CZ20032172A3

CZ20032172A3 - Farmaceutické prostředky pro léčení demyelinačních onemocnění

Info

Publication number: CZ20032172A3
Application number: CZ20032172A
Authority: CZ
Inventors: Craig P. Smith; Michael P. Rathbone; Margaret Petty; David Rampe
Original assignee: Aventis Pharmaceuticals Inc.
Priority date: 2001-02-15
Filing date: 2002-02-14
Publication date: 2004-01-14
Also published as: US20050234105A1; MA26152A1; HUP0303203A2; MY157745A; TR200800692T2; AU2002247200B2; US20030105150A1; US20090209594A1; TR200800691T2; US20090281147A1; CN1529598A; AU2002247200B9; JP2004518711A; US20090209595A1; US7230015B2; WO2002064126A2; YU62903A; EA200600896A1; EA011319B1; KR20040014459A

Description

Předkládaný vynález se týká N-pyridinyl-lH-indol-l-aminů s jedinečnou kombinací inhibičních vlastností vůči draslíkovým, a rovněž tak sodíkovým kanálům a jejich použití k přípravě farmaceutických prostředků pro léčení demyelinačních onemocnění a stavů.

Dosavadní stav techniky

Mnohočetná skleróza (MS) je degenerativní a zánětlivé neurologické onemocnění, které postihuje centrální nervový systém a je spojeno s tvorbou neuronálních plaků a porušeným neuronálním vedením kvůli demyelinaci (úbytku myelinu). Podobně je rozsáhlá demyelinace obvykle pozorována u míšního traumatu a mrtvice (Bunge a kol., 1993; Blight a DeCrescito, 1986; Pendlebury akol., 2000).

Základní výzkum fyziologie šíření akčního potenciálu v myelinových vláknech ukázal, že blok vedení u demyelinovaných vláken byl částečně způsoben výskytem aminopyridinsenzitivních draslíkových kanálů v oblastech s úbytkem myelinu (Bever 1996).

Akční potenciály se šíří podél normálních myelinovaných nervových vláken procesem salvového vedení, který je výsledkem sodíkového proudu vytvořeného otevřením sodíkových kanálů senzitivních vůči elektrickému napětí u Ranvierova uzlu. Tak na počátku elektrické stimulace vstupují sodné (Na⁺) ionty do neuronu, což způsobuje, že se neuron stává pozitivněji nabitým. Když pozitivní náboj hranice, nastává depolarizace pozitivnímu jádru iontů proudit kritické umožňuje axonu a neuronu dosáhne

Depolarizace neuronem, podél • ·

k nervovému zakončení. Aby se neuron „resetoval, musí se zbavit přebytečného pozitivního náboje. K tomuto dochází prostřednictvím výtoku draslíkových iontů (dále „K⁺) skrze draslíkové kanály. Pokud je myelin porušený, objevují se na axolemmě draslíkové kanály senzitivní vůči elektrickému napětí, které se otevírají v průběhu depolarizace. Draslíkový proud, proudící opačně než sodíkový proud, snižuje amplitudu a dobu trvání akčního potenciálu, což přispívá k selhání vedení snížením distálních hustot účinných proudů. Tyto deficity vedení jsou spojeny s poruchovými symptomy, zahrnujícími svalovou slabost. Při blokaci výtoku K⁺ skrze draslíkové kanály, zůstává neuron déle depolarizovaný a lze ho snáze opětovně stimulovat. Proto se věří, že jsou blokátory draslíkových kanálů použitelné při léčení onemocnění a stavů, které narušují přenos akčního potenciálu, jako jsou MS, traumatické poranění mozku (dále TBI) a poranění míchy (dále SCI) .

Blokátory draslíkových kanálů, jako je 4-aminopyridin (dále 4-AP)m zvyšují dobu trvání a amplitudu akčního potenciálu v demyelinovaných vláknech a zlepšují šíření akčního potenciálu in vitro (Bostock a kol., 1978; 1981; Targ a Kocsis, 1985; 1986; Shi a Blight, 1997), usnadňují uvolňování neurotransmiteru (Bostock a kol., 1981; Hirsh a Quandt, 1993; Sherratt akol, 1980), a posilují svalovou kontraktilitu (Agoston a kol., 1982; Savage a kol., 1985). Tato pozorováni naznačují, že blokátory draslíkových kanálů, jako je 4-AP, mohou obnovit vedení v demyelinovaných vláknech u pacientů s MS. Výsledky následných klinických studií poskytly další podporu pro tvrzení, že aminopyridinová léčba může zlepšit symptomy u některých pacientů s MS (Jones a kol., 1983; Stefoski a kol., 1987; Davis a kol., 1990; van Diemen a kol., 1992; Bever a kol., 1994; Schwid a kol., 1997).

O 4-AP bylo též zveřejněno, že je účinný při léčení neurologických stavů, zahrnujících SCI, oslabení chronické

• ·

bolesti a spasticity u pacientů s SCI, Alzheimerovy choroby, post-poliomyelitického syndromu, myastenie gravis, Huntingtonovy choroby, poruch paměti v souvislosti s věkem, post-traumatických, pomrtvičných či post-toxických syndromů postihujících paměť či vnímání, a dysautonomie (Wurtman R. J. a Buyukuysal R., 1989; Hansebout R. R. a Blight A., 1996;

Hansebout R. R. a Blight A., 1994). Započaly klinické studie použití Fampridine-SR u pacientů s dlouhodobým poraněním míchy (Potter a kol., 1998a,b) nehledě na obavy z bezpečnosti týkající se použití 4-AP u obecné populace pacientů (Multiple Sclerosis, Cognos Study #51, Decisions Resources, October, 1999; str. 77 až 78). Několik studií ukázalo, že jednotlivé dávky 4-AP mohou obnovit některé funkce u pacientů s SCI, pokud jsou podávány jeden rok či déle po poranění (Potter a kol., 1998a,b; Qiao a kol., 1997; Hayes a kol., 1993; 1994). Zveřejněny byly také kladné účinky chronického podávání. Klinicky významná funkční zlepšení byla pozorována u 16 pacientů z 16 po 3 měsících denního orálního podávání 30 mg/kg 4-AP u pacientů s SCI trvající 2 roky či déle. Někteří pacienti dříve klasifikovaní jako s kompletním poraněním byli reklasifikování na nekompletní poranění (Segal a kol., 199). Všichni pacienti vykázali po 3 měsících denní orální léčby pomocí 4-AP (30 mg/den nebo přibližně 0,5 mg/kg) určitý stupeň zlepšení alespoň u některých typů neurologických či plicních funkcí. Nižší dávky nebyly účinné.

Jak bylo předešle uvedeno, 4-AP blokují draslíkové kanály, čímž účinně prodlužují akční potenciál. Tento mechanismus, jímž mohou blokátory draslíkových kanálů zlepšovat symptomy spojené s chorobami a stavy, které narušují přenos akčního potenciálu, však může bohužel vést k aktivitě podobné epilepsii. 4-AP je skutečně uznaným konvulzívním činidlem u savců a člověka. Proto je použitelnost 4-AP jako terapeutického činidla u MS, TBI nebo SCI omezena jeho prokřečovou náchylností a dalšími nežádoucími vedlejšími účinky. Při dávkách vyšších než 0,8 mg/kg byl pozorován • 0 » · « > 0 0 « • Φ 0· neklid, zmatenost a generalizované tonicko-klonické záchvaty (Balí a kol., 1979; Bever a kol., 1994). Van Diemen a kol. (1993) pozoroval, že velikost zlepšeni u pacientů s MS (definovaného zlepšením výsledků hladkého sledování) byla významně spojena se sérovou hladinou 4-AP (33 až 75 ng/ml nutná pro významné zlepšení po orálním podávání). Při stejných dávkách však byly pozorovány vedlejší účinky (parestézie/dysestézie, závratě/mdloby a dokonce nestabilita chůze). V jiné lidské studii, Bever a kol. (1994), byl při sérové hladině 104 ng/ml pozorován velký „grand mal záchvat. Obě skupiny výzkumných pracovníků naznačily, že by vyšší dávkování a sérové hladiny pravděpodobně vedly k vyšším zlepšením u těch pacientů s MS, kteří odpovídali na nižší dávky 4-AP. Stupeň účinnosti 4-AP je tedy omezen dávkou a vedlejšími účinky.

Obavy z vedlejších účinků spojených s vyššími sérovými hladinami 4-AP vedly k vývoji přípravků s ustáleným uvolňováním (Fampridine-SR) (Masterson J. G. a Myers Μ. , 1994;

1996a; 1996b) . Fampridine-SR je nyní ve fázi 2 klinických studií na MS. U pacientů v dosavadních studiích Fampridine-SR bylo pozorováno zlepšení u řady funkcí. V závislosti na jednotlivých případech zahrnovala tato zlepšení zvýšení funkce měchýře, střev a sexuálních funkcí, zvýšenou snadnost pohybu a vnímání a sníženou svalovou spasticitu, únavu a chronickou bolest.

Jiný přístup eliminace nežádoucích vedlejších účinků spojených se 4-AP zahrnuje společné podávání 4-AP a blokátorů sodíkových kanálů závislých na elektrickém napětí. Blokátory sodíkových (Na⁺) kanálů blokují vtok Na⁺ iontů a snižují vnímavost neuronu vůči depolarizaci. Toto účinné snižuje neuronální vzrušivost. Skutečně bylo pozorováno, že společné podávání blokátorů sodíkových kanálů závislých na elektrickém napětí a 4-AP předchází u myši křečím vyvolaným 4-AP (Yamaguchi a Rogawski, 1992) . 4-AP nevykazuje žádné inhibiční • · • · schopnosti vůči sodíkovým kanálům.

Sloučeniny použité v rámci vynálezu lze syntetizovat způsoby popsanými v US patentovém spisu č. 4,970,218. Všechny patenty a další publikace zde citované jsou zde tímto zahrnuty zmínkou.

Je známo, že určité sloučeniny spadající do rozsahu předkládaného vynálezu mohou in vitro a in vivo vyvolat blokádu sodíkových kanálů závislou na elektrickém napětí (Tang a kol., 1995; 1998; Tang a Kongsamut, 1996). Blokátory sodíkových kanálů závislé na elektrickém napětí účinkují za podmínek buněčné depolarizace účinněji. Tyto sloučeniny vykazují malé či žádné účinky na normální neuronální signalizaci, avšak umožňují blokádu sodíkových kanálů během záchvatů, traumatu hlavy či ischémie. Mnohé z těchto činidel jsou v rámci živočišných modelů těchto patologických stavů cerebroprotektivní (Madge a kol., 1998).

Blokátory draslíkových kanálů jsou též použitelnými činidly při léčení neuropatické bolesti a bolesti spojené s cytokiny, zahrnující artritickou bolest. Schweizer a kol. (1999) naznačil, že u hyperalgézie následující buď periferní zánět, či periferní nervové poranění, může hrát roli mikrogliální aktivace a uvolňování cytokinů. O blokátorech draslíkových kanálů, jako je 4-AP, bylo zveřejněno, že blokují aktivaci krysí, myší a lidské mikroglie (Eder, 1998). V Pyo a kol. (1997) bylo popsáno, že 4-AP může snižovat uvolňování dusitanů z aktivované mikrogile, což ukazuje, že chování bolesti lze regulovat prostřednictvím tohoto mechanismu. Dále bylo o 4-AP zvěřejněno, že snižuje tvorbu NO murinními makrofágy vyvolanou lipopolysacharidy (LPS)(Lowry a kol., 1998). Podávání LPS myši bylo též použito jako modelový systém pro identifikaci antiartritické účinnosti několika různých činidel s různými mechanismy účinku (Mcllay a kol., 2001). Ke zkoumání neuropatické bolesti bylo vyvinuto několik ·· ···· “ 6 ·· ·♦ • · ·

·· ·· experimentálních modelů, které zahrnují sevření sedacího nervu nebo L5 či L6 spinálního nervu (Bennett a Xie, 1988; Seltzer a kol., 1990; Kim a Chung, 1992).

Podstata vynálezu

Nyní bylo zjištěno, že sloučeniny obecného vzorce I vykazují vlastnosti ve smyslu blokování draslíkových kanálů. Jedinečná kombinace inhibičních vlastnosti jak vůči draslíkovým, tak vůči sodíkovým, kanálům znamená, že jsou tyto sloučeniny použitelné jako terapeutická činidla pro léčení demyelinačních onemocnění či stavů. Jsou například použitelné při léčení MS, SCI, TBI (traumatického poranění mozku) a mrtvice. Tyto sloučeniny poskytují bezpečnější terapeutické činidlo než 4-AP, neboť 4-AP blokuje pouze draslíkový kanál, což může vést k nežádoucím vedlejším účinkům ve smyslu neklidu, zmatenosti a záchvatů. Sloučeniny obecného vzorce I jsou též použitelné při rehabilitaci mrtvice, léčení iritace a dysfunkce močového měchýře, léčení viscerální, chemokiny vyvolané bolesti (včetně artritické bolesti) a neuropatické bolesti.

