CZ76699A3

CZ76699A3 - Způsob léčení postmenopauzálních chorob, včetně osteoporozy

Info

Publication number: CZ76699A3
Application number: CZ99766A
Authority: CZ
Inventors: Jeremy N. Bradbeer; Maxine Gowen
Original assignee: Smithkline Beecham Corporation
Priority date: 1996-09-06
Filing date: 1997-09-03
Publication date: 1999-08-11
Also published as: EP0929216A4; AU4409797A; BR9711681A; AR008155A1; CO4920218A1; WO1998009519A1; JP2002515047A; JP2002515046A; TR199900506T2; CA2264775A1; AU4247397A; TR199900504T2; NO991096L; BR9711676A; CN1236299A; CO5070658A1; EP0929216A1; PL332278A1; EP0927029A4; TW411273B

Description

(57) Anotace:

Metoda prevence postmenopauzálních chorob bez zjevných uterotrofních efektů. Metoda zahrnuje podání účinného množství sloučeniny obecného vzorce I, kde symboly X, R¹ a Ř²mají specifický význam.

Ť-i. y

CZ 766-99 A3

I φ * «φφφ φφφφ φ

Φ £ ΦΦΦ

Φφφ «

*φ

Způsob léčeni postmenopauzálnich chorob, včetně osteoporozy

Oblast techniky

Tento vynález se týká terapeutických prostředků, které se vážou na estrogenový receptor, a bylo nalezeno, že jsou užitečné pro léčbu osteoporozy.

Dosavadní stav techniky

Snížení hladiny estrogenů, ke kterému dochází v menopauze, je důležitým etiologickýrn faktorem ve zvýšení incidence osteoporotických fraktur a kardiovaskulární choroby u postmenopauzálnich žen. Ačkoliv postmenopauzální ztrátě kosti lze předejít estrogen nahrazující léčbou, (estrogen replacement therapy (ERT)), ERT sama o sobě zvyšuje riziko vzniku karcinomu endometria. Ideální léčba by měla mít zachované žádané skeletální a kardiovaskulární účinky estrogenů, bez nežádoucích účinků na reprodukční tkáně. Tamoxifen je antiestrogen, u kterého bylo prokázáno, že snižuje hladiny cholesterolu a chrání proti kostním ztrátám u postmenopauzálnich žen. Tamoxifen je též účinný u modelu osteoporozy na ovarektomizované kryse, jako modelu. Avšak bylo prokázáno, že tamoxifen má nežádoucí vedlejší účinky, zejména ty, že způsobuje hyperplazíi endometria a karcinom endometria, . viz:

1. R.R. Love, D.A. Weibe, P.A. Newcomb, L. Cameron, H. Leventhal, V.C. Jordán, J. Feyzi, D.L. DeMets, Effects of tamoxifen on cardiovascular risk factors in postmenopausal women, Annals of internal medicine, 115, 860-864 (1991).

2. R.R. Love, R.B. Mazess, H.S. Barden, S. Epstein, P.A. Newcomb, V.C. Jordán, P.P. Carbone, D.L. DeMets, Effěcts of • « * · · · · · · · · • · 9 · · · > ···♦·· • · · · · · · »·«Ι ··· ·» ··· · ·· tamoxifen on bone minerál density in postmenopausal women with breast cancer, New England Journal of Medicine, 326, 852,856 (1992).

3. R.T. Turner, G.K. Wakely, K.S. Hannon, N.H. Bell,

Tamoxifen inhibits osteoclast-mediated resorption of trabecular bone in ovarian hormone-deficient rats,

Endocrinology, 122, 1146-1150 (188) .

