SK10392003A3

SK10392003A3 - Farmaceutické prostriedky na liečenie demyelinizačných ochorení alebo stavov

Info

Publication number: SK10392003A3
Application number: SK1039-2003A
Authority: SK
Inventors: Craig P. Smith; Michel P. Rathbone; Margaret Petty; David Rampe
Original assignee: Aventis Pharmaceuticals Inc.
Priority date: 2001-02-15
Filing date: 2002-02-14
Publication date: 2004-01-08
Also published as: PL363638A1; NZ544720A; US20050159456A1; PA8540101A1; EP1368031A2; NZ539159A; HK1080361A1; IL157341A; HUP0303203A2; ZA200306124B; NO20033622D0; AU2009238332A1; CR7023A; SG134170A1; AU2002247200B9; AP1749A; BR0207272A; EA200600896A1; US20060025452A1; EE200300363A

Description

Farmaceutické prostriedky na liečenie demyelinizačných ochorení alebo stavov

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka N-pyridyl-líŕ-indol-l-amínov s jedinečnou kombináciou inhibičných vlastností vzhľadom na draslíkové, ako aj sodíkové kanály a ich použitia na prípravu farmaceutických prostriedkov na liečenie demyelinizačných ochorení a stavov.

Doterajší stav techniky

Skleróza multiplex (MS) je degeneratívne a zápalové neurologické ochorenie, ktoré postihuje centrálny nervový systém a je spojené s tvorbou neuronálnych plakov a s porušeným neuronálnym vedením kvôli demyelinizácii (úbytku myelínu). Podobne sa rozsiahla demyelinizácia zvyčajne pozoruje v prípade traumy miechy a mŕtvice (Bunge a kol., 1993; Blight a De Crescito, 1986; Pendlebury a kol., 2000) .

Základný výskum fyziológie šírenia akčného potenciálu v myelínových vláknach ukázal, že blok vedenia v prípade demyelinizovaných vlákien bol čiastočne spôsobený výskytom aminopyridín-senzitívnych draslíkových kanálov v oblastiach s úbytkom myelínu (Bever, 1996).

Akčné potenciály sa šíria pozdĺž normálnych myelinizovaných nervových vlákien procesom salvového vedenia, ktorý je výsledkom sodíkového prúdu vytvoreného otvorením sodíkových kanálov senzitívnych vzhľadom na elektrické napätie v prípade Ranvierovho uzla. Tak na počiatku elektrickej stimulácie vstupujú sodné (Na⁺) ióny do neurónu, čo spôsobuje, že sa neurón stáva pozitívnejšie nabitým. Keď pozitívny náboj neurónu dosiahne kritickú hranicu, nastáva depolarizácia. Depolarizácia umožňuje pozitívnemu jadru iónov prúdiť neurónom pozdĺž axónu a k nervovému zakončeniu. Aby sa neurón „resetoval, musí sa zbaviť nadbytočného pozitívneho náboja. K tomu dochádza prostredníctvom výtoku draslíkových (K') iónov cez draslíkové kanály. Ak je myelín porušený, objavujú sa na axoleme draslíkové kanály senzitívne vzhľadom na elektrické napätie, ktoré sa otvárajú v priebehu depolarizácie. Draslíkový prúd prúdiaci opačne než sodíkový prúd znižuje amplitúdu a čas trvania akčného potenciálu, čo prispieva k zlyhaniu vedenia znížením distálnych hustôt účinných prúdov. Tieto deficity vedenia sú spojené s poruchovými symptómami zahŕňajúcimi svalovú slabosť. Pri blokácii výtoku K⁺ cez draslíkové kanály zostáva neurón dlhšie depolarizovaný a môže sa ľahšie opätovne stimulovať. Preto sa verí, že sú blokátory draslíkových kanálov použiteľné pri liečení ochorení a stavov, ktoré narušujú prenos akčného potenciálu, ako sú MS, traumatické poranenia mozgu (TBI) a poranenia miechy (SCI).

Blokátory draslíkových kanálov, ako je 4-aminopyridín (4-AP) zvyšujú čas trvania a amplitúdu akčného potenciálu v demyelinizovaných vláknach a zlepšujú šírenie akčného potenciálu ir. vitro (Bostock a kol., 1978; 1981; Targ a Kocsis, 1985; 1986; Shi a Blight, 1997), uľahčujú uvoľňovanie neurotransmitera (Bcsuock a kol., 1981; Hirsh a Quandt, 1993; Sherratt a kol., 1980), a posilňujú svalovú kontraktilitu (Agoston a kol., 1982; Savage a kol., 1985). Tieto pozorovania naznačujú, že blokátory draslíkových kanálov, ako je 4-AP, môžu obnoviť vedenie v demyelinizovaných vláknach v prípade pacientov s MS. Výsledky následných klinických štúdií poskytli ďalšiu podporu pre tvrdenie, ze aminopyridínová liečba môže zlepšiť symptómy v prípade niektorých pacientov s MS (Jones a kol., 1983; Stefoski a kol., 1987; Davis a kol., 1990; van Diemen a kol., 1992; Bever a kol., 1994; Schwid a kol., 1997).

4-AP sa tiež zverejnilo, že je účinný pri liečení neurologických stavov zahŕňajúcich SCI, oslabenie chronickej bolesti a spasticity v prípade pacientov s SCI, Alzheimerovej choroby, postpoliomyelitického syndrómu, myastenie gravis, Huntingtonovej choroby, porúch pamäti v súvislosti s vekom, posttraumatických, postmŕtvičných alebo posttoxických syndrómov postihujúcich pamäť alebo vnímanie a dysautonómie (Wurtman a Buyukuysal, 1989; Hansebout a Blight, 1996; Hansebout a Blight, 1994). Zahájili sa klinické štúdie použitia Fampridine-SR v prípade pacientov s dlhodobým poranením miechy (Potter a kol., 1998 a, b) nehradiac na obavy z bezpečnosti týkajúcej sa použitia 4-AP v prípade všeobecnej populácie pacientov (Multiple Sclerosis, Cognos Study #51, Decisions Resources, October, 1999; str. 77 až 78) . Niekoľko štúdií ukázalo, že jednotlivé dávky 4-AP môžu obnoviť niektoré funkcie v prípade pacientov s SCI, ak sa podávajú jeden rok alebo dlhšie po poranení (Potter a kol., 1998a,b; Qiao a kol., 1997; Hayes a kol., 1993; 1994). Zverejnili sa aj kladné účinky chronického podávania. Klinicky významné funkčné zlepšenia sa pozorovali v prípade šestnástich pacientov zo šestnástich po 3 mesiacoch denného orálneho podávania 30 mg/kg 4-AP v prípade pacientov s SCI trvajúcej 2 roky alebo dlhšie. Niekrorí pacienti predtým klasifikovaní ako s kompletným poranením sa reklasifikovali na nekompletné poranenie (Segal a kol., 1999). Všetci pacienti sa vyznačovali po 3 mesiacoch dennej orálnej liečby pomocou 4-AP (30 mg/deň alebo približne 0,5 mg/kg) určitým stupňom zlepšenia aspoň v prípade niektorých typov neurologických alebo pľúcnych funkcií. Nižšie dávky neboli účinné.

Ako sa už uviedlo, 4-AP blokujú draslíkové kanály, čím účinne predlžujú akčný potenciál. Tento mechanizmus, ktorým môžu blokátory draslíkových kanálov zlepšovať symptómy spojené s chorobami a stavmi, ktoré narušujú prenos akčného potenciálu, však môže žial viesť k aktivite podobnej epilepsii. 4-AP je skutočne uznaným konvulzívnym činidlom v prípade cicavcov a človeka. Preto je použitelnosť 4-AP ako terapeutického činidla v prípade MS, TBI alebo SCI obmedzená jeho prokŕčovou náchylnosťou a ďalšími nežiaducimi vedľajšími účinkami. Pri dávkach vyšších než

0,8 mg/kg sa pozoroval nepokoj, zmätenosť a generalizované tonicko-klonické záchvaty (Balí a kol., 1979; Bever a kol., 1994). van Diemen a kol. (1993) pozorovali, že velkosť zlepšenia v prípade pacientov s MS (definovaného zlepšením výsledkov hladkého sledovania) bola významne spojená so sérovou hladinou 4-AP (33 až 75 ng/ml nutná pre významné zlepšenie po orálnom podávaní). Pri rovnakých dávkach sa však pozorovali vedľajšie účinky (parestézia/dysestézia, závrate/mdloby a dokonca nestabilita chôdze). V inej ľudskej štúdii (Bever a kol., 1994) sa pri sérovej hladine 104 ng/ml pozoroval veľký „grand mal” záchvat. Obe skupiny výskumných pracovníkov naznačili, že by vyššie dávkovanie a sérové hladiny pravdepodobne viedli k vyšším zlepšeniam v prípade tých pacientov s MS, ktorí odpovedali na nižšie dávky 4-AP. Stupeň účinnosti 4-AP je teda obmedzený dávkou a vedľajšími účinkami .

Obavy z vedľajších účinkov spojených s vyššími sérovými hladinami 4-AP viedli k vývoju prípravkov s ustáleným uvoľňovaním (Fampridine-SR; Masterson a Myers, 1994; 1996a; 1996b). Fampridine-SR je teraz vo fázi dvoch klinických štúdií na MS. V prípade pacientov v doterajších štúdiách Fampridine-SR sa pozorovalo zlepšenie v prípade radu funkcií. V závislosti od jednotlivých prípadov zahŕňali tieto zlepšenia zvýšenie funkcie mechúra, čriev a sexuálnych funkcií, zvýšenú ľahkosť pohybu a vnímania a zníženú svalovú spasticitu, únavu a chronickú bolesť.

Iný prístup eliminácie nežiaducich vedľajších účinkov spojených so 4-AP zahŕňa spoločné podávanie 4-AP a blokátorov sodíkových kanálov závislých od elektrického napätia. Blokátory sodíkových (Na⁺) kanálov blokujú vtok Na⁺ iónov a znižujú vnímavosť neurónu vzhladom na neuronálnu vzrušivosť. podávanie blokátorov

Toto účinne znižuje pozorovalo, že spoločné kanálov závislých od depolarizáciu Skutočne sa sodíkových elektrického napätia a 4-AP predchádza v prípade myši kŕčom vyvolaným 4-AP (Yamaguchi a Rogawski, 1992) . 4-AP sa nevyznačuje žiadnymi inhibičnými schopnosťami vzhladom na sodíkové kanály.

Zlúčeniny použité v rámci vynálezu sa môžu syntetizovať spôsobmi opísanými v US patentovom spise 4,970,218. Všetky patenty a ďalšie publikácie, ktoré sa tu citujú, sa uvádzajú ako odkazy.

Je známe, že určité zlúčeniny spadajúce do rozsahu predkladaného vynálezu môžu in vitro a in vivo vyvolať blokádu sodíkových kanálov závislú od elektrického napätia (Táng a kol., 1995; 1998; Táng a Kongsamut, 1996). Blokátory sodíkových kanálov závislé od elektrického napätia účinkujú za podmienok bunkovej depolarizácie účinnejšie. Tieto zlúčeniny sa vyznačujú malými alebo žiadnymi účinkami na normálnu neuronálnu signalizáciu, umožňujú však blokádu sodíkových kanálov v priebehu záchvatov, traumy hlavy alebo ischémie. Mnohé z týchto činidiel sú v rámci živočíšnych modelov týchto patologických stavov cerebroprotektívne (Madge a kol., 1998) .

Blokátory draslíkových kanálov sú takisto použiteľnými činidlami pri liečení neuropatickej bolesti a bolesti spojenej s cytokínmi zahŕňajúcej artritickú bolesť. Schweizer a kol. (1999) naznačili, že v prípade hyperalgézie nasledujúcej buď periférny zápal alebo periférne nervové poranenie, môže zohrávať úlohu mikrogliálna aktivácia a uvoľňovanie cytokínu. O blokátoroch draslíkových kanálov, ako je 4-AP, sa zverejnilo, že blokujú aktiváciu potkanej, myšej a ľudskej mikroglie (Eder, 1998). Pyo a kol. (1997) opísali, že 4-AP môže znižovať uvoľňovanie dusitanov z aktivovanej mikroglie, čo ukazuje, že správanie bolesti sa môže regulovať prostredníctvom tohto mechanizmu. Ďalej sa o 4-AP zverejnilo, že znižuje tvorbu NO vyvolanú lipopolysacharidmi z murinných makrofágov (LPS; Lowry a kol., 1998). Podávanie LPS myši sa takisto použilo ako modelový systém na identifikáciu antiartritickej účinnosti niekoľkých rôznych činidiel s rôznymi mechanizmami účinku (Mc Ilay a kol., 2001) . Na skúmanie neuropatickej bolesti sa vyvinulo niekoľko experimentálnych modelov, ktoré zahŕňajú zovretie sedacieho nervu alebo L5 alebo L6 spinálneho nervu (Bennett a Xie, 1988; Seltzer a kol., 1990; Kim a Chung, 1992).

