CZ307719B6 - Použití derivátu tryptaminu - Google Patents

Použití derivátu tryptaminu Download PDF

Info

Publication number
CZ307719B6
CZ307719B6 CZ2015-962A CZ2015962A CZ307719B6 CZ 307719 B6 CZ307719 B6 CZ 307719B6 CZ 2015962 A CZ2015962 A CZ 2015962A CZ 307719 B6 CZ307719 B6 CZ 307719B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
mmol
solution
conjugate
hapten
ethyl
Prior art date
Application number
CZ2015-962A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ2015962A3 (cs
Inventor
Martin Kuchař
Anna Šuláková
Lucie Fojtíková
Oldřich Lapčík
Michal Maryška
Barbora Holubová
Original Assignee
Vysoká škola chemicko-technologická v Praze
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Vysoká škola chemicko-technologická v Praze filed Critical Vysoká škola chemicko-technologická v Praze
Priority to CZ2015-962A priority Critical patent/CZ307719B6/cs
Publication of CZ2015962A3 publication Critical patent/CZ2015962A3/cs
Publication of CZ307719B6 publication Critical patent/CZ307719B6/cs

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07DHETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/02Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
    • C07D209/04Indoles; Hydrogenated indoles
    • C07D209/10Indoles; Hydrogenated indoles with substituted hydrocarbon radicals attached to carbon atoms of the hetero ring
    • C07D209/14Radicals substituted by nitrogen atoms, not forming part of a nitro radical
    • C07D209/16Tryptamines
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

Vynález se týká použití derivátů tryptaminu, součástí jejichž struktury je krátký spojovací můstek nesoucí karboxylovou funkční skupinu, a chemických postupů vedoucích k přípravě takovýchto sloučenin. Tyto deriváty tryptaminu lze s výhodou využít pro přípravu imunogenů konjugací s nosným proteinem. Polyklonální králičí protilátky získané z imunizovaných laboratorních zvířat lze uplatnit při vývoji rychlých, uživatelsky příjemných imunochemických testů formátu LFIA (Lateral-Flow Immunochromatographic Assay).