Sloučeniny obecného vzorce I poskytují jedinečnou kombinace inhibičních vlastnosti jak vůči draslíkovým, tak vůči sodíkovým, kanálům. Tyto sloučeniny použitelné při léčení demyelinačních onemocnění a stavů, jako je mnohočetná skleróza, míšní poranění, traumatické poranění mozku a mrtvice. Tyto sloučeniny jsou též použitelné při rehabilitaci mrtvice, léčení iritace a dysfunkce močového měchýře, léčení viscerální, chemokiny vyvolané bolesti (včetně artritické bolesti) a neuropatické bolesti.

Předkládaný vynález se týká sloučenin obecného vzorce I »· ··· · • ·

ve kterém m znamená O, 1 nebo 2;

n zanmená 0, 1 nebo 2;

p znamená 0 nebo 1;

každý substituent R nezávisle znamená atom vodíku, halogenu, trifluormethylovou skupinu, alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, alkoxyskupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, benzyloxyskupinu, hydroxyskupinu, nitroskupinu nebo aminoskupinu;

každý substituent Ri nezávisle znamená atom vodíku, alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, alkenylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, alkanoylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, atom halogenu, kyanoskupinu, -C(O)alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů v alkylové části, skupinu -alkylenCN obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů v alkylenové části, skupinu -alkylenNR'R obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů v alkylenové části, kde

R' a R nezávisle znamenají atom vodíku nebo alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů,

0

0· ·

0·

0000 skupinu -alkylenOC(O)alkyl obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů v alkylenové části a 1 až 6 uhlíkových atomů v alkylové části nebo skupinu -CH(OH)R₄, kde

R₄ znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů;

R2 znamená atom vodíku, alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů popřípadě substituovanou atomem halogenu, hydroxyskupinou nebo benzyloxyskupinou, alkenylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, alkynylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, skupinu -CO₂alkyl obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů v alkylové části nebo skupinu -R₅-NR'R, kde

R₅ znamená alkylenovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, alkenylenovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů nebo alkynylenovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů a

R' a R každý nezávisle znamená atom vodíku, alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů nebo alternativně skupina -NR'R jako celek znamená 1-pyrrolidinylovou skupinu; a

R₃ znamená atom vodíku, nitroskupinu, aminoskupinu, atom halogenu, alkoxyskupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, hydroxyskupinu nebo alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů.

Definice:

1) Demyelinační onemocnění:

V rámci předkládaného vynálezu jsou demyelinační onemocnění definována jako onemocnění, u nichž je primárně ·· ···· ·♦ ·· » 9 9 « cílem myelin. Spadají do dvou hlavních skupin: získaná onemocnění a dědičná metabolická onemocnění.

Mnohočetná skleróza (MS) spadá do kategorie získaných onemocnění. MS se obvykle projevuje mezi dvacátým a padesátým rokem života. MS napadá bílou hmotu centrálního nervového systému. Při své klasické manifestaci (90 % všech případů) se vyznačuje střídavými fází relapsu/remise s periodami remise během času pomalu vzrůstajícími. K jejím příznakům patří libovolná kombinace spastické paraparézy, vratkého kroku, diplopie a inkontinence.

Kategorie dědičných metabolických onemocnění zahrnuje osm poznaných leukodystrofií : metachromatickou leukodystrofii, Refsumovu chorobu, adrenoleukodystrofii, Krabbeovu chorobu, fenylketonurii, Canavanovu chorobu, Pelizaeus-Merzbacherovu chorobu a Alexanderovu chorobu. Prvních šest onemocnění je poruchami ukládání metabolických produktů. Chybění či chybná funkce enzymu vede k toxické tvorbě chemických látek. Etiologie Pelizaeus-Merzbacherovy choroby a Alexanderovy choroby zůstává na druhou stranu neznámá.

Klinický průběh dědičných demyelinačních onemocnění, která mají obvykle tendenci projevovat se u nemluvňat či v ranném dětství, je tragický. Dříve normální děti přicházejí, v rychlém sledu, o zrak, sluch, řeč a chůzi. Prognózou je smrt v několika málo letech.

2) Demyelinační stavy

V rámci předkládaného vynálezu je demyelinačním stavem stav, který vede k nedostatečné myelinaci. K takovým demyelinačním stavům patří, nejsou však na ně omezeny, míšní poranění, traumatické poranění mozku a mrtvice.

• *

3)

Míšní poranění (SCI) ·· ·* » · · · » · ·· • · · · · • · · · ·« ··

V rámci předkládaného vynálezu je SCI definováno jako poranění míchy, které vede k úbytku funkcí, jako je pohyblivost nebo citlivost.

4) Traumatické poranění mozku (TBI)

V rámci předkládaného vynálezu je traumatické poranění mozku definováno jako poranění, jehož výsledkem je poškození mozku. K poranění hlavy může dojít jedním ze dvou způsobů:

• K uzavřenému poranění hlavy dochází, pokud je pohybující jako v případě úderu o přední je udeřena tupým předmětem do tvrdého kostěného povrchu vnitřku lebky. K uzavřenému poranění hlavy může dojít též bez přímého vnějšího traumatu hlavy, pokud se mozek rychle pohybuje vpřed či vzad, jako u osoby s hyperextenzi krku.

se hlava rychle zastavena, sklo nebo v případě, že způsobujícím náraz mozku • K otevřenému poranění hlavy dochází v případě, že lebkou pronikne rychle se pohybující předmět, jako je kulka.

Jak uzavřená, tak otevřená, poranění hlavy mohou vést k lokalizovanému a rozšířenému, či difúznímu poškození mozku. Výsledná postižení mohou zahrnovat ztrátu paměti a emocionální poruchy, motorické obtíže, zahrnující paralýzu, a poškození pěti smyslů. Navíc mnozí pacienti následkem zranění umírají.

přesahuje počáteční trauma, poškození. Imunitní buňky tvorbu tekutiny a poraněné nervové buňky začínají vapouštět

Dnes se léčba soustřeďuje na obsažení co možná nejvyššího počtu poškození v rámci období 24 hodin následujících po poranění. Pokud někdo utrpí poranění mozku, výsledné poškození

Dochází ke kaskádě „sekundárního vlastní mozku spouštějí otok a

ΦΦΦ·

- 11 neurotransmiter zvaný glutamát, který se může brzy nahromadit do úrovně, která je toxická pro okolní neurony.

5) Rehabilitace mrtvice

V rámci předkládaného vynálezu je rehabilitace mrtvice definována jako zákrok, jehož výsledkem je obnovení funkcí, které byly ztraceny kvůli mrtvici.

6) Mtrtvice

V rámci předkládaného vynálezu dochází k mrtvici v případě, že krevní sraženina blokuje krevní cévu či artérii, nebo v případě, že dochází k narušení krevní cévy, což přerušuje tok krve do oblasti mozku. Pokud nastane mrtvice, dochází k úmrtí mozkových buněk v bezprostředním okolí. Lékaři tuto oblast mrtvých buněk nazývají infarktem. Tyto buňky obvykle umírají během minut až několika málo hodin po počátku mrtvice. Ukazatelé demyelinace, jako je magnetizačni přenosový poměr (MTR) , jsou u mrtvice úzce spojeny s axonálním poškozením, které koreluje s motorickým deficitem (Pendlebury a kol., 2000) .

7) Alkylová či alkylenová skupina

Pokud není řečeno či naznačeno jinak, znamenají termíny „alkylová skupina či „alkylenová skupina rozvětvenou nebo přímou alkylovou či alkylenovou skupinu, jak to odpovídá vzori, vymezená množstvím uhlíkových atomů v alkylové skupině, např. alkylová skupina obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů znamená, podle okolností, jedno-, dvou-, tří-, čtyř-, pětinebo šestiuhlíkatý, rozvětvený či přímý řetězec alkylové či alkylenové skupiny, nebo se počet uhlíkových atomů pohybuje v libovolném rozmezí spadajícím do tohoto rozsahu, počet atomů uhlíku například, avšak bez omezení, činí 1 až 2, 1 až 3, 1 až

• · · • · • · *

9· ··

Η ·*·«

4, 1 až 5, 2 až 3, 2 až 4, 2 až 5, 2 až 6, 3 až 4, 3 až 5, 3 až 6, 4 až 5, 4 až 6, 5 až 6, atd.

8) Alkoxyskupina obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů

Pokud není řečeno či naznačeno jinak, znamená termín „alkoxyskupina obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů přímou či rozvětvenou alkoxyskupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů. K příkladům takové alkoxyskupiny patří methoxyskupina, ethoxyskupina, n-propoxyskupina, isopropoxyskupina, n-butoxyskupina, isobutoxyskupina, sec-butoxyskupina, terc-butoxyskupina a přímé či rozvětvené pentoxyskupiny a hexoxyskupiny.

9) Halogenu

Pokud není řečeno či naznačeno jinak, má termín „halogen znamenat fluor, chlor, brom nebo jod.

10) Alkanová kyselina obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů

Pokud není řečeno či naznačeno jinak, má termín „alkanová kyselina obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů znamenat karboxylovou kyselinu, u níž je karboxylová skupina navázána na atom vodíku nebo alkylovou skupinu obsahující od 1 do 5 uhlíkových atomů.

10) Alkanoylová skupina obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů

Termín „alkanoylová skupina obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů má znamenat skupinu získanou odstraněním hydroxyskupiny z karboxyiové skupiny alkanové kyseliny obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, a proto zahrnuje například formylovou skupinu, acetylovou skupinu apod. Termíny „alkanoylová skupina, alkenoylová skupina a „alkynoylová skupina mají znamenat skupiny získané odstraněním hydroxyskupiny z karboxyiové skupiny alkanové kyseliny, alkenové kyseliny, • · • ·

respektive alkynové kyseliny. Tak je například linoleylová skupina odvozená o kyseliny linolové příkladem termínu „alkenoylová skupina definovaného výše.

12) Termín „farmaceuticky přijatelné soli znamená buď adiční sůl s kyselinou nebo adiční sůl s bází, která je slučitelná s léčením pacientů pro zamýšlené použití.

13) „Farmaceuticky přijatelnou adiční sůl s kyselinou libovolná netoxické, organická či anorganická, adiční s kyselinou bazických sloučenin libovolného z jejich meziproduktů, kyselin, které vytvářejí vhodné je sůl obecného vzorce I či K příkladům anorganických soli, patří kyselina chlorovodíková, kyselina bromovodíková, kyselina sírová a kyselina fosforečná, a kyselé soli kovů, jako jsou monohydrogenorthofosforečnan sodný a hydrogensíran draselný. K příkladům organických kyselin, které vytvářejí vhodné soli, patří mono-, di- a trikarboxylové kyseliny. Příklady těchto kyselin jsou například kyselina octová, kyselina glokolová, kyselina mléčná, kyselina pyrohroznová, kyselina malonová, kyselina jantarová, kyselina glutarová, kyselina fumarová, kyselina jablečná, kyselina vinná, kyselina citrónová, kyselina askorbová, kyselina maleinová, kyselina hydroxymaleinová, kyselina benzoová, kyselina hydroxybenzoová, kyselina fenyloctová, kyselina skořicová, kyselina salicylová, kyselina 2-fenoxybenzoová, kyselina p-toluensulfonová, a sulfonové kyseliny, jako jsou kyselina methansulfonové a kyselina 2-hydroxyethansulfonová. Mohou být vytvořeny buď adiční soli s obsahem jedné nebo dvou molekul kyseliny, a tyto soli mohou být buď v hydratované nebo solvatované nebo v podstatě bezvodé formě. Obecně jsou adiční soli těchto sloučenin s kyselinou rozpustnější ve vodě a různých hydrofilních organických rozpouštědlech, a v porovnání s jejich volnými bázemi obecně vykazují vyšší teploty tání.

• · · ·

14) Termín „farmaceuticky přijatelné adiční soli s bází znamená netoxické, organické nebo anorganické, adiční soli s bází sloučenin obecného vzorce I nebo libovolného z jejich meziproduktů. Příklady jsou hydroxidy alkalických kovů nebo kovů alkalických zemin, jako jsou hydroxid sodný, hydroxid draselný, hydroxid vápenatý, hydroxid hořečnatý nebo hydroxid barnatý; amoniak a alifatické, alicyklické nebo aromatické organické aminy, jako je methylamin, trimethylamin a pikolin. Kritéria pro zvolení vhodné soli jsou odborníkovi v oboru známá.

