CZ2015962A3 - Derivát tryptaminu, způsob jeho přípravy a použití - Google Patents
Derivát tryptaminu, způsob jeho přípravy a použití Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2015962A3 CZ2015962A3 CZ2015-962A CZ2015962A CZ2015962A3 CZ 2015962 A3 CZ2015962 A3 CZ 2015962A3 CZ 2015962 A CZ2015962 A CZ 2015962A CZ 2015962 A3 CZ2015962 A3 CZ 2015962A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- ethyl
- mmol
- solution
- hapten
- conjugate
- Prior art date
Links
- APJYDQYYACXCRM-UHFFFAOYSA-N tryptamine Chemical class C1=CC=C2C(CCN)=CNC2=C1 APJYDQYYACXCRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 29
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 36
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 31
- -1 2- {3- [2- (N, N-dimethylamino) ethyl] -1H-indol-5-yl} acetic acid hydrochloride Chemical compound 0.000 claims description 18
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 13
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 13
- AMMBUJFMJOQABC-UHFFFAOYSA-N 1-carboxypropylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCC(N)C(O)=O AMMBUJFMJOQABC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 125000000814 indol-3-yl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C([*])C2=C1[H] 0.000 claims description 2
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 claims 4
- 125000002147 dimethylamino group Chemical group [H]C([H])([H])N(*)C([H])([H])[H] 0.000 claims 1
- DRLFMBDRBRZALE-UHFFFAOYSA-N melatonin Chemical compound COC1=CC=C2NC=C(CCNC(C)=O)C2=C1 DRLFMBDRBRZALE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 abstract description 20
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 abstract description 13
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 abstract description 13
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 abstract description 13
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract description 9
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 abstract description 8
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 abstract description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 abstract description 4
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 abstract description 2
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 72
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 67
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 57
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 29
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 29
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 24
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 23
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 18
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 18
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 18
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 15
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 15
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 14
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 11
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 11
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 10
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 10
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 10
- CTSLXHKWHWQRSH-UHFFFAOYSA-N oxalyl chloride Chemical compound ClC(=O)C(Cl)=O CTSLXHKWHWQRSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- ZRVAAGAZUWXRIP-UHFFFAOYSA-N N,N-diisopropyltryptamine Chemical compound C1=CC=C2C(CCN(C(C)C)C(C)C)=CNC2=C1 ZRVAAGAZUWXRIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- DMULVCHRPCFFGV-UHFFFAOYSA-N N,N-dimethyltryptamine Chemical compound C1=CC=C2C(CCN(C)C)=CNC2=C1 DMULVCHRPCFFGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 9
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 9
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 8
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 8
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- NCIKQJBVUNUXLW-UHFFFAOYSA-N N-methyltryptamine Chemical class C1=CC=C2C(CCNC)=CNC2=C1 NCIKQJBVUNUXLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 7
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Natural products CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 6
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 6
- UAOMVDZJSHZZME-UHFFFAOYSA-N diisopropylamine Chemical compound CC(C)NC(C)C UAOMVDZJSHZZME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000003818 flash chromatography Methods 0.000 description 6
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N serotonin Chemical compound C1=C(O)C=C2C(CCN)=CNC2=C1 QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 6
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 238000006641 Fischer synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical group [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 5
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 5
- 150000002475 indoles Chemical class 0.000 description 5
- 238000001869 matrix assisted laser desorption--ionisation mass spectrum Methods 0.000 description 5
- 239000002899 monoamine oxidase inhibitor Substances 0.000 description 5
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 5
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 5
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- YLANFXRDWDNPRL-UHFFFAOYSA-N 4,4-dimethoxy-n,n-di(propan-2-yl)butan-1-amine Chemical compound COC(OC)CCCN(C(C)C)C(C)C YLANFXRDWDNPRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MIANLSMIRRRMJS-UHFFFAOYSA-N 5-meo-dmt Chemical compound [CH]1C(OC)=CC=C2N=CC(CCN(C)C)=C21 MIANLSMIRRRMJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940123685 Monoamine oxidase inhibitor Drugs 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000011545 carbonate/bicarbonate buffer Substances 0.000 description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 230000003400 hallucinatory effect Effects 0.000 description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 4
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 4
- 238000005292 vacuum distillation Methods 0.000 description 4
- WDZKKBDOGYBYBG-UHFFFAOYSA-N 4,4-dimethoxy-n,n-dimethylbutan-1-amine Chemical compound COC(OC)CCCN(C)C WDZKKBDOGYBYBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UAACPUXQSNTFKD-UHFFFAOYSA-N 4-[di(propan-2-yl)amino]butan-1-ol Chemical compound CC(C)N(C(C)C)CCCCO UAACPUXQSNTFKD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZSTKHSQDNIGFLM-UHFFFAOYSA-N 5-methoxy-N,N-dimethyltryptamine Chemical compound COC1=CC=C2NC=C(CCN(C)C)C2=C1 ZSTKHSQDNIGFLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910010082 LiAlH Inorganic materials 0.000 description 3
- 102000010909 Monoamine Oxidase Human genes 0.000 description 3
- 108010062431 Monoamine oxidase Proteins 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- XBPOBCXHALHJFP-UHFFFAOYSA-N ethyl 4-bromobutanoate Chemical compound CCOC(=O)CCCBr XBPOBCXHALHJFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000019439 ethyl acetate Nutrition 0.000 description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 3
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 3
- 230000000506 psychotropic effect Effects 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- GIFGMEWQGDEWKB-UHFFFAOYSA-N 2-(4-aminophenoxy)acetic acid Chemical compound NC1=CC=C(OCC(O)=O)C=C1 GIFGMEWQGDEWKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSEWAUGPAQPMDC-UHFFFAOYSA-N 2-(4-aminophenyl)acetic acid Chemical compound NC1=CC=C(CC(O)=O)C=C1 CSEWAUGPAQPMDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IIHGIMUHYGFENH-UHFFFAOYSA-N 2-(4-hydrazinylphenoxy)acetic acid hydrochloride Chemical compound Cl.NNc1ccc(OCC(O)=O)cc1 IIHGIMUHYGFENH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QBSIFZWYKGBSFI-UHFFFAOYSA-N 2-(4-hydrazinylphenyl)acetic acid;hydrochloride Chemical compound Cl.NNC1=CC=C(CC(O)=O)C=C1 QBSIFZWYKGBSFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 2-(chloromethyl)pyridine-3-carbonitrile Chemical compound ClCC1=NC=CC=C1C#N FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PLIKAWJENQZMHA-UHFFFAOYSA-N 4-aminophenol Chemical compound NC1=CC=C(O)C=C1 PLIKAWJENQZMHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LTLKJYMNUSSFAH-UHFFFAOYSA-N 4-chloro-1,1-dimethoxybutane Chemical compound COC(OC)CCCCl LTLKJYMNUSSFAH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DLBWMKQESCEERJ-UHFFFAOYSA-N 5-methoxy-diisopropyltryptamine Chemical compound [CH]1C(OC)=CC=C2N=CC(CCN(C(C)C)C(C)C)=C21 DLBWMKQESCEERJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ROSDSFDQCJNGOL-UHFFFAOYSA-N Dimethylamine Chemical compound CNC ROSDSFDQCJNGOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NFDDCRIHMZGWBP-UHFFFAOYSA-N N,O-dimethylserotonin Chemical compound C1=C(OC)C=C2C(CCNC)=CNC2=C1 NFDDCRIHMZGWBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 2
- QSQQQURBVYWZKJ-UHFFFAOYSA-N alpha-methyltryptamine Chemical compound C1=CC=C2C(CC(N)C)=CNC2=C1 QSQQQURBVYWZKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940054051 antipsychotic indole derivative Drugs 0.000 description 2
- ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N cocaine Chemical compound O([C@H]1C[C@@H]2CC[C@@H](N2C)[C@H]1C(=O)OC)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 2
- 229940043279 diisopropylamine Drugs 0.000 description 2
- CFNDVXUTYPXOPG-UHFFFAOYSA-N ethyl 2-(4-aminophenyl)acetate Chemical compound CCOC(=O)CC1=CC=C(N)C=C1 CFNDVXUTYPXOPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DENTXBGEUCFNQB-UHFFFAOYSA-N ethyl 2-(4-hydrazinylphenyl)acetate;hydrochloride Chemical compound Cl.CCOC(=O)CC1=CC=C(NN)C=C1 DENTXBGEUCFNQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SRRXSNXLLNUOBI-UHFFFAOYSA-N ethyl 4-(4-aminophenoxy)butanoate Chemical compound CCOC(=O)CCCOC1=CC=C(N)C=C1 SRRXSNXLLNUOBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N formamide Substances NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000003533 narcotic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- SPCIYGNTAMCTRO-UHFFFAOYSA-N psilocin Chemical compound C1=CC(O)=C2C(CCN(C)C)=CNC2=C1 SPCIYGNTAMCTRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QVDSEJDULKLHCG-UHFFFAOYSA-N psilocybin Chemical compound C1=CC(OP(O)(O)=O)=C2C(CCN(C)C)=CNC2=C1 QVDSEJDULKLHCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001337 psychedelic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000018 receptor agonist Substances 0.000 description 2
- 229940044601 receptor agonist Drugs 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 229940014800 succinic anhydride Drugs 0.000 description 2
- DYHSDKLCOJIUFX-UHFFFAOYSA-N tert-butoxycarbonyl anhydride Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)OC(=O)OC(C)(C)C DYHSDKLCOJIUFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YRQMBQUMJFVZLF-UHFFFAOYSA-N tert-butyl n-(4-hydroxyphenyl)carbamate Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 YRQMBQUMJFVZLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ADFXKUOMJKEIND-UHFFFAOYSA-N 1,3-dicyclohexylurea Chemical compound C1CCCCC1NC(=O)NC1CCCCC1 ADFXKUOMJKEIND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AZUYLZMQTIKGSC-UHFFFAOYSA-N 1-[6-[4-(5-chloro-6-methyl-1H-indazol-4-yl)-5-methyl-3-(1-methylindazol-5-yl)pyrazol-1-yl]-2-azaspiro[3.3]heptan-2-yl]prop-2-en-1-one Chemical compound ClC=1C(=C2C=NNC2=CC=1C)C=1C(=NN(C=1C)C1CC2(CN(C2)C(C=C)=O)C1)C=1C=C2C=NN(C2=CC=1)C AZUYLZMQTIKGSC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GVNVAWHJIKLAGL-UHFFFAOYSA-N 2-(cyclohexen-1-yl)cyclohexan-1-one Chemical compound O=C1CCCCC1C1=CCCCC1 GVNVAWHJIKLAGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZNBGBHISQKMEPA-UHFFFAOYSA-N 2-oxoacetyl chloride Chemical compound ClC(=O)C=O ZNBGBHISQKMEPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZBQCCTCQUCOXBO-UHFFFAOYSA-N 4-(4-aminophenyl)-2,2,6,6-tetramethylcyclohex-3-en-1-amine Chemical compound CC1(C)C(N)C(C)(C)CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 ZBQCCTCQUCOXBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WYWMSDILLLWJFQ-UHFFFAOYSA-N 4-[di(propan-2-yl)amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound CC(C)N(C(C)C)C(=O)CCC(O)=O WYWMSDILLLWJFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000040125 5-hydroxytryptamine receptor family Human genes 0.000 description 1