Description

Oblast techniky
Vynález se týká derivátů tryptaminu, součástí jejichž struktury je krátký spojovací můstek nesoucí karboxylovou funkční skupinu, a chemických postupů vedoucích k přípravě takovýchto sloučenin. Tyto deriváty tryptaminu lze s výhodou využít pro přípravu imunogenů konjugací s nosným proteinem. Polyklonální králičí protilátky získané z imunizovaných laboratorních zvířat lze uplatnit při vývoji rychlých, uživatelsky příjemných imunochemických testů formátu LFIA (Lateral-Flow Immunochromatographic Assay).
Dosavadní stav techniky
Na drogové scéně se v posledních letech kromě tradičních drog (kokain, opiáty, amfetaminy, kanabinoidy) objevují také nové syntetické drogy (NSD). Důvodem je snaha výrobců a distributorů obejít stávající legislativní normy, v nichž jsou omamné a psychotropní látky vymezeny obvykle taxativně. Na ilegální trh se tak dostávají analoga známých látek s psychotropním potenciálem, která dosud nejsou uvedena na seznamu ilegálních látek, nebo jejichž prekurzory nejsou monitorovanými substancemi. Hlavní nebezpečí spojené s užíváním těchto nových syntetických drog (NSD) tkví v nedostatku informací o jejich farmakokinetickém a toxikologickém chování, neboť tyto látky neprošly žádnými klinickými testy.
Mezi nové syntetické drogy se řadí i skupina látek zvaná tryptaminy. Jedná se o halucinogenní látky a kromě syntetických derivátů existuje i několik přírodních tryptaminů, které patří mezi tradiční psychedelika. Tryptaminy jsou obecně agonisté serotoninových 5-HT receptorů, za halucinogenní efekt je zodpovědný agonismus především 5-HT2A a 5-HTia subtypů těchto receptorů. Mezi nej známější přírodní tryptaminy patří psilocin a psilocybin, účinné látky obsažené v halucinogenních houbách, zejména v lysohlávkách (Psilocybe). Tradiční roli v jihoamerických kulturách má dimethyltryptamin (DMT), kde je užíván zejména ve formě rituálního nápoje ayahuasca. Nápoj je připravován z několika druhů psychotropních rostlin vyskytujících se vAmazonii, zejména Psychotria viridis a Diplopterys cabrerana, obsahující jako aktivní látku právě DMT. V dnešní době není DMT záležitostí pouze Jižní Ameriky, často je připravován i synteticky a v čisté formě ho lze užívat i kouřením či intravenózně. Obecně platí, že k dosažení halucinogenního účinku přírodních tryptaminů při perorálním užití je nutné zároveň užít i inhibitor monoaminoxidasy (MAO), jinak dojde k rychlé metabolizaci tryptaminů. Na základě strukturních variací bylo syntetizováno několik desítek syntetických tryptaminů, jejichž vlastnosti jsou závislé na strukturních modifikacích a dají se shrnout do několika základních skupin. Jednoduché syntetické tryptaminy, odvozené od DMT pouze variací alkylových substituentů na aminoskupině, působí na organismus podobně jako DMT, pouze s tím rozdílem, že nejsou po užití rozkládány MAO a jsou účinné i perorálně. Deriváty substituované v α-poloze jsou díky této substituci účinnými inhibitory MAO a zároveň mají kromě halucinogenních i výraznější stimulační účinky. Deriváty modifikované v poloze 5, nejčastěji methoxy skupinou, vykazují podobné účinky jako látky nesubstituované, jsou však výrazně účinnější. Mezi nejrozšířenější syntetické tryptaminy se řadí 5-methoxydimethyltryptamin (5MeO-DMT), diisopropyltryptamin (DiPT), 5-methoxydiisopropyltryptamin (5-MeO-DiPT), alfamethyltryptamin (α-MT) a 5-methoxydiallyltryptamin (5-MeO-DALT). S výjimkou 5-MeODMT lze všechny tyto deriváty užít perorálně bez nutnosti užití inhibitoru MAO. 5-MeO-DiPT je velmi potentní psychedelikum s dlouhou dobou účinku, jeho účinná dávka se pohybuje okolo 10 mg.
Tradiční drogy lze detekovat pomocí komerčních imunochemických testů založených na selektivní reakci protilátky a antigenu, kterým je v tomto případě hledaná omamná či psychotropní látka. K detekci NSD však tyto testy použít nelze. (Páleníček T, Kuchař M. Je
- 1 CZ 307719 B6 možná detekce a identifikace nových syntetických drog (NSD) pomocí orientačních testů? Adiktologie 2011;11:208-14.) Odhalit intoxikaci osob novými syntetickými drogami je možné pomocí metod klinické biochemie, a to zejména analýzou pomocí plynové či kapalinové chromatografie s hmotnostním detektorem (GC-MS či LC-MS), což je poměrně náročné jak na přístroje, tak na odbornost obsluhy. Sestavení přístrojově nenáročných, jednoduchých, uživatelsky příjemných imunochemických testů na principu LFIA (Lateral Flow Immunochromatographic Assay) by umožňovalo daleko rychlejší a levnější orientační detekci látek v biologickém materiálu ve zdravotnictví nebo při dopravních kontrolách řidičů a také při screeningu rostlinného materiálu.
Možnosti analýzy a detekce tryptaminů v biologických vzorcích jsou omezené prakticky na použití metod LC-MS či GC-MS. V literatuře je popsána metoda pro stanovení několika desítek tryptaminových derivátů v moči nebo krevní plazmě s limity detekce mezi 10 až 100 ng/ml v moči a 1 až 100 ng/ml v plazmě. (Meyer, M. R.; Caspar, A.; Brandt, S. D.; Maurer, Η. H., A qualitative/quantitative approach for the detection of 37 tryptamine-derived designér drugs, beta-carbolines, ibogaine, and yohimbine in human urine and plasma using standard urine screening and multi-analyte approaches. Analytical and bioanalytical chemistry 2014; 406(1):225-237.) Tyto metody jsou nedílnou součástí klinických testů, jejich nevýhodou je ale časová náročnost a nemožnost využití mimo laboratoř. Pro kvalitativní detekci tryptaminů v zachycených vzorcích lze použít detekční kity založené na barevné důkazové reakci, nicméně vzhledem k nízké specifitě a velkému množství možných zkřížených reakcí je jejich využití značně omezené. Z imunochemických metod pro detekci tryptaminů jev literatuře znám pouze radioimunochromatografický test pro 5-MeO-DMT. (Strahilevitz. M. Immunological methods for treating mammals. US 4834973 (A), 30. květen 1989.)
Jako nosičové proteiny se používají hovězí sérový albumin (BSA), hovězí thyroglobumin (BTG), popř. další proteiny vhodných vlastností. Konjugáty se připravují reakcí aktivované formy haptenu (reaktivní anhydridy či estery) s ε-aminoskupinami lysinových zbytků proteinu za vytvoření amidových vazeb. Konjugací se dosáhne statisticky náhodného obsazení lysylů přítomných v proteinu.
Podstata vynálezu
Vynález se týká derivátů tryptaminů, součástí jejichž struktury je krátký spojovací můstek nesoucí karboxylovou funkční skupinu, a chemických postupů vedoucích k přípravě takovýchto sloučenin. Tyto deriváty tryptaminů lze s výhodou využít pro přípravu imunogenů konjugací s nosným proteinem. Polyklonální králičí protilátky získané z imunizovaných laboratorních zvířat lze uplatnit při vývoji rychlých, uživatelsky příjemných imunochemických testů formátu LFIA (Lateral-Flow Immunochromatographic Assay).
Spojovací můstek je připojen přes dusík aminoskupiny tryptaminů nebo v poloze 5 indolového jádra či přes kyslík v poloze 5 indolového jádra.
Sloučeniny se připraví převedením indolu reakcí s oxalylchloridem a methylaminem na příslušné /7/-indol-3-ylglyoxylylainidy. Z nich jsou redukcí tetrahydridohlinitanem lithným získány příslušné /V-methyltryptaminy, jejichž ÍV-alkylací ethyl-esterem ω-bromalkanové kyseliny a následnou bazickou hydrolýzou je do molekuly zaveden spojovací můstek nesoucí karboxylovou funkční skupinu.
Nebo se sloučeniny připraví pomocí Fischerovy syntézy indolu l,l-dimethoxy-4(dialkylamino)butanalu a příslušných arylhydraziniových solí. Spojovací můstek je součástí struktury výchozí arylhydraziniové soli a podmínky reakce se liší podle toho, zda můstek už nese přímo karboxylovou skupinu, či esterovou funkční skupinu. V druhém případě je pro přípravu sloučenin nutná ještě hydrolýza.
-2CZ 307719 B6
Připravené deriváty tryptaminů lze s výhodou využít pro přípravu imunogenů konjugací s nosným proteinem. Polyklonální králičí protilátky získané z imunizovaných laboratorních zvířat lze uplatnit při vývoji rychlých, uživatelsky příjemných imunochemických testů formátu LFIA (Lateral-Flow Immunochromatographic Assay).
Pro získání protilátek proti těmto tryptaminům bylo nutné připojit jek nosnému proteinu a k tomuto účelu byly vytvořeny hapteny, nesoucí specifické spojovací můstky. Pro tyto účely byl jako vhodný nosný protein vybrán hovězí sérový albumin (BSA). Při tvorbě konjugátů byla využita metoda aktivovaného esteru, při níž je hapten reakcí s ΛζΛ/’-dicyklohexylkarbodiimidem (DCC) a IV-hydroxysukcinimidem (NHS) nejprve převeden na nestabilní derivát Oacylisomočoviny, a poté na aktivovaný ester. Vlastní konjugační reakce, při níž dochází k tvorbě amidové vazby mezi karboxylovou skupinou haptenu a primární aminoskupinou aminokyseliny lysinu v BSA, pak probíhala v reverzním micelámím prostředí anionaktivního tenzidu.
Způsob přípravy derivátů tryptaminů