15) Termín „stereoisomery je obecným termínem pro všechny isomery jednotlivých molekul, které se liší pouze orientací jejich atomů v prostoru. Zahrnuje zrcadlové isomery (enanciomery), geometrické (cis/trans) isomery a isomery sloučenin s více než jedním chirálním centrem, které nejsou navzájem zrcadlovými isomery (diastereomery).

16) Termín „pacient znamená teplokrevného živočicha, jako jsou například krysy, myši, psi, kočky, morčata a primáti, jako jsou lidé.

17) Termín „léčit či „léčba znamená mírnění symptomů, odstraňování příčin symptomů, a to buď na přechodné nebo permanentní bázi, nebo předcházení či zpomalování projevů symptomů jmenovaných onemocnění či stavů.

18) Termín „terapeuticky účinné množství znamená množství sloučeniny, které je účinné při léčení jmenované poruchy, onemocnění či stavu.

19) „Farmaceuticky přijatelným nosičem je netoxické rozpouštědlo, dispergační činidlo, pomocná látka, adjuvans nebo jiný materiál, který se smísí s účinnou látkou za účelem umožnění vytvoření farmaceutické kompozice, t j. dávkové formy schopné podávání pacientovi. Jedním z příkladů takového nosiče • ·· je farmaceuticky přijatelný olej, typicky používaný pro parenterální podávání.

20) Termín „neuropatická bolest znamená bolest, která je výsledkem poškození nervového systému. Nervové poškození může být identifikováno nebo může být neidentifikované. K příkladům neuropatické bolesti patří post-herpetická neuralgie, bolestivá diabetická neuropatie, fantomová bolest končetin a centrální pomrtvičná bolest.

21) Termín „iritace a dysfunkce močového měchýře znamená stav, jako je intersticiální cystitida a nadměrná aktivita močového měchýře. Nadměrná aktivita močového měchýře je určitý lékařský stav vyznačující se symptomy zahrnujícími frekvenci močení, naléhavost močení a urgentní ikontinenci, tj . neúmyslný únik moči, ke kterému dochází po silném náhlém nucení na močení. Diagnózu nadměrně aktivního močového měchýře se vysloví v případě nepřítomnosti lokálních příčin či příčin souvisejících s metabolismem, se symptomy, které lze připsat mimovolním kontrakcím močového měchýře způsobeným nadměrnou aktivitou svalového detruzoru. Intersticiální cystitida (IC) je chronický zánětlivý stav stěny močového měchýře, který často probíhá nediagnostikován.

Sloučeniny obecného vzorce I mohou účinně zlepšovat rychlost a stupeň uzdravení u akutního míšního poranění a dlouhodobého míšního poranění. Vykazují vlastnosti, které jsou v souladu s blokádou sodíkových kanálů závislou na aplikaci a blokádou draslíkových kanálů závislou na napětí in vivo. Poskytují bezpečnější léčiva než 4-AP. Obzvláště výhodné jsou sloučeniny, ve kterých R znamená atom vodíku, atom halogenu, trifluormethylovou skupinu nebo alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů; R_x znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů; R2 znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů; R₃ znamená atom vodíku, alkylovou skupinu obsahující 1 • · • · • ·

- 16 až 6 uhlíkových atomů nebo atom halogenu; a p znamená 0. Dalšími výhodnými sloučeninami jsou sloučeniny, ve kterých je aminoskupina navázána v poloze 4 pyridinového kruhu.

Ještě výhodnější jsou sloučeniny vzorců II [též známá jako HP184 nebo N-(3-fluor-4-pyridinyl)-N-propyl-3-methyl-lH-indol-1-amin] a III (též známá jako „8183).

(II)

(III)

HP 184 je velmi dobře snášena u krysy v mikromolárních mozkových koncentracích jednu hodinu po i.p. podání 30 mg/kg HP 184 (Smith a kol., 1996).

Jedinečná kombinace blokády sodíkových kanálů závislé na aplikaci a blokády draslíkových kanálů závislé na napětí sloučeniny podle předkládaného vynálezu též odlišuje od „čistých blokátorů sodíkových kanálů, jako je carbamazepin a fenytoin. Tato činidla byla úspěšně použita ke zmírnění „pozitivních symptomů MS (bolestivý tonický záchvat a • · · · · · • ·

dysestézie). Zhoršují však negativní symptomy (paralýza a hypestézie)(Sakurai a Kanazawa, 1999). Sloučeniny podle předkládaného vynálezu zvyšují neuronální funkci díky skutečnosti, že blokují draslíkové kanály. Toto napomáhá funkčnímu zotavení. V současnosti se věří, že jsou blokátory sodíkových kanálů použitelné při léčení bolestivých symptomů nebo/a jako neuroprotektivní činidla. Neočekávalo se však, že by zvyšovaly intenzitu rehabilitace.

Při léčení pacientů postižených stavy a poruchami popsanými výše lze podávat sloučeninu obecného vzorce I formě či libovolným způsobem, které činí biologicky dostupnou což zahrnuje orální, v libovolné sloučeninu množstvích, subkutánní, intranazální, v terapeuticky účinných sublinguální, bukální, intramuskulární, intravenózní, transdermální, rektální, topické podávání apod. Odborník v oboru přípravy přípravků může stanovit patřičnou formu a způsob podávání v závislosti na konkrétních vlastnostech sloučeniny zvolené pro léčený stav či onemocnění, stupni onemocnění, stavu pacienta a dalších relevantních okolnostech. Viz například Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. vydání, Mack Publishing Co. (1990), zde zahrnut zmínkou.

Sloučeniny obecného vzorce I lze podávat samotné nebo ve formě farmaceutické kompozice v kombinaci s farmaceuticky přijatelnými nosiči, jejichž poměrná část a povaha je dána rozpustností a chemickými vlastnostmi zvolené sloučeniny, zvoleném způsobu podávání, standardní farmaceutickou praxí a dalšími releventními kritérii.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu lze podávat orálně, například ve formě tablet, pastilek, kapslí, elixírů, suspenzí, roztoků, sirupů, oplatek, žvýkaček apod. a mohou obsahovat jednu či více z následujících pomocných látek:

mikrokrystalická celulóza, tragantová guma excipienty, jako je škrob a laktóza;

pojivá, jako je nebo želatina;

• · · · · · ·· ·· ·· ·· desintegrační činidla, jako je kyselina alginová, Primogel, kukuřičný škrob apod.; lubrikanty, jako je stearát hořečnatý nebo Sterotex; glidanty, jako je koloidní oxid křemičitý; a sladidla, jako je sacharóza nebo sacharin či aromatická činidla, jako je peppermint, methylsalicylát nebo pomerančové ochucovadlo. Pokud je dávkovou jednotkou kapsle, může kromě látek výše uvedeného typu obsahovat kapalný nosič, jako je polyethylenglykol nebo mastný olej. Další jednotkové dávkové formy mohou obsahovat různé materiály, které modifikují fyzikální formu dávkové jednotky, jako jsou např. potahy. Tablety či pilule tak mohou být potaženy cukrem, šelakem nebo dalšími činidly pro enterické potahy. Sirup může kromě sloučenin podle vynálezu obsahovat sacharózu, jako sladidlo a určitá konzervační činidla, barviva a barvící činidla a ochucovadla.

Sloučeniny obecného vzorce I podle předkládaného vynálezu lze také podávat topicky, a pokud se tak činí, může nosič vhodně obsahovat rozpouštědlový, masťový či gelový základ. Základ může například zahrnovat jednu či více z látek, jako jsou vazelína, lanolin, polyethylenglykoly, včelí vosk, minerální olej, ředidla, jako je voda a alkohol, a emulgační činidla a stabilizátory.

Roztoky a suspenze mohou též zahrnovat jednu či více z následujících pomocných látek: sterilní ředidla, jako jsou voda pro injekce, fyziologický roztok, nevysychající oleje, polyethylenglykoly, glycerin, propylenglykol či další syntetická rozpouštědla; antibakteriální činidla, jako je benzylalkohol nebo methylparaben; antioxidanty, jako je kyselina askorbová nebo hydrogensiřičitan sodný; chelatační činidla, jako je kyselina ethylendiamintetraoctová; pufry, jako jsou acetáty, citráty nebo fosfáty a činidla pro úpravu tonicity, jako je chlorid sodný či dextróza. Parenterální přípravek může být uzavřen v ampuli, stříkačce pro jednorázové použití či vícedávkové nádobce.

Vysoce lipofilní estery, amidy a karbamáty podle předkládaného vynálezu jsou schopné ustáleného uvolňování u savců po dobu několika dní či od přibližně jednoho do čtyř týdnů, pokud jsou upraveny a podávány v podobě depotních přípravků, jako například, pokud jsou injekčně vpraveny ve vhodně zvoleném farmaceuticky přijatelném oleji. Výhodné oleje jsou rostlinného původu, jako je sezamový olej, bavlníkový olej, kukuřičný olej, kokosový olej, sojový olej, olivový olej apod., nebo jsou jimi syntetické estery mastných kyselin a polyfunkčních alkoholů, jako je glycerol nebo propylenglykol.

Depotní kompozice podle předkládaného vynálezu se připraví rozpuštěním vysoce lipofilního esteru, amidu či karbamátu podle předkládaného vynálezu ve farmaceuticky přijatelném oleji za sterilních podmínek. Olej se zvolí tak, že se dosáhne uvolňování účinné látky v průběhu požadovaného období. Vhodný olej může odborník v oboru lehce stanovit na základě dosavadního stavu techniky a bez přílišného experimentování.

Dávkové rozmezí, při něž sloučeniny obecného vzorce I vykazují svoji schopnost terapeutického účinku, se liší v závislosti na konkrétním léčeném onemocnění či stavu a jeho závažnosti, pacientovi, přípravku, dalších doprovodných chorobných stavů, jimž pacient trpí, a dalších medikacích, které mohou být pacientovi současně podávány. Obecně mohou sloučeniny obecného vzorce I vykazovat svoje terapeutické účinky v dávkách pohybujících se mezi 0,001 mg/kg tělesné hmotnosti pacienta/den do přibližně 100 mg/kg tělesné hmotnosti pacienta/den.

Následující příklady provedení vynálezu mají sloužit pouze k ilustrativním účelům a nemají tedy v žádném ohledu omezovat rozsah předkládaného vynálezu.

• · ·· ···· • · «

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

In vivo prokázání souladu s blokádou sodíkových kanálů závislou na napětí

Metody

Postup experimentu byl založen na metodě popsané BachauB a kol. (1992). Samčí CD-I myši anestezovány chloralhydrátem mikroskopem byl proveden 3mm pravou orbitou.

provedena malá o hmotnosti 35 až 40 g byly (400 mg/kg) . Pod operačním vertikální kožní řez 2 mm za

Spánkový sval byl odsunut stranou a byla kraniotomie k odhalení důry. Důra byla incidována a odsunuta stranou a byla obnažena distální část pravá střední karotické artérie. Artérie byla okludována před hlavní bifurkací bipolární elektrokoagulací jemnou svorkou. O 24 hodin později byl změřen objem infarktu pomocí 2% roztoku trifenyltetrazoliumchloridu. V rámci tohoto experimentálního pokusu byl nelačným myším (10 ve skupině) hodinu před okluzí orálně podán HP 184. Snižování objemu infarktu bylo založeno na porovnání s myšmi ošetřenými 1% kyselinou octovou, tj. vehikulem. Výsledky ukazuje tabulka 1.

Tabulka 1

Neuroprotektivní aktivita HP 184 v myším modelu mrtvice pMCAO

Dávka (mg/kg, p.o.)	Čas (min.)	% snížení objemu infarktu (střed ± SEM)
1	-60	21 + 3
10	-60	32 ± 11*
10	-60	40 ± 2,5**

SEM = standardní chyba měření, * = p<0,05; ** = p<0,01

00·· • 0 0 •00 • 0 0 • 0 0 0

00 • ·

Neuroprotekce pozorovaná v myším modelu permanentní okluze střední karotické artérie (pMCAO) je, při této dávce a času, v souladu s in vivo blokádou sodíkových kanálů závislou na napětí.

Příklad 2

Účinek HP 184 na edém pofototrombotické cerebrální lézi u krysy

Princip/cíl

Tromboembolická mrtvice je třetí příčinou smrti v západním světě. Je způsobena krevní sraženinou nebo rozpadajícím se trombem, a to buď vytvořeným v cerebrální cirkulaci nebo vytvořeným v srdci či velkých cévách a doneseným do cerebrální cirkulace. Poté se přerušuje krevní průtok a objevuje se ischemická léze s edémem, nekrózou a apoptózou tkáně. Edém je zhoubný, neboť stlačuje mozek, což podporuje ischémii a také lýzu buněk a mechanické poranění. Léčba pomocí HP 184, tj . společného blokátoru Na⁺/K⁺ kanálů, byla testována na účinky na tento cerebrální edém.

