CZ28908U1 - Imunochromatografický test syntetických kanabinoidu - Google Patents
Imunochromatografický test syntetických kanabinoidu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ28908U1 CZ28908U1 CZ2015-31576U CZ201531576U CZ28908U1 CZ 28908 U1 CZ28908 U1 CZ 28908U1 CZ 201531576 U CZ201531576 U CZ 201531576U CZ 28908 U1 CZ28908 U1 CZ 28908U1
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- conjugate
- membrane
- strip
- antibody
- test
- Prior art date
Links
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims description 48
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 33
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 20
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 20
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 20
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 19
- 229930003827 cannabinoid Natural products 0.000 claims description 14
- 239000003557 cannabinoid Substances 0.000 claims description 14
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 13
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 11
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 10
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 6
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 claims description 5
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Natural products CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 claims description 4
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 2
- 239000010409 thin film Substances 0.000 claims 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 24
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 24
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 229940065144 cannabinoids Drugs 0.000 description 13
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 13
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 12
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 12
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- SZWYXJHTNGJPKU-UHFFFAOYSA-N jwh-200 Chemical compound C=1C=CC2=CC=CC=C2C=1C(=O)C(C1=CC=CC=C11)=CN1CCN1CCOCC1 SZWYXJHTNGJPKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 239000003637 basic solution Substances 0.000 description 8
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 8
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 8
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 6
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 6
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 6
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 239000002585 base Substances 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 4
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 4
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 230000000506 psychotropic effect Effects 0.000 description 4
- 239000004328 sodium tetraborate Substances 0.000 description 4
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- JDNLPKCAXICMBW-UHFFFAOYSA-N JWH 018 Chemical compound C12=CC=CC=C2N(CCCCC)C=C1C(=O)C1=CC=CC2=CC=CC=C12 JDNLPKCAXICMBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 241001279686 Allium moly Species 0.000 description 2
- 102000018208 Cannabinoid Receptor Human genes 0.000 description 2
- 108050007331 Cannabinoid receptor Proteins 0.000 description 2
- 229920003043 Cellulose fiber Polymers 0.000 description 2
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 2
- QHMBSVQNZZTUGM-UHFFFAOYSA-N Trans-Cannabidiol Natural products OC1=CC(CCCCC)=CC(O)=C1C1C(C(C)=C)CCC(C)=C1 QHMBSVQNZZTUGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 2
- 229950011318 cannabidiol Drugs 0.000 description 2
- QHMBSVQNZZTUGM-ZWKOTPCHSA-N cannabidiol Chemical compound OC1=CC(CCCCC)=CC(O)=C1[C@H]1[C@H](C(C)=C)CCC(C)=C1 QHMBSVQNZZTUGM-ZWKOTPCHSA-N 0.000 description 2
- ZTGXAWYVTLUPDT-UHFFFAOYSA-N cannabidiol Natural products OC1=CC(CCCCC)=CC(O)=C1C1C(C(C)=C)CC=C(C)C1 ZTGXAWYVTLUPDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011545 carbonate/bicarbonate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N cocaine Chemical compound O([C@H]1C[C@@H]2CC[C@@H](N2C)[C@H]1C(=O)OC)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- CYQFCXCEBYINGO-IAGOWNOFSA-N delta1-THC Chemical compound C1=C(C)CC[C@H]2C(C)(C)OC3=CC(CCCCC)=CC(O)=C3[C@@H]21 CYQFCXCEBYINGO-IAGOWNOFSA-N 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- PCXRACLQFPRCBB-ZWKOTPCHSA-N dihydrocannabidiol Natural products OC1=CC(CCCCC)=CC(O)=C1[C@H]1[C@H](C(C)C)CCC(C)=C1 PCXRACLQFPRCBB-ZWKOTPCHSA-N 0.000 description 2
- 239000002621 endocannabinoid Substances 0.000 description 2
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 2
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 2
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 2
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102000009132 CB1 Cannabinoid Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010073366 CB1 Cannabinoid Receptor Proteins 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001200 N-acyl ethanolamides Chemical class 0.000 description 1
