CZ306547B6 - Derivát syntetického kanabinoidu, způsob jeho přípravy a použití - Google Patents

Abstract

Vynález se týká nově připravených derivátů syntetických kanabinoidů, součástí jejichž struktury je krátký spojovací můstek nesoucí karboxylovou funkční skupinu, a chemických postupů vedoucích k přípravě takovýchto sloučenin. Tyto deriváty syntetických kanabinoidů lze s výhodou využít pro konjugaci s fluorescentní značkou, která by následně umožnila vizualizaci interakcí takto značených ligandů s kanabinoidními receptory, či pro přípravu imunogenů konjugací s nosným proteinem. Polyklonální králičí protilátky získané z imunizovaných laboratorních zvířat lze uplatnit při vývoji rychlých, uživatelsky příjemných imunochemických testů formátu LFIA (Lateral-Flow Immunochromatographic Assay).

Description

Derivát syntetického kanabinoidů, způsob jeho přípravy a použití

Oblast techniky

Vynález se týká nově připravených derivátů syntetických kanabinoidů, součástí jejichž struktury je krátký spojovací můstek nesoucí karboxylovou funkční skupinu, a chemických postupů vedoucích k přípravě takovýchto sloučenin. Tyto deriváty syntetických kanabinoidů lze s výhodou využít pro konjugaci s fluorescentní značkou, která by následně umožnila vizualizaci interakcí takto značených ligandů s kanabinoidními receptory, či pro přípravu imunogenů konjugací s nosným proteinem. Polyklonální králičí protilátky získané z imunizovaných laboratorních zvířat lze uplatnit při vývoji rychlých, uživatelsky příjemných imunochemických testů formátu LFIA (Lateral-Flow Immunochromatographic Assay).

Dosavadní stav techniky

Na drogové scéně se v posledních letech kromě tradičních drog (kokain, opiáty, amfetaminy, kanabinoidy) objevují také nové syntetické drogy (NSD). Důvodem je snaha výrobců a distributorů obejít stávající legislativní normy, v nichž jsou omamné a psychotropní látky vymezeny obvykle taxativně. Na ilegální trh se tak dostávají analoga známých látek s psychotropním potenciálem, která dosud nejsou uvedena na seznamu ilegálních látek, nebo jejichž prekurzory nejsou monitorovanými substancemi. Hlavní nebezpečí spojené s užíváním těchto nových syntetických drog (NSD) tkví v nedostatku informací o jejich farmakokinetickém a toxikologickém chování, neboť tyto látky neprošly žádnými klinickými testy.

Početně nejbohatší a ze strukturního hlediska značně rozmanitou skupinou NSD jsou syntetické kanabinoidy. Tyto látky se váží na kanabinoidní receptory, což jsou s G-proteinem spřažené transmembránové receptory. Podtyp receptoru CBÍ se nachází především v centrální nervové soustavě, podtyp CB2 je exprimován zejména v buňkách imunitního systému. Endokanabinoidní systém dodnes nebyl zcela pochopen. Je však známo, že endogenní kanabinoidy, jejichž nejznámějším zástupcem je anandamid, ovlivňují cítění bolesti, náladu, paměť, ale i chuť k jídlu. Ke kanabinoidním receptorům se váže též celá řada exogenních sloučenin, k nejvýznamnějším patří aktivní složky konopí A9-tetrahydrokanabinol (THC) a kanabidiol (CBD), které jsou parciálními agonisty obou zmíněných podtypů receptorů. Syntetické kanabinoidy jsou plní agonisté kanabinoidních receptorů s mnohem dramatičtějšími psychickými účinky. Zaznamenána byla celá řada intoxikací, které měly v některých případech i fatální důsledky. Popsány jsou i případy indukované psychózy. (Banister SD, Wilkinson SM, Longworth M, Stuart J, Apetz N, English K, Brooker L, Goebel C, Hibbs DE, Glass M, Connor M, McGregor IS, Kassiou M. The Synthesis and Pharmacological Evaluation of Adamantane-Derived Indoles: Cannabimimetic Drugs of Abuse. Chem. Neurosci. 2013;4:1081-92.)

Tradiční drogy lze detekovat pomocí komerčních imunochemických testů založených na selektivní reakci protilátky a antigenu, kterým je v tomto případě hledaná omamná či psychotropní látka. K detekci NSD však tyto testy použít nelze. (Páleníček T, Kuchař M. Je možná detekce a identifikace nových syntetických drog (NSD) pomocí orientačních testů? Adiktologie 2011; 11:208-14.) Odhalit intoxikaci osob novými syntetickými drogami je možné pomocí metod klinické biochemie, a to zejména analýzou pomocí plynové chromatografíe s hmotnostním detektorem (GCMS), což je poměrně náročné jak na přístroje, tak na odbornost obsluhy. Sestavení přístrojově nenáročných, jednoduchých, uživatelsky příjemných imunochemických testů na principu LFIA (Lateral Flow Immunochromatographic Assay) by umožňovalo daleko rychlejší a levnější orientační detekci látek v biologickém materiálu ve zdravotnictví nebo při dopravních kontrolách řidičů.