Metoda

Samčí krysy Sprague Dawley (180 až 200 g tělesné hmotnosti) byly anestezovány chloralhydrátem (400 mg/kg i.p.) a umístěno ve stereotaktickém zařízení. Byla otevřena kůže za účelem obnažení lebky a do kontaktu s pravou stranou lebky před lambdu bylo umístěno studené světlo (Bioblock 150W). Intravenózně bylo podáno barvivo Bengál rose (10 mg/kg i.v. ve fyziologickém roztoku) a bezprostředně poté bylo započato osvětlování lebky a bylo v něm pokrčováno 5 minut. Kůže byla poté uzavřena suturou nad lebkou a zvířata byla navrácena do jejich klecí. Dvacet čtyři hodiny po fototrombotické lézi byl zvířatům intravenózní cestou podán HP 184 připravený v 1% • · > fl ·· ·· ·*··

- 22 » · · fl

99

9 9 9 • 9 9 fl ♦ ♦ ·♦ • · · fl • · · fl ·· ·· tweenu ve vodě v dávce 0, 10 nebo 20 mg/kg tělesné hmotnosti v objemu 5 ml/kg. 0 hodinu později byla zvířata usmrcena jejich mozky (protokol viz odebrány v místě léze a použití korkového vrtáku dekapitací a byly odebrány dodatek). Vzorky kůry byly kontralaterálně vůči lézi za průměru 6 mm. Pomocí vlhké hmotnosti tkáně/suché hmotnosti tkáně byl u každé krysy stanoven obsah vody a edém byl vyjádřen jako procentuální nadbytek vody ve vzorku z léze oproti vzorku z kontralaterální hemisféry.

Výsledky ukazuje tabulka 2

Tabulka 2

Terapie 24 h po lézi	n	edém (% nadbytek vody) 25 h po lézi
vehikulum	26	4,10 ± 0,12
HP 184 10 mg/kg i.v.	12	3,61 ± 0,23 ns
HP 184 20 mg/kg i.v.	13	3,20 ± 0,27**

statistické údaje: ANOVA plus Tukey-Kramer ** = p<0,001

HP 184 vykázal významné (22 %) snížení edému v kůře pravého mozku jednu hodinu po i.v. podání v dávce 20 mg/kg a 25 h po fototrombotické lézi.

Přiklad 3

Princip/cíl

Při této studii byl HP 184 podáván 1 hodinu po nástupu ischémie v modelu přechodné cerebrální ischémie u krys.

Měřenými parametry byly velikost léze a neurologická funkce.

Φ Φ · • φ · φ φ φφφφ φ φ φφ • φ φ φ • φ φ φ φφ φ φ

Metody

Samčí krysy Sprague-Dawley (Iffa Credo, Francie) o hmotnosti přibližně 220 až 240 g byly anestezovány halothanem (1,4%) ve směsi oxidu dusného a kyslíku (70:30). Byly izolovány obě společné karotické artéríe (CCAs). Levá střední cerebrální artérie (MCA) obnažená prostřednictvím temporální kraniotomie byla okludována pomocí mikrosvorky a současně byly okludovány na dobu 1 hodiny CCAs. Jak tělesná, tak cerebrální teplota, byly udržovány normotermické. Po chirurgickém zákroku byla zvířata navrácena do jejich domácích klecí v místnosti vyhřáté na 24 až 26 °C.

HP 184, rozpuštěný v 1% tweenu (v injikovatelné sterilní vodě), byl podáván v dávce 10 a 20 mg/kg i.v. po nástupu ischémie, a kontrolním krysám bylo podáno vehikulum podle stejného protokolu. 24 h po ischémíi byla slepě zhodnocena neurologická funkce za použití devítibodové hodnotící stupnice.

Hodnotící stupnice použitá pro neurologickou funkci

Položka				Normální skóre	Deficit
Umisťovací reakce
Věšení končetiny	levá	přední	tlapa	1	0
	levá			1	0
Vizuální				1	0
Uchopovací reflex	levá	přední	tlapa	1	0
	levá			1	0

Vzpřimovací reflex

Skloněná hlava	levá strana pravá	1 1	0 0
Abnormální držení	těla	nepřítomno	přítomno
Kroucení hrudníku		1	0
Flexe levé přední	končetiny	1	0
Celkové neurologické skóre	9

* “fl ·

• · β* ·»*♦

·* fl ·· ♦ 9 • · · • · ··

Poté byly krysy usmrceny a mozky byly vyjmuty. Byly nařezány čerstvé řezy mozkové matrix a byly při 37 °C po dobu 5 min barveny 2% trifenyltetrazoliumchloridem. Řezy byly poté uchovávány v 10% formalinu při 4 °C po dobu 24 h. Oblasti infarktu byly měřeny obrazovým analyzátorem (Leica Q500).

Výsledky

Ischémie vyvolala objevení cerebrálních lézí, a to jak v kůře tak v corpus striatum (viz obr. 1, který ukazuje účinek HP 184 na poškození mozku při 10 a 20 mg/kg i.v. bolu 1 hodinu po okluzi MCA) . V dávce 10 mg/kg i.v. HP 184 významně snižuje mozkové léze o 41 % (p < 0,05). Toto snížení bylo významné v kůře (-45 %, p < 0,05).

Příklad 4

Měření blokády draslíkových kanálů

Metody

Buňky PC12 (ATCC, Rockville, MD) byly kultivovány v Dulbeccem modifikovaném Eaglově médiu doplněném 10% fetálním hovězím sérem (GIBCO BRL Grand Island, NY).

Proudy draslíkových kanálů byly měřeny za použití standardního elektrofyziologického protokolu terčíkového zámku (patch clamp), jak byl dříve popsán (Rampě a kol., 1998).

Výsledky a diskuse

Proudy draslíkových kanálů byly vyvolány 200ms svorkovými pulsy na +40 mV z udržovacího potenciálu -80 mV. Výsledkem tohoto protokolu byl ustálený, ven namířený proud. Aplikací HP

184 (10 pmol) byla snížena amplituda tohoto proudu a zvýšena míra slábnutí proudu. Pokud byl proud měřen na konci pulsu,

9999

9

4

9

9 9

99

9 ·· ** ·* FA ·**· »·«« • · ·· 9 « ·« • · · · · * · · « • * · · · 4 · <

9» «· byla amplituda proudu snížena pomocí HP 184 o 75 ± 4 % (n = 4) . Výsledky jsou v souladu s představou, že HP 184 účinkuje jako antagonista K⁺ kanálů závislých na napětí blokováním aktivovaného stavu.

Příklad 5

In vivo prokázání zvýšení svalové funkce

Princip synaptosomů 1995; Tapi anorganickém barvivu Ruthenium red (RuR) bylo publikováno, že blokuje Ca²⁺ proud závislý na napětí u různých typů buněk, včetně myších senzorických neuronů (Duchen, 1992), a neuromuskulárních přípravků (Hamilton a Lundy, a Velasco, 1997). Dále RuR blokuje uvolňování neurotransmiterů v mozkových synaptosomech (Meza-Ruiz a Tapia, 1978; Tapia a Meza-Ruiz, 1977) a neuromuskulární spojení (Alnaes a Rahamimoff, 1975; Person a Kuhn, 1979). In vivo způsobuje intraperitoneální (i.p.) podávání RuR u myši chabou paralýzu (Tapia a kol., 1976) a tento účinek je antagonizován 4-aminopyridinem (4-AP), blokátorem K⁺ kanálů závislých na napětí (Tapia, 1982). Tapia a Velasco (1997) posoudili účinky RuR jak in vivo, tak in vitro, a vyslovili hypotézu, že RuR působí na místa Ca umístěna v membráně nervového zakončení. Vazebné studie naznačují, že RuR selektivně blokuje Ca²⁺ kanály že tyto kanály regulují tok uvolnění neurotransmiterů. že i.p. podávání RuR může

Eaton-Lambertova syndromu

Ca²⁺ směrem dovnitř, Tito autoři také být experimentálním myastenie gravis, typu N, a nutný pro naznačuj ί, modelem autoimunitního onemocnění vyznačujícího se blokádou vstupu Ca²⁺a uvolňování ACh způsobenou protilátkami, které se vážou na Ca²⁺ kanály typu N. V souladu s touto možností, bylo o 4-AP publikováno, že u pacientů zlepšuje svalovou slabost a obnovuje neuromuskulární přenos (Lundh a kol., 1977a; 1997b;

1979; McEvoy a kol., 1989; Aisen a kol., 1995).

• ·

I

9« • · • 9 9 • 9 99 • 9 ·

Schopnost jak 4-aminopyridinu (4-AP), tak guanidinu, antagonizovat chabou paralýzu vyvolanou RuR je možná způsobena jejich schopností usnadnit uvolňování neurotransmiteru (Lundh, 1978; Lundh a Thesleff, 1977; Tapia a Stiges, 1982). V každém případě Tapia a spolupracovníci (Tapia a Stiges, 1982) oznámili, že RuR blokuje v synaptosomech uvolňování vyvolané prostřednictvím 4-AP.

In vitro zvyšuje HP 184 uvolňování neurotransmiteru odlišným mechanismem než 4-AP. Ve vysokých koncentracích zvyšuje 4-AP jak elektricky stimulované, tak spontánní, uvolňování, tyto účinky však jsou závislé na vápníku. Oproti tomu HP 184 zvyšuje pouze spontánní uvolňování neurotransmiteru nezávislé na vápníku (Smith a kol., 1993). Byla také vyslovena hypotéza, že spontánní uvolňování má in vivo funkční roli (Smith a kol., 1996).

Cílem následujícího pokusu bylo stanovení skutečnosti, zda by HP 184 a 4-AP mohli antagonizovat paralyzující účinek RuR po souběžné injekci.

Metody a výsledky

Skupinám 4 až 5 myší (CD-I; Charles River; 25 až 35 g) bylo odděleně, avšak souběžně, injekčně i.p. podáno barvivo Ruthenium red a vehikulum (1% ledová kyselina octová), barvivo Ruthenium red a 4-AP nebo barvivo Ruthenium red a HP 184. V rámci tohoto pokusu byla testována též sloučenina známá jako „8183. Se začátkem 15 minut po injekcích byly myši umístěny do blízkosti „stožárového zařízení a byla zaznamenána jejich schopnost nést vlastní tělesnou hmotnost (tj . držet držet se stožáru a nespadnout). Výsledky byly zaznamenávány v podobě počtu myší, které mohli nést vlastní tělesnou hmotnost oproti celkovému počtu testovaných myší, Tyto výsledky ukazuje tabulka 3. Všechny pokusy byly provedeny mezi 14 a 16:30 h.

• · • ·

Tabulka 3

látka, dávka	látka, dávka	15 min	30 min	4 5 min
RuR, 30 mg/kg i.p.	vehikulum	29 z 69 (42 %)	19 z 69 (27,5 %)	18 ze 64 (30,4 %)
	0,3 mg/kg 4-AP	22 z 25 (88 %)	13 z 25 (52 %)	12 z 25 (48 %)
	0,6 mg/kg 4-AP	12 ze 14 (85,7 %)	8 ze 14 (57,1 %)	8 ze 14 (57,1 %)
	30 mg/kg HP 184	15 z 15 (100 %)	15 z 15 (100 %)	15 z 15 (100 %)
	10 mg/kg HP 184	14 z 15 (93,3 %)	12 z 15 (80 %)	11 z 15 (73,3 %)
	30 mg/kg 8183	13 ze 14 (92,8 %)	13 ze 14 (92,8 %)	14 ze 14 (100 %)
	100 mg/kg DPH	11 z 20 (55 %)	10 z 20 (50 %)	10 z 20 (50 %)
	30 mg/kg DPH	4 z 15 (26,7 %)	3 z 15 (20 %)	4 z 15 (26,7 %)
	10 mg/kg RIL	9 z 15 (60 %)	4 z 15 (26,7 %)	4 z 15 (26,7 %)

Závěr

Jak 4-AP (i.p.), tak HP 184 (i.p.), může antagonizovat chabou paralýzu vyvolanou i.p. podáním RuR. Z toho vyplývá, že je HP 184 schopen zvyšovat neuronální transmisi in vivo, možná prostřednictvím blokády K⁺ kanálů. Je též možné, jako je to u 4-AP, že HP 184 zvyšuje neuronální transmisi, protože pokusy in vitro s mozkovými řezy dokládají zvýšené uvolňování mozkových neurotransmiterů (Smith a kol., 1993; 1996).

