CZ291352B6 - Retinoidy, jejich použití a farmaceutické přípravky na jejich bázi - Google Patents

Abstract

Retinoidy obecného vzorce I, kde C.sub.7.n.-C.sub.8.n. vazba je dvojná vazba a jeden ze symbolů R.sub.1.n. a R.sub.2.n. je alkyl s 1 až 4 C a zbývající je brom nebo jod, nebo R.sub.1.n. a R.sub.2.n., brány dohromady, představují alkylen se 3 až 13 C, jehož jeden atom C je popřípadě nahrazen sírou, kyslíkem nebo dusíkem; nebo C.sub.7.n.-C.sub.8.n. vazba je trojná vazba a R.sub.1.n. a R.sub.2.n. nezávisle je vždy alkyl s 1 až 4 atomy uhlíku, nebo R.sub.1.n. a R.sub.2.n., brány dohromady, představují alkylen se 3 až 13 C, jehož jeden atom C je popřípadě nahrazen sírou, kyslíkem, nebo dusíkem, nebo R.sub.1.n. a R.sub.2.n., brány dohromady spolu s C, k nimž jsou připojeny, představují aromatický kruh obsahující 5 až 6 atomů uhlíku nebo heteroaromatický kruh obsahující 5 až 6 atomů, v němž jedním atomem zbytku R.sub.1.n. nebo R.sub.2.n. je kyslík, dusík nebo síra a zbývající atomy zbytků R.sub.1.n. a R.sub.2.n. jsou atomy C; jakož i jejich farmaceuticky přijatelné soli, estery a amidy. Použití retinoidu vzorce I pro výrobu farmaceutického přípravku pro léčení pevných nádorů, leukemie nebo akné. Farmaceutické přípravky na bázi tohoto retinoidu.ŕ

Description

Oblast techniky

Vynález se týká retinoidů. jejich použití a farmaceutických přípravků na jejich bázi.

Dosavadní stav techniky

Retinové kyseliny působí přes navázání k rodině proteinů známých jako jaderný retinová kyselina receptor (..RAR). Tři členové této rodiny jsou označeni jako RARa, RARp a RARy. 9-cis retinová kyselina se váže ke skupině receptorů známých jako X receptory kyseliny retinové („RXR“) (Levin a spol., Nátuře. 355:359-361 (1992); Heyman a spol., Cell, 68:397-406 (1992)), zatímco plně-trans- a 13-cis-retinová kyselina, která se váže kRARa, ne. Nicméně 9-cis-retinová kyselina také působí jako ligand pro RAR skupinu receptorů a proto může působit nežádoucí vedlejší účinky plně-trans a 13-cis-retinové kyseliny. Jak RAR tak RXR receptory jsou známé jako tvořící heterodimery pro zprostředkování jejich biologických funkcí (Leid a spol., Cell, 68:377-395 (1992); Yu a spol., Cell, 67:1251-1266 (1991); Zhang a spol., Nátuře, 355:441-446(1992).

Sloučeniny, které se vážou k RXRa, ale nevykazují dostatečnou selektivitu, jsou známé z WO 95/04036.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu jsou retinoidy obecného vzorce I

kde

Cr-Cg vazba je dvojná vazba a jeden ze symbolů R_b a R2 představuje alkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku a zbývající představuje brom nebo jod, nebo R], a R₂, brány dohromady, představují alkylenskupinu se 3 až 13 atomy uhlíku, jejíž jeden atom uhlíku je popřípadě nahrazen heteroatomem zvoleným ze souboru zahrnujícího síru, kyslík a dusík; nebo Cr-Cg vazba je trojná vazba a Ri a R₂ nezávisle představuje vždy alkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, nebo R| a R₂, brány dohromady, představují alkylenskupinu se 3 až 13 atomy uhlíku, jejíž jeden atom uhlíku je popřípadě nahrazen heteroatomem zvoleným ze souboru zahrnujícího síru, kyslík a dusík, nebo Ri a R₂, brány dohromady spolu s atomy uhlíku, k nimž jsou připojeny, představují aromatický kruh obsahující 5 až 6 atomů uhlíku nebo heteroaromatický kruh obsahující 5 až 6 atomů, v němž jedním atomem zbytku R_t nebo R₂ je heteroatom zvolený ze souboru zahrnujícího kyslík, dusík a síru a zbývající atomy zbytků Ri a R₂ jsou atomy uhlíku;

jakož i jejich farmaceuticky přijatelné soli, estery a amidy.

-1 CZ 291352 B6

Předmětem vynálezu je dále také farmaceutický přípravek, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje retinoid obecného vzorce i nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl, ester nebo amid a farmaceuticky přijatelný inertní nosič.

Dále je předmětem vynálezu také farmaceutický přípravek v jednotkové dávkové formě pro orální podávání, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje první sloučeninu, kterou je retinoid, mající RARa aktivitu a druhou sloučeninu, kterou je retinoid obecného vzorce i podle nároku 1 nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, ester nebo amid, přičemž první sloučenina je přítomna v jednotkové dávkové formě v množství od 10 do 50 mg a druhá sloučenina je přítomna v jednotkové dávkové formě v množství odpovídajícím 1 až lOnásobku množství první sloučeniny.

Konečně je předmětem vynálezu také použití retinoidu podle nároku 1 pro výrobu farmaceutického přípravku pro léčení pevných nádorů, leukemie nebo akné.

Jestliže R! a R₂ tvoří společně C₃_i₃-alkylen, je výhodně tento C₃-6-alkylen, zejména C₆-alkylen. Jestliže R] a R₂ spolu tvoří s atomy uhlíku, ke kterým jsou navázány, aromatický kruh, jsou preferovanými aromatickými kruhy thiofen, benzen a pyridin. Ri a R₂ halogeny mohou být Cl, Br, F nebo 1, kde preferován je Br a I. Přednostním Ci^ alkylem je methyl.

Preferované sloučeniny podle vynálezu jsou sloučeniny vzorce I, kde Cr-Cg vazba je dvojná vazba, R_t a R₂ jsou nezávisle halogen nebo Ci ^-alkyl nebo Ri a R₂ spolu tvoří C₃_i₃-alkylen, ve kterém může být jeden atom uhlíku nahrazen heteroatomem vybraným ze skupiny, zahrnující síru, kyslík a dusík, nebo Rj a R₂ spolu tvoří s atomy uhlíku, ke kterým jsou připojeny, aromatický kruh, mající 5-6 atomů uhlíku, nebo heteroaromatický kruh, mající 5 až 6 atomů uhlíku, ve kterém jeden atom Rj nebo R₂ je heteroatom vybraný ze skupiny, zahrnující kyslík, dusík a síru a zbývající atomy Ri a R₂ jsou uhlík, a jejich farmaceuticky přijatelné soli, estery a amidy.

V jiném výhodném provedení se vynález týká sloučenin vzorce I, kde Cr-Cg vazba je trojná vazba, R^A a R2 jsou nezávisle (Ci-4-alkyl nebo R] a R2 spolu tvoří C3_]3-alkylen, ve kterém může být jeden atom uhlíku nahrazen heteroatomem vybraným ze skupiny, zahrnující síru, kyslík a dusík nebo Ri a R2 spolu tvoří s atomy uhlíku, ke kterým jsou připojeny aromatický kruh, mající 5-6 atomů uhlíku nebo heteroaromatický kruh, mající 5 až 6 atomů uhlíku, ve kterém jeden atom R^A nebo R2 je heteroatom vybraný ze skupiny, zahrnující kyslík, dusík a síru a zbývající atomy R] a R₂ jsou uhlík, a jejich farmaceuticky přijatelné soli, estery a amidy.

Sloučeniny podle vynálezu demonstrují vysoký stupeň selektivity proti RXR rodině receptorů ajsou vhodné jako antiproliferativní činidla a mají použití pro dermatologické a onkologické indikace, Zejména sloučeniny podle vynálezu inhibují proliferaci sebocytů. Proliferace sebocytů je známá jako vyvolávající akné. Proto inhibice proliferace sebocytů je známý prostředek pro léčbu akné a proto jsou sloučeniny podle vynálezu vhodné pro léčbu akné.

Dále RXR-sloučeniny podle vynálezu v dávkách, ve kterých jsou samy neaktivní, zvyšují aktivitu retinoidů, které jsou vhodné pro léčbu rakoviny, zejména leukemie a pevných nádorů, zejména nádorů hlavy, krku a prsu mezi pevnými nádory, zvláště výhodně nádorů prsu, a jsou také vhodné samy o sobě pro léčení dermatologických stavů, zejména akné a poškození kůže sluncem, se sníženými toxickými účinky ve srovnání s 9-cis- nebo 13-cis-retinovou kyselinou. Retinoidy, mající RARa aktivitu jako je all-trans-retinová kyselina a 13-cis retinová kyselina jsou sloučeniny, které mají biologickou aktivitu, která je založena na jejich vazbě k a transaktivaci RARa receptorů. Sloučeniny podle vynálezu jsou využitelné jako potenciátory aktivity retinoidů, majících RARa. aktivitu při léčení stavů, kde je známo, že takové retinoidy jsou vhodné. Podání sloučenin podle vynálezu v kombinaci s retinoidem, majícím RARa aktivitu umožňuje použití mnohem menších dávek retinoidů, nebo zvýšení potence retinoidů v obvyklé dávce, pro jakoukoliv z takových indikací, ve kterých je známo použití retinoidů, majícího RARa aktivitu.

-2CZ 291352 B6

Vynalez umožňuje potenciovat aktivitu retinoidů, majících RARa aktivitu, kdy se množství sloučeniny podle vynálezu, které je účinné pro potenciaci aktivity sloučeniny, mající RARa aktivitu (výhodné 1 až 10 násobek množství hmotnosti sloučeniny, mající RARa aktivitu) podává pacientovi ve spojení s účinným množstvím sloučeniny, mající RARa aktivitu. „Spojením s“ se míní, že RXR-selektivní sloučenina podle vynálezu může být podána spolu se sloučeninou, mající RARa aktivitu, výhodné bud v podstatě současně, ale ne nezbytně spojená sní do jednotlivé, orální dávkové formy, nebo v době před nebo po podání sloučeniny, mající RARa aktivitu, takže RXR-selektivní sloučenina a sloučenina, mající RARa aktivitu jsou současně přítomny v krevním proudu pacienta, takže RXR-selektivní sloučenina podle vynálezu je přítomna v koncentraci, která bude potenciovat aktivitu sloučeniny, mající RARa aktivitu. Výhodně RXR-selektivní sloučenina podle vynálezu a sloučenina, mající RARa aktivitu jsou podávány po sobě v intervalu ne delším než 4 hodiny, výhodněji ne delším než jednu hodinu a nej výhodněji současně.

V souladu s tímto vynálezem bylo zjištěno, že sloučeniny podle vynálezu potencují aktivitu retinoidů, majících RARa aktivitu při produkci diferenciace buněk lidské leukemie ve standardní zkoušce buněčné kultury. Sloučeniny podle vynálezu mají aktivitu, která bude potencovat známou aktivitu retinoidů, majících RARa aktivitu v produkci regrese nebo remise hematologických nádorů, zejména takových nádorů, které jsou spojeny s akutní promyelocytickou leukémií. Tato léčba leukemie by mohla být spojena s podáním sloučeniny podle vynálezu systémově pacientovi ve spojení s retinoidem, majícím RARa aktivitu, o kterém je známo, že je vhodný pro zpomalení progrese nebo produkci regrese hematologických nádorů. Množství bude záviset na množství a velikosti nádorů a na potřebách pacienta.

V souladu s vynálezem bylo také zjištěno, že sloučeniny podle vynálezu potencují aktivitu retinoidů, majících RARa aktivitu při produkci regrese nebo remise pevných nádorů, zejména nádorů spojených s rakovinou hlavy a krku a prsu. Sloučeniny podle vynálezu tak mají aktivitu, která bude potencovat známou aktivitu retinoidů, majících RARa aktivitu v produkci regrese nebo remise pevných nádorů, zejména těch nádorů, které jsou spojeny s rakovinou hlavy a krku a s rakovinou prsu. Toto léčení pevných nádorů by mohlo být provedeno podáním sloučeniny podle vynálezu systémově pacientovi ve spojení s retinoidem, majícím RARa aktivitu v produkci regrese nebo remise pevných nádorů, zejména hlavy, krku a prsu. Množství bude záviset na množství a velikosti nádorů a na potřebách pacienta.

Pro výše uvedené léčení se sloučenina podle vynálezu podává jako kompozice, obsahující sloučeninu podle vynálezu, popřípadě v kombinaci se sloučeninou, mající RARa aktivitu a farmaceuticky přijatelný nosič kompatibilní s uvedenou sloučeninou(ami). Při přípravě takové kompozice může být použit jakýkoliv běžný farmaceuticky přijatelný nosič. Jestliže se léčivo podává orálně, je obecně podáváno v řízených intervalech, obvykle v době jídla nebo jednou denně.

Farmaceuticky přijatelné soli zahrnují jakoukoliv sůl chemicky přijatelnou v oboru retinové kyseliny a aplikovatelnou lidským pacientům ve farmaceuticky přijatelném přípravku. Může být využita jakákoliv taková běžná farmaceuticky přijatelná sůl sloučenin podle vynálezu. Mezi běžné soli, které mohou být využity patří bazické soli, například soli alkalických kovů jako je sodík nebo draslík, soli kovů alkalických zemin jako je vápník nebo hořčík a amoniové nebo alkylamoniové soli.

V souladu s předloženým vynálezem mohou být sloučeniny podle vynálezu podávány ve formě svých farmaceuticky přijatelných esterů. Může být použit jakýkoliv farmaceuticky přijatelný hydrolyzovatelný ester v přípravcích a způsobech podle tohoto vynálezu. Mezi estery patří aromatické estery jako je benzyl (OBzl) nebo benzyl substituovaný nižším alkylem, halogenem, nitro, thio nebo substituovanou thio, tj. nižší alkyl, terc.-butyl, cyklopentyl, cyklohexyl, cykloheptyl a 9-fluorenylmethyl.