- 1 CZ 306547 B6

Přestože existuje mnoho evaluovaných imunochemických testů pro stanovení tradičních kanabinoidů, možnosti imunoanalýzy syntetických kanabinoidů jsou omezené. V literatuře jsou popsány příklady metod pro ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) stanovení JWH-018 a JWH250 v krvi, krevním séru a moči (Amtson A, Ofsa B, Lancaster D, Simon JR, McMullin M, Logan B. Validation of a Novel Immunoassay for the Detection of Synthetic Cannabinoids and Metabolites in Urine Specimens. J. Anal. Toxicol. 2013; 37:284-90.), JWH-200 ve slinách (Rodrigues WC, Catbagan P, Rana S, Wang G, Moore C. Detection of Synthetic Cannabinoids in Oral Fluid Using ELISA and LC—MS-MS. J. Anal. Toxicol. 2013; 37:526-33.) a HEIA (Homogenous Enzyme ImmunoAssay) stanovení JWH-018 A-pentanové kyseliny, což je významný metabolit JWH-018, v moči (Bames AJ, Young S, Spinelli E, Martin TM, Klette KL, Huestis MA. Evaluation of a homogenous enzyme immunoassay for the detection of synthetic cannabinoids in urine. Forensic Sci Int. 2014;241:27-34.).

Jako nosičové proteiny se používají hovězí sérový albumin (BSA), hovězí thyroglobumin (BTG), popř. další proteiny vhodných vlastností. Konjugáty se připravují reakcí aktivované formy haptenu (reaktivní anhydridy či estery) s ε-aminoskupinami lysinových zbytků proteinu za vytvoření amidových vazeb. Konjugací se dosáhne statisticky náhodného obsazení lysylů přítomných v proteinu.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu jsou nové deriváty syntetických kanabinoidů. Tyto deriváty nesou krátký spojovací můstek s karboxylovou skupinou. Spojovací můstek je využitelný pro připojení fluorescentní značky, která následně umožní vizualizaci interakcí kanabinoidů s kanabinoidními receptory, či je karboxylová skupina spojovacího můstku využitelná pro přípravu imunogenů konjugací s nosným proteinem. Z laboratorních zvířat imunizovaných těmito imunogeny lze získat polyklonální králičí protilátky a uplatnit je při vývoji imunoanalytických metod stanovení syntetických kanabinoidů.

Spojovací můstek je připojen přes kyslík v poloze 4 benzenového jádra l-alkyl-3-benzoylindolů nebo v poloze 4 naftalenu u l-alkyl-3-naftoylindolů či přímo na dusíku 1 -alkyl-7/7-indol-3karboxamidů.

Sloučeniny obecného vzorce II a IV se připraví tak, že se benzylem chráněná 4-hydroxyaren-lkarboxylová kyselina nejprve převede na příslušný chlorid. Ten slouží jako acylační činidlo při Friedelově-Craftsově reakci s ^-substituovaným indolem v přítomnosti Lewisovy kyseliny. Jako Lewisova kyselina je s výhodou použit zirkonium tetrachlorid.

Hydroxylová skupina je odchráněna debenzylací na palladiovém katalyzátoru. č>-alkylací ethylesterem ω-bromalkanové kyseliny a následnou bazickou hydrolýzou je do molekuly zaveden spojovací můstek nesoucí karboxylovou funkční skupinu.

Připravené deriváty syntetických kanabinoidů lze s výhodou využít pro konjugaci s fluorescentní značkou, která by následně umožnila vizualizaci interakcí takto značených ligandů s kanabinoidními receptory, či pro přípravu imunogenů konjugací s nosným proteinem. Polyklonální králičí protilátky získané z imunizovaných laboratorních zvířat lze uplatnit při vývoji rychlých, uživatelsky příjemných imunochemických testů formátu LFIA (Lateral-Flow Immunochromatographic Assay).

Pro získání protilátek proti těmto syntetickým kanabinoidům, tedy nízkomolekulámím látkám (haptenům), bylo nutné připojit je k nosnému proteinu. Pro tyto účely byl jako vhodný nosný protein vybrán hovězí sérový albumin (BSA). Při tvorbě konjugátů byla využita metoda aktivovaného esteru, při níž je hapten reakcí s AJV’-dicyklohexylkarbodiimidem (DCC) a A-hydroxysukcinimidem (NHS) nejprve převeden na nestabilní derivát O-acylisomočoviny, a poté na aktivovaný

-2CZ 306547 B6 ester. Vlastní konjugační reakce, při níž dochází k tvorbě amidové vazby mezi karboxylovou skupinou haptenu a primární aminoskupinou aminokyseliny lysinu v BSA, pak probíhala v reverzním micelámím prostředí anionaktivního tenzidu.

Způsob přípravy derivátů syntetických kanabinoidů

Sloučeniny obecného vzorce II a IV se připraví tak, že se benzylem chráněná 4-hydroxyaren-lkarboxylová kyselina nejprve převede na příslušný chlorid. Ten slouží jako acylační činidlo při Friedelově-Craftsově reakci s /V-substituovaným indolem v přítomnosti zirkonium tetrachloridu jako Lewisovy kyseliny. Hydroxylová skupina je odchráněna debenzylací na palladiovém katalyzátoru. O-alkylací ethyl-esterem ω-bromalkanové kyseliny a následnou bazickou hydrolýzou je do molekuly zaveden spojovací můstek nesoucí karboxylovou funkční skupinu. Produkty, získané ve vysokém výtěžku, je proto možné konjugovat s ε-aminoskupinami lysinových zbytků proteinu za vytvoření amidových vazeb.

