MXPA00001605A - Un metodo para prevenir o tratar enfermedades y desordenes dependientes de estrogeno - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a tratamiento de enfermedades y desórdenes dependientes de estrógeno, y en particular, a un método para el tratamiento de cánceres dependientes de estrógeno, particularmente cáncer del pecho, con antiestrógenos.

Description

UN MÉTODO PARA PREVENIR O TRATAR ENFERMEDADES Y DESORDENES DEPENDIENTES DE ESTROGENO CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere, en general, al tratamiento de enfermedades y desórdenes dependientes de estrógeno, y en particular, a un método para el tratamiento de cánceres dependientes del estrógeno, particularmente cáncer del pecho, con antiestrógenos. ANTECEDENTES El receptor de estrógeno humano (ER) es un miembro de la superfamilia de receptores nucleares de factores de transcripción (Evans, Science 240:889-895 (1988)) en ausencia de hormona, reside en el núcleo de las células objetivo en un estado transcripcionalmente inactivo. Después de enlazar el ligando, el receptor de estrógeno sufre un cambio de conformación que inicia una cascada de eventos que conducen finalmente a su asociación con regiones reguladoras especificas adentro de los genes objetivo (O'Malley y colaboradores, Hormone Research 47:1-26 (1991)) . El siguiente efecto sobre la transcripción es influenciado por el contexto de la célula y el promotor del receptor enlazado con el ADN (Tora y colaboradores, Cell 59:477-487 (1989); Tasset y colaboradores, Cell 62:1177-1187 (1990); McDonnell y colaboradores, Mol. Endocrinol. 9:659-669 (1995); Tzukerman y colaboradores, Mol. Endocrinol. 8:21-30 (1994) ) . Es de esta manera que el agonista de receptor de estrógeno fisiológico, el estradiol, ejerce su actividad biológica en los sistemas reproductor, esquelético, y cardiovascular (Clark y Peck, Female Sex Steroids : Receptors and Functions (editores) Monographs on Endocrinology, Springer-Verlag, Nueva York (1979) ; Chow y colaboradores, J. Clin. Invest. 89:74-78 (1992); Eaker y colaboradores, Circulation 88:1999-2009 (1993) ) . En adición a estas actividades, se ha demostrado que el estrógeno funciona como un mitógeno en la mayoría de las células de cáncer de pecho con receptor de estrógeno positivo. Por consiguiente, los regímenes de tratamiento que incluyen antiestrógenos, compuestos sintéticos que se oponen a las acciones del estrógeno, han sido efectivos clínicamente para detener o demorar el progreso de la enfermedad (Jordán y Murphy, Endocrine Reviews 11:578-610 (1990); Parker, Breast Cáncer Res. Treat. 26:131-137 (1993)). La disponibilidad de estos moduladores sintéticos del receptor de estrógeno, y la disección subsecuente de sus mecanismos de acción, han propor-cionado discernimientos útiles sobre la acción del receptor de estrógeno. Uno de los compuestos más estudiados en este aspecto, es el tamoxifeno (Jordán y Murphy, Endocrine Reviews 11:578-610 (1990) ) . Este compuesto funciona como un antagonista en la mayoría de los tumores de pecho con receptor de estrógeno positivo, pero exhibe una actividad agonista paradójica en el hueso y el sistema cardiovascular, y una actividad agonista parcial en el útero (Kedar y colaboradores, Lancet 343:1318-1321 (1994); Love y colaboradores, New Engl. J. Med. 326:852-856 (1992); Love y colaboradores, Ann. Intern. Med. 115:860-864 (1991) ) . Por consiguiente, la actividad agonista/antagonista del complejo de receptor de estrógeno-tamoxifeno, es influenciada por el contexto celular. Esta importante observación está en la contradicción aparente con los modelos de rétención largos establecidos que sostienen que el receptor de estrógeno existe solamente en la célula en un estado activo o inactivo (Clark y Peck, Female Sex Steroids : Receptors and Functions (editores) Monographs on Endocrinology, Springer-Verlag, Nueva York (1979) ) . En su lugar, esto indica que diferentes ligandos actuando a través del mismo receptor pueden manifestar diferentes biologías en diferentes células. La definición del mecanismo de esta selectividad tiene posibilidades de avanzar en entendimiento de los procesos, tales como la resistencia al tamoxifeno, observados en la mayoría de los cánceres de pecho que contienen receptor de estrógeno, en donde están implicadas anormalidades en la señalización del receptor de estrógeno (Tonetti y Jordán, Anti-Cancer Drugs 6:498-507 (1995) ) . Utilizando un planteamiento in vi tro, se ha determi-nado el posible mecanismo para la actividad agonista/antagonista selectiva celular del tamoxifeno (Tora y colaboradores, Cell 59:477-487 (1989); Tasset y colaboradores, Cell 62:1177-1187 (1990); McDonnell y colaboradores, Mol. Endocrinol. 9:659-669 (1995); Tzukerman y colaboradores, Mol. Endocrinol. 8:21-30 (1994)) . Lo que es importante, es que se ha demostrado que el tamoxifeno induce un cambio de conformación adentro del receptor de estrógeno, que es distinto de aquél inducido por el estradiol (McDonnell y colaboradores, Mol. Endocrinol. 9:659-669 (1995) Beekman y colaboradores, Molecular Endocrinology 7:1266-1274 (1993)). Además, la determinación de las secuencias adentro del receptor de estrógeno requeridas para la actividad de transcripción, indica la manera en que estos complejos específicos de ligando-receptor son reconocidos diferencialmente por la maquinaria de transcripción celular. De una manera específica, se ha demostrado que el receptor de estrógeno contiene dos dominios de activación, FA-1 (Función de Activación-1) y FA-2, que permite su interacción con el aparato de transcripción. La contribución relativa de estas Funciones de Activación a la eficacia global del receptor de estrógeno difiere de célula a célula (Tora y colaboradores, Cell 59:477-487 (1989); McDonnell y colaboradores, Mol. Endocrinol. 9:659-669 (1995); Tzukerman y colaboradores, Mol. Endocrinol. 8:21-30 (1994)) . Se determinó que el estradiol funciona como un agonista tanto de FA-1 como de FA-2, en que exhibió una actividad máxima, independientemente de cuál Función de Activación era dominante en un medio ambiente celular dado. Por otra parte, el tamoxifeno funciona como un antagonista de FA-2, inhibiendo la actividad del receptor de estrógeno en las células en donde se requiere el FA-2, o es el activador dominante (Tora y colaboradores, Cell 59:477-487 (1989); McDonnell y colaboradores, Mol. Endocrinol. 9:659-669 (1995); Tzukerman y colaboradores, Mol. Endocrinol. 8:21-30 (1994) ) . Inversamente, el tamoxifeno funciona como un agonista cuando se requiere solamente el FA-1, (McDonnell y colaboradores, Mol. Endocrinol. 9:659-669 (1995); Tzukerman y colaboradores, Mol. Endocrinol. 8:21-30 (1994)) . Subsecuentemente, basándose en su actividad relativa de FA-l/FA-2, se definieron cuatro grupos mecánicamente distintos de moduladores de receptor de estrógeno; los agonistas totales (es decir, estradiol) , dos clases distintas de agonistas parciales, representados por tamoxifeno y raloxifeno y los antagonistas puros, de los cuales ICI182, 780 es un miembro representativo (McDonnell y colaboradores, Mol. Endocrinol. 9:659-669 (1995); Tzukerman y colaboradores, Mol. Endocrinol. 8:21-30 (1994)). Estos resultados proporcionan una explicación mecánica para las diferencias observadas en las actividades biológicas de algunos moduladores del receptor de estrógeno, e indican que el mecanismo mediante el cual opera el receptor de estrógeno en diferentes tejidos no es idéntico. Es interesante que la actividad agonista exhibida por los moduladores del receptor de estrógeno, tales como estrógeno y tamoxifeno, en estos sistemas in vi tro refleja su actividad en los tractos reproductores de animales íntegros. Sin embargo, esta correlación no se extiende al hueso, en donde el estradiol, el tamoxifeno, y el raloxifeno, que exhiben diferentes grados de actividad agonista de FA-l/FA-2, protegen todos efectivamente contra la pérdida ósea en el modelo de rata ovariectomizada. Por consiguiente, con la excepción de los antiestrógenos esteroidales puros (es decir, ICI182, 780), todas las clases conocidas de moduladores de receptor de estrógeno parecen proteger contra la pérdida ósea en los seres humanos y en los modelos animales pertinentes, mientras que exhiben diferentes grados de actividad estrogénica en otros tejidos (Chow y colaboradores, J. Clin. Invest. 89:74-78 (1992); Love y colaboradores, New Engl. J. Med. 326:852-856 (1992); Draper y colaboradores,, Biochemical Markers of Bone and Lipid Metabolism in Healthy Postmenopausal Women. En: C. Christiansen and B. Biis (editores) Proceedings 1993. Fourth International Symposium on Osteoporosis and Consensus Development Conference, Handelstrykkeriet, Aalborg; Wagner y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 93 : 8739-8744 (1996); Black y colaboradores, J. Clin. Invest 93:63-69 (1994) ) . SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa en la identificación de moduladores de receptor de estrógeno que son mecánicamente distintos de los moduladores tales como el tamoxifeno. Estos moduladores tienen aplicación en el tratamiento de una variedad de enfermedades y desórdenes dependientes de estrógeno, incluyendo cáncer del pecho. Esto moduladores son de una importancia particular en el tratamiento de cánceres del pecho que son de novo resistentes al tamoxifeno, o que llegan a ser resistentes con el tratamiento. Los objetos y ventajas de la invención quedarán claros a partir de la siguiente descripción. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura ÍA y IB. GW5638 es mecánicamente distinto de las clases conocidas de moduladores del receptor de estrógeno. El promotor C3 humano (-1807 a +58) fusionado con el gen reportero de luciferasa de luciérnaga, se transfectó junto con un plásmido de expresión que contenía (Figura ÍA) el receptor de estrógeno humano de tipo silvestre (ERwt) , o (Figura IB) un receptor de estrógeno mutado en donde se había alterado la función FA-2 (ER-TAF1) en células HepG2 , y se probó para determinar su actividad de transcripción en la presencia de concentraciones crecientes de modulador de receptor de estrógeno, como se indica. Las transfecciones se normalizaron para la eficiencia y el número de células, cotransfectando un plásmido de expresión que contenía ß-galactosidasa. La respuesta normalizada se obtuvo dividiendo unidades de luz entre la actividad de la ß-galactosidasa, como se mide en un ensayo enzimático. Se realizaron transfecciones por triplicado. Los datos mostrados son representativos de múltiples experimentos realizados bajo condiciones similares. Figura 2A-2C. GW5638 y GW7604 se oponen a la activi dad agonista del estradiol , a la actividad agonista parcial del tamoxif no, y a la actividad agonista inversa del ICI182, 780. Figura 2A. La capacidad de GW5638 ó GW7604 para inhibir la actividad agonista de 17-ß-estradiol 10"8 M, o la actividad agonista parcial exhibida por el tamoxifeno 10~8 M, se evaluó en células HepG2 transfectadas con ERwt. Figura 2B. La capacidad de GW5638 ó GW7604 para inhibir la actividad agonista del 17-ß-estradiol 10"8M, o la actividad agonista parcial exhibida por el 4-OH tamoxifeno 10~8M, se evaluó en células HepG2 transfectadas con ER-TAFI (McDonnell y colaboradores, Mol. Endocrinol. 9:659-669 81995)). Figura 2C. Ambos GW5638 y GW7604 pueden inhibir la actividad agonista inversa del receptor de estrógeno del ICI182 780 (ICI) , manifiesta en el promotor C3 , cuando se ensaya en células HepG2 en las concentraciones indicadas. Las transfecciones se normalizaron para la eficiencia y el número de células, cotransfectando un plásmido de expresión que contenía ß-galactosidasa. La respuesta normalizada se obtuvo dividiendo unidades de luz entre la actividad de la ß-galactosidasa, como se mide en un ensayo enzimático. Se muestran los ensayos representativos en donde se realizaron transfecciones por triplicado. Las barras de error representan el error estándar del promedio (SEM) . Figuras 3A y 3B. GW5638 protege contra la pérdida ósea en ratas ovariectomizadas . Figura 3A. Se midió el efecto de GW5638 sobre la densidad mineral ósea (DMO) en la espina lumbar (L1-L4) utilizando absorción de rayos X doble. El significado de la diferencia en la densidad mineral ósea entre ratas OVX y tratadas se determinó utilizando la prueba de Dunnets (*p<. 0.005). Se indica el rango de las densidades minerales óseas observadas en los animales operados falsamente (barra sombreada) y en animales OVX (barra hueca) . Figura 3B. Se midió el efecto de GW5638 sobre la densidad mineral ósea en la metáfisis proximal de la tibia en ratas OVX mediante tomografía computarizada cuantitativa (TCC) . Se determinó el significado de la diferencia en la densidad mineral ósea entre las ratas OVX y tratadas (indicada por los asteriscos) utilizando la prueba de Turkey-Kramer (p<. 0.05) . Figura 4. GW5638 suprime las elevaciones inducidas por la ovariectomía en el colesterol en suero . Se realizaron mediciones del colesterol en suero en sangre extraída de grupos de ratas ovariectomizadas de 90 días de edad, que fueron tratadas ya sea con estradiol, o bien con GW5638, como se indica. Cada punto representa el colesterol en suero promedio (+. error estándar del promedio) para el control OVX (n=7) , estradiol (n=7) , y GW5638 (n=7) , como se indica. Los asteris-cos indican grupos significativamente diferentes del control OVX. Se indica el rango de colesterol en suero en el animal OVX (barra hueca) . Figura 5. GW5638 no exhibe actividad agonista de receptor de estrógeno en el útero inmaduro de rata . Los grupos de ratas de 21 días de edad fueron tratados oralmente ya sea con vehículo solo, GW5638, o tamoxifeno, como las únicas sustancias, o GW5638 o tamoxifeno en la presencia de estradiol. Los datos mostrados representan el valor promedio (+ error estándar del promedio) . Se indica el rango en las mediciones hechas en animales tratados con estradiol (barra sombreada) y operados falsamente (barra hueca) . Figura 6. Efecto de GW5638 sobre el peso uterino húmedo en ratas ovariectomizadas . Los grupos de ratas de 90 días de edad falsamente operadas u ovariectomizadas se trataron durante 28 días con vehículos solamente, estradiol o GW5638. Los resultados mostrados representan el peso uterino húmedo promedio (+. error estándar del promedio) para 7 ratas por grupo. Se indica el rango en las mediciones hechas en los animales falsamente operados (barra sombreada) y OVX (barra hueca) . Figuras 7A-7F. Efecto de GW5638 sobre la histología uterina en ratas ovariectomizadas . Histología comparativa (Amplificación Baja) de úteros de ratas de 90 días de edad que fueron operadas falsamente (Figura 7A) , ovariectomizadas (Figura 7B) , ovariectomizadas más estradiol (Figura 7C) , u ovariectomizadas más 1 microgramo/kilogramos (Figura D) , 3 microgramos/kilogramo (Figura 7E) , ó 10 microgramos/kilogramo (Figura 7F) de GW5638. Figuras 8A-8D. Efecto de GW5638 sobre la histología uterina en ratas ovari ectomizadas . Histología comparativa de úteros de ratas de 90 días de edad que fueron operadas falsamente (Figura 8A) , ovariectomizadas (Figura 8B) , ovariectomizadas más estradiol (Figura 8C) , u ovariectomizadas más 10 microgramos/kilogramo de GW5638 (Figura 8D) . Las fotografías se tomaron en una amplificación 150X, y subsecuentemente se amplificaron hasta una amplificación final de 600X. Figura 9 Efecto del tratami ento anti -estrógeno sobre tumores de cáncer de pecho MCF- 7 en ratones desnudos . El día 0 indica el primer día del tratamiento; 2 semanas después de la inoculación de los tumores, el análisis estadístico reveló que cada grupo de tratamiento tenía un efecto significativo sobre el control (ANOVA, p<0.5) y no hubo una diferencia significativa entre las dos dosis más altas de GW5638 y tamoxifeno. Figura 10. Estudio de respuesta a la dosi s . Figura 11. Estudio LCC2. Figura 12. GW7604 funciona como un antiestrógeno en células de cáncer de pecho MCF- 7. Figuras 13A y 13B: El análisis del efecto de mutacio-nes específicas de receptor de estrógeno sobre la farmacología de los antiestrógenos , revela la complej idad mecánica adicional . Figura 13A. ER wt . Figura 13B. ER-TAF1. Figuras 14A y 14B: Un análisi s compara tivo de la capacidad de una variedad de antiestrógenos para inhibir la actividad de transcripción del receptor de estrógeno-a (Figura 14B) , y del receptor de estrógeno-ß (Figura 14B) . Figuras 15A-15C: Análisis de inmunotinción Western de expresión del receptor de estrógeno en células objetivo en seguida del tratamiento con agonistas o antagonistas . Figura 15A. Células MCF-7. Figura 15B. Células Ishikawa. Figura 15C. Células Ishikawa transfectadas con pRST7ER. Figuras 16A y 16B: Análisis de inmunotinción Western de la expresión endógena del receptor de estrógeno en células MCF- 7 en seguida de tratamientos de corto plazo (Figura 16 A . 1 hora, y Figura 16B. 4 horas) . con agonistas o antagonistas .

Figuras 17A y 17B: Análisis de inmunotinción Western de la expresión endógena del receptor de estrógeno en células Ishikawa en seguida de tratamientos de corto plazo (Figura 17A. 1 hora, y Figura 17B. 4 horas) con agonistas o antagonistas . Figuras 18A-18C: Análisis de inmunotinción Western de la expresión endógena de receptor de estrógeno de célula entera (Figura 18A) , nuclear (Figura 18B) , y ci toplásmica (Figura 18C) en células Ishikawa en seguida de tratamientos de corto plazo con agonistas o antagonistas .

Figuras 19A-19C: Efecto sobre la proliferación celular MCF- 7 estimulada por E2. Figura 19A. ICI 182-780. Figura 19B. GW760 . Figura 19C. 4 -OH tamoxifeno. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a moduladores selectivos del receptor de estrógeno que poseen actividad agonista del receptor de estrógeno específica del tejido. Los moduladores de la invención funcionan como agonistas en hueso y en el sistema cardiovascular, pero no en el útero. Estos moduladores son mecánicamente distintos de, por ejemplo, el tamoxifeno, y son útiles en el tratamiento de tumores, tales como tumores del pecho, particularmente tumores positivos para el receptor de estrógeno, caracterizados por resistencia de novo o adquirida a diferentes moduladores del receptor de estrógeno, incluyendo tamoxifeno. Los presentes moduladores también son mecánicamente distintos de raloxifeno, droloxifeno, idoxifeno, e ICI182-780. Los moduladores preferidos de la invención son derivados de trifeniletileno, más preferiblemente compuestos de la Fórmula I, como se definen en la Patente Número USP 5,681,835, GW5638 y derivados de la misma, tales como GW7604, que son los más preferidos . Estos compuestos se pueden preparar como se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número USP 5,681,835, y por Willson y colaboradores, (J. Med. Chem. 37:1550 (1994)). Los moduladores pueden formar sales farmacéuticamente aceptables con cationes, incluyendo metales alcalinos, tales como sodio y potasio, o metales alcalinotérreos, tales como cationes de calcio o magnesio. Los moduladores de la presente invención se pueden utilizar en el tratamiento y/o en la prevención de una variedad de desórdenes o condiciones, tales como cáncer estimulados por estrógeno, incluyendo cáncer uterino, cáncer de ovario, cáncer de colon, y cáncer del pecho, enfermedad cadiovascular (en hombres y mujeres), osteoporosis, y condiciones artríticas.