Podstata vynálezu

Tento vynález poskytuje metodu prevence a léčby postmenopauzálních chorob, která nemá zjevné uterotrofni efekty. Metoda zahrnuje podáni člověku, který to potřebuje, účinného množství sloučeniny obecného vzorce I

(I) kde

X představuje atom jodu nebo bromu v poloze 3 nebo 4 a symboly R a R , které mohou být stejné nebo rozdílné, představují alkylovou skupinu s 1 až 3 atomy uhlíku, zejména methylovou či ethylovou skupinu, nebo

R představuje atom vodíku a R představuje alkylovou skupinu s 1 až 3 atomy uhlíku, nebo

4 • · · ♦ • 4 * ··*

R¹ a R² společně s atomem dusíku, na který jsou navázány, představují nasycenou heterocyklickou skupinu, obvykle s 5 nebo 6 atomy v kruhu, zejména pyrrolidinoskupinu, piperidinoskupinu, 4-metylpiperidino-skupinu nebo morfoíinoskupinu, a jejich farmaceuticky přijatelné adiční soli s kyselinou.

Podrobný popis vynálezu

Přítomný vynález je terapeutická metoda pro léčení postmenopauzálních chorob skupinou sloučenin, které byly připraveny již dříve a ohodnoceny jako účinné v léčbě karcinomu prsu pozitivního na estrogenový receptor. Tyto sloučeniny byly popsány výše v obecném vzorci I a v US patentu č. 4 839 155.

Preferovanou sloučeninou pro popsanou metodu léčby je

(E)-1-[2-[4-[1-(4-jodfenyl)-2-fenyl-l-butenyl]fenoxy]pyrrolidin.

A A . A A A A AA AA

AAA «ΑΑ*

Á AAAA A AA A

A A Aa » · · AAA *AA

A · * A A · *

AAAA AAA AA AAA AA K

Takovéto sloučeniny jsou známé svou schopností vázat se na estrogenový receptor a vyvolávat buď estrogen agonístické či antagonistické účinky, v závislosti na studované tkáni.

Termín postmenopauzální choroby se vztahuje na osteoporozu a atherosklerotická kardiovaskulární onemocnění, jako jsou infarkt myokardu, cévní mozková příhoda a zvýšení piazmatického cholesterolu. Metoda podle tohoto vynálezu je vhodná pro prevenci ztráty kostní tkáně a pro vytváření takového piazmatického lipidového profilu, který je spojen s redukcí rizika vzniku atherosklerozy.

Schopnost zabránit ztrátě kostní tkáně je stanovena studiemi modelu osteoporozy na ovarektomizované kryse a studiemi u postmenopauzálních žen.

Histomorfometrické studie ukázaly, že pokud jsou dospělé krysí samici odstraněna ovaria, dojde k progresivnímu úbytku kosti v proximální metafyze tibie. Tři měsíce po ovarektomii (OVX) bylo odbouráno 60 až 70 % spongiozní kosti zvýšením kostního metabolismu, při kterém převažuje zvýšení kostní resorpce. Ke kostní ztrátě dochází také v lumbální páteři, ale pomaleji. Ovarektomii indukovaná ztráta kosti u krys, které může být kompletně předejito substitučními dávkami estrogenů, tvoří základ nejvíce užívaného a”nejlepe charakterizovaného zvířecího modelu osteoporozy.

Byly používány krysy kmene Sprague-Dawley ve věku 7 až 8 měsíců. Základní hodnoty kostní minerální hustoty (BMD) byly měřeny absorpční fotometrií s dvojitou energií rentgenového záření (duál energy x-ray absorptiometry =

0 00

0 0 *

0 0 0

000 000 ·

0 0 0 • · I * 0 0 · *

0 0 * 0

0*0 0 0 0

0« 000« * · ·

0 · · 0 • * 0 • · ·

0 ··«

DXA) v 3 až 6 lumbálním regionu páteře a v proximální metafyze tibie. Krysy byly následně rozděleny do skupin po 8 až 10, které měly přibližně stejné střední hodnoty a standardní odchylky lumbálního BMD. Skupiny krys byly oboustranně ovarektomizovány (OVX), a v každém experimentu byla jedné skupině zavedena simulace.

Idoxifen pro perorální dávkování byl připraven jako suspenze v 1% vodném roztoku karboxymethylcelulozy. Krysám byla dávka podávána perorálně žaludeční sondou, jednou za den. V každém experimentu vždy jedna z OVX skupin a jedna simulovaná skupina dostaly jednou za den žaludeční sondou perorální dávku vehikula. Dávkování začalo v den následující po operaci.