Dávky blokátorů sodíkových kanálů difenylhydantoinu (DPH) a riluzolu (RIL) testované v rámci tohoto pokusu, se dříve ukázaly jako neuroprotektivní v modelech fokální ischémie • · ·· ·· • · · · • · (Rataud a kol., 1994; 0'Neill a kol., 1997). Chybění jejich účinku v tomto modelu podporuje interpretaci, že schopnost HP 184 antagonizovat chabou paralýzu vyvolanou RuR pravděpodobně není způsobena in vivo blokádou sodíkových kanálů. Toto se předpokládá rovněž klinicky. Negativní symptomy MS (ztráta hybnosti) jsou často blokátory sodíkových kanálů zhoršovány (Sakurai a Kanazawa, 1999).

Příklad 6

Modely míšního onemocnění ze stlačení

Princip a cíle

Gruner & Yee (1999) ukázaly, že 4-AP u krys 25 dnů po poškození míchy zvyšuje mMEP's po odstupňovaném míšním poranění. Za použití stejného postupu byla stanovena funkční chování. 0 těchto chováních se ukázalo, že jsou v korelaci s minimálním mMEP. Cíl těchto pokusů byl dvojí:

1) stanovit, zda může HP 184 zmírnit motorická poškození střední intenzity vyvolaná stlačením míchy, pokud je podáván akutně, a srovnat jeho účinnost s methylprednisolonsukcinátem (MPSS) a

2) stanovit, zda může HP 184 zlepšit motorické funkce u krys s dlouhodobým (25 dní) míšním poraněním malé intenzity, a srovnat jeho účinky se 4-aminopyridinem (4-AP).

Akutní léčba - i.p. podávání

Míchy samičích krys byly vystaveny laminektomii (falešná, n=12) nebo byly stlačeny na průměr 1,4 mm (5 skupin, n = 12 každá). Normální průměr míchy činí přibližně 2,5 mm. Toto stlačení představuje střední poranění vyznačující se počátečním skórem chůze v otevřeném prostoru (Open Field • · ··· ·

Walking score) ve výši 1,5 až 2,5 podle stupnice Open Field Walking Scaie. Definice Open Field Walking Scale (OFT) jsou následuj ící:

0,0 žádné spontánní pohyby

0,7 lehké pohyby

1,0 pohyby v kyčli nebo/a koleni (nikoliv v kotníku)

1.3 aktivní pohyby v kyčli a koleni, nikoliv v kotníku

1.7 sporné pohyby v kotníku

2,0 pohyby končetiny ve všech třech velkých kloubech

2.3 pokusy o podepření

2.7 podepření pouze v postoji

3,0 aktivní podepření, nekoordinované pohyby

3.3 přerušované záchvaty koordinované chůze

3.7 absence kontroly kotníku či nohy, chůze na kloubech nebo mediální ploše nohy

4,0 koordinace předních končetin a zadních končetin při chůzi

4.3 lepší posturální opora zadních končetin, břicho neklesá k zemi

4.7 jeden či dva prsty se táhnou, lehká nestálost obracení v plné rychlosti

5,0 normální chůze a základna opory, žádná ztráta rovnováha při rychlých obratech, žádné tahání prstů

Léčení léčivy

Během 15 minut stlačování (den 1), byly krysám ve skupinách označených HP 184 podávány i.p. injekce 20, 10, 5 nebo 0 mg/kg v 1% vehikulu v podobě ledové kyseliny octové. Toto podání bylo opakováno ve dnech 2 a 3. Na druhou stranu MPSS byl podáván v dávce 30 mg/kg 15 minut, 2 h, 4 h a 6 h v den 1 po stlačení. Tento dávkovači režim MPSS byl popsán v literatuře jako optimální lidí. MPSS je v současné schválenou pro lidské poranění míchy. Obr chování (OFT) různých léčebných skupin a odráží dávkování prováděné u době jedinou lékovou terapií ukazuje skóre v průběhu času.

··· · «« ··

Normální předoperační skóre činí 5. Rychlost a rozsah zlepšování byl jak u skupiny s dávkou 20 mg/kg, tak u skupiny s dávkou 5 mg/kg, odlišný než u krys ošetřovaných vehikulem. Každý bod představuje střední hodnotu plus SEM 8 až 12 krys.

Akutní léčení - p.o. podávání

Opět byly míchy samičích krys podrobeny laminektomii nebo stlačení na průměr 1,4 mm. Ve skupinách HP 184 byly krysy orálně ošetřeny 5 až 10 minut před stlačením, a poté jednou denně ve dnech 2 a 3. MPSS byl podáván, jak bylo pospáno výše. Skóre chování (OFT) ukazuje obr. 3. Normální předoperační skóre činí 5.

Rychlost a rozsah zlepšování byly v porovnání se skupinou ošetřenou vehikulem lepší u všech dávek, včetně skupiny s 10 mg/kg. Každý bod představuje střední hodnotu plus SEM 12 krys.

Pokus s chronickým stlačením

Míchy samičích krys byly podrobeny laminektomii nebo stlačení na průměr 1,6 mm. Toto představuje malé poranění a bylo označeno jako vedoucí ke skóre OFT ve výši 4,0 po 25 dnech bez léčení. Toto bylo zvoleno v rámci pokusu o vytvoření stejného stupně motorického poškození, jako bylo popsáno Gruner a Yee (1999), kteří prokázali zlepšení u záznamů miniaturních koncových potenciálů (MEPP) na zadní končetině vyvolané 4-APOD. O tomto postupu a délce neléčeného poškození bylo rovněž prokázáno, že vede k demyelinaci. Skóre chování (OFT) ukazuje obr. 4. Obr. 4 ukazuje střední hodnoty a standardní chyby skupin za použití definic stupnice Open Field Walking Scale popsané výše.

V rámci tohoto pokusu byly skóre OFT lehce vyšší (4,3 až

4,5), což ponechává pouze malý prostor pro zlepšeni. Za použití každé krysy jako její vlastní kontroly byla pozorována • ·

shodná zlepšení po orálním podávání HP 184 jednou denně ve dnech 26, 27 a 28. Shodná zlepšení byla pozorována také po 0,6 mg/kg i.p. 4-AP jednou denně. Statistické rozdíly byly založeny na změnách pro každou jednotlivou krysu (každá krysa byla svojí vlastní kontrolou) za použití Mann-Whitneyova U-testu. Všechny testy chování ve dnech 1, 2 a 3 byly provedeny 3 hodin po podání. V den 3 nebylo podáno žádné léčivo (prvním dnem, kdy započalo podávání léčiva byl den 0). Statistické analýzy byly následovně:

mg/kg - významné zlepšení v 3 h až den 3 (p=0,002) v porovnání s vehikulovou kontrolou mg/kg - významné zlepšení ve 30 min a 3 h až 12 h (p=0,014) v porovnání s vehikulovou kontrolou mg/kg - významné zlepšení ve 30 min až 6 h až den 1 (p=0,0027) v porovnání s vehikulovou kontrolou

4-AP - významné zlepšení v 90 min až 3 h a 12 h až den 2 (p=0,0027) v porovnání s vehikulovou kontrolou

Tabulka 4 ukazuje změny ve skóre pro každou skupinu od období před dávkováním do tří hodin po třetí po sobě jdoucí denní dávce.

	Vehikulum stlačení	4-AP stlačení	20 HP stlačení	10 HP stlačení	3 HP stlačení	Laminek. bez stlačení
Před	4,52 ±	4,43 ±	4,54 ±	4,36 ±	4,32 ±	4,87 ±
dávkou	0,04	0, 03	0,02	0, 01	0, 05	0,01
3 h po poslední dávce	4,53 ± 0,03	4,53 ± 0, 02	4,60 ± 0, 02	4,44 + 0,03	4,47 ± 0, 04	4,87 + 0,01

• · ····

Obr. 5 ukazuje změny ve skóre, normalizované pro každou krysu. Graf ukazuje změnu pozorovanou po třech po sobě jdoucích dnech dávkování (od období před dávkováním do 3 h po třetí po sobě jdoucí denní dávce), buď u 0,6 mg/kg 4-AP (i.p.), 20 nebo 10 nebo 3 mg/kg (p.o.). Laminektomie označuje falešnou skupinu. Na obr. 5 je znázorněna střední hodnota ± SEM pro každou skupinu (n = 12).

Účinnost při dlouhodobém míšním poranění

Třicet pět dnů po středním stupni míšního poranění zlepšuje orální podávání 3 mg/kg HP 184 (p.o.) obnovení motoriky po jediné dávce, a denní dávkování po další 4 dny vede na základě definic testu Open Field Walking Test popsaného výše k setrvalému a ustálenému zlepšování. 4-AP byl v dávce 0,6 mg/kg (i.p.) podobně účinný. Tabulkové znázornění výsledků obou studií chronických míšních poranění (léčiva poprvé podávána 25 dní po lehkém stlačení míchy a 35 dní po středním stlačení míchy) ukazuje tabulka 5.

Tabulka 5

Léčení	Den 25 (lehké) před	Den 28 (lehké) 3 h po poslední dávce	Delta	% možného zlepšení (nej vyšší skóre = 5)
Kontrola	4,52 ± 0,037	4,53 ± 0,026	0,01	2 %
4-AP (0,6 mg/kg i.p.)	4,43 ± 0,030	4,53 ± 0,023	0,10	17,5 %*
HP 184 (3 mg/kg p.o.)	4,32 1 0,016	4,47 ± 0,035	0, 15	22,0 %*

• · • · · · • · φ φ ·· φφφφ

Léčení	Den 35 (střední) před	Den 39 (střední) 3 h po poslední dávce	Delta	% možného zlepšení
Kontrola	4,00 ± 0,074	3,99 + 0,057	-0,01	-2 %
4-AP (0,6 mg/kg i.p.)	3,95 + 0,084	4,17 ± 0,047	0,22	22,1 %*
HP 184 (3 mg/kg p.o.)	3,89 ± 0,054	4,17 ± 0,058	0,274	24,8 %*

Jak je ukázáno výše, vykazuje HP 184 v dávce 3 mg/kg/den při orálním podávání od 35 do 41 dní po středním poraněním stlačením významné zlepšení. Při této studii se zjistilo, že v místě poranění poraněných mích krys užívajících HP 184 bylo více myelinu. Tato data poskytují důkaz, který je v souladu s tvrzením, že HP 184 buď zvyšuje remyelinaci nebo snižuje existující demyelinační proces.

Další studie byly provedeny za účelem stanovení nejnižší účinné dávky HP184 u pokusu se středním chronickým (35 dní po poranění) stlačením způsobem dvojitě slepé, placebem a pozitivně kontrolované studie. Dříve pozorované účinky HP 184 v dávce 3 mg/kg p.o. byly potvrzeny pomocí 4-AP (0,6 mg/kg i.p.) jako pozitivní kontroly. Účinek všech terapií byl dále histologicky zkoumán na barvení myelinu.

(1) Behaviorální hodnocení

Sto padesát dospělých samičích krys Wistar o hmotnosti 250 až 300 g, získaných z Charles River, bylo hospitalizováno na dobu alespoň jednoho týdne v McMaster University Health Sciences Centre (HSC) Central Animal Facilities (CAF). Během této doby byly podrobeny výkonovým testům popsaným níže, k zajištění, že byly s nimi obeznámeny. S krysami bylo 2 týdny před chirurgickým zákrokem denně manipulováno.

• · φφ φφφφ

Krysy byly anestezovány za použití isofluranu (3 až 5%) : 02 (1 1/min) ve vhodně vybaveném chirurgickém zařízení v CAF. Pro zmírnění bolesti byl před chirurgickým zákrokem podán temgestic (0,03 mg/kg tělesné hmotnosti, subkutánně (SQ)). Míchy byly poškozeny (stlačeny) 3,5 mm širokou modifikovanou pinzetou (Blight 1991, postup revidovaný Rathboneovou laboratoří). Kleště byly uzavřeny na dobu 15 sekund na 1,4 mm, což vedlo k úrovni poranění ekvivalentní výsledku na střední úrovni Grunerovy stupnice (1996). Kompresní poranění bylo jinak provedeno podle postupu popsaného Blightem (1991).

Zvířata byla pozorována za účelem stanovení jejich bolestivého chování, přítomnosti infekcí močového traktu nebo retence moči. Bolest byla ošetřována pomocí Tynenolu (0,8 mg/10 g tělesné hmotnosti, orálně).

K prevenci močové infekce byla orálně podávána Septra (trimethoprin-sulfamethoxazol)(4,5 ml ve 300 ml vody) 1 den před a 5 dní po operaci, a byly podrobovány manuální expresi močového měchýře. V případě infekce, tj. libovolné infekce močových cest, projevující se zakalenou či krvavou močí, byl dvakrát denně subkutánně (SQ) injekčně podáván Baytril (enrofloxacin, 7 mg/kg tělesné hmotnosti).