Zatímco 4-benzyloxybenzoová kyselina byla připravena standardním, v literatuře popsaným způsobem, pro přípravu 4-benzyloxynaftalen-l*karboxylové kyseliny je představena inovativní syntetická cesta. V molekule l-benzyloxy-4-bromnaftalenu je brom nejprve nahrazen nitrilovou funkční skupinou při Rosenmundově - von Braunově reakci. Redukce získaného nitrilu diisobutylaluminium hydridem a zpětná oxidace aldehydu oxidem stříbrným, připravovaným in situ z dusičnanu stříbrného a hydroxidu sodného, umožní zavést do molekuly karboxylovou funkční skupinu s vyšším výtěžkem, než publikovaný postup založený na lithiaci a následné reakci organokovového species s oxidem uhličitým, přestože je reakční sekvence delší.

Metodou enzymové imunoanalýzy byly testovány interakce polyklonálních králičích protilátek připravených proti příslušným syntetickým kanabinoidům. S protilátkami vykazujícími nejlepší charakteristiky byly pro imunochemické stanovení optimalizovány a charakterizovány varianty ELISA v nepřímém kompetitivním uspořádání. Byl určen významný analytický parametr tzv. 50% intercept, (I_50j viz tabulka). I₅₀ představuje koncentraci analytu, potřebnou k vyvázání 50 % protilátek přítomných v reakčním roztoku, která je nezbytná pro kvalitativní stanovení syntetického kanabinoidů v neznámém vzorku.

Při imunoanalýze v nepřímém kompetitivním uspořádání soutěží antigen zakotvený na pevném nosiči (imobilizační konjugát) se stanovovaným antigenem ve vzorku o omezený počet vazebných míst na molekulách protilátky. Čím více antigenu obsahuje analyzovaný vzorek, tím méně protilátky se naváže na zakotvený antigen. Nenavázané složky se odstraní a přidá se enzymem značená sekundární protilátka proti navázané protilátce. Detekce je uskutečněna enzymovou reakcí, kdy vzniká barevný produkt, jehož intenzita zbarvení je měřena spektrofotometricky.

Byly připraveny tyto hapteny:

Hapten II:

o názvu 2-{4-[l-(2-(4-morfolino)ethyl)-777-indol-3-ylkarbonyl]naftalen-l-yloxy}octové kyseliny a struktuře II:

-3 CZ 306547 B6

a hapten IV:

o názvu 2-{4-[l-(2-(4-morfolino)ethyl)-7Z7-indol-3-ylkarbonyl]benzyloxy}octové kyseliny a struktuře IV:

Objasnění výkresů

Obr. 1: Schéma syntézy haptenu II

Obr.2: Schéma syntézy haptenu IV

Obr.3: Schéma provedené konjugace hapten s BSA

Obr.4: MALDI spektrum prokazující strukturu připraveného konjugátu haptenu II s BSA, detekující, že 20 molekul haptenu II se průměrně navázalo na nosný protein - BSA

Obr.5: MALDI spektrum prokazující strukturu připraveného konjugátu haptenu IV s BSA, detekující, že 20 molekul haptenu IV se průměrně navázalo na nosný protein - BSA

Obr.6: Schématický průběh nepřímé kompetitivní ELISA; A imobilizace konjugátu na stěny jamek mikrotitraění destičky; B aplikace kompetujících složek; C aplikace sekundární protilátky značené enzymem (peroxidasou); D aplikace substrátu pro peroxidasu; E enzymová reakce peroxidasy se substrátem; F zastavení enzymové reakce kyselinou sírovou · imobilizační konjugát ©cílový analyt ve vzorku; । primární protilátka;^ sekundární protilátka značená enzymem © substrát pro peroxidasu.

-4CZ 306547 B6

Obr.7: Přehled použitých konjugátů a protilátek při vývoji metod ELISA; BSA: hovězí sérový albumin z ang. bovine serum albumin; specifická protilátka: protilátka proti imunogenu příslušného kanabinoidu s BSA

Obr.8: Chemická struktura haptenu II

Obr.9: Chemická struktura haptenu IV

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Syntéza haptenu II

Výchozí naft-l-ol (1442 mg, 10,00 mmol) byl rozpuštěn v acetonitrilu (40 mL), k roztoku byl přisypán bezvodý uhličitan draselný (2764 mg, 20.00 mmol). Po 30 minutách byl přidán benzylbromid (1784 pL, 15,00 mmol), reakční směs byla zahřáta k varu a míchána 16 hodin. Po zchladnutí reakční směsi na laboratorní teplotu byl přidán ethyl-acetát, organická fáze byla postupně promyta 2 mol/1 kyselinou chlorovodíkovou, vodou a nasyceným roztokem chloridu sodného, poté byla vysušena pomocí síranu sodného. Rozpouštědla byla odpařena a produkt přečištěn sloupcovou chromatografií (hexan-dichlormethan 19/1). Byl izolován produkt 1-benzyloxynaftalen (2239 mg, 9,56 mmol) ve výtěžku 96 %.

1-Benzyloxynaftalen (1531 mg, 6,53 mmol) byl rozpuštěn v acetonitrilu (35 mL), roztok byl pomocí ledové lázně ochlazen na 0 °C a v několika podílech byl přidán jV-bromsukcinimid (1163 mg, 6,53 mmol). Reakční směs byla 3 hodiny míchána při 0 °C. Po ohřátí na laboratorní teplotu byl přidán ethyl-acetát a organická fáze byla třikrát promyta vodou. Vodná fáze byla zpětně extrahována dvěma podíly ethyl-acetátu a spojené organické fáze byly sušeny pomocí síranu hořečnatého. Rozpouštědla byla odpařena a produkt přečištěn sloupcovou chromatografií (hexandichlormethan 19/1). Byl izolován produkt 1 -benzyloxy-4-bromnaftalen (1885 mg, 6,02 mmol) ve výtěžku 92 %.