Plazmatické hladiny cholesterolu byly stanoveny po 2 týdnech léčby. Lumbální a tíbiální BMD byly měřeny v 1měsíčních intervalech. Zvířata byla usmrcena, dělohy byly vyjmuty a byla stanovena jejich vlhká hmotnost. Tibie byly post mortem sebrány, zality a nařezány na histomorfometrii (15) . Oblast spongiozy a perimetr byly měřeny v sekundární spongioze, ve vzdálenosti 1,2 mm od růstové ploténky.

Oblast spongiozy (cancellous bone area = Cn.B.Ar.) byla vyjádřena jako procento medulární oblasti. Sekundární strukturální parametry, šíře kostních trámců, počet kostních trámců a jejich separace byly vypočítány z oblasti .primárníma z měření perimetru^: při použití rovnic'vyvinutých Parfittem a kol.

Počáteční dávku vymezující studie účinku idoxifenu na kostní ztrátu, plazmatický cholesterol a hmotnost uteru u modelu osteoporozy u ovarektomizované krysy ·· 1 4 4 4 · 4 4 * · ·· • · · 4 4 9 4 4 9 4 * « 4 4 4 4 9 9 9 · · «» 4 4 4 «««··· · · · · » <«4· ·4· 44 44« ·’ ·♦

Cílem této studie bylo stanovení optimální dávky idoxifenu pro prevenci kostní ztráty u, modelu osteoporozy na OVX ovarektomizované kryse.

BMD byio měřeno po' 1, 2 a 3 měsících léčby.

K odstraňování tibií na histomorfometrii .bylo ještě připojeno odebrání femurů a obratlů (Ll a 2) na ex vivo měření BMD (pouze u femurů) a na mechanické testování.

Idoxifen byl podáván v dávkách 2, 8, 40 a 200 pg/kg za den.

Podle všech naměřených parametrů byla neúčinná dávka idoxifenu 2 pg/kg.

Pouze dávka idoxifenu 200 pg/kg vedla k signifikantní prevenci ovarektomií indukovaného snížení BMD v lumbální páteři. Tato dávka byla účinná a vedla ke 100% inhibici kostního úbytku po jednom měsíci. Po 3 měsících léčby vedl idoxifen v dávce 2.00 pg/kg k přibližně 50% inhibici kostního, úbytku v lumbální páteři.

Po 1 měsíci vedly dávky idoxifenu 8 až 200 pg/kg k· přibližně 50% inhibici kostního úbytku v proximální tibií.

Po 3 měsících poklesl tento stupeň protekce asi na 25%, což není signifikantní. Tento poznatek napovídá, že 200 pg/kg idoxifenu není dávka optimální pro toto skeletální místo.

. . -Kostní minerální-hustota měřená ex vivo ukázala, žé

200 pg/kg idoxifenu stačilo k udržení proximální femorální BMD na úrovni hodnot kontrol simulací. Tato dávka také udržela oblast v medulárním příčném řezu v diafyze femuru na úrovni simulací jako kontrol, což značí, že idoxifen zabraňuje ztrátě jak kortikální, tak spongiozní kosti.

Idoxifen nepůsobil nežádoucím způsobem na mechanickou ·» '* «····» 4 4 4· i 4 · · 4 4*4 * 4 « 4 · 4 4444 4 ' 4 4

4 44 · 4 4 4« · 4 · 4

4. » 4 · · ·

4 4 4 «·· 44 ·4· 44 44 pevnost buď femorální diafýzy ve tříbodovém ohýbacím testu (3-point bending test) nebo na tělo obratle L2 v axiálním kompresním testu.

Histomorfometrie odhalila malý, ale nevýznamný účinek idoxifenu po třech měsících léčby na oblast spongiozy v proximální tibii, což bylo v souladu s BMD měřeními. Co se šíře kostních trámců týká, nebyly mez'i skupinami žádné rozdíly. Navzdory nedostatečnému účinku na spongiozu tibie za dlouhé období byla aktivita idoxifenu, v dávkách tak nízkých jako 40 pg/kg, zjevná na počtu a separaci kostních trámců.

