdujo DNA en las células usando Lipofectin (Life Technologies). En pocas palabras, se llevaron a cabo transfecciones por triplicado usando 3 \mug de DNA total. Para transfecciones estándares, se usaron 500 ng de pCMV-\beta-Gal (vector de normalización), 1500 ng de informador (variable) y 1000 ng de receptor [pRST7-hER (Dana et al., Mol. Endocrinol. 8: 1193-1207, 1994)] para cada triplicado. Se desarrolló la incubación de las células con Lipofectin durante 3 horas, tras las cuales se separó el medio, se lavaron las células con disolución salina tamponada con fosfato (PBS; del inglés, phosphate buffered saline) y luego se realizó una inducción con la apropiada hormona diluida en medio exento de rojo fenol que contenía CS al 10% aligerado con carbón vegetal (Cyclone Inc.). La incubación con la hormona continuó durante 48 horas, tras las cuales las células fueron lisadas y fueron analizadas en cuanto a actividades luciferasa y \beta-galactosidasa de la manera previamente descrita [Norris et al., JBC 270: 22.777-22.782 (1995)].

Ensayo uterotrófico en ratas inmaduras

Se obtuvieron hembras de rata Sprague-Dawley (30-35 gramos) de veintiún días de edad de Harlan o Taconic Laboratories. Se distribuyeron aleatoriamente los animales en grupos de tratamiento de cinco y se registraron los pesos medios en cada grupo de tratamiento. Los pesos se registraron cada día de tratamiento. Se preparó GW5638 o tamoxifeno en EtOH al 100% como una disolución madre 10x y se almacenó a -70ºC hasta el día de la administración de las dosis. El día de la administración, el fármaco fue diluido en metilcelulosa al 0,5%; viscosidad del 2% a 25ºC: 0,4 Pa\cdots (Sigma, St. Louis, Missouri, EE.UU.). La administración oral por sonda gástrica se basó en un volumen total de 10 ml/kg de peso corporal. Se preparó estradiol (Sigma, St. Louis, Missouri, EE.UU.) en aceite de sésamo, se mezcló en un homogeneizador de vidrio (disuelto o en suspensión), y se prepararon partes alícuotas y se congelaron a -70ºC hasta la administración. La administración subcutánea se basó en un total de 2 ml/kg de peso corporal. Los animales recibieron GW5638 (sonda gástrica) o estradiol (inyección) durante 3 días. El día 4, se sacrificaron los animales mediante asfixia por CO_{2}, se obtuvieron los pesos corporales y se extirparon, secaron con material absorbente y pesaron los úteros. Los datos se expresaron como peso uterino/peso corporal.

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Ejemplo 1

Identificación de nuevos moduladores de ER

Se ha desarrollado una serie de exploraciones in vitro que permiten la clasificación de los moduladores de ER en cuatro grupos distintos en cuanto al mecanismo [Tzukerman et al., Mol. Endocrinol. 8: 21-30 (1994)]. Específicamente, se reconstituyó un ensayo en células HepG2 de hígado mediante el cual se evalúa la capacidad de un compuesto para regular la actividad transcripcional del promotor del componente 3 del complemento (C3), sensible a estrógenos, en presencia de ER de tipo silvestre (ERwt) o de un receptor mutante, ER-TAF-1, en el que se ha destruido la función de AF-2. Utilizando estos ensayos, ha sido posible obtener "huellas dactilares" de moduladores de ER conocidos [McDonell et al., Mol. Endocrinol. 9: 659-669 (1995)]. Aunque estos ensayos no reflejan exactamente el ambiente de ER in vivo, la actuación de los compuestos en estos ensayos basta para repartirlos en grupos, cada uno de los cuales manifiesta unas actividades únicas in vivo.