1-Benzyloxy-4-bromnaftalen (1404 mg, 4,48 mmol) byl rozpuštěn v A,A-dimethylformamidu (150 mL) a k roztoku byl přidán kyanid měďný (605 mg, 6,72 mmol). Reakční směs byla po dobu 24 hodin zahřívána k varu na elektrickém topném hnízdě. Poté byl přisypán další podíl kyanidu měďného (121 mg, 1,35 mmol) a reakční směs byla zahřívána k varu dalších 21 hodin. Rozpouštědlo bylo odpařeno a odparek extrahován mezi ethyl-acetát a vodu. Nerozpuštěný podíl byl odfiltrován a suspendován ve vodném roztoku amoniaku. Amoniakální roztok byl protřepán s dvěma podíly ethyl-acetátu, spojené organické fáze byly promyty 1 mol/1 kyselinou chlorovodíkovou a vodou a poté vysušeny pomocí síranu hořečnatého. Ethyl-acetát byl odpařen a produkt přečištěn sloupcovou chromatografií (hexan-ethyl-acetát 20/1). Byl izolován produkt 4-benzyloxynaftalen-l-karbonitril (1013 mg, 3,91 mmol) ve výtěžku 87 %.

4-Benzyloxynaftalen-l-karbonitril (1000 mg, 3,86 mmol) byl rozpuštěn v suchém tetrahydrofuranu (60 mL), roztok byl pomocí ledové lázně ochlazen na 0 °C a stříkačkou byl přikapán 1 mol/1 roztoku diisobutylaluminium hydridu v hexanu (7,7 mL, 7,70 mmol). Reakční směs byla ponechána míchat přes noc za laboratorní teploty. Přebytečný diisobutylaluminium hydrid byl rozložen vodou. Vodná fáze byla okyselena 2 mol/1 kyselinou chlorovodíkovou až na pH 1 a promyta dvěma podíly dichlormethanu. Organické fáze byly spojeny a vysušeny pomocí síranu hořečnatého. Rozpouštědla byla odpařena a produkt přečištěn sloupcovou chromatografií (hexanethyl-acetát 9/1). Byl izolován produkt 4-benzyloxynaftalen-1-karbaldehyd (762 mg, 2,91 mmol) ve výtěžku 75 %.

-5CZ 306547 B6

4-Benzyloxynaftalen-l-karbaldehyd (1544 mg, 5,89 mmol) byl rozpuštěn v ethanolu (80 mL) při 60 °C, k roztoku byl přidán dusičnan stříbrný (4002 mg, 23,56 mmol) a stříkačkou byl postupně přikapáván roztok hydroxidu sodného (942 mg, 23,56 mmol) ve směsi ethanolu s vodou. Po přidání veškerého hydroxidu byla reakční směs míchána a zahřívána po dobu 24 hodin. Přebytečný oxid stříbrný i vyloučené stříbro byly odfiltrovány a promyty větším množstvím vody. Filtrát byl okyselen 2 mol/1 kyseliny chlorovodíkové až na pH 1 a promyt dvěma podíly diethyletheru. Organické fáze byly spojeny a vysušeny pomocí síranu hořečnatého. Rozpouštědla byla odpařena a získaný surový produkt byl triturován chloroformem. Žádaný produkt 4-benzyloxynaftalen-1 karboxylová kyselina (1409 mg, 5,07 mmol) byl izolován ve výtěžku 86 %.

4-Benzyloxynaftalen-l-karboxylová kyselina (1200 mg, 4,30 mmol) byla rozpuštěna v suchém dichlormethanu (20 mL), k roztoku bylo přidáno několik kapek Λζ/V-dimethylformamidu a stříkačkou byl přikapán oxalylchlorid (482 pL, 5,60 mmol). Reakce probíhala 3 hodiny při laboratorní teplotě. Byl přidán toluen (10 mL), přebytečný oxalylchlorid a rozpouštědla byly odpařeny. Surový 4-benzyloxynaftalen-1-karbonylchlorid (382 mg, 1,29 mmol) byl rozpuštěn v suchém dichlormethanu (25 mL) a stříkačkou byl přikapán roztok l-[2-(morfolin-4-yl)ethyl]777-indolu (385 mg, 1,67 mmol) v suchém dichlormethanu (5 mL) při teplotě -10 °C. K reakční směsi byl přidán zirkonium tetrachlorid (450 mg, 1,93 mmol). Teplota byla 1 hodinu udržována na -10 °C, poté 3 hodiny na 0 °C. Reakce dále probíhala přes noc za laboratorní teploty, ukončena byla přidáním vody. Vodná fáze byla promyta dvěma podíly ethyl-acetátu, spojené organické fáze byly zpětně extrahovány vodou a vysušeny pomocí síranu hořečnatého. Rozpouštědla byla odpařena a produkt přečištěn sloupcovou chromatografií (hexanaceton 3/1). Byl izolován produkt l-[2-(4-morfolino)ethyl]-3-(4-benzyloxy-l-naftoyl)-777-indol (444 mg, 0,91 mmol) ve výtěžku 70 %.