- 108091032151 5-hydroxytryptamine receptor family Proteins 0.000 description 1
- DWAQDRSOVMLGRQ-UHFFFAOYSA-N 5-methoxyindole Chemical compound COC1=CC=C2NC=CC2=C1 DWAQDRSOVMLGRQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- ZTQSAGDEMFDKMZ-UHFFFAOYSA-N Butyraldehyde Chemical compound CCCC=O ZTQSAGDEMFDKMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QXPUBANOKZYTQC-UHFFFAOYSA-N C1C=CC=C2C=CN=C12 Chemical compound C1C=CC=C2C=CN=C12 QXPUBANOKZYTQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150065749 Churc1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000748561 Diplopterys cabrerana Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 238000006783 Fischer indole synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 150000007930 O-acyl isoureas Chemical class 0.000 description 1
- 102100038239 Protein Churchill Human genes 0.000 description 1
- 241001237914 Psilocybe Species 0.000 description 1
- 241001145996 Psychotria viridis Species 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- VOXIUXZAOFEFBL-UHFFFAOYSA-N Voacangin Natural products CCC1CC2CN3CC1C(C2)(OC(=O)C)c4[nH]c5ccc(OC)cc5c4C3 VOXIUXZAOFEFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BLGXFZZNTVWLAY-CCZXDCJGSA-N Yohimbine Natural products C1=CC=C2C(CCN3C[C@@H]4CC[C@@H](O)[C@H]([C@H]4C[C@H]33)C(=O)OC)=C3NC2=C1 BLGXFZZNTVWLAY-CCZXDCJGSA-N 0.000 description 1
- DHKHKXVYLBGOIT-UHFFFAOYSA-N acetaldehyde Diethyl Acetal Natural products CCOC(C)OCC DHKHKXVYLBGOIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006359 acetalization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000008484 agonism Effects 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- SDBCCDNTZKHGBJ-UHFFFAOYSA-N amino butanoate Chemical compound CCCC(=O)ON SDBCCDNTZKHGBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124277 aminobutyric acid Drugs 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001448 anilines Chemical class 0.000 description 1
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- BLGXFZZNTVWLAY-UHFFFAOYSA-N beta-Yohimbin Natural products C1=CC=C2C(CCN3CC4CCC(O)C(C4CC33)C(=O)OC)=C3NC2=C1 BLGXFZZNTVWLAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000003557 cannabinoid Substances 0.000 description 1
- 229930003827 cannabinoid Natural products 0.000 description 1
- 229940065144 cannabinoids Drugs 0.000 description 1
- 238000012754 cardiac puncture Methods 0.000 description 1
- 238000005266 casting Methods 0.000 description 1
- 229960003920 cocaine Drugs 0.000 description 1
- 238000002967 competitive immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000747 designer drug Substances 0.000 description 1
- 125000004663 dialkyl amino group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012954 diazonium Substances 0.000 description 1
- 150000001989 diazonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000006193 diazotization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 235000019329 dioctyl sodium sulphosuccinate Nutrition 0.000 description 1
- YHAIUSTWZPMYGG-UHFFFAOYSA-L disodium;2,2-dioctyl-3-sulfobutanedioate Chemical compound [Na+].[Na+].CCCCCCCCC(C([O-])=O)(C(C([O-])=O)S(O)(=O)=O)CCCCCCCC YHAIUSTWZPMYGG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- LQQLBFZHJXGMCR-UHFFFAOYSA-N ethyl 4-(4-aminophenyl)butanoate Chemical compound CCOC(=O)CCCC1=CC=C(N)C=C1 LQQLBFZHJXGMCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OPXNFHAILOHHFO-UHFFFAOYSA-N ethyl 4-chlorobutanoate Chemical compound CCOC(=O)CCCCl OPXNFHAILOHHFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PQJJJMRNHATNKG-UHFFFAOYSA-N ethyl bromoacetate Chemical compound CCOC(=O)CBr PQJJJMRNHATNKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004494 ethyl ester group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000380 hallucinogen Substances 0.000 description 1
- HSIBGVUMFOSJPD-CFDPKNGZSA-N ibogaine Chemical compound N1([C@@H]2[C@H]3C[C@H](C1)C[C@@H]2CC)CCC1=C3NC2=CC=C(OC)C=C12 HSIBGVUMFOSJPD-CFDPKNGZSA-N 0.000 description 1
- OLOCMRXSJQJJPL-UHFFFAOYSA-N ibogaine Natural products CCC1CC2CC3C1N(C2)C=Cc4c3[nH]c5ccc(OC)cc45 OLOCMRXSJQJJPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AREITJMUSRHSBK-UHFFFAOYSA-N ibogamine Natural products CCC1CC2C3CC1CN2CCc4c3[nH]c5ccccc45 AREITJMUSRHSBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 1
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 1
- TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N octane Chemical compound CCCCCCCC TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940127240 opiate Drugs 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000003196 psychodysleptic agent Substances 0.000 description 1
- 239000004089 psychotropic agent Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 229940076279 serotonin Drugs 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000012265 solid product Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000954 titration curve Methods 0.000 description 1
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- BLGXFZZNTVWLAY-SCYLSFHTSA-N yohimbine Chemical compound C1=CC=C2C(CCN3C[C@@H]4CC[C@H](O)[C@@H]([C@H]4C[C@H]33)C(=O)OC)=C3NC2=C1 BLGXFZZNTVWLAY-SCYLSFHTSA-N 0.000 description 1
- 229960000317 yohimbine Drugs 0.000 description 1
- AADVZSXPNRLYLV-UHFFFAOYSA-N yohimbine carboxylic acid Natural products C1=CC=C2C(CCN3CC4CCC(C(C4CC33)C(O)=O)O)=C3NC2=C1 AADVZSXPNRLYLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AIFRHYZBTHREPW-UHFFFAOYSA-N β-carboline Chemical class N1=CC=C2C3=CC=CC=C3NC2=C1 AIFRHYZBTHREPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
- C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
- C07D209/04—Indoles; Hydrogenated indoles
- C07D209/10—Indoles; Hydrogenated indoles with substituted hydrocarbon radicals attached to carbon atoms of the hetero ring
- C07D209/14—Radicals substituted by nitrogen atoms, not forming part of a nitro radical
- C07D209/16—Tryptamines
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
Řešení se týká nově připravených derivátů tryptaminu, součástí jejichž struktury je krátký spojovací můstek nesoucí karboxylovou funkční skupinu, a chemických postupů vedoucích k přípravě takovýchto sloučenin. Tyto deriváty tryptaminu lze s výhodou využít pro přípravu imunogenů konjugací s nosným proteinem. Polyklonální králičí protilátky získané z imunizovaných laboratorních zvířat lze uplatnit při vývoji rychlých, uživatelsky příjemných imunochemických testů formátu LFIA (Lateral-Flow Immunochromatographic Assay).
Description
Oblast techniky
Vynález se týká nově připravených derivátů tryptaminu, součástí jejich struktury je krátký spojovací můstek nesoucí karboxylovou funkční skupinu, a chemických postupů vedoucích k přípravě takovýchto sloučenin. Tyto deriváty tryptaminu lze s výhodou využít pro přípravu imunogenů konjugací s nosným proteinem. Polyklonální králičí protilátky získané z imunizovaných laboratorních zvířat lze uplatnit při vývoji rychlých, uživatelsky příjemných imunochemických testů formátu LFIA (Lateral-Flow Immunochromatographic Assay).
Dosavadní stav techniky
Na drogové scéně se v posledních letech kromě tradičních drog (kokain, opiáty, amfetaminy, kanabinoidy) objevují také nové syntetické drogy (NSD). Důvodem je snaha výrobců a distributorů obejít stávající legislativní normy, v nichž jsou omamné a psychotropní látky vymezeny obvykle taxativně. Na ilegální trh se tak dostávají analoga známých látek s psychotropním potenciálem, která dosud nejsou uvedena na seznamu ilegálních látek, nebo jejichž prekurzory nejsou monitorovanými substancemi. Hlavní nebezpečí spojené s užíváním těchto nových syntetických drog (NSD) tkví v nedostatku informací o jejich farmakokinetickém a toxikologickém chování, neboť tyto látky neprošly žádnými klinickými testy.
Mezi nové syntetické drogy se řadí i skupina látek zvaná tryptaminy. Jedná se o halucinogenní látky a kromě syntetických derivátů existuje i několik přírodních tryptaminů, které patří mezi tradiční psychedelika. Tryptaminy jsou obecně agonisté serotoninových 5-HT receptorů, za halucinogenní efekt je zodpovědný agonismus především 5-HT2a a 5-HT[A subtypů těchto receptorů. Mezi nejznámější přírodní tryptaminy patří psilocin a psilocybin, účinné látky obsažené v halucinogenních houbách, zejména v lysohlávkách (Psilocybe). Tradiční roli v jihoamerických kulturách má dimethyltryptamin (DMT), kde je užíván zejména ve formě rituálního nápoje ayahuasca. Nápoj je připravován z několika druhů psychotropních rostlin vyskytujících se v Amazonii, zejména Psychotria viridis a Diplopterys cabrerana, obsahující jako aktivní látku právě DMT. V dnešní době není DMT záležitostí pouze Jižní Ameriky, často je připravován i synteticky a v čisté formě ho lze užívat i kouřením či intravenózně. Obecně platí, že k dosažení halucinogenního účinku přírodních tryptaminů při perorálním užití je nutné zároveň užít i inhibitor monoaminoxidasy (MAO), jinak dojde k rychlé metabolizaci tryptaminů. Na základě strukturních variací bylo syntetizováno několik desítek syntetických tryptaminů, jejichž vlastnosti jsou závislé na strukturních modifikacích a dají se shrnout do několika základních skupin. Jednoduché syntetické tryptaminy, odvozené od DMT pouze variací alkylových substituentů na aminoskupině, působí na organismus podobně jako DMT, pouze s tím rozdílem, že nejsou po užití rozkládány MAO a jsou účinné i perorálně. Deriváty substituované v α-poloze jsou díky této substituci účinnými inhibitory MAO a zároveň mají kromě halucinogenních i výraznější stimulační účinky. Deriváty modifikované v poloze 5, nejčastěji methoxy skupinou, vykazují podobné účinky jako látky nesubstituované, jsou však výrazně účinnější. Mezi nejrozšířenější syntetické tryptaminy se řadí 5-methoxydimethyltryptamin (5-MeO-DMT), diisopropyltryptamin (DiPT), 5-methoxydiisopropyltryptamin (5-MeO-DiPT), alfamethyltryptamin (a-MT) a 5-methoxydiallyltrpytamin (5-MeO-DALT). S výjimkou 5-MeODMT lze všechny tyto deriváty užít perorálně bez nutnosti užití inhibitoru MAO. 5-MeODiPT je velmi potentní psychedelikum s dlouhou dobou účinku, jeho účinná dávka se pohybuje okolo 10 mg.
Tradiční drogy lze detekovat pomocí komerčních imunochemických testů založených na selektivní reakci protilátky a antigenu, kterým je v tomto případě hledaná omamná či psychotropní látka. K detekci NSD však tyto testy použít nelze. (Páleníček T, Kuchař M. Je možná detekce a identifikace nových syntetických drog (NSD) pomocí orientačních testů? Adiktologie 2011;11:208-14.) Odhalit intoxikaci osob novými syntetickými drogami je možné pomocí metod klinické biochemie, a to zejména analýzou pomocí plynové či kapalinové chromatografie s hmotnostním detektorem (GC-MS či LC-MS), což je poměrně náročné jak na přístroje, tak na odbornost obsluhy. Sestavení přístrojově nenáročných, jednoduchých, uživatelsky příjemných imunochemických testů na principu LFIA (Lateral Flow Immunochromatographic Assay) by umožňovalo daleko rychlejší a levnější orientační detekci látek v biologickém materiálu ve zdravotnictví nebo při dopravních kontrolách řidičů a také při screeningu rostlinného materiálu.
Možnosti analýzy a detekce tryptaminů v biologických vzorcích jsou omezené prakticky na použití metod LC-MS či GC-MS. V literatuře je popsána metoda pro stanovení několika desítek tryptaminových derivátů v moči nebo krevní plazmě s limity detekce mezi 10 až 100 ng/ml v moči a 1 až 100 ng/ml v plazmě. (Meyer, M. R.; Caspar, A.; Brandt, S. D.;
Maurer, Η. H., A qualitative/quantitative approach for the detection of 37 tryptamine-derived designer drugs, 5 beta-carbolines, ibogaine, and yohimbine in human urine and plasma using standard urine screening and multi-analyte approaches. Analytical and bioanalytical chemistry 2014; 406(1):225-237.) Tyto metody jsou nedílnou součástí klinických testů, jejich nevýhodou je ale časová náročnost a nemožnost využití mimo laboratoř. Pro kvalitativní detekci tryptaminů v zachycených vzorcích lze použít detekční kity založené na barevné důkazové reakci, nicméně vzhledem k nízké specifítě a velkému množství možných zkřížených reakcí je jejich využití značně omezené. Z imunochemických metod pro detekci tryptaminů je v literatuře znám pouze radioimunochromatografický test pro 5-MeO-DMT. (Strahilevitz. M. Immunological methods for treating mammals. US 4834973 (A), May 30, 1989.)