Se sintetizó una serie de ligandos de ER derivados de trifeniletileno [Willson et al., J. Med. Chem. 37: 1550-1552 (1994)]. El análisis preliminar de estos compuestos in vivo indicó que las actividades relativas de estos compuestos en el hueso y en el útero no eran idénticas, lo que reflejaba posibles diferencias en cuanto al mecanismo [Willson et al., J. Med. Chem. 37: 1550-1552 (1994)]. En consecuencia, se llevó a cabo un ensayo ciego de estos compuestos sobre Erwt en células HepG2, sobre el promotor de C3, y se determinó que todos los compuestos salvo dos eran indistinguibles del tamoxifeno en cuanto al mecanismo. Sin embargo, dos compuestos, GW5638 y GW7604, presentaban en este sistema un perfil suficientemente diferente del de otros ligandos de ER para justificar una investigación ulterior. Es interesante reseñar que estos compuestos son estructuralmente idénticos entre sí salvo GW7604, que es la versión 4-hidroxilada de GW5638 (Tabla 1). Utilizando un ensayo de unión competitiva de radioligandos in vitro, se demostró que ambos compuestos presentaban interacciones de alta afinidad con ER. Específicamente, GW5638 y GW7604 presentaban valores de K_{i} de 50,4 nM (\pm 5,4) y 15,5 nm (\pm 1,4), respectivamente. Se mostró que, bajo las mismas condiciones, el 17-\beta-estradiol tenía un valor de K_{i} de 6,3 nM (\pm 0,4). Aunque no se ha estudiado el metabolismo de GW5638, es probable que se convierta in vivo en el compuesto de mayor afinidad GW7604 del mismo modo que el tamoxifeno se convierte en el metabolito de mayor afinidad 4-OH-tamoxifeno [Jordan et al., J. Endocrinology 75: 305-316 (1977)]. En la Figura 1A se muestra una comparación de la actividad agonista de estos compuestos con respecto a la de miembros representativos de cada uno de los cuatro grupos establecidos de ligandos de ER. En este ensayo, el tamoxifeno actúa como un agonista parcial de ER cuando se ensaya sobre el promotor de C3, alcanzando el 45% de la eficacia del estradiol. Cuando se analiza del mismo modo, el raloxifeno y el antagonista puro ICI 182.780 no muestran actividad agonista aunque inhiben la actividad transcripcional basal del promotor de C3. Se ha determinado recientemente que la actividad basal del promotor de C3 depende de ER, aunque es independiente del ligando [Norris et al., Molecular Endocrinology 10: 1605-1616 (1996)]. Puesto que tanto el raloxifeno como ICI 182.780 inhiben las activaciones de ER dependientes e independientes del ligando, parece que actúan como "agonistas inversos" en este ambiente. Sin embargo, tanto GW5638 como su supuesto metabolito GW7604 no muestran ninguna actividad agonista ni antagonista sobre este promotor, presentando una "huella dactilar" previamente no reconocida. Se concluyó que, en un ambiente en que el tamoxifeno presenta actividad agonista parcial, los compuestos GW5638 y GW7604, análogos al tamoxifeno, son funcionalmente inactivos.

Aunque el raloxifeno e ICI 182.780 actúan análogamente sobre ERwt, son distintos en cuanto al mecanismo [McDonnell et al., Mol. Endocrinol. 9: 659-669 (1995); Dauvois et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4037-4041 (1992); Dauvois et al., J. Cell. Sci. 106: 1377-1388 (1993)]. Cuando se ensaya sobre un ER mutante (ER-TAF1), en el que se ha alterado la secuencia de activación de AF-2, el raloxifeno actúa como el tamoxifeno, presentando el 40% de la actividad agonista del estradiol (Figura 1B). En este ensayo, ICI 182.780, GW5638 y GW7604 son funcionalmente inactivos. Estos datos indican que GW5638 (y GW7604) actúan de un modo que es distinto del de las clases previamente definidas de agonistas y antagonistas mixtos de ER [McDonnell et al., Mol. Endocrinol. 9: 659-669 (1995)].