Idoxifen (200 pg/kg) signifikantně snížil plazmatický cholesterol (obr. 5). Po třech měsících léčby způsobily všechny dávky idoxifenu vermi mírný, avšak statisticky významný vzestup hmotnosti uteru.

Dávku upravující studie účinku idoxifenu na ztrátu kosti, plazmatický cholesterol a hmotnost uteru, u modelu osteoporozy na ovarektomizované kryse

Cílem této studie bylo stanovení optimální dávky idoxifenu pro prevencí kostních ztrát u modelu osteoporozy na OVX ovarektomizované kryse. BMD bylo měřeno po 1 měsíci a léčba pokračovala po dobu dalších 2 týdnů před sběrem uterů-a tibii. · .....

Idoxifen v dávkách 200 až 500 pg/kg kompletně zabránil kostnímu úbytku v lumbální páteři. Idoxifen v dávce 1000 pg/kg neměl na lumbální páteř signifikantní účinek. Idoxifen v dávce 200 až 1000 pg/kg kompletně zabránil kostní ztrátě v proximální metafyze tibie.

• fl · ·«···· ·· ·· ‘.J • · ·· · * · «··· d • ·, · · · · · · · ♦ t · · · · ·····«·· - j • · · · a ·« Ci!

• «••••fl ··«·· flfl · · ,;η ýil

Histomorfometrie odhalila, že idoxifen v dávce 500 /’ pg/kg, optimálně zabránil ovarektomií vyvolanému úbytku i ?· spongiozni kosti. K zabránění ovarektomií vyvolaného .í snížení šíře kostních trámců došlo signifikantně při | dávkách idoxifenu 200 až 500 pg/kg. Počet kostních trámců byl významně zachován při dávkách idoxifenu 500 a 1000 ug/kg. Idoxifen v dávkách 200 až 1000 pg/kg. signifikantně předešel ovarektomií indukovanému zvýšení 'separace kostních trámců.

Všechny dávky idoxifenu významně snížily hladiny plazmatického cholesterolu (obr. 11). Idoxifen v žádné z testovaných dávek nepůsobil na vlhkou hmotnost uteru.

Dávka idoxifenu 500 pg/kg byla v souladu se všemi parametry měření, po šesti týdnech léčby u ovarektomizované krysy, určena jako optimální.

Během šesti týdnů léčby, byla optimální dávka idoxifenu stanovena na 500 pg/kg. Minimální dávka účinná pro prevenci kostní ztráty v páteři byla 200 pg/kg, a 100 pg/kg jako minimální dávka účinná pro snižování cholesterolu. Souhrnně, kost ochraňující a cholesterol snižující účinky idoxifenu jsou užitečné k prevenci postmenopauzálních onemocnění, aniž by tyto dávky měly významný uterotrofní účinek. - · - - - - - -

Tři různé dávky idoxifenu (2,5, 5 a 10 mg za den) podávané postmenopauzálním ženám, byly porovnávány s placebem, ve studii trvající tři měsíce. Na počátku této studie byla u těchto žen zjevná snížená kostní minerální hustota. Přítomnost účinku na kost, který by byl v souladu «« · ·* **·« ♦· ·· • · · ··· ♦ · · · • · · · · · · · · » · • · · * · · » ··♦·· « ♦ · · » * · ·«·· ··· «· ·«· · ·· se snížením rychlosti kostního úbytku, byl zjišťován prostřednictvím měření změn biochemických markérů resorpce kosti (exkrece zesíténého kolagenu močí, měřená jako exkrece C-telopeptidů, volného a celkového zesíténého kolagenu) a novotvorby kosti (sérový kalcitonin).

Pozorované snížení hladin těchto biochemických markérů v závislosti na dávce (viz. dále), je.příznačné pro snížení kostního metabolizmu, a je v souladu .s účinky estrogenů na kostní metabolizmus u postmenopauzálních žen. Všechny změny jsou popsány jako procentuální změna od základní hodnoty. Statisticky významné odchylky od placeba jsou vyznačeny následující .soustavou znamének: * = p <0,01, ** = p <0,001.