- 208000028810 Shared psychotic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- LGEQQWMQCRIYKG-DOFZRALJSA-N anandamide Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(=O)NCCO LGEQQWMQCRIYKG-DOFZRALJSA-N 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000036528 appetite Effects 0.000 description 1
- 235000019789 appetite Nutrition 0.000 description 1
- LGEQQWMQCRIYKG-UHFFFAOYSA-N arachidonic acid ethanolamide Natural products CCCCCC=CCC=CCC=CCC=CCCCC(=O)NCCO LGEQQWMQCRIYKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 229940121376 cannabinoid receptor agonist Drugs 0.000 description 1
- 239000003537 cannabinoid receptor agonist Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 229960003920 cocaine Drugs 0.000 description 1
- 238000012505 colouration Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 229960004242 dronabinol Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N formamide Substances NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 1
- FFLSJIQJQKDDCM-UHFFFAOYSA-N jwh-250 Chemical compound C12=CC=CC=C2N(CCCCC)C=C1C(=O)CC1=CC=CC=C1OC FFLSJIQJQKDDCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- -1 lysine amino acid Chemical class 0.000 description 1
- 240000004308 marijuana Species 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 230000036651 mood Effects 0.000 description 1
- 230000003533 narcotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229940127240 opiate Drugs 0.000 description 1
- 239000004031 partial agonist Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000003236 psychic effect Effects 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 102000027257 transmembrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008578 transmembrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000005353 urine analysis Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
Analýza drog v tělních tekutinách
Dosavadní stav techniky
Na drogové scéně se v posledních letech kromě tradičních drog (kokain, opiáty, amfetaminy, kanabinoidy) objevují také nové syntetické drogy (NSD). Důvodem je snaha výrobců a distributorů obejít stávající legislativní normy, v nichž jsou omamné a psychotropní látky vymezeny obvykle taxativně. Na ilegální trh se tak dostávají analoga známých látek s psychotropním potenciálem, která dosud nejsou uvedena na seznamu ilegálních látek, nebo jejichž prekurzory nejsou monitorovanými substancemi. Hlavní nebezpečí spojené s užíváním těchto nových syntetických drog (NSD) tkví v nedostatku informací o jejich farmakokinetickém a toxikologickém chování, neboť tyto látky neprošly žádnými klinickými testy.
Početně nejbohatší a ze strukturního hlediska značně rozmanitou skupinou NSD jsou syntetické kanabinoidy. Tyto látky se váží na kanabinoidní receptory, což jsou s G-proteinem spřažené transmembránové receptory. Podtyp receptoru CB1 se nachází především v centrální nervové soustavě, podtyp CB2 je exprimován zejména v buňkách imunitního systému. Endokanabinoidní systém dodnes nebyl zcela pochopen. Je však známo, že endogenní kanabinoidy, jejichž nejznámějším zástupcem je anandamid, ovlivňují cítění bolesti, náladu, paměť, ale i chuť k jídlu. Ke kanabinoidním receptorům se váže též celá řada exogenních sloučenin, k nej významnějším patří aktivní složky konopí A9-tetrahydrokanabinol (THC) a kanabidiol (CBD), které jsou parciálními agonisty obou zmíněných podtypů receptorů. Syntetické kanabinoidy jsou plní agonisté kanabinoidních receptorů s mnohem dramatičtějšími psychickými účinky. Zaznamenána byla celá řada intoxikací, které měly v některých případech i fatální důsledky. Popsány jsou i případy indukované psychózy. (Banister SD, Wilkinson SM, Longworth M, Stuart J, Apetz N, English K, Brooker L, Goebel C, Hibbs DE, Glass M, Connor M, McGregor IS, Kassiou M. The Synthesis and Pharmacological Evaluation of Adamantane-Derived Indoles: Cannabimimetic Drugs of Abuse. Chem. Neurosci. 2013;4:1081-92).
Tradiční drogy lze detekovat pomocí komerčních imunochemických testů založených na selektivní reakci protilátky a antigenu, kterým je v tomto případě hledaná omamná či psychotropní látka. K detekci NSD však tyto testy použít nelze. (Páleníček T, Kuchař M. Je možná detekce a identifikace nových syntetických drog (NSD) pomocí orientačních testů? Adiktologie 2011;11:208-14). Odhalit intoxikaci osob novými syntetickými drogami je možné pomocí metod klinické biochemie, a to zejména analýzou pomocí plynové chromatografie s hmotnostním detektorem (LC-MS), což je poměrně náročné jak na přístroje, tak na odbornost obsluhy. Sestavení přístrojově nenáročných, jednoduchých, uživatelsky příjemných imunochemických testů na principu LFIA (Lateral Flow Immunochromatographic Assay) by umožňovalo daleko rychlejší a levnější orientační detekci látek v biologickém materiálu ve zdravotnictví nebo při dopravních kontrolách řidičů.