Jako nosičové proteiny se používají hovězí sérový albumin (BSA), hovězí thyroglobumin (BTG), popř. další proteiny vhodných vlastností. Konjugáty se připravují reakcí aktivované formy haptenu (reaktivní anhydridy či estery) s ε-aminoskupinami lysinových zbytků proteinu za vytvoření amidových vazeb. Konjugací se dosáhne statisticky náhodného obsazení lysylů přítomných v proteinu.
Podstata vynálezu
Byly vytvořeny hapteny, které jsou novými deriváty tryptaminů. Nesou krátký spojovací můstek s karboxylovou skupinou. Spojovací můstek je využitelný pro přípravu imunogenů konjugací s nosným proteinem. Z laboratorních zvířat imunizovaných těmito imunogeny lze získat polyklonální králičí protilátky a uplatnit je při vývoji imunoanalytických metod stanovení tryptaminů.
Spojovací můstek je připojen přes dusík aminoskupiny tryptaminů nebo v poloze 5 indolového jádra či přes kyslík v poloze 5 indolového jádra.
Sloučeniny se připraví převedením indolu reakcí s oxalylchloridem a methylaminem na příslušné 7H-indol-3-ylglyoxylylamidy. Z nich jsou redukcí tetrahydridohlinitanem lithným získány příslušné A-methyltryptaminy, jejichž A-alkylací ethyl-esterem ω-bromalkanové kyseliny a následnou bazickou hydrolýzou je do molekuly zaveden spojovací můstek nesoucí karboxylovou funkční skupinu.
Nebo se sloučeniny připraví pomocí Fischerovy syntézy indolu l,l-dimethoxy-4(dialkylamino)butanalu a příslušných arylhydraziniových solí. Spojovací můstek je součástí struktury výchozí arylhydraziniové soli a podmínky reakce se liší podle toho, zda můstek už nese přímo karboxylovou skupinu, či esterovou funkční skupinu. V druhém případě je pro přípravu sloučenin nutná ještě hydrolýza.
Připravené deriváty tryptaminů lze s výhodou využít pro přípravu imunogenů konjugací s nosným proteinem. Polyklonální králičí protilátky získané z imunizovaných laboratorních zvířat lze uplatnit při vývoji rychlých, uživatelsky příjemných imunochemických testů formátu LFIA (Lateral-Flow Immunochromatographic Assay).
Pro získání protilátek proti těmto tryptaminum, bylo nutné připojit je k nosnému proteinu a k tomuto účelu byly vytvořeny hapteny, nesoucí specifické spojovací můstky. Pro tyto účely byl jako vhodný nosný protein vybrán hovězí sérový albumin (BSA). Při tvorbě konjugátů byla využita metoda aktivovaného esteru, při níž je hapten reakcí sVJVdicyklohexylkarbodiimidem (DCC) a A-hydroxysukcinimidem (NHS) nejprve převeden na nestabilní derivát O-acylisomočoviny, a poté na aktivovaný ester. Vlastní konjugační reakce, při níž dochází k tvorbě amidové vazby mezi karboxylovou skupinou haptenu a primární aminoskupinou aminokyseliny lysinu v BSA, pak probíhala v reverzním micelámím prostředí anionaktivního tenzidu.
Způsob přípravy derivátů tryptaminů
Syntéza haptenu I a II je založena na metodě Speetera a Anthonyho pro výstavbu tryptaminových derivátů. (Speeter, Μ. E.; Anthony, W. C., The Action of Oxalyl Chloride on Indoles - a New Approach to Tryptamines. J Am Chem Soc 1954, 76(23):6208-6210.) Indol, případně 5-methoxyindol, je nejprve převeden reakcí s oxalychloridem na příslušný glyoxylylchlorid. Jeho reakcí s methylaminem a následnou redukcí vzniklého amidu se připraví V-methyltryptamin, případně 5-methoxy-V-methyltryptamin. Alkylací dusíku aminoskupiny ethyl-4-brombutanoátem a následnou bazickou hydrolýzou je do molekuly zaveden spojovací můstek nesoucí karboxylovou fůnkční skupinu. Takto připravené hapteny, je proto možné konjugovat s ε-aminoskupinami lysinových zbytků proteinu za vytvoření amidových vazeb.
K přípravě haptenů III - VII byl využit přístup založený na Fischerově syntéze indolových derivátů vycházející z příslušných arylhydraziniových solí a acetalu 4-(ΛζNdialkylamino)butanalu. (Chen, C. Y.; Senanayake, C. H.; Bill, T. J.; Larsen, R. D.; Verhoeven, T. R.; Reider, P. J., Improved Fischer Indole Reaction for the Preparation of
Χ/V-Dimethyltryptamines - Synthesis of L-695,894, a Potent 5-Htld Receptor Agonist. J Org Chem 1994, 59(13):3738-3741.) Hydraziniové soli lze připravit ve vysokém výtěžku z příslušných anilinů diazotací a následnou redukcí diazoniové soli pomocí SnCl2.2H2O. Při použití hydraziniové soli nesoucí na aromatickém jádře přímo spojku zakončenou karboxylovou funkcí se ukázalo, že za podmínek Fischerovy reakce nelze připravit hapteny IV a VI s 4-uhlíkatou spojkou. Úpravou podmínek Fischerovy reakce a použitím hydraziniových solí nesoucí na aromatickém jádře spojku s esterovou funkční skupinou se podařilo připravit příslušné indolové deriváty a jejich hydrolýzou byly získány hapteny III VI. Zatímco 4-(VV-dimethylamino)-l,l-dimethoxybutan, použitý pro přípravu haptenů III VI, byl připraven podle postupů popsaných v literatuře (Koch, S. S. C.; Chamberlin, A. R., Enantioselective Preparation of Beta-Alkyl-Gamma-Butyrolactones from Functionalized Ketene Dithioacetals. J Org Chem 1993, 55(10):2725-2737.; Chen, C. Y.; Senanayake, C. H.; Bill, T. J.; Larsen, R. D.; Verhoeven, T. R.; Reider, P. J., Improved Fischer Indole Reaction for the Preparation of VjV-Dimethyltryptamines - Synthesis of L-695,894, a Potent 5-Htld Receptor Agonist. J Org Chem 1994, 59(13):3738-3741.) Pro přípravu 4-(VVdiisopropylamino)-l,l-dimethoxybutanu byla použita inovativní syntetická cesta. Pro jeho syntézu je vycházeno ze sukcinanhydridu, který reakcí s diisopropylaminem poskytne monodiisopropylamid butandiové kyseliny. Redukcí tohoto amidu LiAlH4 je získán 4-(N,Ndiisopropylamino)butanol. Swemovou oxidací tohoto alkoholu a následnou acetalizací vzniklého aldehydu methanolem je získán 4-(VjV-diisopropylamino)-1,1-dimethoxybutan, který byl použit ve Fischerově reakci pro syntézu haptenu VIL
Antiséra proti jednotlivým drogám byla získána imunizací laboratorních králíků. Metodou enzymové imunoanalýzy byly testovány interakce králičích antisér připravených proti příslušným derivátům tryptaminu. S antiséry vykazujícími nejlepší charakteristiky byly pro imunochemické stanovení optimalizovány a charakterizovány varianty ELISA v nepřímém kompetitivním uspořádání. Byl určen významný analytický parametr tzv. 50% intercept, (I50, viz tabulka). I5o představuje koncentraci analytu, potřebnou k vyvázání 50 % protilátek přítomných vreakčním roztoku, která je nezbytná pro kvalitativní stanovení derivátu tryptaminu v neznámém vzorku. Při imunoanalýze v nepřímém kompetitivním uspořádání soutěží antigen zakotvený na pevném nosiči (imobilizační konjugát) se stanovovaným antigenem ve vzorku o omezený počet vazebných míst na molekulách protilátky. Čím více antigenu obsahuje analyzovaný vzorek, tím méně protilátky se naváže na zakotvený antigen. Nenavázané složky se odstraní a přidá se enzymem značená sekundární protilátka proti navázané protilátce. Detekce je uskutečněna enzymovou reakcí, kdy vzniká barevný produkt, jehož intenzita zbarvení je měřena spektrofotometricky.
Byly získány celkem čtyři antiséra proti třem drogám a to DMT, 5MeO-DMT a DiPT.
Byly získány dvě různé antiséra proti DMT, kdy byl k imunizaci použit konjugát BSA-I a konjugát BSA-II.
Dále bylo získáno antisérum proti 5MeO-DMT, kdy byl k imunizaci použit konjugát BSA-IV A také antisérum proti DiPT, kdy byl k imunizaci použit konjugát BSA-VII.
Získaná antiséra byla testovaná na křížové reaktivity a bylo zjištěno, že velmi záleží na umístění spojovacího můstku, který má vliv na vazbu protilátka - antigen, tedy konformaci pro možnou vazbu.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1: Schéma syntézy haptenů I - II.
Obr. 2: Schéma syntézy haptenu III a IV využívající arylhydraziniové soli nesoucí spojku s karboxylovou funkční skupinou.
Obr. 3. Schéma syntézy haptenů III — VI využívající arylhydraziniové soli nesoucí spojku s esterovou funkční skupinou.
Obr. 4: Schéma syntézy 4-(V,V-dimethylamino)-l,l-dimethoxybutanu.
Obr. 5: Schéma syntézy haptenu VII.
Obr. 6:Schéma syntézy 4-(V,V-diisopropylamino)-l,l-dimethoxybutanu.
Obr. 7:MALDI spektrum prokazující strukturu připraveného konjugátu haptenu I s BSA, detekující, že 13 molekul haptenu I se průměrně navázalo na nosný protein — BSA. Větší pík odpovídá jednou nabitému konjugátu, menší pík odpovídá 2x nabitému konjugátu.
Obr. 8:MALDI spektrum prokazující strukturu připraveného konjugátu haptenu II s BSA, detekující, že 3 molekuly haptenu II se průměrně navázaly na nosný protein - BSA. Větší pík odpovídá jednou nabitému konjugátu, menší pík odpovídá 2x nabitému konjugátu.
Obr. 9:MALDI spektrum prokazující strukturu připraveného konjugátu haptenu III s BSA, detekující, že 31 molekul haptenu III se průměrně navázalo na nosný protein — BSA.
Větší pík odpovídá jednou nabitému konjugátu, menší pík odpovídá 2x nabitému konjugátu.
Obr. 10: MALDI spektrum prokazující strukturu připraveného konjugátu haptenu IV s BSA, detekující, že 28 molekul haptenu IV se průměrně navázalo na nosný protein - BSA. Větší pík odpovídá jednou nabitému konjugátu, menší pík odpovídá 2x nabitému konjugátu.
Obr. 11: MALDI spektrum prokazující strukturu připraveného konjugátu haptenu V s BSA, detekující, že 37 molekul haptenu VII se průměrně navázalo na nosný protein - BSA. Větší pík odpovídá jednou nabitému konjugátu, menší pík odpovídá 2x nabitému konjugátu.
Obr. 12: Schéma přípravy konjugátů haptenů s nosným proteinem - BSA.
Obr. 13: Schématický průběh nepřímé kompetitivní ELISA; A imobilizace konjugátu na stěny jamek mikrotitraění destičky; B aplikace kompetujících složek; C aplikace protilátky značené enzymem peroxidasou (Gar-Ρο); D aplikace substrátu pro peroxidasu; E enzymová reakce peroxidasy se substrátem; F zastavení enzymové reakce kyselinou sírovou; · imobilizační konjugát; O analyt; králičí antisérum; protilátka značená enzymem (Gar-Ρο); O substrát pro peroxidasu.