	Placebo	2,5	5,0	10,0
C-telo-	9,8	-0,2	-6,8	-16,0
peptid	(4,3)	(4,3)	(5,2)*	(6,3)**
Volný	4,4.	2,6	-1,5	-6,4
zesítě- ný kolagen	(3,0)	(3,0)	(2,4)	(2,3) *
Celkový	2,4	-4,8	-2,4	-12,6
zesítě- ný kolagen	(2,9)	(2,7)	(4,8)	(2,6) **
Kalci- '	-i ' - ’ ““	-6 '.....	-9	-17
tónin	(0,01)	(0,02)	(0,02) k k	(0,02) k k

Změny v hladinách různých lipidových parametrů, fibrinogenu a ostatních koagulačních/fibrinolytických ukazatelů byly rovněž stanoveny před začátkem a po ukončení

« * ··«« ·* ·· • · « « · · « · · · ί» · · · • «« · · · ·· * • · · · • · · · · · · léčby jako index možného účinku idoxifenu na riziko kardiovaskulární choroby. Výsledky této studie jsou popsány níže.

	Placebo	2,5	5,0	10,0
Celkový	0,5	-0,9	-4,2	-9,8
chole- sterol	(1,1)	(1,1)	(1,2)*	(1,1) **
LDL-	1,3	-1,3	-4,7	-15,2
chole- sterol	(1,5)	(2,0)	(1,7)*	(1,6) **
HDL-	2,4	2,1	-1,4	0,8
chole- sterol	(1,4)	(1,5)	(1,5)	(1,7)
Poměr	2,2	7,1	5,2	21,7
HDL/LDL	(1,6)	(2,6)	(2,1)	(3,1)**
Lipo-	5,0	-2,0	1,0	-6,0
protein (a)	(3,0)	(6,0)	(4,0)	(4,0)
trigly-	1,3	1,8	-3,2	3,8,
ceridy	(3,8)	(3,9)	(3,6)	(3,8)
fibri-	5,8	-1,7	-8,3	-16, 9
nogen	(3,0)	(2,4)	(3,1)*	(2,4)**
D-dimer	0,0 (3,1)	4,7 (4,3)	-2,1 (2,7)	-7,1 (2,7)
faktor	5,4	-10,1	-9,6	-11,1
VII	(2,4)	(2,4)**	(2,1)**	(1,6)**

Sloučeniny podle přítomného vynálezu a jejich farmaceuticky přijatelné soli, které jsou aktivní při podání perorální cestou, mohou být formulovány jako kapaliny, například sirupy, suspenze nebo emulze, tablety, * kapsle a pastilky.

0000 00 ··

0 0 0 0 0 0

0 000 0 00 0 «0 0 00 000 0··

0 0 0 0 • 0« 000 00 00

Kapalný prostředek se bude obecně skládat ze suspenze nebo z roztoku sloučeniny, či její farmaceuticky přijatelné soli, ve vhodném kapalném nosiči (nosičích), například v éthanoiu, glycerinu, nevodném rozpouštědle, například v polyethylenglykolu, olejích či ve vodě se suspendujícím přípravkem, konzervačním přípravkem, ochucovadlem nebo barvidlem.

Prostředek ve formě tablet může být zhotoven použitím jakéhokoliv vhodného farmaceutického nosiče (nosičů) rutinně používaných pro přípravu pevných lékových prostředků. Mezi příklady takového nosiče patří stearat hořečnatý, škrob, laktóza, sacharóza a celulóza.

Prostředek ve formě kapsle může být zhotoven použitím běžných enkapsulačních postupů. Například pelety obsahující aktivní složku mohou být^r připraveny z běžných nosičů a posléze plněny do tvrdé zelatinové kapsle; alternativně může být připravena disperze či suspenze použitím jakéhokoliv vhodného farmaceutického nosiče (nosičů), například vodných gumovitých látek, celulóz, silikátů nebo olejů, a touto disperzí či suspenzí plněna měkká zelatinové kapsle.