Přestože existuje mnoho evaluovaných imunochemických testů pro stanovení tradičních kanabinoidů, možnosti imunoanalýzy syntetických kanabinoidů jsou omezené. V literatuře jsou popsány příklady metod pro ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) stanovení JWH-018 a JWH250 v krvi, krevním séru a moči (Amtson A, Ofsa B, Lancaster D, Simon JR, McMullin M, Logan B. Validation of a Novel Immunoassay for the Detection of Synthetic Cannabinoids and Metabolites in Urine Specimens. J. Anal. Toxicol. 2013; 37:284-90), JWH-200 ve slinách (Rodrigues WC, Catbagan P, Rana S, Wang G, Moore C. Detection of Synthetic Cannabinoids in Oral Fluid Using ELISA and LC-MS-MS. J. Anal. Toxicol. 2013; 37:526-33) a HEIA (Homogenous Enzyme ImmunoAssay) stanovení JWH-018 A-pentanové kyseliny, což je významný metabolit JWH-018, v moči (Bames AJ, Young S, Spinelli E, Martin TM, Klette KL, Huestis MA. Evaluation of a homogenous enzyme immunoassay for the detection of synthetic cannabinoids in urine. Forensic Sci Int. 2014;241:27-34).
CZ 28908 Ul
Jako nosné proteiny se používají hovězí sérový albumin (BSA), ovalbumin (OVA), hovězí thyroglobumin (BTG), popř. další proteiny vhodných vlastností. Konjugáty se připravují reakcí aktivované formy haptenu (reaktivní anhydridy či estery) s ε-aminoskupinami lysinových zbytků proteinu za vytvoření amidových vazeb. Konjugací se dosáhne statisticky náhodného obsazení lysylů přítomných v proteinu.
Podstata technického řešení
Byly sestaveny imunochemické testovací proužky formátu LFIA (Lateral-Flow Immunochromatographic Assay) pro rychlou, uživatelsky příjemnou analýzu přítomnosti kanobinoidních látek v tělních tekutinách.
Pro vývoj metody byl použit [l-[2-(4-morfolinyl)ethyl]-lH-indol-3-yl]-l-nafthalenyl-methanon (JWH200), ze kterého byl vytvořen hapten, který byl připojen k nosnému proteinu pro vytvoření imunogenu. Pro tyto účely byl jako vhodný nosný protein vybrán hovězí sérový albumin (BSA). Při tvorbě konjugátů byla využita metoda aktivovaného esteru, při níž je hapten reakcí s Ν,Ν’dicyklohexylkarbodiimidem (DCC) a A-hydroxysukcinimidem (NHS) nejprve převeden na nestabilní derivát ř?-acylisomočoviny, a poté na aktivovaný ester. Vlastní konjugační reakce, při níž dochází k tvorbě amidové vazby mezi karboxylovou skupinou haptenu a primární aminoskupinou aminokyseliny lysinu v BSA, pak probíhala v reverzním micelámím prostředí anionaktivního tenzidu. Z laboratorních zvířat imunizovaných imunogeny lze získat polyklonální králičí protilátky a uplatnit je při vývoji imunoanalytických metod stanovení kanabinoidních látek.
Takto vytvořeným imunogenem byli imunizováni laboratorní králíci, ze kterých byla získána polyklonální králičí protilátka, která byla označena PL199 Protilátka byla použita pro sestavení kvalitativního testovacího proužku na přítomnost kanabinoidních látek v tělních tekutinách, které obsahují strukturu:
Testovací proužky se skládají z: podložky, membrány, která slouží pro samotnou chromatografickou analýzu a je situována uprostřed podložky, ve spodní části ji překrývá proužek pro konjugát a ten je překrýván proužkem pro vzorek, který je připevněn na spodním konci podložky. Na horním konci podložky je připevněn absorpční proužek, který překrývá membránu v horní části.
Na proužek pro konjugát je nanesen konjugát GAR (kozí protilátka proti králičí protilátce) značený zlatými částicemi o velikosti 40 nm v množství 1 mg/ml ve směsi s králičí polyklonální protilátkou (PL199) proti haptenu AŠ089, čímž vznikne směs konjugátů GAR-Au a PL199GAR-Au. Koloidní zlato v konjugátu způsobuje červené zabarvení linek.
Membrána obsahuje dvě linky, kontrolní a testovací. Je-li analýza na sledované drogy negativní, dojde ke zviditelnění obou linek. Zda je vzorek tělních tekutin bez obsažených drog, dojde ke zviditelnění obou linek. Pokud je vzorek pozitivní, dojde ke zvýraznění pouze kontrolní linky.
V testovací lince je obsažen imobilizační konjugát haptenu AŠ089-200 o systematickém názvu: 2-{4-[l-(2-(4-morfolino)ethyl)-17/-indol-3-ylkarbonyl]naftalen-l-yloxy}octová kyselina s hovězím sérovým albuminem (AŠ089-BSA), v množství 150 až 200 pg/ml pro analýzu ve slinách
CZ 28908 Ul a 100 až 150 pg/ml pro analýzu v moči. V kontrolní lince je obsažena DAG (terciální oslí protilátka proti kozí protilátce) s koncentrací 50 až 100 pg/ml.