-3CZ 291352 B6

Farmaceutické přípravky mohou být vyrobeny vjakékoliv běžné formě, zahrnující: (a) pevnou formu pro orální podání jako jsou tablety, kapsle, pilule, prášky, granule a podobně a (b) přípravky pro topické podání jako jsou roztoky, suspenze, masti, krémy, gely, mikronizované prášky, aerosoly a podobně. Farmaceutické přípravky mohou být sterilizovány a/nebo mohou obsahovat přísady jako jsou chránící látky, stabilizátory', smáčecí činidla, emulgátory, soli pro měnění osmotického tlaku a/nebo pufry.

V souladu s tímto vynálezem jsou uvedené sloučeniny podle vynálezu vhodné ve farmaceuticky přijatelných orálních typech. Tyto farmaceutické přípravky podle vynálezu obsahují uvedenou sloučeninu podle vynálezu nebo její farmaceuticky přijatelné soli a její farmaceuticky přijatelné estery' ve spojení s kompatibilním farmaceuticky přijatelným nosičovým materiálem. Může být použit jakýkoliv běžný nosičovy materiál. Nosičovým materiálem může být organický nebo anorganický inertní nosičovy materiál vhodný pro orální podání. Vhodné nosiče zahrnují vodu, želatinu, arabskou gumu, laktózu, škrob, stearát horečnatý, talek, rostlinné oleje, polyalkylenglykoly, ropnou vazelínu a podobné. Dále mohou farmaceutické přípravky obsahovat jiná farmaceuticky přijatelná činidla, výhodně retinoid, mající RARa aktivitu. Další aditiva jako jsou příchuťová činidla, ochranné látky, stabilizátory, emulgační činidla, pufry a podobně, mohou být přidány v souladu s běžnou praxí kompaundování farmaceutik.

Farmaceutické přípravky mohou být vyrobeny vjakékoliv běžné orální dávkové formě, zahrnující pevnou formu pro orální podání jako jsou tablety, kapsle, pilule, prášky, granule a podobně. Preferovaná orální dávková forma zahrnuje tablety, kapsle - tvrdé nebo měkké, methylcelulózu nebo další vhodný materiál snadno rozpustný v trávicím traktu. Orální dávkové formy podle předloženého vynálezu se budou měnit podle potřeby jednotlivého pacienta jak bude stanovena ošetřujícím lékařem.

Při orálním podání pacientovi sloučeniny podle tohoto vynálezu pro potenciaci diferencující aktivity retinoidů, majících RARa aktivitu, které se používají pro léčbu akutní promyelotické leukemie, nebo nádorů hlavy, krku nebo prsu, se sloučenina podle vynálezu podává dospělému denně v množství asi. 1 až lOnásobku množství retinoidů, majícího RARa aktivitu. Množství podávaného retinoidů, majícího RARa aktivitu je od asi 20 mg/m² do asi 300 mg/m², výhodně od asi 50 mg/m² do asi 100 mg/m² denně, kde přesná dávka se mění v závislosti na velikosti a hmotnosti pacienta. Obecně se kombinační léčba provádí po dobu asi tří měsíců.

Sloučeniny podle vynálezu nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli nebo hydrolyzovatelné estery a retinoidy, mající RARa aktivitu mohou být podávány odděleně v souladu s vynálezem, ale budou výhodně podávány jako orální kompozice, obsahující sloučeninu podle vynálezu, její farmaceuticky přijatelné soli nebo estery v kombinaci s retinoidem, majícím RARa aktivitu v množství, dostačujícím pro to, aby kombinace léčila akutní promyelotickou leukémii nebo nádory hlavy, krku nebo prsu.

Obecně je preferovanou jednotkovou dávkovou formou tableta anebo kapsle, obsahující 10 až 50 mg retinoidů, majícího RARa aktivitu a sloučeninu podle vynálezu v množství od 1 do lOnásobku množství retinoidů, majícího RARa aktivitu, její farmaceuticky přijatelné soli nebo její farmaceuticky přijatelné hydrolyzovatelné estery. Množství sloučeniny podle vynálezu v každé tabletě nebo kapslí může být od 10 do 500 mg. Takové tablety nebo kapsle mohou být podávány jednou nebo dvakrát denně podle hmotnosti a velikosti pacienta.

V souladu s předloženým vynálezem jsou topická orální podání sloučenin podle vynálezu, jejich farmaceuticky přijatelných solí a jejich farmaceuticky hydrolyzovatelných esterů, plně účinná při léčbě, forem akné jako je zánětlivé a nezánětlivá forma.

Pro topické podání na kůži se výhodně připraví kompozice, obsahující sloučeninu podle vynálezu ve farmaceuticky přijatelném nosiči, jako mastě, tinktury, krémy, gely, roztoky, lotiony, spreje,

-4CZ 291352 B6 suspenze, šampony, vlasová mýdla a podobně, v souladu s vynálezem může být využita jakákoliv běžná kompozice pro aplikaci na pokožku hlavy nebo na kůži. Mezi výhodné metody aplikace kompozic, obsahujících účinnou složku podle vynálezu patří aplikace účinné složky podle vynálezu ve formě gelu, lotionu nebo krému. Farmaceutický přípravek pro topické podání na kůži může být připraven smísením uvedené účinné složky podle vynálezu s netoxickými, terapeuticky inertními, pevnými nebo kapalnými nosiči běžně v takových přípravcích používanými. Tyto přípravky by měly obsahovat alespoň asi 0,05 procenta, hmotn. účinné složky podle vynálezu vztaženo na celkovou hmotnost kompozice. Protože účinná složka podle vynálezu je relativně netoxická a nedráždivá, může být použita v topických kompozicích v množstvích přesahujících 3,0 %. Preferováno je, když tyto přípravky obsahují asi 1 až 2 % hmotnostní účinné složky podle vynálezu vztaženo na celkovou hmotnost kompozice. Také je výhodné aplikovat tyto přípravky jednou nebo dvakrát denně na kůži. Tyto přípravky mohou být aplikovány podle potřeby pacienta. Při provedení tohoto vynálezu může být účinná látka podle vynálezu také aplikována ve vodném roztoku nebo alkoholovém roztoku jako je ethylalkohol.

Při přípravě topických přípravků popsaných výše mohou být použita aditiva jako jsou ochranné látky, zahušťovadla, parfémy a podobně, běžná v oboru farmaceutického kompaundování topických přípravků. Dále mohou být do topických přípravků podle vynálezu, obsahujících výše uvedené aktivní činidlo, inkorporovány běžné antioxidanty. z běžných antioxidantů, které mohou být použity v těchto přípravcích, jsou zahrnuty N-methyl-a-tokoferolamin, tokoferoly, butylátovaný hydroxyanisol, butylátovaný hydroxytoluen, etoxyquin a podobně.

V souladu s tímto vynálezem mohou být v topických přípravcích pro vlasy použity konvenční parfémy a lotiony. Dále, je-li to žádoucí, mohou být použita běžná emulgační činidla v topických přípravcích podle tohoto vynálezu.

Masťové přípravky, obsahující účinnou složku podle vynálezu mohou obsahovat směs polopevných ropných uhlovodíků s disperzí účinné složky podle vynálezu v rozpouštědle.

Krémové kompozice, obsahující účinnou složku podle vynálezu, výhodně obsahují emulze vytvořené z vodné fáze humektantu, stabilizátor viskozity a vodu, olejové fáze alkoholu mastné kyseliny, polopevné ropné uhlovodíky a emulgační činidlo a fáze obsahující účinnou složku podle vynálezu dispergovanou ve vodném roztoku stabilizátor-pufr. Stabilizátory mohou být přidány k topickému přípravku, v souladu s tímto vynálezem může být použit jakýkoliv běžný stabilizátor, v olejové fázi působí složka alkohol mastné kyseliny jako stabilizátor. Tylo složky alkoholu mastné kyseliny jsou výhodně získány z redukce nasycené mastné kyseliny, mající alespoň asi 14 atomů uhlíku. Krémová báze farmaceutických přípravků, obsahujících účinnou složku podle vynálezu může být složena, například, z vodných emulzí, obsahujících alkohol mastné kyseliny, polopevný ropný uhlovodík, 1,2-ethylenglykol a emulgační činidlo.

Obecně může být léčení akné,bud zánětlivého nebo nezánětlivého, provedeno orálním podáním 0,1 až 10 mg/kg sloučeniny podle vynálezu jednou nebo dvakrát denně pacientovi. Ošetření může být provedeno topickou aplikací topické kompozice, obsahující sloučeninu podle vynálezu v množství od asi 0,05 % do asi 3 % hmotn., výhodně asi 1 % až asi 2 % hmotn., jednou nebo dvakrát denně.

Typicky závisí dávka ošetření na způsobu podání, věku, hmotnosti, velikosti a stavu choroby jednotlivce.

-5CZ 291352 B6

Preferované sloučeniny podle vynálezu jsou:

(2E,4E,6Z,8E)-3,6,7-trimethyI-9-(2,6,6-trimethyl-l-cyklohexen-l-yl)-2,4,6,8-nonatetraenová kyselina;

(2E,4E)-3-methyl-5-(2(2((E)-2-(2,6,6-trimethyl-l-cyklohexen-l-yl)ethenyl)-l-cyklohexenl-yl)-2,4-pentadienová kyselina;

(all-E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethyl-l-cyklohexen-l-yl)-2,4,6,8-nonatetraenová kyselina; (all-E)-6-jod-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethyl-l-cyklohexen-l-yl)-2,4,6,8-nonatetraenová kyselina;

(all-E)-6-chlor-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethyl-l-cyklohexen-l-yl)-2,4,6,8-nonatetraenová kyselina;

(2E,4E)-3-methyl-5-(2-(2-((E)-2-(2,6,6-trimethyl-l-cyklohexen-l-yl)ethenyl)-l-cyklopenten-1 -y l)-2,4-pentad ienová kysel ina;

(2E,4E)-3-methy l-5-(2-(2-((E)-2-(2,6,6-trimethyl-1 -cyklohexen-1 -yl)ethenyl)-1 -cyklohepten-l-yl)-2,4-pentadienová kyselina;

(2E, 4E)-3-methyl-5-(2-(2-((E)-2-(2,6,6-trimethy 1-1 -cyklohexen-1 -yl)ethenyl)~ 1 -cyklookten-1 -yl)-2,4-pentad ienová kysel ina;

(2E,4E)-3-methyl-5-(2-(2-((E)-2-(2,6,6-trimethyl-l-cyklohexen-l-yl)ethenyl)-fenyl)-2,4pentadienová kyselina;

(2E,4E)-3-methyl-5-(2-(2-((E)-2-(2,6,6-trimethyl-l-cyklohexen-l-yl)ethenyl)-2-thienyl)2,4-pentadienová kyselina;

(2E,4E)-3-methyl-5-(2-(2-((E)-2-(2,6,6-trimethyl-l-cyklohexen-l-yl)ethenyl)-3-thienyl)2,4-pentadienová kyselina; (2E,4E)-3-methyl-5-(4-((E)-2-(2,6,6-trimethyl-l-cyklohexen-l-yl)ethenyl)-3-thienyl}-2,4pentadienová kyselina;

(2E,4E)-3-methyl-5-[2-(2,6,6-trimethyl-l-cyklohexen-l-yl)ethinyl)-cyklopent-l-enyl]-2,4pentadienová kyselina;

(2E,4E)-3-methyl-5-[2-(2,6,6-trimethyl-l-cyklohexen-l-yl)ethinyl)-cyklohept-l-enyl]-2,4pentadienová kyselina; a (2E,4E)-3-methyl-5-[2-(2,6,6-trimethyl-l-cyklohexen-l-yl)ethinyl)-fenyl]-penta-2,4-dienová kyselina.

Metody pro stanovení vazebných a transaktivačních vlastností retinoidů k RAR a RXR receptorům jsou v oboru známé, např. Levin a spol., Nátuře, 355:359-361 (23. leden 1992); Allenby a spol., Proc.Nati.Acad.Sci. USA, 90:30-34 (leden 1993); Allenby a spol., J.Biol.Chem., 269:16689-16695 ( 17.červen 1994). Metody byly použity v podstatě tak jak jsou popsány v těchto publikacích pro stanovení vazebných a transaktivačních vlastností retinoidů uvedených zde v příkladech.

Aktivita sloučenin podle vynálezu pro použití při léčení akné může být stanovena mnoha běžnými způsoby. Například schopnost sloučenin podle vynálezu inhibovat proliferaci sebocytů je standardní model léčby akné. Sebocytová antiproliferační aktivita sloučenin podle předloženého vynálezu může být stanovena v souladu s postupem z příkladu 20(1).

Dále schopnost sloučenin podle vynálezu redukovat velikost Rhino myších utriclů je jiným standardním modelem léčby akné. Tato aktivita může být stanovena podle postupu v příkladu 20(2).

Dále je jiným standardním modelem léčby akné schopnost sloučenin podle vynálezu redukovat tukové žlázy syrských zlatých křečků. Tato aktivita může být stanovena v souladu s postupem z příkladu 20(3).

-6CZ 291352 B6

Schopnost sloučenin podle vynálezu potencovat RARa aktivitu retinoidů může byt stanovena jakýmkoliv konvenčním způsobem. Schopnost sloučenin podle vynálezu kpotenciaci RARa aktivity retinoidů může být stanovena měřením aktivity kombinace sloučeniny podle vynálezu s retinoidem, majícím RARa aktivitu ve standardní screeningové zkoušce, která se týká chorobného stavu pro který je retinoid znám jako použitelný pro léčbu. Redukce koncentrace retinoidů, majícího RARa aktivitu potřebného pro získání určité hladiny aktivity nebo zvýšení aktivity retinoidů při konstantní koncentraci, by mohlo demonstrovat potenciaci aktivity sloučeninami podle vynálezu, při takové koncentraci sloučeniny podle vynálezu, při které sloučenina podle vynálezu má malou nebo žádnou aktivitu sama o sobě.

Například dále uvedené výsledky schopnosti sloučenin podle vynálezu potencovat aktivitu retinoidů v diferenciaci HL-60 buněk (standardní model lidské leukemie) demonstruje potencování aktivity sloučenin podle vynálezu. Schopnost sloučenin podle vynálezu potencovat aktivitu retinoidů majících RARa aktivitu v diferenciaci HL-60 buněk může být provedena podle příkladu 18.

Dále, výsledky uvedené níže pro schopnost sloučenin podle vynálezu potencovat aktivitu retinoidů, majících RARa aktivitu v inhibici aktivace myších B buněk (standardní model imunosuprese) demonstruje potenciační aktivitu sloučenin podle vynálezu. Schopnost sloučenin podle vynálezu potencovat aktivitu retinoidů v inhibici aktivace myších B buněk může být provedena v souladu s příkladem 19.