Obr. 14: Chemická struktura haptenu I - hydrochlorid 4-{A-[2-(7Z7-indol-3-yl)ethyl]-Vmethyl} amino butanové kyseliny
Obr. 15: Chemická struktura haptenu II. - hydrochlorid 4-pV-[2-(5-methoxy-777-indol-3yl)ethyl]-V-methyl]aminobutanové kyseliny
Obr. 16: Chemická struktura haptenu III. - hydrochlorid 2-{3-[2-(A,V-dimethylamino)ethyl]7/7-indol-5-yl} octové kyseliny
Obr. 17: Chemická struktura haptenu IV. - hydrochlorid 2-{3-[2-(2V,V-dimethylamino)ethyl]777-indol-5-yloxy}octové kyseliny
Obr. 18: Chemická struktura haptenu V. - hydrochlorid 4-{3-[2-(A,V-dimethylamino)ethyl]777-indol-5-yl}butanové kyseliny
Obr. 19: Chemická struktura haptenu VI. - hydrochlorid 4-{3-[2-(V,A-dimethylamino)ethyl]777-indol-5-yloxy}butanové kyseliny
Obr. 20. Chemická struktura haptenu VIL - hydrochlorid {3-[2-(VJV-diisopropylamino)ethyl]777-indol-5-yl}octové kyseliny
Obr. 21: Analytická optimalizace ELISY
Obr. 22: Graf znázorňující titrační křivky imobilizačního konjugátu (konjugát haptenu VII s BSA) a antiséra Anti-DiPT.
Obr. 23: Schéma mikrotitrační destičky s koncentracemi
Obr. 24 Graf znázorňující kalibrační křivky pro různé kombinace imunoreagencií
Obr. 25. Schéma mikrotitrační destičky s hodnotami naměřených absorbancí
Obr. 26: Tabuka popisující přehled křížových reaktivit
Obr. 27: Hodnoty křížových reaktivit zbylých konjugátů byly získány obdobně dle příkladu 10, 10a a 11 s příslušným konjugátem
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Syntéza haptenu I
Výchozí indol (2,00 g, 17,1 mmol) byl rozpuštěn v diethyletheru (50 ml) a ke vzniklému roztoku byl po chlazení ledovou lázní přidán po kapkách oxalylchlorid (1,7 ml, 19,6 mmol). Směs byla míchána 1 hodinu při 0 °C a poté 2 hodiny při laboratorní teplotě. Vzniklý barevný precipitát byl oddělen filtrací, promyt diethyletherem a usušen, čímž byl získán 2-(7H-indol-
3-yl)-2-oxoacetylchlorid jako žlutá krystalická látka (3,31 g, 93 %).
2-(777-indol-3-yl)-2-oxoacetylchlorid (3,31 g, 16,0 mmol) byl po částech přidán k vodnému roztoku methylaminu (40 % w/w, 22 ml) ochlazenému ledovou lázní Vzniklá suspenze byla 2 hodiny míchána při 0 °C a poté byl precipitát zfiltrován. Rekrystalizací z THF/Et2O byl získán 2-(777-indol-3-yl)-V-methyl-2-oxoacetamid jako lehce nažloutlá krystalická látka (2,61 g, 81 %).
Roztok 2-(777-indol-3-yl)-V-methyl-2-oxoacetamidu (2,00 g, 9,9 mmol) v THF (200 ml) byl přikapán k suspenzi LÍA1H4 (3,79 g, 100,0 mmol) v THF (100 ml) ochlazené ledovou lázní. Směs byla následně refluxována 7 hodin, poté ochlazena ledovou lázní a opatrně rozložena přídavkem vody (40 ml), 20% roztoku NaOH (40 ml) a poté znovu vody (40 ml). Vzniklý precipitát byl odfiltrován a promyt THF. Filtrát byl odpařen, zbytek znovu rozpuštěn v dichlormethanu (200 ml), vzniklý roztok byl promyt vodou (3 x 200 ml) a solankou (150 ml) a organická fáze vysušena MgSO4. Kolonovou chromatografií (CH2Cl2:MeOH, 5:1 + 1 % NH3 (aq)) byl získán V-methyltryptamin jako bezbarvý sirup (683 mg, 40 %), který stáním asi za jednu hodinu postupně vykrystalizoval.
Ke směsi A-methyltryptaminu (523 mg, 3,0 mmol) a Nal (450 mg, 3,0 mmol) v isopropylalkoholu (30 ml) byl přidán diisopropylethylamin (0,84 ml, 4,8 mmol) a ethyl-4brombutanoát (878 mg, 4,5 mmol) a vzniklý roztok byl zahříván přes noc na 60 °C. Poté byla směs odpařena, zbytek rozpuštěn v dichlormethanu (75 ml) a roztok byl promyt 10% roztokem Na2CO3 (75 ml), vodou (75 ml) a solankou (75 ml). Kolonovou chromatografií (CH2Cl2:MeOH, 10:1 + 1 % NH3 (aq)) byl získán ethyl-4-{A-[2-(///-indol-3-yl)ethyl]-Amethyljaminobutanoát jako světle hnědý sirup (570 mg, 65 %).
Ke směsi ethyl-4-{A-[2-(7tf-indol-3-yl)ethyl]-A-methyl}aminobutanoátu (433 mg, 1,5 mmol) a 40% vodného ethanolu (22 ml) byl přidán NaOH (66 mg, 1,7 mmol) a směs byla míchána přes noc při laboratorní teplotě. Poté byl roztok okyselen 1 mol/1 HC1 na pH = 1 a odpařen. Flash chromatografií na reverzní fázi (MeOH:H2O, gradient 5-100 % MeOH) byl získán hydrochlorid 4-{7V-[2-(777-indol-3-yl)ethyl]-A-methyl}aminobutanové kyseliny (hapten I) jako bezbarvá sklovitá pěna (274 mg, 62 %).
'H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 1,90 (qui, 2H, J = 7,3 Hz, CH2CH2CH2), 2,35 (t, 2H, J=7,3 Hz, NCH2CH2CH2), 2,80 (s, 3H, NCH3), 3,06 - 3,15 (m, 4H, NCH2CH2CH2, ArCH2CH2), 3,21 - 3,31 (m, 2H, ArCH2CH2), 6,97 - 7,04 (m, 1H, ArH), 7,06 - 7,13 (m, 1H, ArH), 7,24 (d, 1H, 2,3 Hz, ArH), 7,34 - 7,39 (m, 1H, ArH), 7,62 (d, 1H, J= Ί,6 Hz, ArH),
10,97 (s br, 1H, NH)
C NMR (75 MHz, DMSO-d6) δ: 20,09; 20,71; 31,51; 40,12; 55,06; 56,07; 110,12; 111,48; 118,22; 118,37; 121,11; 123,05; 126,86; 136,21; 174,08
HRMS (ESI): m/z [M + H]+ vypočteno pro Ci5H20N2O2: 261,15975, nalezeno 261,15979
Příklad la
Syntéza Haptenu II
Hydrochlorid 4-[A-[2-(5-methoxy-7//-indol-3-yl)ethyl]-A-methyl]aminobutanové kyseliny (hapten II) byl připraven z 5-methoxy-777-indolu podle postupu popsaném v Příklad 1 jako bezbarvá sklovitá pěna.
‘Η NMR (300 MHz, CD3OD) δ: 1,86 (qui, 2H, J= 6,2 Hz, CH2CH2CH2), 2,38 (t, 2H, J= 6,2
Hz, NCH2CH2CH2), 2,77 (s, 3H, NCH3), 3,03 - 3,14 (m, 4H, NCH2CH2CH2, ArCH2CH2),
3,20 - 3,29 (m, 2H, ArCH2CH2), 3,80 (s, 3H, OCH3), 6,78 (dd, 1H, Λ = 8,8 Hz, J2 = 2,3 Hz,
ArH), 7,06 (d, 1H, J= 2,3 Hz, ArH), 7,10 (s, 1H, ArH), 7,25 (d, 1H, 8,8 Hz, ArH) 13C NMR (75 MHz, D2O) δ: 19,77; 20,11; 33,89; 39,73; 55,38; 55,78; 56,00; 100,43; 108,32; 111,71; 112,90; 124,80; 126,77; 131,71; 153,00; 180,37
HRMS (ESI): m/z [M + H]+ vypočteno pro Ci6H22N2O3: 291,17032, nalezeno 291,17050
Příklad 2
Syntéza haptenu III
Suspenze výchozí (4-aminofenyl)octové kyseliny (2,27 g, 15,0 mmol) v koncentrované HC1 (30 ml) byla ochlazena na -5 °C. Poté byl po kapkách přidán roztok NaNO2 (Γ,09 g, 15,8 mmol) ve vodě (8 ml). Směs byla míchána 1 hodinu při -5 °C a poté přikapána k roztoku SnCl2.2H2O (10,15 g, 45,0 mmol) v koncentrované HC1 (20 ml) vychlazenému na -20 °C a při této teplotě byla směs míchána další 2,5 hodiny. Vzniklý precipitát byl oddělen filtrací, promyt studeným ethanolem a usušen, čímž byl získán
4-(karboxymethyl)fenylhydrazinium-chlorid jako lehce nažloutlá krystalická látka (2,86 g, 94 %).
Roztok ethyl-4-chlorbutanoátu (12,30 g, 81,7 mmol) v suchém dichlormethanu (125 ml) byl ochlazen na -78 °C a po kapkách byl přidán DIBAL-H (94 ml, 1 mol/1 roztok v hexanu). Směs byla míchána půl hodiny při -78 °C, pak byla nalita k 10% HC1 (160 ml) vychlazené ledovou lázní a celá směs byla 1 hodinu míchána při 0 °C. Poté byla organická fáze oddělena, vodná extrahována dichlormethanem (2 x 100 ml) a spojené organické podíly promyty solankou (300 ml) a usušeny pomocí MgSO4. Roztok byl zkoncentrován na vakuové rotační odparce a ke zbytku přidán methanol (35 ml) okyselený koncentrovanou H2SO4 (několik kapek). Vzniklá směs byla míchána přes noc, naředěna dichlormethanem (125 ml), promyta 10% roztokem NaHCO3 (100 ml), vodou (100 ml) a solankou (100 ml) a organická fáze usušena pomocí MgSO4. Vakuovou destilací byl získán 4-chlor-l,l-dimethoxybutan jako bezbarvá kapalina (9,76 g, 78 %).
4-chlor-l,l-dimethoxybutan (4,86 g, 31,8 mmol) byl přidán k roztoku dimethylaminu ve vodě (30 ml, 40% w/w) a směs byla míchána 15 minut při laboratorní teplotě. Poté byla reakční směs zahřívána na 65 °C po dobu 3,5 hodiny. Po ochlazení na laboratorní teplotu byla směs extrahována dichlormethanem (2 x 50 ml), spojené organické podíly byly promyty 10% roztokem NaHCO3 (100 ml) a solankou (100 ml) a usušeny pomocí MgSCL. Vakuovou destilací byl získán 4-(V, V-dimethylamino)-1,1-dimethoxybutan jako bezbarvá kapalina (4,32 g, 84 %).
Ke 4% H2SO4 (25 ml), která byla nejprve probublávána argonem při 50 °C pro odstranění rozpuštěného kyslíku, byl přidán 4-(karboxymethyl)fenylhydrazinium-chlorid (608 mg, 3,0 mmol) a poté po kapkách 4-(A,V-dimethylamino)-l,l-dimethoxybutan (581 mg,
3,6 mmol). Reakční směs byla zahřívána 3,5 hodiny na 80 °C, poté ochlazena na laboratorní teplotu a reakční směs neutralizována pomocí 25% vodného amoniaku. Po odstranění rozpouštědla byl odparek zbaven většiny anorganických solí promytím EtOH (30 ml) a vzniklý roztok byl odpařen. Poté byl odparek rozpuštěn v 1 mol/1 HC1 (30 ml), roztok odpařen a flash chromatografií na reverzní fázi (MeOH:H2O, gradient 5-100 % MeOH) byl získán hydrochlorid 2-{3-[2-(V,/V-dimethylamino)ethyl]-7/7-indol-5-yl}octové kyseliny (hapten III) (414 mg, 56 %) jako bílá pevná látka.