Odebrané tělní tekutiny, které jsou vyšetřovány na přítomnost drogy, jsou aplikovány na proužek pro vzorek. Po vyvzlínání do absorpčního proužku je imunochromatografie ukončena. Během chromatografie vzlíná droga z tělních tekutin ke konjugátům GAR-Au a PL199-GAR-Au, naváže se na, pro něj specifickou, protilátku PL199, čímž vysytí její vazebná místa pro hapten. Konjugát PL199-GAR-Au se tedy na testovací linku již nemá jak navázat. Konjugát GAR-Au se naváže na DAG na kontrolní lince, čímž se ověří, že chromatografie probíhala správně. Zobrazí-li se pouze jedna linka, vzorek je pozitivní. Pokud je vzorek negativní, naváže se konjugát PL199-GAR-Au na hapten imobilizačního konjugátu (AŠ089-BSA), který je nanesený na testovací lince. Tak pozorujeme zviditelnění obou proužků.
Objasnění výkresů
Obr. 1: Schéma testovacího proužku
Obr. 2: Princip metody
Obr. 3: Znázornění rozdílu mezi pozitivní a negativní kontrolou
Obr. 4: Struktura haptenu [l-[2-(4-morfolinyl)ethyl]-lH-indol-3-yl]-l-nafthalenyl-methanon Obr. 5: Struktura[ 1 -[2-(4-morfolinyl)ethyl]-1 H-indol-3 -yl] -1 -nafthalenyl-methanon (JWH200)
Obr. 6: Výsledek analýzy Příkladu 3 (jedna linka na membráně-negativní výsledek)
Obr. 7: Výsledek analýzy Příkladu 4 (dvě linky na membráně-pozitivní výsledek)
Obr. 8: Výsledek analýzy Příkladu 5 (jedna linka na membráně-negativní výsledek)
Obr. 9: Výsledek analýzy Příkladu 6 (dvě linky na membráně-pozitivní výsledek)
Obr. 10: Výsledek analýzy Příkladu 7 (jedna linka na membráně-pozitivní výsledek)
Obr. 11: Výsledek analýzy Příkladu 8 (jedna linka na membráně-pozitivní výsledek)
Příklady uskutečnění technického řešení
Příklad 1
Testovací proužek pro detekci kanabinoidních látek ve slinách
Standard JWH200 (zás. roztok: 1 mg/ml) v 99 % EtOH
Imobilizační konjugát AŠ089-BSA 7 (zás. roztok: 1 mg/ml) v 0,01 mol/1 karbonát-bikarbonátovém pufru
Králičí polyklonální protilátka PAbl99 13 (zás. roztok: 1 mg/ml) v 0,01 mol/1 fosfátovém pufru s přídavkem soli (PBS)
DAG 8 (zás. roztok 1 mg/ml) v deionizované vodě
GAR 14 ( zás. roztok 1 mg/ml) v deionizované vodě
Gold Colloid 40 nm OD 5 15 - roztok zlatých částic
| Velikost částic (nm) | OD 520nm | Počet částic /ml | Počet molů částic/ml | Molámí koncentrace částic | Hmotnost zlata /ml | Moly zlata/1 |
| 40 | 5 | 4,50x10 | 7,4726xl0’13 | 7,4726x104U | 2,91x1ο'04 | 1,48x10'03 |
CZ 28908 Ul
Příprava membrány 3- uzavřený formát
Byla ustřižena membrána 3 (Millipore HiFlowPlus 75) o délce 20 cm a přilepena na podložku 5 do prostřední části.
Zásobní roztoky imobilizačního konjugátu AŠ089-BSA 7 o koncentraci 180 pg/ml a DAG 8 o koncentraci 85 pg/ml v 5 mol/1 borátovém pufru byly naneseny na membránu 3 rychlostí 8 μΐ/s v objemu 40 μ1/20 cm membrány 3, a to imobilizační konjugát AŠ089-BSA 7 na testovací linku 11 a DAG 8 na kontrolní linku 10. Následovala inkubace membrány 3 při 37 °C 10 hodin.
Na podložku 5 a přes homí konec membrány 3 byl nalepen absorpční proužek 4 z celulózových vláken a podložka byla nastříhána na řezačce na proužky o velikosti 0,4 cm.
Příprava proužku I pro vzorek 9 a proužku 2 pro konjugát
Byl připraven blokační pufr (10 ml):
| Složka | Finál. konc. | Množství pro přípravu |
| Borátový pufr | 0,2 mol/1 | 10 ml |
| BSA | 1% | 0,1 g |
| Tween 20 | 1% | 100 μΐ neřeď. Tweenu |
| Sacharóza | 1% | 0,1 g |
Proužek 2 pro konjugát a proužek I pro vzorek 9 z polyesteru PE VL98 byly nastříhány na malé kousky (proužek 2 pro konjugát 0,4 x 1 cm, proužek I pro vzorek 0,4 x 1,5 cm). Následně byly vsádkově namočeny do blokačního pufru a sušeny na sušící mřížce po dobu 1 h při 37 °C. Tento proces namočení a sušení byl prováděn 2x.
