CZ28938U1

CZ28938U1 - Imunochromatografický test dimethyltryptaminových drog

Info

Publication number: CZ28938U1
Application number: CZ2015-31514U
Authority: CZ
Inventors: Martin Kuchař; Anna Šuláková; Lucie Fojtíková; Oldřich Lapčík; Michal Maryška
Original assignee: Vysoká škola chemicko-technologická v Praze
Priority date: 2015-09-14
Filing date: 2015-09-14
Publication date: 2015-12-07

Description

Na drogové scéně se v posledních letech kromě tradičních drog (kokain, opiáty, amfetaminy, kanabinoidy) objevují také nové syntetické drogy (NSD). Důvodem je snaha výrobců a distributorů obejít stávající legislativní normy, v nichž jsou omamné a psychotropní látky vymezeny obvykle taxativně. Na ilegální trh se tak dostávají analoga známých látek s psychotropním potenciálem, která dosud nejsou uvedena na seznamu ilegálních látek, nebo jejichž prekurzory nejsou monitorovanými substancemi. Hlavní nebezpečí spojené s užíváním těchto nových syntetických drog (NSD) tkví v nedostatku informací o jejich farmakokinetickém a toxikologickém chování, neboť tyto látky neprošly žádnými klinickými testy.

Dimethyltryptamin (DMT) se minimálně ve stopovém množství vyskytuje pravděpodobně ve všech živých organismech. V některých rostlinách se ale vyskytuje v poměrně velké koncentraci (například Psychotria viridis, Mimosa hostilis nebo chrastice rákosovitá). V lidském těle je jeho přítomnost také prokázána a je vylučováno pravděpodobně šišinkou, ze které se vylučuje chemicky příbuzný hormon melatonin. Jeho funkce v těle zatím nebyla uspokojivě objasněna, předpokládá se, že se mj. podílí na snění, zážitcích blízkých smrti, mystických prožitcích atd. DMT lze také vytvořit synteticky. DMT díky své extrémní síle není příliš populární drogou a od drogových dealerů není běžně k dostání, mnoho uživatelů si ho vyrábí pro vlastní potřebu.

DMT je extémně silný, ač jen krátce účinkující halucinogen. Jedná se o tzv. agonistu serotoninu, ozkového neuropřenašeče, který řídí zpracování informací, ale má vliv i na náladu a vnímání rality. Jelikož je DMT normálně přítomno v lidském těle (ač v malých množstvích), tělo je připraveno na jeho metabolizaci a působení.

5-MeO-DMT (5-methoxy-N, N-dimethyltryptamin) je velmi silné psychedelikum. Přírodně se vyskytuje v malé míře v některých rostlinách, a v poměrně velké míře je obsažen v jedu některých druhů ropuch a v dalších organismech, které obsahují příbuznou látku - bufotenin. Je možné ho vyrobit i synteticky. Účinky jsou srovnatelné s účinky DMT.

Tradiční drogy lze detekovat pomocí komerčních imunochemických testů založených na selektivní reakci protilátky a antigenu, kterým jev tomto případě hledaná omamná či psychotropní látka. K detekci NSD však tyto testy použít nelze. Odhalit intoxikaci osob novými syntetickými drogami je možné pomocí metod klinické biochemie, a to zejména analýzou pomocí plynové chromatografie s hmotnostním detektorem (LC-MS), což je poměrně náročné jak na přístroje, tak na odbornost obsluhy. Sestavení přístrojově nenáročných, jednoduchých, uživatelsky příjemných imunochemických testů na principu LFIA (Lateral Flow Immunochromatographic Assay) by umožňovalo daleko rychlejší a levnější orientační detekci látek v biologickém materiálu ve zdravotnictví nebo při dopravních kontrolách řidičů.

Přestože existuje mnoho evaluovaných analyzačních postupů pro stanovení DMT a jejich analogů, možnosti imunoanalýzy jsou omezené. V literatuře jsou popsány příklady metod pro ELIS A (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) stanovení strukturně složitějších syntetických kanabinoidů JWH-018 a JWH-250 v krvi, krevním séru a moči (Amtson A, Ofsa B, Lancaster D, Simon JR, McMullin M, Logan B. Validation of a Novel Immunoassay for the Detection of Synthetic Cannabínoids and Metabolites in Urine Specimens. J. Anal. Toxicol. 2013; 37:284-90), JWH-200 ve slinách (Rodrigues WC, Catbagan P, Rana S, Wang G, Moore C. Detection of Synthetic Cannabinoids in Oral Fluid Using ELISA and LC-MS-MS. J. Anal. Toxicol. 2013; 37:526-33) a HEIA (Homogenous Enzyme ImmunoAssay) stanovení JWH-018 A-pentanové kyseliny, což je významný metabolit JWH-018, v moči (Bames AJ, Young S, Spinelli E, Martin TM, Klette KL, Huestis MA. Evaluation of a homogenous enzyme immunoassay for the detection of synthetic cannabínoids in urine. Forensic Sci Int. 2014;241:27-34).