Syntéza haptenů I a II je založena na metodě Speetera a Anthonyho pro výstavbu tryptaminových derivátů. (Speeter, Μ. E.; Anthony, W. C., The Action of Oxalyl Chloride on Indoles - a New Approach to Tryptamines. J Am Chem Soc 1954, 76(23):6208-6210.) Indol, případně 5methoxyindol, je nejprve převeden reakcí s oxalylchloridem na příslušný glyoxylylchlorid. Jeho reakcí s methylaminem a následnou redukcí vzniklého amidu se připraví V-methyltryptamin, případně 5-methoxy-V-methyltryptamin. Alkylací dusíku aminoskupiny ethyl-4-brombutanoátem a následnou bazickou hydrolýzou je do molekuly zaveden spojovací můstek nesoucí karboxylovou funkční skupinu. Takto připravené hapteny, je proto možné konjugovat s εaminoskupinami lysinových zbytků proteinu za vytvoření amidových vazeb.
K přípravě haptenů III až VII byl využit přístup založený na Fischerově syntéze indolových derivátů vycházející z příslušných arylhydraziniových solí a acetalu 4-(N,Ndialkylamino)butanalu. (Chen, C. Y.; Senanayake, C. H.; Bili, T. J.; Larsen, R. D.; Verhoeven, T. R.; Reider, P. J., Improved Fischer Indole Reaction for the Preparation of N,NDimethyltryptamines - Synthesis of L-695,894, a Potent 5-Htld Receptor Agonist. J Org Chem 1994, 59(13):3738-3741.) Hydraziniové soli lze připravit ve vysokém výtěžku z příslušných anilinů diazotací a následnou redukcí diazoniové soli pomocí SnCF^FFO. Při použití hydraziniové soli nesoucí na aromatickém jádře přímo spojku zakončenou karboxylovou funkcí se ukázalo, že za podmínek Fischerovy reakce nelze připravit hapteny IV a VI s 4-uhlíkatou spojkou. Úpravou podmínek Fischerovy reakce a použitím hydraziniových solí nesoucích na aromatickém jádře spojku s esterovou funkční skupinou se podařilo připravit příslušné indolové deriváty a jejich hydrolýzou byly získány hapteny III až VI. Zatímco 4-(VV-dinicthylaniino)-l, I dimethoxybutan, použitý pro přípravu haptenů III až VI, byl připraven podle postupů popsaných v literatuře (Koch, S. S. C.; Chamberlin, A. R., Enantioselective Preparation of Beta-AlkylGamma-Butyrolactones from Functionalized Ketene Dithioacetals. J Org Chem 1993, 58(10):2725-2737.; Chen, C. Y.; Senanayake, C. H.; Bili, T. J.; Larsen, R. D.; Verhoeven, T. R.; Reider, P. J., Improved Fischer Indole Reaction for the Preparation of W-I)imethyltryptamines Synthesis of L-695,894, a Potent 5-Htld Receptor Agonist. J Org Chem 1994, 59(13):37383741.) Pro přípravu 4-(W,/V-diisopropylainino)-LI-dimctlioxybutanu byla použita inovativní syntetická cesta. Pro jeho syntézu je vycházeno ze sukcinanhydridu, který reakcí s diisopropylaminem poskytne monodiisopropylamid butandiové kyseliny. Redukcí tohoto amidu L1AIH4 je získán 4-(W,V-diisopropy lamí no) butanol. Swemovou oxidací tohoto alkoholu a následnou acetalizací vzniklého aldehydu methanolem je získán 4-(V V-diisopropylamino)-1,1 dimethoxybutan, který byl použit ve Fischerově reakci pro syntézu haptenu VII.
Antiséra proti jednotlivým drogám byla získána imunizací laboratorních králíků. Metodou enzymové imunoanalýzy byly testovány interakce králičích antisér připravených proti příslušným derivátům tryptaminů. S antiséry vykazujícími nej lepší charakteristiky byly pro imunochemické stanovení optimalizovány a charakterizovány varianty ELISA v nepřímém kompetitivním
-3 CZ 307719 B6 uspořádání. Byl určen významný analytický parametr tzv. 50% intercept (I50, viz tabulka). I50 představuje koncentraci analytu, potřebnou k vyvázání 50 % protilátek přítomných vreakčním roztoku, která je nezbytná pro kvalitativní stanovení derivátu tryptaminu v neznámém vzorku. Při imunoanalýze v nepřímém kompetitivním uspořádání soutěží antigen zakotvený na pevném nosiči (imobilizační konjugát) se stanovovaným antigenem ve vzorku o omezený počet vazebných míst na molekulách protilátky. Čím více antigenu obsahuje analyzovaný vzorek, tím méně protilátky se naváže na zakotvený antigen. Nenavázané složky se odstraní a přidá se enzymem značená sekundární protilátka proti navázané protilátce. Detekce je uskutečněna enzymovou reakcí, kdy vzniká barevný produkt, jehož intenzita zbarvení je měřena spektrofotometricky.
Byla získána celkem čtyři antiséra proti třem drogám a to DMT, 5MeO-DMT a DiPT. Byla získána dvě různá antiséra proti DMT, kdy byl k imunizaci použit konjugát BSA-I a konjugát BSA-II.
Dále bylo získáno antisérum proti 5MeO-DMT, kdy byl k imunizaci použit konjugát BSA-IV. A také antisérum proti DiPT, kdy byl k imunizaci použit konjugát BSA-VII.
Získaná antiséra byla testovaná na křížové reaktivity a bylo zjištěno, že velmi záleží na umístění spojovacího můstku, který má vliv na vazbu protilátka - antigen, tedy konformaci pro možnou vazbu.
Objasnění výkresů
Obr. 1: Schéma syntézy haptenů I až II.
Obr. 2: Schéma syntézy haptenu III a IV využívající arylhydraziniové soli nesoucí spojku s karboxylovou funkční skupinou.
Obr. 3: Schéma syntézy haptenů III až VI využívající arylhydraziniové soli nesoucí spojku s esterovou funkční skupinou.
Obr. 4: Schéma syntézy 4-( W-diiiiclhylainino)-1,1 -dimethoxybutanu.
Obr. 5: Schéma syntézy haptenu VII.
Obr. 6: Schéma syntézy 4-(A,A-diisopropylamino)-l, 1 -dimethoxybutanu.
Obr. 7: MALDI spektrum prokazující strukturu připraveného konjugátu haptenu I s BSA, detekující, že 13 molekul haptenu I se průměrně navázalo na nosný protein - BSA. Větší pík odpovídá jednou nabitému konjugátu, menší pík odpovídá 2x nabitému konjugátu.
Obr. 8: MALDI spektrum prokazující strukturu připraveného konjugátu haptenu II s BSA, detekující, že 3 molekuly haptenu II se průměrně navázaly na nosný protein - BSA. Větší pík odpovídá jednou nabitému konjugátu, menší pík odpovídá 2x nabitému konjugátu.
Obr. 9: MALDI spektrum prokazující strukturu připraveného konjugátu haptenu III s BSA, detekující, že 31 molekul haptenu III se průměrně navázalo na nosný protein - BSA. Větší pík odpovídá jednou nabitému konjugátu, menší pík odpovídá 2x nabitému konjugátu.
Obr. 10: MALDI spektrum prokazující strukturu připraveného konjugátu haptenu IV s BSA, detekující, že 28 molekul haptenu IV se průměrně navázalo na nosný protein - BSA. Větší pík odpovídá jednou nabitému konjugátu, menší pík odpovídá 2x nabitému konjugátu.
-4CZ 307719 B6
Obr. 11: MALDI spektrum prokazující strukturu připraveného konjugátu haptenu V s BSA, detekující, že 37 molekul haptenu VII se průměrně navázalo na nosný protein - BSA. Větší pík odpovídá jednou nabitému konjugátu, menší pík odpovídá 2x nabitému konjugátu.
Obr. 12: Schéma přípravy konjugátů haptenů s nosným proteinem - BSA.
Obr. 13: Schématický průběh nepřímé kompetitivní ELISA; A imobilizace konjugátu na stěny jamek mikrotitrační destičky; B aplikace kompetujících složek; C aplikace protilátky značené enzymem peroxidázou (Gar-Po); D aplikace substrátu pro peroxidázu; E enzymová reakce peroxidázy se substrátem; F zastavení enzymové reakce kyselinou sírovou; Φ imobilizační konjugát; ® analyt; - králičí antisérum; A protilátka značená enzymem (Gar-Po); © substrát pro peroxidázu.
Obr. 14: Chemická struktura haptenu I - hydrochlorid 4-{.V-[2-(777-indol-3-yl)ethyl]-Vmethyljaminobutanové kyseliny
Obr. 15: Chemická struktura haptenu II. - hydrochlorid 4-|7V-[2-(5-methoxy-777-indol-3yl)ethyl] - V-methyl] aminobutanové kyseliny
Obr. 16: Chemická struktura haptenu III. - hydrochlorid 2-{3-|2-(VV-diniclhylaiiiino)elhyl|777-indol-5-yl} octové kyseliny
Obr. 17: Chemická struktura haptenu IV. - hydrochlorid 2-{3-[ 2-(/V,/V-climcthylaniino)cthyl |777-indol-5-yloxy} octové kyseliny
Obr. 18: Chemická struktura haptenu V. - hydrochlorid 4-{3-[ 2-(/V,/V-di mcthy lanii nojcthy 1 ] 777-indol-5-yl}butanové kyseliny
Obr. 19: Chemická struktura haptenu VI. - hydrochlorid 4-{3-|2-(VV-diniclhylaiiiino)elhyl|777-indol-5 -yloxy} butanové kyseliny
Obr. 20: Chemická struktura haptenu VII. - hydrochlorid [3-|2-(W-diisopropylaiiiino)elhyl|777-indol-5-yl} octové kyseliny
Obr. 21: Analytická optimalizace ELISY
Obr. 22: Graf znázorňující titrační křivky imobilizačního konjugátu (konjugát haptenu VII s BSA) a antiséra Anti-DiPT.
Obr. 23: Schéma mikrotitrační destičky s koncentracemi
Obr. 24 Graf znázorňující kalibrační křivky pro různé kombinace imunoreagencií
Obr. 25. Schéma mikrotitrační destičky s hodnotami naměřených absorbancí
Obr. 26: Tabulka popisující přehled křížových reaktivit
Obr. 27: Hodnoty křížových reaktivit zbylých konjugátů byly získány obdobně dle příkladu 10, 10a a 11 s příslušným konjugátem
-5 CZ 307719 B6
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1
Syntéza haptenu I
Výchozí indol (2,00 g, 17,1 mmol) byl rozpuštěn v diethyletheru (50 ml) a ke vzniklému roztoku byl po chlazení ledovou lázní přidán po kapkách oxalylchlorid (1,7 ml, 19,6 mmol). Směs byla míchána 1 hodinu při 0 °C a poté 2 hodiny při teplotě místnosti. Vzniklý barevný precipitát byl oddělen filtrací, promyt diethyletherem a usušen, čímž byl získán 2-(7H-indol-3-yl)-2oxoacetylchlorid jako žlutá krystalická látka (3,31 g, 93 %).