Příprava konjugátu protilátky GAR 14 se zlatými částicemi (GAR 14 - Au 15)
Použité chemikálie:
zlaté částice 40 nm, OD 515 1 ml mmol/1 borátový pufr 2 ml
GAR 14 100 pg (100μ1, konc. 1 pg/μΐ)
GAR 14 byl aplikován po malých kapkách k roztoku zlatých částic 15 ředěných v borátovém pufru za pomalého míchání. Následovala inkubace směsi při 37 °C po dobu 2 h, za stálého míchání. Připravený konjugát byl rozdělen na 2 díly a centrifugován (5 000 x g, 10 °C, 75 min). Supernatant (tekutina nad sedimentem) byl odebrán a pelety resuspendovány v 1 ml promývacího pufru. Byla provedena centriíugace (3x), (13640 x g, 10 °C, 15 min). Vždy byl odpipetován supematant a pelety resuspendovány v 1 ml promývacího pufru. Před třetí centrifugací byly obě pelety spojeny a resuspendovány v 1 ml promývacího pufru. Po centrifugací byla peleta resuspendována v 10 ml skladovacího pufru. Přečištěný konjugát GAR 14 - Au 15 (zás. roztok 200 pg/ml) byl skladován při 4 °C ve skleněné lahvičce s alobalem.
Smícháním reagencií byl připraven MasterMix:
GAR 14-Au 15 10 μΐ
Reakční pufr 18 μΐ
PAb (PL199, lmg/ml) 13 2 μΐ
MasterMix byl kapán na proužek 2 pro konjugát o objemu 40 μΐ/kus. Poté byl sušen na síťce při teplotě 37 °C po dobu 2 h až 16 h. Připravený proužek 2 pro konjugát byl přilepen k membráně 3 s nanesenými imunoreagenciemi a následně přes jehož okraj byl k podložce 3 přilepen proužek 1 pro vzorek 9.
CZ 28908 Ul
5. Příprava pufřů a roztoků pro metodu LFIA
0,1 mol/1 Borátový pufr, pH 8,8
0,1 mol/1 borax (tetrahydroboritan sodný dodekahydrát)
38,14 g boraxu 1 000 ml deionizované vody
0,1 mol/1 kyselina boritá 6,17 g kyseliny borité 1 000 ml deionizované vody mmol/1 Borátový pufr, pH 8,8 ml 0,1 mol/1 borátového pufru 95 ml deionizované vody
2% Roztok NaN3
0,2gNaN3 ml deionizované vody Skladovací pufr ml 0,1 mol/1 borátového pufru 0,1 g BSA
0,1 ml NaN3 (2% zásobní roztok)
Promývací pufr
100 ml 0,1 mol/1 borátového pufru 1 gBSA ml NaN3 (2% zásobní roztok)
Reakční pufr ml 0,05 mol/1 PBS 0,05 g BSA 0,05 g sacharóza 500 μΐ 10% Tween 20
Příklad 2
Testovací proužek pro detekci kanabinoidních látek v moči
Standard JWH200 (zás. roztok: 1 mg/ml) v 99 % EtOH
Imobilizační konjugát JWH200-BSA 7 (zás. roztok: 1 mg/ml) v 0,01 mol/1 karbonát-bikarbonátovém pufru
Králičí polyklonální protilátka PAbl99 13 (zás. roztok: 1 mg/ml) v 0,01 mol/l fosfátovém pufru s přídavkem soli (PBS)
DAG 8 (zás. roztok 1 mg/ml) v deionizované vodě
GAR 14 ( zás. roztok 1 mg/ml) v deionizované vodě
Gold Colloid 40 nm OD 5 15 - roztok zlatých částic
| Velikost částic (nm) | OD 520nm | Počet částic /ml | Počet molů ěástic/ml | Molámí koncentrace částic | Hmotnost zlata /ml | Moly zlata/1 |
| 40 | 5 | 4,50x10“ | 7,4726xl0’13 | 7,4726xl0'lu | 2,91x1ο’04 | l,48xl0'°3 |
CZ 28908 Ul
Příprava membrány 3 - uzavřený formát
Byla ustřižena membrána 3 (Millipore HiFlowPlus 75) o délce 20 cm a přilepena na podložku 5 do prostřední části.