Una explicación posible, aunque improbable, de estos resultados iniciales es que los compuestos fueron metabolizados (o que de algún modo se evitó que se unieran al receptor), lo que explicaría su inactividad en este ensayo. Esta cuestión fue abordada evaluando la capacidad de GW5638 y GW7604 para inhibir la actividad agonista que presentan el estradiol y el tamoxifeno sobre ERwt y ER-TAF1, respectivamente, y para invertir la actividad agonista inversa de ICI 182.780. Como se muestra en la Figura 2A, el estradiol actuaba como un agonista completo y el tamoxifeno actuaba como un agonista parcial sobre ERwt cuando se ensayaban sobre el promotor de C3 en células HepG2. Es importante reseñar que la actividad agonista mostrada por el tamoxifeno o el estradiol era inhibida tanto por GW7604 como por GW5638. De esta manera, estos compuestos estaban actuando como antagonistas sobre el receptor de una manera distinta a la del tamoxifeno. Se llevó a cabo un análisis similar utilizando ER-TAF1 en vez de ERwt (Figura 2B). Como se esperaba, tanto GW5638 como GW7604 eran capaces de inhibir la actividad transcripcional de ER-TAF1 inducida por estradiol y tamoxifeno. Es interesante reseñar que el raloxifeno presenta una actividad agonista parcial sobre ER-TAF1 (Figura 1B), actividad que es inhibida tanto por GW5638 como por GW7604. Acumuladamente, estos datos indican que GW5638 y su supuesto metabolito in vivo, GW7604, son moduladores de ER únicos en cuanto al mecanismo, que no presentan actividad agonista in vitro pero pueden inhibir la actividad agonista del estradiol, el tamoxifeno y el raloxifeno. Aunque sus perfiles se parecen al de la clase antagonista pura de ligandos en algunos de estos ensayos, estos compuestos son distintos de los antagonistas esteroides como el ICI 182.780, ya que no presentan actividad agonista inversa (Figura 1A).

Con objeto de confirmar que GW5638 y GW7604 son distintos de ICI 182.780 en cuanto al mecanismo, se midió la capacidad de estos compuestos para invertir la actividad agonista inversa mostrada por ICI 182.780. En la Figura 2C se muestran los resultados de este análisis. Específicamente, se observó que la actividad basal del promotor de C3 humano resultaba suprimida por un factor de 10 veces tras la adición de ICI 182.780 y que esto podía ser completamente invertido por la adición conjunta de GW7604 y parcialmente invertido por GW5638.

Una posible explicación de las diferencias observadas en cuanto al mecanismo es que GW5638 y GW7604 interaccionan con ER e inhiben su capacidad para interaccionar con DNA. Esto fue abordado usando un ER modificado (ER-VP16) para que informara sobre la localización nuclear y el estatus ligante de DNA del ER dentro de una célula después de la unión del ligando. Esta proteína modificada actúa exactamente como ER en todos los aspectos salvo en que activa la transcripción tras la interacción con un elemento de respuesta a estrógenos (ERE) independiente de la naturaleza del ligando unido [McDonell et al., Mol. Endocrinol. 9: 659-669 (1995)]. Utilizando este reactivo, se mostró que todas las clases de ligandos de ER, incluyendo ICI 182.780, GW5638 y GW7604, facilitan unas interacciones eficaces de ER con el DNA diana [McDonell et al., Mol. Endocrinol. 9: 659-669 (1995)].

De este modo, GW5638 y GW7604 interaccionan con ER in vivo y muestran una farmacología que es distinta de la de otros moduladores de ER conocidos. Por lo tanto, significa que las propiedades únicas de GW5638 y GW7604 se manifiestan en alguna fase aguas abajo de la unión al DNA. A causa de las propiedades únicas de estos compuestos, se inició una serie de estudios con animales completos para examinar su actividad en los sistemas esquelético, cardiovascular y reproductor.

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Ejemplo 2

GW5638 como un modulador de ER de salvaguardia uterina

Para ampliar el examen de la especificidad tisular de GW5638, se llevó a cabo un extenso análisis de la actividad uterotrófica de este compuesto. En la serie inicial de experimentos, se compararon las actividades de GW5638 y tamoxifeno en los úteros de ratas inmaduras de 21 días de edad. En este ensayo, se utilizó el peso uterino en estado húmedo como una medida de la actividad agonista de ER en este tejido (Figura 5). Cuando se administró oralmente, como un único agente, GW5638 no presentaba ninguna actividad significativa con respecto al testigo. Adviértase en particular que este compuesto es inactivo en este ensayo con 10 \mum/kg/d, tres veces la cantidad requerida para una protección ósea (Figura 3). Por contraste, el tamoxifeno mostraba actividad uterotrófica en dosis tan bajas como 0,1 micromoles/kg/d. Se ampliaron estos estudios para mostrar que el GW5638, pero no el tamoxifeno, podía inhibir completamente la actividad agonista del estradiol en estas ratas, lo que confirmaba que este compuesto es un antagonista puro en este tejido bajo las condiciones del ensayo.