- 1 CZ 28938 Ul

Jako nosné proteiny se používají hovězí sérový albumin (BSA), ovalbumin (OVA), hovězí thyroglobumin (BTG), popř. další proteiny vhodných vlastností. Konjugáty se připravují reakcí aktivované formy haptenu (reaktivní anhydridy či estery) s ε-aminoskupinami lysinových zbytků proteinu za vytvoření amidových vazeb. Konjugací se dosáhne statisticky náhodného obsazení lysylů přítomných v proteinu.

Podstata technického řešení

Byly sestaveny imunochemické testovací proužky formátu LFIA (Lateral-Flow Immunochromatographic Assay) pro rychlou, uživatelsky příjemnou analýzu přítomnosti dimethyltryptaminových látek v tělních tekutinách.

Pro vývoj metody byl použit hapten 5-methoxy-N,N-dimethyltryptaminu, který byl připojen k nosnému proteinu pro vytvoření imunogenu. Pro tyto účely byl jako vhodný nosný protein vybrán hovězí sérový albumin (BSA). Při tvorbě konjugátů byla využita metoda aktivovaného esteru, při níž je hapten reakcí s jV,7V’-dicyklohexylkarbodiimidem (DCC) a A-hydroxysukcinimidem (NHS) nejprve převeden na nestabilní derivát O-acylisomočoviny, a poté na aktivovaný ester. Vlastní konjugační reakce, při níž dochází k tvorbě amidové vazby mezi karboxylovou skupinou haptenu a primární aminoskupinou aminokyseliny lysinu v BSA, pak probíhala v reverzním micelámím prostředí anionaktivního tenzidu. Z laboratorních zvířat imunizovaných imunogeny lze získat polyklonální králičí protilátky a uplatnit je při vývoji imunoanalytických metod stanovení dimethyltryptaminových látek.

Takto vytvořeným imunogenem byli imunizováni laboratorní králíci, ze kterých byla získána polyklonální králičí protilátka, která byla označena PL245. Protilátka byla použita pro sestavení kvalitativního testovacího proužku na přítomnost dimethyltryptaminových látek v tělních tekutinách, které obsahují strukturu:

Testovací proužky se skládají z: podložky, membrány, která slouží pro samotnou chromatografickou analýzu a je situována uprostřed podložky, ve spodní části ji překrývá proužek pro konjugát a ten je překrýván proužkem pro vzorek, který je připevněn na spodním konci podložky. Na horním konci podložky je připevněn absorpční proužek, který překrývá membránu v homí části.

Na proužek pro konjugát je nanesen konjugát GAR (kozí protilátka proti králičí protilátce) značený zlatými částicemi o velikosti 40 nm v množství 2 až 20 μΐ, přičemž koncentrace GAR-Au je 200 pg/ml ve směsi s králičí polyklonální protilátkou (PL245) proti haptenu 5Meo-DMT, čímž vznikne směs konjugátů GAR-Au a PL245-GAR-Au. Koloidní zlato v konjugátu způsobuje červené zabarvení linek.

Membrána obsahuje dvě linky, kontrolní a testovací. Je-li analýza na sledované drogy negativní, dojde ke zviditelnění obou linek. Pokud je vzorek pozitivní, dojde k zeslabení až úplnému vymizení spodní (testovací) linie. Zeslabení intenzity linky je závislé na koncentraci analytu. Čím vyšší je koncentrace ve vzorku, tím více linka vymizí.

- 9 CZ 28938 Ul

V testovací lince je obsažen imobilizační konjugát haptenu 5Meo-DMT o systematickém názvu: 2-{3-[2-(jV,/V-dimethylamino)ethyl]-lH-indol-5-yloxy} octová kyselina s hovězím sérovým albuminem (5Meo-DMT-BSA), v množství 140-160 pg/ml. V kontrolní lince je obsažena DAG (terciální oslí protilátka proti kozí protilátce) s koncentrací 70 až 120 pg/ml.