Podstata vynálezu

Teraz sa zistilo, že zlúčeniny všeobecného vzorca I sa vyznačujú vlastnosťami v zmysle blokovania draslíkových kanálov. Jedinečná kombinácia inhibičných vlastností tak vzhľadom na draslíkové, ako aj vzhľadom na sodíkové kanály znamená, že sú tieto zlúčeniny použiteľné ako terapeutické činidlá na liečenie demyelinizačných ochorení alebo stavov. Sú napríklad použiteľné pri liečení MS, SCI, TBI (traumatického poranenia mozgu) a mŕtvice. Tieto zlúčeniny poskytujú bezpečnejšie terapeutické činidlo než 4-AP, pretože 4-AP blokuje iba draslíkový kanál, čo môže viesť k nežiaducim vedľajším účinkom v zmysle nepokoja, zmätenosti a záchvatov. Zlúčeniny všeobecného vzorca I sú použiteľné aj pri rehabilitácii mŕtvice, liečení iritácie a dysfunkcie močového mechúra, liečení viscerálnej, chemokínmi vyvolanej bolesti (vrátane artritickej bolesti) a neuropatickej bolesti.

Zlúčeniny všeobecného vzorca I poskytujú jedinečnú kombináciu inhibičných vlastností tak vzhľadom na draslíkové, ako aj vzhľadom na sodíkové kanály. Tieto zlúčeniny sú tiež použiteľné pri liečení demyelinizačných ochorení a stavov, ako je skleróza multiplex, poranenie miechy, traumatické poranenie mozgu a mŕtvica. Tieto zlúčeniny sú použiteľné aj pri rehabilitácii mŕtvice, liečení iritácie a dysfunkcie močového mechúra, liečení viscerálnej, chemokínmi vyvolanej bolesti (vrátane artritickej bolesti) a neuropatickej bolesti.

Predkladaný vynález sa týka zlúčenín všeobecného vzorca I v ktorom m znamená n znamená p znamená

0, 1 alebo 2;

alebo 1;

každý substituent R nezávisle znamená atóm vodíka, atóm halogénu, trifluórmetylovú skupinu, alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka, alkoxyskupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka, benzyloxyskupinu, hydroxyskupinu, nitroskupinu alebo aminoskupinu;

každý substituent R¹ nezávisle znamená atóm vodíka, alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka, alkenylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka, alkanoylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka, atóm halogénu, kyanoskupinu, -C(O)-alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka v alkylovej časti, skupinu -alkylén-CN obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka v alkylénovej časti, skupinu -alkylén-NR'R' obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka v alkylénovej časti, kde

R' a R'' nezávisle znamenajú atóm vodíka alebo alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka, skupinu -alkylén-OC(O)-alkyl obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka v alkylénovej časti a 1 až 6 atómov uhlíka v alkylovej časti alebo skupinu -CH(OH)R⁴, kde

R⁴ znamená atóm vodíka alebo alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka;

R² znamená atóm vodíka, alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka, prípadne substituovanú atómom halogénu, hydroxyskupinou alebo benzyloxyskupinou, alkenylovú skupinu obsahujúcu 1 .až 6 atómov uhlíka, alkinylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka, skupinu -C(0)O-alkyl obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka v alkylovej časti alebo skupinu -R³-NR'R'', kde

R⁵ znamená alkylénovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka, alkenylénovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka alebo alkinylénovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka, a

R' a R' každý nezávisle znamená atóm vodíka, alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka alebo alternatívne skupina -NR'R'' ako celok znamená 1-pyrolidinylovú skupinu; a

R³ znamená atóm vodíka, nitroskupinu, aminoskupinu, atóm halogénu, alkoxyskupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka, hydroxyskupinu alebo alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka.

Definície

1) Demyelinizačné ochorenie

V rámci predkladaného vynálezu sa demyelinizačné ochorenia definujú ako ochorenia, v prípade ktorých je primárne cielom myelín. Spadajú do dvoch hlavných skupín: získané ochorenia a dedičné metabolické ochorenia.

Skleróza multiplex (MS) spadá do kategórie získaných ochorení. MS sa zvyčajne prejavuje medzi dvadsiatym a päťdesiatym rokom života. MS napadá bielu hmotu centrálneho nervového systému. Pri svojej klasickej manifestácii (90 % všetkých prípadov) sa vyznačuje striedavými fázami relapsu/remisie s periódami remisie pomaly vzrastajúcimi v priebehu času. K jej príznakom patrí ľubovoľná kombinácia spastickej paraparézy, vratkého kroku, diplopie a inkontinencie.

Kategór.ia dedičných metabolických ochorení zahŕňa osem poznaných leukodystrofii: metachromatickú leukodystrofiu, Refsumovu chorobu, adrenoleukodystrofiu, Krabbeovu chorobu, fenylketonúriu, Canavanovu chorobu, Pelizaeus-Merzbacherovu chorobu a Alexanderovu chorobu. Prvých šesť ochorení je poruchami ukladania metabolických produktov. Chýbanie enzýmu alebo jeho chybná funkcia vedú k toxickej tvorbe chemických látok. Etiológia Pelizaeus-Merzbacherovej choroby a Alexanderovej choroby zostáva na druhej strane neznáma.

Klinický priebeh dedičných demyelinizačných ochorení, ktoré majú zvyčajne tendenciu prejavovať set v prípade nemluvniat alebo v ranom detstve, je tragický. Predtým normálne deti prichádzajú v rýchlom slede o zrak, sluch, reč a chôdzu. Prognózou je smrť v niekoľkých málo rokoch.

2) Demyelinizačné stavy

V rámci predkladaného vynálezu je demyelinizačným stavom stav, ktorý vedie k nedostatočnej myelinizácii. K takýmto demyelinizačným stavom patria, nie sú však na ne obmedzené, poranenie miechy, traumatické poranenie mozgu a mŕtvica.

3) Poranenie miechy (SCI)

V rámci predkladaného vynálezu sa SCI definuje ako poranenie miechy, ktoré vedie k úbytku funkcií, ako je pohyblivosť alebo citlivosť.

4) Traumatické poranenie mozgu (TBI)

V rámci predkladaného vynálezu sa traumatické poranenie moz10 gu definuje ako poranenie, ktorého výsledkom je poškodenie mozgu. K poraneniu hlavy môže dôjsť jedným z dvoch spôsobov:

• K uzavretému poraneniu hlavy dochádza, ak sa pohybujúca sa hlava rýchlo zastaví, ako v prípade úderu o predné sklo alebo v prípade, že sa udrie tupým predmetom spôsobujúcim náraz mozgu do tvrdého kosteného povrchu vnútra lebky. K uzavretému poraneniu hlavy môže dôjsť aj bez priamej vonkajšej traumy hlavy, ak sa mozog rýchlo pohybuje vpred alebo vzad, ako v prípade osoby s hyperextenziou krku.

• K otvorenému poraneniu hlavy dochádza v prípade, že lebkou prenikne rýchlo sa pohybujúci predmet, ako je strela.

Tak uzavreté, ako aj otvorené poranenia hlavy môžu viesť k lokalizovanému a rozšírenému alebo difúznemu poškodeniu mozgu. Výsledné postihnutia môžu zahŕňať stratu pamäti a emocionálne poruchy, motorické ťažkosti zahŕňajúce paralýzu a poškodenie piatich zmyslov. Navyše mnohí pacienti následkom zranenia umieraj ú.

Dnes sa liečba sústreďuje na obsiahnutie čo možno najvyššieho počtu poškodení v rámci obdobia 24 hodín nasledujúcich po poranení. Ak niekto utrpí poranenie mozgu, výsledné poškodenie presahuje počiatočnú traumu. Dochádza ku kaskáde „sekundárneho poškodenia. Imunitné bunky vlastné mozgu spúšťajú opuch a tvorbu tekutiny a poranené nervové bunky začínajú vypúšťať, neurotransmiter zvaný glutamát, ktorý sa môže čoskoro nahromadiť do úrovne, ktorá je toxická pre okolité neuróny.

5) Rehabilitácia mŕtvice

V rámci predkladaného vynálezu sa rehabilitácia mŕtvice definuje ako zákrok, ktorého výsledkom je obnovenie funkcií, ktoré sa stratili kvôli mŕtvici.

6) Mŕtvica

V rámci predkladaného vynálezu dochádza k mŕtvici v prípade, že krvná zrazenina blokuje krvnú cievu alebo artériu, alebo v prípade, že dochádza k narušeniu krvnej cievy, čo prerušuje tok krvi do oblasti mozgu. Ak nastane mŕtvica, dochádza k úmrtiu mozgových buniek v bezprostrednom okclí. Lekári túto oblasť mŕtvych buniek nazývajú infarktom. Tieto bunky zvyčajne umierajú v priebehu minút až niekoľkých málo hodín po počiatku mŕtvice. Ukazovatele demyelinizácie, ako je magnetizačný prenosový pomer (MTR), sú v prípade mŕtvice úzko spojené s axonálnym poškodením, ktoré koreluje s motorickým deficitom (Pendlebury a kol., 2000).

7) Alkylová alebo alkylénová skupina

Ak sa neuvádza alebo nenaznačuje inak, znamenajú termíny „alkylová skupina” alebo „alkylénová skupina” rozvetvenú alebo priamu alkylovú alebo alkylénovú skupinu, ako to vhodné vo vzorci, vymedzenú množstvom atómov uhlíka v alkylovej skupine, napr. alkylová skupina obsahujúca 1 až 6 atómov uhlíka znamená podľa okolností jedno-, dvoj-, troj-, stvor-, päť- alebo šesťuhlíkatý rozvetvený alebo priamy reťazec alkylovej alebo alkylénovej skupiny, alebo sa počet atómov uhlíka pohybuje v ľubovoľnom rozsahu spadajúcom do tohto rozsahu. Počet atómov uhlíka napríklad, avšak bez obmedzenia, predstavuje 1 až 2, 1 až 3, 1 až 4, 1 až 5, 2 až 3, 2 až 4, 2 až 5, 2 až 6, 3 až 4, 3 až 5, 3 až 6, 4 až 5, 4 až 6, 5 až 6, atď.

8) Alkoxyskupina obsahujúca 1 až 6 atómov uhlíka

Ak sa neuvádza alebo nenaznačuje inak, znamená termín „alkoxyskupina obsahujúca 1 až 6 atómov uhlíka” priamu alebo rozvetvenú alkóxyskupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka. K príkladom takejto alkoxyskupiny patrí metoxyskupina, etoxyskupina, n-propoxyskupina, izopropoxyskupina, n-butoxyskupina, izobutoxyskupina, sek-butoxyskupina, terc-butoxyskupina a priame alebo rozvetvené pentoxyskupiny a hexoxyskupiny.

9) Atóm halogénu

Ak sa neuvádza alebo nenaznačuje inak, termín „atóm halogénu” znamená atóm fluóru, atóm chlóru, atóm brómu alebo atóm j ódu.

10) Alkánová kyselina obsahujúca 1 až 6 atómov uhlíka

Ak sa neuvádza alebo nenaznačuje inak, termín „alkánová kyselina obsahujúca 1 až 6 atómov uhlíka” znamená karboxylovú kyselinu, v prípade ktorej sa karboxylová skupina viaže na atóm vodíka alebo alkylovú skupinu obsahujúcu od 1 do 5 atómov uhlíka .

11) Alkanoylová skupina obsahujúca 1 až 6 atómov uhlíka

Termín „alkanoylová skupina obsahujúca 1 až 6 atómov uhlíka” znamená skupinu získanú odstránením hydroxyskupiny z karboxylovej skupiny alkánovej kyseliny obsahujúcej 1 až 6 atómov uhlíka, a preto zahŕňa napríklad formylovú skupinu, acetylovú skupinu a pod. Termíny „alkanoylová skupina”, „alkenoylová skupina” a „alkinoylová skupina” znamenajú skupiny získané odstránením hydroxyskupiny z karboxylovej skupiny alkánovej kyseliny, alkénovej kyseliny, respektíve alkínovej kyseliny. Tak je napríklad linoleylová skupina odvodená od kyseliny linolovej príkladom termínu „alkenoylová skupina”, ktorý sa už definoval.