Otros desórdenes o condiciones para los que son útiles los moduladores de la presente invención (tanto para tratamiento como para prevención) incluyen cáncer prostático, infertilidad (por ejemplo, como un inductor de la ovulación), síntomas vasomotores asociados con menopausia (por ejemplo "bochornos"), vaginitis, desórdenes proliferativos benignos, incluyendo endometriosis y fibroides uterinos, diabetes tipo II, degeneración macular, incontinencia urinaria, y enfermedad de Alzheimer (función cognoscitiva) . Además, los presentes compuestos se pueden utilizar como anticonceptivos en mujeres. Como quedará claro a partir de los siguientes Ejemplos, el GW5638 y sus derivados son los moduladores mecánicamente únicos. Se espera que estas sustancias sean superiores a, por ejemplo, el tamoxifeno, como una terapia de primera línea, y como un quimiopreventivo para los cánceres estimulados por estrógeno, particularmente cáncer del pecho, debido a que carecen de actividad uterotrófica . Estas sustancias no tienen una actividad clásica sobre el receptor de estrógeno, y por consiguiente, se anticipa que no inducirán resistencia hasta el mismo grado que los compuestos actuales. Además, estas sustancias se pueden utilizar para tratar pacientes que respondan pobremente a otros moduladores de receptor de estrógeno, incluyendo tamoxifeno, idoxifeno, reloxífeno, e ICI 182, 780, así como aquellos que respondan inicialmente bien a estos moduladores, pero subsecuentemente fracasen. En vista de la exclusividad mecánica de las presentes sustancias, se espera que su uso no dé como resultado efecto secundarios adversos, tales como trombosis de venas profundas . Debido al mecanismo único de acción de los presentes moduladores, también se contempla su uso como un componente de un "cóctel" terapéutico, particularmente para el tratamiento de cáncer del pecho. En este aspecto, los presentes moduladores se pueden utilizar en combinación con otro antiestrógeno, un ligando del ácido retinoico o receptor retinóxico X, una antiprogestina tal como RU486, un antiandrógeno tal como casdex o flutamida, vitamina D (o un metabolito de la misma) , un inhibidor de transferasa de farnesilo, un agonista PPAR o gamma, o un inhibidor de cinasa MAP. Como se indicó anteriormente, la invención incluye el uso de los presentes moduladores en profilaxis, así como en el tratamiento de enfermedades o síntomas establecidos. La cantidad del modulador requerida para utilizarse variará con la condición (enfermedad/desorden) y la edad y condición del paciente, y quedará finalmente a discreción del médico que atienda (o veterinario, en el caso de aplicaciones veterinarias) . En general, sin embargo, las dosis empleadas para un tratamiento de un humano adulto normalmente estarán en la escala de 0.001 miligramos/kilogramo a aproximadamente 100 miligramos/kilogramo al día. La dosis deseada convenientemente se puede presentar en una sola dosis, o como dosis divididas administradas a intervalos apropiados, por ejemplo como 2, 3, 4, ó más subdosis al día. La presente invención también incluye composiciones farmacéuticas que comprendan al modulador anteriormente descrito, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables, y opcionalmente, otros ingredientes terapéuticos y/o profilácticos, incluyendo los descritos anteriormente. Las formulaciones de la presente invención se pueden administrar de una manera convencional para el tratamiento de las enfermedades/desórdenes indicados, tal como oralmente, parenteralmente, sublingualmente, transdérmicamente, rectalmente, mediante inhalación, o mediante administración bucal. Para administración bucal, la composición puede tomar la forma (por ejemplo, forma de dosificación unitaria) de una tableta o gragea formulada de una manera convencional. Por ejemplo, las tabletas y cápsulas para administración oral pueden contener excipientes convencionales, tales como sustancias aglutinantes, rellenos, lubricantes, desintegrantes, y sustancias humectantes. Las tabletas se pueden recubrir de acuerdo con los métodos bien conocidos en la materia. De una manera alternativa, los moduladores de la presente invención se pueden incorporar en preparaciones líquidas orales, tales como suspensiones acuosas u oleosas, soluciones, emulsiones, jarabes, o elíxires. Más aun, las formulaciones que contengan estos moduladores se pueden presentar como un producto seco para constituirse con agua u otro vehículo adecuado antes de usarse. Estas preparaciones líquidas pueden contener aditivos convencionales, tales como sustancias de suspensión, sustancias emulsionantes, conservadores, y vehículos no acuosos. Estas preparaciones también se pueden formular como supositorios, por ejemplo que contengan bases de supositorio convencionales, tales como manteca de cacao u otros glicéridos. Las composiciones para inhalación se pueden proporcionar normalmente en la forma de una solución, suspensión, o emulsión, que se puede administrar como un polvo seco, o en la forma de un aerosol, utilizando un propelente convencional, tal como diclorofluorometano o triclorofluorometano. Las formula-ciones transdérmicas típicas comprenden un vehículo acuoso o no acuoso convencional, tal como cremas, ungüentos, lociones, o pastas, y están en la forma de emplaste medicado, parche, o membrana . Adicionalmente, las composiciones de la presente invención se pueden formular para administración parenteral mediante inyección o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones, o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener sustancias de formulación, tales como sustancias de suspensión, estabilizantes, y/o dispersantes. De una manera alternativa, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para constituirse con un vehículo adecuado (por ejemplo, agua estéril exenta de pirógeno) antes de usarse. La composición de conformidad con la invención también se puede formular como una preparación de depósito. Estas formulaciones de larga acción se pueden administrar mediante implantación (por ejemplo, subcutáneamente o intramuscularmente) , o mediante inyección intramuscular. De conformi-dad con lo anterior, los moduladores de la invención se pueden formular con materiales poliméricos o hidrofóbicos adecuados (como una emulsión en un aceite aceptable, por ejemplo), resinas de intercambio iónico, o como derivados escasamente solubles, o como una sal escasamente soluble, por ejemplo. La identificación de GW5638 y GW7604 como sustancias sin actividad agonista clásica, indica que los compuestos que "activan" el receptor de estrógeno (es decir, los compuestos que hacen que se libere el receptor de estrógeno desde las proteínas en choque por calor) , y tampoco ocasionan degradación del receptor de estrógeno, se pueden utilizar en el tratamiento de osteoporosis. El descubrimiento de la incapacidad para separar las actividades osteoporótica y cardioprotectora de GW5638 y GW7604, indica que cualquier compuesto que se enlace con el receptor de estrógeno y tenga cualquier actividad (osteoporótica o cardioprotectora) , también tendrá la otra. Ciertos aspectos de la presente invención se describen con mayor detalle en los siguientes ejemplos no limitantes. EJEMPLOS Los siguientes detalles experimentales son referen-ciados en los siguientes Ejemplos específicos. Bioquímicos Se obtuvieron ADN y enzimas de modificación en Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN) , New England Biolabs (Beverly, MA) , o Promega Corp. (Madison, Wl) . Los reactivos de laboratorio generales y el 17ß -estradiol (E2) se adquirieron en Sigma (SL Louis, MO) . ICI182, 780 fue un regalo de Zeneca Pharmaceuticals, Macclesfield, Reino Unido. El raloxifeno fue un regalo de Pfizer Pharmaceuticals, Groton, CT. El 4 -OH tamoxifeno fue un regalo de Ligand Pharmaceuticals (San Diego, CA) . Los GW5638 y GW7604 se prepararon como se describió anteriormente (Wilson y colaboradores, J. Med. Chem. 37:1550-1552 (1994) ) . El anticuerpo H222 está disponible en Abbott Laboratories . Cultivo celular y ensayos de cotransfección Se mantuvieron células HepG2 en Medio de Eagles Modificado (MEM) (Life Technologies, Grand Island, NY) más Suero Fetal de Becerro al 10 por ciento (FCS) (Life Technologies) . Las células se recubrieron en placas de 24 cavidades (recubiertas con gelatina) 24 horas antes de la transfección. Se introdujo ADN en las células utilizando Lipofectina (Life Technologies) . Dicho de una manera breve, se realizaron transfecciones por triplicado utilizando 3 microgramos de ADN total. Para las transfecciones estándares, se utilizaron 500 nanogramos de pCMV-ß-Gal (vector de normalización); 1,500 nanogramos de reportero (variable), y 1,000 nanogramos de receptor (pRST7-hER) (Dana y colaboradores, Mol. Endocrinol. 