Dále výsledky uvedené pro schopnost sloučenin podle vynálezu potencovat aktivitu retinoidů, majících RARa aktivitu v inhibici růstu buněčné linie rakoviny prsu (model pevného tumoru) demonstrují potenciační aktivitu sloučenin podle vynálezu. Schopnost sloučenin podle vynálezu potencovat aktivitu retinoidů v inhibici růstu buněčné linie rakoviny prsu může být provedena podle příkladu 21.

Sloučeniny podle vynálezu mohou být připraveny jakýmikoliv běžnými způsoby. Preferované způsoby jsou uvedeny v následujících schématech:

-ΊCZ 291352 B6

SCHÉMA la

SCHÉMA lc (R₁₂= nižší alkyl halogen; ⁿ*žSí alkyl, F nebo Cl)

SCHÉMA ld

-8CZ 291352 B6

SCHÉMA 2

CO₂Me

3,3', 3”Si 3’ (R’2 = Ř20. R21» R22 oř R23)

SCHÉMA 3 (CHJn (CHi)n

PPh₃Br

OEt 5

CO₂Me

-9CZ 291352 B6

SCHÉMA 4

PPh₃HBr

MnO₂

-10CZ 291352 B6

SCHÉMA 5

CO₂Et

-11 CZ 291352 B6

SCHÉMA 6

SCHÉMA 7

.(CHJn

O <

CO₂Et ,(CH£)n o COjEt

O=P-OET I OET

Ho_!E.

-12CZ 291352 B6

SCHÉMA 8

Si Μβ3

NaH (EtO)₂-ⁱ^_xL/^COOEI

1. Burgesssvo

2. B114NT

činidlo

-13CZ 291352 B6

ch₂or

R»HČÍSiMe_s

SCHÉMA 9

1. BurgessovQ Čin»

2. KOH

3. MnO,

Schémata la-ld představují preferované způsoby pro přípravu meziproduktových esterů pro použití při přípravě sloučenin vzorce I, kde Rj a R₂ spolu netvoří kruh. Schéma la představuje cestu ke sloučeninám vzorce I, kde Ri a R₂jsou nezávisle nižší alkyl a R₂ je halogen nebo nižší alkyl. Schéma lc je cesta ke sloučeninám vzorce I, kde Ri je nižší alkyl nebo halogen a R₂ je nižší alkyl, fluor nebo chlor. Schéma ld je jiná cesta ke sloučeninám vzorce I, kde R] je nižší alkyl nebo halogen a R₂ je brom. Nicméně, je-li R_t alkyl výhodně se sloučeniny vzorce 1, kde R₂ je brom připraví způsobem podle schématu 1 b.

Ve schéma la, vystavení 1 silné bázi (např. lithiumdiizopropalamidu) a alkylace enolátu s alkylhalogenidem vede ke tvorbě esteru 3, který po působení báze za rovnovážných podmínek (např. ethoxid sodný v refluxujícím ethanolu) poskytne ester 3 jako převážně jeden izomer (Z).

Schéma lb se výhodně používá pro získání sloučenin vzorce I, kde R² je halogen. Avšak schéma lb může být také použito pro přípravu sloučenin vzorce I, kde R₂ je nižší alkyl. Přídavek kuprátu (Ri)₂LiCu kacetylenu 7 (Carotenoids, Otto Isled., vyd. (Birkhauser Verlage, Basilej, 1971)) poskytne nový kuprát ze syn adice, který rozložením vhodným halogenem (např. jodem nebo dioxanem) poskytne 3'; R₂ = I. Rozložení kuprátu s alkylhalogenidem poskytne ester 3', kde R₂ je alkyl. Výhoda kuprátové chemie je ve tvorbě jediného izomeru ve většině případů.

14CZ 291352 B6

Schéma Ic se výhodně používá pro získání sloučenin vzorce I, kde R₂ je nižší alkyl. Komerčně dostupné výchozí materiály, např. β-ίοηοη 14 (R]₂=CH₃) se kondenzují se vhodným fosfonátem 15 (Carotenoids, supra) pro získání požadovaného esteru 3.

Schéma Id může být použito pro tvorbu sloučenin vzorce I, kde R₂ je brom (G. Kobřích a spol., Liebigs Ann.Chem., 51:704(1967)). Keton 14 se převede na alken 16 referenční metodou. Známá směs bromkyselin 16 se převede na směs esterů 3' (např. R] = Me, R₂ = Br), která se pak rozdělí HPLC a potom transformuje na finální produkty jako výše, z esterů 3,3' 3 nebo 3' se připraví finální produkty standardními postupy (Carotenoids, supra). Například může být reakce provedena jak je uvedeno ve schématu 2. Ve schématu 2 redukce esterů 3, 3', 3 nebo 3' vede k aldehydu 4. Aldehyd 4 se pak kondenzuje s fosfonátem 5 za vzniku finálního produktu jako methylesteru 6. Hydrolýza báze 6 poskytne volnou kyselinu.

Sloučeniny vzorce I, kde Rj a R₂ tvoří společně C₃_i₃alkylen se snadno připraví podle schématu 3 (R.M.Coates a spol. J.Org.Chem., 47:3597(1982)). Cyklický keton 8 (např. cyklopentanon nebo cyklohexanon atd.) se vystaví působení bromidu fosforitého v dimethylformamidu za vzniku bromaldehydu 9 (Coates a spol., supra), který se pak kondenzuje s fosfoniovou solí 10¹ za získání vinylbromidu 11. Tento vinylbromid se pak převede na aldehyd 12 transmetalací a reakcí s dimethylf ormartiidem. z nového aldehydu se finální produkt 13 snadno připraví kondenzací 12 s fosfonátem 5. Hydrolýzou se pak získá konečná kyselina.

Schéma Ί představuje preferovaný způsob pro přípravu meziproduktu 12 pro použití ve schématu 3, kde R¹ a R² spolu tvoří C₃_₁₃-alkylen. Keton 8 se tak převede na ester 36 známými metodami (např. Org. Synthesis, Coli Vol. 5 198 (1973)) a pak se transformuje do enolfosfátu 37. Odstranění fosfátové skupiny dimethylkuprátem (J. Org. Chem., 53:2984 (1988) pak poskytne ester 38. Působením lithiumdiizopropylamidu na 38 s následujícím přídavkem cyklocitralu 39 poskytne lakton 40 (Tet. Letters, 21:2509(1980)). Zpracování laktonu 40 s terc.-butoxidem draselným a potom rozložením reakčního produktu methyljodidem poskytne ester 41. Redukcí diizobutylaluminíumhydridem s následující postupnou oxidací oxidem manganičitým se pak získá aldehyd 12.

Přípravy uvedené ve schématech 4, 5 a 6 mohou být použity pro získání sloučenin vzorce I, kde Ri a R₂ spolu tvoří s atomy uhlíku, ke kterým jsou připojeny 5-6členné aromatické kruhy (např. thiofen, benzen, pyridin atd.). Ve schématu 4 je uveden postup, vedoucí ke struktuře 22, obsahující benzen. Ftalid se zpracuje s trifenylfosfínhydrobromidem a výsledná sůl 17 se pak kondenzuje s aldehydem 18 za získání esteru kyseliny 19. Redukce esteru kyseliny 19 přes chlorid kyseliny (neuveden) poskytne benzylalkohol 20, který se pak převede na aldehyd 21 a potom kondenzuje s cyklogeranylfosfoniumylidem 10 za získání esteru 22, který hydrolýzou poskytne kyselinu.

Různé thiofenové deriváty se připraví ze vhodného brorathiofenu jak je uvedeno ve schématu 5 a 6. Například ve schématu 5 je 2,3-dibrorathiofen 23 selektivně metalován a vystaven dimethylformamidu za vzniku aldehydu 24, který se pak homologuje na ester 25 triethylfosfonoacetátem. Redukce esterové skupiny poskytne alkohol 26, který je chráněný jako acetal 27 a tento se opět metaluje a rozloží dimethylformamidem a získá se aldehyd 28. Kondenzací 28 s cyklogeranylfosfoniumylidem s následujícím zpracováním s kyselinou se získá alkohol 29. Alkohol 29 se pak oxiduje na aldehyd 30 oxidem manganičitým, působí se na něj methyllithiem a opět se oxiduje oxidem manganičitým za získání methylketonu 31. Prodloužení řetězce s triethylfosfonoacetátem pak poskytne požadovaný materiál jako ester 32, který poskytne hydrolýzou kyselinu. Jiné analogy mohou být připraveny podobným způsobem (viz příklady).

Ve schématu 6 je aldehyd 24 kondenzován s cyklogeranylfosfoniumylidem 10 za získání 33, který je selektivně metalátován a působením dimethylformamidu poskytne aldehyd 34. Prodloužení řetězce triethylfosfonátem pak poskytne požadovaný materiál jako ester 35, který hydrolýzou poskytne kyselinu.

-15CZ 291352 B6

Schémata 8 a 9 představují preferované způsoby pro přípravu sloučenin vzorce I. kde C—C_g vazba je vazba trojná.

Ve schématu 8 se aldehyd 42 kondenzuje ve Wittig-Homerově reakci s ethylesterem 4-(diethoxyfosfonyl)-3-methyl-but-2-enové kyseliny za přítomnosti báze, např. NaH a získá se ester 43.

2,2,6-Trimethylcyklohexanon reaguje s trimethylsilylacetylenem (TMS-acetylen) za použití silné báze např. butyllithia.

Odstraněním vody Burgessovým činidlem (methoxykarbonylsulfamoyl-triethylainonium hydroxid, vnitřní sůl) a odstraněním silylové chránící skupiny tetrabutv lamoniumfluoridem vede ke 2-eth iny 1-1,3,3-trimethyl-1 -cyklohexenu.

Tento cyklohexenový derivát se kondenzuje s esterem 43 za použití komplexu Pd(PH₃P)4/CuI jako katalyzátoru a piperidinu jako rozpouštědla. Výsledný ester se pak hydrolyzuje na kyselinu III.

Ve schématu 9 se 2-ethinylbenzylalkohol (sloučenina 44, kde R je H) reaguje s trimethylsilylchloxidem. Chráněný alkohol (44, R = SiMe3) reaguje se 2,2,6-trimeth) 1-cyklohexanonem po deprotonaci s butyllithiem za vzniku aduktu 45, kde R' je SiMe3. Odstranění silylchránící skupiny bází, např. vodným hydroxidem draselným s následující acetylací acetylchloridem a triethylaminem poskytne acetát 45 (R¹ = acetyl).

Voda se z cyklohexanolového derivátu 45 odstraní zpracováním s Burgessovým činidlem za získání odpovídajícího cyklohexenového derivátu. Následuje hydrolýza acetylové skupiny a oxidací primárního alkoholu s MnO₂ se získá aldehyd 46. Aldehyd 46 reaguje s ethylesterem 4-(diethoxyfosfonyl)-3-methyl-but-2-enové kyseliny ve Wittig-Homerově reakci a získá se kyselina III po hydrolýze odpovídajícího esteru.

Následující příklady ilustrují vynález, v příkladech zahuštění znamená odpaření rozpouštědla za použití rotační odparky při 40 °C a 20 mm Hg vakua. HPLC znamená vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii používající Waters Prep 500 s patronami s oxidem křemičitým. Všechny meziprodukty a konečné produkty jsou charakterizovány H-NMR spektroskopií.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava kyseliny (2E,4E,Z,8E)-3,6,7-trimethyl-9-(2,6,6-trimethyl-l-cyklohexen-l-yl)2,4,6,8 .nonatetraenové (All-E)-Ethyl-3-methyl-5-(2,6,6-trimethyl-l-cyklohexen-l-yl)-2,4-pentadienoát (1; Rl = Me, 13,1 g) se rozpustí v tetrahydrofuranu (25 ml) a pak se přidá čerstvé připravený roztok lithiumdiizopropylamidu (1,2 ekv. vztaženo na výchozí diizopropylamin a n-butyllithium; 1,6M v hexanech) rozpuštěného v tetrahydrofuranu (100 ml) při -70 °C. Výsledný roztok se míchá další 1 hodinu při této teplotě a pak se zpracuje s methyljodidem (10 ml) a nechá ohřát na teplotu místnosti. Přidá se nasycený chlorid amonný a organické látky se izolují extrakcí směsí hexan/ethylacetát (4:1). Odstraněním rozpouštědel ve vakuu se získá alkylovaný produkt (14 g) jako olej. Tento materiál se rozpustí v methanolu (100 ml), obsahujícím methoxid sodný (10 ml; 4,6M v methanolu) a zahřívá se na teplotu refluxu 2 hodiny. Po této době se směs ochladí na teplotu místnosti, zpracuje se s vodou a extrahuje hexanem/ethylacetátem jako výše. Odstraněním

-16CZ 291352 B6 rozpouštědel ve vakuu se získá surový methyl-(2Z,4E)-2.3-dimethyl-5-(2,6,6-trimethyl-lcyklohexen-l-yl)-2,4-pentadionát (13,2 g) jako 9:1 směs izomerů na 2,3 dvojné vazbě. Tento materiál se rozpustí v hexanu (150 ml) ochlazeném na -70 °C a pak se zpracuje s přebytkem diizobutylamoniumhydridu (1M v hexanu) a zahřeje na 0 °C. Potom se přidá diethylether (200 ml) a pak vodný roztok Rochelle soli (20%, 20 ml). Směs se pak opatrně ohřeje na teplotu místnosti, reakce je slabě exotermní. Směs se pak nechá ohřát na 35 °C a potom se ochladí na teplotu místnosti. Přidá se pak pevný síran horečnatý (50 g) a pevné látky se odfiltrují.

Odstraněním rozpouštědel ve vakuu se získá surový alkohol jako olej. Tento materiál se rozpustí v hexanu (20 ml) a přidá se k suspenzi oxidu manganičitého (102 g) ve směsi hexan-ether (1:1, 400 ml) ochlazené na 5 °C a míchá se 1,5 h při této teplotě a pak další 1 hodinu při teplotě místnosti. Pevné látky se pak odfiltrují a roztok se zahustí ve vakuu. Chromatografie zbytku HPLC (5% ether-hexan rozpouštědlový systém) poskytne čistý (2Z,4E)-2,3-dimethyl-5-(2,6,6trimethyl-l-cyklohexen-l-yl)-2,4-pentadienyl (6 g, 51% celkový výtěžek z ethylesteru).