Odebrané tělní tekutiny, které jsou vyšetřovány na přítomnost drogy, jsou aplikovány na proužek pro vzorek spolu sreakčním pufrem. Test se odečítá po 15 min. Po vyvzlínání do absorpčního proužkuje imunochromatografie ukončena. Během chromatografie vzlíná droga z tělních tekutin ke konjugátům GAR-Au a PL245-GAR-Au, naváže se na, pro něj specifickou, protilátku PL245, čímž vysytí její vazebná místa pro hapten. Konjugát PL245-GAR-Au se tedy na testovací linku ío již nemá jak navázat. Konjugát GAR-Au se naváže na DAG na kontrolní lince, čímž se ověří, že imunochromatografie probíhala správně. Zobrazí-li se pouze jedna linka, vzorek je pozitivní. Pokud je vzorek negativní, naváže se tedy konjugát PL245-GAR-Au na hapten imobilizačního konjugátu (5Meo-DMT-BSA), který je nanesený na testovací lince. Tak pozorujeme zviditelnění obou proužků.

Imunochromatografický test v tenké vrstvě na každý 1 cm šířky obsahuje imobilizační konjugát, který je nanesen v množství 0,2 až 0,4 pg, oslí protilátku proti kozí protilátce v množství 0,12 až 0,3 pg, konjugát kozí protilátky s koloidními zlatými částicemi je nanesen v množství 2 až 5 pg, polyklonální králičí protilátka je nanesena v množství 1 až 3 pg.

S výhodou jsou látky v poměru konjugát kozí protilátky s koloidními zlatými částicemi ku poly20 klonální králičí protilátce ku imobilizačnímu konjugátu ku oslí protilátce 20:10:2:1.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1: Schéma testovacího proužku Obr. 2: Princip metody

Obr. 3: Znázornění rozdílu mezi pozitivní a negativní kontrolou

Obr. 4: Struktura haptenu 5-methoxy-N, N-dimethyltryptaminu

Obr. 5: Struktura 5-methoxy-N, N-dimethyltryptaminu (5MeO-DMT)

Obr. 6: Struktura Dimethyltriptaminu (DMT)

Obr. 7: Výsledek analýzy Příkladu 2 (dvě linky na membráně-negativnívýsledek)

Obr. 8: Výsledek analýzy Příkladu 3 (jedna linka na membráně-pozitivní výsledek)

Obr. 9: Výsledek analýzy Příkladu 4 (jedna linka na membráně-pozitivní výsledek)

Obr. 10: Výsledek analýzy Příkladu 5 (jedna linka na membráně-pozitivní výsledek)

Příklady provedení technického řešení

Příklad 1

Testovací proužek pro detekci DMT látek

Standard 5MeO-DMT (zás. roztok: 1 mg/ml) v 99 % EtOH

Imobilizační konjugát 5MeO-DMT-BSA 7 (zás. roztok: 1 mg/ml) v 0,01 mol/1 karbonát-bikarbonátovém pufru

Králičí polyklonální protilátka PL245 13 (zás. roztok: 1 mg/ml) v 0,01 mol/1 fosfátovém pufru s přídavkem soli (PBS)

DAG 8 ( zás. roztok 1 mg/ml) v deionizované vodě GAR 14 ( zás. roztok 1 mg/ml) v deionizované vodě Gold Colloid 40 nm OD 5 15 - roztok zlatých částic

-3CZ 28938 Ul

Velikost částic (nm)	OD 520nm	Počet částic /ml	Počet molů částic/ml	Molámí koncentrace částic	Hmotnost zlata /ml	Moly zlata/L
40	5	4,50x10“	7,4726xl0’¹³	7,4726xl0'^lu	2,91χ10'^υ4	1,48x10'⁰³

Příprava membrány 3 - uzavřený formát

Byla ustřižena membrána 3 (Millipore HiFlowPlus 75) o délce 20 cm a přilepena na podložku 5 do prostřední části.

Zásobní roztoky imobilizačního konjugátu 5MeO-DMT-BSA 7 o koncentraci 150 pg/ml a DAG 8 o koncentraci 100 pg/ml v 5 mol/1 borátovém pufru byly naneseny na membránu 3 rychlostí 8 μΐ/s v objemu 40 μ1/20 cm membrány 3, a to imobilizační konjugát 5MeO-DMT-BSA 7 na testovací linku lj_ a DAG 8 na kontrolní linku 10. Následovala inkubace membrány 3 při 37 °C 10 hodin.