Sloučeniny podle přítomného vynálezu a jejich farmaceuticky přijatelné soli,' které'jsou aktivní' při parenterálním podání (to jest injekcí či infuzí) mohou být formulovány jako roztoky nebo suspenze.

Prostředek pro podání parenterální se bude obecně skládat z roztoku či suspenze aktivní složky ve sterilním vodném nosiči nebo v parenterálně přijatelném oleji,

fefe fefefefe fefe fefe « « · fefefefe • · «fefe · fefe · fefe fe fefe fefefe fefefe • · * fefe « fefefe·· fefe fefe například v polyethylenglykolu, polyvinylpyrrolidonu, lecithinu, arašídovém či sezamovém oleji. Alternativně může být roztok lyofilizován a následně, těsně před podáním, rekonstituován s vhodným rozpouštědlem.

Typické složení čípku zahrnuje sloučeninu podle přítomného vynálezu nebo její -farmaceuticky přijatelnou sůl, jež je aktivní při podání touto cestou, společně s pojivovým a/nebo lubrikačním přípravkem, jako jsou polymerní glykoly, želatiny nebo kakaové máslo či jiné rostlinné nebo syntetické vosky či tuky tající při nízké teplotě.

Typická transdermální formulace zahrnuje běžné vodné či nevodné vehikulum, například krém, mast, lotion nebo pastu, nebo je ve- formě lékem napuštěné sádry, náplasti čí membrány.

Farmaceutické prostředky adaptované k místnímu podání zahrnují roztoky, suspenze, masti a pevné vložky. Typické farmaceuticky přijatelné nosiče jsou například voda, směsi vody a s vodou mísitelných rozpouštědel jako jsou nižší alkanoly či rostlinné oleje, dále ve vodě rozpustné oftalmologicky přijatelné netoxické polymery, například deriváty celulózy jako'je methylcelulóza. Farmaceutické prostředky mohou též·obsahovat netoxické pomocné -látky jako jsou'emulgační/ konzervační,' zvlhčující a zpevňující přípravky, jako třeba polyethylenglykoly; antibakteriáiní složky jako jsou kvarterní amoniové sloučeniny; pufrovací přípravky jako je chlorid alkalického kovu; antioxidanty jako disiřičitan sodný; a jiné běžné složky jako monolaurátsorbitan.

• 0 « 4 • 4 • 0 0000

I 0 000 k · « ► 0 1

044 *0*0

Prostředek je s výhodou ve formě jednotkové dávky. Dávky sloučenin podle přítomného vynálezu ve farmaceutické jednotkové dávce budou účinná, netoxická množství pohybující se v rozmezí 0,01 až 200 mg/kg aktivní sloučeniny, přednostně 0,1 až 100 mg/kg. Svolená dávka je podána člověku při potřebě léčby či prevence osteoporozy, nebo snižování plazmatického cholesterolu, nebo pro prevencí kardiovaskulární choroby, jednou '.až šestkrát za den, perorálně, rektálně, místně, injekcí čí. kontinuálně infuzí. Perorální jednotkové dávky obsahují přednostně od 10 do 500 mg aktivní sloučeniny. Nižší dávky jsou obecně používány pro parenterální podání. Podání cestou perorální je používáno, pokud je to pro pacienta bezpečné, účinné a pohodlné.

Pokud jsou sloučeniny podle vynálezu podávány v souladu s přítomným vynálezem, neočekávají se žádné nepřijatelné toxikologícké účinky.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Perorální dávková forma pro podávání orálně aktivních sloučenin obecného vzorce I je zhotovena proséváním, míšením a plněním tvrdých želatinových kapslí přísadami, v- poměrech, - j ak je například uvedeno nízel »0 ·

0*

··· ··· • * • # · »

stearat hořečnatý laktóza mg 100 mg

Příklad 2

Sacharóza, dihydrát síranu vápenatého a orálně aktivní sloučeniny obecného vzorce I jsou míšeny, a granulovány s 10% želatinizujícím roztokem. Vlhké granule jsou prosévány, sušeny, míšeny se škrobem,' mastkem a kyselinou stearovou, prosévány a slisovány do tablet.