Hydrid sodný (1,3 g, 64% voleji) se promyje hexanem, suší se ve vakuu a pak se suspenduje v tetrahydrofuranu (60 ml) při 5 °C. k výše uvedené suspenzi se přidá roztok methyl-3-methyl4—diethylfosfonokrotonátu v tetrahydrofuranu (8,6 g ve 30 ml) a získá se čirý roztok sodné sol (pozn.: je-li zakalený, filtruje se směs přes diatomickou hlinku CELÍTE). Čirý roztok se pak ochladí na 10 °C a zpracuje s výše uvedeným aldehydem (6 g) rozpuštěným v tetrahydrofuranu (20 ml) a pak se míchá při teplotě místnosti 30 minut. Potom se přidá hexan a směs se promyje vodou, suší (síran horečnatý), pevný podíl se odfiltruje a zahustí se. Krystalizací zbytku z hexanu se získá čistý methyl-{2E,4E,6Z,8E)-3,6,7-trimethyl-9-(2,6,6-trimethyl-l-cyklohexen-l-yl)-

2.4.6.8- nonatetraenoát jako žlutá krystalická pevná látka. Tento materiál se rozpustí ve směsi ethanolu-vody (100 ml; 9:1)), obsahující hydroxid draselný (4 g) a zahřívá se pod refluxem 20 minut. Směs se pak ochladí na teplotu místnosti, nalije do studené kyseliny fosforečné (2M) a pevný podíl se extrahuje do dichlormethanu. Odstraněním rozpouštědel ve vakuu a krystalizací zbytku z acetonitrilu se získá (2E,4E,6Z,8E)-3,6,7-trimethyl-9-(2,6,6-trimethyl-l-cyklohexen- l-yl)-2,4,6,8-nonatetraenová kyselina (3,8 g) jako světležlutá krystalická látka. Tento materiál vykazuje charakteristické píky ve spektru protonové magnetické rezonance pro Ε,Ε,Ζ,Ε polyenový systém.

Příklad 2

Příprava kyseliny (all E)-6-brom-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethyl-l-cyklohexen-l-yl)-2,4,-

6.8- nonatetraenové

Směs (2E,4E) a (2Z,4E)-2-brom-3-methyl-5-(2,6,6-trimethyl-l-cyklohexen-l-yl)-2,4-pentadienové kyseliny (75 g) se rozpustí v dimethylformamidu (500 ml) a pomalu se přidá k suspenzi hydridu sodného (10,5 g, 65% v oleji) v tetrahydrofuranu (1100 ml) při 10 °C a pak se míchá až ustane vývoj vodíku. Potom se přidá methyljodid (50 g) a výsledná směs se zahřívá 2 hodiny na 50-60 °C, nalije se do směsi led-voda a extrahuje se hexanem. Hexanové extrakty se promyjí vodou, suší (síran horečnatý) a zahustí. Směs methylesterů se pak rozdělí pomocí hPLC (2,5% ether/hexan) a získá se čistý methyl-(2Z,4E)-2-brom-3-methyl-5-(2,6,6-trimethyl-l-cyklohexen-l-yl)-2,4-pentadienoát (20 g) a methyl-(2E,4E)-2-brom-3-methyl-5-(2,6,6 -trimethyll-cyklohexen-l-yl)-2,4-pentadienoát (37 g).

Hydrid sodný (1,3 g, 64% voleji) se promyje hexanem, suší ve vakuu a pak se suspenduje v tetrahydrofuranu (60 ml) při 5 °C. Potom se přidá roztok methyl-3-methyl-4-diethylfosfonokrotonátu v tetrahydrofuranu (8,6 g ve 30 ml) k výše uvedené suspenzi a získá se čirý roztok sodné soli(pozn.: je-li zakalen, směs se filtruje přes diatomickou hlinku CELÍTE). Čirý roztok se pak ochladí na 10 °C a zpracuje se s výše uvedeným aldehydem (6 g) rozpuštěným v tetrahydrofuranu (20 ml) a pak se míchá při teplotě místnosti 30 minut. Potom se přidá hexan a směs se promyje vodou, suší (síran horečnatý), pevné látky se odfiltrují a zahustí. Krystalizací zbytku

- 17CZ 291352 B6 z hexanu se získá čistý methyl-(2E,4E,6Z,8E)-3,6,7-trimethyl-9-(2,6,6-trimethyl-l-cyklohexen-l-yl)-2,4,6,8-nonatetraenoát jako žlutá krystalická pevná látka. Tento materiál se rozpustí ve směsi ethanol-voda (100 ml, 9:1), obsahující hydroxid draselný (4 g) a zahřívá se pod refluxem 20 minut. Směs se pak ochladí na teplotu místnosti, nalije se do studené kyseliny fosforečné (2M) a pevné látky se extrahují do dichlormethanu. Odstraněním rozpouštědel ve vakuu a krystalizací zbytku z acetonitrilu se získá (2E,4E,6Z,8E)-3,6,7-trimethv 1—9—(2,6,6—trimethyl-l-cyklohexen-l-yl)-2,4,6,8-nonatetraenová kyselina (3,8 g) jako světležlutě zbarvená krystalická pevná látka. Tento materiál vykazuje charakteristické píky ve spektru protonové magnetické rezonance pro Ε,Ε,Ζ,Ε polyenový systém.

(2E,4E)-2-Brom-3-methyl-5-(2,6,6-trimethyl-l-cyklohexen-l-yl)-2,4-pentadienoát (37 g) se redukuje na alkohol jako v příkladu 1 a pak se na něj ihned působí oxidem manganičitým a získá se nestabilní aldehyd (15 g). Tento materiál se pak převede na ethyl—(all E)-6-brom-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethyl-l-cyklohexen-l-yl)-2,4,6,8-nonatetraenoát a potom se hydrolyzuje na (all E)-6-brom-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethyl-l-cyklohexen-l-yl)-2,4,6,8-nonatetraenovou kyselinu jako v příkladu 1.

Příklad 3

Příprava (all E)-6-jod-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethyl-l-cyklohexen-l-yl)-2,4,6,8-nonatetraenové kyseliny

Suspenze komplexu bromid mědný-dimethylsulfid (10,3 g) v tetrahydrofuranu (500 ml) při 0 °C se zpracuje s roztokem methyllithia v etheru (1,4M, nízký bromid), míchá dalších 15 minut a potom se ochladí na -70 °C. k tomuto čirému roztoku se přidá ethyl-(E)-5-(2,6,6 -trimethyll-cyklohexen-l-yl)-4-penten-2inoát (10 g) rozpuštěný v tetrahydrofuranu (50 ml) a směs se míchá 2 hodiny a pak se zpracuje s roztokem jodu v tetrahydrofuranu (13 g ve 100 ml) po 0,5 hodiny. Po této době se směs ohřeje na -60 °C a nalije do vodného roztoku chloridu amonného a organické materiály se extrahují do hexanu. Hexanové extrakty se promyjí zředěným vodným roztokem thiosíranu sodného, suší se (síran sodný) a zahuštěním při teplotě místnosti se získá nestabilní jodoester, který se čistí pomocí HPLC (2,5% ether/hexan) a získá se čistý ethyl(2E,4E)-2-jod-3-methyl-5-(2,6,6-trimethyl-l-cyklohexen-l-yl)-2,4-pentadienoát (5 g). Tento ester se transformuje na odpovídající aldehyd a pak se kondenzuje sfosfonátem jako v předchozích příkladech a výsledný ester kyseliny retinové se hydrolyzuje a získá se čistá (all E)-6-jod-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethyl-l-cyklohexen-l-yl)-2,4,6,8- nonatetraenová kyselina jako světle žlutá pevná látka po krystalizací ze směsi hexan/tetrahydrofuran.

Příklad 4

Příprava (2E,4E)-3-methy l-5-(2-((E)-2-(2,6,6-trimethy 1-1 —cyklohexen-1 -yl)etheny 1)-1 cyklohexen-1 -yl)-2,4-pentadienové kyseliny

Suspenze ((2,6,6-trimethyl-l-cyklohexen-l-al)methyl)trifenylfosfoniumchloridu (18 g) v tetrahydrofuranu (300 ml) se ochladí na -60 °C, potom se přikape n-butyllithium (1,4M v hexanu) a pak se míchá dalších 10 minut, k tomuto ochlazenému roztoku se přidá 2-bromcyklohexen-lkarboxaldehyd (8,5 g, 75% čistota podle HNMR analýzy) rozpuštěný v tetrahydrofuranu a směs se nechá ohřát na teplotu místnosti a potom se míchá další 2 hodiny. Hexan se pak ochladí k reakční směsi a výsledná směs se promyje vodou, 50% vodným methanolem a suší se (síran horečnatý). Odstraněním rozpouštědel se získá surový (2E,4E)-l-brom-2-(2-(2,6,6-trimethyl1-cyklohexen-l-yl)ethenyl)-cyklohexen (12,5 g) jako směs izomerů, která se použije jako taková v následujícím stupni. Standardní transmetalací a reakcí s DMF se získá surový aldehyd (4,5 g), který se rozpustí v tetrahydrofuranu (100 ml) a pak se nechá reagovat s přebytkem fosfonátu jako v příkladu 1 a získá se methyl-(2E,4E)-3-methyl-5-(2-((E)-2(2,6,6-trimethyl

-18CZ 291352 B6 l-eyklohexen-l-yl)ethenyl)-l-cyklohexen-l-yl)-2,4-pentadienoát (3 g) jako olej po čištění pomocí HPLC (2,5% ether v hexanu). Hydrolýzou s vodným roztokem hydroxidu draselného se získá krystalická (2E,4E)-3-methyl-5-(2-((E)-2(2,6,6-trimethyl-l-cyklohexen-l-yl)ethenyl)l-cyklohexen-l-yl)-2,4-pentadienová kyselina (1,6 g z hexanu-tetrahydrofuranu).

Příklad 5

Příprava (2E,4E)-3-methyl-5-(2-((E)-2(2,6,6-trimethyl-l-cyklohexen-l-yl)ethenyl)-l-cyklopenten-l-yl)-2,4-pentadienové kyseliny

Jako v příkladu 4 se 2-bromcyklopenten-l-karboxaldehyd převede na ethylester (2E,4E)-3methyl-5-(2-((E)-2(2,6,6-trimethyl-1 -cyklohexen-1 -y l)etheny 1)-1 -cyklopenten-1 -y 1)-2.4pentadienové kyseliny, který hydrolýzou bází poskytne (2E,4E)-3-methyl-5-(2-((E)-2(2.6_?6trimethyl-l-cyklohexen-yl)ethenyl)-l-cyklopenten-l-yl)-2,4-pentadienovou kyselinu.

Příklad 6

Příprava (2E,4E) -3-methyl-5-(2-((E)-2(2,6,6 -trimethyl-l-cyklohexen-l-yl)erhenyl)-lcyklohepten-l-yl)-2,4-pentadienové kyseliny

Jako v příkladu 4 a 5 se l-bromcyklohepten-2-karboxaldehyd převede na ethylester (2E,4E)-3-methyl-5-(2-((E)-2(2,6,6-trimethyl-l-cyklohexen-l-yl)ethenyl)-l—cykloheptenl-yl)-2,4-pentadienové kyseliny, který po hydrolýze bází poskytne (2E,4E)-3-methyl-5-(2((E)-2(2,6,6-trímethyl-l -cyklohexen-1 -yl)ethenyl)-1 -cyklohepten-1 -yl)-2,4-pentad ienovou kyselinu.

Příklad 7

Příprava (2E,4E)-3-methyl-5-(2-((E)-2(2,6,6-trimethyl-l-cyklohexen-l-yl)ethenyl)-l-cyklookten-l-yl)-2,4 pentadienové kyseliny

Jako v příkladech výše uvedených se l-bromcyklookten-2-karboxaldehyd převede na ethylester (2E,4E)-3-methyl-5-(2-((E)-2(2,6,6-trimethyl-l-cyklohexen-l-yl)ethenyl)-l-cyklookten-lyl)-2,4-pentadienové kyseliny, který hydrolýzou bází poskytne (2E,4E)-3-methyl-5-(2-((E)2(2,6,6-trimethyl-1 -cyklohexen-1 -y l)etheny I)-1 -cyklookten-1 -yl)-2,4-pentad ienovou kyselinu.

Příklad 8

Příprava kyseliny (2E,4E)-3-methyl-5-(2-((E}-2(2,6,6-trimethyl-l-cyklohexen-l-yljethenyl)l-fenyl-l-yl)-2,4-pentadienové

Jak je uvedeno ve schématu 4, zahřívá se ftalid (0,1 mol) a trifenylfosfin-hydrobromid (0,1 mol) na 200 °C po dvě hodiny, ochladí se na teplotu místnosti a získá se sůl 17 (39 g) jako bílá pevná látka. Roztok této soli (4,6 g) v dimethylsulfoxidu (DMSO, 50 ml) při 5 °C se zpracuje s roztokem sodné soli DMSO (1M, 20 ml) a pak s aldehydem 18 (1,5 g) a získá se světležlutě zbarvená reakční směs. Potom se přidá voda a výsledná směs se okyselí vodnou kyselinou fosforečnou (2M) a kyselina 19 se extrahuje do ethylacetátu. Surový produkt (4,3 g) se rozpustí v benzenu a působí se na něj oxalylchloridem (3 ml) a dimethylformamidem (3 kapky), potom se udržuje na teplotě místnosti 30 minut. Odstraněním rozpouštědel ve vakuu s následujícím rozpuštěním surového chloridu kyseliny v tetrahydrofuranu (100 ml) se získá alkohol 20 po

- 19CZ 291352 B6 přídavku borohydridu sodného při -20 °C a ohřátí na teplotu místnosti. Čištěním surového alkoholu pomocí HPLC s následující krystalizací ze směsi hexan/ethylacetát se získá ethylester kyseliny 3-methyl-5-(2-hydroxymethylfenyl)-2,4-pentadienové 20 jako bezbarvá pevná látka (1,1 g). Působením alkoholu 20 (1,1 g) na suspenzi oxidu manganičitého (11 g) v hexanu/dichlormethanu (5:1, 60 ml) při 0 °C s následujícím mícháním po další 2 hodiny při teplotě místnosti se získá aldehyd 21 (1,1 g). Roztok fosfoniumylidu získaný z cyklogeranylfosfoniumbromidu 10 (1,3 g) v tetrahydrofuranu (20 ml) a n-butyllithia při 10 °C se pak zpracuje se surovým aldehydem 21 (1,0 g) a ohřeje na teplotu místnosti během 15-30 minut. Zředěním vodou a extrakcí organických látek do směsi hexan/ethylacetát (4:1) se získá surový adukt 22 jako olej. Tento materiál v hexanu se nechá projít sloupečkem silikagelu za získání esteru (0,8 g) jako oleje. Hydrolýzou tohoto materiálu vodným hydroxidem draselným v refluxujícím ethanolu se získá kyselina po okyselení minerální kyselinou (2M kyselina fosforečná). Krystalizací ze směsi hexanu/ethylacetátu se získá čistá kyselina (2E,4E)-3-methyl-5-(2-((E) -2 (2,6,6-trimethyl-l-cyklohexen-l-yl)ethenyl)-l-fenyl)-2,4-pentadienová jako bílá pevná látka.