Na podložku 5 a přes homí konec membrány 3 byl nalepen absorpční proužek 4 z celulózových vláken a podložka byla nastříhána na řezačce na proužky o velikosti 0,4 cm.

Příprava proužku i pro vzorek 9 a proužku 2 pro konjugát

Byl připraven blokační pufr (10 ml):

Složka	Finál. konc.	Množství pro přípravu
Borátový pufr	0,2 mol/1	10 ml
BSA	1%	0,1 g
Tween 20	1%	100 μΐ neřeď. Tweenu
Sacharóza	1%	0,1 g

Proužek 2 pro konjugát a proužek I pro vzorek 9 z polyesteru PE VL98 byly nastříhány na malé kousky (proužek 2 pro konjugát 0,4 x 1 cm, proužek 1 pro vzorek 0,4 x 1,5 cm). Následně byly vsádkově namočeny do blokačního pufru a sušeny na sušící mřížce po dobu 1 h při 37 °C. Tento proces namočení a sušení byl prováděn 2x.

Příprava konjugátu protilátky GAR 14 se zlatými částicemi (GAR 14 - Au 15)

Použité chemikálie:

zlaté částice 40 nm, OD 5 15 1 ml mmol/1 borátový pufr 2 ml

GAR 14 100 pg (100 μΐ, koně. 1 pg/μΐ)

GAR 14 byl aplikován po malých kapkách k roztoku zlatých částic 15 ředěných v borátovém pufru za pomalého míchání. Následovala inkubace směsi při 37 °C po dobu 2 h, za stálého míchání. Připravený konjugát byl rozdělen na 2 díly a centrifugo ván (5 000 x g, 10 °C, 75 min). Supematant (tekutina nad sedimentem) byl odebrán a pelety resuspendovány v 1 ml promývacího pufru. Byla provedena centrifugace (3x), (13640 x g, 10 °C, 15 min). Vždy byl odpipetován supematant a pelety resuspendovány v 1 ml promývacího pufru. Před třetí centrifugací byly obě pelety spojeny a resuspendovány v 1 ml promývacího pufru. Po centrifugací byla peleta resuspendována v 10 ml skladovacího pufru. Přečištěný konjugát GAR 14 - Au 15 (zás. roztok 200 pg/ml) byl skladován při 4 °C ve skleněné lahvičce s alobalem.

Smícháním reagencií byl připraven MasterMix:

GAR 14-Au 15 20 μΐ

-4CZ 28938 Ul

Reakční pufr 18 μΐ

PAb (PL245, lmg/ml) 13 2 μΐ

MasterMix byl kapán na proužek 2 pro konjugát o objemu 40 μΐ/kus. Poté byl sušen na síťce při teplotě 37 °C po dobu 2 h 16 h. Připravený proužek 2 pro konjugát byl přilepen k membráně 3 s nanesenými imunoreagenciemi a následně přes jehož okraj byl k podložce 5 přilepen proužek 1 pro vzorek 9.

5. Příprava pufrů a roztoků pro metodu LFIA

0,1 mol/1 Borátový pufr, pH 8,8

0,1 mol/1 borax (tetrahydroboritan sodný dodekahydrát)

38,14 g boraxu 1 000 ml deionizované vody

0,1 mol/1 kyselina boritá 6,17 g kyseliny borité 1 000 ml deionizované vody mmol/1 Borátový pufr, pH 8,8 ml 0,1 mol/1 borátového pufru 95 ml deionizované vody

2% Roztok NaN₃0,2 g NaN₃ ml deionizované vody Skladovací pufr ml 0,1 mol/1 borátového pufru 0,1 gBSA

0,1 ml NaN₃ (2% zásobní roztok)

Promývací pufr

100 ml 0,1 mol/1 borátového pufru 1 gBSA ml NaN₃ (2% zásobní roztok)

Reakční pufr ml 0,01 mol/1 PBS

0,05 g BSA μΐ 10% Tween 20

Příklad 2

Analýza reálného vzorku

Na proužek 1 pro vzorek 9 testovacího proužku bylo nakapáno 100 μΐ reakční směsi (50 μΐ reakční pufr + 50 μΐ vzorku slin). Testovací proužek se nechal po dobu 12 minut při laboratorní teplotě. Poté byly na membráně 3 odečteny dvě linky, čímž bylo potvrzeno, že testovaný vzorek slin byl negativní na přítomnost drogy.