12) Farmaceutický prijateľné soli

Termín „farmaceutický prijateľné soli” znamená buď adičnú sol s kyselinou alebo adičnú sol s bázou, ktorá je zlúčitelná s liečením pacientov pri zamýšľanom použití.

13) Farmaceutický prijateľná adičná sol s kyselinou „Farmaceutický prijateľnou adičnou solou s kyselinou” je ľubovoľná netoxická, organická alebo anorganická, adičná sci s kyselinou bázických zlúčenín všeobecného vzorca I alebo ľubovoľného z ich medziproduktov. K príkladom anorganických kyselín, ktoré vytvárajú vhodné soli, patrí kyselina chlorovodíková, kyselina bromovodíková, kyselina sírová a kyselina fosforečná, a kyslé solí kovov, ako sú monohydrogenortofosforečnan sodný a hydrogensíran draselný. K príkladom organických kyselín, ktoré vytvárajú vhodné soli, patria mono-, di- a trikarboxylové kyseliny. Príkladmi týchto kyselín sú napríklad kyselina octová, kyselina glykolová, kyselina mliečna, kyselina pyrohroznová, kyselina malónová, kyselina jantárová, kyselina glutárová, kyselina fumarová, kyselina jablčná, kyselina vínna, kyselina citrónová, kyselina askorbová, kyselina maleínová, kyselina hydroxymaleínová, kyselina benzoová, kyselina hydroxybenzoová, kyselina fenyloctová, kyselina škoricová, kyselina salicylová, kyselina 2-fenoxybenzoová, a sulfónové kyseliny, ako sú kyselina metánsulfónová, kyselina 2-hydroxyetánsulfónová a kyselina p-toluénsulfónová. Môžu sa vytvoriť buď adičné soli s obsahom jednej alebo dvoch molekúl kyseliny, a tieto soli môžu byť buď v hydratovanej alebo solvatovanej alebo v podstate bezvodej forme. Vo všeobecnosti sú adičné soli týchto zlúčenín s kyselinou rozpustnéjšie vo vode a rôznych hydrofilných organických rozpúšťadlách, a v porovnaní s ich voľnými bázami sa vo všeobecnosti vyznačujú vyššími teplotami topenia.

14) Farmaceutický prijatelná adičná sol s bázou

Termín „farmaceutický prijateľná adičná sol s bázou znamená netoxické, organické alebo anorganické, adičné soli s bázou zlúčenín všeobecného vzorca I alebo ľubovoľného z ich médziproduktov. Príkladmi sú hydroxidy alkalických kovov alebo kovov alkalických zemín, ako sú hydroxid sodný, hydroxid draselný, hydroxid vápenatý, hydroxid horečnatý alebo hydroxid bárnarý; amoniak a alifatické, alicyklické alebo aromatické organické amíny, ako je metylamín, trimetylamín a pikolín. Kritéria na voľbu vhodnej soli sú odborníkovi v odbore známe.

15) Stereoizoméry

Termín „stereoizoméry je všeobecným termínom pre všetky izoméry jednotlivých molekúl, ktoré sa líšia iba orientáciou ich atómov v priestore. Zahŕňa zrkadlové izoméry (enantioméry), geometrické (cis/trans) izoméry a izoméry zlúčenín s viac než jedným chirálnym centrom, ktoré nie sú navzájom zrkadlovými izomérmi (diastereoméry).

16) Pacient

Termín „pacient znamená teplokrvného živočícha, ako sú napríklad potkany, myši, psy, mačky, morčatá a primáty, ako sú ľudia.

17) Liečenie alebo liečba

Termín „liečenie alebo „liečba znamená zmiernenie symptómov, odstraňovanie príčin symptómov, a to buď na prechodnej alebo permanentnej báze, alebo predchádzanie alebo spomaľovanie prejavov symptómov uvedených ochorení alebo stavov.

18) Terapeuticky účinné množstvo

Termín „terapeuticky účinné množstvo znamená množstvo zlúčeniny, ktoré je účinné pri liečení uvedenej poruchy, ochorenia alebo stavu.

19) Farmaceutický prijateľný nosič „Farmaceutický prijateľným nosičom je netoxické rozpúšťadlo, dispergačné činidlo, pomocná látka, adjuvant alebo iný materiál, ktorý sa zmieša s účinnou látkou s cieľom umožniť vytvorenie farmaceutickej kompozície, t. j. dávkovej formy schopnej podávania pacientovi. Jedným z príkladov takéhoto nosiča je farmaceutický prijateľný olej, typicky používaný na parenterálne podávanie.

20) Neuropatická bolesť

Termín „neuropatická bolesť znamená bolesť, ktorá je výsledkom poškodenia nervového systému. Nervové poškodenie môže byť identifikované alebo môže byť neidentifikované. K príkladom neuropatickej bolesti patrí postherpetická neuralgia, bolestivá diabetická neuropatia, fantómová bolesť končatín a centrálna postmŕtvičná bolesť.

21) Iritácia a dysfunkcia močového mechúra

Termín „iritácia a dysfunkcia močového mechúra znamená stav, ako je intersticiálna cystitída a nadmerná aktivira močového mechúra. Nadmerná aktivita močového mechúra je určitý lekársky stav vyznačujúci sa symptómami zahŕňajúcimi frekvenciu močenia, naliehavosť močenia a urgentnú inkontinenciu, t. j. neúmyselný únik moču, ku ktorému dochádza po silnom náhlom nutkaniu k močeniu. Diagnóza nadmerne aktívneho močového mechúra sa vysloví v prípade neprítomnosti lokálnych príčin alebo príčin súvisiacich s metabolizmom so symptómami, ktoré sa môžu pripísať mimovolným kontrakciám močového mechúra spôsobeným nadmernou aktivitou svalového detruzora. Intersticiálna cystitída (IC) je chronický zápalový stav steny močového mechúra, ktorý časno prebieha nediagnostikovaný.

Zlúčeniny všeobecného vzorca I môžu účinne zlepšovať rýchlosť a stupeň uzdravenia v prípade akútneho poranenia miechy a dlhodobého poranenia miechy. Vyznačujú sa vlastnosťami, ktoré sú v súlade s blokádou sodíkových kanálov závislou od aplikácie a blokádou draslíkových kanálov závislou od napätia in vivo. Poskytujú bezpečnejšie liečivá než 4-AP. Obzvlášť výhodné .sú zlúčeniny, v ktorých R znamená atóm vodíka, atóm halogénu, trifluórmetylovú skupinu alebo alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka;. R¹ znamená atóm vodíka alebo alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka; R² znamená atóm vodíka alebo alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka; R³ znamená atóm vodíka, alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka alebo atóm halogénu; a p znamená 0. Ďalšími výhodnými zlúčeninami sú zlúčeniny, v ktorých sa aminoskupina viaže v polohe 4 pyridínového kruhu.

Ešte výhodnejšie sú zlúčeniny všeobecných vzorcov II [známe aj ako HP 184 alebo N-(3-fluór-4-pyridyl)-N-propyl-3-metyl-l.fí-indol-l-amín] a III (známa aj ako „8183).

HP 184 je veľmi dobre znášaná v prípade potkana v mikromolárnych mozgových koncentráciách 1 hodinu po i. p. podaní 30 mg/kg HP 184 (Smith a kol., 1996).

Jedinečná kombinácia blokády sodíkových kanálov závislej od aplikácie a blokády draslíkových kanálov závislej od napätia zlúčeniny podlá predkladaného vynálezu takisto odlišuje od „čistých blokátorov sodíkových kanálov, ako je karbamazepín a fenytoín. Tieto činidlá sa úspešne použili na zmiernenie „pozitívnych symptómov MS (bolestivý tonický záchvat a dysestézia). Zhoršujú však negatívne symptómy (paralýza a hypestézia; Sakurai a Kanazawa, 1999). Zlúčeniny podlá predkladaného vynálezu zvyšujú neuronálnu funkciu vďaka skutočnosti, že blokujú draslíkové kanály. Toto napomáha funkčnému zotaveniu. V súčasnosti sa verí, že sú blokátory sodíkových kanálov použiteľné pri liečení bolestivých symptómov alebo/a ako neuroprotektívne činidlá. Neočakávalo sa však, že by zvyšovali intenzitu rehabilitácie.

Pri liečení pacientov postihnutých už opísanými stavmi a poruchami sa môže podávať zlúčenina všeobecného vzorca I v ľubovoľnej forme alebo ľubovoľným spôsobom, ktoré umožnia, že zlúčenina je biologicky dostupná v terapeuticky účinných množstvách, čo zahŕňa orálne, sublingválne, bukálne, subkutánne, intramuskulárne, intravenózne, transdermálne, intranasálne, rektáľne, topické podávanie a pod. Odborník v odbore prípravy prípravkov môže stanoviť patričnú formu a spôsob podávania v závislosti od konkrétnych vlastností zlúčeniny zvolenej pre liečený stav alebo ochorenie, stupňa ochorenia, stavu pacienta a ďalších relevantných okolností; pozri napríklad Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. vydanie, Mack Publishing Co. (1990), ktorý sa uvádza ako odkaz.

Zlúčeniny všeobecného vzorca I sa môžu podávať samotné alebo vo forme farmaceutickej kompozície v kombinácii s farmaceutický prijateľnými nosičmi, ktorých pomerná časť a charakter je daná rozpustnosťou a chemickými vlastnosťami zvolenej zlúčeniny, zvoleného spôsobu podávania, štandardnej farmaceutickej praxe a ďalšími relevantnými kritériami.

Zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu sa môžu podávať orálne, napríklad vo forme tabliet, pastiliek, kapsulí, elixírov, suspenzií, roztokov, sirupov, oblátok, žuvačiek a pod., a môžu obsahovať jednu alebo viacero z nasledovných pomocných látok: spájadlá, ako je mikrokryštalická celulóza, tragantová guma alebo želatína; excipienty, ako je škrob a laktóza; dezintegračné činidlá, ako je kyselina algínová, Primogel, kukuričný škrob a pod. ; lubrikanty, ako je stearát horečnatý alebo Sterotex; glidanty, ako je koloidný oxid kremičitý; sladidlá, ako je sacharóza alebo sacharín, alebo aromatické činidlá, ako je pepermint, metylsalicylát alebo pomarančové ochuťovadlo. Ak je dávkovou jednotkou kapsula, môže okrem látok uvedeného typu obsahovať kvapalný nosič, ako je polyetylénglykol alebo mastný olej. Ďalšie jednotkové dávkové formy môžu obsahovať rôzne materiály, ktoré modifikujú fyzikálnu formu dávkovej jednotky, ako sú napr.

poťahy. Tablety alebo pilulky tak môžu byť potiahnuté cukrom, šelakom alebo ďalšími činidlami na enterické poťahy. Sirup môže okrem zlúčenín podlá predkladaného vynálezu obsahovať sacharózu ako sladidlo a určité konzervačné činidlá, farbivá a farbiace činidlá a ochuťovadlá.

Zlúčeniny všeobecného vzorca I podľa predkladaného vynálezu sa môžu podávať aj topicky, a ak sa tak urobí, môže nosič vhodne obsahovať rozpúšťadlový, masťový alebo gélový základ. Základ môže napríklad zahŕňať jednu alebo viacero z látok, ako sú vazelína, lanolín, polyetylénglykoly, včelí vosk, minerálny olej, riedidlá, ako je voda a alkohol, a emulgačné činidlá a stabilizátory .

Roztoky a suspenzie môžu zahŕňať aj jednu alebo viacero z nasledovných pomocných látok: sterilné riedidlá, ako je voda pre injekcie, fyziologický roztok, nevysychajúce oleje, pclyetylénglykoly, glycerín, propylénglykol alebo ďalšie syntetické rozpúšťadlá; antibakteriálne činidlá, ako je benzylalkohol alebo metylparabén; antioxidanty, ako je kyselina askorbová alebo hydrogensiričitan sodný; chelatačné činidlá, ako je kyselina etyléndiamíntetraoctová; pufre, ako sú acetáty, citráty alebo fosfáty, a činidlá na úpravu tonicity, ako je chlorid sodný alebo dextróza. Parenterálny prípravok môže byť uzavretý v ampule, striekačke na jednorazové použitie alebo viacdávkovej nádobke.