l-[2-(4-morfolino)ethyl]-3-(4-benzyloxy-l-naftoyl)-777-indol (144 mg, 0,29 mmol) byl rozpuštěn v bezvodém ethanolu (35 mL), k roztoku byl přidán formiát amonný (93 mg, 1,47 mmol) a katalytické množství palladia na uhlíku. Reakce byla míchána 1 hodinu za laboratorní teploty. Palladiový katalyzátor byl odfiltrován, filtrát byl zahuštěn částečným odpařením ethanolu a následně naředěn ethyl-acetátem. Organická fáze byla promyta roztokem uhličitanu draselného, a dvěma podíly roztoku chloridu sodného, poté byla vysušena pomocí síranu hořečnatého. Rozpouštědla byla odpařena a produkt byl přečištěn sloupcovou chromatografií (hexan/aceton 9/4). Byl izolován produkt l-[2-(4-morfolino)ethyl]-3-(4-hydroxy-l-naftoyl)-7/7-indol (116 mg, 0,29 mmol) ve výtěžku 99 %.

l-[2-(4-morfolino)ethyl]-3-(4-hydroxy-l-naftoyl)-777-indol (110 mg, 0,28 mmol) byl rozpuštěn v suchém acetonu (30 mL) při 50 °C, k roztoku byl přisypán bezvodý uhličitan draselný (57 mg, 0,41 mmol). Po 30 minutách byl přidán ethyl-2-bromacetát (36 pL, 0,32 mmol) a reakční směs byla zahřívána k varu. Reakce probíhala 3 hodiny. Po zchladnutí reakční směsi na laboratorní teplotu byl přidán ethyl-acetát, organická fáze byla postupně promyta dvěma podíly vody a nasyceným roztokem chloridu sodného, poté byla vysušena pomocí síranu hořečnatého. Rozpouštědla byla odpařena a produkt přečištěn sloupcovou chromatografií (hexan/aceton 3/1). Byl izolován produkt ethyl-2-{4-[l-(2-(4-morfolino)ethyl)-7/7-indol-3-ylkarbonyl]naftalen-l-yloxy}acetát (111 mg, 0,23 mmol) ve výtěžku 83 %.

Ethyl-2-{4-[l-(2-(4-morfolino)ethyl)-777-indol-3-ylkarbonyl]naftalen-l-yloxy}acetát (105 mg, 0,22 mmol) byl suspendován v ethanolu (15 mL), k roztoku byl stříkačkou přikapán 1M roztok hydroxidu sodného ve vodě (3 mL). Reakce probíhala 1 hodinu při teplotě 50 °C. Ethanol byl odpařen, vodná fáze byla okyselena na pH 1, poté byla odpařena i voda. Vyloučený chlorid sodný byl odstraněn triturací odparku vodou. Produkt byl přečištěn chromatografií na reverzní fázi (voda/methanol, gradient 10/1—>1/1). Byl izolován produkt ve formě hydrochloridu 2-{4-[l-(2(4-morfolino)ethyl)-777-indol-3-ylkarbonyl]naftalen-l-yloxy}octové kyseliny (73 mg, 0,15 mmol) s výtěžkem 68 %.

-6CZ 306547 B6

1H NMR (300 MHz, CDC1₃) δ ppm: 2,52 (t, J=4,50 Hz, 4 H, CH₂NCH₂), 2,78 (t, J=6,60 Hz, 2 H, NCH₂), 3,62 (t, J=4,50 Hz, 4 H, CH₂OCH₂), 3,83 (br s, 1 Η, NH), 4,24 (t, J=6,90 Hz, 2 H, NCH₂), 4,66 (s, 2 H, OCH₂), 6,60 (d, J=7,80 Hz, 1 H, ArH), 7,30 - 7,46 (m, 7 H, ArH), 8,19 8,22 (m, 1 H, ArH), 8,32 - 8,35 (m, 1 H, ArH), 8,41 - 8,44 (m, 1 H, ArH). 13C NMR (75 MHz, CDC13) δ ppm: 42,75, 52,86, 56,44, 65,42, 66,86, 103,33, 109,84, 118,07, 122,57, 122,96, 123,10, 124,04, 125,62, 125,79, 125,92, 127,12, 127,48, 127,67, 131,70, 132,15, 136,87, 138,34, 155,58, 172,61, 191,69. IČ (CHC1₃): 3107, 3075, 3053, 2957, 2927, 2859, 2816, 1920, 1727,1622, 1605, 1578, 1520, 1509, 1485, 1463, 1425, 1394, 1372, 1322, 1258, 1230, 1196, 1159, 1134, 1098, 1071, 1032, 1014, 986, 910, 870, 820, 794, 774, 749, 715, 669, 626, 561, 425. HRMS-ESI: monoisotopická hmota: 458,18417 Da, nalezeno (m/z) 459,19109 (vypočteno 459,19145) odpovídá iontu [M+H]+ připravené látky.

Příklad 2

Syntéza haptenu IV

Výchozí 4-hydroxybenzoová kyselina (8287 mg, 60,00 mmol) byla rozpuštěna v acetonitrilu (140 mL) při 60 °C, k roztoku byl přisypán bezvodý uhličitan draselný (19073 mg, 138,00 mmol). Po 30 minutách byl přidán benzylbromid (14 986 pL, 126,00 mmol), reakční směs byla zahřáta k varu a míchána 16 hodin. Po zchladnutí reakční směsi na laboratorní teplotu byl přidán ethyl-acetát a voda, organická fáze byla oddělena a vodná promyta dalšíma dvěma podíly ethyl-acetátu. Organické extrakty byly spojeny a vysušeny pomocí síranu hořečnatého. Rozpouštědla byla odpařena a produkt přečištěn sloupcovou chromatografií (hexan/dichlormethan, gradient 4/1—>1/1). Byl izolován produkt benzyl-4-benzyloxybenzoát (18714 mg, 58,83 mmol) ve výtěžku 98 %.