8:1193-1207 (1994)) para cada triplicado. La incubación de las células con Lipofectina procedió durante 3 horas, en cuyo tiempo se removió el medio, se lavaron las células con suero regulado con fosfato, y luego se indujeron con la hormona apropiada diluida en un medio exento de rojo de fenol que contenía CS separado con carbón al 10 por ciento (Cyclone Inc.) . La incubación con la hormona continuó durante 48 horas, después de lo cual, las células se lisaron y se analizaron para determinar la actividad de luciferasa y ß-galactosidasa como se describió anteriormente (Norris y colaboradores, JBC 270:2777-22782 (1995) ) . Ensayo utßrotrófico en ratas inmaduras Se obtuvieron ratas Sprague-Dawley hembras de 21 días de edad (de 30 a 35 gramos) en Harían o Taconic Laboratories. Los animales se seleccionaron aleatoriamente en grupos de tratamiento de cinco, y se registraron los pesos promedio para cada grupo de tratamiento. Los pesos se registraron en cada día del tratamiento. GW5638 o tamoxifeno se preparó en ETOH al 100 por ciento como una solución patrón lOx, y se almacenó a -70°C hasta el día de la dosificación. En el día de la dosificación, el fármaco se diluyó en celulosa metílica al 0.5 por ciento, viscosidad del 2 por ciento a 25°C: 400 centipoises (Sigma, St . Louis, MO) ) . La dosificación oral por sonda se basó en un volumen total de 10 mililitros/kilogramo de peso del cuerpo. Se preparó estradiol (Sigma, St . Louis, MO) en aceite de ajonjolí, se mezcló en un homogenizador de vidrio (ya sea disuelto o en suspensión) , se sacaron alícuotas, y se congelaron a -70°C hasta la dosificación. La dosificación subcutánea se basó en un total de 2 mililitros/kilogramo de peso del cuerpo. A los animales se les dió por sonda (GW5638) o se les inyectó (estradiol) durante 3 días. En el día 4, los animales se sacrificaron mediante asfixia con C02, se obtuvieron los pesos corporales, y se removieron los úteros, se tiñeron, y se pesaron. Los datos se expresaron como peso uterino/peso corporal . Estudios de densidad mineral ósea Preparación del animal . Las ratas Sprague-Dawley, de 90 días de edad, se anestesiaron con isofluorano (inducción del 4 por ciento, mantenimiento del 2 por ciento) , se ovariectomi-zaron (OVX) , o se operaron falsamente (SO) , y se asignaron aleatoriamente a grupos (n=7) tratados desde el día 1 hasta el día 28 después de la cirugía mediante administración por sonda oral con vehículos solamente, estradiol, o GW5638, en celulosa metílica al 0.5 por ciento. En el sacrificio, los animales se eutanizaron con C02, se registraron los pesos corporales, y se removieron y se pesaron los úteros. El útero, la vagina, y el tejido mamario se fijaron en formalina regulada neutra al 10 por ciento. Se tomaron muestras para el procesamiento histoló-gico desde el punto medio de cada trompa uterina. Las muestras de tejido se empotraron en parafina, se tiñeron con hematoxili-na y eosina, y se evaluaron microscópicamente. Se separaron las vértebras lumbares y ambas tibias izquierda y derecha. Se midió el colesterol total en sangre (Roche Biomedical Laborato-ries) . Absorción de rayos X de energía doble (DEXA) . Se utilizó un densitómetro óseo Hologic QDR-2000 con un paquete de software regional de alta resolución para el análisis DEXA. La longitud de exploración, el ancho, la separación de líneas, y la resolución de puntos por omisión, se establecieron en 5.08, 1.905, 0.0254, y 0.0127 centímetros, respectivamente. El densitómetro se calibró diariamente utilizando una plataforma de espina de hidroxiapatita. Las tibias separadas se colocaron en un baño de agua de 1 centímetro de profundidad, con la tibia y la fíbula colocadas horizontalmente. Para las exploraciones en vivo, las ratas se enestesiaron con isofluorano, y se colocaron en una posición supina, con la espina paralela al eje largo de la mesa del densitómetro. La pata de exploración se acomodó en una posición paralela al eje largo de la mesa, y la tibia se exploró hasta la unión con el fémur. Una región de interés (ROÍ) en la tibia se analizó con el software subregio-nal, enfocándose en una zona de 2 milímetros de ancho, empezando a 3 milímetros distales a la placa de crecimiento. Tomografía computará zada cuanti tativamente periférica (pQCT) . Se realizaron exploraciones de tomografía computarizada en un PQCT (XCT-960A, Norland) . Se exploraron secciones de cuatro a cinco milímetros con un tamaño de voxel de E (0.148 milímetros), y un paso de 0.5 milímetros. Se analizó una sección de 3 a 5 milímetros distal a la placa de crecimiento utilizando contmode, 2/peelmode, 5/cortmode. Se obtuvieron mediciones de la densidad mineral ósea total, trabecular y cortical. Las tibias separadas se colocaron en un baño de agua de 1 centímetro de profundidad, con la tibia y la fíbula colocadas horizontalmente, para asegurar que se pudiera explorar el hueso verticalmente. Las ratas se anestesiaron con isofluorano, y la pata se colocó de tal manera que la imagen de las uniones de fémur-tibia y de tibia-fíbula en la vista de investigación se pudieran localizar y utilizar como marcas para las exploraciones de tomografía computarizada. EJEMPLO 1 Identificación de Moduladores de Receptor de Estrógeno Novedosos Se han desarrollado una serie de rastreos in vi tro que permiten la clasificación de los moduladores de receptor de estrógeno en cuatro grupos mecánicamente distintos (Tzukerman y colaboradores, Mol. Endocrinol. 8:21-30 (994)). De una manera específica, se reconstituyó un ensayo en células de hígado HepG2 , en donde se evalúa la capacidad de un compuesto para regular la actividad de transcripción del promotor del complemento 3 (C3) que responde al estrógeno, en la presencia de receptor de estrógeno de tipo silvestre (ERwt) , o un mutante del receptor, ER-TAF1, en donde se ha destruido la función FA-2. Utilizando estos ensayos, ha sido posible derivar "huellas" de moduladores conocidos de receptor de estrógeno (McDonnell y colaboradores, Mol. Endocrinol. 9:659-669 (1995)). Aunque estos ensayos no reflejan exactamente el medio ambiente del receptor de estrógeno en vivo, el funcionamiento de los compuestos en estos ensayos es suficiente para separarlos en grupos, cada uno de los cuales manifiesta actividades únicas en vivo. Se sintetizaron una serie de ligandos de receptor de estrógeno derivados de trifeniletileno (Willson y colaboradores, J. Med. Chem 37:1550-1552 (1994)) . El análisis preliminar de estos compuestos en vivo indicó que las actividades relativas de estos compuestos en hueso y en el útero no eran idénti-cas, reflejando posibles diferencias mecánicas (Willson y colaboradores, J. Med. Chem. 37:1550-1552 (1994)). En consecuencia, se realizó un ensayo ciego de estos compuestos sobre ERwt en células HepG2 sobre el promotor C3 , y se determinó que todos, salvo dos compuestos, eran mecánicamente indistinguibles del tamoxifeno. Sin embargo, dos compuestos, GW5638 y GW7604, demostraron un perfil suficientemente diferente en este sistema, de otros ligandos de receptor de estrógeno, para garantizar una investigación adicional . Es interesante que estos compuestos son estructuralmente idénticos unos a otros, excepto que el GW7604 es la versión 4-hidroxilada del GW5638 (Tabla 1) . Utilizando un ensayo de enlace de radioligando competitivo in vi tro, se demostró que ambos compuestos exhiben interacciones del receptor de estrógeno de alta afinidad.