2-(7H-indol-3-yl)-2-oxoacetylchlorid (3,31 g, 16,0 mmol) byl po částech přidán k vodnému roztoku methylaminu (40 % w/w, 22 ml) ochlazenému ledovou lázní. Vzniklá suspenze byla 2 hodiny míchána při 0 °C a poté byl precipitát zfiltrován. Rekrystalizací z tetrahydrofuranu/diethyletheru (THF/Et2O) byl získán 2-(777-indol-3-yl)-V-methyl-2oxoacetamid jako lehce nažloutlá krystalická látka (2,61 g, 81 %).
Roztok 2-(777-indol-3-yl)-V-methyl-2-oxoacetamidu (2,00 g, 9,9 mmol) v THF (200 ml) byl přikapán k suspenzi LiAlFU (3,79 g, 100,0 mmol) v THF (100 ml) ochlazené ledovou lázní. Směs byla následně refluxována 7 hodin, poté ochlazena ledovou lázní a opatrně rozložena přídavkem vody (40 ml), 20% roztoku NaOH (40 ml) a poté znovu vody (40 ml). Vzniklý precipitát byl odfiltrován a promyt THF. Filtrát byl odpařen, zbytek znovu rozpuštěn v dichlormethanu (200 ml), vzniklý roztok byl promyt vodou (3x 200 ml) a solankou (150 ml) a organická fáze vysušena MgSCU Kolonovou chromatografií (CIVCKMcOII, 5:1 + 1 % NH3 (aq)) byl získán Nmethyltryptamin jako bezbarvý sirup (683 mg, 40 %), který stáním asi za jednu hodinu postupně vykrystalizoval.
Ke směsi /V-methyltryptaminu (523 mg, 3,0 mmol) a Nal (450 mg, 3,0 mmol) v isopropylalkoholu (30 ml) byl přidán diisopropylethylamin (0,84 ml, 4,8 mmol) a ethyl-4brombutanoát (878 mg, 4,5 mmol) a vzniklý roztok byl zahříván přes noc na 60 °C. Poté byla směs odpařena, zbytek rozpuštěn v dichlormethanu (75 ml) a roztok byl promyt 10% roztokem Na2CC>3 (75 ml), vodou (75 ml) a solankou (75 ml). Kolonovou chromatografií (CHzCMMcOII, 10:1 + 1 % NH3 (aq)) byl získán ethyl-4-{/V-[2-(777-indol-3-yl)ethyl]-V-methyl}aminobutanoát jako světle hnědý sirup (570 mg, 65 %).
Ke směsi ethyl-4-{/V-[2-(777-indol-3-yl)ethyl]-V-methyl}aminobutanoátu (433 mg, 1,5 mmol) a 40% vodného ethanolu (22 ml) byl přidán NaOH (66 mg, 1,7 mmol) a směs byla míchána přes noc při teplotě místnosti. Poté byl roztok okyselen 1 mol/1 HC1 na pH = 1 a odpařen. Flash chromatografií na reverzní fázi (MeOH:H2O, gradient 5 až 100 % MeOH) byl získán hydrochlorid 4-{/V-[2-(777-indol-3-yl)ethyl]-V-methyl}aminobutanové kyseliny (hapten I) jako bezbarvá sklovitá pěna (274 mg, 62 %).
II NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 1,90 (qui, 2H, J = 7,3 Hz, CH2CH2CH2), 2,35 (t, 2H, J = 7,3 Hz, NCH2CH2CH2), 2,80 (s, 3H, NCH3), 3,06 - 3,15 (m, 4H, NCH2CH2CH2, ArCH2CH2), 3,21 3,31 (m, 2H, ArCH2CH2), 6,97 - 7,04 (m, 1H, ArH), 7,06 - 7,13 (m, 1H, ArH), 7,24 (d, 1H, J = 2,3 Hz, ArH), 7,34 - 7,39 (m, 1H, ArH), 7,62 (d, 1H, J = 7,6 Hz, ArH), 10,97 (s br, 1H, NH) 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6) δ: 20,09; 20,71; 31,51; 40,12; 55,06; 56,07; 110,12; 111,48; 118,22; 118,37; 121,11; 123,05; 126,86; 136,21; 174,08
HRMS (ESI): m/z [M + H]+ vypočteno pro Ci5H2oN202: 261,15975, nalezeno 261,15979
-6CZ 307719 B6
Příklad la
Syntéza Haptenu II
Hydrochlorid 4-[2V- [2-(5-methoxy-1 H-i ndol-3 -yl)ethyl] -/V- methyl] aminobutanové kyseliny (hapten II) byl připraven z 5-methoxy-7H-indolu podle postupu popsaného v příkladu 1 jako bezbarvá sklovitá pěna.
II NMR (300 MHz, CD3OD) δ: 1,86 (qui, 2H, J = 6,2 Hz, CH2CH2CH2), 2,38 (t, 2H, J = 6,2 Hz, NCH2CH2CH2), 2,77 (s, 3H, NCH3), 3,03 - 3,14 (m, 4H, NCH2CH2CH2, ArCH2CH2), 3,20 - 3,29 (m, 2H, ArCH2CH2), 3,80 (s, 3H, OCH3), 6,78 (dd, 1H, Ji = 8,8 Hz, J2 = 2,3 Hz, ArH), 7,06 (d, 1H, J = 2,3 Hz, ArH), 7,10 (s, 1H, ArH), 7,25 (d, 1H, J = 8,8 Hz, ArH) 13C NMR (75 MHz, D2O) δ: 19,77; 20,11; 33,89; 39,73; 55,38; 55,78; 56,00; 100,43; 108,32; 111,71; 112,90; 124,80; 126,77; 131,71; 153,00; 180,37
HRMS (ESI): m/z [M + H]+ vypočteno pro Ci6H22N2O3: 291,17032, nalezeno 291,17050
Příklad 2
Syntéza haptenu III
Suspenze výchozí (4-aminofenyl)octové kyseliny (2,27 g, 15,0 mmol) v koncentrované HC1 (30 ml) byla ochlazena na -5 °C. Poté byl po kapkách přidán roztok NaN02 (1,09 g, 15,8 mmol) ve vodě (8 ml). Směs byla míchána 1 hodinu při -5 °C a poté přikapána k roztoku SnCl2.2H2O (10,15 g, 45,0 mmol) v koncentrované HC1 (20 ml) vychlazenému na -20 °C a při této teplotě byla směs míchána další 2,5 hodiny. Vzniklý precipitát byl oddělen filtrací, promyt studeným ethanolem a usušen, čímž byl získán 4-(karboxymethyl)fenylhydrazinium-chlorid jako lehce nažloutlá krystalická látka (2,86 g, 94 %).
Roztok ethyl-4-chlorbutanoátu (12,30 g, 81,7 mmol) v suchém dichlormethanu (125 ml) byl ochlazen na -78 °C a po kapkách byl přidán diisobutylaluminium hydrid (DIBAL-H) (94 ml, 1 mol/1 roztok v hexanu). Směs byla míchána půl hodiny při -78 °C, pak byla nalita k 10% HC1 (160 ml) vychlazené ledovou lázní a celá směs byla 1 hodinu míchána při 0 °C. Poté byla organická fáze oddělena, vodná extrahována dichlormethanem (2x 100 ml) a spojené organické podíly promyty solankou (300 ml) a usušeny pomocí MgSCfi. Roztok byl zkoncentrován na vakuové rotační odparce a ke zbytku přidán methanol (35 ml) okyselený koncentrovanou H2SC>4 (několik kapek). Vzniklá směs byla míchána přes noc, naředěna dichlormethanem (125 ml), promyta 10% roztokem NaHCO3 (100 ml), vodou (100 ml) a solankou (100 ml) a organická fáze usušena pomocí MgSCfi. Vakuovou destilací byl získán 4-chlor-l,l-dimethoxybutan jako bezbarvá kapalina (9,76 g, 78 %).
4-chlor-l,l-dimethoxybutan (4,86 g, 31,8 mmol) byl přidán k roztoku dimethylaminu ve vodě (30 ml, 40% w/w) a směs byla míchána 15 minut při teplotě místnosti. Poté byla reakční směs zahřívána na 65 °C po dobu 3,5 hodiny. Po ochlazení na teplotu místnosti byla směs extrahována dichlormethanem (2x 50 ml), spojené organické podíly byly promyty 10% roztokem NaHCO3 (100 ml) a solankou (100 ml) a usušeny pomocí MgSCU Vakuovou destilací byl získán 4-(N,Ndimethylamino)-l,l-dimethoxybutan jako bezbarvá kapalina (4,32 g, 84 %).
Ke 4% H2SC>4 (25 ml), která byla nejprve probublávána argonem při 50 °C pro odstranění rozpuštěného kyslíku, byl přidán 4-(karboxymethyl)fenylhydrazinium-chlorid (608 mg, 3,0 mmol) a poté po kapkách 4-(VV-diniethylainino)-1,1 -dimethoxybutan (581 mg, 3,6 mmol). Reakční směs byla zahřívána 3,5 hodiny na 80 °C, poté ochlazena na teplotu místnosti a reakční směs neutralizována pomocí 25% vodného amoniaku. Po odstranění rozpouštědla byl odparek
-7 CZ 307719 B6 zbaven většiny anorganických solí promytím EtOH (30 ml) a vzniklý roztok byl odpařen. Poté byl odparek rozpuštěn v 1 mol/1 HC1 (30 ml), roztok odpařen a flash chromatografií na reverzní fázi (MeOH:H2O, gradient 5 až 100 % MeOH) byl získán hydrochlorid 2-{3-[2-(N,Ndimethylamino)ethyl|-/H-indol-5-yl(octové kyseliny (hapten III) (414 mg, 56 %) jako bílá pevná látka.
II NMR (300 MHz, CD3OD) δ: 2,87 (s, 6H, N(CH3)2), 3,11 - 3,21 (m, 2H, CH2CH2N), 3,30 3,39 (m, 2H, CH2CH2N), 3,66 (s, 2H, CH2COOH), 7,07 (dd, 1H, Ji = 8,5 Hz,
J2 = 1,5 Hz, ArH), 7,15 (s, 1H, ArH), 7,30 (d, 1H, J = 8,5 Hz, ArH), 7,51 (s, 1H, ArH) 13C NMR (75 MHz, D2O) δ: 20,03; 41,42; 42,63; 57,50; 108,28; 112,21; 118,67; 123,56; 124,58; 125,63; 126,69; 135,47; 178,25
HRMS (ESI): m/z [M + H]+ vypočteno pro Ci4HisN2O2: 247,14410, nalezeno 247,14413
Příklad 3
Syntéza haptenu IV
K roztoku výchozího 4-aminofenolu (10,09 g, 100,0 mmol) v methanolu (250 ml) byl přidán triethylamin (30 ml, 210,0 mmol) a di-íerc-butyl-dikarbonát (24 g, 110,0 mmol) a směs byla míchána přes noc při teplotě místnosti. Poté byl methanol odpařen, zbytek rozdělen mezi ethylacetát (250 ml) a 0,25 mol/1 HC1 (100 ml) a organická vrstva promyta nasyceným roztokem NH4CI (3x 70 ml). Kolonovou chromatografií (hexan:EtOAc, 1:1) byl získán N-(tercbutoxykarbonyl)-4-aminofenol (19,31 g, 92 %) jako bílá krystalická látka.
K roztoku A-(íerc-butoxykarbonyl)-4-aminofenolu (8,40 g, 40,0 mmol) v acetonu (160 ml) byl přidán ethyl-bromacetát (13,36 g, 80,0 mmol) a pevný K2CO3 (16,58 g, 120,0 mmol) a vzniklá směs byla refluxována po dobu 4 hodin. Poté byla směs ochlazena na teplotu místnosti, pevný podíl odfiltrován a filtrát odpařen. Kolonovou chromatografií (hexan:ethylacetát (EtOAc), 4:1) byl získán ethyl-2-{4-[(íerc-butoxykarbonyl)amino]fenoxy}acetát (11,29 g, 96 %) jako bezbarvý sirup, který stáním zkrystalizoval.
Suspenze ethyl-2-{4-[(íerc-butoxykarbonyl)amino]fenoxy}acetátu XX (11,14 g, 37,7 mmol) v 1 mol/1 HC1 (100 ml) byla míchána při 60 °C po dobu 8 hodin. Poté byl vzniklý roztok ochlazen na teplotu místnosti a extrahován dichlormethanem (80 ml). Pomocí pevného Na2CO3 bylo pH vodné fáze upraveno na hodnotu 4 až 5 (podle pH papírku). Filtrací a sušením vzniklého precipitátu byla získána 2-(4-aminofenoxy)octová kyselina (5,71 g, 91 %) jako lehce nažloutlá krystalická látka.