Vysoko lipofilné estery, amidy a karbamáty podlá predkladaného vynálezu sú schopné ustáleného uvoľňovania v prípade cicavcov počas niekoľkých dní alebo od približne jedného do štyroch týždňov, ak sa. upravia a podávajú v podobe depotných prípravkov, ako napríklad, ak sa injekčné vpravia vo vhodne zvolenom farmaceutický prijateľnom oleji. Výhodné oleje sú rastlinného pôvodu, ako je sezamový olej, bavlníkový olej, kukuričný olej, kokosový olej, sójový olej, olivový olej a pod., alebo sú nimi syntetické estery mastných kyselín a polyfunkčných alkoholov, ako je glycerol alebo propylénglykol.

Depotná kompozícia podlá predkladaného vynálezu sa pripraví rozpustením vysoko lipofilného esteru, amidu alebo karbamátu'podlá predkladaného vynálezu vo farmaceutický prijateľnom oleji za sterilných podmienok. Olej sa zvolí tak, že sa dosiahne uvolňovanie účinnej látky v priebehu požadovaného obdobia. Vhodný olej môže odborník v odbore ľahko stanoviť na základe doterajšieho stavu techniky a bez prílišného experimentovania.

Dávkový rozsah, pri ktorom sa zlúčeniny všeobecného vzorca I vyznačujú svojou schopnosťou terapeutického účinku, sa líši v závislosti od konkrétneho liečeného ochorenia alebo stavu a jeho závažnosti, pacienta, prípravku, ďalších sprievodných chorobných stavov, ktorými pacient trpí, a ďalších liečiv, ktoré sa môžu pacientovi súčasne podávať. Vo všeobecnosti sa môžu zlúčeniny všeobecného vzorca I vyznačovať svojimi terapeutickými účinkami v dávkach pohybujúcich sa medzi 0,001 mg/kg telesnej hmotnosti pacienta/deň do približne 100 mg/kg telesnej hmotnosti pacienta/deň.

Nasledovné príklady uskutočnenia vynálezu majú slúžiť iba na ilustratívne účely a nemajú teda zo žiadneho hľadiska obmedzovať rozsah predkladaného vynálezu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

In vivo preukázanie súlade s blokádou sodíkových kanálov závislou od napätia

Metódy

Postup experimentu bol založený na metóde opísanej BachauPom a kol. (1992). Samčie CD-I myši s hmotnosťou 35 až 40 g sa anestetizovali chloralhydrátom (400 mg/kg). Pod operačným mikroskopom sa uskutočnil 3 mm vertikálny kožný rez 2 mm za pravou or20 bitou. Spánkový sval sa odsunul na bok a uskutočnila sa malá kraniotómia s cielom odhaliť duru. Dura sa incidovala a odsunula sa na bok a obnažila sa distálna časť pravej strednej karotickej artérie. Artéria sa okludovala pred hlavnou bifurkácicu bipolárnou elektrokoaguláciou jemnou svorkou. O 24 hodín neskôr sa zmeral objem infarktu pomocou 2 % roztoku trifenyltetrazóliumchloridu. V'rámci tohto experimentálneho pokusu sa nelačným myšiam (10 v skupine) 1 hodinu pred oklúziou orálne podal HP 184. Znižovanie objemu infarktu bolo založené na porovnaní s myšami ošetrenými 1 % kyselinou octovou, t. j. vehikulom. Výsledky ukazuje tabulka 1.

Tabulka 1

Neuroprotektívna aktivita HP 184 v myšom modeli mŕtvice pMCAO

Dávka	Čas	% zníženia objemu infarktu
(mg/kg, p. o.)	(min.)	(stred ± SEM)
1	-60	21 ± 3
10	-60	32 ± 11*
10	-60	40 ± 2,5**

SEM = štandardná chyba merania, * = p < 0,05; ** = p < 0,31

Neuroprotekcia pozorovaná v myšom modeli permanentnej oklúzie strednej karotickej artérie (pMCAO) je pri tejto dávke a v tomto čase v súlade s in vivo blokádou sodíkových kanálov závislou od napätia.

Príklad 2

Účinok HP 184 na edém pofototrombotickej cerebrálnej lézie v prípade potkana

Princíp/ciel

Tromboembolická mŕtvica je treťou príčinou smrti v západnom svete. Je spôsobená krvnou zrazeninou alebo rozpadajúcim sa trombom, a to buď vytvoreným v cerebrálnej cirkulácii alebo vytvoreným v srdci alebo veľkých cievach a doneseným do cerebrálnej cirkulácie. Potom sa prerušuje krvný prietok a objavuje sa ischemická lézia s edémom, nekrózou a apoptózou tkaniva. Edém je zhubný, pretože stláča mozog, čo podporuje ischémiu, ako aj lýzu buniek a mechanické poranenie. Liečba pomocou HP 184, t. j. spoločného blokátora Na⁺/K⁺ kanálov, sa testovala na účinky na tento cerebrálny edém.

Metóda

Samčie potkany Sprague-Dawley (180 až 200 g telesnej hmotnosti) sa anestetizovali chloralhydrátom (400 mg/kg i. p.) a umiestnili sa v stereotaktickom zariadení. Otvorila sa koža s cieľom obnažiť lebku a do kontaktu s pravou stranou lebky pred lambdu sa umiestnilo studené svetlo (Bioblock 150 W) . Intravenózne sa podalo farbivo Bengál rose (10 mg/kg i. v. vo fyziologickom roztoku) a bezprostredne potom sa zahájilo osvetľovanie lebky a pokračovalo sa v ňom počas 5 minút. Koža sa potom uzavrela suturou nad lebkou a zvieratá sa vrátili do ich klietok. 24 hodín po fototrombotickej lézii sa zvieratám intravenóznou cestou podal HP 184 pripravený v 1 % tweene vo vode v dávke 0, 10 alebo 20 mg/kg telesnej hmotnosti v objeme 5 ml/kg. O hodinu neskôr sa zvieratá usmrtili dekapitáciou a odobrali sa ich mozgy (protokol pozri dodatok). Vzorky kôry sa odobrali v mieste lézie a kontralaterálne vzhľadom na léziu použitím korkového vrtáku s priemerom 6 mm. Pomocou vlhkej hmotnosti tkaniva/suchej hmotnosti tkaniva sa v prípade každého potkana stanovil obsah vody a edém sa vyjadril ako percentuálny nadbytok vody vo vzorke z lézie oproti vzorke z kontralaterálnej hemisféry. Výsledky ukazuje tabuľka 2.

Tabuľka 2

Terapia 24 h po lézii	n	edém (% nadbytok vody) 25 h po lézii
vehikulum	26	4,10 ± 0,12
HP 184 10 mg/kg i. v.	12	3,61 ± 0,23 ns
HP 184 20 mg/kg i. v.	13	3,20 ± 0,27**

štatistické údaje: ANOVA + Tukey-Kramer ★★ = p < 0,001

HP 184 sa vyznačoval významným (22 %) znížením edému v kôre pravého mozgu 1 hodinu po i. v. podaní v dávke 20 mg/kg a 25 hodín po fototrombotickej lézií.

Príklad 3

Princíp/ciei

Pri tejto štúdii sa HP 184 podával 1 hodinu po nástupe ischémie v modeli prechodnej cerebrálnej ischémie v prípade potkanov. Meranými parametrami boli veľkosť lézie a neurologická funkcia.

Metódy

Samčie potkany Sprague-Dawley (Iffa Credo, Francúzsko) s hmotnosťou približne 220 až 240 g sa anestetizovali halotanom (1,4 %) v zmesi oxidu dusného a kyslíka (70 : 30). Izolovali sa obe spoločné karotické artérie (CCA). Ľavá stredná cerebrálna artéria (MCA) obnažená prostredníctvom temporálnej kraniotómie sa okludovala pomocou mikrosvorky a súčasne sa okludovali počas 1 hodiny CCA. Tak telesná, ako aj cerebrálna teplota sa udržiavali normotermickými. Po chirurgickom zákroku sa zvieraná vrátili do ich domácich klietok v miestnosti vyhriatej na teplotu 24 až 26 ’C.

HP 184 rozpustený v 1 % tweene (v injikovateľnej sterilnej vode) sa podával v dávke 10 a 20 mg/kg i. v. po nástupe ischémie a kontrolným potkanom sa podávalo vehikulum pódia rovnakého protokolu. 24 hodín po ischémii sa slepo zhodnotila neurologická funkcia použitím deväťbodovej hodnotiacej stupnice.

Hodnotiaca stupnica použitá na neurologickú funkciu

Položka	Normálne skóre	Deficit
Umiestňovacia reakcia	ľavá predná	labka	1	0
Vešanie končatiny	ľavá		1	0
Vizuálna			1	0
Uchopovací reflex	ľavá predná	labka	1	0
	ľavá		1	0
Vzpriamovací reflex
Sklonená hlava	ľavá strana		1	0
	pravá		1	0
Abnormálne držanie tela		neprítomné	prítomné
Krútenie hrudníka			1	0
Flexia ľavej prednej	končatiny		1	0
Celkové neurologické	skóre		9

Potom sa potkany usmrtili a mozgy sa vybrali. Narezali sa čerstvé rezy mozgového matrixu a pri teplote 37 °C sa počas 5 minút farbili 2 % trifenyltetrazóliumchloridom. Rezy sa potom uchovávali v 10 % formalíne pri teplote 4 °C počas 24 hodín. Oblasti infarktu sa merali obrazovým analyzátorom (Leica Q500).

Výsledky

Ischémia vyvolala objavenie sa cerebrálnych lézií, a to tak v kôre, ako aj v corpus striatum (pozri obr. 1, ktorý .ukazuje účinok HP 184 na poškodenie mozgu pri 10 a 20 mg/kg i. v. boluse 1 hodinu po oklúzii MCA). V dávke 10 mg/kg i. v. HP 184 významne znižuje mozgové lézie o 41 % (p < 0,05). Toto zníženie bolo významné v kôre (-45 %, p < 0,05) .

Príklad 4

Meranie blokády draslíkových kanálov

Metódy

Bunky PC12 (ATCC, Rockville, MD) sa kultivovali v Dulbeccom modifikovanom Eaglovom médiu doplnenom 10 % fetálnym hovädzím sérom (GIBCO BRL, Grand Island, NY).

Prúdy draslíkových kanálov sa merali použitím štandardného elektrofyziologického protokolu terčíkového zámku (patch clamp), ako sa už opísal (Rampe a kol., 1998).

Výsledky a diskusia

Prúdy draslíkových kanálov sa vyvolali 200 ms svorkovými pulzmi na +40 mV z udržiavacieho potenciálu -80 mV. Výsledkom tohto protokolu bol ustálený, von namierený prúd. Aplikáciou HP 184 (10 gmol) sa znížila amplitúda tohto prúdu a zvýšila sa miera slabnutia prúdu. Ak sa prúd meral na konci pulzu, amplitúda prúdu sa znížila pomocou HP 184 o 75 ± 4 % (n = 4) . Výsledky sú v súlade s predstavou, že HP 184 účinkuje ako antagonista K⁺ kanálov závislých od napätia blokovaním aktivovaného stavu.