Benzyl-4-benzyloxybenzoát (18593 mg, 58,44 mmol) byl suspendován ve směsi ethanolu (300 mL) s vodou (100 mL). Byl přidán hydroxid sodný (12 000 mg, 300,02 mmol) a reakční směs byla zahřáta k varu. Reakce probíhala 1 hodinu. Ethanol byl odpařen a vodná fáze byla po naředění promyta dvěma podíly diethyletheru. Poté byla okyselena na pH 1 a protřepána postupně s třemi podíly diethyletheru a ethyl-acetátem. Organické fáze byly spojeny a vysušeny pomocí síranu hořečnatého. Rozpouštědla byla odpařena a produkt přečištěn sloupcovou chromatografií (dichlormethan/methanol 97/3). Byl izolován produkt 4-benzyloxybenzoová kyselina (12 658 mg, 55,50 mmol) ve výtěžku 95 %.

4-Benzyloxybenzoová kyselina (1460 mg, 6,40 mmol) byla rozpuštěna v suchém dichlormethanu (35 mL), k roztoku bylo přidáno několik kapek N,A-dimethy 1 formámidu a stříkačkou byl přikapán oxalylchlorid (715 pL, 8,32 mmol). Reakce probíhala 3 hodiny při laboratorní teplotě. Byl přidán toluen (10 mL), přebytečný oxalylchlorid a rozpouštědla byly odpařeny, vznikl 4-benzyloxybenzoylchlorid.

Surový 4-benzyloxybenzoylchlorid (1081 mg, 4,38 mmol) byl rozpuštěn v suchém dichlormethanu (55 mL) a stříkačkou byl přikapán roztok l-[2-(morfolin-4-yl)ethyl]-777-indolu (1313 mg, 5,70 mmol) připravený v suchém dichlormethanu (5 mL) při teplotě -30 °C. K. reakční směsi byl přidán zirkonium tetrachlorid (1533 mg, 6,58 mmol). Teplota byla 90 minut udržována na -30 °C, 90 minut na -20 °C, poté 90 minut na -10 °C a nakonec 3 hodiny na teplotě 0 °C. Reakce dále probíhala přes noc za laboratorní teploty, ukončena byla přidáním vody. Vodná fáze byla promyta dvěma podíly ethyl-acetátu, spojené organické fáze byly zpětně extrahovány vodou a vysušeny pomocí síranu hořečnatého. Rozpouštědla byla odpařena a produkt přečištěn sloupcovou chromatografií (hexan/aceton, gradient 16/3—>3/1). Byl izolován produkt l-[2-(4-morfolino)ethyl]-3-(4-benzyloxybenzoyl)-777-indol (827 mg, 1,88 mmol) ve výtěžku 43 %.

l-[2-(4-morfolino)ethyl]-3-(4-benzyloxybenzoyl)-7ZZ-indol (839 mg, 1,90 mmol) byl rozpuštěn v bezvodém ethanolu (65 mL), k roztoku byl přidán formiát amonný (600 mg, 9,51 mmol) a kata

-7CZ 306547 B6 lytické množství palladia na uhlíku. Reakce byla míchána 3 hodiny za laboratorní teploty. Palladiový katalyzátor byl odfiltrován, filtrát byl zahuštěn částečným odpařením ethanolu a následně naředěn ethyl-acetátem. Organická fáze byla postupně promyta roztokem uhličitanu draselného, roztokem chloridu sodného a vodou, poté byla vysušena pomocí síranu hořečnatého. Rozpouštědla byla odpařena a produkt byl přečištěn sloupcovou chromatografií (hexan-aceton, gradient 3/1—>2/1). Byl izolován produkt l-[2-(4-morfolino)ethyl]-3-(4-hydroxybenzoyl)-7Z7-indol (551 mg, 1,57 mmol) ve výtěžku 83 %.

l-[2-(4-morfolino)ethyl]-3-(4-hydroxybenzoyl)-777-indol (480 mg, 1,37 mmol) byl rozpuštěn v suchém acetonu (35 mL) při 50 °C, k roztoku byl přisypán bezvodý uhličitan draselný (285 mg, 2,05 mmol). Po 30 minutách byl přidán ethyl-2-bromacetát (183 pL, 1,64 mmol) a reakční směs byla zahřívána k varu. Reakce probíhala 3 hodiny. Po zchladnutí reakční směsi na laboratorní teplotu byl přidán ethyl-acetát, organická fáze byla postupně promyta dvěma podíly vody a nasyceným roztokem chloridu sodného, poté byla vysušena pomocí síranu hořečnatého. Rozpouštědla byla odpařena a produkt přečištěn sloupcovou chromatografií (hexan-aceton 5/2). Byl izolován produkt ethyl-2-{4-[l-(2-(4-morfolino)ethyl)-7//-indol-3-ylkarbonyl]benzyloxy}acetát (549 mg, 1,26 mmol) ve výtěžku 92 %.

Ethyl-2-{4-[l-(2-(4-morfolino)ethyl)-7Z7-indol-3-ylkarbonyl]benzyloxy}acetát (63 mg, 0,14 mmol) byl rozpuštěn v ethanolu (15 mL), k roztoku byl stříkačkou přikapán 1M roztok hydroxidu sodného (8 mg, 0,20 mmol) ve vodě. Reakce probíhala 3 hodiny při teplotě 60 °C. Ethanol byl odpařen, vodná fáze byla okyselena na pH 1, poté byla odpařena i voda. Surový produkt byl zbaven vyloučeného chloridu sodného a přečištěn chromatografií na reverzní fázi (voda/methanol, gradient 10/1—>1/1). Byl izolován produkt ve formě hydrochloridu 2-{4-[ 1-(2-(4morfolino)ethyl)-777-indol-3-ylkarbonyl]benzyloxy}octové kyseliny (36 mg, 0,08 mmol) s výtěžkem 56 %.