‘H NMR (300 MHz, CD3OD) δ: 2,87 (s, 6H, N(CH3)2), 3,11 - 3,21 (m, 2H, CH2CH2N), 3,30 - 3,39 (m, 2H, CH2CH2N), 3,66 (s, 2H, CH2COOH), 7,07 (dd, 1H, Ji = 8,5 Hz, J2 = 1,5 Hz, ArH), 7,15 (s, 1H, ArH), 7,30 (d, 1H, J= 8,5 Hz, ArH), 7,51 (s, 1H, ArH) 13C NMR (75 MHz, D2O) δ: 20,03; 41,42; 42,63; 57,50; 108,28; 112,21; 118,67; 123,56; 124,58; 125,63; 126,69; 135,47; 178,25
HRMS (ESI): m/z [M + H]+ vypočteno pro Ci4Hi8N2O2: 247,14410, nalezeno 247,14413
Příklad 3
Syntéza haptenu IV
K roztoku výchozího 4-aminofenolu (10,09 g, 100,0 mmol) v methanolu (250 ml) byl přidán triethylamin (30 ml, 210,0 mmol) a di-terc-butyl-dikarbonát (24 g, 110,0 mmol) a směs byla míchána přes noc při laboratorní teplotě. Poté byl methanol odpařen, zbytek rozdělen mezi ethyl-acetát (250 ml) a 0,25 mol/1 HC1 (100 ml) a organická vrstva promyta
nasyceným roztokem NH4CI (3 x 70 ml). Kolonovou chromatografií (hexamEtOAc, 1:1) byl získán H-(7erc-butoxykarbonyl)-4-aminofenol (19,31 g, 92 %) jako bílá krystalická látka.
K roztoku V-(/erc-butoxykarbonyl)-4-aminofenolu (8,40 g, 40,0 mmol) v acetonu (160 ml) byl přidán ethyl-bromacetát (13,36 g, 80,0 mmol) a pevný K2CO3 (16,58 g, 120,0 mmol) a vzniklá směs byla refluxována po dobu 4 hodin. Poté byla směs ochlazena na laboratorní teplotu, pevný podíl odfiltrován a filtrát odpařen. Kolonovou chromatografií (hexamEtOAc, 4:1) byl získán ethyl-2-{4-[(terc-butoxykarbonyl)amino]fenoxy}acetát (11,29 g, 96 %) jako bezbarvý sirup, který stáním zkrystalizoval.
Suspenze ethyl-2-{4-[(terc-butoxykarbonyl)amino]fenoxy}acetátu XX (11,14 g, 37,7 mmol) v 1 mol/1 HC1 (100 ml) byla míchána při 60 °C po dobu 8 hodin. Poté byl vzniklý roztok ochlazen na laboratorní teplotu a extrahován dichlormethanem (80 ml). Pomocí pevného Na2CO3 bylo pH vodné fáze na hodnotu 4-5 (podle pH papírku). Filtrací a sušením vzniklého precipitátu byla získána 2-(4-aminofenoxy)octová kyselina (5,71 g, 91%) jako lehce nažloutlá krystalická látka.
Suspenze 2-(4-aminofenoxy)octové kyseliny (836 mg, 5,0 mmol) v koncentrované HC1 (10 ml) byla ochlazena na -5 °C. Poté byl po kapkách přidán roztok NaNO2 (363 mg, 5,3 mmol) ve vodě (3 ml). Směs byla míchána 1 hodinu při -5 °C a poté přikapána k roztoku SnCl2.2H2O (3,39 g, 15,0 mmol) v koncentrované HC1 (7 ml) vychlazenému na -20 °C a při této teplotě byla směs míchána další 2,5 hodiny. Vzniklý precipitát byl oddělen filtrací, promyt studeným ethanolem a usušen, čímž byl získán 4-(karboxymethoxy)fenylhydrazinium-chlorid (937 mg, 86 %) jako bílá krystalická látka.
Ke 4% H2SO4 (15 ml), která byla nejprve probublávána argonem při 50 °C pro odstranění rozpuštěného kyslíku, byl přidán 4-(karboxymethoxy)fenylhydraziniumchlorid (328 mg, 1,5 mmol) a poté po kapkách 4-(N,/V-dimethylamino)-1,1 -dimethoxybutan (290 mg, 1,8 mmol). Reakční směs byla zahřívána 3,5 hodiny na 80 °C, poté ochlazena na laboratorní teplotu a neutralizována pomocí koncentrovaného vodného amoniaku. Po odstranění rozpouštědla byl odparek zbaven většiny anorganických solí promytím EtOH (15 ml) a vzniklý roztok byl odpařen. Poté byl odparek rozpuštěn v 1 mol/1 HC1 (15 ml), roztok odpařen a flash chromatografií na reverzní fázi (MeOH:H2O, gradient 5-100 % MeOH) byl získán hydrochlorid 2-{3-[2-(7V,V-dimethylamino)ethyl]-7/7-indol-5-yloxy}octové kyseliny (hapten IV) (209 mg, 53 %) jako bílá pevná látka.
'H NMR (300 MHz, DMSO-d6 + D2O) δ: 2,72 (s, 6H, N(CH3)2), 2,90 - 3,00 (m, 2H, CH2CH2N), 3,08 - 3,18 (m, 2H, CH2CH2N), 4,26 (s, 2H, CH2O), 6,73 (dd, 1H, Ji = 8,8 Hz, J2 = 2,1 Hz, ArH), 6,99 (d, 1H, J= 2,1 Hz, ArH), 7,10 (s, 1H, ArH), 7,21 (d, 1H, J = 8,8 Hz, ArH) ,3C NMR (75 MHz, D2O) δ: 20,11; 42,65; 57,43; 67,69; 100,87; 108,22; 112,26; 112,93; 124,81; 126,63; 131,74; 151,95; 177,21
HRMS (ESI): m/z [M + H]+ vypočteno pro Ci4Hi8N2O3: 263,13902, nalezeno 263,13912
Příklad 4
Syntéza haptenu VI
K roztoku A-(/erc-butoxykarbonyl)-4-aminofenolu (8,40 g, 40,0 mmol) (viz. Příklad 3) v acetonu (160 ml) byl přidán ethyl-4-brombutanoát (15,60 g, 80,0 mmol) a pevný K2CO3 (16,58 g, 120,0 mmol) a vzniklá směs byla refluxována po dobu 6,5 hodiny. Poté byla směs ochlazena na laboratorní teplotu, pevný podíl odfiltrován a filtrát odpařen. Kolonovou chromatografií (hexamEtOAc, 4:1) byl získán ethyl-4-{4-[(fórcbutoxykarbonyl)amino]fenoxy}butanoát (12,35 g, 97 %) jako bílá krystalická látka.
Trifluoroctová kyselina (12,5 ml) byla přidána k roztoku ethyl-4-{4-[(tercbutoxykarbonyl)amino]fenoxy}butanoátu (4,05 g, 12,5 mmol) v dichlormethanu (100 ml). Roztok byl míchán 3 hodiny, poté byl naředěn dalšími 100 ml dichlormethanu a neutralizován 10% roztokem NaHCO3 (200 ml). Vodná fáze byla extrahována dichlormethanem (2x 50 ml), organické podíly byly spojeny a promyty solankou (150 ml). Flash chromatografií (hexamEtOAc, gradient 30 - 50 % EtOAc) byl získán ethyl-4-(4-aminofenoxy)butanoát (2,63 g, 94 %) jako světle hnědý sirup.
Roztok ethyl-4-(4-aminofenoxy)butanoátu (2,63 g, 11,8 mmol) v koncentrované HC1 (12 ml) byl ochlazen na -10 °C a poté byl přidán po kapkách roztok NaNO2 (853 mg, 12,4 mmol) ve vodě (5 ml) tak, aby teplota směsi nepřesáhla 0 °C. Po přídavku byla reakční směs míchána ještě 10 minut a poté byla přidána po kapkách k roztoku SnCl2.2H2O (9,97 g, 44,2 mmol) v koncentrované HC1 (7 ml) ochlazenému na -15 °C tak, aby teplota směsi nepřesáhla -5 °C.
Po kompletním přídavku byla vzniklá suspenze ponechána ohřát na laboratorní teplotu, zfiltrována a pevný podíl byl promyt ledovou vodou a diethyletherem. Usušením byl získán 4[3-(ethoxykarbonyl)propyloxy]fenylhydrazinium-chlorid (1,93 g, 60 %) jako bílá krystalická látka.
Ke 4% roztoku H2SO4 ve směsi ethanohvoda, 5:1 (15 ml), která byla nejprve probublávána argonem pro odstranění rozpuštěného kyslíku, byl přidán 4-[3(ethoxykarbonyl)propyloxy]fenylhydrazinium-chlorid (412 mg, 1,5 mmol) a poté po kapkách 4-CVJV-dimethylamino)- 1,1-dimethoxybutan (290 mg, 1,8 mmol). Reakční směs byla zahřívána 4 hodiny na 85 °C, poté byla ochlazena ledovou lázní a naředěna dichlormethanem (20 ml). Vodná fáze byla obazičtěna 1 mol/1 roztokem NaOH, fáze byly odděleny a vodná ihned extrahována dichlormethanem (2x 20 ml). Organické podíly byly spojeny, sušeny MgSO4 a kolonovou chromatografií (dichlormethan:methanol, 9:1 + 1 % NH3 (aq)) byl získán ethyl-4-{3-[2-(V,V-dimethylamino)ethyl]-/H-indol-5-yloxy}butanoát (98 mg, 21 %) jako světle hnědý viskózní sirup.
Ke směsi ethyl-4-{3-[2-(V-V-dimethylamino)ethyl]-7//-indol-5-yloxy}butanoátu (95 mg, 0,3 mmol) a 20% ethanolu (15 ml) byl přidán 1 mol/1 roztok NaOH (0,36 mmol, 0,36 ml) a reakční směs byla míchána přes noc při laboratorní teplotě. Poté byla směs naředěna vodou (5 ml) a extrahována diethyletherem (2x 10 ml). Vodná fáze byla okyselena pomocí 1 mol/1 HC1 na pH = 1 a odpařena. Flash chromatografií na reverzní fázi (MeOH:H2O, gradient 5 - 100 % MeOH) byl získán hydrochlorid 4-{3-[2-(N,V-dimethylamino)ethyl]-777-indol-5yloxy}butanové kyseliny (hapten VI) (42 mg, 49 %) jako bílá pevná látka.
*H NMR (300 MHz, CD3OD) δ: 2,08 (qui, 2H, CH2CH2CH2, J = 6,7 Hz), 2,39 (t, 2H, CH2COOH, J= 7,2 Hz), 2,74 (s, 6H, N(CH3)2), 2,98 - 3,09 (m, 2H, CH2CH2N), 3,10 - 3,22 (m, 2H, CH2CH2N), 4,04 (t, 2H, CH2O, J = 6,5 Hz), 6,76 (dd, 1H, Λ = 8,8 Hz, J2 = 2,2 Hz, ArH), 7,07 (s, 1H, ArH), 7,12 (d, 1H, J= 2,2 Hz, ArH), 7,22 (d, 1H, 8,8 Hz, ArH) 13C NMR (75 MHz, CD3OD) δ: 22,08; 27,34; 35,02; 43,28; 59,00; 69,54; 102,28; 110,04; 113,18; 113,57; 124,71; 128,53; 133,33; 154,45; 181,83 *» » » 4 < « > ? * • * 9 9 ··« « * · « 1 · t>
• * · · * · « * * ♦ · * ♦ > < * J · · » » · I ί · ÍJ ) β 1 »
Příklad 4a
Syntéza Haptenu V
Hydrochlorid 4-{3-[2-(JV,V-dimethylamino)ethyl]-/H-indol-5-yl}butanové kyseliny (hapten V) byl připraven z ethyl-4-(4-aminofenyl)butanoátu podle postupu popsaném v Příklad 4 jako bílá pevná látka.