Zásobní roztoky imobilizačního konjugátu JWH200-BSA 7 o koncentraci 130 pg/ml a DAG 8 o koncentraci 85 pg/ml v 5 mol/1 borátovém pufru byly naneseny na membránu 3 rychlostí 8 μΐ/s v objemu 40 μ1/20 cm membrány 3, a to imobilizační konjugát JWH200-BSA 7 na testovací linku H a DAG 8 na kontrolní linku 10. Následovala inkubace membrány 3 při 37 °C 10 hodin.
Na podložku 5 a přes homí konec membrány 3 byl nalepen absorpční proužek 4 z celulózových vláken a podložka byla nastříhána na řezačce na proužky o velikosti 0,4 cm.
Příprava proužku 1 pro vzorek 9 a proužku 2 pro konjugát
Byl připraven blokační pufr (10 ml):
| Složka | Finál. konc. | Množství pro přípravu |
| Borátový pufr | 0,2 mol/1 | lOml |
| BSA | 1% | 0,1 g |
| Tween 20 | 1% | 100 μΐ neřeď. Tweenu |
| Sacharóza | 1% | 0,1 g |
Proužek 2 pro konjugát a proužek 1 pro vzorek 9 z polyesteru PE VL98 byly nastříhány na malé kousky (proužek 2 pro konjugát 0,4 x 1 cm, proužek 1 pro vzorek 0,4 x 1,5 cm). Následně byly vsádkově namočeny do blokačního pufru a sušeny na sušící mřížce po dobu 1 h při 37 °C. Tento proces namočení a sušení byl prováděn 2x.
Příprava konjugátu protilátky GAR 14 se zlatými částicemi (GAR 14 - Au 15)
Použité chemikálie:
zlaté částice 40 nm, OD 5 15 1 ml mmol/1 borátový pufr 2 ml
GAR 14 100 pg (100μ1, konc. 1 pg/μΐ)
GAR 14 byl aplikován po malých kapkách k roztoku zlatých částic 15 ředěných v borátovém pufru za pomalého míchání. Následovala inkubace směsi při 37 °C po dobu 2 h, za stálého míchání. Připravený konjugát byl rozdělen na 2 díly a centrifugován (5 000 x g, 10 °C, 75 min). Supematant (tekutina nad sedimentem) byl odebrán a pelety resuspendovány v 1 ml promývacího pufru. Byla provedena centrifugace (3x), (13640 x g, 10 °C, 15 min). Vždy byl odpipetován supematant a pelety resuspendovány v 1 ml promývacího pufru. Před třetí centrifugací byly obě pelety spojeny a resuspendovány v 1 ml promývacího pufru. Po centrifugací byla peleta resuspendována v 10 ml skladovacího pufru. Přečištěný konjugát GAR 14 - Au 15 (zás. roztok 200 pg/ml) byl skladován při 4 °C ve skleněné lahvičce s alobalem.
Smícháním reagencií byl připraven MasterMix:
GAR14-Aul5 20 μΐ
Reakční pufr 18 μΐ
PAb (PL199, lmg/ml) 13 2 μΐ
MasterMix byl kapán na proužek 2 pro konjugát o objemu 40 μΐ/kus. Poté byl sušen na síťce při teplotě 37 °C po dobu 2 h až 16 h. Připravený proužek 2 pro konjugát byl přilepen k membráně 3 s nanesenými imunoreagenciemi a následně přes jehož okraj byl k podložce 3 přilepen proužek 1 pro vzorek 9.
CZ 28908 Ul
5. Příprava pufřů a roztoků pro metodu LFIA
0,1 mol/1 Borátový pufr, pH 8,8
0,1 mol/1 borax (tetrahydroboritan sodný dodekahydrát)
38,14 g boraxu 1 000 ml deionizované vody
0,1 mol/1 kyselina boritá 6,17 g kyseliny borité 1 000 ml deionizované vody mmol/1 Borátový pufr, pH 8,8 ml 0,1 mol/1 borátového pufru 95 ml deionizované vody
2% Roztok NaN3
0,2gNaN3 ml deionizované vody Skladovací pufr ml 0,1 mol/1 borátového pufru 0,1 gBSA
0,1 ml NaN3 (2% zásobní roztok)
Promývací pufr
100 ml 0,1 mol/1 borátového pufru 1 gBSA ml NaN3 (2% zásobní roztok)
Reakční pufr ml 0,05 mol/1 PBS 0,05 g BSA 0,05 g sacharóza 500 μΐ 10% Tween 20
Příklad 3
Analýza reálného vzorku
Na proužek 1 pro vzorek 9 testovacího proužku do pozice A bylo nakapáno 100 μΐ reakční směsi (50 μΐ reakční pufr + 50 μΐ vzorku slin) a do pozice B bylo nakapáno 100 μΐ reakčního pufru. Testovací proužek se nechal po dobu 12 minut pri laboratorní teplotě. Poté byly na membráně 3 odečteny dvě linky v pozici A, čímž bylo potvrzeno, že testovaný vzorek slin byl negativní na přítomnost drogy a v pozici B byly taktéž odečteny dvě linky, což ověřuje funkčnost testu.