En la segunda serie de experimentos, se evaluó la actividad uterotrófica en ratas sometidas a ovariectomía (OVX) de 90 días de edad después de tratamientos de 28 días con GW5638 o estradiol. Los resultados de este análisis, mostrados en la Figura 6A, indican que en dosis de hasta tres veces la requerida para una protección ósea, GW5638 presenta una actividad uterotrófica mínima. Sin embargo, es importante reseñar que no se advirtieron diferencias significativas en el peso corporal total de las ratas OVX tratadas con GW5638 frente al de los animales simuladamente operados. Se observó un pequeñísimo aumento, independiente de la dosis, en el peso uterino en estado húmedo con respecto a la VHX. Esto es similar a lo que ha sido comunicado por otros investigadores en ratas tratadas con raloxifeno, en las que la actividad se ha atribuido a un aumento de la absorción de agua [Kedar et al., Lancet 343: 1318-1321 (1994); Love et al., Ann. Intern. Med. 115: 860-864 (1991); Black et al., J. Clin. Invest. 93: 63-69 (1994)].

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Además de las mediciones del peso uterino en estado húmedo, se llevó a cabo un examen histológico de los úteros recogidos de los mismos animales [Figuras 7A-7F (bajo aumento) y Figuras 8A-8D (alto aumento)]. En este análisis las células epiteliales uterinas de las ratas tratadas con GW5638 presentaban una hipertrofia relacionada con la dosis, mientras que el estroma presentaba un aumento marginal de tejido conjuntivo intercelular y de matriz extracelular amorfa. Con las dosis máximas de GW5638 (3 veces mayores que las requeridas para una protección ósea), la hipertrofia epitelial observada era comparable a la de los úteros tratados con estradiol, mientras que la respuesta estromal y la infiltración eosinófila eran menores que las observadas en las ratas tratadas con estradiol (compárense las Figuras 8C y 8D). Acumuladamente, estos datos indican que GW5638 posee actividad agonista de ER marginal en el útero, mientras que, en el hueso, actúa como un agonista de ER. Por lo tanto, GW5638 es un modulador de ER único que presenta actividad agonista y antagonista de ER de un modo tisularmente selectivo.

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Ejemplo 3

Efecto del tratamiento con antiestrógenos sobre tumores de cáncer de mama en ratones inmunodeprimidos

Este estudio fue llevado a cabo utilizando células tumorales procedentes de la línea de cáncer de mama MCF-7. Esta línea es positiva para el receptor de estrógenos y progesterona, dependiente de la hormona y sensible a antihormonas. Se inocularon las células tumorales en la ijada de ratones BALB/c Urd nunu atímicos y sometidos a ovariectomía. Los ratones fueron complementados con glóbulos de estrógenos de liberación lenta. Se administraron diariamente inyecciones subcutáneas a los animales, del modo indicado a continuación:

Grupo 1:: testigo (aceite de maíz)

Grupo 2:: 0,3 mg de GW5638

Grupo 3:: 0,6 mg de GW5638

Grupo 4:: 1,0 mg de GW5638

Grupo 5:: 1,0 mg de tamoxifeno

Usando un compás, se midieron los tumores en dos dimensiones, siendo el área del tumor = 1/2 X w/2 X \pi. Los resultados se muestran en la Figura 9.

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Ejemplo 4

Estudio de dosis-respuesta

La finalidad de este estudio era comparar la dosis máximamente eficaz de GW5638 con respecto a la del tamoxifeno en términos de capacidad para inhibir el crecimiento de tumores de cáncer de mama MCF-7 en ratones inmunodeprimidos.

Se inyectaron 5 millones de células MCF-7 a 10 ratones donantes OVX. Los tumores resultantes fueron trasplantados a ratones receptores. A todos los animales se les administraron glóbulos de estradiol de liberación lenta.