Específicamente, el GW5638 y el GW7604 demostraron valores K± de 50.4 nM (+/- 5.4), y de 15.5 nM (+/- 1.4), respectivamente. Bajo las mismas condiciones, se demostró que el 17-ß-estradiol tiene un valor K± de 6.3 nM (+/- 0.4) . Aunque no se ha estudiado el metabolismo del GW5638, es posible que se convierta en el compuesto de más alta afinidad GW7604 en vivo de la misma manera en que se convierte el tamoxifeno en el metabolito de más alta afinidad 4-OH tamoxifeno (Jordán y colaboradores, J. Endocrinology 75:305-316 (1977)). Una comparación de la actividad agonista de estos compuestos con los miembros representativos de cada uno de los cuatro grupos establecidos de ligandos del receptor de estrógeno, se muestra en la Figura ÍA. En este ensayo, el tamoxifeno actúa como un agonista parcial del receptor de estrógeno cuando se ensaya sobre el promotor C3 , alcanzando el 45 por ciento de la eficacia del estradiol. Cuando se analiza de la misma manera, el raloxifeno y el antagonista puro ICI182, 780 no demuestran actividad agonista, pero inhiben la actividad de transcripción basal del promotor C3. Recientemente se ha determinado que la actividad basal del promotor C3 depende del receptor de estrógeno, aunque es independiente del ligando (Norris y colaboradores, Molecular Endocrinology 10:1605-1616 (1996)). Debido a que tanto el raloxifeno como ICI182, 780 inhiben la activación del receptor de estrógeno dependiente e independiente del ligando, parecen operar como "agonistas inversos" en este medio ambiente. Sin embargo, tanto el GW5638, como su metabolito supuesto GW7604, no demuestran ninguna actividad agonista o antagonista sobre este promotor, exhibiendo una "huella" previamente no reconocida. Se concluyó que, en un medio ambiente en donde el tamoxifeno exhibe una actividad agonista parcial, los análogos de tamoxifeno GW5638 y GW7604 son funcionalmente inactivos. Aunque el raloxifeno e ICI182, 780 se comportaron de una manera análoga sobre ERwt, son mecanísticamente distintos (McDonnell y colaboradores, Mol. Endocrinol. 9:659-669 (1995); Dauvois y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 89:4037-4041 (1992); Dauvois y colaboradores, J. Cell. Sci. 106:1377-1388 (1993)). Al ensayarse sobre un receptor de estrógeno mutante (ER-TAF1) , en donde se ha alterado la secuencia de activación FA-2, el raloxifeno se comporta como tamoxifeno, exhibiendo el 40 por ciento de la actividad agonista del estradiol (Figura IB) . En este ensayo, ICI182, 780 GW5638 y GW7604 son funcionalmente inactivos. Estos datos indican que el GW5638 (y el GW7604) , funciona de una manera que es distinta de las clases previamente definidas de agonistas y antagonistas mezclados con receptor de estrógeno (McDonnell y colaboradores, Mol. Endocrinol 9:659-669 1995)). Una posible, aunque poco probable, explicación para estos resultados iniciales, es que los compuestos fueron metabolizados (o de alguna manera se les impidió el enlace con el receptor) , explicando de este modo su inactividad en este ensayo. Esta cuestión se resolvió evaluando la capacidad de GW5638 y GW7604 para inhibir la actividad agonista del estradiol, y el tamoxifeno exhibida sobre ERwt y ER-TAF1, respectivamente, y para revertir la actividad agonista inversa de ICI182, 780. Como se muestra en la Figura 2A, el estradiol funcionó como una agonista total, y el tamoxifeno funcionó como un agonista parcial sobre ERwt, al ensayarse sobre el promotor C3 en células HepG2. Es importante que la actividad agonista manifestada por el tamoxifeno o el estradiol fue inhibida tanto por GW7604 como por GW5638. Por consiguiente, estos compuestos estuvieron funcionando como antagonistas sobre el receptor de una manera distinta del tamoxifeno. Se realizó un análisis similar utilizando ER-TAF1 en lugar de ERwt (Figura 2B) . Como se esperaba, tanto GW5638 como GW7604 fueron capaces de inhibir la actividad de transcripción de ER-TAF1 inducida por estradiol y por tamoxifeno. Es interesante que el raloxifeno exhibe una actividad agonista parcial sobre ER-TAF1 (Figura IB) ; una actividad que es inhibida tanto por GW5638 como por GW7604. De una manera acumulativa, estos datos indican que el GW5638 y su metabolito supuesto en vivo, GW7604, son moduladores del receptor de estrógeno mecanísticamente únicos que no exhiben actividad agonista in vi tro, pero que pueden inhibir la actividad agonista del estradiol, del tamoxifeno, y del raloxifeno. Aunque su perfil en algunos de estos ensayos se parece a aquél de la clase de ligandos antagonistas puros, estos compuestos son distintos de los antagonistas esteroidales como ICI182, 780, debido a que no exhiben una actividad agonista inversa (Figura ÍA) . Con el objeto de confirmar que el GW5638 y el GW7604 son mecánicamente distintos del ICI182, 780, se midió la capacidad de estos compuestos para revertir la actividad agonista inversa demostrada por ICI182, 780. Los resultados de este análisis se muestran en la Figura 2C. De una manera específica, se observó que la actividad basal del promotor C3 humano era suprimida 10 veces sobre la adición de ICI182, 780, y que ésta podía revertirse completamente mediante la co-adición de GW7604, y podía revertirse parcialmente mediante GW5638. Una posible explicación para las diferencias mecánicas observadas, es que el GW5638 y el GW7604 interactúan con el receptor de estrógeno, e inhiben su capacidad para interactuar con el ADN. Esto se resolvió utilizando un receptor de estrógeno modificado (ER-VP16) , para reportar sobre la localización nuclear y el estado de enlace de ADN del receptor de estrógeno adentro de una célula en seguida del enlace del ligando. Esta proteína modificada se comporta exactamente como el receptor de estrógeno en todos los aspectos, excepto que activa la transcripción después de interactuar con un elemento de respuesta de estrógeno (ERE) independientemente de la naturaleza del ligando enlazado (McDonnell y colaboradores, Mol. Endocrinol. 9:659-669 (1995)). Utilizando este reactivo, se demostró que todas las clases de ligandos de receptor de estrógeno, incluyendo ICI182, 780 GW5638 y GW7604 facilitan las interacciones eficientes del receptor de estrógeno con el ADN objetivo (McDonnell y colaboradores, Mol. Endocrinol. 9:659-669 (1995) ) . Por consiguiente, el GW5638 y el GW7604 interactúan con el receptor de estrógeno en vivo, y demuestran una farmacología que es distinta de otros moduladores de receptor de estrógeno conocidos. Por consiguiente, se implica que las propiedades únicas del GW5638 y del GW7604 se manifiestan en algún paso corriente abajo del enlace del ADN. Debido a las propiedades únicas de estos compuestos, se inició una serie de estudios en animales íntegros para examinar su actividad en los sistemas esquelético, cardiovascular, y reproductor. EJEMPLO 2 Prevención de Pérdida Osea Inducida en Ratas Ovariectomizadas Ahora existe una fuerte evidencia de que tanto el tamoxifeno como el raloxifeno previenen la pérdida ósea en modelos preclínicos de osteoporosis postmenopaúsica (Love y colaboradores, New Engl. J. Med. 326:852-856 (1992); Love y colaboradores, Ann. Intern. Med. 115:860-864 (1991)). Black y colaboradores, J. Clin Invest 93:63-69 (1994)). Sin embargo, no se ha definido el mecanismo de acción de estos compuestos en el hueso. El destino del hueso en los pacientes tratados con el antagonista puro ICI182, 780 no está claro en el presente, aunque los datos de modelos de rata preclínicos sugieren que no es un agonista en este tejido (Gallagher y colaboradores, Endocrinology 133-2787-2791 (1993)). Esto ha conducido a la hipótesis de que se requiere la actividad agonista parcial del tamoxifeno y el raloxifeno para la protección ósea (Love y colaboradores, New Engl. J. Med. 326:852-856 (1992); Black y colaboradores, J. Clin Invest 93:63-69 (1994)). El trabajo anterior que demuestra que tanto el tamoxifeno como el raloxifeno pueden funcionar como antagonistas igualmente efectivos en algunos contextos de células y promotores apoya esta idea (McDonnell y colaboradores, Mol. Endocrinol. 9:659-669 (1995)); sin embargo, el GW5638 proporciona una nueva herramienta con la que se resuelve esta cuestión. Este compuesto, que no manifiesta una actividad agonista clásica en ninguno de los ensayos in vi tro, se ensayó para determinar su capacidad para inhibir la pérdida ósea en ratas ovariectomizadas. De una manera específica, se ensayó la densidad mineral ósea (DMO) tanto en la espina lumbar como en la tibia de ratas ovariectomizadas de 90 días de edad, en seguida de la administración oral durante 28 días de cualquiera de 17ß-estradiol , o dosis crecientes de GW5638. Los resultados mostrados en la Figura 3A indican que se presentó una pérdida ósea significativa en las espinas lumbares de los animales ovariectomizados (OVX) durante el transcurso del estudio de 28 días, al compararse con los animales de control falsamente operados, mientras que se mantuvo la densidad mineral ósea en las ratas ovariectomizadas tratadas con estradiol. De una manera significativa, el GW5638 demostró una actividad protectora ósea dependiente de la dosis, que fue tan efectivo como el estradiol en una concentración de 3 micromoles/kilogramo (1 miligramo/kilogramo) . Esto es similar a la dosis de tamoxifeno requerida para la protección ósea en el mismo modelo (Love y colaboradores, New Engl. J. Med. 326:852-856 (1992); Black y colaboradores, J. Clin Invest 93:63-69 (1994), Yang y colaboradores, , Endocrinology 137 : 2075-2084 (1996) ) . La actividad protectora ósea observada no estaba restringida la espina lumbar, debido a que se obtuvieron resultados análogos cuando se tuvo acceso a la densidad mineral ósea de la tibia (Figura 3B) . Específicamente, utilizando el mismo protocolo experimental, se demostró que el GW5638 era efectivo para mantener la masa ósea total con un efecto muy pronunciado en el compartimiento trabecular. Esto fue interesante a la luz del hecho de que previamente se ha demostrado que el estrógeno regula el cambio óseo en este compartimiento (Gallagher y colaboradores, Endocrinology 133:2787-2791 (1993)) . Juntos, estos datos indican que el GW5638, un compuesto sin actividad agonista clásica de receptor de estrógeno, al ensayarse in vi tro, funciona como un agonista