Příklad 9

Příprava kysel iny (2E,4E)-3-methyl-5-(2-((E)-2(2,6,6-trimethyl-1 -cyklohexen-1 -yl)ethenyl)-

2-thienyl)-2,4-pentadienové

Roztok 2,3-dibromthiofenu (0,1 mol) v diethyletheru (přibližně 5% koncentrace) se zpracuje s n-butyllithiem (1,6M v hexanu, 1,1 ekvivalentu) při -70 °C a míchá se 30 minut. Potom se přidá přebytek dimethylformamidu a směs se ohřeje na teplotu místnosti, rozloží se vodou a pak se okyselí zředěnou kyselinou fosforečnou. Extrakcí hexanem se získá surový aldehyd, který se pak čistí pomocí HPLC. Všechen aldehyd z této reakce se pak přidá k sodné soli triethylfosfonoacetátu v tetrahydrofuranu a směs se míchá při teplotě místnosti 1 hodinu a pak se rozloží vodou a kyselinou octovou. Surový ester 25 se pak přidá k přebytku diizobutylaluminiumhydridu v hexanu při -40 °C a směs se ohřeje na 0 °C a rozloží se vodným roztokem Rochellovy soli (20%, 10 ml) a ohřeje se na 32 °C. Extrakcí s hexanem se získá alkohol 26, který se pak převede na acetal 27 2-methoxypropenem. Po čištění acetalu pomocí HPLC se veškerý produkt rozpustí v tetrahydrofuranu (cca 5% koncentrace) ochlazeném na -70 °C a pak se zpracuje s n-butyllithiem jak výše. Po dalších 30 minutách míchání při této teplotě se přidá přebytek dimethylformamidu a směs se ohřeje na teplotu místnosti a pak se rozloží vodným roztokem chloridu amonného (20%) a získá se aldehyd 28 po izolaci s hexanem a čištění pomocí HPLC. Na tento aldehyd se pak působí přebytkem (1,2 ekv.) ylidu vytvořeného z cyklogeranylfosfoniumbromidu 10 a n-butyllithia v tetrahydrofuranu a hexanu při -70 °C a pak se míchá další 2 hodiny při teplotě místnosti. Přídavkem vody a zředěné vodné kyseliny fosforečné se pak získá alkohol 29 po extrakci do hexanu. Tento materiál se rozpustí v diethyletheru (min. objem) a pak se přidá k suspenzi oxidu manganičitého (10 násobek) v dalším etheru (300 ml) při 0 °C a ohřeje se na teplotu místnosti. Po další 1 hodině míchání se pevné látky odfiltrují a odstraněním rozpouštědla se získá aldehyd 30 po čištění pomocí HPLC. Tento materiál se pak rozpustí v etheru, ochladí na -10 °C a působí se na něj přebytkem methyllithia v etheru (1,4 ekv.) a pak se ohřeje na teplotu místnosti. Přídavkem vody a zahuštěním organické fáze se získá surový alkohol, který se oxiduje oxidem manganičitým jak uvedeno výše a získá se keton 31. Na tento materiál se působí přebytkem sodné soli triethylfosfonoacetátu v tetrahydrofuranu při teplotě místnosti a získá se požadovaný ester 32 (R=ethyl) jako směs izomerů kolem nově vytvořené dvojné vazby (asi 4:1), kde převažuje požadovaný izomer. Čištěním této směsi pomocí HPLC a krystalizací hlavního izomeru z hexanu se získá surový ethyl-(2E,4E)-3-methyl-5-(3-((E)-2(2,6,6-trimethyl-lcyklohexen-l-yl)ethenyl)-2-thienyl)-2,4-pentadienoát. Hydrolýzou vodným roztokem hydroxidu draselného v refluxujícím ethanolu jako v příkladu 8 se získá čistá kyselina (2E,4E)-3-methyl-5-(3-((E)-2(2,6,6-trimethyl-l-cyklohexen-l-yl)ethenyl)-2-thienyl)-2,4pentadienová po krystalizací ze směsi tetrahydrofuran/hexan.

-20CZ 291352 B6

Příklad 10

Příprava (2E.4E)-3-methyl-5-(3-((E)-2(2,6,6-trimethyl-l-cyklohexen-l-yl)ethenyl)-3-thienyl)-2,4-pentadienové kyseliny

Jako v příkladu 9, se 2,3-dibromthiofen převede na aldehyd 24 a pak se na něj působí ylidera získaným z cyklogeranyalfosfoniumbromidu 10 a n—butyllithia a získá se adukt 33. Zpracováním bromsloučeniny 33 s n-butyllithiem v hexanu/tetrahydrofuranu jako v příkladu 9 s přebytkem dimethylformamidu se získá aldehyd 34 po zpracování s vodnou kyselinou fosforečnou. Tento materiál se pak kondenzuje s fosfonátem 5 jako v příkladu 1 a získá se methyl-(2E,4E)-3-methyl-5-(2-((E)-2(2,6,6-trimethyl-l-cyklohexen-l-yl)ethenyl)-2-thienyl)-2,4-pentadienoát 35 (R = methyl) jako směs isomerů kolem koncové dvojné vazby. Čištěním pomocí HPLC se získá methyl-(2E,4E) -3-methyl-5-(2-((E)-2-(2,6,6-trimethyl-l-cyklohexen-l-yl)ethenyl)-3thienyl)-2,4-pentadienoát, který po hydrolýze jako výše poskytne čistou (2E,4E)-3-methyl-5(2-((E)-2(2,6,6-trimethyl-l-cyklohexen-l-yl)ethenyl)-3-thienyl)-2,4-pentadienovou kyselinou po krystalizací ze směsi tetrahydrofuran/hexan.

Příklad 11

Příprava kyseliny (2E,4E)-3-methyl-5-(4-((E)-2(2,6,6-trimethyl-l-cyklohexen-l-yl)ethenyl)-

3-thienyl)-2,4-pentadienové

Zpracováním 3,4-dibromthiofenu jako v příkladu 10 se získá kyselina (2E,4E)-3-methyl-5-(4((E)-2(2,6,6-trimethyl-l-cyklohexen-l-yl)ethenyl)-3-thienyl)-2,4-pentadienová.

Příklad 12

Příprava (all-E) 6-chlor-3,7-diraethyl-9-(2,6,6-trimethyl-l-cyklohexen-l-yl)-2,4,6,8-nonatetraenové kyseliny

Roztok triethyl-2-chlorfosfonoacetátu (J. Org. Chem., 51:5467 (1986)) (0,12M) v tetrahydrofuranu se zpracuje shydridem sodným (64% suspenze voleji, 0,12M) a míchá se při teplotě místnosti a získá se čirý roztok aniontu. k této směsi se přidá β-jonon (0,lM) a reakce se zahřívá na 45 °C přes noc. Potom se přidá voda a produkty se extrahují do hexanu/ethylacetátu (4:1). Odstraněním rozpouštědel se získá kondenzovaný produkt jako směs (1:1) izomerů dvojné vazby, ze kterých se požadovaný izomer ethyl-(2E,4E)-2-chlor-3-methyl-5-(2,6,6-trimethyl-l-cyklohexen-l-yl)ethenyl)-2,4-pentadienoát oddělí pomocí HPLC. Redukcí tohoto esteru diizobutylaluminiumhydridem jako v příkladu 1 s následující oxidací oxidem manganičitým jako dříve se získá (2E,4E)-2-chlor-3-methyl-5-(2,6,6-trimethyl-l-cyklohexen-l-yl)-2,4-pentadial. Tento materiál se pak kondenzuje s methyl-3-methyl-4-diethylfosfonokrotonátem jako v příkladu 1 se získá methyl-(-E)-6-chlor-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethyl-l-cyklohexen-l-yl)-2,4,6,8nonatetraenoát. Hydrolýzou esteru jako výše a krystalizací kyseliny ze směsi tetrahydrofuranu a hexanu se získá čistá kyselina (all-E)-6-chlor-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethyl-lcyklohexen-yl)-2,4,6,8-nonatetraenová jako žlutá pevná látka.

Příklad 13

Příprava kyseliny all-E-3,7-dimethyl-9-[(2-methoxy-4-methyl-6-oktyloxy)fenyl]-2,4,6,8nonatetraenové

Roztok 2,6-dihydroxy-4-methylbenzoové kyseliny v acetonu (50,4 g, 750 ml) se zpracuje s methyljodidem (100 ml) a uhličitanem draselným (124,2 g) a zahřívá se pod refluxem 18 hodin.

-21CZ 291352 Β6

Směs se pak ochladí na teplotu místnosti a filtrací se zbaví pevných látek. Zahuštěním roztoku se získá surový produkt, který se rozpustí v ethylacetátu a promyje se vodným roztokem hydroxidu sodného (IN studený). Odstraněním rozpouštědel ve vakuu se pak získá methvl-2,6-dimethoxy-

4-methyl-benzoát (54 g). Tento materiál (52,5 g) se rozpustí v dichlormethanu (1000 ml) ochlazeném na -70 °C a zpracuje se s roztokem chloridu boritého ve stejném rozpouštědle (29,3 g/100 ml, 180 ml). Směs se pak nechá ohřát na teplotu místnosti a míchá se dalších 45 minut a potom se nalije na led. Organická vrstva se oddělí, promyje se další vodou, suší (síran horečnatý), filtruje a zahustí.

Zbytek se pak čistí vysokotlakovou preparativní kapalinovou chromatografii (HPLC) za použití Waters prep.500 chromatografu (7% ethgylacetát/hexan jako eluent) a získá se čistý’ methyl-2hydroxy-6-methoxy-4-raethylbenzoát jako pevná látka (28,3 g). Roztok tohoto materiálu (35 g) v methylethylketonu (700 ml) obsahujícím uhličitan draselný (27,1 g) se zpracuje s 1-oktyljodidem (34,2 g) a zahřívá se na teplotu refluxu po 20 hodin. Reakční směs se za studená zfiltruje a filtrát se zahustí a pak se znovu rozpustí ve směsi hexanu a ethylacetátu. Tento roztok se pak promyje vodnou bází (IN hydroxid sodný), vodou, suší (síran horečnatý) a zahustí se do sucha. Čištěním pomocí HPLC jako výše se získá čistý methyl-2-methoxv-6-oktvl-4-methylbenzoát (51,8 g).

Roztok tohoto materiálu (51,8 g) v toluenu (500 ml) se ochladí na -60 °C a zpracuje se s roztokem diizobutylaluminiumhydridu (25% v hexanu, 281 ml) a pak se ohřeje na teplotu místnosti. Reakční směs se pak opatrně zpracuje s vodným methanolem (100 ml; 1:1) za chlazení tak, aby se teplota udržela na 20 °C s následujícím přídavkem hexanu (500 ml) a síranu horečnatého. Pevné látky se pak odfiltrují a rozpouštědla se odstraní ve vakuu; získá se tak surový alkohol. Tento materiál (47 g) se rozpustí v acetonitrilu (500 ml), obsahujícím trifenylfosfoniumhydrobromid (54,9 g) a zahřívá se pod refluxem 22 hodin. Rozpouštědla se pak odstraní ve vakuu a surová sůl se suší při teplotě místnosti při tlaku 0,1 mm Hg (tento materiál může být krystalován z tetrahydrofuranu a získá se čistý [(2-methoxy-6-oktyloxy-4-methyl)fenyljmethyl-trifenylfosfoniumbromid). Tato sůl se převede na all-E-3,7--dimethyl-9-[(2-methoxy-4-methyl-6-oktyloxy)fenyl]-2,4,6,8-nonatetraenovou kyselinu, jak je popsáno v US patentu č. 4 894 480, příklad 5.

Příklad 14

Příprava (E)-2-(2-(2,6,6-trimethyl-l-cyklohexen-l-yl)ethenyl)-cyklohepten-karboxaldehydu

Jak je uvedeno ve schématu 7 převede se cykloheptanon (152 g) na ester (Org. Syn. Coll., 5:198 (1973); 232 g), transformuje na enolfosfát 37 (274 g) a následně se zpracuje s lithiumdimethylkuprátem a získá se ethyl-2-methyl-cyklohept-l-enoát 38 (119 g). Potom se přidá roztok ethyl-2-methyl-cyklohept-l-enoátu (91 g) v tetrahydrofuranu k roztoku lithiumdiizopropylamidu (0,53 mol) a pak se rozloží cyklocitralem 39 (76 g) a získá se lakton 40 (113 g) po zpracování s kyselinou. Redukcí výše uvedeného esteru s diizobutylaluminiumhydridem s následující oxidací oxidem manganičitým jako v příkladu 1 se získá aldehyd 12 (n=3) (98 g).