Una vez que los ratones experimentales tuvieron tumores mensurables, se comenzó la administración diaria por medio de inyecciones subcutáneas de 0,1 ml de la forma siguiente:

Grupo 1:: testigo (aceite de maíz)

Grupo 2:: 0,3 mg de GW5638

Grupo 3:: 0,6 mg de GW5638

Grupo 4:: 1,0 mg de GW5638

Grupo 5:: 1,0 mg de tamoxifeno

Se midieron diariamente los tumores con un compás y se calculó el área del modo siguiente:

Área = 1/2 X w/2 X \pi

Después de 8 semanas, se comparó el crecimiento tumoral entre los grupos. Todos los grupos de tratamiento presentaban crecimiento tumoral (con significación estadística) en comparación con el testigo. Las dos dosis superiores de GW5638, 0,6 mg y 1,0 mg, eran indistinguibles de los 1,0 mg de tamoxifeno (véase la Figura 10).

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Ejemplo 5

Estudio con LCC2

MCF-7/LCC2 es una línea celular (del Lombardi Cancer Center) que es independiente de estrógenos, aunque sensible, y resistente al tamoxifeno. Este experimento se llevó a cabo para determinar la capacidad de GW5638 para retrasar el crecimiento de esta línea celular en ratones inmunodeprimidos con respecto a tumores tratados con testigo o con tamoxifeno.

Se prepararon 40 ratones OVX para que aceptaran células y se agruparon del modo siguiente:

Grupo 1:: testigo

Grupo 2:: glóbulo de estrógenos

Grupo 3:: 1,0 mg de tamoxifeno

Grupo 4:: 1,0 mg de compuesto 5638

Los animales testigo no recibieron nada y los grupos 3 y 4 recibieron inyecciones de 0,1 ml en aceite de maíz cada tres días. Se midieron los tumores cada 3 días con un compás y se calculó el área del modo siguiente:

Área = 1/2 X w/2 X \pi

Después de 8 semanas, se comparó el crecimiento tumoral entre los grupos. Por contraste con lo que se esperaba, no parecía que el tumor fuera sensible al estrógeno. Además, el tumor parecía sensible al tamoxifeno a pesar de su predicha resistencia al tamoxifeno. Tanto el tamoxifeno como el GW5638 eran capaces de inhibir igualmente el crecimiento de este tumor (véase la Figura 11).

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Ejemplo 6

GW7604 actúa como un antiestrógeno en células de cáncer de mama MCF-7

Se cotransfectaron transitoriamente células MCF-7 de cáncer de mama humano con 0,9 \mug/ml de vector de expresión de ER humano junto con 2 \mug/ml del plásmido informador C3-Luc y 0,1 \mug/ml del vector de expresión pRSV-\beta-galactosidasa (como un testigo interno para la eficacia de la transfección). Tras la transfección, se incubaron las células durante 48 horas en presencia de 17-\beta-estradiol y concentraciones crecientes de cada antagonista, según se indica. Posteriormente, las células transfectadas se analizaron en cuanto a actividades luciferasa y \beta-galactosidasa. La actividad luciferasa normalizada se calculó dividiendo la actividad luciferasa bruta (x 10^{4} U) en cada punto por la actividad \beta-galactosidasa [(A_{415} x 10^{5})/tiempo en minutos]. Con referencia a la Figura 12, cada punto de datos de este experimento representa la media de determinaciones por triplicado de la actividad transcripcional bajo las condiciones experimentales dadas. El coeficiente de variación medio para cada concentración de hormona fue < 10%.

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Ejemplo 7

Un análisis del efecto de mutaciones de ER específicas sobre la farmacología de antiestrógenos revela una complejidad adicional en el mecanismo

Se transfectaron transitoriamente células HepG2 de carcinoma hepatocelular humano con 0,9 \mug/ml de un vector que expresaba ER humano (pRST7ER; véase la Figura 13A) o un ER mutante (ER-TAF1; véase la Figura 13B) en el que se había inactivado la función de AF-2 (ER-TAF1), junto con 2 \mug/ml del promotor del componente 3 del complemento (C3), sensible a estrógenos, fusionado con el gen de la luciferasa; y 0,1 \mug/ml del vector de expresión pRSV-\beta-galactosidasa (como un testigo interno para la eficacia de la transfección). Tras la transfección, se incubaron las células durante 48 horas en presencia de disolvente solo o de concentraciones crecientes de estradiol o antiestrógenos, según se indica. Posteriormente, las células transfectadas fueron analizadas en cuanto a actividades luciferasa y \beta-galactosidasa. Cada punto de datos de este experimento representa la media de determinaciones por triplicado de la actividad transcripcional bajo las condiciones experimentales dadas. El coeficiente de variación medio para cada concentración de hormona fue < 10%. Los datos mostrados en las Figuras 13A y 13B indican que la mayoría de los antiestrógenos conocidos presentan actividad agonista sobre receptores mutados de estrógenos. El hecho de que GW7604 no presente actividad agonista sobre ningún ER mutante examinado indica en cierta medida que este compuesto es útil en el tratamiento de tumores de mama refractarios al tamoxifeno.