Príklad 5

In vivo preukázanie zvýšenia svalovej funkcie

Princíp

O anorganickom farbive Ruthenium red (RuR) sa publikovalo, že blokuje Ca²⁺ prúd závislý od napätia v prípade rôznych typov buniek, vrátane myších senzorických neurónov (Duchen, 1992), synaptozómov a neuromuskulárnych prípravkov (Hamilton a Lundy,

1995; Tapi a Velasco, 1997). Ďalej RuR blokuje uvoľňovanie neurotransmiterov v mozgových synaptozómoch (Meza-Ruiz a Tapia, 1978; Tapia a Meza-Ruiz, 1977) a neuromuskulárne spojenie (Alnaes a Rahamimoff, 1975; Person a Kuhn, 1979). In vivo spôsobuje intraperitoneálne (i. p.) podávanie RuR v prípade myši chabú paralýzu (Tapia a kol., 1976) a tento účinok je antagonizovaný

4-aminopyrid’ínom (4-AP), blokátorom K⁺ kanálov závislých od napätia (Tapia, 1982). Tapia a Velasco (1997) posúdili účinky RuR tak in vivo, ako aj in vitro, a vyslovili hypotézu, že RuR pôsobí na miesta Ca²⁺ umiestnené v membráne nervového zakončenia. Väzbové štúdie naznačujú, že RuR selektívne blokuje Ca²⁺ kanály typu N, a že tieto kanály regulujú, tok Ca²⁺ smerom dovnútra, nutný na uvoľnenie neurotransmitera. Títo autori naznačujú aj to, že í. p. podávanie RuR môže byť experimentálnym modelom Eaton-Lambertovho syndrómu myastenia gravis, autoimunitného ochorenia vyznačujúceho sa blokádou vstupu Ca²⁺ a uvoľňovania ACh spôsobenou protilátkami, ktoré sa viažu na Ca²⁺ kanály rýpu N. V súlade s touto možnosťou sa o 4-AP publikovalo, že v prípade pacientov zlepšuje svalovú slabosť a obnovuje neuromuskulárny prenos (Lundh a kol., 1977a; 1997b; 1979; Mc Evoy a kol., 1989; Aisen a kol., 1995).

Schopnosť tak 4-aminopyridínu (4-AP), ako aj guanidínu antagonizovať chabú paralýzu vyvolanú RuR je možno spôsobená ich schopnosťou uľahčiť uvoľňovanie neurotransmitera (Lundh, 1978; Lundh a Thesleff, 1977; Tapia a Stiges, 1982). V každom prípade Tapia a spolupracovníci (Tapia a Stiges, 1982) oznámili, že RuR blokuje v synaptozómoch uvoľňovanie vyvolané prostredníctvom

4-AP.

In vitro zvyšuje HP 184 uvoľňovanie neurotransmitera odlišným mechanizmom než 4-AP. Vo vysokých koncentráciách zvyšuje

4-AP tak elektricky stimulované, ako aj spontánne uvoľňovanie, tieto účinky sú však závislé od vápnika. Naproti tomu HP 184 zvyšuje iba spontánne uvoľňovanie neurotransmitera nezávislé od vápnika (Smith a kol., 1993). Vyslovila sa aj hypotéza, že spôn26 tánne uvoľňovanie má in vivo funkčnú úlohu (Smith a kol., 1996).

Cieľom nasledovného pokusu bolo stanoviť skutočnosť, či by HP 184 a 4-AP mohli antagonizovať paralyzujúci účinok RuR po súbežnej injekcii.

Metódy a výsledky

Skupinám 4 až 5 myší (CD-I; Charles River; 25 až 35 g) sa oddelene, avšak súbežne, injekčné i. p. podalo farbivo Rurhenium red a vehikulum (1 % ľadová kyselina octová), farbivo Rurhenium red a 4-AP alebo farbivo Ruthenium red a HP 184. V rámci tohto pokusu sa testovala aj zlúčenina známa ako „8183. 15 minút po injekciách sa myši umiestnili do blízkosti „stožiarového zariadenia a zaznamenávala sa ich schopnosť niesť vlastnú telesnú hmotnosť (t. j. držať sa stožiaru a nespadnúť). Výsledky sa zaznamenávali v podobe počtu myší, ktoré mohli niesť vlasrnú telesnú hmotnosť oproti celkovému počtu testovaných myší. Tieto výsledky ukazuje tabuľka 3. Všetky pokusy sa uskutočnili medzi 14:00 a 16:30 hod.

Tabuľka 3

látka, dávka	látka, dávka	15 min	30 min	4 5 min
RuR, 30 mg/kg	vehikulum	29 zo 69	19 zo 69	18 zo 64
i. p.		(42 %)	(27,5 %)	(30,4 %)
	0,3 mg/kg	22 z 25	13 z 25	12 z 25
	4-AP	(88 %)	(52 %)	(48 %)
	0,6 mg/kg	12 zo 14	8 zo 14	8 zo 14
	4-AP	(85,7 %)	(57,1 %)	(57,1 %)
	30 mg/kg	15 z 15	15 z 15	15 z 15
	HP 184	(100 %)	(100 %)	(100 %)
	10 mg/kg	14 z 15	12 z 15	11 z 15
	HP 184	(93,3 %)	(80 %)	(73,3 %)
	30 mg/kg	13 zo 14	13 zo 14	14 zo 14
	8183	(92,8 %)	(92,8 %)	(100 %)
	100 mg/kg	11 z 20	10 z 20	10 z 20
	DPH	(55 %)	(50 %)	(50 %)
	30 mg/kg	4 z 15	3 z 15	4 z 15
	DPH	(26,7 %)	(20 %)	(26,7 %)
	10 mg/kg	9 z 15	4 z 15	4 . z 15
	RIL	(60 %)	(26,7 %)	(26,7 %)

Záver

Tak 4-AP (i. p.), ako aj HP 184 (i. p.) môže antagonizovať chabú paralýzu vyvolanú i. p. podaním RuR. Z toho vyplýva, že HP 184 je schopný zvyšovať neuronálnu transmisiu in vivo, možno prostredníctvom blokády K⁺ kanálov. Je takisto možné, že HP 184 zvyšuje neuronálnu transmisiu, ako je to v prípade 4-AP, pretože pokusy in vitro s mozgovými rezmi dokladajú zvýšené uvolňovanie mozgových neurotransmiterov (Smith a kol., 1993; 1996) .

Dávky blokátorov sodíkových kanálov, difenylhydantoínu (DPH) a riluzolu (RIL), testované v rámci tohto pokusu, sa predtým ukázali ako neuroprotektívne v modeloch fokálnej ischémie (Rataud a kol., 1994; O'Neill a kol., 1997). Chýbanie ich účinku v tomto modeli podporuje interpretáciu, že schopnosť HP 184 antagonizovať chabú paralýzu vyvolanú RuR pravdepodobne nie je spôsobená in vivo blokádou sodíkových kanálov. Toto sa predpokladá aj klinicky. Negatívne symptómy MS (strata hybnosti) sa často blokátormi sodíkových kanálov zhoršujú (Sakurai a Kanazawa, 1999) .

Príklad 6

Modely ochorenia miechy zo stlačenia

Princíp a ciele

Gruner a Yee (1999) ukázali, že 4-AP v prípade potkanov 25 dní po poškodení miechy zvyšuje mMEP po odstupňovanom poranení miechy. Použitím rovnakého postupu sa stanovilo funkčné správanie. 0 tomto správaní sa ukázalo, že je v korelácii s minimálnym mMEP. Ciel týchto pokusov bol dvojaký:

1) stanoviť, či môže HP 184 zmierniť motorické poškodenia strednej intenzity vyvolané stlačením miechy, ak sa podáva akútne, a porovnať jeho účinnosť s metylprednisolonsukcinátom (MPSS); a

2) stanoviť, či môže HP 184 zlepšiť motorické funkcie v prípade potkanov s dlhodobým (25 dní) poranením miechy s malou intenzitou, a porovnať jeho účinky so 4-aminopyridínom (4-AP).

Akútna liečba - i. p. podávanie

Miechy samičích potkanov sa vystavili laminektómíi (falošná, n = 12) alebo sa stlačili na priemer 1,4 mm (5 skupín, n = 12 každá). Normálny priemer miechy je približne 2,5 mm. Toto stlačenie predstavuje stredné poranenie vyznačujúce sa počiatočným skóre chôdze v otvorenom priestore (Open Field Walking Score) vo výške 1,5 až 2,5 podľa stupnice Open Field Walking Scale Definície Open Field Walking Scale (OFT) sú nasledovné:

0,0 žiadne .spontánne pohyby

0,7 lahké pohyby

1,0 pohyby v bedre alebo/a kolene (nie však v členku)

1.3 aktívne pohyby v bedre a kolene, nie však v členku

1.7 sporné pohyby v členku

2,0 pohyby končatiny vo všetkých troch veľkých kĺboch

2.3 pokusy o podoprenie

2.7 podoprenie iba v postoji

3,0 aktívne podoprenie, nekoordinované pohyby

3.3 prerušované záchvaty koordinovanej chôdze

3.7 absencia kontroly členka alebo nohy, chôdza na kĺboch alebo mediálnej ploche nohy

4,0 koordinácia predných končatín a zadných končatín pri chôdzi

4.3 lepšia posturálna opora zadných končatín, brucho neklesá k zemi

4.7 jeden alebo dva prsty sa ťahajú, ľahká nestálosť obracania v plnej rýchlosti

5,0 normálna chôdza a základňa opory, žiadna strata rovnováhy pri rýchlych obratoch, žiadne ťahanie prstov

Liečenie liečivami

V priebehu 15 minút stláčania (deň 1) sa potkanom v skupinách označených HP 184 podávali i. p. injekcie 20, 10, 5 alebo 0 mg/kg v 1 % vehikule v podobe ľadovej kyseliny octovej. Toto podanie sa opakovalo v dňoch 2 a 3. Na druhej strane sa podával MPSS v dávke 30 mg/kg 15 minút, 2 hodiny, 4 hodiny a 6 hodín v deň 1 po stlačení. Tento dávkovací režim MPSS sa opísal v literatúre ako optimálny a odráža dávkovanie uskutočňované v prípade ľudí. MPSS je v súčasnosti jedinou liekovou terapiou schvá30 lenou pre ľudské poranenie miechy. Obr. 2 ukazuje skóre správania (OFT) rôznych liečebných skupín v priebehu času. Normálne predoperačné skóre je 5. Rýchlosť a rozsah zlepšovania bol tak v prípade skupiny s dávkou 20 mg/kg, ako aj v prípade skupiny s dávkou 5 mg/kg, odlišný než v prípade potkanov ošetrovaných vehikulom. Každý bod predstavuje strednú hodnotu + SEM 8 až 12 potkanov.

Akútne liečenie - p. o. podávanie

Opäť sa miechy samičích potkanov podrobili laminektómii alebo stlačeniu na priemer 1,4 mm. V skupinách HP 184 sa potkany orálne ošetrili 5 až 10 minút pred stlačením, a potom jedenkrát denne v dňoch 2 a 3. MPSS sa podával tak, ako sa už opísalo. Skóre správania (OFT) ukazuje obr. 3. Normálne predoperačné skóre je 5.

Rýchlosť a rozsah zlepšovania boli v porovnaní so skupinou ošetrenou vehikulom lepšie v prípade všetkých dávok, vrátane skupiny s 10 mg/kg. Každý bod predstavuje strednú hodncru + SEM 12 potkanov.

Pokus s chronickým stlačením

Miechy samičích potkanov sa podrobili laminektómii alebo stlačeniu na priemer 1,6 mm. Toto predstavuje malé poranenie a označilo sa ako vedúce ku skóre OFT vo výške 4,0 po 25 dňoch bez liečenia. Toto sa zvolilo v rámci pokusu na vytvorenie rovnakého stupňa motorického poškodenia, ako opísali Gruner a Yee (1999), ktorí preukázali zlepšenie v prípade záznamov miniatúrnych koncových potenciálov (MEPP) na zadnej končatine vyvolanej 4-APOD. 0 tomto postupe a dĺžke neliečeného poškodenia sa takisto preukázalo, že vedie k demyelinizácii. Skóre správania (OFT) ukazuje obr. 4. Obr. 4 ukazuje stredné hodnoty a štandardné chyby skupín, pričom sa použili definície už opísanej stupnice Open Field Walking Scale.

V rámci tohto pokusu bolo skóre OFT o niečo vyššie (4,3 až 4,5), čo ponecháva iba malý priestor na zlepšenie. Použitím každého potkana ako jeho vlastnej kontroly sa pozorovali zhodné zlepšenia po orálnom podávaní HP 184 jedenkrát denne v dňoch 26, 27 a 28. Zhodné zlepšenia sa pozorovali aj po 0,6 mg/kg i. p.

4-AP jedenkrát denne. Štatistické rozdiely boli založené na zmenách pre každého jednotlivého potkana (každý potkan bol svojou vlastnou kontrolou) použitím Mann-Whitneyovho U-testu. Všetky testy správania v dňoch 1, 2 a 3 sa uskutočnili 3 hodiny po podaní. V deň 3 sa nepodalo žiadne liečivo (prvý deň, kedy sa zahájilo podávanie liečiva bol dňom 0). Štatistické analýzy boli nasledovné:

mg/kg - významné zlepšenie v 3 hodinách až deň 3 (p = 0,002) v porovnaní s vehikulovou kontrolou mg/kg - významné zlepšenie v 30 minúte a 3 až 12 hodinách (p = 0,014) v porovnaní s vehikulovou kontrolou mg/kg - významné zlepšenie v 30 minúte až 6 hodine až deň 1 (p = 0,0027) v porovnaní s vehikulovou kontrolou

4-AP - významné zlepšenie v 90 minúte až 3 a 12 hodine až deň 2 (p = 0,0027) v porovnaní s vehikulovou kontrolou

Tabulka 4 ukazuje zmeny v skóre pre každú skupinu od obdobia pred dávkovaním do 3 hodín po tretej po sebe idúcej dennej dávke .