eficiente del receptor de estrógeno en el hueso. Se ha demostrado que los compuestos que funcionan como agonistas del receptor de estrógeno en el hueso, tales como estradiol, tamoxifeno, y raloxifeno, también pueden suprimir la elevación en el colesterol en suero asociada con ovariectomía (Love y colaboradores, Ann. Intern. Med 115:860-864 (1991); Black y colaboradores, J. Clin Invest 93:63-69 (1994) ) . Esta observación ha conducido a la sugerencia de que el mecanismo de actividad del receptor de estrógeno en el hueso y en el sistema cardiovascular es muy similar. Aunque no está claro si la supresión observada de los niveles de colesterol en suero es suficiente para explicar la disminución en la mortali-dad por enfermedad cardiovascular en mujeres postmenopáusicas con terapia de reemplazo de estrógeno, se acepta como un marcador de la acción del estrógeno en el sistema cardiovascular. Para resolver esta cuestión, se ensayó el nivel de colesterol total en suero en ratas ovariectomizadas tratadas con estradiol o GW5638 durante 28 días. Los resultados mostrados en la Figura 4 indican que, inclusive en la concentración más baja probada, el GW5638 fue tan efectivo como el estradiol para reducir los niveles de colesterol en suero. EJEMPLO 3 GW5638 como un Modulador del Receptor de Estrógeno Escaso Uterino Para extender el examen de la especificidad del tejido del GW5638, se realizó un análisis comprensivo de la actividad uterotrófica de este compuesto. En la serie inicial de experimentos, se compararon las actividades del GW5638 y el tamoxifeno en los úteros de ratas inmaduras de 21 días de edad. En este ensayo, se utilizó el peso húmedo uterino como una medida de la actividad agonista del receptor de estrógeno en este tejido (Figura 5). Al administrarse oralmente, como una sola sustancia, el GW5638 no exhibió una actividad significati-va sobre el control. Observe en particular que este compuesto es inactivo en este ensayo en 10 micromoles/kilogramo/día, tres veces la cantidad requerida para la protección ósea (Figura 3) . En contraste, el tamoxifeno demostró una actividad uterotrófica en dosis tan bajas como de 0.1 micromoles/kilogramo/día. Estos estudios se extendieron para demostrar que el GW5638, pero no el tamoxifeno, podía inhibir completamente la actividad agonista del estradiol en estas ratas, confirmando que este compuesto es un antagonista puro en este tejido bajo las condiciones del ensayo. En la segunda serie de experimentos, se evaluó la actividad uterotrófica en seguida de tratamientos de 28 días con GW5638 o con estradiol en ratas ovariectomizadas (OVX) de 90 días de edad. Los resultados de este análisis, mostrados en la Figura 6A, indican que, en dosis de hasta tres veces aquélla requerida para la protección ósea, el GW5638 exhibe una actividad uterotrófica mínima. Sin embargo, es importante que no se observaron diferencias significativas en el peso corporal total de la ratas ovariectomizadas tratadas con GW5638 contra los animales falsamente operados. Se observó un incremento muy pequeño, independiente de la dosis, en el peso húmedo uterino sobre las ratas ovariectomizadas. Esto es similar a lo que ha sido reportado por otros en ratas tratadas con raloxifeno, en donde la actividad se ha atribuido a un incremento en la imbibición de agua (Kedar y colaboradores, Lancet 343:1318-1321 (1994); Love y colaboradores, Ann. Intern. Med. 115:860-864 (1991); Black y colaboradores, J. Clin. Invest 93:63-69 (1994) ) . En adición a las mediciones del peso húmedo uterino, se realizó un examen histológico de los úteros cosechados de los mismos animales (Figuras 7A-7F (amplificación baja) y Figuras 8A-8D (amplificación alta)) . En este análisis, las células epiteliales uterinas en ratas tratadas con GW5638 exhibieron una hipertrofia relacionada con la dosis, mientras que el estroma demostró un incremento marginal en el tejido conectivo intercelular y sustancia molida. En las dosis más altas de GW5638 (3 veces más altas que la requerida para la protección ósea) , la hipertrofia epitelial observada fue comparable con aquélla de los úteros tratados con estradiol, mientras que la respuesta estromal y la infiltración eosinofílica fue menor que la observada en la ratas tratadas con estradiol (compare las Figuras 8C y 8D) . Acumulativamente, estos datos indican que el GW5638 posee una actividad agonística marginal del receptor de estrógeno en el útero, mientras que, en el hueso, funciona como un agonista del receptor de estrógeno. Por consiguiente, el GW5638 es un modulador único del receptor de estrógeno que manifiesta una actividad agonista y antagonista del receptor de estrógeno de una manera selectiva del tejido.

EJEMPLO 4 Efecto del Tratamiento Antiestrógeno Sobre Tumores de Cáncer de Pecho en Ratones Desnudos Este estudio se condujo utilizando células tumorales derivadas a partir de la línea de cáncer de pecho MCF-7. Esta línea es positiva para el receptor de estrógeno y de progesterona, dependiente de la hormona, y sensible a las antihormonas. Las células tumorales se inocularon en el flanco de ratones BALB/c Urd nunu atímicos ovariectomizados. Los ratones se complementaron con granulos de estrógeno de liberación lenta. A los animales se les dieron inyecciones subcutáneas diarias como se indica en seguida : Grupo 1 control (aceite de maíz) Grupo 2 0.3 miligramos de GW5638 Grupo 3 0.6 miligramos de GW5638 Grupo 4 1.0 miligramos de GW5638 Grupo 5 1.0 miligramos de tamoxifeno Utilizando calibradores, se midieron los tumores en dos dimensiones, en donde el área del tumor = 1/2 X w/2 X p. Los resultados se muestran en la Figura 9. EJEMPLO 5 Estudio de Respuesta a la Dosis La meta de este estudio fue comparar la dosis máximamente efectiva de GW5638 con tamoxifeno en términos de su capacidad para inhibir el crecimiento de tumores de cáncer del pecho MCF-7 en ratones desnudos. 10 ratones donadores ovariectomizados se inyectaron con 5 millones de células MCF-7. Los tumores resultantes se transplantaron a los ratones receptores. A todos los animales se les dieron granulos de estradiol de liberación lenta. Cuando los ratones experimentales tuvieron tumores mensurables, se inició una dosificación diaria, mediante inyecciones subcutáneas de 0.1 mililitros, como sigue: Grupo 1 control (aceite de maíz) Grupo 2 0.3 miligramos de GW5638 Grupo 3 0.6 miligramos de GW5638 Grupo 4 1.0 miligramos de GW5638 Grupo 5 1.0 miligramos de tamoxifeno Los tumores se midieron diariamente con calibradores, y el área se calculó como sigue: rea = 1/2 X w/2 X p. Después de 8 semanas, se comparó el crecimiento tumoral entre los grupos . Todos los grupos de tratamiento inhibieron el crecimiento tumoral (con un significado estadís-tico), comparándose con el control. Las dos dosis superiores de GW5638, 0.6 miligramos y 1.0 miligramos, fueron indistinguibles de 1.0 miligramos de tamoxifeno (ver la Figura 10) . EJEMPLO 6 Estudio LCC2 MCF-7/LCC2 es una línea celular (del Lombardi Cáncer Center) que es independiente del estrógeno, aunque es sensible y resistente al tamoxifeno. Este experimento se condujo para determinar la capacidad de GW5638 para retardar el crecimiento de esta línea celular en ratones desnudos en relación con tumores de control o tratados con tamoxifeno. Se prepararon 40 ratones ovariectomizados para aceptar las células, y se agruparon como sigue: Grupo 1 : control Grupo 2 : granulo de estrógeno Grupo 3: 1.0 miligramos de tamoxifeno Grupo 4: 1.0 miligramos del compuesto 5638 Los animales de control no recibieron nada, y los grupos 3 y 4 recibieron inyecciones de 0.1 mililitros en aceite de maíz cada tres días. Los tumores se midieron Q3 días con calibradores, y el área se calculó como sigue: rea = 1/2 X w/2 X p Después de 8 semanas, se comparó el crecimiento tumoral entre los grupos. En contraste con lo esperado, el tumor no pareció responder al estrógeno. Adicionalmente, el tumor pareció ser sensible al tamoxifeno, a pesar de su resistencia al tamoxifeno predicha. Tanto el tamoxifeno como el GW5638 pudieron inhibir igualmente el crecimiento de este tumor (ver la Figura 11) . EJEMPLO 7 El GW7604 Funciona como un Antiestrógeno en Células de Cáncer de Pecho MCF-7 Las células MCF-7 de cáncer de pecho humanas se cotrasfectaron transitoriamente con 0.9 microgramos/mililitro de vector de expresión de receptor de estrógeno humano, junto con 2 microgramos/mililitro del plásmido reportero C3-Luc, y 0.1 microgramos/mililitro del vector de expresión de pRSV-ß-galactosidasa (como un control interno para la eficiencia de la transfección) . Después de la transfección, las células se incubaron durante 48 horas en la presencia de 17-ß -estradiol y concentraciones crecientes de cada antagonista, como se indican. Subsecuentemente, se ensayaron las células transfectadas para determinar la actividad de luciferasa y ß-galactosidasa. La actividad de luciferasa normalizada se calculó dividiendo la luciferasa bruta (xlO4 U) para cada punto entre la actividad de ß-galatosidasa [ (A415 x 105) /tiempo en minutos] . Con referencia a la Figura 12, cada punto de datos en este experimento representa el promedio de determinaciones por triplicado de la actividad de transcripción bajo las condiciones experimentales dadas. El coeficiente promedio de variación en cada concentración de la hormona fue <10 por ciento. EJEMPLO 8 El Análisis del Efecto de Mutaciones Específicas del Receptor de Estrógeno Sobre la Farmacología de los Antiestrógenos Revela una Complejidad Mecánica Adicional Las células de carcinoma hepatocelular humano HepG2 se transfectaron transitoriamente con 0.9 microgramos/mililitro de un vector que expresaba el receptor de estrógeno humano (pRST7ER) (ver la Figura 13A) , o bien un mutante del receptor de estrógeno (ER-TAF1) (ver la Figura 13B) , en donde se ha inactivado la función FA-2 (ER-TAF1) junto con 2 microgramos/mililitro del promotor del complemento 3 (C3) que responde al estrógeno fusionado con el gen de luciferasa; 0.1 microgramos/mililitro del vector de expresión pRSV- ß-galactosidasa (como un control interno para la eficiencia de la transfec-ción) . Después de la transfección, las células se incubaron durante 48 horas en la presencia de solventes solamente, o de concentraciones crecientes de estradiol o