1H NMR (300 MHz, CD₃OD) δ ppm: 2,94 (t, J=4,50 Hz, 4 H, CH₂NCH₂), 3,23 (t, J=6,l 5 Hz, 2 H, NCH₂), 4,07 (t, J=4,50 Hz, 4 H, CH₂OCH₂), 4,82 (t, J=6,50 Hz, 2 H, NCH₂), 5,03 (s, 2 H, OCH₂), 7,49 (d, J=7,50 Hz, 2 H, ArH), 7,69 - 7,75 (m, 2 H, ArH), 7,97 (d, J=7,50 Hz, 1 H, ArH), 8,24 (d, J=7,50 Hz, 2 H, ArH), 8,35 (s, 1 H, ArH), 8,69 (d, J=7,80 Hz, 1 H, ArH). IČ (CHC1₃): 3606, 3403, 3326, 3218, 3147, 3058, 3043, 2999, 2965, 2943, 2897, 2883, 2868, 2824, 2796, 1672, 115, 1598, 1573, 1523, 1470, 1452, 1425, 1380, 1304, 1261, 1242, 1209, 1176, 1131, 1114, 1098, 1048, 1028, 991, 904, 879, 871, 843, 818, 762, 751, 716, 702, 659, 637, 621, 568, 493, 477, 449. HRMS-ESI: monoisotopická hmota: 408,16852 Da, nalezeno (m/z) 409,17600 (vypočteno 409,17580) odpovídá iontu [M+H]+ připravené látky.

Příklad 3

Konjugace haptenu II s BSA

Hydrochlorid 2-{4-[l-(2-(4-morfolino)ethyl)-777-indol-3-ylkarbonyl]naftalen-l-yloxy}octové kyseliny (15 mg, 30.3 μτηοΐ) byl rozpuštěn v A/A-dimethylformamidu (150 μΙ), k roztoku byl přidán roztok ALW-dicyklohexylkarbodiimidu (8,1 mg, 39,4 pmol) v A/V-dimethylformamidu (85 μΐ) a roztok N-hydroxysukcinimidu (4,5 mg, 39,4 pmol) v A/A-dimethylformamidu (45 μΐ). Reakční směs byla ponechána stát přes noc v mikrozkumavce při laboratorní teplotě. Po vyloučení krystalků derivátu močoviny, bylo pomocí TLC analýzy ověřeno, že veškerá výchozí kyselina byla převedena na aktivovaný ester.

K roztoku hovězího sérového albuminu (24,2 mg, 0,4 pmol) v bikarbonátovém pufru (1,9 ml) byl přidán roztok dioktylsulfosukcinátu sodného v oktanu (12,4 ml). Do micelámího prostředí byl pipetou opatrně přenesen aktivovaný ester v A, A-dimethylformamidu tak, aby došlo k oddělení krystalků derivátu močoviny. Reakční směs byla ponechána míchat přes noc při laboratorní teplotě. Poté byl modifikovaný protein vysrážen chladným acetonem (-30 °C) z reakční směsi. Pro

-8CZ 306547 B6 dukt byl oddělen centrifugací a promyt dalším podílem chladného acetonu(-30 °C). Po centrifugaci a odlití promývacího acetonu byl modifikovaný protein ponechán 30 minut na vzduchu, aby došlo k odpaření zbylého acetonu. Poté byl produkt rozpuštěn ve vodě a lyofilizován. Analýza pomocí MS-MALDI ukázala, že k jedné molekule hovězího sérového albuminu je navázáno průměrně 20 molekul haptenu II.

Příklad 4

Konjugace haptenu IV s BSA

Hydrochlorid 2-{4-[l-(2-(4-morfolino)ethyl)-7/f-indol-3-ylkarbonyl]benzyloxy}octové kyseliny (12 mg, 27,0 pmol) byl rozpuštěn v VN-dimethylformamidu (120 μΐ), k roztoku byl přidán roztok VW-dicyklohexylkarbodiimidu (7,2 mg, 35,1 μηιοΙ) v VN-dimethylformamidu (75 μΐ) a roztok V-hydroxysukcinimidu (4,0 mg, 351 pmol) v ΛζΑ-dimethylformamidu (40 μΐ). Reakční směs byla ponechána stát přes noc v mikrozkumavce při laboratorní teplotě. Po vyloučení krystalků derivátu močoviny, bylo pomocí TLC analýzy ověřeno, že veškerá výchozí kyselina byla převedena na aktivovaný ester.

K roztoku hovězího sérového albuminu (21,6 mg, 0,4 pmol) v bikarbonátovém pufru (1,7 ml) byl přidán roztok dioktylsulfosukcinátu sodného v oktanu (11,1 ml). Do micelámího prostředí byl pipetou opatrně přenesen aktivovaný ester v AyV-dimethylformamidu tak, aby došlo k oddělení krystalků derivátu močoviny. Reakční směs byla ponechána míchat přes noc při laboratorní teplotě. Poté byl modifikovaný protein vysrážen chladným acetonem (-30 °C) z reakční směsi. Produkt byl oddělen centrifugací a promyt dalším podílem chladného acetonu (-30 °C). Po centrifugaci a odlití promývacího acetonu byl modifikovaný protein ponechán 30 minut na vzduchu, aby došlo k odpaření zbylého acetonu. Poté byl produkt rozpuštěn ve vodě a lyofilizován. Analýza pomocí MS-MALDI ukázala, že k jedné molekule hovězího sérového albuminu je navázáno průměrně 20 molekul haptenu IV.