Složky ____,_Množství (E.) -1 - [ 2 — [4 - [1- (4-jodfenyl) -2-fenyl-1-butenyl] fenoxy]pyrrolidin 75 mg dihydrát síranu vápenatého 100 mg sacharóza 15 mg škrob 8 mg mastek 4 mg kyselina stearová 2 mg

Příklad 3 mg (E)-1-[2-[4-[1-(4-jodfenyl)-2-fenyl-l-butenyl]fenoxy]pyrrolidinu je dispergováno ve 25 ml normálního fyziologického roztoku, za účelem přípravy -.in.jxkovatelného roztoku...... --- ..... ............

Příklad 4

Tento experiment byl proveden za účelem porovnání mechanizmu účinku idoxifenu a raloxifenu v osteoblastech. Použitím konstruktu obsahujícího element odpovědi na

0

00*0

0*0 * · · · • 0 00· 0 · · 0 • 0 0· 000 000 • 0 0 0 0 • 0 000 00 00 estrogen (estrogen response element = ERE), jež je umístěný nad reportérovým genem pro luciferázu (luciferase reportér gene) (posán níže), bylo nyní prokázáno, že idoxifen je, stejně jako estrogen, čistý agonista v osteoblastech prostřednictvím ERE. Síla agonistického účinku byla mezi přírodním steroidním hormonem estrogenem a idoxifenem obdobná. Raloxifen ve stejných koncentracích jako idoxifen (0,01 až 10 μΜ) vydal extrémně slabý signál, kterýbyl srovnatelně veliký jako kontrola vehikulem, a to prostřednictvím ERE.

Byly provedeny kompetiční experimenty, aby byl potvrzen mechanizmus účinku skrze tento element odpovědi. Raloxifen inhiboval agonistickou aktivitu jak estrogenů tak idoxifenu prostřednictvím ERE. Při dávkách ligandů (buď estrogenů nebo idoxifenu) 100 nM byla agonistická odpověď maximální. Současně probíhající léčba 500 nM raloxifenu redukovala aktivitu reportérového genu na úroveň kontrol vehikulem. Naproti ťomu, idoxifen v dávce 500 nM nezmenšoval v osteoblastech maximální agonistický účinek estrogenů v dávce 100 nM. V případě použití submaximálních koncentrací idoxifenu a estrogenů (méně než 100 nM) se projevil aditivní účinek těchto dvou agonistů v osteoblastech, skrze ERE.

Experimentální postupy

Buňky byly naočkovány buď na plotny o 6 jamkách při 1,5 χ 10⁵ buněk na jamku, nebo na plotny o 24 jamkách při 1,5 χ 10⁴ buněk na jamku, do media bez fenolové červeně. Konstrukt DNA obsahující promotor viru myšího mamárního tumoru, ve kterém byly elementy odpovědi na glukokortikdidy nahrazeny pěti kopiemi vitellogeninového elementu estro16 ·· *··· «« ·« » · « · l · · · ··« ··· ·· genové odpovědi, o 33 párech baží. Toto je proti směru reportérového genu pro iuciferázu (MMTV-ERE-Luc), (Wen,

D.X., Y-P.Xu, M.K. Goldman and P. McDonnel, The A and B isoforms of human progesterone receptor operáte through distinct signalling pathways within target cells, Molec. Cell. Biol., H, 8356-8364 (1994)). Vektor renillaluciferázy byl· použit ke korekci účinnosti transfekce při použití metody duální detekce luciferázy (Promega, Madison, WI). DNA byla zavedena do buněk osteosarkomu .krysy (Ros 17/2.8) lipofektinovou metodou (Life Technologies, Gaithersburg, MD). Buňky byly kotransfekovány s 2 pg na jamku do ploten se 6 jamkami, a se 140 ng ,na jamku u ploten s 24 jamkami, MMTV ERE-Luc a 25 ng kontrolního vektoru renilla-luciferázy (pRL-CMV). Účinnost transfekce byla korigována kotransfekcí vektorem renilla-luciferázy, který spotřebovává rozdílný substrát, coelenterazin, pro jeho bioluminescentní vlastnosti (readout) (Promega, Madison, WI). Buňky byly inkubovány přes noc. Transfekční medium bylo potom odstraněno a buňky byly inkubovány s hormony nebo bez nich po dobu 48 hodin. Buňky byly promyty fosfátem pufrovaným fyziologickým roztokem, poté lyžovány lx pasivním lytickým pufrem (PLB) v objemu 500 μΐ na jamku, po dobu 15 minut během třepání vzorku na třepací desce. Lyzáty byly po dobu 30 sekund centrifugovány při 12000 g a čistý lyzát poté přenesen do zkumavky, ještě před analýzou reporterového enzymu. Vzorky (20 μΐ) byly přeneseny do detekčni'plothý o 96~'jamkách á’poňéchány zreagovat se 100 μΐ každého testovacího činidla (Promega, Madison, WI).