Změny lokomotorického chování a segmentálních reflexů byly hodnoceny až do 5 týdnů po poranění. Zvířata byla testována v rámci úlohy chůze v otevřeném prostoru, umístění zadní končetiny a orientaci nohy. Zvířata byla hodnocena ve dnech 2, 7, 14, 21, 28 a 35 po chirurgickém zákroku. 35 dní po chirurgickém zákroku již nedocházelo téměř k žádnému dalšímu spontánnímu zotavování. Proto bylo v den 35 započato s léčbou.

HP 184 byl rozpuštěn ve sterilizované (autoklávované) deionizované reverzně osmotické vody okyselené ledovou kyselinou octovou (0,1 ml kyseliny na 10 ml vody). 4-AP (Sigma, molekulová hmotnost 94,12; Jankowska E. a kol., 1982;

* · · ·

Gruner a kol. 1999) byl rozpuštěn ve fyziologickém roztoku (0,6 mg/kg tělesné hmotnosti) a byl podáván prostřednictvím i.p. injekce. Jedné skupině krys (vehikulová kontrola - 1) bylo orálně podáváno vehikulum. Testování chování bylo prováděno bezprostředně před užitím dávky a 3 h poté. Poté byly krysy v den 35 skarifikovány. Všechny další krysy užívající buď HP 184 orálně (0,3, 1 nebo 3 mg/kg tělesné hmotnosti, v závislosti na skupině) nebo 4-AP (0,6 mg/kg, i.p.) nebo vehikulum (vehikulová kontrola - 2) jednou denně ve dnech 35 až 42 po chirurgickém zákroku. V těchto dnech byly testy chování prováděny bezprostředně před užitím dávky, 2 a 24 h poté. Poté byly krysy v den 43 po posledním testování chování perfundovány.

Ve dnech 35 až 43 po chirurgickém zákroku byly zhotoveny videozáznamy testování chování za použití Hi-8.

Statistické analýzy byly provedeny na počítači Macintosh za použití GB-Stat ppc 6.5.2. Skóre chování bylo analyzováno Kruskal-Wallisovou neparametrickou analýzou rozptylu (ANOVA). Srovnání post hoc bylo učiněno pomocí Mann-Whitneyova U testu.

Přehled zotavování lokomotorické schopnosti v otevřeném prostoru byl hodnocen pomocí středních skóre OFT pro každou skupinu, což ukazují obr. 6a a 6b. Tyto výsledky ukazují, že výkon zvířat ošetřovaných HP 184 či 4-AP byl významně odlišný od výkonu kontrolních zvířat užívajících vehikulum. ANOVA pro opakovaná měření ukazuje účinek léčby (p < 0,01) ve dnech 35 až 42.

Výsledky ukazují že jak 4-AP, tak HP 184, vykazují prospěšné účinky, že zlepšují testování chování po středním chronickém stlačování míchy. Ačkoliv prospěšné účinky vykazují všechny tři koncentrace HP 184, dávka 3 mg/kg HP 184 vykázala nej lepší zotavení lokomotorické funkce, čímž se potvrdily dříve pozorované účinky HP 184 v této dávce. Tyto výsledky též ··· · ·· ·· • · • ··

• · • · 9 • 99 • · · • · · ukazují, že nejnižší (0,3 mg/kg) koncentrace HP 184 nemůže být, v rámci tohoto pokusu, nejnižší účinnou dávkou HP 184.

Míšní histologická studie

Byla provedena studie za účelem zjištění, zda léčení pomocí HP 184 ovlivňuje množství myelinu u krys se středním dlouhodobým míšním poraněním ze stlačení, pokud je podáván dlouho po míšním poranění.

Pro tuto studii byly použity míchy krys popsaných výše v hodnocení.

V pooperační den 21 byly pokusní jedinci hluboce anestezovány pentobarbitalem sodným (50 až 60 mg/kg tělesné hmotnosti, i.p.) a transkardiálně perfundovány - nejprve 100 ml 0,05M fosfátem pufrované solanky (PBS) obsahující 0,1 % heparinu a následně 300 až 500 ml 4% paraformaldehydu (PFA) . Byly odebrány míšní segmenty T9 až LI, poté byly ochráněny před mrazem v 30% roztoku sacharózy a zmraženy při -70 °C v 10,24% polyvinylalkoholu a 4,26% polyethylenglykolu.

Segment z každé míchy zahrnující místo léze plus 10 mm rostrálně a kaudálně byl vložen do media Tissue Tek. Na kryostatu byly podélně ve 20μιη intervalech nařezány sériové řezy. Každý třetí řez byl obarven Luxol fast blue na myelin. Hodnocení bylo provedeno na kódovaném sklíčku slepými pozorovateli, pokud jde o terapii. Řezy byly zkoumány pod světelným mikroskopem z hlediska rozsahu demyelinace (oblast bez zbarvením barvivém Luxol fast blue).

Za účelem stanovení maximální demyelinované oblasti míchy byly celé řezy digitalizovány na fotografiích za použití mikroskopu Zeiss. Rozsah demyelinace byl měřen v centru léze za pomoci počítačového programu pro obrazovou analýzu Bioquant ·· ··· · • · ·· ·· ·* · · » » · · • · ·« • · · · • · · · ·· ··

BQ-TCW98, a to pracovníkem, který byl slepý s ohledem na léčebnou skupinu.

Statistická analýza byla provedena na počítači Macintosh za použití GB-Stat ppc 6.5.2. Histologické výsledky byly analyzovány Kruskal-Wallisovou neparametrickou analýzou rozptylu (ANOVA). Srovnání post hoc bylo učiněno pomocí MannWhitneyova U testu.

Rozsah demyelinace u šesti experimentálních skupin (0,3, 1 nebo 3 mg/kg tělesné hmotnosti v závislosti na skupině nebo 4AP 0,6 mg/kg nebo vehikulová kontrola 1 a 2) ukazuje obr. 7. Jednotky představují počet pixelů demyelinované plochy v centru stlačení. (**P < 0,001, *P < 0,05, Kruskal-Wallisova neparametrická analýza rozptylu (ANOVA)). Kvantitatiovní výsledky ukazují, že míchy ze zvířat léčených HP 184 a 4-AP vykazují významně vyšší myelinovanou plochu než míchy solankových kontrol. To znamená, že míchy ze zvířat, jimž byly podávány injekce vehikula, vykazovaly významně vyšší plochu demyelinace než míchy zvířat léčených buď HP 184 nebo 4-AP.

Histologická analýza ukázala, že jak HP 184 (všechny tři koncentrace), tak 4-AP, vykazují prospěšné účinky na myelinaci, což bylo v souladu s výsledky testování chování. Z těchto skupin vykázali nejmenší demyelinaci zvířata léčená 3 mg/kg HP 184. Proto se 4-AP či HP 184 zdá být schopný zvyšovat remyelinaci ve stavu dlouho po míšním poranění. Je nepravděpodobné, že by data jednoduše představovala snížení rychlosti úbytku myelinu, neboť nebyl pozorován rozdíl v rozsahu demyelinace u dvou kontrolních skupin, tj. kontroly 1 a kontroly 2, hodnocených na počátku a na konci pokusu.

Příklad 7

Účinek intravenózně podávaného HP 184 na iritaci močového měchýře u krysy • 444 ♦

» 4 4 4 *4 44 • 4 44 * 4 4 fl > · 44 » 4 · fl ·« 44 • · 4 « • · 44 • · 4 · • · · fl ·· 4«

Tento pokus ukazuje účinek intravenózně podávaného HP 184 (200.1) . Fraser a kol. s myšlenkou poškodit deštníkovitého typu, v KC1 modelu navrženém Fraserem a kol. kombinovali léčbu protaminsulfátem, funkci bariéry urotelových buněk fyziologické močové koncentrace KC1 (500 mmol). Účinky HP 184 byly porovnávány se samotným vehikulem (n = 4/skupina) v rámci studie kumulativní dávkové odpovědi u urethanem anestezovaných krys s akutní iritací močového měchýře. Ke stanovení účinku léčiva na iritaci měchýře byla použita kontinuální otevřená cystometrie, při které se měří plnění a vyprazdňování močového měchýře během kontinuální infúze. Pokud je močových měchýř iritován, stahuje se během stejné rychlosti plnění častěji, a to kvůli senzitizaci C-vláken aferentních nervů. Obr. 8 ukazuje snížení frekvence kontrakcí močového měchýře od hodnot iritace před podáním v porovnání s účinky samotného vehikula. Analýza rozptylu opakovaných měření ukázala, že zatímco samotné vehikulum nevykazuje žádné účinky, zvyšuje HP 184 významně frekvenci kontrakcí močového měchýře u iritovaných močových měchýřů, a to v závislosti na dávce (P = 0,0019).

Příklad 8

Účinek HP 184 na produkci NO u myší

Myším bylo injekčně podáno 30 mg/kg HP 184 (i.p.) 30 minut před LPS (3 mg/kg, i.p.). 5 hodin po injekci LPS byly myši usmrceny a byla odebrána plasma. Nitrátové hladiny byly stanovovány pomocí Griessovy analýzy. Skupiny byly složeny z 9 až 10 myší, každá. Jak graficky ukazuje obr. 9, inhibuje HP 184 produkci NO. Po jednocestné ANOVA bylo zjištěno, že pouze LPS terapie byla významně odlišná (p < 0,01) od ošetření vehikulem.

0* * 0 0 » 0 • 0 0 »0 ·»« · • 0 • · · · • 11« • 0 0 0 « · · « ·· ««

Příklad 9

HP 184 v modelu neuropatické bolesti

Za účelem vytvoření chronického nervového poranění byla dospělým samčím krysám Sprague-Dawley provedena unilaterální konstrikce L6 nervu. Po zotavení z chirurgického zákroku (3 až 7 dní po operaci) byla zvířata testována na prahové hodnoty odtahování končetiny po mechanickém stimulu aplikovaném na postižené končetině. Tento byl vyvolán aplikací kalibrovaných von Freyových mikrovláken na plantární plochu každé zadní končetiny. Do studie byla zařazena pouze zvířata s 50% snížením prahových hodnot odtahování u ligované končetiny, a tato zvířata byla přidělena do jedné z šesti skupin: třem skupinám byla podávána jedna ze tří dávek HP 184 (0,3, 3 a 20 mg/kg, p.o.), čtvrté skupině byla podávána jediná dávka jiné sloučeniny označované MDL (10 mg/kg, i.p.), páté skupině byl podáván gabapentin (90 mg/kg, s.c.) a šesté skupině bylo podáváno samotné vehikulum. Testování chování bylo provedeno 45 minut po aplikaci gabapentinu (90 mg/kg, s.c.) a 3 hodiny po HP 184, MDL a vehikulu. Pro každé zvíře bylo vypočteno rozdílové skóre mezi prahovými hodnotami odtahování ligované a neligované končetiny, a tyto rozdíly byly podrobeny ANOVA, se skupinou jako hlavním faktorem. Výsledky ukazuje obr. 10. Graf ukazuje střední hodnoty (+/- SEM) rozdílů prahových hodnot odtahování levé (ligované) minus pravé (normální) končetiny, a to před a po prvním podáním léčiva (akutní fáze studie). Statistická analýza ukazuje u HP 184 v dávce 20 mg/kg zmírnění mechanické hyperalgézie způsobené ligací L5 závislé na dávce a jasný zvrat hyperalgézie u gabapentinu v dávce 90 mg/kg. Analýzy byly mezi/v rámci ANOVA opakovaných měření. Toto bylo následováno porovnáním post hoc (LSD) na době interakce skupiny X za účelem studie prahových hodnot odtahování před oproti po podání léčiva.

Skupina: F(5,43) = 8,18, p < 0,001 *« * 9 • *

• · · · 9 * · · · ·· 99 • 9 ··

Čas: F(l,43) = 47,34, p < 0,001

Čas skupiny X: F(5,43) = 9,25, p < 0,001 u zvířat ošetřených vehikulem byl pozorován velký rozdíl v prahových hladinách odtahování na mechanický podnět mezi dvěma končetinami.

Odkazy

Agoston S., Bowman W. C., Houwertjes MC, Rodger I. W. , Savage A. O., Direct action of 4-aminopyridine on the contractility of a fast- contracting muscle in the cat., Clin. Exp. Pharm. Physiol. 1982; 9: 21 až 34.

Aisen M. L., Sevilla D., Gibson G., Kutt H., Blau A., Edelstein L., Hatch J. a Blass J. (1995), 3,4-Diaminopyridine as a treatment for amyotropic lateral sclerosis., J. Neurol. Sci. 129: 21 až 24.

Alnaes E. a Rahaminoff R. (1975), On the role of mitochondria in transmitter release from motor nerve terminals., J. Physiol. (Lond) 248: 285 až 306.