'H NMR (300 MHz, CD3OD) δ: 1,95 (qui, 2H, CH2CH2CH2, J = 7,3 Hz), 2,23 (t, 2H, CH2COOH, J = 7,3 Hz), 2,68 - 2,80 (m, 8H, N(CH3)2 + CH2Ar), 3,04 - 3,15 (m, 2H, CH2CH2N), 3,16-3,27 (m, 2H, CH2CH2N), 6,98 (dd, 1H, Jt = 8,5 Hz, J2 = 1,3 Hz, ArH), 7,09 (s, 1H, ArH), 7,25 (d, 1H, J= 8,5 Hz, ArH), 7,39 (s, 1H, ArH) 13C NMR (75 MHz, CD3OD) δ: 22,04; 30,19; 36,96; 38,08; 43,36; 59,14; 109,85; 112,34; 118,38; 123,95; 124,17; 128,29; 134,02; 136,80; 171,57
Příklad 5
Syntéza 4-(A, A-diisopropy lamino)-1,1 -dimethoxybutanu
K roztoku sukcinanhydridu (10,07 g, 100 mmol) v dichlormethanu (300 ml) byl přidán diisopropylamin (21,8 ml, 300 mmol) a vzniklý roztok byl míchán 20 hodin při laboratorní teplotě. Poté byla reakční směs zkoncentrována, byla přidána 1 mol/1 HC1 (250 ml) a vodná fáze byla extrahována dichlormethanem (3x 150 ml). Po sušení MgSO4 a odpaření rozpouštědel byla získána 4-(AjV-diisopropylamino)-4-oxobutanová kyselina (16,50 g, 82 %) jako světle hnědý viskózní olej, který v lednici za dva dny zkrystalizoval.
Suspenze LiAlH4 (6,83 g, 180 mmol) vTHF (300 ml) byla ochlazena ledovou lázní a poté k ní byl přikapán po kapkách roztok 4-(AjV-diisopropylamino)-4-oxobutanová kyseliny (8,05 g, 40 mmol) v THF (150 ml). Po kompletním přídavku byla reakční směs refluxována 5 hodin. Poté byla směs ochlazena ledovou lázní a rozložena opatrným přídavkem vody (40 ml), 20% roztoku NaOH (40 ml) a opět vody (40 ml). Vzniklá suspenze byla zfiltrována a pevný podíl promyt diethyletherem. Filtrát byl odpařen a znovu rozpuštěn v dichlormethanu (250 ml), vzniklý roztok byl promyt vodou (3x 200 ml) a solankou (150 ml) a sušen MgSO4.
Vakuovou destilací byl získán 4-(V,V-diisopropylamino)butanol (4,91 g, 71 %) jako bezbarvá kapalina.
Dimethylsulfoxid (2,56 ml, 36 mmol) byl přidán po kapkách k roztoku oxalylchloridu (2,57 ml, 30 mmol) v suchém dichlormethanu (60 ml) ochlazenému na -55 °C a směs byla míchána ještě dalších 10 minut. Dále byl přidán po kapkách roztok 4-(V,V-diisopropylamino)butanolu (2,60 g, 15 mmol) v dichlormethanu (10 ml) a vzniklá směs byla po přídavku ještě 15 minut míchána při -55 °C. Pak byl ke směsi přikapán triethylamin (8,9 ml, 60 mmol) a reakční směs byla postupně ohřátá na laboratorní teplotu (cca 1 h). Poté byla směs nalita do vody (130 ml), fáze byly odděleny a vodná byla extrahována dichlormethanem (2x 100 ml). Organické podíly byly spojeny, sušeny MgSO4 a odpařeny. Získaný surový intermediát byl rozpuštěn v methanolu (50 ml), k roztoku byla přidána koncentrovaná H2SO4 (2,5 ml) a reakční směs byla míchána přes noc při laboratorní teplotě. Poté byl roztok naředěn dichlormethanem (150 ml) a za chlazení ledovou lázní byl přidán 20% NaOH (100 ml) až do bazického pH (pH = 10). Fáze byly odděleny, vodná byla naředěna vodou (50 ml) a extrahována dichlormethanem (2x 75 ml). Organické fáze byly spojeny, promyty solankou (200 ml) a sušeny MgSO4. Vakuovou destilací byl získán 4-(N,V-di i sopropy lamino)-1,1-dimethoxy butan jako bezbarvá kapalina (1,74 g, 54 %).
b.v. = 51 -55°C (0,24 Torr).
’H NMR (300 MHz, CDC13) δ: 0,98 (d, 12H, 2x CH(CH3)2, J= 6,5 Hz), 1,36-1,51 (m, 2H, CH2CH2N), 1,53 - 1,63 (m, 2H, CHCH2CH2), 2,39 (t, 2H, CH2N, J= 7,3 Hz), 2,99 (sept, 2H, 2x CH(CH3)2, J= 6,5 Hz), 3,31 (s, 6H, 2x OCH3), 4,37 (t, 1H, CH(OCH3)2 J= 5,8 Hz) 13C NMR (75 MHz, CDC13) δ: 20,69; 26,11; 30,28; 44,73; 48,16; 52,59; 104,66
Příklad 6
Příprava haptenu VII
K roztoku výchozí (4-aminofenyl)octové kyseliny (7,56 g, 50 mmol) v ethanolu (80 ml) byla přidána koncentrovaná kyselina sírová (3,7 ml) a směs byla refluxována po dobu 6 hodin. Poté byla směs ochlazena na laboratorní teplotu a ponechána stát přes noc v lednici. Vzniklá suspenze byla zfiltrována a surový pevný produkt usušen. Přečištěním kolonovou chromatografií (hexarr.EtOAc, 2:1), byl získán ethyl-(4-aminofenyl)acetát (6,54 g, 73 %) jako nažloutlá krystalická látka.
Roztok ethyl-(4-aminofenyl)acetátu (3,00 g, 16,7 mmol) v koncentrované HC1 (17 ml) byl ochlazen na -10 °C a poté byl přidán po kapkách roztok NaNO2 (1,20 g, 17,4 mmol) ve vodě (6 ml) tak, aby teplota směsi nepřesáhla 0 °C. Po přídavku byla reakční směs míchána ještě 10 minut a poté byla přidána po kapkách k roztoku SnCl2.2H2O (14,17 g, 62,8 mmol) v koncentrované HC1 (10 ml) ochlazenému na -15 °C tak, aby teplota směsi nepřesáhla -5 °C. Po kompletním přídavku byla vzniklá suspenze ohřátá na laboratorní teplotu, zfiltrována a pevný podíl byl jednou promyt ledovou vodou a diethyletherem. Usušením byl získán 4-[(ethoxykarbonyl)methyl]fenylhydrazinium-chlorid (2,80 g, 73 %) jako bílá krystalická látka.
Ke 4% roztoku H2SO4 ve směsi ethanokvoda, 5:1 (25 ml), která byla nejprve probublávána argonem pro odstranění rozpuštěného kyslíku, byl přidán 4-[(ethoxykarbonyl)methyl]fenylhydrazinium-chlorid (461 mg, 2,0 mmol) a poté po kapkách 4-(JVJV-diisopropylamino)-l,l-dimethoxybutan (522 mg, 2,4 mmol). Reakční směs byla zahřívána 4 hodiny na 90 °C, poté byla ochlazena ledovou lázní a naředěna dichlormethanem (50 ml). Vodná fáze byla obazičtěna 1 mol/1 roztokem NaOH, fáze byly odděleny a vodná byla naředěna vodou (50 ml) a ihned extrahována dichlormethanem (3x 75 ml). Organické podíly byly spojeny, sušeny MgSO4 a kolonovou chromatografií (dichlormethammethanol, 9:1 +1 % NH3 (aq)) byl získán ethyl-{3-[2-(A/V-diisopropylamino)ethyl]-7//-indol-5yl}acetát (337 mg, 51 %) jako nahnědlý viskózní sirup.
Ke směsi ethyl-{3-[2-(M/V-diisopropylamino)ethyl]-77/-mdol-5-yl}acetátu (290 mg, 0,9 mmol) a 20% ethanolu (25 ml) byl přidán 1 mol/1 roztok NaOH (1,0 mmol, 1,0 ml) a reakční směs byla míchána přes noc při laboratorní teplotě. Poté byla směs naředěna vodou (10 ml) a extrahována diethyletherem. Vodná fáze byla okyselena pomocí 1 mol/1 HC1 na pH = 1 a odpařena. Flash chromatografií na reverzní fázi (MeOH:H2O, gradient 5 - 100 % MeOH) byl získán hydrochlorid {3-[2-(V,Vr-diisopropylamino)ethyl]-7H-indol-5-yl}octové kyseliny (hapten VII) (201 mg, 67 %) jako bílá pevná látka.
’H NMR (300 MHz, CD3OD) δ: 1,26 (d, 12H, 2x CH(CH3)2, J- 6,5 Hz), 2,83 - 3,04 (m, 4H, CH2CH2N), 3,48 (sept, 2H, 2x CH(CH3)2, J= 6,5 Hz), 3,57 (s, 2H, CH2COOH), 6,93 (s, 1H,
ArH), 7,11 (dd, 1H, Ji = 8,5 Hz, J2 = 1,5 Hz, ArH), 7,24 (d, 1H, J= 8,5 Hz, ArH), 7,38 (s,
1H, ArH) 13C NMR (75 MHz, CD3OD) δ: 18,12; 24,86; 46,58; 49,17; 55,86; 110,22; 112,32; 119,07; 124,39; 124,53; 128,12; 129,77; 136,74; 180,91
Příklad 7
Konjugace haptenu I s BSA
Hydrochlorid 4-{Ar-[2-(777-indol-3-yl)ethyl]-A-methyl}aminobutanové kyseliny (hapten I) (19,2 mg, 64,7 pmol) byl rozpuštěn v dimethylsulfoxidu (200 pl), k roztoku byl přidán roztok MM’-dicyklohexylkarbodiimidu (17,3 mg, 84,1 pmol) v dimethylsulfoxidu (170 pl) a roztok yV-hydroxysukcinimidu (9,7 mg, 84,1 pmol) v dimethylsulfoxidu (100 pl). Reakční směs byla ponechána stát přes noc v mikrozkumavce při laboratorní teplotě po dobu 2 dnů, během kterých byly vyloučeny krystaly dicyklohexylmočoviny a průběh reakce byl monitorován pomocí TLC.
Reakční roztok byl nasán pipetou a přidán k albuminu. Tento roztok, bez vzniklých krystalů, byl přímo přidán k roztoku hovězího sérového albuminu (51,8 mg, 0,8 pmol) v bikarbonátovém pufru (4 ml). Dále byl přidán roztok dioktylsulfosukcinátu sodného v oktanu (27 ml) a reakční směs byla míchána 18 hodin při laboratorní teplotě. Poté byl modifikovaný protein vysrážen ledovým acetonem (40 ml) a vzniklá suspenze byla centrifugo vána 30 minut při 4 °C (přetížení 1500 x g). Po odlití acetonu byl celý proces znovu opakován za stejných podmínek. Následně byl aceton znovu odlit a konjugát byl usušen na vzduchu. Poté byl konjugát rozpuštěn ve vodě (1,5 ml) a lyofílizován. Analýzou MALDI hmotnostní spektroskopií bylo určeno, že na jednu molekulu BSA je navázáno průměrně 13 molekul haptenu I. Množství navázaných molekul bylo vypočteno odečtením molární hmotnosti BSA od naměřené molární hmotnosti konjugátu (hodnota v maximu píku) a tento rozdíl byl vydělen molární hmotností haptenu po odečtení molární hmotnosti vody.
Příklad 8
Provedení nepřímé nekompetitivní ELISY
Imobilizace konjugátu na stěny jamek mikrotitrační destičky
Zásobní roztok imobilizačního konjugátu (hapten VII-BSA) byl naředěn na koncentraci 6,25 mol/1 v 0,05 mol/1 karbonát-bikarbonátovém pufru, pH 9,6 a pipetován do jamek mikrotitrační destičky v množství 100 μΐ na jamku. Imobilizace probíhala po dobu osmi hodin při laboratorní teplotě. Nenavázaný imobilizační konjugát byl následující den odstraněn pomocí automatické promývačky 4 x 300 μΐ 0,01 mol/1 PBS-Tw (0,01mol/l PBS, pH 7,4 obohacený 0,05% Tweenem).