Příklad 15

A: Příprava ethylesteru (2E,4E)-3-methyl-5-(2,6,6-trimethyl-cyklohex-l-enylethinyl)cyklopent-l-enyl]-penta-2,4-dienové kyseliny

Ethylester (2E,4E)-5-(2-brom-cyklopent-l-enyl)-3-methyl-penta-2,4-dienové kyseliny (1,43 g) se rozpustí v 5 ml benzenu. Postupně se při teplotě místnosti přidá: 293 mg Pd(Ph₃P)₄, 95 mg Cul, 147 mg (Ph)₃P a 8 1 piperidinu. k této směsi se přidá kapací nálevkou během 1 hodiny 2-ethinyl-l,3,3-triraethyl-l-cyklohexen (745 mg) rozpuštěný v 5 1 benzenu. Po 4,5 hodinách se

-22CZ 291352 B6 přidá další acetylen (350 mg) a v míchání se pokračuje 30 minut. Směs se pak nalije na rozdrcený led/HCl, extrahuje se EtOAc, promyje se dvakrát vodou, suší nad síranem sodným a odpaří se do sucha. Středně tlaková chromatografie (SiO?, hexan/AcOEt = 98/2) poskytne 1,478 g ethylesteru kyseliny (2E,4E)-3-methyl-5-(2,6,6-trimethyl-cyklohex-l-enylethinyl)-cyklopent-l-enyl]penta-2,4-dienové jako žlutý olej.

Výchozí ethylester kyseliny (2E, 4E)-5-(2-brom-cyklopent-l-enyl)-3-methyl-penta-2,4-dienové byl syntetizován následovně:

2,03 g NaH (50% v minerálním oleji) byl suspendován ve 120ml DMF. Ethylester kyseliny 4-(diethoxy-fosfínyl-3-methyl-but-2-enové (12,9 g) byl přidán při 0 °C. Směs byla míchána 15 minut při 0 °C a 30 minut při t.m. Po znovu ochlazení na 0 °C se 2-brom-cyklopent-l-enkarbaldehyd (5,72 g), rozpuštěný vlil DMP, přikape a nechá se reagovat 10 minut při 0 °C a 2 hodiny při t.m. Směs se pak nalije na rozdrcený led, extrahuje EtOEt, promyje nasyceným NaCl-roztokem, suší se nad síranem sodným a odpaří se do sucha. Čištěním zbytku rychlou chromatografií (silikagel, hexan/AcEt= 97/3) a krystalizací z hexanu/stopová množství AcOEt se nakonec získá 3,408 g čisté kyseliny (2E,4E)-5-(2-brom-cyklopent-l-enyl)-3-methyl-penta2,4-dienové jako nažloutlé krystaly o t.t. 85 až 86 °C.

Výchozí 2-ethinyl-l,3,3-trimethyI-l-cyklohexen se syntetizuje standardními postupy přídavkem Li-derivátu TMS-acetylenu ke 2,2,6-trimethylcyklohexanonu, dehydratací zpracováním s Burgessovým činidlem (methoxykarbonylsulfamoyl-triethylamoniumhydroxid, vnitřní sůl) a konečnou desilylací tetrabutylamoniumfluoridem. Používá se ihned vzhledem k jeho nestabilitě.

B: Příprava kyseliny (2E,4E)-3-methyl-5-[2-2,6,6-trimethyl-cyklohex-l-enylethinyl)cyklopent-l-enyl]-penta-2,4-dienové

Ethylester kyseliny (2E,4E)-3-methyl-5-[2-(2,6,6-trimethyl-cyklohex-l-enylethinyl)-cyklopent-l-enyl]-penta-2,4-dienové (1. 47 g) se rozpustí ve 141 THF/EtOH = 1/1. Přidá se 3N vodný NaOH (7,0 ml) a reakční nádoba se udržuje ve tmě. Po míchání po 16 hodin při teplotě okolí se směs nalije na rozdrcený led/HCl, extrahuje se dvakrát EtOEt, promyje vodou, suší nad síranem sodným a odpařuje se do sucha. Krystalizací z EtOEt/pentanu se získá 1,31 g kyseliny (2E,4E)-3-methyl-5-[2-(2,6,6-trimethyl-cyklohex-l-enylethinyl)-cyklopent-l-enyl]-penta2,4-dienové jako žluté krystaly o t.t. 173 až 174 °C.

Příklad 16

Analogicky příkladu 15 se připraví:

kyselina (2E,4E)-3-methyl-5-[2-(2,6,6-trimethyl-cyklohex-l-enylethinyl)-cyklohept-lenyl]-penta-2,4-dienová jako žluté krystaly o t.t. 166 až 167 °C.

Příklad 17

Příprava kyseliny (2E,4E)-3-methyl-5-[2-(2,6,6-trimethyl-cyklohex-l-enylethinyl)-penta-2,4-dienové

229 g ethylesteru (2E,4E)-3-methyl-5-[2-(2,6,6-trimethyl-cyklohex-l-enylethinyl)-fenyl]penta-2,4-dienové kyseliny se rozpustí v 8 1 ethanolu. Po přídavku 411 mg hydroxidu draselného ve 2,5 ml vody se reakční směs míchá při 50 °C 2 hodiny. Směs se pak nalije na led/vodu, okyselí 2N chlorovodíkem a extrahuje se ethylacetátem. Organická fáze se promyje vodou, suší se nad síranem sodným a odpařením se získají slabě žluté krystaly, které se rekrystalují z ethylacetátu/

-23CZ 291352 B6 hexanu. Výtěžek 93 mg kyseliny (2E,4E)-3-methyl-5-[2-(2,6,6-trimethyl-cyklohex-l-enylethinyl)-fenyl]-penta-2,4-dienové, t.t. 194 až 196 °C.

Výchozí materiál použitý v tomto příkladu se připraví následovně:

970 mg 2-ethinyl-benzylalkoholu se rozpustí v 50 ml diethylesteru. Přidá se 1,9 ml triethylaminu, potom se přikape 0,9 ml trimethylsilylchloridu. Reakční směs se míchá při teplotě místnosti 4 hodiny, nalije se na led/5% vodný hydrogenuhličitan a extrahuje se etherem. Olejovitý zbytek získaný po sušení a odpaření rozpouštědla se destiluje a získá se 1,3 g 2-ethinylbenzyltrimethylsilyleteru jako bezbarvého oleje, t.v. 85-89 °C/0,8 mm.

Tento bezbarvý olej se rozpustí v 5 ml tetrahydrofuranu. Po přikapání 3,9 ml butyllithia (1.6 molámí v hexanu) při -78 °C se reakční směs míchá při této teplotě 30 minut. Roztok 0,59 g 2,2,6-trimethylcyklohexanonu ve 4 ml tetrahydrofuranu se přikape a reakční směs se míchá při teplotě místnosti 5 hodin, vznikne žlutý roztok. Žlutý roztok se nalije na ledovou vodu/10% vodný chlorid amonný, extrahuje se hexanem, suší nad síranem sodným a odpaří. Žlutý, olejovitý zbytek se čistí rychlou chromatografií (SiO₂, hexan/5% ethylacetát) a získá se 1,7 g žlutého oleje.

Žlutý' olej se rozpustí v 90 ml tetrahydrofuranu a míchá 6 hodin při teplotě místnosti se 28,8 ml 0,5 normálního vodného roztoku hydroxidu draselného. Reakční směs se nalije do ledu/vody, extrahuje etherem, promyje se vodou, suší a odpaří. Čištěním zbytku rychlou chromatografií (SiO₂, hexan/ethylacetát = 7:3) a krystalizaci z ethylacetátu/hexanu se získá 1,1 g bílých krystalů, t.t. 120 až 121 °C.

Bílé krystaly se rozpustí v 10 ml tetrahydrofuranu a postupně se zpracuj se 679 mg triethylaminu a 400 mg acetylchloridu. Po 4 hodinách míchání při teplotě místnosti se reakční směs nalije na led/ΙΝ chlorovodík, extrahuje se etherem, suší nad síranem sodným a odpaří se. Rychlou chromatografií (SiO₂, hexan/ethylacetát - 4:1) se získá 0,8 g bezbarvého oleje.

Bezbarvý olej se rozpustí ve 13 ml benzenu a přidá se k roztoku 1,3 g Burgessova činidla (methoxykarbonylsulfamoyltriethylamoniumhydroxid, vnitřní sůl) ve 40 ml benzenu. Reakční směs se zahřívá na 60 °C 3 hodiny. Po oddestilování většiny rozpouštědla se zbytek rozpustí v ledové vodě a extrahuje se etherem. Získaný zbytek po sušení se čistí rychlou chromatografií (SiO₂, hexan/ethylacetát= 9:1) se získá 0,7 g slabě žlutého oleje.

Tento žlutý olej se rozpustí v 18 ml ethanolu a zpracuje s roztokem 0,78 g hydroxidu draselného ve 4 ml vody při 45 °C po 2,5 hodiny. Reakční směs se nalije na led/nasycený roztok chloridu amonného, extrahuje se etherem, suší a odpaří. Zbytek se čistí střednětlakovou kapalinovou chromatografií (Si₂O, hexan/ethylacetát = 9:1) a získá se 0,46 g slabě žlutého oleje. Tento žlutý olej se rozpustí ve 20 ml methylenchloridu a zpracuje se s 1,6 g oxidu manganičitého po 15 hodin za intenzivního míchání při teplotě místnosti. Oxid manganičitý se odfiltruje, filtrát se odpaří a zbytek se čistí střednětlakovou kapalinovou chromatografií (Si₂O, hexan/2 % ethylacetátu) a získá se 225 mg 2-(2,6,6-trimethylcyklohex-l-enylethinyl)-benzaldehydu jako žlutého oleje, který tuhne za chladu.

mg hydridu sodného (50% v minerálním oleji) se promyje pentanem a suspenduje ve 4 ml tetrahydrofuranu. Při 0 °C se přikape 470 mg ethylesteru kyseliny 4-(diethoxyfosfonyl)-3methyl-but-2-enové rozpuštěné ve 4 ml tetrahydrofuranu a reakční směs se mícha při teplotě místnosti 1 hodinu. Po znovu ochlazení na 0 °C se přikape roztok 225 mg žlutého aldehydu z předchozího stupně ve 3 ml tetrahydrofuranu. Reakční směs se míchá při teplotě místností 3 hodiny, nalije se na led/nasycený chlorid amonný, extrahuje se etherem, promyje vodou, suší a odpaří. Zbytek se čistí nejprve rychlou chromatografií (SiO₂, hexan/5% ethylacetát) a pak střednětlakovou kapalinovou chromatografií (SiO₂, hexan/2% ethylacetát) a získá se ethylester kyseliny (2E,4E)-3-methyl-5-[2-(2,6,6-trimethyl-cyklohex-l-enylethinyl)-fenyl]-penta-2,4dienové jako bezbarvý olej.

-24CZ 291352 B6

Příklad 18

Pod vlivem retinoidů diferencují HL-60 buňky (lidská myeloidní leukeraická buněčná linie) na granulocyty. Tato diferenciace HL-60 buněk na granulocyty je zprostředkována RARa a tak poskytuje základ pro použití retinoidů pro léčbu leukemie. Výsledky tohoto testu demonstrují, že RXR-selektivní sloučeniny podle vynálezu v dávkách, kdy samy nejsou účinné, jsou schopné potencovat až řádově prodiferenciační účinky all-trans reninové kyseliny a dalšího RARa-selektivního retinoidů, majícího následující vzorec:

CO₂H (sloučenina A)

Schopnost testovaných sloučenin transaktivovat retinoidové receptory je následující:

Tabulka 1

Aktivace (ED₅₀, nM)

RARa RXRa

all-trans retinová
kyselina	6,7	41
sloučenina A	3	>10 000
sloučenina z
příkladu 4	> 10 000	1,7

HL-60 diferenciace

Retinoidy indukovaná diferenciace HL-60 buněk byla zkoušena měřením jejich oxidačního trhacího potenciálu pomocí redukce NBT (Nitroblueterstazolium) [Piek a spol., J.Reticuloendothelial Soc., 30:581-593 (1981)].

HL-60 buňky byly udržovány v RPMI 1640 médiu doplněném 10% FCS, 2 mM L-glutaminu, 1 mM pyruvátu sodného, 1 % ne-esenciálních aminokyselin, 50 μ/ml penicilinu a 50 μ/ml streptomycinu (=RPMI/FCS). Buňky byly shledány prostými mykoplazmy,

000 buněk/ΙΟΟμΙ RPMI/FCS se vyseje do raikrotitračních jamek s plochým dnem. 10 μΐ retinoidů zředěných v kompletním médiu se současně přidá na konečnou koncentraci mezi 10’” a ÍO^M (zásobní roztok 10'²M v ethanolu a udržuje se na -20 °C a chrání se před světlem). Po 3 dnech se médium odstraní multikanálkovou pipetou a nahradí se 100 μΐ NBT roztoku (1 mg/ml v PBS s 200 nM forborol myristát acetátu (PMA). Po další hodině inkubace při 37 °C se NBT roztok odstraní a přidá se 100 μΐ 10% SDS v0,01N HC1. Množství redukovaného NBT se kvantifikuje fotometricky při 540 nm za použití automatické čtečky ploten. Byl vypočten průměr ze 3 jamek. S.E.M. byla mezi 5 a 10 %.

-25CZ 291352 B6

Výsledky

Účinky RXR-selektivních retinoidů na HL-60 diferenciaci

V souladu se svoji slabou potencí jako aktivátor RARa, byl RXR-selektivní retinoid z příkladu 4 zřetelně méně aktivní jako induktor HL-60 diferenciace než all-trans retinová kyselina (obr. 1). Příklad 4 byl skutečně inaktivní i při lxlO^M, což je v dobré shodě sjeho transaktivačními charakteristikami. HL-60 buňky se jeví být asi 10* citlivější kretinoidům než transaktivační systém (srovnej tabulka 1, RARa a obr. 1).

Jak je možno vidět z obr. 2 a 3, RXR-selektivní retinoid příkladu 4 byl schopen potencovat účinky all-trans retinové kyseliny a sloučeniny A v koncentracích, kdy sám není účinný. Potenciace byla v rozmezí 3* až 10*, tj. 3 až lOnásobně vyšší koncentrace all-trans retinové kyseliny nebo sloučeniny A samotné jsou vyžadovány pro dosažení srovnatelných hladin diferenciace HL-60.