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Ejemplo 8

Un análisis comparativo de la capacidad de una diversidad de antiestrógenos para inhibir la actividad transcripcional de ER\alpha y ER\beta

Se transfectaron células HeLa con un vector de expresión de ER\alpha (véase la Figura 14A) o un vector de expresión de ER\beta (véase la Figura 14B) junto con una construcción informadora de ERE-TK-luciferasa sensible a estrógenos. Posteriormente se evaluó la capacidad de diferentes concentraciones de antagonista para inhibir la transcripción activada por estradiol (10^{-9}). Los resultados mostrados en las Figuras 14A y 14B indican que, con la excepción del idoxifeno, todos los antiestrógenos presentan actividades más o menos equivalentes sobre ER\alpha, mientras que, sobre ER\beta, ni el raloxifeno ni el idoxifeno presentan una actividad antagonista potente. Además, estos datos indican que GW7604 es un potente antagonista total de ambas formas del receptor de estrógenos humano.

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Ejemplo 9

Análisis de la expresión de ER en células diana, por inmunotransferencia Western, después de un tratamiento con agonistas o antagonistas

Las líneas celulares elegidas se incubaron durante 48 horas en presencia de disolvente o de estradiol o antiestrógeno 10 nM, según se indica. Se prepararon extractos nucleares, se sometieron las muestras a separación por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE; del inglés, polyacrylamide gel electrophoresis) bajo condiciones desnaturalizantes y a transferencia a una membrana de nailon, y se estimó la expresión relativa de ER después de estos tratamientos mediante inmunotransferencia Western usando el anticuerpo monoclonal H222, específico de ER. En la Figura 15A se muestra el contenido de ER nuclear endógeno de células MCF-7 (10 \mug/carril). En la Figura 15B se muestra el contenido de ER nuclear endógeno de células Ishikawa (100 \mug/carril). La Figura 15C se refiere a células Ishikawa transitoriamente transfectadas con 0,9 \mug/ml de ER (pRST7ER); para la detección se usaron 10 \mug de extracto nuclear/carril. Los niveles de ER se cuantificaron por densitometría de las inmunotransferencias. Los resultados mostrados en las Figuras 15A-15C son representativos de múltiples experimentos llevados a cabo bajo las mismas condiciones.

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Ejemplo 10

Análisis de la expresión de ER endógeno en células MCF-7, por inmunotransferencia Western, después de tratamientos de corta duración con agonistas o antagonistas

Se indujeron células MCF-7 de cáncer de mama humano durante 1 hora (Figura 16A) o 4 horas (Figura 16B) en presencia de disolvente o de estradiol o antiestrógeno 10 nM, según se indica. Se prepararon extractos nucleares, se sometieron las muestras a separación por PAGE desnaturalizante y a transferencia a una membrana de nailon, y se estimó la expresión relativa de ER después de estos tratamientos mediante inmunotransferencia Western usando el anticuerpo monoclonal H222, específico de ER. Los niveles de ER se cuantificaron por densitometría de las inmunotransferencias. Los resultados mostrados en las Figuras 16A y 16B son representativos de múltiples experimentos llevados a cabo bajo las mismas condiciones.

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Ejemplo 11

Análisis de la expresión de ER endógeno en células Ishikawa (células uterinas en cultivo), por inmunotransferencia Western, después de tratamientos de corta duración con agonistas o antagonistas

Se incubaron células Ishikawa de adenocarcinoma endometrial humano durante 1 hora (Figura 17A) o 4 horas (Figura 17B) en presencia de disolvente o de estradiol o antiestrógeno 10 nM, según se indica. Se prepararon extractos nucleares, se sometieron las muestras a separación por PAGE desnaturalizante y a transferencia a una membrana de nailon, y se estimó la expresión relativa de ER después de estos tratamientos mediante inmunotransferencia Western usando el anticuerpo monoclonal H222, específico de ER. Los niveles de ER se cuantificaron por densitometría de las inmunotransferencias. Los resultados mostrados en las Figuras 17A y 17B son representativos de múltiples experimentos llevados a cabo bajo las mismas condiciones.