Aplikace kompetujících složek
Po promytí nenavázaného konjugátu byly do jamek mikrotitrační destičky pipetovány kompetující složky v pořadí 50 μΐ roztoku antigenu (kalibračního standardu diisopropyltryptaminu (koncentrační rozsah 5 000 - 0 ng/ml) nebo vzorku slin)) ředěného v PBS a 50 pl roztoku králičího antiséra ředěného v příslušném pufru (různé pufry pro různé systémy) na koncentraci 1,25 pg/ml. Inkubace probíhala za mírného třepání při laboratorní teplotě, po dobu 1 hodiny. Nezreagované imunoreaktanty byly odstraněny opakovaným promytím jamek 0,01 mol/1 PBS-Tw (4 x 300 pl, promývačka).
Aplikace sekundární protilátky
Ke kvantifikaci navázaných králičích antisér na imobilizační konjugát byla využita protilátka GAR-Po (z angl. Goat Anti-Rabbit - kozí protilátky proti králičí protilátce značené peroxidasou). Protilátka Gar-Ρο byla ředěna 1:10 000 v 0,01 mol/1 PBS-Tw a pipetována v množství 100 pl na jamku. Inkubace probíhala za mírného třepání při laboratorní teplotě, po dobu 1 hodiny. Nenavázané antisérum bylo poté odstraněno opakovaným promytím jamek 0,01 mol/1 PBS-Tw (4 x 300 pl, promývačka).
Aplikace substrátu pro peroxidasu
Do každé jamky bylo následně přidáno 100 pl čerstvě připraveného roztoku substrátu pro peroxidasu (1 mg 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidinu + 1 ml dimethylsulfoxidu + 9 ml 0,05mol/l citrát-fosfátového pufru; pH 5,0 + 2pl 30% H2O2). Enzymová reakce probíhala za mírného třepání při laboratorní teplotě deset minut.
V důsledku enzymové reakce změnila reakční směs barvu. K zastavení enzymové reakce byl použit přídavek 2 mol/1 kyseliny sírové v množství 50 pl na jamku. Absorbance reakční směsi byla měřena v jamkách mikrotitrační destičky při vlnové délce 450 nm. Čím větší byla hodnota absorbance, tím méně analytu bylo navázáno.
Příklad 9
Imunizace laboratorních králíků pro získání Antiséra proti diisopropyltryptaminu (Anti-DiPT)
K imunizaci byl použit konjugát BSA-VII haptenu VII s hovězím sérovým albuminem (BSA).
Konjugát BSA-VII byl rozpuštěn ve sterilním fyziologickém roztoku a emulgoval se se stejným objemem kompletního Freudova adjuvans, byl aplikován subkutánně do tří až čtyř míst na zádech a nohou u králíků. Imunizace byla opakována čtyřikrát ve 4-týdenním období, přičemž jedna dávka obsahovala 0,3 mg imunogenu v 0,3 ml emulze. Finální sérum bylo získáno po 10 dnech od poslední imunizace srdeční punkcí za úplné anestezie. Sebrané antisérum se lyofilizuje a uchovává -28 0 C.
Zásobní roztok antiséra o koncentraci 1 mg/ml byl získán rozpuštěním lyofilizovaného králičího antiséra v 0,01 mol/1 PBS a byly uchovány při teplotě -28 °C. Před použitím byly temperovány při laboratorní teplotě po dobu minimálně patnácti minut.
Obdobně byly získány dvě různé antiséra proti DMT, kdy byl k imunizaci použit konjugát BSA-I a konjugát BSA-II.
Dále bylo získáno antisérum proti 5MeO-DMT, kdy byl k imunizaci použit konjugát BSA-IV.
Příklad 10
Metoda enzymové imunoanalýzy
Byla zjišťována schopnost antisér reagovat s analyty strukturně či funkčně podobnými cílovému analytu. Byly určeny optimální podmínky pro každý pár antiséra a konjugátu. S antiséry vykazujícími nej lepší charakteristiky byly pro imunochemické stanovení optimalizovány a charakterizovány varianty ELISA v nepřímém kompetitivním uspořádání.
Imobilizační konjugát (hapten VII s BSA) o různých koncentracích 50; 25; 12,5; 6,25; 3,125; 0 ng/ml byl nanášen na stěny jamek mikrotitrační destičky. Zásobní koncentrace imobilizačního konjugátu (100 pg/ml) byla ředěna v 0,05 mol/1 karbonát-bikarbonátovém pufru, pH 9,6. Imobilizace probíhala 8 hodin při laboratorní teplotě.
Dále následovalo promytí destiček (4 x 300 μΐ/jamka, 0,01 mol/1 PBS-Tw (0,01 mol/1 PBS, pH 7,4 obohacený 0,05% Tween 20)). Do jamek byl aplikován pufr 0,01 mol/1 PBS (50pl/jamka) a následně králičí antisérum Anti-DiPT (50pl/jamka) o různých koncentracích (10; 5; 2,5; 1,25 a 0 pg/ml) ředěné vPBS-0,1 % BSA (0,01 mol/1 PBS obohacený 0,1% BSA). Inkubace pufru s králičím antisérem probíhala po dobu jedné hodiny. Po ukončení doby inkubace byly destičky znovu promyty (4 x 300pl/jamka) PBS-0,05% Tw.
Do jednotlivých jamek byla dávkována protilátka GAR-Po (100 pl/jamka) ředěná 10 000 x v PBS-0,05% Tw. Znovu probíhala hodinová inkubace za mírného třepání v třepačce. Poté následovalo promytí destiček 4 x 300pl/jamka PBS-0,05%Tw. Do každé jamky bylo následně přidáno 100 pl čerstvě připraveného roztoku substrátu TMB (1 mg 3,3',5,5'Tetramethylbenzidinu+ 1 ml DMSO + 9 ml 0,05 mol/1 citrát-fosfátového pufru; pH 5,0 + 2pl 30% H2O2) (100 pl/jamka). Enzymová reakce probíhala za mírného třepání při laboratorní teplotě deset minut.
V důsledku enzymové reakce změnila reakční směs barvu. K zastavení enzymové reakce byl použit přídavek 2 mol/1 kyseliny sírové v množství 50 pl na jamku. Absorbance reakční směsi byla měřena v jamkách mikrotitrační destičky při vlnové délce 450 nm. Čím větší byla hodnota absorbance, tím méně analytů bylo navázáno.
Z naměřených hodnot absorbancí byly vybrány tři kombinace koncentrací králičího antiséra a imobilizačního konjugátu. Jednalo se o tyto kombinace imobilizačního konjugátu - AntiDiPT: 6,25 ng/ml - 1,25 pg/ml; 3,125 ng/ml - 1,25 pg/ml; 3,125 ng/ml - 2,5 pg/ml. S těmito kombinacemi koncentrací byly sestrojeny kalibrační křivky.
Příklad 10a
Sestrojení kalibračních křivek
Dělají se sedmibodové kalibrační křivky s použitím vybraných kombinací koncentrací imunoreagencií (většinou 4 kalibrační křivky na destičku; standard drogy např. od koncentrace 5 000 ng/ml do 0 ng/ml v PBS).
Imobilizační konjugát (konjugát haptenu VII s BSA) o koncentracích 6,25 a 3,125 ng/ml byl nanesen na stěnu jamek mikrotitrační destičky. Zásobní koncentrace imobilizačního konjugátu (100 pg/ml) byla ředěna v 0,05 mol/1 karbonát-bikarbonátovém pufru, pH 9,6. Imobilizace probíhala 8 hodin při laboratorní teplotě.
Dále následovalo promytí destiček (4 x 300 μΐ/jamka, 0,01 mol/1 PBS-Tw (0,01 mol/1 PBS, pH 7,4 obohacený 0,05% Tween 20)). Do jamek byl aplikován diisopropyltryptaminu (DiPT; zásobní roztok 1 mg/ml v 96% ethanolu); koncentrační řada 5 000; 500; 50; 5; 0,5; 0,05 a 0 ng/ml v PBS (50pl/jamka) a následně králičí antisérum Anti-DiPT (50pl/jamka) o koncentraci 1,25 nebo 2,5 pg/ml, (závislé na koncentračním páru) ředěné v PBS-0,1% BSA (0,01 mol/1 PBS obohacený 0,1% BSA). Inkubace diisopropyltraptaminu s králičí protilátkou probíhala po dobu jedné hodiny. Po ukončení doby inkubace byly destičky znovu promyty (4 x 300pl/jamka) PBS-0,05%Tw.
Do jednotlivých jamek byla dávkována protilátka GAR-Po (100 μΐ/jamka) ředěná 10 000 x v PBS-0,05% Tw. Znovu probíhala hodinová inkubace za mírného třepání v třepačce. Poté následovalo promytí destiček 4 x 300pl/jamka PBS-0,05% Tw. Do každé jamky bylo následně přidáno 100 μΐ čerstvě připraveného roztoku substrátu TMB (1 mg 3,3',5,5'Tetramethylbenzidinu+ 1 ml DMSO + 9 ml 0,05mol/l citrát-fosfátového pufru; pH 5,0 + 2μ1 30% H2O2) (100 μΐ/jamka). Enzymová reakce probíhala za mírného třepání při laboratorní teplotě deset minut.
V důsledku enzymové reakce změnila reakční směs barvu. K zastavení enzymové reakce byl použit přídavek 2 mol/1 kyseliny sírové v množství 50 μΐ na jamku. Absorbance reakční směsi byla měřena v jamkách mikrotitrační destičky při vlnové délce 450 nm. Čím větší byla hodnota absorbance, tím méně analytu bylo navázáno.
Byl vybrán koncentrační pár: imobilizační konjugát 6,25 ng/ml a Anti-DiPT 1,25 pg/ml. Sledovanými parametry kalibračních křivek byly hodnoty I50, maximální hodnota absorbance, minimální hodnota absorbance (vypovídá o nespecifických interakcích, ideální hodnota absorbance do 0,2) a délka lineární křivky. Výše uvedené parametry byly sledovány v celé práci u všech hodnocení týkajících se kalibračních křivek.
Příklad 11
Křížové reaktivity
Křížové interakce se využívají k vyjádření specifity sestavené imunoanalýzy. Prostřednictvím křížových reakcí byla testována schopnost antiséra Anti-DiPT reagovat s analyty strukturně či funkčně podobnými diisopropyltryptaminu. S testovanými analyty byly sestaveny kalibrační křivky. Hodnoty I50 získané z kalibračních křivek byly použity k výpočtu hodnot křížových reaktivit (CR) dle vztahu: C7ř(%) = .)οθ = ^50. ]οθ (5)
C5o% (A) = I50 (A).....koncentrace diisopropyltryptaminu při A50% θ50% (Β) = I50 (Β)......koncentrace křížově interagujícího analytu při A5o%
Byly sestaveny kalibrační křivky, které byly získány naředěním diisopropyltryptaminu a testovaných drog na koncentrace: 5 000; 500; 50; 5; 0,5; 0,05 a 0 ng/ml v PBS. ELISA byla provedena dle standardního postupu (viz. Příklad 8). Získané hodnoty I50 z každé křivky byly použity k výpočtu křížové reaktivity dle vztahu uvedeného výše.
Imobilizační konjugát (konjugát haptenu VII s BSA) o koncentracích 6,25 ng/ml byl nanášen na stěnu jamek mikrotitrační destičky. Zásobní koncentrace imobilizačního konjugátu (100 pg/ml) byla ředěna v 0,05 mol/1 karbonát-bikarbonátovém pufru, pH 9,6. Imobilizace probíhala 8 hodin při laboratorní teplotě.