Každé testovací činidlo bylo nainjikováno luminometrem microlumat LB96P (Wallac, Gaithersburg, MD), který měřil aktivitu luciferázy. Aktivita luciferázy poskytuje náhradu informace o transkripční aktivaci genu odpovídajícího na estrogen, který obsahuje element odpovědi na estrogen

• 4

(ERE). Proto upregulace aktivity luciferázy vypovídá o agonistickém účinku, zatímco down-regulace vypovídá o antagonismu skrze ERE.

Diskuse

Idoxifen je agonista v osteoblastech prostřednictvím elementu odpovědi na estrogen (ERE). Naproti idoxifenu je raloxifen v testovaných dávkách antagonista v osteoblastech prostřednictvím ERE, což napovídá o rozdílném mechanismu účinku šetřícím kost pozorovaného u raloxifenu. Proto je raloxifen schopen projevit své biologické účinky cestou sekvence obsahující non-ERE přítomnou na 5'-netranslatované oblasti humánního TGF£3 promotoru. V tom samém buněčném systému inhiboval raloxifen expresi ERE-obsahujícího vítellogeninového promotoru a vyvolával proto čistý estrogenový antagonismus. Element odpovědi na raloxifen (N.N. Yang, M. Venugopalan, S. Hardikar a A. Glasebrook, Identification of an estrogen response element activated by metabolites of 17fS-estradiol and raloxifene, Science, 273, 1222-1225, (1996)) není přítomný na stejných genech jako ERE, což napovídá, že modulace skrze tento element odpovědi bude vést k účinkům na rozdílných genech. Toto odlišuje mechanismus účinku idoxifenu od účinku estrogen-selektivního receptorového modulátoru{ŠERM), raloxifenu, a vyrovnává idoxifen s klasičtějšími mechanismy estrogénového’typu projevujícími své biologické agonistické účinky v osteoblastech skrze ERE. Účinky idoxifenu a estrogenů jsou specifické pro konstrukty reportéroveho genu, které nesou klasické ERE. Tento systém se ukázal jako citlivý na buněčné specifické faktory a je proto platným modelem pro účinky na endogenní transkripci genu.

Claims

NÁROKY postmenopauzálních tím, že se podá

PATENTOVÉ

1. Způsob prevence a léčby chorob, vyznačujíc! se účinné množství sloučeniny obecného vzorce I. subjektu, který to potřebuje.
2. Způsob podle nároku 1., vyznačuj í.c.í se t i m, že postmenopauzální chorobou je osteoporoza.
3. Způsob podle nároku 1., vyznačuj ící se t í m, že sloučeninou obecného -vzorce I je (E)-l—[2[4-[1-(4-jodfenyl)-2-fenyl-1butenyl]fenoxy]ethyl]pyrroíidin.
4. Použití.sloučeniny obecného, vzorce I k výrobě léčivého přípravku pro léčbu postmenopauzálních -chorob.
5. Použití podle nároku 4., kde postmenopauzální chorobou je osteoporoza.
6. Použití podle nároku 1., kde sloučeninou obecného vzorce I je (E)-1-[2-[4-[1-(4-jodfenyl)-2-fenyl-l-butenyl], fenoxy]ethyl]pyrroíidin.