Ze získaných výsledků je zřejmé, že účinky RXR-selektivních ligandů na HL-60 diferenciaci jsou více než aditivní a nemohou být proto vysvětleny zbytkovými RAR-aktivujícími účinky. Pozorované účinky jsou také o něco zřetelnější, je-li použit preferovaný RARa ligand (sloučenina A) spíše než méně selektivní (RAR vs. RXR) all-trans RA. Potenciační účinek je také kompatibilní s in vitro daty ukazujícími, že RXR tvoří heterodimery s RAR, které vedou ke zvýšené transkripční aktivitě na RAR-specifických promotorových sekvencích. Není dosud jasné jak relativně vysoké koncentrace RXR-selektivních retinoidů (10^-7) jsou požadovány pro projevení jakýchkoliv účinků. Tyto koncentrace jsou o dva řády vyšší než EC₅₀ v RXR transkripční aktivační zkoušce, ale není známo které RXR změny retinoidové vazebné aktivity závisí na tvorbě heterodimeru. ED₅₀ hodnoty jak uvedeno v tabulce 1 by proto nemusely být plnými představiteli účinků zprostředkovaných heterodimery, zahrnujícími RXR.

Příklad 19

Sloučenina z příkladu 4 byla testována na schopnost inhibovat proliferaci myších B buněk v kombinaci s all-trans RA. RXR selektivní ligand podle vynálezu potencuje inhibiční aktivitu all-trans RA u proliferace myších B buněk.

Tabulka 2

Retinoid	RARa vazba IC50(nM)	RARa aktivace ED50(nM)	RARa vazba IC50(nM)	RARa aktivace ED5o (nM)
all-trans RA	14	6,7	>10000	41
sloučenina z příkladu 4	>10000	>10000	92	1,7

Buněčná zkouška

Suspenze buněk myší sleziny byly umístěny v kultuře v mikrotitračních miskách s plochým dnem Microtiter, 0,2 ml/jamka v množství 2*10⁵/ml buněčné suspenze c/v IMDM doplněné 10% fetálním telecím sérem, HEPES, antibiotiky a 50 μΜ 2-merkaptoethanolu. Specifický B buněčný mitogenní E.coli lipopolysacharid (DIFCO)(LPS) byl přidán v koncentraci 50 pg/ml. Kultury byly inkubovány při 37 °C ve zvlhčované atmosféře a 5 % CO₂.

-26CZ 291352 B6

Retinoidy, které byly testovány, byly nejprve titrovány ve třech pokusech 10 mM až 10 μΜ a prováděny po celou dobu kultivace. Potom byly aktivní sloučeniny dále titrovány na dosažení IC₅o hodnot. Cyklosporin A (Sandoz AG) byl použit jako referenční sloučenina (od 1 nM do 1 μΜ).

Po 2,3 a 4 dnech kultivace byly buňky pulzovány s [³H] thyraidinem, 1 pCi/jamka po 4 hodiny. Kultury pak byly sklizeny na filtry' ze skleněných vláken a radioaktivita inkorporováná do DNA byla měřena v β-kapalinových scintilačních čítačích (Betaplate, Wallac Oy, Turku, Finsko).

Výsledky jsou uvedeny jako % odpovědi neošetřených kultur. Mitogen-indukovaná proliferace byla měřena jako inkorporace Ή-thymidinu po 24, 48 a 72 hodinách kultury. Retinoidy byly přidány ke kulturám na začátku kultivační periody.

Výsledky

1. Vliv RXR selektivních ligandů na proliferaci myších B buněk

RXR selektivní ligand z příkladu 4 byl testován nejprve na řízenou interferenci s LPS indukovanou proliferaci myších B buněk. Výsledky jsou uvedeny na obr.4 a demonstrují, že retinoid z příkladu 4 je inhibující s IC50 100 nM. Tato potence je 1/100 potence all-trans RA (IC50 = 1 nM). 4. den retinoid z příkladu 4 v malých dávkách (« IC50 3. den) slabě zvyšuje odezvu, která je v souladu s výsledky všech retinoidů aktivních v tomto systému.

2. RXR selektivní ligandy potencují inhibiční účinek all-trans retinové kyseliny na proliferaci myších B buněk

All-trans RA inhibuje LPS indukovanou proliferaci myších B buněk s IC50 1 nM. Maximální inhibice se získá s 10-30 nM a nikdy nepřesáhne 75 až 80 %. RXR selektivní ligand z příkladu 4 podle vynálezu byl dávkován do LPS stimulovaných kultur vystavených 1 nM all-trans RA; kultury vystavené lOnM all-trans RA byly prováděny paralelně. Ve všech případech koncentrace RXR ligandů z příkladu 4 podle vynálezu, které per se jsou sotva vyvolávají inhibici indukují potenciaci účinku 1 nM na hladinu pozorovanou s 10 mM RA. Podobné výsledky byly získány 2. a 3. den kultury. Údaje ze 3.dne jsou uvedeny na obr. 5.

Vzhledem k aktivitě sloučeniny z příkladu 4 je účinek možný aditivní nebo zvýšený. Výsledky získané v posledním bodě kultury nicméně indukují, že účinek není pouze aditivní, ale spíše zvyšující.

4. den není 1 nM inhibičně jakkoliv vyšší a aktuálně indukuje malé zvýšení odezvy, zatímco 10 nM RA inhibuje pouze asi 30 %. Důvody tohoto fenoménu jsou neznámé, ale poločas životnosti sloučeniny by mohl v tomto hrát určitou roli. RXR selektivní ligand také má podobný účinek (viz křivka 4). Nicméně kombinace 1 nM RA a RXR ligandu z příkladu 4 podle vynálezu ještě vede k inhibici řádově takové jako je indukována 10 nM RA. Výsledky jsou uvedeny na obr. 6.

Výsledky demonstrují, že RXR selektivní retinoid (příklad 4) potencuje vliv all-trans RA ve funkčním systému, ve kterém je retinoidový vliv zprostředkován RARa. Potenciace se získá 10 až 30násobném přebytku RXR ligandu vzhledem k all-trans RA. Magnituda potenciace je přibližně desetinásobná; hladina inhibice obvykle indukovaná 10 nM RA se získá s 1 nM RA v kombinaci s RXR ligandem podle vynálezu.

-27CZ 291352 B6

Příklad 20

Následující zjištění použitím běžných zkoušek aktivity proti akné demonstrují aktivitu sloučenin podle vynálezu proti akné:

(i) Antiproliferativní aktivita lidských sebocytů

Metody

Tukové buňky byly izolovány z tukových žláz dospělých lidí v kombinaci enzymatických a mechanických metod (Doran a spol., 1991). Buňky byly kultivovány v Iscove-ově médiu obsahujícím 10 % fetálního telecího séra a 4 pg/ml dexamethasonu na vrstvě růstově zastavených 3T3 myších fibroblastů. Buňky byly umístěny na plotnu v médiu bez testované sloučeniny a pak přidána testovaná sloučenina v čerstvém médiu 24-48 hodin po počátečním umístěním na plotnu. Kulturám bylo přidáváno čerstvé médium, obsahující testovanou sloučeninu každých 48 hodin, v den odebrání byly kultury propláchnuty s 0,03% EDTA v PBS pro odstranění 3T3 fibroblastů s následující inkubací v 0,05% trypsinu/0,03% EDTA. Buňky byly suspendovány, promíseny intenzivně pro přípravu jednotné suspenze buněk a spočteny na hemocytometru.

Zásobní roztoky sloučenin byly vyrobeny jako 10”² roztoky ve 100% DMSO a uchovávány při -20 °C ve tmě. Sloučeniny v roztoku byly uvedeny na teplotu místnosti a použity za ředění přímo do kompletního media na vhodnou koncentraci.

Sloučeniny byly testovány na inhibici proliferace růstu tukových buněk in vitro při 10-⁶ a 10⁷M.

Sloučeniny z příkladů 12, příkladu 2 a příkladu 4 byly testovány na jejich účinek v inhibici proliferace první pasáže lidských tukových buněk in vitro po 10 dnech vystavení léčivu. Výsledky jsou uvedeny jako koncentrace v nM, vyžadované pro inhibici růstu v 50 % (lC₅o).

Tabulka 3

Inhibice proliferace in vitro lidských tukových buněk

Sloučenina	IC50 (nM)
příklad 4 příklad 2 příklad 12 13-cis-retinová kyselina 9-cis-retinová kyselina	> 1000 (testováno dvakrát) 100 a 1000 (testováno dvakrát) 100 (testována dvakrát) 100 100

Sloučenina z příkladu 4 zobrazuje špatné dávkové odezvy se supresí růstu dosahující 30 až 40 %. i když je mnohem slabší než 13-cis-retinová kyselina, je ještě stále indikující biologickou aktivitu in vitro. Sloučenina z příkladu 2 poskytuje 1059 lOOnM pro první pokus ačkoliv 1000 nM dávka pouze poskytuje 70% inhibici růstu v tomto pokusu.

(2) Redukční aktivita Rhino myších utriclů

V tomto modelu jsou sloučeniny zkoušeny na jejich schopnost redukovat velikost již existujících utriclů, keratinizovaných pilosebaceozních struktur, které se podobají lidským komedonům (Mezick a spol., 1985).

-28CZ 291352 B6

Metoda

Samice Rhino myši (hr™ hr^rh) 6 až 8 týdnů staré, získané od Jackson Laboratories. byly použity ve skupině 6. Sloučeniny byly rozpuštěny ve 100% acetonu a uchovávány při 4 °C po dobu trvání 5 pokusu pod dusíkem. Testované sloučeniny byly aplikovány na záda myši denně po 5 dnů 3 po sobě jdoucí týdny. Jeden den po poslední dávce byly myši usmrceny inhalací CO2. Volná kůže ze zad byla odříznuta a inkubována ve 2M bromidu sodném 2-3 hodiny při teplotě místnosti. Epidermis byl pak oddělen od dermis.

Epidermis byl pak dehydratován 70%, 80%, 95%, 100% ethanolem a xylenem. Vzorky byly udržovány v každém z uvedených roztoků 2 hodiny. Vzorky kůže byly odstraněny ze xylenu a umístěny na mikroskopická sklíčka. Zobrazovací analýzy za použití softwaru Ultimata image analysis, byly použity pro stanovení středního průměru a plochy utriclů. Přibližně 5násobek na vzorek v průměru na měřených 150 utriclů na myš.

Výsledky

Několik sloučenin podle vynálezu (příklad 12, příklad 2 a příklad 4) bylo testováno topicky na rhino myších

Myši byly dávkovány topicky se 100μ1 13-cis-retinové kyseliny, 9-cis-retinové kyseliny a sloučeninami z příkladu 12, příkladu 2 a příkladu 4 v acetonu. Výsledky jsou uvedeny dále v tabulce 4:

Tabulka 4

Sloučenina	Dávka (pg/day)	vel.utriclu (pm2/utricle)	% změny ke kontrole
vehikulum.		9750 ±508	-
13-cis-RA	0,1	9187 ±794	-6ns
	1	6400 ± 424	-34
	10	3793 ± 368	-61
	100	3132 ±305	-68
9-cis-RA	0,1	8650 ± 427	-11
	1	6926 ± 497	-29
	10	3540 ± 354	-64
	100	2644 ±312	-73
příklad 12	0,1	9104 ±829	yns
	1	9156 ±938	-6ns
	10	7634 ± 485	-22
	100	3596 ± 300	-63
příklad 2	0,1	9535 ± 890	2°s
	1	9616 ±1134	-lns
	10	9049 ±891	ynS
	100	5437 ±615	M4
příklad 4	0,1	9843 ± 565	+lns
	1	9491 ± 507	^ns
	10	8951 ±964	-8ns
	100	5916 ±992	-39

= statisticky nevýznamný ke kontrole. Všechny ostatní hodnoty < 0,05

-29CZ 291352 B6

Poznámky:

Během tohoto pokusu byly zaznamenány vedlejší účinky, Zvířata s dávkou 100 pg 5 13-eis-retinové kyseliny vykazovala exfoliaci a erythem 5. den. Zvířata s dávkou 9-cis-retinové kyseliny vykazovala tyto účinky o den dříve se stejnou dávkou.

7. den dávkování byl erythem pozorován u 100 zzg sloučeniny z příkladu 12. Byl zaznamenán ve stejný den určitý erythem u zvířat se 100 pg sloučeniny z příkladu 2. Tento erythem však nebyl ío tak intenzivní jako u příkladu 12. vtémže čase nevykazovala srovnatelná dávka z příkladu 4 žádný vyhodnotitelný erythem.

14. den dávkování byla exfoliace viditelná u všech zvířat dávkovaných se 100 pg sloučeniny z příkladu 12, u kterých nebyl pozorován den předem. Jsou-li sloučeniny v koncentraci 100 pg je 15 pořadí efektu exfoliace/erythema od nejtěžšího kméně těžkému následující: 9-cis-RA, 13-cis-RA, příklad 12, příklad 2 a příklad 4.

Sloučeniny podle vynálezu produkují tak snížené dráždění ve srovnání s 9-cis-RA, 13-cis-RA.

(3) In vivo vliv sloučenin na velikost tukových žláz zlatých syrských křečků

Metody

Samci Charles River Golden Syrian křečků dostali požadovanou dávku v acetonu. Sloučeniny 25 byly uchovávány při 4 °C. Týdně byly připravovány čerstvé roztoky.

Křečkům byla podávána dávka denně po pět dnů, vynechány dva dny a opět dávkováno pět dnů až do podání 20 dávek. Objem roztoku byl 50 mikrolitrů na ucho.

Křečci byly usmrceni CO₂ inhalací a uši byly odebrány pro histologické hodnocení. Jedno ucho bylo odebráno a ventrální povrch byl oddělen od zbytku ucha. 2mm terčík byl vyříznut 5 mm od špičky ucha a uchováván v 0,1% Sudan Blach B rozpuštěné ve 100% propylenglykolu přes noc. Po odbarvení byla velikost tukových žláz kvantifikována pomocí Donsanto Image Analysis Systém.

Uvedená data jsou průměry ploch 80-120 tukových žláz na dávku, jako procenta kontrolních (rozpouštědlem ošetřených) sekcí.

Tabulka 5

Vliv 4-týdenního dávkování sloučeniny z příkladu 4 a 13-cis-retinové kyseliny na velikost ušních tukových žláz křečka

Sloučenina	dávka (pg/den)	velikost tukové žlázy	% změny kontroly
vehikulum	-	16475± 1708	-
13-cis-RA	1	14029 ±2977	-15ns
	10	12965 ± 2029	-21
	100	10459±1302	-37
příklad 4	1	13237± 1491	-20
	10	17046 ±4667	+3ns
	100	13043± 1577	-21

ns = statisticky nevýznamný vzhledem ke kontrole. Ostatní hodnoty významné vzhledem k vehikulovýn. kontrolám.