Suspenze 2-(4-aminofenoxy)octové kyseliny (836 mg, 5,0 mmol) v koncentrované HC1 (10 ml) byla ochlazena na -5 °C. Poté byl po kapkách přidán roztok NaNO2 (363 mg, 5,3 mmol) ve vodě (3 ml). Směs byla míchána 1 hodinu při -5 °C a poté přikapána k roztoku SnCl2.2H2O (3,39 g, 15,0 mmol) v koncentrované HC1 (7 ml) vychlazenému na -20 °C a při této teplotě byla směs míchána další 2,5 hodiny. Vzniklý precipitát byl oddělen filtrací, promyt studeným ethanolem a usušen, čímž byl získán 4-(karboxymethoxy)fenylhydrazinium-chlorid (937 mg, 86 %) jako bílá krystalická látka.
Ke 4% H2SC>4 (15 ml), která byla nejprve probublávána argonem při 50 °C pro odstranění rozpuštěného kyslíku, byl přidán 4-(karboxymethoxy)fenylhydrazinium-chlorid (328 mg, 1,5 mmol) a poté po kapkách 4-(VA-diniethylainino)-1,1 -dimethoxybutan (290 mg, 1,8 mmol). Reakční směs byla zahřívána 3,5 hodiny na 80 °C, poté ochlazena na teplotu místnosti a neutralizována pomocí koncentrovaného vodného amoniaku. Po odstranění rozpouštědla byl odparek zbaven většiny anorganických solí promytím EtOH (15 ml) a vzniklý roztok byl
-8CZ 307719 B6 odpařen. Poté byl odparek rozpuštěn v 1 mol/1 HC1 (15 ml), roztok odpařen a flash chromatografií na reverzní fázi (MeOH:H2O, gradient 5 až 100 % MeOH) byl získán hydrochlorid 2-{3-[2-(V,.V-dimethylamino)ethyl]-777-indol-5-yloxy}octové kyseliny (hapten IV) (209 mg, 53 %) jako bílá pevná látka.
Ή NMR (300 MHz, DMSO-d6+ D2O) δ: 2,72 (s, 6H, N(CH3)2), 2,90 - 3,00 (m, 2H, CH2CH2N), 3,08 - 3,18 (m, 2H, CH2CH2N), 4,26 (s, 2H, CH2O), 6,73 (dd, 1H, Ji = 8,8 Hz, J2 = 2,1 Hz, ArH), 6,99 (d, 1H, J = 2,1 Hz, ArH), 7,10 (s, 1H, ArH), 7,21 (d, 1H, J = 8,8 Hz, ArH) 13C NMR (75 MHz, D2O) δ: 20,11; 42,65; 57,43; 67,69; 100,87; 108,22; 112,26; 112,93; 124,81; 126,63; 131,74; 151,95; 177,21
HRMS (ESI): m/z [M + H]+ vypočteno pro Ci4HisN2O3: 263,13902, nalezeno 263,13912
Příklad 4
Syntéza haptenu VI
K roztoku A-(íerc-butoxykarbonyl)-4-aminofenolu (8,40 g, 40,0 mmol) (viz příklad 3) v acetonu (160 ml) byl přidán ethyl-4-brombutanoát (15,60 g, 80,0 mmol) a pevný K2CO3 (16,58 g, 120,0 mmol) a vzniklá směs byla refluxována po dobu 6,5 hodiny. Poté byla směs ochlazena na teplotu místnosti, pevný podíl odfiltrován a filtrát odpařen. Kolonovou chromatografií (hexan:EtOAc, 4:1) byl získán ethyl-4-{4-[(íerc-butoxykarbonyl)amino]fenoxy}butanoát (12,35 g, 97 %) jako bílá krystalická látka.
Trifluoroctová kyselina (12,5 ml) byla přidána k roztoku ethyl-4-{4-[(tercbutoxykarbonyl)amino]fenoxy}butanoátu (4,05 g, 12,5 mmol) v dichlormethanu (100 ml). Roztok byl míchán 3 hodiny, poté byl naředěn dalšími 100 ml dichlormethanu a neutralizován 10% roztokem NaHCO3 (200 ml). Vodná fáze byla extrahována dichlormethanem (2x 50 ml), organické podíly byly spojeny a promyty solankou (150 ml). Flash chromatografií (hexan:EtOAc, gradient 30 až 50 % EtOAc) byl získán ethyl-4-(4-aminofenoxy)butanoát (2,63 g, 94 %) jako světle hnědý sirup.
Roztok ethyl-4-(4-aminofenoxy)butanoátu (2,63 g, 11,8 mmol) v koncentrované HC1 (12 ml) byl ochlazen na -10 °C a poté byl přidán po kapkách roztok NaNO2 (853 mg, 12,4 mmol) ve vodě (5 ml) tak, aby teplota směsi nepřesáhla 0 °C. Po přídavku byla reakční směs míchána ještě 10 minut a poté byla přidána po kapkách k roztoku SnCl2.2H2O (9,97 g, 44,2 mmol) v koncentrované HC1 (7 ml) ochlazenému na -15 °C tak, aby teplota směsi nepřesáhla -5 °C. Po kompletním přídavku byla vzniklá suspenze ponechána ohřát na teplotu místnosti, zfiltrována a pevný podíl byl promyt ledovou vodou a diethyletherem. Usušením byl získán 4-[3(ethoxykarbonyl)propyloxy]fenylhydrazinium-chlorid (1,93 g, 60 %) jako bílá krystalická látka.
Ke 4% roztoku H2SC>4 ve směsi ethanokvoda, 5:1 (15 ml), která byla nejprve probublávána argonem pro odstranění rozpuštěného kyslíku, byl přidán 4-[3(ethoxykarbonyl)propyloxy]fenylhydrazinium-chlorid (412 mg, 1,5 mmol) a poté po kapkách 4(A,A-dimethylamino)-l,l-dimethoxybutan (290 mg, 1,8 mmol). Reakční směs byla zahřívána 4 hodiny na 85 °C, poté byla ochlazena ledovou lázní a naředěna dichlormethanem (20 ml). Vodná fáze byla alkalizována 1 mol/1 roztokem NaOH, fáze byly odděleny a vodná ihned extrahována dichlormethanem (2x 20 ml). Organické podíly byly spojeny, sušeny MgSO4 a kolonovou chromatografií (dichlormethammethanol, 9:1 + 1 % NH3 (aq)) byl získán ethyl-4-{3-[2-(A,Adimethylamino)ethyl]-777-indol-5-yloxy}butanoát (98 mg, 21 %) jako světle hnědý viskózní sirup.
-9CZ 307719 B6
Ke směsi ethyl-4-{3-[2-(/V,/V-dimethylamino)ethyl]-777-indol-5-yloxy}butanoátu (95 mg, 0,3 mmol) a 20% ethanolu (15 ml) byl přidán 1 mol/1 roztok NaOH (0,36 mmol, 0,36 ml) a reakční směs byla míchána přes noc při teplotě místnosti. Poté byla směs naředěna vodou (5 ml) a extrahována diethyletherem (2x 10 ml). Vodná fáze byla okyselena pomocí 1 mol/1 HC1 na pH = 1 a odpařena. Flash chromatografií na reverzní fázi (MeOH:H2O, gradient 5 až 100 % MeOH) byl získán hydrochlorid 4-{3-[2-(/V,/V-dimethylamino)ethyl]-777-indol-5-yloxy}butanové kyseliny (hapten VI) (42 mg, 49 %) jako bílá pevná látka.
II NMR (300 MHz, CD3OD) δ: 2,08 (qui, 2H, CH2CH2CH2, J = 6,7 Hz), 2,39 (t, 2H, CH2COOH, J = 7,2 Hz), 2,74 (s, 6H, N(CH3)2), 2,98 - 3,09 (m, 2H, CH2CH2N), 3,10 - 3,22 (m, 2H, CH2CH2N), 4,04 (t, 2H, CH2O, J = 6,5 Hz), 6,76 (dd, 1H, Ji = 8,8 Hz, J2 = 2,2 Hz, ArH), 7,07 (s, 1H, ArH), 7,12 (d, 1H, J = 2,2 Hz, ArH), 7,22 (d, 1H, J = 8,8 Hz, ArH) 13C NMR (75 MHz, CD3OD) δ: 22,08; 27,34; 35,02; 43,28; 59,00; 69,54; 102,28; 110,04; 113,18; 113,57; 124,71; 128,53; 133,33; 154,45; 181,83
Příklad 4a
Syntéza Haptenu V
Hydrochlorid 4-{3-[2-(/V,/V-dimethylamino)ethyl]-777-indol-5-yl}butanové kyseliny (hapten V) byl připraven z ethyl-4-(4-aminofenyl)butanoátu podle postupu popsaného v příkladu 4 jako bílá pevná látka.
II NMR (300 MHz, CD3OD) δ: 1,95 (qui, 2H, CH2CH2CH2, J = 7,3 Hz), 2,23 (t, 2H, CH2COOH, J = 7,3 Hz), 2,68 - 2,80 (m, 8H, N(CH3)2 + CH2Ar), 3,04 - 3,15 (m, 2H, CH2CH2N), 3,16 - 3,27 (m, 2H, CH2CH2N), 6,98 (dd, 1H, Ji = 8,5 Hz, J2 = 1,3 Hz, ArH), 7,09 (s, 1H, ArH),
7,25 (d, 1H, J = 8,5 Hz, ArH), 7,39 (s, 1H, ArH) 13C NMR (75 MHz, CD3OD) δ: 22,04; 30,19; 36,96; 38,08; 43,36; 59,14; 109,85; 112,34; 118,38; 123,95; 124,17; 128,29; 134,02; 136,80; 171,57
Příklad 5
Syntéza 4-(N, V-di i sopropy lamino) -1,1 -dimethoxybutanu
K roztoku sukcinanhydridu (10,07 g, 100 mmol) v dichlormethanu (300 ml) byl přidán diisopropylamin (21,8 ml, 300 mmol) a vzniklý roztok byl míchán 20 hodin při teplotě místnosti. Poté byla reakční směs zkoncentrována, byla přidána 1 mol/1 HC1 (250 ml) a vodná fáze byla extrahována dichlormethanem (3x 150 ml). Po sušení MgSCU a odpaření rozpouštědel byla získána 4-(/V,/V-diisopropylamino)-4-oxobutanová kyselina (16,50 g, 82 %) jako světle hnědý viskózní olej, který v lednici za dva dny zkrystalizoval.
Suspenze LÍAIH4 (6,83 g, 180 mmol) v THF (300 ml) byla ochlazena ledovou lázní a poté k ní byl přikapán po kapkách roztok 4-(/V,/V-diisopropylamino)-4-oxobutanové kyseliny (8,05 g, 40 mmol) v THF (150 ml). Po kompletním přídavku byla reakční směs refluxována 5 hodin. Poté byla směs ochlazena ledovou lázní a rozložena opatrným přídavkem vody (40 ml), 20% roztoku NaOH (40 ml) a opět vody (40 ml). Vzniklá suspenze byla zfiltrována a pevný podíl promyt diethyletherem. Filtrát byl odpařen a znovu rozpuštěn v dichlormethanu (250 ml), vzniklý roztok byl promyt vodou (3x 200 ml) a solankou (150 ml) a sušen MgSO4. Vakuovou destilací byl získán 4-( W-diisopropylainino)butanol (4,91 g, 71 %) jako bezbarvá kapalina.
- 10CZ 307719 B6
Dimethylsulfoxid (DMSO) (2,56 ml, 36 mmol) byl přidán po kapkách k roztoku oxalylchloridu (2,57 ml, 30 mmol) v suchém dichlormethanu (60 ml) ochlazenému na -55 °C a směs byla míchána ještě dalších 10 minut. Dále byl přidán po kapkách roztok 4-(N,Ndiisopropylamino)butanolu (2,60 g, 15 mmol) v dichlormethanu (10 ml) a vzniklá směs byla po přídavku ještě 15 minut míchána při -55 °C. Pak byl ke směsi přikapán triethylamin (8,9 ml, 60 mmol) a reakční směs byla postupně ohřátá na teplotu místnosti (cca 1 h). Poté byla směs nalita do vody (130 ml), fáze byly odděleny a vodná byla extrahována dichlormethanem (2x 100 ml). Organické podíly byly spojeny, sušeny MgSO4 a odpařeny. Získaný surový intermediát byl rozpuštěn v methanolu (50 ml), k roztoku byla přidána koncentrovaná H2SO4 (2,5 ml) a reakční směs byla míchána přes noc při teplotě místnosti. Poté byl roztok naředěn dichlormethanem (150 ml) a za chlazení ledovou lázní byl přidán 20% NaOH (100 ml) až do bazického pH (pH = 10). Fáze byly odděleny, vodná byla naředěna vodou (50 ml) a extrahována dichlormethanem (2x 75 ml). Organické fáze byly spojeny, promyty solankou (200 ml) a sušeny MgSO4. Vakuovou destilací byl získán 4-(W-diisopropylaiiiino)-l,l-diinclhoxybulan jako bezbarvá kapalina (1,74 g, 54 %).
t.v. = 51 až 55 °C (32 Pa).