Příklad 4
Analýza reálného vzorku
Na proužek I pro vzorek 9 testovacího proužku do pozice A bylo nakapáno 100 μΐ reakční směsi (50 μΐ reakční pufr + 50 μΐ vzorku slin) a do pozice B bylo nakapáno 100 μΐ reakčního pufru. Testovací proužek se nechal po dobu 10 minut při laboratorní teplotě. Poté byla na membráně 3 odečtena jedna linka v pozici A, čímž bylo potvrzeno, že testovaný vzorek slin byl pozitivní na přítomnost drogy a v pozici B byly odečteny dvě linky, což ověřuje funkčnost testu.
. 7 .
CZ 28908 Ul
Příklad 5
Analýza reálného vzorku
Na proužek i pro vzorek 9 testovacího proužku do pozice A bylo nakapáno 100 μΐ reakční směsi (50 μΐ reakční pufr + 50 μΐ vzorku moči) a do pozice B bylo nakapáno 100 μΐ reakěního pufru. Testovací proužek se nechal po dobu 12 minut při laboratorní teplotě. Poté byly na membráně 3 odečteny dvě linky v pozici A, čímž bylo potvrzeno, že testovaný vzorek slin byl negativní na přítomnost drogy a v pozici B byly odečteny dvě linky, což ověřuje funkčnost testu.
Příklad 6
Analýza reálného vzorku
Na proužek 1 pro vzorek 9 testovacího proužku bylo do pozice A nakapáno 100 μΐ reakční směsi (50 μΐ reakční pufr + 50 μΐ vzorku moči) a do pozice B bylo nakapáno 100 μΐ reakěního pufru. Testovací proužek se nechal po dobu 10 minut při laboratorní teplotě. Poté byla na membráně 3 odečtena jedna linka v pozici A, čímž bylo potvrzeno, že testovaný vzorek slin byl pozitivní na přítomnost drogy a v pozici B byly odečteny dvě linky, což ověřuje funkčnost testu.
Příklad 7
Analýza reálného vzorku
Byl připraven vzorek pro ověření funkčnosti testovacího proužku. Sliny laborantky byly uměle kontaminovány JWH-200 v koncentraci 5 pg/ml.
Na proužek 1 pro vzorek 9 testovacího proužku bylo do pozice A nakapáno 100 μΐ reakční směsi (50 μΐ reakční pufr + 50 μΐ vzorku slin) a do pozice B bylo nakapáno 100 μΐ reakěního pufru. Testovací proužek se nechal po dobu 15 minut při laboratorní teplotě. Poté byla na membráně 3 odečtena jedna linka v pozici A, čímž bylo potvrzeno, že testovaný vzorek slin byl pozitivní na přítomnost drogy a v pozici B byly odečteny dvě linky, což ověřuje funkčnost testu.
Příklad 8
Analýza reálného vzorku
Analýza reálného vzorku
Byl připraven vzorek pro ověření funkčnosti testovacího proužku. Moč laborantky byla uměle kontaminována JWH-200 v koncentraci 5 pg/ml.
Na proužek 1 pro vzorek 9 testovacího proužku bylo do pozice A nakapáno 100 μΐ reakční směsi (50 μΐ reakční pufr + 50 μΐ vzorku slin) a do pozice B bylo nakapáno 100 μΐ reakěního pufru. Testovací proužek se nechal po dobu 5 minut při laboratorní teplotě. Poté byla na membráně 3 odečtena jedna linka v pozici A, čímž bylo potvrzeno, že testovaný vzorek slin byl pozitivní na přítomnost drogy a v pozici B byly odečteny dvě linky, což ověřuje funkčnost testu.
Průmyslová využitelnost
Terénní analýza návykových a psychotropních látek, chromatografické metody, LFIA
Claims (6)
1. Imunochromatografický test kanabinoidních drog v tenké vrstvě, který obsahuje podložku (5) s přichycenou membránou (3), kterou v homí části překrývá absorpční proužek (4) a ve spodní části proužek (2) pro konjugát, přičemž proužek (2) pro konjugát překrývá proužek (1) pro vzorek (9), pro analýzu látek obsahujících strukturu:
n
CZ 28908 Ul vyznačující se tím, že na membráně (3) je nanesena testovací linka (11), která obsahuje imobilizační konjugát (7) 2-{4-[l-(2-(4-morfolino)ethyl)-l//-indol-3-ylkarbonyl]naftalen-lyloxy}octová kyselina s hovězím sérovým albuminem a kontrolní linka (10), která obsahuje oslí protilátku (8) proti kozí protilátce (14), na proužku (2) pro konjugát je nanesena směs polyklonální králičí protilátky (13) proti imobilizačnímu konjugátu (7) a konjugát kozí protilátky (14) proti králičí protilátce (13) s koloidními zlatými částicemi (15) o velikosti 40 nm.