Příklad 3

Analýza reálného vzorku

Na proužek I pro vzorek 9 testovacího proužku bylo nakapáno 100 μΐ reakční směsi (50 μΐ reakční pufr + 50 μΐ vzorku slin). Testovací proužek se nechal po dobu 10 minut při laboratorní teplotě. Poté byla na membráně 3 odečtena jedna linka, čímž bylo potvrzeno, že testovaný vzorek slin byl pozitivní na přítomnost drogy.

-5CZ 28938 Ul

Příklad 4

Analýza reálného vzorku

Byl připraven vzorek pro ověření funkčnosti testovacího proužku. Sliny laborantky byly uměle kontaminovány 5Meo-DMT v koncentraci 5 pg/ml.

Na proužek 1 pro vzorek 9 testovacího proužku bylo nakapáno 100 μΐ reakční směsi (50 μΐ reakční pufr + 50 μΐ vzorku slin). Testovací proužek se nechal po dobu 15 minut při laboratorní teplotě. Poté byla na membráně 3 odečtena jedna linka, čímž bylo potvrzeno, že testovaný vzorek slin byl pozitivní na přítomnost drogy.

Příklad 5

Analýza reálného vzorku

Byl připraven vzorek pro ověření funkčnosti testovacího proužku. Sliny laborantky byly uměle kontaminovány DMT v koncentraci 5 pg/ml.

Průmyslová využitelnost

Terénní analýza návykových a psychotropních látek, chromatografické metody, LFIA

Claims

NÁROKY NA OCHRANU

1. Imunochromatografický test dimethyltryptaminových drog v tenké vrstvě, který obsahuje podložku (5) s přichycenou membránou (3), kterou v horní části překrývá absorpční proužek (4) a ve spodní části proužek (2) pro konjugát, přičemž proužek (2) pro konjugát překrývá proužek (1) pro vzorek (9), pro analýzu látek obsahujících dimethyltryptaminový zbytek:

vyznačující se tím, že na membráně (3) je nanesena testovací linka (11), která obsahuje imobilizační konjugát (7) 2-{3-[2-(A,A-dimethylamino)ethyl]-l//-indol-5-yloxy}octové kyseliny s hovězím sérovým albuminem a kontrolní linka (10), která obsahuje oslí protilátku DAG (8) proti kozí protilátce GAR (14), přičemž kozí protilátka GAR (14) je proti polyklonální králičí protilátce (13), na proužku (2) pro konjugát je nanesena směs polyklonální králičí protilátky (13) proti imobilizačnímu konjugátu (7) a konjugát kozí protilátky (14) proti králičí protilátce (13) s koloidními zlatými částicemi (15) o velikosti 40 nm.
2. Imunochromatografický test podle nároku 1, vyznačující se tím, že imobilizační konjugát (7) je nanesen v množství 0,2 až 0,4 pg na 1 cm membrány.

. a _

CZ 28938 Ul
3. Imunochromatografický test podle nároku 2, vyznačující se tím, že oslí protilátka (8) proti kozí protilátce (14) je nanesena v množství 0,12 až 0,3 pg na 1 cm membrány.
4. Imunochromatografický test podle nároku 1, vyznačující se tím, že konjugát kozí protilátky (14) s koloidními zlatými částicemi (15) je nanesen v množství 2 až 5 pg na 1 cm
5 membrány.

5. Imunochromatografický test podle nároku 4, vyznačující se tím, že polyklonální králičí protilátka (13) je nanesena v množství 1 až 3 pg na 1 cm membrány.

6. Imunochromatografický test podle nároku 1 až 5, vyznačující se tím, že látky jsou v poměru konjugát kozí protilátky (14) s koloidními zlatými částicemi (15) ku polyklonální ío králičí protilátce (13) ku imobilizačnímu konjugátu (7) ku oslí protilátce (8) 20:10:2:1.

4 výkresy

Seznam vztahových značek:

1. 2. Proužek pro vzorek Proužek pro konjugát 15 3. Membrána 4. Absorpční proužek 5. Podložka 6. GAR-AU + PL245 (králičí protilátka) 7. Imobilizační konjugát 5Meo-DMT-BSA (BSA-Hapten) 20 8. DAG oslí protilátka proti kozí protilátce GAR 14 9. Vzorek 10. Kontrolní linka 11. Testovací linka 12. Drogy 25 13. PL 245 14. GAR kozí protilátka proti králičí protilátce PL245 13 15. Au.