II NMR (300 MHz, CDCh) δ: 0,98 (d, 12H, 2x CH(CH3)2, J = 6,5 Hz), 1,36 - 1,51 (m, 2H, CH2CH2N), 1,53 - 1,63 (m, 2H, CHCH2CH2), 2,39 (t, 2H, CH2N, J = 7,3 Hz), 2,99 (sept, 2H, 2x CH(CH3)2, J = 6,5 Hz), 3,31 (s, 6H, 2x OCH3), 4,37 (t, 1H, CH(OCH3)2, J = 5,8 Hz) 13C NMR (75 MHz, CDCh) δ: 20,69; 26,11; 30,28; 44,73; 48,16; 52,59; 104,66
Příklad 6
Příprava haptenu VII
K roztoku výchozí (4-aminofenyl)octové kyseliny (7,56 g, 50 mmol) v ethanolu (80 ml) byla přidána koncentrovaná kyselina sírová (3,7 ml) a směs byla refluxována po dobu 6 hodin. Poté byla směs ochlazena na teplotu místnosti a ponechána stát přes noc v lednici. Vzniklá suspenze byla zfiltrována a surový pevný produkt usušen. Přečištěním kolonovou chromatografií (hexan:EtOAc, 2:1), byl získán ethyl-(4-aminofenyl)acetát (6,54 g, 73%) jako nažloutlá krystalická látka.
Roztok ethyl-(4-aminofenyl)acetátu (3,00 g, 16,7 mmol) v koncentrované HC1 (17 ml) byl ochlazen na -10 °C a poté byl přidán po kapkách roztok NaNCE (1,20 g, 17,4 mmol) ve vodě (6 ml) tak, aby teplota směsi nepřesáhla 0 °C. Po přídavku byla reakční směs míchána ještě 10 minut a poté byla přidána po kapkách k roztoku SnC12.2H2O (14,17 g, 62,8 mmol) v koncentrované HC1 (10 ml) ochlazenému na -15 °C tak, aby teplota směsi nepřesáhla -5 °C. Po kompletním přídavku byla vzniklá suspenze ohřátá na teplotu místnosti, zfiltrována a pevný podíl byl jednou promyt ledovou vodou a diethyletherem. Usušením byl získán 4[(ethoxykarbonyl)methyl]fenylhydrazinium-chlorid (2,80 g, 73 %) jako bílá krystalická látka.
Ke 4% roztoku H2SO4 ve směsi ethanokvoda, 5:1 (25 ml), která byla nejprve probublávána argonem pro odstranění rozpuštěného kyslíku, byl přidán 4[(ethoxykarbonyl)methyl]fenylhydrazinium-chlorid (461 mg, 2,0 mmol) a poté po kapkách 4(A,A-diisopropylamino)-l,l-dimethoxybutan (522 mg, 2,4 mmol). Reakční směs byla zahřívána 4 hodiny na 90 °C, poté byla ochlazena ledovou lázní a naředěna dichlormethanem (50 ml). Vodná fáze byla alkalizována 1 mol/1 roztokem NaOH, fáze byly odděleny a vodná byla naředěna vodou (50 ml) a ihned extrahována dichlormethanem (3x 75 ml). Organické podíly byly spojeny, sušeny MgSO4 a kolonovou chromatografií (dichlormethan:methanol, 9:1 + 1 % NH3 (aq)) byl získán ethyl-{3-[2-(A,A-diisopropylamino)ethyl]-111-indol-5-yljacetát (337 mg, 51 %) jako nahnědlý viskózní sirup.
- 11 CZ 307719 B6
Ke směsi ethyl-{3-[2-(A,A-diisopropylamino)ethyl]-777-indol-5-yl}acetátu (290 mg, 0,9 mmol) a 20% ethanolu (25 ml) byl přidán 1 mol/1 roztok NaOH (1,0 mmol, 1,0 ml) a reakční směs byla míchána přes noc při teplotě místnosti. Poté byla směs naředěna vodou (10 ml) a extrahována diethyletherem. Vodná fáze byla okyselena pomocí 1 mol/1 HC1 na pH = 1 a odpařena. Flash chromatografií na reverzní fázi (McOITHzO, gradient 5 až 100 % MeOH) byl získán hydrochlorid [3-|2-(W-diisopropylainino)elhyl|-///-indol-5-yl(octové kyseliny (hapten VII) (201 mg, 67 %) jako bílá pevná látka.
II NMR (300 MHz, CD3OD) δ: 1,26 (d, 12H, 2x CH(CH3)2, J = 6,5 Hz), 2,83 - 3,04 (m, 4H, CH2CH2N), 3,48 (sept, 2H, 2x CH(CH3)2, J = 6,5 Hz), 3,57 (s, 2H, CH2COOH), 6,93 (s, 1H, ArH), 7,11 (dd, 1H, Ji = 8,5 Hz, J2 = 1,5 Hz, ArH), 7,24 (d, 1H, J = 8,5 Hz, ArH), 7,38 (s, 1H, ArH) 13C NMR (75 MHz, CD3OD) δ: 18,12; 24,86; 46,58; 49,17; 55,86; 110,22; 112,32; 119,07; 124,39; 124,53; 128,12; 129,77; 136,74; 180,91
Příklad 7
Konjugace haptenu I s BSA
Hydrochlorid 4-{A-[2-(777-indol-3-yl)ethyl]-A-methyl}aminobutanové kyseliny (hapten I) (19,2 mg, 64,7 pmol) byl rozpuštěn v dimethylsulfoxidu (200 μΐ), k roztoku byl přidán roztok N,N’dicyklohexylkarbodiimidu (17,3 mg, 84,1 pmol) v dimethylsulfoxidu (170 pl) a roztok Nhydroxysukcinimidu (9,7 mg, 84,1 pmol) v dimethylsulfoxidu (100 pl). Reakční směs byla ponechána stát přes noc v mikrozkumavce při teplotě místnosti po dobu 2 dnů, během kterých byly vyloučeny krystaly dicyklohexylmočoviny a průběh reakce byl monitorován pomocí TLC.
Reakční roztok byl nasát pipetou a přidán k albuminu. Tento roztok, bez vzniklých krystalů, byl přímo přidán k roztoku hovězího sérového albuminu (51,8 mg, 0,8 pmol) v bikarbonátovém pufru (4 ml). Dále byl přidán roztok dioktylsulfosukcinátu sodného v oktanu (27 ml) a reakční směs byla míchána 18 hodin při teplotě místnosti. Poté byl modifikovaný protein vysrážen ledovým acetonem (40 ml) a vzniklá suspenze byla centrifůgována 30 minut při 4 °C (přetížení 1500 x g). Po odlití acetonu byl celý proces znovu opakován za stejných podmínek. Následně byl aceton znovu odlit a konjugát byl usušen na vzduchu. Poté byl konjugát rozpuštěn ve vodě (1,5 ml) a lyofilizován. Analýzou MALDI hmotnostní spektroskopií bylo určeno, že na jednu molekulu BSA je navázáno průměrně 13 molekul haptenu I. Množství navázaných molekul bylo vypočteno odečtením molámí hmotnosti BSA od naměřené molámí hmotnosti konjugátu (hodnota v maximu píku) a tento rozdíl byl vydělen molámí hmotností haptenu po odečtení molámí hmotnosti vody.
Příklad 8
Provedení nepřímé nekompetitivní ELISY
Imobilizace konjugátu na stěny jamek mikrotitrační destičky
Zásobní roztok imobilizačního konjugátu (hapten VII-BSA) byl naředěn na koncentraci
6,25 mol/1 v 0,05 mol/1 karbonát-bikarbonátovém pufru, pH 9,6 a pipetován do jamek mikrotitrační destičky v množství 100 μΐ na jamku. Imobilizace probíhala po dobu osmi hodin při teplotě místnosti. Nenavázaný imobilizační konjugát byl následující den odstraněn pomocí automatické promývačky 4x 300 μΐ 0,01 mol/1 fosfátového pufru (PBS)-Tw (0,01mol/l PBS, pH
7,4 obohacený 0,05% Tweenem).
- 12CZ 307719 B6
Aplikace kompetujících složek
Po promytí nenavázaného konjugátu byly do jamek mikrotitrační destičky pipetovány kompetující složky v pořadí 50 μΐ roztoku antigenu (kalibračního standardu diisopropyltryptaminu (koncentrační rozsah 5000 až 0 ng/ml) nebo vzorku slin)) ředěného v PBS a 50 μΐ roztoku králičího antiséra ředěného v příslušném pufru (různé pufry pro různé systémy) na koncentraci 1,25 pg/ml. Inkubace probíhala za mírného třepání při teplotě místnosti, po dobu 1 hodiny. Nezreagované imunoreaktanty byly odstraněny opakovaným promytím jamek 0,01 mol/1 PBS -Tw (4x 300 μΐ, promývačka).
Aplikace sekundární protilátky
Ke kvantifikaci navázaných králičích antisér na imobilizační konjugát byla využita protilátka GAR-Po (z angl. Goat Anti-Rabbit - kozí protilátky proti králičí protilátce značené peroxidázou). Protilátka Gar-Po byla ředěna 1:10 000 v 0,01 mol/1 PBS -Tw a pipetována v množství 100 μΐ na jamku. Inkubace probíhala za mírného třepání při teplotě místnosti, po dobu 1 hodiny. Nenavázané antisérum bylo poté odstraněno opakovaným promytím jamek 0,01 mol/1 PBS -Tw (4x 300 μΐ, promývačka).
Aplikace substrátu pro peroxidázu
Do každé jamky bylo následně přidáno 100 μΐ čerstvě připraveného roztoku substrátu pro peroxidázu (1 mg 3,3',5,5'-tetramethylbenzidinu (TMB) + 1 ml dimethylsulfoxidu + 9 ml 0,05mol/l citrát-fosfátového pufru; pH 5,0 + 2 μΐ 30% H2O2). Enzymová reakce probíhala za mírného třepání při teplotě místnosti deset minut.
V důsledku enzymové reakce změnila reakční směs barvu. K zastavení enzymové reakce byl použit přídavek 2 mol/1 kyseliny sírové v množství 50 μΐ na jamku. Absorbance reakční směsi byla měřena v jamkách mikrotitrační destičky při vlnové délce 450 nm. Čím větší byla hodnota absorbance, tím méně analytu bylo navázáno.
Příklad 9
Imunizace laboratorních králíků pro získání Antiséra proti diisopropyltryptaminu (Anti-DiPT)
K imunizaci byl použit konjugát BSA-VII haptenu VII s hovězím sérovým albuminem (BSA).
Konjugát BSA-VII byl rozpuštěn ve sterilním fyziologickém roztoku a emulgoval se se stejným objemem kompletního Freudova adjuvans, byl aplikován subkutánně do tří až čtyř míst na zádech a nohou u králíků. Imunizace byla opakována čtyřikrát ve 4-týdenním období, přičemž jedna dávka obsahovala 0,3 mg imunogenu v 0,3 ml emulze. Finální sérum bylo získáno po 10 dnech od poslední imunizace srdeční punkcí za úplné anestezie. Sebrané antisérum se lyofilizuje a uchovává při -28 °C.
Zásobní roztok antiséra o koncentraci 1 mg/ml byl získán rozpuštěním lyofilizovaného králičího antiséra v 0,01 mol/1 PBS a byl uchován při teplotě -28 °C. Před použitím byl temperován při teplotě místnosti po dobu minimálně patnácti minut.
Obdobně byla získána dvě různá antiséra proti DMT, kdy byl k imunizaci použit konjugát BSA-I a konjugát BSA-II.
Dále bylo získáno antisérum proti 5MeO-DMT, kdy byl k imunizaci použit konjugát BSA-IV.
- 13CZ 307719 B6
Příklad 10
Metoda enzymové imunoanalýzy
Byla zjišťována schopnost antisér reagovat s analyty strukturně či funkčně podobnými cílovému analytu. Byly určeny optimální podmínky pro každý pár antiséra a konjugátu. S antiséry vykazujícími nej lepší charakteristiky byly pro imunochemické stanovení optimalizovány a charakterizovány varianty ELISA v nepřímém kompetitivním uspořádání.