-30CZ 291352 B6

Odkazy:

Doran a spol., „Characterization of human sebaceous celíš invitro., J. Invest.Dermatol., 96:341-348(1991).

Mezick a spol., „Topical and systeraic effect of retinoids on horn-filled utriculus size in rhino mouše. A model to quantify ,antikeratinizing‘ effects of retinoids.“, J. Invest.Dermatol, 83:110-113 (1985).

Příklad 21

Sloučenina z příkladu 6 byla testována na svoji schopnost inhibovat buněčnou linii lidského karcinomu prsu v kombinaci sretinoidem, majícím RARa aktivitu, all-E-3,7-dimethyl-9-[(2methoxy-4-methyl-6-oktyloxy)fenyl]-2,4,6,8-nonatetraenová kyselina (sloučenina B) uvedeného vzorce

sloučenina B

Výsledky dokládají, že RXR selektivní ligand podle vynálezu potencuje inhibiční aktivitu pevných tumorů sloučeniny B.

-31 CZ 291352 B6

I. Syntéza sloučeniny B

Sloučenina B byla připravena podle následujícího postupu:

Roztok kyseliny 2,6-dihydroxy-4-methylbenzoové 1 v acetonu (50,4 g, 750 ml) se zpracuje s methyljodidem (100 ml) a uhličitanem draselným (124,2 g) a zahřívá se na teplotu refluxu 18 hodin. Směs se pak ochladí na teplotu místnosti a filtrací se zbaví pevných látek. Zahuštěním roztoku se získá surový produkt, který se rozpustí v ethylacetátu a promyje se vodným roztokem hydroxidu sodného (IN, studený). Odstraněním rozpouštědel ve vakuu se pak získá 2,6—dimethoxy-4-methyl-benzoát 2 (54 g). Tento materiál (52,5 g) se rozpustí v dichlormethanu (1 000 ml) ochlazeném na -70 °C a pak se zpracuje s roztokem chloridu boritého ve stejném rozpouštědle (29,3 g/100 ml; 180 ml). Tato směs se pak zahřívá až na teplotu místnosti a míchá se dalších 45 minut a pak se nalije na led. Organická vrstva se oddělí, promyje se další vodou, suší (síran horečnatý), filtruje a zahustí. Zbytek se pak čistí vysokoúčinnou preparativní kapalinovou chromatografií (HPLC) za použití Waters prep.500 chromatografií (7% ethylacetát/hexan) eluent a získá se čistý rnethyl-2-hydroxy-6-methoxy-4-methylbenzoát 3 jako pevná látka (28,3 g). Roztok tohoto materiálu (35 g) v methylethylketonu (700 ml), obsahujícím uhličitan draselný (27,1 g) se zpracuje s 1-oktyljodidem (34,2 g) a zahřívá pod refluxem 20 hodin. Reakční směs se ochladí, filtrací se odstraní pevné látky a filtrát se zahustí a pak znovu rozpustí ve směsi hexanu a ethylacetátu. pento roztok se pak promyje vodnou bází (IN hydroxid sodný), vodou, suší se (síran horečnatý) a zahustí do sucha. Čištěním pomocí HPLC jako výše se získá čistý methyl-2-methoxy-6-oktyl-4-methylbenzoát 4 (51,8 g). Roztok tohoto materiálu

-32CZ 291352 B6 (51,8 g) v toluenu (500 ml) se ochladí na -60 °C a zpracuje s roztokem diizobutylaluminiumhydridu (25% v hexanu, 281 ml) a potom se ohřeje na teplotu místnosti. Reakční směs se pak pečlivě zpracuje s vodným methanolera (100 ml, 1:1) za chlazení tak, že se teplota udržuje na 20 °C a pak se přidá hexan (500 ml) a síran horečnatý. Pevné látky se pak odfiltrují a rozpouštědla se odstraní ve vakuu a získá se surový alkohol 5. Tento materiál (47 g) se rozpustí v acetonitrilu (500 ml), obsahujícím trifenylfosfoniumhydrobromid (54,9 g) a zahřívá se pod refluxem 22 hodin. Rozpouštědla se pak odstraní ve vakuu a surová sůl 6 se suší při teplotě místnosti při tlaku 0,1 mm Hg (tento materiál může být krystalován z tetrahydrofuranu a získá se čistý [(2-methoxy-6-oktyloxy-4-methyl) fenylmethyltrifenylfosfoniumbromid). Tato sůl 6 se pak převede na sloučeninu B, all-E-3,7-dimethyl-9-[(2-methoxy-4-methyl-6-oktyloxy)fenyl]-2,4,6,8-nonatetraenovou kyselinu, jak je popsána v US patentu č. 4 894 480 (příklad 5).

2. Testování

Zkoušky vazby retinoid receptoru a transaktivace se provedou na sloučenině B a příkladu 5 jak je popsáno výše. Výsledky jsou následující:

Tabulka 6

Sloučenina aktivace vazba

	RAR EC3o(nM) %max	RXR EC50(nM) %max	RAR ICso(nM) %	RXR IC50(nM)
B	a β Y	11 114 5,3 82 1000 48	at 1000 0	240 500 > 10,000 <20
Př. 6	a β 7	1000 4 1000 8 1000 9	1,4	> 10,000 24 > 10,000 9 > 10,000 245	110 150

Buněčná linie rakoviny prsu, 747-D, získaná zATCC (přírůstkové číslo HTB133) byla kultivována v RPMI 1640 médiu doplněném 10% FBS, 10 μΐ/ml inzulínu a 13 ng/ml gentaraicinu a inkubována při 37 °C, 4,5 % CO₂ a 99,5% zvlhčeném vzduchu. Buňky se sklidí když dosáhnou 70 až 80% konfluence a peletují se. Buňky se resuspendují v médiu a vysejí (150 μΐ/jamku) do 96jamkových ploten (Coming) při hustotě umožňující lineární růst během sedmi dnů zkušební periody (tj. T47-D vyseté v množství 4*10³ buněk/jamka). Plotny se umístí do inkubátoru při 37 °C na noc.

Léčiva (1 mM zásobní roztok ve 100% DMSO) se přidají 18-24 hodin po naočkování. Kombinace léčiv byly připraveny v 96-jamkových mikrotitračních plotnách a ručně se přidají ke zkušebním plotnám. MTT zkoušky byly provedeny 3.-7. den po přídavku léčiva. MTT zkouška je zkouška na bázi tetrazolia, která měří životnost buněk v kultuře. MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-difenyltetrazoliurabromid) zásobní roztok (5 mg/ml v 1^XPBS) se přidá ke zkušebním plotnám (50 μΐ/jamka) a inkubuje se 2,5 hodiny při 37 °C.

Kapalina se odstraní odsátím, přidá se 50 μΐ 95% ethanolu a plotny se třepou (Mini-Orbital Shaker, Bellco) 15 minut pro solubilizaci formazanového produktu. Optická hustota každé jamky se měří použitím automatické čtečky ploten (Microplate EL320 Reader, Bio-Tek Instruments) se zkušební vlnovou délkou 570 nm a referenční vlnovou délkou 660 nm. Rozsah inhibice buněčného růstu vyvolaný různými koncentracemi sloučeniny B v kombinaci s konstantní koncentrací sloučeniny z příkladu 6 byl stanoven podle následující rovnice:

% inhibice =

CD570 (neošetřená) - CD570 (ošetřená léčivem)

C570 (neošetřená) *100

-33CZ 291352 B6

Výsledky jsou graficky znázorněny na obr. 7. Výsledky dokládají, že RXR-selektivní sloučenina podle vynálezu potencuje aktivitu retinoidu majícího RARa aktivitu v inhibici růstu buněčné linie pevného tumoru.

Příklad A

Tvrdé želatinové kapsle, obsahující 20 mg účinné složky

Složení: jedna kapsle obsahuje:

vzorec I	20 mg
RARa retinoid	20 mg
želatina Bloom 30	70,0 mg
maltodextrin MD 05	108,0 mg
dl-a-tokoferol	2,0 mg
askorbát sodný	10,0 mg
mikrokrystalická celulóza	48,0 mg
stearát horečnatý	2,0 mg
(hmotnost obsahu kapsle)	280,0 mg

Postup:

Účinné substance se melou za mokra v roztoku želatiny, maltodextrinu, dl-a-tokoferolu a askorbátu sodného.

Suspenze mletá za mokra se suší postřikem.

Postřikem sušený prášek se smísí s mikrokrystalickou celulózou a stearátem horečnatým.

280 mg této směsi se naplní do tvrdých želatinových kapslí vhodné velikosti a barvy.

Popis obrázků na připojených výkresech:

Obr. 1: Indukce diferenciace HL-60 buněk s all-trans-kyselinou retinovou (RA), jiným RARa

Obr. 2:	selektivním retinoidem (sloučenina A, zde) a RXR selektivním retinoidem (příklad 4, zde). Indukce diferenciace HL-60 buněk s kombinacemi all-trans kyseliny retinové (RA) a sloučeniny z příkladu 4.
Obr. 3:	Indukce diferenciace HL-60 buněk s kombinacemi sloučeniny A a sloučeniny z příkladu 4.
Obr. 4:	Thymidinová inkorporace B buněčných kultur vystavených all-trans RA nebo sloučenině z příkladu 4.
Obr. 5:	Inhibice LPS-indukované B buněčné proliferace all-trans RA a sloučeninou z příkladu 4 a v kombinaci 3. den kultivace.
Obr. 6:	Inhibice LPS-indukované B buněčné proliferace all-trans RA a sloučeninou z přikladu 4 a v kombinaci 4. den kultivace.
Obr. 7:	Zvýšená antiproliferativní aktivita sloučeniny, mající RARa aktivitu (sloučenina B) a RXR-selektivní sloučeniny (příklad 6) v buněčné linii rakoviny prsu.

Claims (12)

1. Retinoidy obecného vzorce I

CO₂H (I), kde

Cr-Cg vazba je dvojná vazba a jeden ze symbolů R_b a R₂ představuje alkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku a zbývající představuje brom nebo jod, nebo Ri a R₂, brány dohromady, představují alkylenskupinu se 3 až 13 atomy uhlíku, jejíž jeden atom uhlíku je popřípadě nahrazen heteroatomem zvoleným ze souboru zahrnujícího síru, kyslík a dusík; nebo Cr-Cg vazba je trojná vazba a Ri a R₂ nezávisle představuje vždy alkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, nebo Ri aR₂, brány dohromady, představují alkylenskupinu se 3 až 13 atomy uhlíku, jejíž jeden atom uhlíku je popřípadě nahrazen heteroatomem zvoleným ze souboru zahrnujícího síru, kyslík a dusík, nebo Rj a R₂, brány dohromady spolu s atomy uhlíku, k nimž jsou připojeny, představují aromatický kruh obsahující 5 až 6 atomů uhlíku nebo heteroaromatický kruh obsahující 5 až 6 atomů, v němž jedním atomem zbytku R] nebo R₂ je heteroatom zvolený ze souboru zahrnujícího kyslík, dusík a síru a zbývající atomy zbytků R] a R₂ jsou atomy uhlíku;

jakož i jejich farmaceuticky přijatelné soli, estery a amidy.

2. Retinoidy podle nároku 1, vzorce I, kde C₇-Cg vazba je dvojná vazba.

3. Retinoidy podle nároku 2, vzorce I, kde R] a R₂, brány dohromady, představují alkylenskupinu se 3 až 6 atomy uhlíku, jejíž jeden atom uhlíku je popřípadě nahrazen heteroatomem zvoleným ze souboru zahrnujícího síru, kyslík a dusík.

4. Retinoidy podle nároku 3, vzorce I, kde Ri a R₂, brány dohromady, představují alkylenskupinu se 3 až 6 atomy uhlíku.

5. Retinoidy podle nároku 2, vzorce I, kde jeden ze symbolů Ri a R₂ Představuje alkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku a zbývající představuje brom nebo jod.

6. Retinoidy podle nároku 1, vzorce I, kde Cr-Cg vazba je trojná vazba.

7. Retinoidy podle nároku 6, vzorce I, kde Rj a R₂, brány dohromady, představují alkylenskupinu se 3 až 13 atomy uhlíku, jejíž jeden atom uhlíku je popřípadě nahrazen heteroatomem zvoleným ze souboru zahrnujícího síru, kyslík a dusík, nebo R] a R₂, brány dohromady spolu s atomy uhlíku, k nimž jsou připojeny, představují aromatický kruh obsahující 5 až 6 atomů uhlíku nebo heteroaromatický kruh obsahující 5 až 6 atomů, v němž jedním atomem zbytku R| nebo R₂ je heteroatom zvolený ze souboru zahrnujícího kyslík, dusík a síru a zbývající atomy zbytků R] a R₂ jsou atomy uhlíku.

-35CZ 291352 B6

8. Retinoidy podle nároku 6, vzorce I, kde R] a R₂, brány dohromady, představují alkylenskupinu se 3 až 6 atomy uhlíku.

9. Retinoidy podle nároku 6, vzorce I, kde Ri a R₂, brány dohromady spolu s atomy uhlíku, k nimž jsou připojeny, představují aromatický kruh obsahující 5 až 6 atomů uhlíku nebo heteroaromatický kruh obsahující 5 až 6 atomů, v němž jedním atomem zbytku Ri nebo R₂ je heteroatom zvolený ze souboru zahrnujícího kyslík, dusík a síru a zbývající atomy zbytků Ri a R₂ jsou atomy uhlíku.

10. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje retinoid obecného vzorce i podle nároku 1 nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl, ester nebo amid a farmaceuticky přijatelný inertní nosič.

11. Farmaceutický přípravek v jednotkové dávkové formě pro orální podávání, vyznačující se tím, že zahrnuje první sloučeninu, kterou je retinoid, mající RARa aktivitu a druhou sloučeninu, kterou je retinoid obecného vzorce I podle nároku 1 nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, ester nebo amid, přičemž první sloučenina je přítomna v jednotkové dávkové formě v množství od 10 do 50 mg a druhá sloučenina je přítomna v jednotkové dávkové formě v množství odpovídajícím 1 až lOnásobku množství první sloučeniny.

12. Použití retinoidu podle nároku 1 pro výrobu farmaceutického přípravku pro léčení pevných nádorů, leukemie nebo akné.