antiestrógenos, como se indican. Subsecuentemente, las células transfectadas se ensayaron para determinar la actividad de luciferasa y ß-galactosidasa. Cada punto de datos en este experimento representa el promedio de determinaciones por triplicado de la actividad de transcripción bajo las condiciones experimentales dadas. El coeficiente promedio de variación en cada concentración de hormona fue <10 por ciento. Los datos mostrados en la Figura 13A y 13B indican que la mayoría de los antiestrógenos conocidos manifiestan una actividad agonista sobre los receptores de estrógeno mutados . El hecho de que el GW7604 no exhiba actividad agonista sobre cualquier mutante de receptor de estrógeno examinado hasta ahora, indica que este compuesto es útil en el tratamiento de tumores de pecho refractarios al tamoxifeno. EJEMPLO 9 Un Análisis Comparativo de la Capacidad de una Variedad de Antiestrógenos para Inhibir la Actividad de Transcripción de ERa y ERß Las células HeLa se transfectaron con un vector de expresión ERa (ver la Figura 14A) , o bien un vector de expresión ERß (ver la Figura 14B) , junto con una construcción de reportera de ERE-TK-luciferasa que responde al estrógeno. Subsecuentemente, se evaluó la capacidad de diferentes concentraciones de antagonista para inhibir la transcripción activada por estradiol (10~9) . Los resultados mostrados en las Figuras 14A y 14B indican que, con la excepción de idoxifeno, todos los antiestrógenos manifiestan actividades regularmente equivalen-tes sobre ERa, mientras que sobre ERß, ni el raloxifeno ni el idoxifeno manifiestan una potente actividad antagonista. Además, estos datos indican que el GW7604 es un potente pan-antagonista de ambas formas del receptor de estrógeno humano. EJEMPLO 10 Análisis de Inmunotinción Western de la Expresión del Receptor de Estrógeno en Células Objetivo en Seguida del Tratamiento con Agonistas o Antagonistas Las líneas celulares seleccionadas se incubaron durante 48 horas en la presencia de solvente o de estradiol 10 nM, o antiestrógeno, como se indica. Se prepararon extractos nucleares, y se separaron las muestras mediante desnaturalización-PAGE, se transfirieron a una membrana de nylon, y se estimó la expresión relativa del receptor de estrógeno en seguida de estos tratamientos mediante inmunotin-ción Western utilizando el anticuerpo monoclonal específico de receptor de estrógeno H222. La Figura 15A muestra el contenido de receptor de estrógeno nuclear endógeno de la células MCF-7 (10 microgramos/pista) . La Figura 15B muestra el contenido de receptor de estrógeno nuclear endógeno de células Ishikawa (100 microgramos/pista) . La Figura 15C se refiere a las células Ishikawa transitoriamente transfectadas con 0.9 microgramos/mililitro de receptor de estrógeno (pRST7ER) , y se utilizaron 10 microgramos/pista de extracto nuclear para la detección. Los niveles de rector de estrógeno se cuantificaron mediante densitometría de inmunotinción. Los resultados mostrados en las Figuras 15A-15C son representativos de múltiples experimentos realizados bajo las mismas condiciones. EJEMPLO 11 Análisis de Inmunotinción Western de la Expresión Endógena del Receptor de Estrógeno en Células MCF-7 en Seguida de Tratamientos de Corto Plazo Con Agonistas o Antagonistas Las células de cáncer de pecho humano MCF-7 se indujeron durante 1 hora (Figura 16A) o durante 4 horas (Figura 16B) en la presencia de solvente o de estradiol 10 nM, o antiestrógeno, como se indica. Se prepararon extractos nucleares, y las muestras se separaron mediante desnaturalización-PAGE, se transfirieron a una membrana de nylon, y se estimó la expresión relativa de receptor de estrógeno en seguida de estos tratamientos mediante inmunotinción Western utilizando el anticuerpo monoclonal específico de receptor de estrógeno H222. Los niveles de receptor de estrógeno se cuantificaron mediante densitometría de inmunotinciones . Los resultados mostrados en las Figuras 16A y 16B son représentativos de múltiples experimentos realizados bajo las mismas condiciones . EJEMPLO 12 Análisis de Inmunotinción Western de la Expresión Endógena del Receptor de Estrógeno en Células Ishikawa (Células Uterinas Cultivadas) en Seguida de Tratamientos de Corto Plazo con Agonistas o Antagonistas Las células de adenocarcinoma endometrial humano Ishikawa se incubaron durante una hora (Figura 17A) , o durante 4 horas (Figura 17B) en la presencia de solvente, o estradiol 10 nM, o antiestrógeno, como se indica. Se prepararon extractos nucleares, y las muestras se separaron mediante desnaturalización-PAGE, se transfirieron a una membrana de nylon, y se estimó la expresión relativa del receptor de estrógeno en seguida de estos tratamientos mediante inmunotin-ción Western, utilizando el anticuerpo monoclonal específico de receptor de estrógeno H222. Los niveles de receptor de estrógeno se cuantificaron mediante densitometría de inmunotinciones . Los resultados mostrados en las Figuras 17A y 17B son representativos de múltiples experimentos realizados bajo las mismas condiciones . EJEMPLO 13 Análisis de Inmunotinción Western de la Expresión Endógena del Receptor de Estrógeno de Células Enteras, Nuclear, y Citoplásmica, en Células Ishikawa, en Seguida de Tratamientos de Corto Plazo con Agonistas o Antagonistas Las células de adenocarcinoma endometrial humano Ishikawa se indujeron durante 1 hora en la presencia de solvente, o estradiol 10 nM, o antiestrógeno. Se prepararon extractos de células enteras (Figura 18A) , nucleares (Figura 18B) , y citoplásmicos (Figura 18C) , y las muestras se separaron mediante desnaturalización-PAGE, se transfirieron a una membrana de nylon, y se estimó la expresión relativa del receptor de estrógeno en seguida del tratamiento mediante inmunotinción Western, utilizando el anticuerpo monoclonal específico de receptor de estrógeno H222. Los niveles de receptor de estrógeno se cuantificaron mediante densitometría de inmunotinciones. Los resultados mostrados en las Figuras 18A-18C son representativos de múltiples experimentos realizados bajo las mismas condiciones.

EJEMPLO 14 El GW7604 Inhibe la Proliferación de Células MCF-7 Estimulada por E2 Meta: Determinar la capacidad del GW5638 para inhibir la proliferación celular estimulada por estrógeno de cáncer de pecho MCF-7 en vivo. Diseño Experimental: Se recubren entre 25,000 y 50,000 células por cavidad, en placas de 24 cavidades. Las células se recubren en un medio exento de rojo de fenol. Después de la unión, las células se estimulan ya sea con antiestrógeno solo, o bien con estrógeno y antiestrógeno. El tiempo de inducción es desde 12 hasta 48 horas, dependiendo del experimento . Se agregan 4? (4µCi) de timidina, [metil-3H] - a cada cavidad. Se incuba a 37°C durante 2 a 4 horas. Se aspira el medio, y se lava dos veces con suero regulado con fosfato helado. Se lava una vez con TCA (ácido tricloroacético) al 10 por ciento helado. Se agregan 2 mililitros de ácido tricloroacético al 10 por ciento a cada cavidad. Se incuba a 4°C durante 1 a 2 horas. Se lava una vez con ácido tricloroacético. Se agrega 1 mililitro de NaOH 0.2 N.

Se transfiere cada cavidad a un frasco de cintilación conteniendo 2 mililitros de fluido de cintilación. Se pone en remolino y se cuenta [3H] . Los resultados indicarán la capacidad de los diferentes compuestos para inhibir la proliferación celular basal e inducida por estrógeno de células MCF-7. (ver las Figuras 19A-19C) .

Todos los documentos citados anteriormente se incorporan a la presente en su totalidad como referencia. Un experto en la materia apreciará, a partir de una lectura de esta divulgación, que se pueden hacer diferentes cambios en la forma y el detalle sin apartarse del verdadero alcance de la invención.

Tabla 1 QW5630 QW7604 taxaoxifeno estradiol IC1162780

Claims (10)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la invención que antecede, se considera como una novedad, y por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES 1. Un método para prevenir o tratar un cáncer estimulado por estrógeno en un mamífero, el cual comprende administrar a este mamífero una cantidad de un compuesto de la fórmula I : en donde : R1 es - (CH2) nCR5=CR6R7 , - (CH2) raC (X) NR8R9 ; R» %* + Ri; R2 y R3 son independientemente H, -CH3, -OH, -OCH3, -0CH2CH3 ó -CH(CH3)2; R4 es -CN, -N02, -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2-Y, ó -Y; R5 y R6 son independientemente H, -alquilo de 1 a 4 átomos de carbono -alquenilo de 2 a 4 átomos de carbono, -alquinilo de 2 a 4 átomos de carbono, -X-alquilo de 1 a 3 átomos de carbono, -X-alquenilo de 2 a 4 átomos de carbono, -X-alquinilo de 2 a 4 átomos de carbono- ó -Y; R7 es -CN, -alquilo de 1 a 4 átomos de carbono-OH, -C (O) NR10R", -C (O) NR12R13, -alquilo de 1 a 4 átomos de carbono-NR^R11, -C(0)R12, -C(0)OR12, -C (0)NR12OR13, -C(0)NHC(0)R12, -C(0)NHCH2R12, -C (NH2) (ÑOR12) , -S(0)R12, -S (0) -(O) (OR12) , -S(0) (O) (NHC02R12) , P03R12, -P(O) (NR12R13) (NR12R13) , -P (0) (NR12R13 (OR14) , -CONR12 (CH2) q OCH3, -CONR12 (CH2) qNR8R9oxadiazol , sustituido con metilo; R8 y R9 son independientemente hidrógeno, -alquilo de 1 a 7 átomos de carbono, -cicloalquilo de 3 a 7 átomos de carbono, -O-alquilo de 1 a 7 átomos de carbono, -alquilo de 1 a 7 átomos de carbono-Y, o fenilo; R10 y R11 son independientemente metilo o etilo, o tomados juntos, forman un grupo morfolino enlazado por medio de su átomo de nitrógeno; R12, R13, y R14 son independientemente H, -alquilo de 1 a 12 átomos de carbono, -alquenilo de 2 a 12 átomos de carbono, -alquinilo de 2 a 12 átomos de carbono, -O-alquilo de 1 a 12 átomos de carbono, -O-alquenilo de 2 a 12 átomos de carbono, -O-alquinilo de 2 a 12 átomos de carbono, -cicloalquilo de 3 a 7 átomos de carbono, -cicloalquenilo de 3 a 7 átomos de carbono, -heteroalquilo lineal y cíclico, arilo, heteroarilo, o -Y; X es oxígeno o azufre; Y es un halógeno; n es un entero seleccionado a partir del 0.1, ó 2; m es el entero 1 ó 2; p es un entero seleccionado a partir de 1 a 4 ; y q es un entero de 1 a 12, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, suficiente para efectuar la prevención o el tratamiento mencionados, siendo este cáncer resistente a un modulador del receptor de estrógeno diferente del compuesto de la fórmula I.