Imobilizační konjugát (hapten VII s BSA) o různých koncentracích 50; 25; 12,5; 6,25; 3,125; 0 ng/ml byl nanášen na stěny jamek mikrotitrační destičky. Zásobní koncentrace imobilizačního konjugátu (100 pg/ml) byla ředěna v 0,05 mol/1 karbonát-bikarbonátovém pufru, pH 9,6. Imobilizace probíhala 8 hodin při teplotě místnosti.
Dále následovalo promytí destiček (4x 300 μΐ/jamka, 0,01 mol/1 PBS -Tw (0,01 mol/1 PBS, pH
7,4 obohacený 0,05% Tween 20)). Do jamek byl aplikován pufr 0,01 mol/1 PBS (50 μΐ/jamka) a následně králičí antisérum Anti-DiPT (50 μΐ/jamka) o různých koncentracích (10; 5; 2,5; 1,25 a 0 μg/ml) ředěné vPBS-0,1% BSA (0,01 mol/1 PBS obohacený 0,1% BSA). Inkubace pufru s králičím antisérem probíhala po dobu jedné hodiny. Po ukončení doby inkubace byly destičky znovu promyty (4x 300 μΐ/jamka) PBS-0,05% Tw.
Do jednotlivých jamek byla dávkována protilátka GAR-Po (100 μΙ/jamka) ředěná 10 000 x v PBS-0,05% Tw. Znovu probíhala hodinová inkubace za mírného třepání v třepačce. Poté následovalo promytí destiček 4x 300 μΐ/jamka PBS-0,05%Tw. Do každé jamky bylo následně přidáno 100 μΐ čerstvě připraveného roztoku substrátu TMB (1 mg 3,3',5,5'tetramethylbenzidinu+ 1 ml DMSO + 9 ml 0,05 mol/1 citrát-fosfátového pufru; pH 5,0 + 2 μΐ 30% H2O2) (100 μΐ/jamka). Enzymová reakce probíhala za mírného třepání při teplotě místnosti deset minut.
V důsledku enzymové reakce změnila reakční směs barvu. K zastavení enzymové reakce byl použit přídavek 2 mol/1 kyseliny sírové v množství 50 μΐ na jamku. Absorbance reakční směsi byla měřena v jamkách mikrotitrační destičky při vlnové délce 450 nm. Čím větší byla hodnota absorbance, tím méně analytu bylo navázáno.
Z naměřených hodnot absorbancí byly vybrány tři kombinace koncentrací králičího antiséra a imobilizačního konjugátu. Jednalo se o tyto kombinace imobilizačního konjugátu - Anti-DiPT:
6,25 ng/ml - 1,25 pg/ml; 3,125 ng/ml - 1,25 pg/ml; 3,125 ng/ml - 2,5 pg/ml. S těmito kombinacemi koncentrací byly sestrojeny kalibrační křivky.
Příklad 10a
Sestrojení kalibračních křivek
Dělají se sedmibodové kalibrační křivky s použitím vybraných kombinací koncentrací imunoreagencií (většinou 4 kalibrační křivky na destičku; standard drogy např. od koncentrace 5000 ng/ml do 0 ng/ml v PBS).
Imobilizační konjugát (konjugát haptenu VII s BSA) o koncentracích 6,25 a 3,125 ng/ml byl nanesen na stěnu jamek mikrotitrační destičky. Zásobní koncentrace imobilizačního konjugátu (100 pg/ml) byla ředěna v 0,05 mokl karbonát-bikarbonátovém pufru, pH 9,6. Imobilizace probíhala 8 hodin při teplotě místnosti.
Dále následovalo promytí destiček (4x 300 μΐ/jamka, 0,01 mol/1 PBS-Tw (0,01 mol/1 PBS, pH
7,4 obohacený 0,05% Tween 20)). Do jamek byl aplikován diisopropyltryptamin (DiPT; zásobní
- 14CZ 307719 B6 roztok 1 mg/ml v 96% ethanolu); koncentrační řada 5 000; 500; 50; 5; 0,5; 0,05 a 0 ng/ml v PBS (50 μΐ/jamka) a následně králičí antisérum Anti-DiPT (50 μΐ/jamka) o koncentraci 1,25 nebo
2,5 μg/ml, (závislé na koncentračním páru) ředěné v PBS-0,1% BSA (0,01 mol/1 PBS obohacený 0,1% BSA). Inkubace diisopropyltryptaminu s králičí protilátkou probíhala po dobu jedné hodiny. Po ukončení doby inkubace byly destičky znovu promyty (4x 300 μΐ/jamka) PBS0,05 %Tw.
Do jednotlivých jamek byla dávkována protilátka GAR-Po (100 μΙ/jamka) ředěná 10 000 x v PBS-0,05% Tw. Znovu probíhala hodinová inkubace za mírného třepání v třepačce. Poté následovalo promytí destiček 4x 300 μΐ/jamka PBS-0,05% Tw. Do každé jamky bylo následně přidáno 100 μΐ čerstvě připraveného roztoku substrátu TMB (1 mg 3,3',5,5'tetramethylbenzidinu+ 1 ml DMSO + 9 ml 0,05mol/l citrát-fosfátového pufru; pH 5,0 + 2 μΐ 30% H2O2) (100 μΐ/jamka). Enzymová reakce probíhala za mírného třepání při teplotě místnosti deset minut.
V důsledku enzymové reakce změnila reakční směs barvu. K zastavení enzymové reakce byl použit přídavek 2 mol/1 kyseliny sírové v množství 50 μΐ na jamku. Absorbance reakční směsi byla měřena v jamkách mikrotitrační destičky při vlnové délce 450 nm. Čím větší byla hodnota absorbance, tím méně analytu bylo navázáno.
Byl vybrán koncentrační pár: imobilizační konjugát 6,25 ng/ml a Anti-DiPT 1,25 pg/ml. Sledovanými parametry kalibračních křivek byly hodnoty I50, maximální hodnota absorbance, minimální hodnota absorbance (vypovídá o nespecifických interakcích, ideální hodnota absorbance do 0,2) a délka lineární křivky. Výše uvedené parametry byly sledovány v celé práci u všech hodnocení týkajících se kalibračních křivek.
Příklad 11
Křížové reaktivity
Křížové interakce se využívají k vyjádření specifity sestavené imunoanalýzy. Prostřednictvím křížových reakcí byla testována schopnost antiséra Anti-DiPT reagovat s analyty strukturně či funkčně podobnými diisopropyltryptaminu. S testovanými analyty byly sestaveny kalibrační křivky. Hodnoty I50 získané z kalibračních křivek byly použity k výpočtu hodnot křížových reaktivit (CR) dle vztahu: CR(°/o) = Cs(f/°· 100 = -100 ¢,0,.(5) Λο(5)
C5o% (A) = I50 (A).....koncentrace diisopropyltryptaminu při Aso%
C5o% (B) = I50 (B)......koncentrace křížově interagujícího analytu při Aso%
Byly sestaveny kalibrační křivky, které byly získány naředěním diisopropyltryptaminu a testovaných drog na koncentrace: 5000; 500; 50; 5; 0,5; 0,05 a 0 ng/ml v PBS. ELISA byla provedena dle standardního postupu (viz příklad 8). Získané hodnoty I50 z každé křivky byly použity k výpočtu křížové reaktivity dle vztahu uvedeného výše.
Imobilizační konjugát (konjugát haptenu VII s BSA) o koncentracích 6,25 ng/ml byl nanášen na stěnu jamek mikrotitrační destičky. Zásobní koncentrace imobilizačního konjugátu (100 pg/ml) byla ředěna v 0,05 mol/1 karbonát-bikarbonátovém pufru, pH 9,6. Imobilizace probíhala 8 hodin při teplotě místnosti.
Dále následovalo promytí destiček (4x 300 μΙ/jamka, 0,01 mol/1 PBS-Tw (0,01 mol/1 PBS, pH 7,4 obohacený 0,05% Tween 20)). Do jamek byl aplikován diisopropyltryptamin a testované analyty (zásobní roztoky 1 mg/ml v 96% ethanolu); koncentrační řada 5000; 500; 50; 5; 0,5; 0,05 a 0 ng/ml v PBS (50 μΙ/jamka) a následně králičí antisérum Anti-DiPT (50 μΙ/jamka) o
- 15CZ 307719 B6 koncentraci 1,25 pg/ml (závislé na koncentračním páru) ředěné v PBS-0,1% BSA (0,01 mol/1 PBS obohacený 0,1% BSA). Inkubace diisopropyltryptaminu s králičí protilátkou probíhala po dobu jedné hodiny. Po ukončení doby inkubace byly destičky znovu promyty (4x 300 μΙ/jamka) PBS-0,05% Tw.
Do jednotlivých jamek byla dávkována sekundární protilátka GAR-Po (100 μΐ/jamka) ředěná 10 000 x v PBS-0,05% Tw. Znovu probíhala hodinová inkubace za mírného třepání v třepačce. Poté následovalo promytí destiček 4x 300 μΙ/jamka PBS-0,05% Tw. Do každé jamky bylo následně přidáno 100 μΐ čerstvě připraveného roztoku substrátu TMB (1 mg 3,3',5,5'tetramethylbenzidinu+ 1 ml DMSO + 9 ml 0,05mol/l citrát-fosfátového pufiru; pH 5,0 + 2 μΐ 30% H2O2) (100 μΐ/jamka). Enzymová reakce probíhala za mírného třepání při teplotě místnosti deset minut.
V důsledku enzymové reakce změnila reakční směs barvu. K zastavení enzymové reakce byl použit přídavek 2 mol/1 kyseliny sírové v množství 50 μΐ na jamku. Absorbance reakční směsi byla měřena v jamkách mikrotitrační destičky při vlnové délce 450 nm. Čím větší byla hodnota absorbance, tím méně analytu bylo navázáno.
Příklad 12
Analýza uměle kontaminovaného vzorku
Analytické vlastnosti sestavené imunoanalýzy byly testovány pomocí uměle kontaminovaných vzorků syntetických slin s cílovým analytem.
Vzorek slin byl uměle kontaminován diisopropyltryptaminem na koncentraci 20; 10 a 5 ng/ml. Pro vlastní test byla připravena kalibrační křivka dimethyltryptaminu (koncentrační řada 5 000; 500; 50; 5; 0,5; 0,05 a 0 ng/ml). Dále byly do mikrotitrační destičky aplikovány uměle kontaminované vzorky slin, které byly předem ředěny lOx k odstranění vlivu matrice. ELISA byla provedena dle standardního postupu (viz příklad 8). Z kalibrační křivky byly pro jednotlivé naměřené hodnoty absorbancí odečteny odpovídající koncentrace v ředěných vzorcích a v závislosti na ředění přepočteny na koncentraci v uměle kontaminovaném vzorku slin.
K vyhodnocení analýzy vzorků byla použita veličina výtěžnost, která byla vypočítána ze vztahu: (%)= ^-100 c
cp průměrná hodnota koncentrace z jednotlivých měření vzorku vyvinutou ELISA c hodnota koncentrace v kontaminovaném vzorku
Pro všechny uměle kontaminované vzorky byla výtěžnost metody vypočtena v rozsahu 89 až 112%. Reprodukovatelnost metody, vyjádřená jako relativní směrodatná odchylka, byla vypočtena v rozsahu 6 až 18 %.
Průmyslová využitelnost
Aplikace v imunoanalytických metodách stanovení derivátů tryptaminu ve formátech nepřímé ELISA, LFIA, FIA a dalších, které využívají kompetice mezi haptenem - některým z připravených derivátů tryptaminu, a analytem - psychoaktivní látkou přítomnou ve vzorku, o vazebná místa protilátky.
PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (1)