Tabulka 4

	Vehikulum stlačenie	4-AP stlačenie	20 HP stlačenie	10 HP stlačenie	3 HP stlačenie	Laminek. bez stlačenia
Pred	4-,52 ±	4, 43 ±	4,54 +	4,36 ±	4,32 ±	4,87 ±
dávkou	0, 04	0,03	0,02	0,01	0,05	0,01
3 h po poslednej dávke	4,53 + 0,03	4,53 ± 0,02	4,60 ± 0,02	4, 44 ± 0, 03	4,47 ± 0,04	4,87 ± 0, 01

Obr. 5 ukazuje zmeny v skóre normalizované pre každého potkana. Graf ukazuje zmenu pozorovanú po troch po sebe idúcich dňoch dávkovania (od obdobia pred dávkovaním do 3 hodín po tretej po sebe idúcej dennej dávke), buď v prípade 0,6 mg/kg 4-AP (i. p.), 20 alebo 10 alebo 3 mg/kg (p. o.). Laminektómia označuje falošnú skupinu. Na obr. 5 je znázornená stredná hodnota ± SEM pre každú skupinu (n = 12).

Účinnosť pri dlhodobom poranení miechy dní po strednom stupni poranenia miechy zlepšuje orálne podávanie 3 mg/kg HP 184 (p. o.) obnovenie motoriky po jedinej dávke a denné dávkovanie počas ďalších 4 dní vedie na základe definícií v už opísanom teste Open Field Walking Test k trvalému a ustálenému zlepšovaniu. 4-AP v dávke 0,6 mg/kg (i. p.) bol účinný podobne. Tabuľkové znázornenie výsledkov oboch štúdií chronických poranení miechy (liečivá podávané po prvýkrát 25 dní po ľahkom stlačení miechy a 35 dní po strednom stlačení miechy) ukazuje tabulka 5.

Tabuika 5

Liečenie	Deň 25 (ľahké) pred	Deň 28 (ľahké) 3 hodiny po poslednej dávke	Delta	% možného zlepšenia (najvyššie skóre = 5)
Kontrola ·	4,52 ± 0,037	4,53 ± 0,026	0,01	2 %
4-AP (0,6 mg/kg i. p.)	4,43 ± 0,030	4,53 ± 0,023	0,10	17,5 %*
HP 184 (3 mg/kg p. o.)	4,32 ± 0,016	4,47 ± 0,035	0, 15	22,0 %*

Liečenie	Deň 35 (stredné) pred	Deň 3 9 (stredné) 3 hodiny po poslednej dávke	Delta	% možného zlepšenia
Kontrola	4,00 ± 0,074	3,99 ± 0,057	-0,01	-2 %
4-AP (0,6 mg/kg i. p.)	3,95 ± 0,084	4,17 ± 0,047	0,22	22,1 %*
HP 184 (3 mg/kg P· o. )	3,89 ± 0,054	4,17 ± 0,058	0,274	24,8 %*

Ako sa už ukázalo, vyznačuje sa HP 184 v dávke 3 mg/kg/deň pri orálnom podávaní od 35 do 41 dní po strednom poranení stlačením významným zlepšením. Pri tejto štúdii sa zistilo, že v mieste poranenia miechy poranených potkanov užívajúcich HP 184 bolo viac myelínu. Tieto údaje poskytujú dôkaz, ktorý je v súlade s tvrdením, že HP 184 buď zvyšuje remyelinizáciu alebo znižuje existujúci demyelinizačný proces.

Ďalšie štúdie sa uskutočnili s cieľom stanoviť najnižšie účinné dávky HP 184 v prípade pokusu so stredným chronickým (35 dní po poranení) stlačením spôsobom dvojitej slepej, plače34 bom a pozitívne kontrolovanej štúdie. Predtým pozorované účinky HP 184 v dávke 3 mg/kg p. o. sa potvrdili pomocou 4-AP (0,6 mg/kg i. p.) ako pozitívnej kontroly. Účinok všetkých terapií sa ďalej histologický skúmal na farbenie myelínu.

(1) Behaviorálne hodnotenie

150 dospelých samičích potkanov Wistar s hmotnosťou 250 až 300 g získaných z Charles River sa hospitalizovalo počas aspoň 1 týždňa v Mc Master University Healt Sciences Centre (HSC) Central Animal Facilities (CAF). V priebehu tohto času sa podrobili výkonovým testom opísaným ďalej aby sa zaistilo, že sa s nimi oboznámili. S potkanmi sa 2 týždne pred chirurgickým zákrokom denne manipulovalo.

Potkany sa anestetizovali použitím izofluranu (3 až 5 %): O₂(1 1/min) vo vhodne vybavenom chirurgickom zariadení v CAF. Na zmiernenie bolesti sa pred chirurgickým zákrokom podal temgestic (0,03 mg/kg telesnej hmotnosti, subkutánne (SQ) ). Miechy sa poškodili (stlačili) 3,5 mm širokou modifikovanou pinzetou (Blight 1991, postup revidovaný Rathboneovým laboratóriom). Kliešte sa uzavreli počas 15 sekúnd na 1,4 mm, čo viedlo k úrovni poranenia ekvivalentnej výsledku na strednej úrovni Grunerovej stupnice (1996). Kompresné poranenie sa inak uskutočnilo podlá postupu opísaného Blightom (1991).

Zvieratá sa pozorovali s cieľom stanoviť ich bolestivé správanie, prítomnosť infekcií močového traktu alebo retenciu moču. Bolesť sa ošetrovala pomocou Tynenolu (0,8 mg/10 g telesnej hmotnosti, orálne).

Na prevenciu močovej infekcie sa orálne podávala Septra (trimetoprínsulfametoxazol; 4,5 ml v 300 ml vody) 1 deň pred a 5 dní po operácii, a potkany sa podrobovali manuálnej expresii močového mechúra. V prípade infekcie, t. j. ľubovoľnej infekcie močových ciest prejavujúcej sa zakaleným alebo krvavým močom sa dvakrát denne subkutánne (SQ) injekčné podával Baytril (enroflo35 xacín, 7 mg/kg telesnej hmotnosti).

Zmeny lokomotorického správania a segmentálnych reflexov sa hodnotili až do 5 týždňov po poranení. Zvieratá sa testovali v rámci úlohy chôdze v otvorenom priestore, umiestnenia zadnej končatiny a orientácie nohy. Zvieratá sa hodnotili v dňoch 2, 7, 14, 21, 28 a 35 po chirurgickom zákroku. 35 dní po chirurgickom zákroku už nedochádzalo takmer k žiadnemu ďalšiemu spontánnemu zotavovaniu. Preto sa v deň 35 zahájila liečba.

HP 184 sa rozpustil v sterilizovanej (autoklávovanéj) deionizovanej reverzne osmotickej vode okyslenej ladovou kyselinou octovou (0,1 ml kyseliny na 10 ml vody). 4-AP (Sigma, molekulová hmotnosť 94,12; Jankowska E. a kol., 1982; Gruner a kol. 1999) sa rozpustil vo fyziologickom roztoku (0,6 mg/kg telesnej hmotnosti) a podával sa prostredníctvom i. p. injekcie. Jednej skupine potkanov (vehikulová kontrola 1) sa orálne podávalo vehikulum. Testovanie správania sa uskutočňovalo bezprostredne pred užitím dávky a 3 hodiny potom. Potom sa potkany v deň 35 skarifikovali. Všetky ďalšie potkany užívajúce buď HP 184 orálne (0,3, 1 alebo 3 mg/kg telesnej hmotnosti v závislosti od skupiny) alebo 4-AP (0,6 mg/kg, i. p.) alebo vehikulum (vehikulová kontrola 2) jedenkrát denne v dňoch 35 až 42 po chirurgickom zákroku. V týchto dňoch sa testy správania uskutočňovali bezprostredne pred užitím dávky, 2 a 24 hodín potom. Potom sa potkany v deň 43 po poslednom testovaní správania perfundovali.

V dňoch 35 až 43 po chirurgickom zákroku sa zhotovili videozáznamy testovania správania použitím Hi-8.

Štatistické analýzy sa uskutočnili na počítači Mac Intosh použitím GB-Stat ppc 6.5.2. Skóre správania sa analyzovalo Kruskal-Wallisovou neparametrickou analýzou rozptylu (ANOVA). Porovnanie post hoc sa uskutočnilo pomocou Mann-Whitneyovho U testu.

Prehľad zotavovania lokomotorickej schopnosti v otvorenom priestore sa hodnotil pomocou stredných skóre OFT pre každú sku36 pinu, čo ukazujú obr. 6a a 6b. Tieto výsledky ukazujú, že výkon zvierat ošetrovaných HP 184 alebo 4-AP bol významne odlišný od výkonu kontrolných zvierat užívajúcich vehikulum. ANOVA pre opakované merania ukazuje účinok liečby (p < 0,01) v dňoch 35 až 42 .

Výsledky ukazujú že tak 4-AP, ako aj HP 184 sa vyznačujú prospešnými účinkami, že zlepšujú testovanie správania po strednom chronickom stláčaní miechy. Hoci prospešnými účinkami sa vyznačujú všetky tri koncentrácie HP 184, dávka 3 mg/kg HP 184 sa vyznačovala najlepším zotavením lokomotorickej funkcie, čím sa potvrdili predtým pozorované účinky HP 184 v tejto dávke. Tieto výsledky takisto ukazujú, že najnižšia (0,3 mg/kg) koncentrácia HP 184 nemôže byť v rámci tohto pokusu najnižšou účinnou dávkou HP 184.

Histologické štúdie miechy

Uskutočnila sa štúdia s cielom zistiť, či liečenie pomocou HP 184 ovplyvňuje množstvo myelínu v prípade potkanov so stredným dlhodobým poranením miechy zo stlačenia, ak sa podáva dlho po poranení miechy.

Pri tejto štúdii sa použili miechy potkanov, ktoré sa už opísali v hodnotení.

V pooperačný deň 21 sa pokusní jedinci hlboko anestetizovali pentobarbitalom sodným (50 až 60 mg/kg telesnej hmotnosti, i. p.) a transkardiálne sa perfundovali, najskôr 100 ml 0,05 M fosfátom pufrovanej soľanky (PBS) obsahujúcej 0,1 % heparínu, a následne 300 áž 500 ml 4 % paraformaldehydu (PFA) . Odobrali sa segmenty miechy T9 až Ll, potom sa ochránili pred mrazom v 30 % roztoku sacharózy a zmrazili sa pri teplote -70 °C v 10,24 % polyvinylalkohole a 4,26 % polyetylénglykole.

Segment z každej miechy zahŕňajúci miesto lézie + 10 mm rostrálne a kaudálne sa vložil do média Tissue Tek. Na kryostate sa pozdĺžne v 20 μπι intervaloch narezali sériové rezy. Každý tretí rez sa vyfarbil farbivom Luxol Fast Blue na myelín. Hodnotenie sa uskutočnilo na kódovanom sklíčku slepými pozorovateľmi, ak ide o terapiu. Rezy sa skúmali pod svetelným mikroskopom z hľadiska rozsahu demyelinizácie (oblasť bez sfarbenia farbivom Luxol Fast Blue).

S cieľom stanoviť maximálne demyelinizované oblasti miechy sa celé rezy digitalizovali na fotografiách použitím mikroskopu Zeiss. Rozsah demyelinizácie sa meral v centre lézie pomocou počítačového programu pre obrazovú analýzu Bioquant BQ-TCW98, a to pracovníkom, ktorý bol slepý z hľadiska liečenej skupiny.

Štatistická analýza sa uskutočnila na počítači Mac Intosh použitím GB-Stat ppc 6.5.2. Histologické výsledky sa analyzovali Kruskal-Wailisovou neparametrickou analýzou rozptylu (ANOVA). Porovnanie post hoc sa uskutočnilo pomocou Mann-Whitneyovho U testu.