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Ejemplo 12

Análisis de la expresión de ER endógeno nuclear, citoplásmico y de célula completa en células Ishikawa, por inmunotransferencia Western, después de tratamientos de corta duración con agonistas o antagonistas

Se indujeron células Ishikawa de adenocarcinoma endometrial humano durante 1 hora en presencia de disolvente o de estradiol o antiestrógeno 10 nM. Se prepararon extractos de célula completa (Figura 18A), nucleares (Figura 18B) y citoplásmicos (Figura 18C), se sometieron las muestras a separación por PAGE desnaturalizante y a transferencia a una membrana de nailon, y se estimó la expresión relativa de ER después del tratamiento mediante inmunotransferencia Western usando el anticuerpo monoclonal H222, específico de ER. Los niveles de ER se cuantificaron por densitometría de las inmunotransferencias. Los resultados mostrados en las Figuras 18A-18C son representativos de múltiples experimentos llevados a cabo bajo las mismas condiciones.

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Ejemplo 13

GW7604 inhibe la proliferación de células MCF-7 estimulada por E2

Finalidad: Determinar la capacidad de GW5638 para inhibir la proliferación celular, estimulada por estrógenos, del cáncer de mama MCF-7 in vivo.

Diseño experimental: Se siembran entre 25.000 y 50.000 células por pocillo en placas de 24 pocillos. Las células se siembran en medio exento de rojo fenol. Después de la fijación, las células son estimuladas con antiestrógeno solo o con estrógeno y antiestrógeno. El tiempo de inducción varía de 12 a 48 horas dependiendo del experimento.

Se añaden 4 \lambda (148 kBq) de [metil-^{3}H]-timidina a cada pocillo.

Se incuba a 37ºC durante 2-4 horas.

Se aspira el medio y se lava dos veces con PBS enfriado con hielo.

Se lava una vez con ácido tricloroacético (TCA) al 10%, enfriado con hielo.

Se añaden 2 ml de TCA al 10% a cada pocillo.

Se incuba a 4ºC durante 1-2 horas.

Se lava una vez con TCA.

Se añade 1 ml de NaOH 0,2 N.

Se transfiere el contenido de cada pocillo a un vial para centelleo que contiene 2 ml de líquido de centelleo.

Se revuelve y se cuenta [^{3}H].

Los resultados indicarán la capacidad de los diversos compuestos para inhibir la proliferación de células basales e inducida por estrógenos, de células MCF-7.

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(Tabla pasa a página siguiente)

3

Claims

1. Un compuesto de fórmula I:

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4

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en la que

\quad: R^{1} es -(CH_{2})_{n}CR^{5}=CR^{6}R^{7};

\quad: R^{4} es -CN, -NO_{2}, -CH_{3}, -CH_{2}CH_{3}, -CH_{2}CH_{2}-Y o -Y;

\quad: R^{7} es -C(O)OR^{12};

\quad: R^{12} es H;

\quad: X es oxígeno o azufre;

\quad: Y es un halógeno; y

\quad: n es un número entero seleccionado entre 0, 1 y 2;

2. Un compuesto de acuerdo con la Reivindicación 1, en que dicho cáncer es cáncer de mama, cáncer uterino, cáncer ovárico o cáncer de colon.

3. Un compuesto de acuerdo con la Reivindicación 2, en que dicho cáncer es cáncer de mama.

4. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3, en que dicho cáncer es resistente al tamoxifeno, idoxifeno, raloxifeno o ICI 182.780.

5. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4, en que dicho cáncer es resistente de novo a dicho modulador del receptor de estrógenos.

6. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4, en que dicha resistencia a dicho modulador del receptor de estrógenos es adquirida.

7. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 6, que es para uso en combinación con uno o más de un antiestrógeno, un ligando del receptor del ácido retinoico o del receptor X de retinoides, una antiprogestina, un antiandrógeno, vitamina D o un metabolito de la misma, un inhibidor de la farnesil transferasa, un agonista de PPAR alfa o gamma y un inhibidor de MAP cinasa.

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8. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 7, en que dicho compuesto es

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