1. Použití derivátu tryptaminů o názvu hydrochlorid 2-{3-[2-(/V,/V-diniethy laniinojethyl |-///indol-5-yloxy} octové kyseliny a struktuře
\ Ν' 0 J .HCI •^N 15 H pro detekci tryptaminových drog psilocinu nebo směsi 5-methoxydimethyltryptaminu, dimethyltryptaminu a psilocinu.
11 výkresů
CZ2015-962A 2015-12-31 2015-12-31 Použití derivátu tryptaminu CZ307719B6 (cs)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2015-962A CZ307719B6 (cs) 2015-12-31 2015-12-31 Použití derivátu tryptaminu

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2015-962A CZ307719B6 (cs) 2015-12-31 2015-12-31 Použití derivátu tryptaminu

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2015962A3 CZ2015962A3 (cs) 2017-07-07
CZ307719B6 true CZ307719B6 (cs) 2019-03-20

Family

ID=59249273

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2015-962A CZ307719B6 (cs) 2015-12-31 2015-12-31 Použití derivátu tryptaminu

Country Status (1)

Country Link
CZ (1) CZ307719B6 (cs)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11591353B2 (en) 2020-02-04 2023-02-28 Mindset Pharma Inc. Psilocin derivatives as serotonergic psychedelic agents for the treatment of CNS disorders
AU2021397252B2 (en) * 2020-12-09 2024-03-14 Caamtech, Inc. Dialkyl tryptamines and their therapeutic uses
US12060328B2 (en) 2022-03-04 2024-08-13 Reset Pharmaceuticals, Inc. Co-crystals or salts of psilocybin and methods of treatment therewith
US12331020B2 (en) 2020-12-31 2025-06-17 1280225 B.C. Ltd. Method of synthesizing indole compounds

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL297492A (en) 2020-05-19 2022-12-01 Cybin Irl Ltd Denatured Tryptamine Derivatives and Methods of Use
CN116693443B (zh) * 2023-06-02 2025-08-19 杭州同舟生物技术有限公司 一种二甲基色胺人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用
CN117164470A (zh) * 2023-08-09 2023-12-05 长沙普济生物科技股份有限公司 一种高纯度Nε-月桂酰赖氨酸的合成方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3719699A1 (de) * 1986-06-12 1987-12-17 Glaxo Group Ltd Indolderivate
CZ28938U1 (cs) * 2015-09-14 2015-12-07 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze Imunochromatografický test dimethyltryptaminových drog

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3719699A1 (de) * 1986-06-12 1987-12-17 Glaxo Group Ltd Indolderivate
CZ28938U1 (cs) * 2015-09-14 2015-12-07 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze Imunochromatografický test dimethyltryptaminových drog

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Boulenguez P. a kol., "A new 5-hydroxy-indole derivative with preferential affinity for 5-HT1B binding sites", European Journal of Pharmacology, 1991, 194, str. 91-98 *
M. Maryška a kol., "Syntéza haptenů drog odvozených od tryptaminu", Studentská odborná konference Chemie je život 2013, Sborník abstraktů, 6.12.2013 *
M. Maryška, "Komponenty imunochemických souprav pro detekci syntetických derivátů tryptaminů", diplomová práce, 2013, obhájená 2.6.2014 (dokument dostupný pouze omezenému okruhu osob) *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11591353B2 (en) 2020-02-04 2023-02-28 Mindset Pharma Inc. Psilocin derivatives as serotonergic psychedelic agents for the treatment of CNS disorders
US12054505B2 (en) 2020-02-04 2024-08-06 Mindset Pharma Inc. Psilocin derivatives as serotonergic psychedelic agents for the treatment of CNS disorders
US12378266B2 (en) 2020-02-04 2025-08-05 Mindset Pharma Inc. Psilocin derivatives as serotonergic psychedelic agents for the treatment of CNS disorders
AU2021397252B2 (en) * 2020-12-09 2024-03-14 Caamtech, Inc. Dialkyl tryptamines and their therapeutic uses
AU2021397252A9 (en) * 2020-12-09 2024-09-05 Caamtech, Inc. Dialkyl tryptamines and their therapeutic uses
US12343328B2 (en) 2020-12-09 2025-07-01 Caamtech, Inc. Dialkyl tryptamines and their therapeutic uses
US12331020B2 (en) 2020-12-31 2025-06-17 1280225 B.C. Ltd. Method of synthesizing indole compounds
US12060328B2 (en) 2022-03-04 2024-08-13 Reset Pharmaceuticals, Inc. Co-crystals or salts of psilocybin and methods of treatment therewith

Also Published As

Publication number Publication date
CZ2015962A3 (cs) 2017-07-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ307719B6 (cs) Použití derivátu tryptaminu
US8822695B2 (en) Violet laser excitable dyes and their method of use
FI90542B (fi) Kemiluminoivia akridiinijohdannaisia, niiden valmistus ja niiden käyttö luminesenssi-immunoanalyyseissä
US5952187A (en) Topiramate immunoassay
JPH0625763B2 (ja) アンフェタミンおよびメタンフェタミンの蛍光偏光イムノアッセイ法
US20230417779A1 (en) Pregabalin Immunoassays
JPH08283258A (ja) カンナビノイド免疫検定に用いる改良試薬
JP4902544B2 (ja) ラモトリジンの免疫アッセイ
JP3190730B2 (ja) 新規標識薬物ハプテン類似体を用いるイムノアッセイ
JP2008518233A (ja) トピラメートに関する免疫アッセイ
US5411869A (en) Immunological analogs for captan
US5407835A (en) Reagents and methods for the quantification of amitriptyline or nortriptyline in biological fluids
CN108689985B (zh) 一种黄樟素半抗原与抗原的制备方法及应用
JP2006282547A (ja) ニテンピラムのハプテン化合物、抗体、ハイブリドーマ、およびその測定手段、測定用キットまたは測定方法
JP2005247822A (ja) コプラナーpcbハプテン、コプラナーpcbに対する抗体およびそれを用いる免疫学的測定方法
US5340750A (en) Reagents and methods for the quantification of imipramine or desipramine in biological fluids
CN109324187B (zh) 一种检测甲霜灵的酶联免疫试剂盒及其应用
JPH08511516A (ja) 3−フェニル−1−アダマンタン酢酸のハプテン、トレーサー、免疫原及び抗体
JPS61236799A (ja) エトサキシミド試験法、トレーサー、イムノゲンおよび抗体
JP2007204394A (ja) テブフェノジドおよびその類似化合物に対する抗体の製造方法、抗体、ハイブリドーマ、その免疫学的測定方法および測定キット
CZ305780B6 (cs) Derivát syntetického kanabinoidu, způsob jeho přípravy a použití
JPH05172814A (ja) イムノアッセイ用標識薬物ハプテン類似体
CN119638611A (zh) N-乙酰-5-羟色胺衍生物、免疫原、抗体及检测试剂制备与应用
CZ306547B6 (cs) Derivát syntetického kanabinoidu, způsob jeho přípravy a použití

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20211231