Rozsah demyelinizácie v prípade 6 experimentálnych skupín (0,3, 1 alebo 3 mg/kg telesnej hmotnosti v závislosti od skupiny alebo 4-AP 0,6 mg/kg alebo vehikuiová kontrola 1 a 2) ukazuje obr. 7. Jednotky predstavujú počet pixelov demyelinizovanej plochy v centre stlačenia (**P < 0,001, *P < 0,05, Kruskal-Wallisova neparametrická analýza rozptylu (ANOVA)). Kvantitatívne výsledky ukazujú, že miechy zo zvierat liečených HP 184 a 4-AP sa vyznačujú významne vyššou myelinizovanou plochou než miechy soľankových kontrol. To znamená, že miechy zo zvierat, ktorým sa podávali injekcie vehikula, sa vyznačovali významne vyššou plochou demyelinizácie než miechy zvierat liečených buď HP 184 alebo 4-AP.

Histologická analýza ukázala, že tak HP 184 (všetky tri koncentrácie), ako aj 4-AP sa vyznačujú prospešnými účinkami na myelinizáciu, čo bolo v súlade s výsledkami testovania správania. Z týchto skupín sa vyznačovali najmenšou demyelinizáciou zvieratá liečené 3 mg/kg HP 184. Preto sa 4-AP alebo HP 184 zdá byť schopný zvyšovať remyelinizáciu v stave dlho po poranení miechy. Je nepravdepodobné, že by údaje jednoducho predstavovali zníženie rýchlosti úbytku myelínu, pretože sa nepozoroval rozdiel v rozsahu demyelinizácie v prípade dvoch kontrolných skupín, t. j. kontroly 1 a kontroly 2, hodnotených na začiatku a na konci pokusu.

Príklad 7

Účinok intravenózne podávaného HP 184 na iritáciu močového mechúra v prípade potkana

Tento pokus ukazuje účinok intravenózne podávaného HP 184 v KC1 modeli navrhnutom Fraserom a kol. (2001) . Fraser a kol. kombinovali liečbu protamínsulfátom s cieľom poškodiť funkciu bariéry urotelových buniek dáždnikového typu, fyziologickej močovej koncentrácie KC1 (500 mmol). Účinky HP 184 sa porovnávali so samotným vehikulom (n = 4/skupina) v rámci štúdie kumulatívnej dávkovej odpovede v prípade uretánom anestetizovaných potkanov s akútnou iritáciou močového mechúra. Na stanovenie účinku liečiva na iritáciu mechúra sa použila kontinuálna otvorená cystometria, pri ktorej sa meria plnenie a vyprázdňovanie močového mechúra v priebehu kontinuálnej infúzie. Ak je močový mechúr íritovaný, sťahuje sa v priebehu rovnakej rýchlosti plnenia častejšie, a to kvôli senzitizácii C-vlákien aferentných nervov. Obr. 8 ukazuje zníženie frekvencie kontrakcií močového mechúra od hodnôt iritácie pred podaním v porovnaní s účinkami samotného vehikula. Analýza rozptylu opakovaných meraní ukázala, že zatial čo samotné vehikulum sa nevyznačuje žiadnymi účinkami, HP 184 významne zvyšuje frekvenciu kontrakcií močového mechúra v prípade iritovaných močových mechúrov, a to v závislosti od dávky (P = 0,0019).

Príklad 8

Účinok HP 184 na produkciu NO v prípade myší

Myšiam sa injekčné podalo 30 mg/kg HP 184 (i. p.) 30 minút pred LPS (3 mg/kg, i. p.). 5 hodín po injekcii LPS sa myši usmrtili a odobrala sa plazma. Nitrátové hladiny sa stanovovali pomocou Griessovej analýzy. Každá skupina bola zložená z 9 až 10 myší. Ako graficky ukazuje obr. 9, inhibuje HP 184 produkciu NO. Po jednocestnej ANOVA sa zistilo, že iba LPS terapia bola významne odlišná (p < 0,01) od ošetrenia vehikulom.

Príklad 9

HP 184 v modeli neuropatickej bolesti

S cielom vytvoriť chronické nervové poranenie sa dospelým samčím potkanom Sprague-Dawley uskutočnila unilaterálna konštrukcia L6 nervu. Po zotavení z chirurgického zákroku (3 až 7 dní po operácii) sa zvieratá testovali na prahové hodnoty odťahovania končatiny po mechanickom stimule aplikovanom na postihnutej končatine. Tento sa vyvolal aplikáciou kalibrovaných von Freyových mikrovlákien na plantárnu plochu každej zadnej končatiny. Do štúdie sa zaradili iba zvieratá s 50 % znížením prahových hodnôt odťahovania v prípade ligovanej končatiny, a tieto zvieratá sa pridelili do jednej zo 6 skupín: trom skupinám sa podávala jedna z troch dávok HP 184 (0,3, 3 a 20 mg/kg, p. o.), štvrtej skupine sa podávala jediná dávka inej zlúčeniny označovanej MDL (10 mg/kg, i. p.), piatej skupine sa podával gabapentín (90 mg/kg, s. c.) a šiestej skupine sa podávalo samotné vehikulum. Testovanie správania sa uskutočnilo 45 minút po aplikácii gabapentínu (90 mg/kg, s. c.) a 3 hodiny po HP 184, MDL a vehikule. Pre každé zviera sa vypočítalo rozdielové skóre medzi prahovými hodnotami odťahovania ligovanej a neligovanej končatiny, a tieto rozdiely sa podrobili ANOVA so skupinou ako hlavným faktorom. Výsledky ukazuje obr. 10. Graf ukazuje stredné hodnoty (± SEM) rozdielov prahových hodnôt odťahovania ľavej (ligovanej) mínus pravej (normálnej) končatiny, a to pred a po prvom podaní liečiva (akútna fáza štúdie). Štatistická analýza ukazuje v prípade HP 184 v dávke 20 mg/kg zmiernenie mechanickej hyperalgézie spôsobenej ligáciou L5 závislej od dávky a jasný zvrat hyperalgézie v prípade gabapentínu v dávke 90 mg/kg. Analýzy boli medzi/v rámci ANOVA opakovaných meraní. Potom nasledovalo porovnanie post hoc (LSD) s časom interakcie skupiny X s cieľom vykonať štúdie prahových hodnôt odťahovania pred oproti po podaní liečiva .

Skupina: F(5,43) = 8,18, p < 0,001

Čas: F(l,43) = 47,34, p < 0,001

Čas skupiny X: F(5,43) = 9,25, p < 0,001

V prípade zvierat ošetrených vehikulom sa pozoroval veľký rozdiel v prahových hladinách odťahovania na mechanický podnet medzi dvoma končatinami.

Odkazy

Agoston S., Bowman W. C., Houwertjes M. C., Rodger I. W._z Savage A. O., Direct action of 4-aminopyridine on the contractHity of a fast-contracting muscle in the cat, Clin. Exp. Pharm. Physiol. , 9, 21-34 (1982) .

Aisen M. L., Sevilla D., Gibson G., Kutt H., Blau A., Edelstein L., Hatch J., Blass J., 3,4-Diaminopyridine as a treatment for amyotropic lateral sclerosis, J. Neurol. Sci., 129, 21-24 (1995) .

Alnaes E., Rahaminoff R., On the role of mitochondria in transmitter release from motor nerve terminals, J. Physiol. (Lond.), 248, 285-306 (1975) .

Backhaup C., Karkoutly C., Welsch M., Krieglstein J., A mouse model of focal cerebral ischémia for screening neuroprotective drug effects, J. Pharmacological Meth., 27, 27-32 (1992).

Balí A. P., Hopkinson R. B., sed by Clostrídium botulinum J. Med., 48, 473-491 (1979).

Farrell I. D., Human botulism cautype E, the Birmingham outbreak Q,

Behrmann D. L., Bresnahan J. C., Beattie M. S., Shah B. R., Spínal cord injury produced by consistenr mechanical displacement of the cord in rats: behavioral and histoiogic analysis, J. Neurotrama, 9, 197-217 (1992) .

Bennett G. J., Xie Y. K., A peripheral mononeuropathy in rat produces disorders of pain sensation like those seen in man, Pain, 33, 87-107 (1998).

Bever C. T., Aminopyridines in handbook of multiple sclerosis,

S. D. Liek Ed., Marcel Dekker, 429-442 (1996).

Bever C. T., Jr. , Young D., Anderson P. A., Krumholz A., Conway

K., Leslie J., Eddington N., Plaisance K. I., Panitch H. S., Dhib-Jalbut S., The effects of 4-aminopyridine in multiple sclerosis patients: results of a randomized, placebo-ccntrolled, double-blind, concentration-controlled, crossover trial, Neurol., 44, 1054-1059 (1994) .

Blight A. R., De Crescito V., Morphometric analysis of experimental spínal cord injury in the cat: the relation cf injury intensity to survival of myelinated axons, Neuroscience, 19, 321-341 (1986).

Blight A. R., Morphology of chronic spínal card injury in the cat: analysis of myelinated axons by line-samping., Neuroscience, 10, 521-543 (1983).

Blight A. R., Morphometric analysis of a model of spínal cord injury in guinea pigs, with behavioral evidence of delayed secondary pathology, J. Neurol. Sci., 103, 155-171 (1991).

Bostock H., Sherratt R. M., Sears T. A., Overcoming conduction failure in demyelinated nerve fibres by prolonging action po42 tentials, Náture, 274, 385-387 (1978).

Bostock H., Sears T. A., Sherratt R. M., The effects of 4-aminopyridine and tetraetylammonium ions on normál and demyelinated mammalian nerve fibres, J. Physiol. (Lond.), 313, 301-315 (1981).

Bunge R. P., Puckett W. R., Bercerra J. L., Marcillo A., Quencer

R. M., Observations on the pathology of human spínal ccrd injury. A review and classif ication of 22 new cases with details from a čase of chronic cord compression with extensr~e focal demyelination, Advances in Neurology 59, Seil F. J. Ed. , Raven Press, New York, 75-89 (1993).

Davis F. A., Stefoski D., Rush J., Orally administered -4-aminopyridine improves clinical signs in multiple sclerosis, Ann. Neurol., 27, 186-192 (1990).

Duchen, M. R., Ca²⁺-dependent changes in the mitochondrial energetics in single dissociated mouse sensory neurons, Biochem. J., 283, 41-50 (1992) .

Eder C., Ion channels in microglia (brain macrophages , Am. J. Physiol., 275 (Celí. Physiol., 44), C327-C342 (1998).

Fraser M. O., Chuang Y., Lavelle J. P., Yoshimura N., de Groat W. C., Chancellor M. B., A reliable, nondestructive animal model for interstitial cystitis: intravesical low dose protamine sulfate combine with physiological concentrations of cccassium chloride, Urology, 57 (Suppl. 1), 112 (2001).

Gruner J. A., Yee A. K., 4-Aminopyridine enhances morcr evoked potentials following graded spínal cord compression irjury in rats, Brain Res., 816, 446-456 (1999).

Gruner J. A., Wade C. K., Menná G., Stokes B. T., Myoelectric evoked potentials versus locomotor recovery in chronic spínal cord injured rats, J. Neurotrauma, 10, 327-347 (1993).

Gruner J. A., Yee A. K., Blight A. R., Histological and functional evaluation of experimental spínal cord injury: evidence of a stepwise response to graded compression, Brain Res., 729, 90-101 (1996).

Gruner J. A., Yee A. K., 4-Aminopyridine enhances motor evoked potentials following graded spínal cord compression injury in rats, Brain Res., 816 (2), 446-456 (1999).

Hamilton M. G., Lundy P. M., Effect of ruthenium red on voltage-sensitive Ca²⁺ channels, JPET, 273, 940-947 (1995).

Hayes K. C., Blight A. R., Potter P. J., Allatt R. D., Hsieh J.

T., Wolfe D. L., Lam S., Hamilton J. T., Preclinical trial of

4-aminopyridine in patients with chronic spínal cord injury, Paraplegia, 31, 216-224 (1993).

Hayes K. C., Potter P. J., Wolfe D. L., Hsieh J. T., Delaney G. A., Blight A. R., 4-Aminopyridine-sensitive neurológie deficits in patients with spínal cord injury., J. Neurotrauma, 11, 433-446 (1994).

Hirsh J. K., Quandt F. N., Aminopyridine block of potassium channels in mouse neuroblastoma cells, J. Pharmacol. Exp. Ther., 267, 604-611 (1993) .