BackhauB C., Karkoutly C., Welsch M. a Krieglstein J. (1992): A mouše model of focal cerebral ischemia for screening neuroprotective drug effects. J. Pharmacological Meth. 27: 27 až 32.

Balí A. P., Hopkinson R. B., Farrell I. D. (1979): Human botulism caused by Clostridium Botulinum type E: the Birmingham outbreak Q. J. Med. 48-473-491.

Behrmann D. L., Bresnahan J. C., Beattie M. S., Shah B. R.,

Spinal cord injury produced by consistent mechanical displacement of the cord in rats: behavioral and histoiogic analysis., J. Neurotrama, 9: 197 až 217, 1992.

• · • · ·· * · · ·

Bennett G. J. a Xie Y. K. (1998), A peripheral mononeuropathy in rat produces disorders of pain sensation like those seen in man., Pain. 33: 87 až 107.

Bever C. T. (1996), Aminopyridines in Handbook of Multiple Sclerosis, ed. S. D. Lick, Marcel Dekker, str. 429 až 442.

Bever C. T., Jr., Young D., Anderson P. A., Krumholz A., Conway Κ., Leslie J. , Eddington N., Plaisance Κ. I., Panitch H. S., Dhib-Jalbut S., The effects of 4-aminopyridine in multiple sclerosis patients: results of a randomízed, placebo-controlled, double-blind, concentration-controlled, crossover trial., Neurol. 1994; 44: 1054 až 1059.

Blight A. R. a DeCrescito V., Morphometric analysis of experimental spinal cord injury in the cat: the relation of injury intensity to survival of myelinated axons., Neuroscience 1986: 19: 321 až 341.

Blight A. R., Morphology of chronic spinal card injury in the cat: Analysis of myelinated axons by line-samping. , Neuroscience, 10: 521 až 543,1983.

Blight A. R. , Morphometric analysis of a model of spinal cord injury in guinea pigs, with behavioral evidence of delayed secondary pathology., J. Neurol. Sci., 103: 155 až 171, 1991.

Bostock H., Sherratt R. Μ. , Sears T. A., Overcoming conduction failure in demyelinated nerve fibres by prolonging action potentials., Nátuře 1978; 274: 385 až 387.

Bostock H., Sears T. A., Sherratt R. 4-aminopyridine and tetraethylammonium demyelinated mammalian nerve fibres., J. 313: 301 až 315.

M., The effects of ions on normál and

Physiol. (Lond) 1981;

• · » 4

Bunge R. P., Puckett W. R., Bercerra J. L., Marcillo A., Quencer R. M., Observations on the pathology of human spinal cord injury. A review and classification of 22 new cases with details from a čase of chronic cord compression with extensive focal demyelination. v: Seil F. J., ed. , Advances in neurology, sv. 59, New York: Raven Press, 1993: 75 až 89.

Davis F. A., Stefoski D., Rush J., Orally administered 4-aminopyridine improves clinical signs in multiple sclerosis. Ann. Neurol. 1990; 27: 186 až 192.

Duchen, M. R. (1992), Ca²⁺-dependent changes in the mitochondrial energetics in single dissociated mouše sensory neurons., Biochem. J. 283: 41 až 50.

Eder C. (1998), Ion channels in microglia (brain macrophages), Am. J. Physiol. 275 (Cell. Physiol. 44): C327 až C342.

Fraser M. O., Chuang Y., Lavelle J. P., Yoshimura N., de Groat W. C., Chancellor Μ. B. (2001), A reliable, nondestructive animal model for interstitial cystitis: intravesical low dose protamine sulfáte combine with physiological concentrations of potassium chloride., Urology 57 (Suppl. 1):112.

Gruner J. A. a Yee A. K. (1999), 4-Aminopyridine enhances motor evoked potentials following graded spinal cord compression injury in rats., Brain Res. 816: 446 až 456.

Gruner J. A., Wade C. K., Menna G. a Stokes Β. T., Myoelectric evoked potentials versus locomotor recovery in chronic spinal cord injured rats. J. neurotrauma, 10: 327 až 347, 1993.

Gruner J. A., Yee A. K. , Blight A. R. , Histological and functional evaluation of experimental spinal cord injury:

evidence of a stepwise response to graded compression., Brain Res. , 729: 90 až 101, 1996.

Gruner J. A., Yee A. K. , 4-Aminopyridine enhances motor evoked potentials following graded spinal cord compression injury in rats., Brain Res. Jan 23; 816(2): 446 až 456, 1999.

Hamilton, M. G. a Lundy Ρ. M. (1995), Effect of ruthenium red on voltage-sensitive Ca²⁺ channels., JPET 273: 940 až 947.

Hayes K. C., Blight A. R., Potter P. J., Allatt R. D., Hsieh J. T., Wolfe D. L., Lam S., Hamilton J. T., Preclinical trial of 4-aminopyrldine in patients with chronic spinal cord injury., Paraplegia 1993; 31: 216 až 224.

Hayes K. C., Potter P. J., Wolfe D. L., Hsieh J. T., Delaney G. A., Blight A. R., 4-Aminopyridine-sensitive neurologie deficits in patients with spinal cord injury., J· Neurotrauma 1994; 11: 433 až 446.

Hirsh J. K. , Quandt F. N. , Aminopyridine block of potassium channels in mouše neuroblastoma cells., J. Pharmacol. Exp. Ther. 1993; 267: 604 až 611.

Hockfield S., Carolson S., Evans C. a kol·., Selected methods for antibody and nucleic acid probes. USA: Cold Sprint Harbour Laboratory Press, str.125 až 130,1993.

Jankowska E., Lundberg A., Rudomin P. a Sykova E., Effects of 4-Aminopyridine on synaptic transmission in the cat spinal cord., Brain Research, 240: 117 až 129,1982.

Jones R. E., Heron J. R. , Foster D. H., Snelgar R. S., Mason

R. J., Effects of 4-aminopyridine in patients with multiple sclerosis., J. Neurol. Sci. 1983; 60: 353 až 362.

Kerasidis H., Wrathall J. R. a Gale K., Behavioral assessment of functional deficit in rats with contusive spinal cord injury., J. Neurosci. Methods, 20: 167 až 179, 1987.

Lowry M. A. R., Goldbert J. I. a Belosevic M. (1998), Induction of nitric oxide (NO} synthesis in murine macrophages requires. potassium channel activity., Clin. Exp. Immunol. 111: 597 až 603.

Lundh H. (1978), Effects of 4-aminopyridine on neuromuscular transmission., Brain Res. 153: 307 až 318.

Lundh H. a Thesleff S. (1977), The mode of action of 4-aminopyridine and guanidine on transmitter from motor nerve terminals., Eur. J. Pharmacol. 42: 411 až 412.

Lundh H., Nilsson O., Rosen I., 4-aminopyridine - a new drug tested in the treatment of Eaton-Lambert syndrome., J. Neurol. Neurosurg. Psychiat. 1977; 40: 1109 až 1112.

Lundh H., Leander S., Thesleff S. (1977): Antagonism of the paralysis produced by botulinum toxin in the rat., J. Neurol. Sci. 32: 29 až 43.

Kim S. H. a Chung J. M. (1992), An experimental model for peripheral neuropathy produced by segmental spinal nerve ligation in the rat., Pain 50: 355 až 363.

(1998}: Sodium channels: recent developments and potential, v Annual Reports v Medicinal Chemistry, (Bristol J. A. Editor in chief, Academie Press, San str. 51 až 60.

Madge D. J. therapeutic sv. 33 Diego),

McEvoy K. M., Windebank A. J. ,

3,4-Diaminopyridine in the myasthenic syndrome, N. Engl. J.

Daube J. R. a Low P. (1989) :

treatment of Lambent-Eaton

Med. 321: 1567 až 1571.

• · » i

Φ·

Mcllay L. M., Halley F., Souness J. E., McKenna J. , Benning

V., Birrell Μ. , Burton B., Belvisi M., Collis A., Constan A.,

Foster M., Hele D., Jayyosi Z., Kelley M., Maslen C., Miller

C.

G., Ouldelhkim M.

B., Ratcliffe A. J. , Thybaud V., Wilsher N.

Page Κ., Phipps S., Pollock Κ., Porter Redford E. J. , Webber S., Slater B., (2001), The discovery of RPR 200765A, a p38 MAP kinase inhibitor displaying a good oral anti-arthritic efficacy., Bioorg. Med. Chem. 9: 537 až 54.

Meza-Ruiz G. a Tapia R. (1978), [3H]GABA release in synaptosomal fractions after intracranial administration of ruthenium red., Brain Res. 154: 163 až 166.

0'Neill M. J., Bath C. P., Dell C. P., Hicks C. A., Gilmore J. , Ambler S. J. , Ward M. A., Bleakman D. (1997): Effects of Ca²⁺ and Na⁺ channel inhibitors in vitro and in globál cerebral ischaemía in vivo., Eur. J. Pharmacol. 332(2): 121 až 131 RIL 10 mg/kg reference.

Pendlebury S. T., Lee M. A., Blamire A. M., Styles P. a Matthews P. M. (2000), Correlating magnetic resonance imaging markers of axonal injury and demyelination in motor impairment secondary to stroke and multiple sclerosis., Magn. Reson. Imaging 18: 369 až 378.

Person R. J. a Kuhn J. A. (1979), Depression of spontaneous and ionophore-induced transmitter release by ruthenium red at the neuromuscular junction., Brain Res. Bull 4: 669 až 674.

Potter P. J., Hayes K. C., Hsieh J. T., Delaney G. A., Segal

J. L., Sustained ímprovements in neurological function in spinal· cord injured patients treated with oral 4-aminopyridine: three cases. Spinal Cord 1998a; 36: 147 až 155.

Potter P. J., Hayes K. C., Segal J. L.

Hsieh J. T., • · • · • · ··· ·

Brunnemann S. R. , Delaney G. A., Tierney D. S. a Mason D.

(1998b): Randomized double-blind crossover trial of fampridine-SR (sustained release 4-aminopyridine) in patients with incomplete spinal cord injury., J. Neurotrauma 15: 837 až

849.

Pyo H., Chung S., Jou I., Gwag B. a Joe Ε. H. (1997), Expression and function of outward K⁺ channels induces by lipopolysaccharide in microglia., Mol. Cells 7: 610 až 614.

Qiao J. , Hayes K. C., Hsieh J. T., Potter P. J. a Delaney G. A. (1997): Effects of 4-aminopyridine on motor evoked potentials with spinal cord injury., J Neurotrauma 14: 135 až

149.

Rampě, D., Murawsky, Μ. K., Grau, J. a Lewis, E. W., The antipsychotic agent sertindole is a high affinity antagonist of the human cardiac potassium channel HERG., J. Pharmacol. Exp. Ther. 286: 788 až 793, 1998,

Rataud J. , Bebarnot F., Mary V., Pratt J. a Stutzmann J. M. (1994): Comparative study of voltage-sensitive sodium channel blockers in focal ischaemia and electric convulsions in rodents., Neuro. Sci. Lett. 172:19 až 23.

Sakurai M. a Kanazawa I. (1999), Positive symptoms in multiple sclerosis: their treatment with sodium channel blockers, lidocain and mexiletine., J. Neurol. Sci. 162: 162 až 168.

Saruhashi Y. a Young W. , Effect of mianserin on locomotory function after thoracic spinal cord hemisection in rats., Expl. Neurol., 129: 207 až 216, 1994.

Savage A. O., A comparison of the effects of 4-dimethylaminopyridine and 4-aminopyridine on isolated cardiac and • · • · · ·

Φ · · ΦΦΦΦ φ 9 « • · · · · · Φ · Φ Φ 9 • Φ Φ Φ · · Φ φ · φ •· ΦΦ ·· φΦ φ · ΦΦ skeletal muscle preparations., Arch Internát. Pharmacodynam. Therapie 1985; 273: 262 až 276.

Schwid S. R., Petrie M. D. , McDermott Μ. P., Tierney D. S., Mason D. H. a Coodman A. D. (1997): Quantitative assessment of sustained release 4-aminopyridine for symptomatic relief of multipule sclerosis: Neurology 48: 817 až 821.

Segal J. L., Pathak M. S., Hernandez J. P., Himber P. L., Brunnemann S. R. a Charter R. S. (1999): Safety and efficacy of 4-aminopyridine in humans with spinal cord injury: A long-term, Controlled Trial., Pharmacotherapy 19: 713 až 723.

Seltzer Z., Dubner R. a Shir Y. (1990), A novel behavioral model of neuropathic pain disorders produced in rats by partial sciatic nerve injury., Pain 43: 205 až 218.

Sherratt R. M., Bostock H., Sears T. A., Effects of 4-aminopyridine on normál and demyelinated mammalian nerve fibres., Nátuře 1984; 283: 570 až 572.