Příklad 5

Provedení nepřímé nekompetitivní ELISY

Imobilizace konjugátu na stěny jamek mikrotitrační destičky

Zásobní roztok imobilizačního konjugátu (I-BSA - VI-BSA) byl vhodně naředěn v 0,05 mol/1 karbonát-bikarbonátovém pufru, pH 9,6 a pipetován do jamek mikrotitrační destičky v množství 100 μΐ na jamku. Imobilizace probíhala přes noc při laboratorní teplotě. Nenavázaný imobilizační konjugát byl následující den odstraněn pomocí automatické promývačky 4x 300 μΐ 0,01 mol/1 PBS-Tw (0.0IM PBS, pH 7,4 obohacený 0,05 % Tweenem).

Aplikace kompetujících složek

Po promytí nenavázaného konjugátu byly do jamek mikrotitrační destičky pipetovány kompetující složky v pořadí 50 μΐ roztoku antigenu (kalibračního standardu nebo vzorku) ředěného v PBS a 50 μΐ roztoku polyklonální králičí protilátky ředěné v příslušném pufru (různé pufry pro různé systémy). Inkubace probíhala za mírného třepání při laboratorní teplotě, po dobu 1 hodiny. Nezreagované imunoreaktanty byly odstraněny opakovaným promytím jamek 0,01 mol/1 PBSTw (4x 300 μΐ, promývačka).

-9CZ 306547 B6

Aplikace sekundární protilátky

Ke kvantifikaci navázaných králičích protilátek na imobilizační konjugát bylo využito tzv. sekundární protilátky GAR-Po (z angl. Goat Anti-Rabbit - kozí protilátky proti králičím protilátkám značené peroxidasou). Sekundární protilátka byla ředěna 1:10 000 v příslušném pufru (v závislosti na systému) a pipetována v množství 100 μΐ na jamku. Inkubace probíhala za mírného třepání při laboratorní teplotě, po dobu 1 hodiny. Nenavázaná protilátka byla poté odstraněna opakovaným promytím jamek 0,01M PBS-Tw (4x 300 μΐ, promývačka).

Aplikace substrátu pro peroxidasu

Do každé jamky bylo následně přidáno 100 μΙ čerstvě připraveného roztoku substrátu pro peroxidasu Enzymová reakce probíhala za mírného třepání při laboratorní teplotě deset minut.

K zastavení enzymové reakce byl použit přídavek 2 mol/1 kyseliny sírové v množství 50 μΐ na jamku. Absorbance reakční směsi byla měřena v jamkách mikrotitrační destičky při vlnové délce 450 nm.

Průmyslová využitelnost

Aplikace v imunoanalytických metodách stanovení syntetických kanabinoidů ve formátech nepřímé ELISA, LFIA, FIA a dalších, které využívají kompetice mezi haptenem - některým z připravených derivátů syntetických kanabinoidů, a analytem - psychoaktivní látkou přítomnou ve vzorku, o vazebná místa protilátky.

Claims (6)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Derivát syntetického kanabinoidů o struktuře 2-{4-[l-(2-(4-morfolino)ethyl)-7Z7-indol-3ylkarbonyl]RiOxy}octové kyseliny, přičemž R| je naftalen-1-yl nebo benzyl.
2. 2. Derivát syntetického kanabinoidů podle nároku 1 o názvu 2-{4-[l-(2-(4-morfolino)ethyl)777-indol-3-ylkarbonyl]naftalen-l-yloxy}octové kyseliny o struktuře II:
3. 3. Derivát syntetického kanabinoidů podle nároku 1 o názvu 2-{4-[l-(2-(4-morfolino)ethyl)7/7-indol-3-ylkarbonyl]benzyloxy}octové kyseliny o struktuře IV:

   - 10CZ 306547 B6
4. 4. Způsob přípravy derivátu syntetického kanabinoidu podle nároků laž3, vyznačující se tím, že výchozí 4-hydroxyaren-l-karboxylová kyselina se podrobí reakci s benzylbromidem, ke vzniklé 4-benzyloxyarenkarboxylové kyselině se přikape oxalylchlorid, ke vzniklému chloridu 4-benzyloxyarenkarboxylové kyseliny se přikape //-substituovaný indol, k reakční směsi Friedel-Crafísově reakci je přidán zirkonium tetrachlorid, vzniklý produkt je debenzylován na paladiovém katalyzátoru, debenzylovaný produkt se izoluje, provede se O-alkylace, kdy se přidá ethyl-ester ω- bromalkanové kyseliny a vzniklý ester nesený na spojovacím můstku se v zásaditém prostředí hydrolyzuje na karboxylovou skupinu.
5. 5. Použití derivátu syntetického kanabinoidu podle nároků 1 až 3 jako prostředku pro vizualizaci interakcí s kanabinoidními receptory.
6. 6. Použití derivátu syntetického kanabinoidu podle nároků 1 až 3 jako prostředku pro přípravu imunogenů konjugací s nosným proteinem, pro získání protilátky pro analýzu drog interagujících s kanabinoidními receptory.