Dále následovalo promytí destiček (4 x 300 pl/jamka, 0,01 mol/1 PBS-Tw (0,01 mol/1 PBS, pH 7,4 obohacený 0,05% Tween 20)). Do jamek byl aplikován diisopropyltryptaminu a testované analyty (zásobní roztoky 1 mg/ml v 96% ethanolu); koncentrační řada 5 000; 500; 50; 5; 0,5; 0,05 a 0 ng/ml v PBS (50pl/jamka) a následně králičí antisérumAnti-DiPT (50pl/jamka) o koncentraci 1,25 pg/ml, (závislé na koncentračním páru) ředěné v PBS-0,1% BSA (0,01 mol/1 PBS obohacený 0,1% BSA). Inkubace diisopropyltraptaminu s králičí protilátkou probíhala po dobu jedné hodiny. Po ukončení doby inkubace byly destičky znovu promyty (4 x 300 pl/jamka) PBS-0,05% Tw.
Do jednotlivých jamek byla dávkována sekundární protilátka GAR-Po (100 μΙ/jamka) ředěná 10 000 x v PBS-0,05% Tw. Znovu probíhala hodinová inkubace za mírného třepání v třepačce. Poté následovalo promytí destiček 4 x 300 μΙ/jamka PBS-0,05% Tw. Do každé jamky bylo následně přidáno 100 μΐ čerstvě připraveného roztoku substrátu TMB (1 mg 3,3 ,5,5 -Tetramethylbenzidinu+ 1 ml DMSO + 9 ml 0,05mol/l citrát-fosfátového pufru; pH 5,0 + 2μ1 30% H2O2) (100 μΙ/jamka). Enzymová reakce probíhala za mírného třepání při laboratorní teplotě deset minut.
V důsledku enzymové reakce změnila reakční směs barvu. K zastavení enzymové reakce byl použit přídavek 2 mol/1 kyseliny sírové v množství 50 μΐ na jamku. Absorbance reakční směsi byla měřena v jamkách mikrotitrační destičky při vlnové délce 450 nm. Čím větší byla hodnota absorbance, tím méně analytu bylo navázáno.
Příklad 12
Analýza uměle kontaminovaného vzorku
Analytické vlastnosti sestavené imunoanalýzy byly testovány pomocí uměle kontaminovaných vzorků syntetických slin s cílovým analytem.
Vzorek slin byl uměle kontaminován diisopropyltryptaminem na koncentraci 20; 10 a 5 ng/ml. Pro vlastní test byla připravena kalibrační křivka dimethyltryptaminu (koncentrační řada 5 000, 500; 50; 5; 0,5; 0,05 a 0 ng/ml. Dále byly do mikrotitrační destičky aplikovány uměle kontaminované vzorky slin, které byly předem ředěny 10 x k odstranění vlivu matrice. ELISA byla provedena dle standardního postupu (viz. Příklad 8). Z kalibrační křivky byly pro jednotlivé naměřené hodnoty absorbancí odečteny odpovídající koncentrace v ředěných vzorcích a v závislosti na ředění přepočteny na koncentraci v uměle kontaminovaném vzorku slin.
K vyhodnocení analýzy vzorků byla použita veličina výtěžnost, která byla vypočítána ze vztahu:
(%)=^.ioo c
Cp průměrná hodnota koncentrace z jednotlivých měření vzorku vyvinutou ELISA c hodnota koncentrace v kontaminovaném vzorku
Pro všechny uměle kontaminované vzorky byla výtěžnost metody vypočtena v rozsahu 89 112 %. Reprodukovatelnost metody, vyjádřená jako relativní směrodatná odchylka, byla vypočtena v rozsahu 6-18 %.
Průmyslová využitelnost
Aplikace v imunoanalytických metodách stanovení derivátů tryptaminu ve formátech nepřímé ELISA, LFIA, FIA a dalších, které využívají kompetice mezi haptenem - některým z připravených derivátů tryptaminu, a analytem - psychoaktivní látkou přítomnou ve vzorku, o vazebná místa protilátky.
Claims (10)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Derivát tryptaminu o struktuřeΝ'kde R je vybráno ze skupiny CH2COOH, OCH2COOH, O(CH2)3COOH, O(CH2)3COOH.
- 2. Derivát tryptaminu o struktuřekde R je H, OCH3.
- 3. Derivát tryptaminu podle nároku 2 o názvu hydrochlorid 4-{N-[2-(lH-indol-3yl)ethyl]-N-methyl}aminobutanové kyseliny a struktuře
- 4. Derivát tryptaminu podle nároku 2 o názvu hydrochlorid 4-[N-[2-(5-methoxy-lHindol-3-yl)ethyl]-N-methyl]aminobutanové kyseliny a struktuře
- 5. Derivát tryptaminu podle nároku 1 o názvu hydrochlorid 2-{3-[2-(N,Ndimethylamino)ethyl]- lH-indol-5-yl}octové kyseliny a struktuře
- 6. Derivát tryptaminu podle nároku 1 o názvu hydrochlorid 2-{3-[2-(N,Ndimethylamino)ethyl]- lH-indol-5-yloxy} octové kyseliny a struktuře
- 7. Derivát tryptaminu podle nároku 1 o názvu hydrochlorid 4-{3-[2-(N,Ndimethylamino)ethyl]- lH-indol-5-yl}butanové kyseliny a strukruře9 * (KM
- 8. Derivát tryptaminů podle nároku 1 o názvu hydrochlorid 4-{3-[2-(N,NÍH-indol-5-yloxy}butanové kyseliny a struktuře dimethylamino)ethyl] -
- 9. Derivát tryptaminů o názvu hydrochlorid {3-[2-(N,N-diisopropylamino)ethyl]- 1Hindol-5-yl}octové kyseliny a struktuře
- 10. Použití derivátu tryptaminů podle nároku 1 nebo 2 nebo 9 pro přípravu prostředku pro detekci tryptaminových drog.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2015-962A CZ307719B6 (cs) | 2015-12-31 | 2015-12-31 | Použití derivátu tryptaminu |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2015-962A CZ307719B6 (cs) | 2015-12-31 | 2015-12-31 | Použití derivátu tryptaminu |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2015962A3 true CZ2015962A3 (cs) | 2017-07-07 |
| CZ307719B6 CZ307719B6 (cs) | 2019-03-20 |
Family
ID=59249273
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2015-962A CZ307719B6 (cs) | 2015-12-31 | 2015-12-31 | Použití derivátu tryptaminu |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ307719B6 (cs) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11724985B2 (en) | 2020-05-19 | 2023-08-15 | Cybin Irl Limited | Deuterated tryptamine derivatives and methods of use |
| CN116693443A (zh) * | 2023-06-02 | 2023-09-05 | 杭州同舟生物技术有限公司 | 一种二甲基色胺人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用 |
| CN117164470A (zh) * | 2023-08-09 | 2023-12-05 | 长沙普济生物科技股份有限公司 | 一种高纯度Nε-月桂酰赖氨酸的合成方法 |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20220137083A (ko) | 2020-02-04 | 2022-10-11 | 마인드셋 파마 인크. | Cns 장애의 치료를 위한 세로토닌성 사이키델릭 작용제로서의 실로신 유도체 |
| CA3201913A1 (en) * | 2020-12-09 | 2022-06-16 | Andrew R. Chadeayne | Dialkyl trytamines and their therapeutic uses |
| WO2022140844A1 (en) | 2020-12-31 | 2022-07-07 | 1280225 B.C. Ltd. | Method of synthesizing indole compounds |
| EP4486448A1 (en) | 2022-03-04 | 2025-01-08 | Reset Pharmaceuticals, Inc. | Co-crystals or salts comprising psilocin |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8614287D0 (en) * | 1986-06-12 | 1986-07-16 | Glaxo Group Ltd | Chemical compounds |
| CZ28938U1 (cs) * | 2015-09-14 | 2015-12-07 | Vysoká škola chemicko-technologická v Praze | Imunochromatografický test dimethyltryptaminových drog |
-
2015
- 2015-12-31 CZ CZ2015-962A patent/CZ307719B6/cs not_active IP Right Cessation
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11724985B2 (en) | 2020-05-19 | 2023-08-15 | Cybin Irl Limited | Deuterated tryptamine derivatives and methods of use |
| US11746088B2 (en) | 2020-05-19 | 2023-09-05 | Cybin Irl Limited | Deuterated tryptamine derivatives and methods of use |
| US11834410B2 (en) | 2020-05-19 | 2023-12-05 | Cybin Irl Limited | Deuterated tryptamine derivatives and methods of use |
| US11958807B2 (en) | 2020-05-19 | 2024-04-16 | Cybin Irl Limited | Deuterated tryptamine derivatives and methods of use |
| US12110272B2 (en) | 2020-05-19 | 2024-10-08 | Cybin Irl Limited | Deuterated tryptamine derivatives and methods of use |
| US12240813B2 (en) | 2020-05-19 | 2025-03-04 | Cybin Irl Limited | Deuterated tryptamine derivatives and methods of use |
| US12291499B2 (en) | 2020-05-19 | 2025-05-06 | Cybin Irl Limited | Deuterated tryptamine derivatives and methods of use |
| CN116693443A (zh) * | 2023-06-02 | 2023-09-05 | 杭州同舟生物技术有限公司 | 一种二甲基色胺人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用 |
| CN117164470A (zh) * | 2023-08-09 | 2023-12-05 | 长沙普济生物科技股份有限公司 | 一种高纯度Nε-月桂酰赖氨酸的合成方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ307719B6 (cs) | 2019-03-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ2015962A3 (cs) | Derivát tryptaminu, způsob jeho přípravy a použití | |
| KR100752536B1 (ko) | 네오니코티닐 살충제에 대한 면역분석법 | |
| FI90542C (fi) | Kemiluminoivia akridiinijohdannaisia, niiden valmistus ja niiden käyttö luminesenssi-immunoanalyyseissä | |
| BRPI0916366B1 (pt) | Anticorpo que se liga às variantes de peptídeos abeta, sua composição, seu uso, seu kit de diagnóstico, e linhagem celular de hibridoma | |
| US5952187A (en) | Topiramate immunoassay | |
| US20230417779A1 (en) | Pregabalin Immunoassays | |
| CN109061169B (zh) | 一种检测啶虫脒的酶联免疫试剂盒及其应用 | |
| CN106324240B (zh) | 检测毒死蜱的酶联免疫试剂盒及其应用 | |
| JP3190730B2 (ja) | 新規標識薬物ハプテン類似体を用いるイムノアッセイ | |
| CN105572348B (zh) | 检测三唑醇的酶联免疫试剂盒及其应用 | |
| JP2008518234A (ja) | ラモトリジンの免疫アッセイ | |
| US8404436B1 (en) | Methods of identifying modulators of GPR17 | |
| CN106674138A (zh) | 一种戊唑醇新型半抗原及其合成方法和应用 | |
| US5614419A (en) | Reagents and methods for the quantification of amitriptyline or nortriptyline in biological fluids | |
| CN109061171A (zh) | 一种检测氟节胺的酶联免疫试剂盒及其应用 | |
| CN109324187B (zh) | 一种检测甲霜灵的酶联免疫试剂盒及其应用 | |
| JP2005247822A (ja) | コプラナーｐｃｂハプテン、コプラナーｐｃｂに対する抗体およびそれを用いる免疫学的測定方法 | |
| US5340750A (en) | Reagents and methods for the quantification of imipramine or desipramine in biological fluids | |
| CN105823872B (zh) | 检测抑芽丹的酶联免疫试剂盒及其应用 | |
| CN103454429B (zh) | 罗丹明b的酶联免疫试剂盒及其组建和检测方法 | |
| CZ305780B6 (cs) | Derivát syntetického kanabinoidu, způsob jeho přípravy a použití | |
| CN108709992B (zh) | 一种检测黄樟素的酶联免疫试剂盒及其应用 | |
| JPH05172814A (ja) | イムノアッセイ用標識薬物ハプテン類似体 | |
| CZ306547B6 (cs) | Derivát syntetického kanabinoidu, způsob jeho přípravy a použití | |
| Zhang et al. | Development of a Distance Effect-Based Ultrasensitive Sandwich Immunoassays for Detecting Small Molecule Semicarbazide |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20211231 |