Shi R. , Blight A. R. , Differential effects of law and high concentrations of 4-aminopyridine on axonal conduction in normál and injured spinal cord., Neurosci. 1997; 77: 553 až

562.

Smith, C. P., A. T. Woods, Corbett, R., S. M. Chesson, G. M. Bores, W. W. Pětko, J. E. Roehr a S. Kongsamut., Serotonergic activity of HP 184: Does spontaneous release háve a role?, Neurochemical Research 21: 573 až 583, 1996.

Smith, C. P., L. R. Brougham, F. P. Huger, L. Davis, J. T. Klein a R. C. Effland., HP 184 [N-(n-propyl)-N-(3-fluoro-4— pyridinyl)-ΙΗ-3-methylindol-l-amine-hydrochloride]: In vitro spontaneous release of acetylcholine (ACh) and norepinephrine (NE)., Drug Dev. Res. 30: 203 až 212,1993.

• 0

00 0

0 0 0 0000 00 0 * 00 0000 00 · • 0« 000 00 00 « 0 0 _Λ π ·0*0000·0000

- 48 - ·· ♦· ·· ·· 0· ··

Stefoski D., Davis Ε. Α. , Faut Μ., Schauf C. L., 4-Aminopyridine improves clinical signs in multiple sclerosis. Ann. Neurol. 1987; 21: 71 až 77.

Sweitzer S. M., Calburn R. W., Rutkowski M. a DeLeo J. A. (1999), Acute peripheral inflammation induces moderate glial activation and spinal IL-Ιβ expression that correlates with pain behavior in the rat., Brain Res. 829: 209 až 221.

Tang L. a Kongsamut S. (1996), Frequency-dependent inhibition of neurotransmitter release by besipirdine and HP 184., Eur. J. Pharmacol. 300: 71 až 74.

Tang, L., Huger, F. P., Klein, J. T., Davis, L., Martin, L., Shimshock, S., Effland, R. C., Smith, C. P. a Kongsamut, S. (1998), 4-Aminopyridine derivatives. A family of novel modulators of voltage-dependent sodium-channels. , Drug Dev. Res., 44: 8 až 13.

Tang L., C. P. Smith a S. Kongsamut., Besipirdine inhibits effects of veratridine at the voltage dependent sodium channel., Br. J. Pharmacol. 116: 2468 až 2472, 1995.

Tapia R. a Velasco I. (1997), Ruthenium red as a tool to study calcium channels, neuronal death and the function of neural pathways., Neurochem. Int. 30: 137 až 147.

Tapia R. a Meza-Ruiz G.	(1977),	Inhibition by ruthenium red of
the calcium-dependent	release	of	[3H]GABA in	synaptosomal
fractions., Brain Res.	126: 160	až	166.
Tapia R., Meza-Ruiz G.,	Duran L.	a	Drucker-Colin	R. D. (1976),
Convulsions or flaccid	paralysis	induced by	ruthenium red

depending on routě of administration., Brain Res. 116: 101 až

109.

« φ φφφφ φ φ

- 49 Tapia R. a Stiges Μ. (1982), Effect of 4-aminopyridine on transmitter release in synaptosomes., Brain Res. 250: 291 až 299.

Tapia R. (1982), Antagonism of the ruthenium red-induced paralysis in mice by 4-aminopyridine, guanidine and lanthanum., Neurosci. Lett. 35: 615 až 623.

Targ E. F., Kocsis J. D., 4-Aminopyridine leads to restoration of conduction in demyelinated rat sciatic nerve., Brain Res. 1985; 328: 358 až 361.

Targ E. F. , Kocsis J. D. , Action potential characteristics of demyelinated rat sciatic nerve following application of 4-aminopyridine., Brain Res. 1986; 363: 1 až 9.

van Diemen H. A., Polman C. H., van Dongen T. M., van Loenen A. C., Nauta J. J., van Walbeek Η. K., Koetsier J. C., The effect of 4-aminopyridine on clinical signs in multiple sclerosis: a randomized, placebo-controlled, double-blind, crossover study., Ann Neurol. 1992; 32: 123 až 130.

van Diemen H. A., Polman C. H., van Dongen Μ. M., Nauta J. J., Strijers R. L., van Loenen A. G., Bertelsmann F. W. , Koetsier J. C., 4-Aminopyridine induces functional improvement in multiple sclerosis patients: a neurophysiological study., J. Neurol. Sci. 1993; 116: 220 až 226.

Yamaguchi S. a Rogawski M. A. (1992): Effects of anticonvulsant drugs on 4-aminopyridine-induced seizures in mice., Epilepsy Res. 11: 9 až 16.

»* ·« • φφφ · ♦ » ·· · • · φ · · « • Φ 4 Φ Φ ·· φφφ · • · • Φ • ΦΦ • Φ

Patenty

Effland R. C., Klein J. T., Davis K. L., Olsen G. E.; US patent č. 4,970,218 s názvem N-(Pyridinyl)-lH-indol-l-amines .

Hansebout R. R. a Blight A. R.; US patent č. 5,545,648 s názvem Use of 4-aminopyrdidine in the reduction of chronic pain and spasticity in a spinal cord injured patient.

Hansebout R. R. a Blight A. R. ; WO 94/14439 s názvem The use of 4-aminopyridine in the treatment of a neurological condition.

Huger, F. P., Kongsamut, S., C. P. Smith & L. Tang, US patent č. 5,776,955 s názvem Use of unsubstituted and substituted N-(pyrrol-l-yl)pyridinamines as anticonvulsant agents.

Kongsamut, S., C. P. Smith & A. T. Woods; US patent č. 5,356,910 s názvem Use of N-(Pyridinyl)-lH-indol-l-amines for the Treatment of Obsessive Compulsive Disorder.

Kongsamut, S., C. P. Smith & A. T. Woods; US patent č. 5,356,910 s názvem Use of N-(Pyridinyl)-lH-indol-l-amines for the preparation of a medicament for the treatment of obsessive-compulsive disorders.

Masterson J. G. a Myers M.; US patent č. 5,370, 879 s názvem Formulations and their use in the treatment of neurological diseases.

Masterson J. G. a Myers M. ; US patent č. 5,580,580 s názvem

Formulations and their use in the treatment of neurological diseases.

·· ·99 ·

Masterson J. G. a Myers M. ; US patent č 5,540, 938 s názvem Formulations and their use in the treatment of neurological diseases.

Wurtman R. J. a Buyukysai R.; WO 89/09600 s názvem Method and composition for treating neurological disorders.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY • Φ φφφφ

1. Použití sloučeniny obecného vzorce I <^R>m n

ve kterém m znamená 0, 1 nebo 2;

n zanmená 0, 1 nebo 2;

p znamená 0 nebo 1;

každý substituent R nezávisle znamená atom vodíku, halogenu, trifluormethylovou skupinu, alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, alkoxyskupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, benzyloxyskupinu, hydroxyskupinu, nitroskupinu nebo aminoskupinu;

každý substituent R_x nezávisle znamená atom vodíku, alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, alkenylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, alkanoylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, atom halogenu, kyanoskupinu, -C(O)alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů v alkylové části, skupinu -alkylenCN obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů v alkylenové části, skupinu -alkylenNR'R obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů v alkylenové části, kde

A A • A • A aa •AAA A A A

AAAA A A A

A A·· AAAA »· AA AA aa • A ·· • A AAAA r₃ nebo

R¹ a R nezávisle znamenají atom vodíku nebo alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, skupinu -alkylenOC(0)alkyl obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů v alkylenové části a 1 až β uhlíkových atomů v alkylové části nebo skupinu -CH(0H)R₄, kde

R₄ znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů;

znamená atom vodíku, alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů popřípadě substituovanou atomem halogenu, hydroxyskupinou nebo benzyloxyskupinou, alkenylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, alkynylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, skupinu -CCkalkyl obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů v alkylové části nebo skupinu -R₅-NR’R, kde

Rs znamená alkylenovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, alkenylenovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů nebo alkynylenovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů a

R' a R” každý nezávisle znamená atom vodíku, alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů nebo alternativně skupina -NR’R jako celek znamená 1-pyrrolidinylovou skupinu; a znamená atom vodíku, nitroskupinu, aminoskupinu, atom halogenu, alkoxyskupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, hydroxyskupinu nebo alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, její farmaceuticky přijatelné soli, pro přípravu léčiva k léčení demyelinačních onemocnění.

*4 44 44 4« • ♦ · · 4444 4« 4 •4 44 44 44 444

44 4444

4 4 4 4

44 44
2. Použití podle nároku 1, při němž

R znamená atom vodíku, atom halogenu, trifluormethylovou skupinu nebo alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů;

Ri znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů;

R₂ znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů;

R₃ znamená atom vodíku, alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů nebo atom halogenu; a p znamená 0.
3. Použití podle nároku 1, při němž demyelinační onemocnění představuje mnohočetná skleróza.
4. Použití podle nároku 2, při němž má sloučenina následující vzorec II
5. Použití podle nároku 4, při němž demyelinační onemocnění představuje mnohočetná skleróza.

*0 ·· 0* • 0 0 0 0 0 • 0 0 0 0 0

0 0· 0*0 0

0 0 0 0 0 0

00 00 00 ·· ····

β. Použití sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1 pro přípravu léčiva k léčení demyelinačních stavů.
7. Použití podle nároku 6, při němž

R znamená atom vodíku, atom halogenu, trifluormethylovou skupinu nebo alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů;

Ri znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů;

R₂ znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů;

R₃ znamená atom vodíku, alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů nebo atom halogenu; a p znamená 0.

8. Použití podle nároku 6, představuje míšní poranění. při němž demyelinační stav 9. Použití podle nároku 6, při němž demyelinační stav představuje traumatické poranění mozku. 10. Použití podle nároku 6, při němž demyelinační stav

představuje mrtvice.

11. Použití podle nároku 7, při němž má sloučenina následující vzorec II ·· ···· ·· ·· (II) ·

12. Použití podle nároku představuje míšní poranění. 11, při němž demyelinační stav 13. Použití podle nároku 11, při němž demyelinační stav představuje traumatické poranění mozku • 14. Použití podle nároku 11, při němž demyelinační stav

představuje mrtvice.

15. Použití sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1 pro přípravu prostředku pro použití při rehabilitaci po mrtvici.

16. Použití podle nároku 14, při němž

R znamená atom vodíku, atom halogenu, trifluormethylovou skupinu nebo alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů;

Ri znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů;

R₂ znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů;

R₃ znamená atom vodíku, alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů nebo atom halogenu; a ·· ···· • · · • · · « · · · • · · · p znamená Ο .

17. Použití podle nároku 16, při němž má sloučenina následující vzorec II (II)

18. Použití sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1 pro přípravu prostředku k blokování draslíkových kanálů.

19. Použití podle nároku 18, při němž

R znamená atom vodíku, atom halogenu, trifluormethylovou skupinu nebo alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů;

Ri znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů;

R₂ znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů;

R3 znamená atom vodíku, alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů nebo atom halogenu; a p znamená 0.

20. Použití podle nároku 19, při němž má sloučenina následující vzorec II • 4 •4 ·«·♦ • 4 4 • 44

4 4 4

44 44

4 4 4 4 • 4 44

4 4 4

4 4 4

4 4 4

4 4 4 4 • 4 44 (II).

21. Použití podle nároku 2, při němž má sloučenina následující vzorec III (III) ·

22. Použití podle nároku 7, při němž má sloučenina následující vzorec III (III) ·

23. Použití podle nároku 22, při němž demyelinační stav představuje míšní poranění.

• 0 90·*

* - 59 - 00 00 0* * * · · · 0 · 00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 99 99 99 *· 00 0000 0 0« 00 0 0 00 000 0 0 0 0 0 0 · • 0 0 0 0 0 0 00 0000 24. Použití podle nároku 22, při němž představuje traumatické poranění mozku. demyelinační stav 25. Použití podle nároku představuje mrtvice. 22, při němž demyelinační stav 26. Použití sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1 pro

přípravu léčiva k léčení neuropatické bolesti.

27. Použití podle nároku následující vzorec II

26, při němž má sloučenina

28. Použití sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1 pro přípravu léčiva k léčení iritace močového měchýře.

29. Použití podle nároku 28, při následující vzorec II němž má sloučenina (II) «· 999 9 ·· *· ·* 99
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 ···· 9 t ·« <« >

» 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 ·· 99 9 9 9 9 9 9 99

30. Použití sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1 pro přípravu léčiva k léčení nadměrně aktivního močového měchýře.

31. Použití podle nároku 30, při následující vzorec II němž má sloučenina

32. Použití sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1 pro přípravu léčiva k léčení bolesti vyvolané chemokiny.

33. Použití podle nároku 32, při následující vzorec II němž má sloučenina