2. 2. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque el cáncer es cáncer de pecho, cáncer uterino, cáncer de ovario, o cáncer del colon.
3. 3. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 2, caracterizado porque el cáncer es cáncer del pecho .
4. 4. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado por el cáncer mencionado es resistente al tamoxifeno, idoxifeno, raloxifeno, ó ICI 182,780.
5. 5. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque el cáncer mencionado es resistente de novo al modulador del receptor de estrógeno.
6. 6. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque la resistencia al modulador del receptor de estrógeno es adquirida.
7. 7. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto es GW5638 ó GW7604.
8. 8. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende administrar al mamífero una cantidad efectiva de cuando menos un compuesto seleccionado a partir del grupo que consiste en un antiestrógeno, un ligando de ácido retinoico o receptor retinóxido X, una antiprogestina, un antiandrógeno, vitamina D o su metabolito, un inhibidor de transferasa de farnesilo, un agonista de PPARa o gamma, y un inhibidor de cinasa MAP.
9. 9. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque este método es un método de tratamiento.
10. 10. Un método para prevenir o tratar un desorden proliferativo benigno en un mamífero, el cual comprende administrar a este mamífero un compuesto de la Fórmula I: en donde: R1 es - (CH2)nCR5=CR6R7, - (CH2) raC (X)NR8R9; (CH,), R2 y R3 son independientemente H, -CH3, -OH, -0CH3, -OCH2CH3 ó -CH(CH3)2; R4 es -CN, -N02, -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2-Y, ó -Y; R5 y R6 son independientemente H, -alquilo de 1 a 4 átomos de carbono -alquenilo de 2 a 4 átomos de carbono, -alquinilo de 2 a 4 átomos de carbono, -X-alquilo de 1 a 3 átomos de carbono, -X-alquenilo de 2 a 4 átomos de carbono, -X-alquinilo de 2 a 4 átomos de carbono- ó -Y; R7 es -CN, -alquilo de 1 a 4 átomos endometriosis o un fibroide uterino. 12. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 10, caracterizado porque este método es un método de tratamiento. 13. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 10, caracterizado porque el compuesto es GW5638 ó GW7604. 14. Un método para prevenir o tratar enfermedad de Alzheimer, degeneración macular, incontinencia urinaria, o diabetes Tipo II en un mamífero, el cual comprende administrar a este mamífero un compuesto de acuerdo con la Fórmula I: en donde: R1 es - (CH3) nCR5=CR6R7, - (CH2) mC (X) NR8R9; ó R» ** (CHi), R2 y R3 son independientemente H, -CH3, -OH, -OCH3, -OCH2CH3 ó -CH(CH3)2; R4 es -CN, -N02, -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2-Y, ó -Y; R5 y R6 son independientemente H, -alquilo de 1 a 4 átomos de carbono -alquenilo de 2 a 4 átomos de carbono, -alquinilo de 2 a 4 átomos de carbono, -X-alquilo de 1 a 3 átomos de carbono, -X-alquenilo de 2 a 4 átomos de carbono, -X-alquinilo de 2 a 4 átomos de carbono- ó -Y; R7 es -CN, -alquilo de 1 a 4 átomos de carbono-OH, -C (O) NR^R11, -C (O) NR12R13, -alquilo de 1 a 4 átomos de carbono-NR10Rp, -C(0)R12, -C(0)OR12, -C (O) NR12OR13, -C(0)NHC(0)R12, -C(0)NHCH2R12, -C (NH2) (ÑOR12) , -S(0)R12, -S (O) - (O) (OR12) , -S(O) (O) (NHC02R12) , P03R12, -P(O) (NR12R13) (NR12R13) , -P(O) (NR1R13 (OR14) , -C0NR12(CH2)q OCH3, -CONR12 (CH2) qNR8R9oxadiazol , sustituido con metilo; R8 y R9 son independientemente hidrógeno, -alquilo de 1 a 7 átomos de carbono, -cicloalquilo de 3 a 7 átomos de carbono, -O-alquilo de 1 a 7 átomos de carbono, -alquilo de 1 a 7 átomos de carbono-Y, o fenilo; R10 y R11 son independientemente metilo o etilo, o tomados juntos, forman un grupo morfolino enlazado por medio de su átomo de nitrógeno; R12, R13, y R14 son independientemente H, -alquilo de 1 a 12 átomos de carbono, -alquenilo de 2 a 12 átomos de carbono, -alquinilo de 2 a 12 átomos de carbono, -O-alquilo de 1 a 12 átomos de carbono, -O-alquenilo de 2 a 12 átomos de carbono, -O-alquinilo de 2 a 12 átomos de carbono, -cicloalquilo de 3 a 7 átomos de carbono, -cicloalquenilo de 3 a 7 átomos de carbono, -heteroalquilo lineal y cíclico, arilo, heteroarilo, o -Y; X es oxígeno o azufre; Y es un halógeno; n es un entero seleccionado a partir del 0.1, ó 2; m es el entero 1 ó 2; p es un entero seleccionado a partir de 1 a 4; y q es un entero de 1 a 12, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en una cantidad suficiente para efectuar dicha prevención o el tratamiento. 15. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 14, caracterizado porque este método es un método de tratamiento. 16. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 14, caracterizado porque el compuesto es GW5638 ó GW7604. 17. Un método para prevenir la concepción en un mamífero hembra, el cual comprende administrar a este mamífero un compuesto de la fórmula I : en donde : R1 es - (CH2) nCR5=CR6R7 , - (CH2) mC (X) NR8R9 ; ó R' R* •Rr. <CH,V R2 y R3 son independientemente H, -CH3, -OH, -0CH3, -OCH2CH3 ó -CH(CH3)2; R4 es -CN, -N02, -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2-Y, ó -Y; R5 y R6 son independientemente H, -alquilo de 1 a 4 átomos de carbono -alquenilo de 2 a 4 átomos de carbono, -alquinilo de 2 a 4 átomos de carbono, -X-alquilo de 1 a 3 átomos de carbono, -X-alquenilo de 2 a 4 átomos de carbono, -X-alquinilo de 2 a 4 átomos de carbono- ó -Y; R7 es -CN, -alquilo de 1 a 4 átomos de carbono-OH, -C (O) NR10R , -C (O) NR12R13, -alquilo de 1 a 4 átomos de carbono-NR^R11, -C(0)R12, -C(0)OR12, -C (O) NR12OR13, -C(0)NHC(0)R12, -C(0)NHCH2R12, -C (NH2) (ÑOR12) , -S(0)R12, -S (O) - (O) (OR12) , -S(O) (O) (NHC02R12) , P03R12, -P(O) (NR12R13) (NR12R13) , -P(O) (NR12R13(OR14) , -CONR12(CH2)q OCH3, -CONR12 (CH2) gNR^oxadiazol , sustituido con metilo; R8 y R9 son independientemente hidrógeno, -alquilo de 1 a 7 átomos de carbono, -cicloalquilo de 3 a 7 átomos de carbono, -O-alquilo de 1 a 7 átomos de carbono, -alquilo de 1 a 7 átomos de carbono-Y, o fenilo; R10 y R11 son independientemente metilo o etilo, o tomados juntos, forman un grupo morfolino enlazado por medio de su átomo de nitrógeno; R12, R13, y R14 son independientemente H, -alquilo de 1 a 12 átomos de carbono, -alquenilo de 2 a 12 átomos de carbono, -alquinilo de 2 a 12 átomos de carbono, -O-alquilo de 1 a 12 átomos de carbono, -O-alquenilo de 2 a 12 átomos de carbono, -O-alquinilo de 2 a 12 átomos de carbono, -cicloalquilo de 3 a 7 átomos de carbono, -cicloalquenilo de 3 a 7 átomos de carbono, -heteroalquilo lineal y cíclico, arilo, heteroarilo, o -Y; X es oxígeno o azufre; Y es un halógeno; n es un entero seleccionado a partir del 0.1, ó 2 ; m es el entero 1 ó 2; p es un entero seleccionado a partir de 1 a 4 ; y q es un entero de 1 a 12, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en una cantidad suficiente para efectuar dicha prevención. 18. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 17, caracterizado porque el compuesto mencionado es GW5638 ó GW7604.