2. Imunochromatografický test podle nároku 1, vyznačující se tím, že imobilizační konjugát (7) je nanesen v množství 0,2 až 0,4 pg na 1 cm membrány.
3. Imunochromatografický test podle nároku 2, vyznačující se tím, že oslí protilátka (8) proti kozí protilátce (14) je nanesena v množství 0,12 až 0,3 pg na 1 cm membrány.
4. Imunochromatografický test podle nároku 1, vyznačující se tím, že konjugát kozí protilátky (14) s koloidními zlatými částicemi (15) je nanesen v množství 2 až 5 pg na 1 cm membrány.
5. Imunochromatografický test podle nároku 4, vyznačující se tím, že polyklonální králičí protilátka (13) je nanesena v množství 1 až 3 pg na 1 cm membrány.
6. Imunochromatografický test podle nároku laž5, vyznačující se tím, že látky jsou v poměru konjugát kozí protilátky (14) s koloidními zlatými částicemi (15) ku polyklonální králičí protilátce (13) ku imobilizačnímu konjugátu (7) ku oslí protilátce (8) 20:10:2:1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2015-31576U CZ28908U1 (cs) | 2015-09-30 | 2015-09-30 | Imunochromatografický test syntetických kanabinoidu |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2015-31576U CZ28908U1 (cs) | 2015-09-30 | 2015-09-30 | Imunochromatografický test syntetických kanabinoidu |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ28908U1 true CZ28908U1 (cs) | 2015-11-30 |
Family
ID=54771467
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2015-31576U CZ28908U1 (cs) | 2015-09-30 | 2015-09-30 | Imunochromatografický test syntetických kanabinoidu |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ28908U1 (cs) |
-
2015
- 2015-09-30 CZ CZ2015-31576U patent/CZ28908U1/cs not_active IP Right Cessation
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103314297B (zh) | 免疫层析测试条及其制造方法 | |
| US7629127B2 (en) | Method for the visual detection of specific antibodies by the use of lateral flow assays | |
| JP5133976B2 (ja) | プロテアーゼ検出製品 | |
| CN1981193B (zh) | △-9-四氢大麻酚检测方法 | |
| CN111164095B (zh) | 用于改进分析物检测的测定方法 | |
| US8859265B2 (en) | Lateral flow immunoassay device with a more rapid and accurate test result | |
| PT92828B (pt) | Metodo de ensaio relativo a receptores de ligandos limite | |
| JP2009518636A (ja) | 迅速診断のためのテスト装置 | |
| JP2002202307A (ja) | イムノクロマトグラフ法 | |
| CZ294954B6 (cs) | Chromatografické zkušební zařízení pro detekci přítomnosti analyzované složky v krevním vzorku | |
| JP2007248073A (ja) | 免疫測定用吸収パッド、免疫測定用ストリップ及び免疫測定装置 | |
| KR20200073259A (ko) | 대칭 디메틸아르기닌의 검출 | |
| CN101435819A (zh) | 免疫层析试验用具 | |
| US9201065B2 (en) | Agglutination assay | |
| KR20120029549A (ko) | 신속한 결과 및 향상된 감도를 갖는 측방 유동 면역 분석 디바이스 | |
| CN105785041A (zh) | 用于定量检测钙卫蛋白的试纸条及其制备方法和钙卫蛋白浓度的测定方法 | |
| CN101305282B (zh) | 凝集分析法 | |
| Park et al. | Immunochromatographic analysis of hippuric acid in urine | |
| RU2638812C2 (ru) | Мультиплексный иммунохроматографический способ определения циркулирующих иммунокомплексов | |
| WO2016014773A1 (en) | Assay for cannabinoids and methods of use thereof | |
| CZ28908U1 (cs) | Imunochromatografický test syntetických kanabinoidu | |
| JP4822275B2 (ja) | 対照部を有するクロマトグラフィー用試験具 | |
| CZ28938U1 (cs) | Imunochromatografický test dimethyltryptaminových drog | |
| EP3067700B1 (en) | Immunoassay for pregabalin | |
| JP7137168B2 (ja) | イムノクロマト用試験片 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG1K | Utility model registered |
Effective date: 20151130 |
|
| ND1K | First or second extension of term of utility model |
Effective date: 20190913 |
|
| MK1K | Utility model expired |
Effective date: 20220930 |