Hockfield S., Carolson S., Evans C. a kol., Selected methods for antibody and nueleie acid probes, Cold Sprint Harbour Laboratory Press, 125-130 (1993) .

Jankowska E., Lundberg A., Rudomin P., Sykova E., Effects of

4-aminopyridine on synaptic transmission in the cat spínal cord, Brain Res., 240, 117-129 (1982).

Jones R. E., Heron J. R., Foster D. H., Snelgar R. S., Mason R. J. , Effects of 4-aminopyridine in patients with multiple sclerosis, J. Neurol. Sci., 60, 353-362 (1993).

Kerasidis H., Wratall J. R., Gale K., Behavioral assessment of functional deficit in rats with contusive spínal cord injury, J. Neurosci. Methods, 20, 167-179 (1987).

Lowry M. A. R., Goldbert J. I., Belosevic M., Induction of nitric oxide (NO} synthesis in murine macrophages reguires potassium channel activity, Clin. Exp. Immunol., 111, 597-603 (1998).

Lundh H., Effects of 4-aminopyridine on neuromuscular transmission, Brain Res., 153, 307-318 (1978).

Lundh H., Thesleff S., The móde of action of 4-aminopyridine and guanidine on transmitter from motor nerve terminals, Eur. J. Pharmacol., 42, 411-412 (1978).

Lundh H., Nilsson 0., Rosen I., 4-Amínopyridine - a new drug tested in the treatment of Eaton-Lambert syndróme, J. Neurol. Neurosurg. Psychiat., 40, 1109-1112 (1977).

Lundh H., Leander S., Thesleff S., Antagonism of the paralysis produced by botulinum toxín in the rat, J. Neurol. Sci., 32, 29-43 (1977).

Kim S. H., Chung J. M., An experimental model for peripheral neuropathy produced by segmental spínal nerve ligation in the rat, Pain, 50, 355-363 (1992).

Madge D. J., Sodium channels: recent developments and terapeutic potential, Annual Reports in Medicinal Chemistry, 33, Bristol J. A. Ed. in chief, Academic Press, San Diego, 51-60 (1998).

Mc Evoy K. M., Windebank A. J., Daube J. R., Low P., 3,4-Diaminopyridine in the treatment of Lambent-Eaton myastenic syndróme, N. Engl. J. Med., 321, 1567-1571 (1989).

Mc Ilay L. M., Halley F., Souness J. E., Mc Kenna J., Benning

V., Birrell M., Burton B., Belvisi M., Collis A., Constan A.,

Foster M., Hele D., Jayyosi 2., Kelley M., Maslen C., Miller G.,

Ouldelhkim M. C., Page K., Phipps S., Pollock K., Porter B.,

Ratcliffe A. J., Redford E. J., Webber S., Slater B., Thybaud

V., Wilsher N., The discovery of RPR 200765A, a p38 MAP kinase inhibítor displaying a good oral anti-artritic efficacy, Bioorg. Med. Chem., 9, 537-554 (2001).

Meza-Ruiz G., Tapia R., [³H]-GABA release in synaptosomal fractions after intracranial administration of ruthenium red, Brain Res., 154, 163-166 (1978).

O'Neill M. J., Bat C. P., Dell C. P., Hicks C. A., Gilmore J., Ambler S. J., Ward M. A., Bleakman D., Effects of Ca²⁺ and Na⁺channel inhibitors in vitro and in global cerebral ischaemia in vivo, Eur. J. Pharmacol., 332 (2), 121-131 (1997); RIL 10 mg/kg reference.

Pendlebury S. T., Lee M. A., Blamire A. M., Styles P., Matthews

P. M., Correlating magnetic resonance imaging markers of axonal injury and demyelination in motor impairment secondary to stroke and multiple sclerosis, Magn. Reson. Imaging, 18, 369-378 (2000) .

Person R. J., Kuhn J. A., Depression of spontaneous and ionophore-induced transmitter release by ruthenium red at the neuromuscular junction, Brain Res. Bull, 4, 669-674 (1979).

Potter P. J., Hayes K. C., Hsieh J. T., Delaney G. A., Segal J.

L., Sustained improvements in neurological function in spínal cord injured patients treated with oral 4-aminopyridine: three cases, Spínal Cord, 36, 147-155 (1998a).

Potter P. J., Hayes K. C., Segal J. L., Hsieh J. T., Brunnemann

S. R., Delaney G. A., Tierney D. S., Mason D., Randomized double-blind crossover trial. of Fampridine-SR (sustained release

4-aminopyridine) in patients with incomplete spínal cord injury, J. Neurotrauma, 15, 837-849 (1998b).

Pyo H., Chung S., Jou I., Gwag B., Joe E. H., Expression and function of outward K⁺ channels induces by lipopolysaccharide in microglia, Mol. Cells, 7, 610-614 (1997).

Qiao J., Hayes K. C., Hsieh J. T., Potter P. J., Delaney G. A. , Effects of 4-aminopyridine on motor evoked potentials with spínal cord ínjury, J. Neurotrauma, 14, 135-149 (1997).

Rampe, D., Murawsky, M. K., Grau, J., Lewis, E. W., The antipsychotic agent sertindole is a high affinity antagonisr of the human cardiac potassium channel HERG, J. Pharmacol. Exp. Ther., 286, 788-793 (1998) .

Rataud J., Bebarnot F., Mary V., Pratt J., Stutzmann J. M., Comparative study of voltage-sensitive sodium channel blockers in focal ischaemia and electric convulsions in rodents, Neuro. Sci. Lett., 172, 19-23 (1994) .

Sakurai M., Kanazawa I., Positive symptoms in multiple sclerosis: their treatment with sodium channel blockers, lidocain and mexiletine, J. Neurol. Sci., 162, 162-168 (1999).

Saruhashi Y., Young W. , Effect of mianserin on locomotory function after toracic spínal cord hemisection in rats, Expl. Neurol. , 129, 207-216 (1994) .

Savage A. O., A comparison of the effects of 4-dimethylaminopyridine and 4-aminopyridine on isolated cardiac and skeletal muscle preparations, Árch. Internát. Pharmacodynam. Therapie, 273, 262-276 (1985).

Schwid S. R., Petrie M. D., Mc Dermott M. P., Tierney D. S., Mason D. H., Coodman A. D., Quantitative assessment of sustained release 4-aminopyridíne for symptomatic relief of multipule sclerosis, Neurology, 48, 817-821 (1997).

Segal J. L., Patak M. S., Hernandez J. P., Himber P. L., Brunnemann S. R., Charter R. S., Safety and efficacy of 4-aminopyrídine in humans with spínal cord injury: A long-term, controlled trial, Pharmacotherapy, 19, 713-723 (1999).

Seltzer Z., Dubner R., Shir Y., A novel behavioral model of neu47 ropatic pain disorders produced in rats by partial sciaric nerve injury, Pain, 43, 205-218 (1990) .

Sherratt R. M., Bostock H., Sears T. A., Effects of 4-aminopyridine on normál and demyelinated mammalian nerve fibres, Náture, 283, 570-572 (1984) .

Shi R., Blight A. R., Differential effects of low and high concentrations of 4-aminopyridine on axonal conduction in normál and injured spínal cord, Neurosci., 77, 553-562 (1997).

Smith, C. P., Woods A. T., Corbett R., Chesson S. M., Bores G.

M., Petko W. W. , Roehr J. E., Kongsamut S., Serotonergic activity of HP 184: Does spontaneous release háve a role?, Neurochemical Res., 21, 573-583 (1996).

Smith, C. P., Brougham L. R., Huger F. P., Davis, L., Klein J.

T., Effland R. C., HP 184 [N-(n-propyl)-N-(3-fluoro-4-pyridyl)-lŕí-3-metylindol-l-amine-hydrochloride] : In vitro spontaneous release of acetylcholine (ACh) and norepinephrine (NE), Drug Dev. Res., 30, 203-212 (1993).

Stefoski D., Davis E. A., Faut M., Schauf C. L., 4-Aminopyridine improves clinical signs in multiple sclerosis, Ann. Neurči., 21, 71-77 (1987).

Sweitzer S. M., Calburn R. W., Rutkowski M., De Leo J. A., Acute peripheral inflammation induces moderate glial activation and spínal IL-Ιβ expression that correlates with pain behavior in the rat, Brain Res., 829, 209-221 (1999).

Táng L., Kongsamut S., Frequency-dependent inhibition of neurotransmitter release by besipirdine and HP 184, Eur. J. Pharmacol., 300, 71-74 (1996).

Táng L., Huger F. P shock S., Effland R pyridine derivatives

Klein J. T. C. , Smith C A family of , Davis L., Martin

P., Kongsamut S., novel modulators of . , Shim4-Aminovoltage48

-dependent sodium channels, Drug Dev. Res., 44, 8-13 (1998).

Táng L., Smith, C. P., Kongsamut, S., Besipirdine inhibits effects of veratridine at the voltage dependent sodium channel, Br. J. Pharmacol., 116, 2468-2472 (1995).

Tapia R., Velasco I., Ruthenium red as a tool to study calcium channels, neuronal deat and the function of neural pathways, Neurochem. Int., 30, 137-147 (1997).

Tapia R., Meza-Ruiz G., Inhibition by ruthenium red of the calcium-dependent release of [³H]-GABA in synaptosomal fractions, BrainRes., 126, 160-166 (1977).

Tapia R., Meza-Ruiz G., Duran L., Drucker-Colin R. D., Convulsions or flaccid paralysis induced by ruthenium red depending on route of administration, Brain Res., 116, 101-109 (1976).

Tapia R., Stiges M., Effect of 4-aminopyridine on transmitter release in synaptosomes, Brain Res., 250, 291-299 (1982).

Tapia R., Antagonism of the ruthenium red-induced paralysis in mice by 4-aminopyridine, guanidine and lantanum., Neurosci. Lett., 35, 615-623 (1982).

Targ E. F., Kocsis J. D., 4-Aminopyrídine leads to rescoration of conduction in demyelinated rat sciatic nerve, Brain Res., 328, 358-361 (1985).

Targ E. F., Kocsis J. D., Action potential characteristics of demyelinated rat sciatic nerve following application of 4-aminopyridine, Brain Res., 363, 1-9 (1986).

van Diemen H. A., Polman C. H., van Dongen T. M., van Loenen A.

C., Nauta J. J., van Walbeek H. K., Koetsier J. C., The effect of 4-aminopyridine on clinical signs in multiple sclerosis: a randomized, placebo-controlled, double-blind, crossover study,

Ann Neurol., 32, 123-130 (1992).

van Diemen H. A., Polman C. H., van Dongen M. M., Nauta J. J., Strijers R. L., van Loenen A. G., Bertelsmann F. W. , Koetsier J. C., 4-Aminopyridine induces functional improvement in multiple sclerosis patients: a neurophysiological study, J. Neuroi. Sci., 116, 220-226 (1993).

Yamaguchi S.., Rogawski M. A., Effects of anticonvulsant drugs on 4-aminopyridine-induced seizures in mice, Epilepsy Res., 11, 9-16 (1992).

Patenty

Effland, R. C., Klein J. T., Davis K. L., Olsen G. E., N-(Pyridyl)-lŕí-indol-l-amines, US patent 4,970,218.

Hansebout R. R., Blight A. R., Use of 4-aminopyrdidine in the reduction of chronic pain and spasticity in a spínal cord injured patient, US patent 5,545,648.

Hansebout R. R., Blight A. R., The use of 4-aminopyridine in the treatment of a neurological condition, WO 94/14439.

Huger F. P., Kongsamut S., Smith C. P., Táng L., Use of unsubstituted and substituted N-(pyrol-l-yl)pyridinamines as anticonvulsant agents, US patent 5,776,955.

Kongsamut	S . , Smith C .	P. , Woods A.	T. ,	Use of N-(pyridyl)-
-1/ŕ-indol·	-1-amines for	the treatment	of	obsessive compulsive
disorder,	US patent 5,356,910.
Kongsamut	S . , Smith C.	P. , Woods A.	T.,	Use of N-(pyridyl)-
-l/ŕ-indol-	-1-amines for	the preparation	of	a medicament for the

treatment of obsessive compulsive disorders, US patent 5,356,910.

Masterson J. G., Myers M., Formulations and their use in the treatment of neurological diseases, US patent 5,370,879.

Masterson J. G., Myers M., Formulations and their use in the treatment of neurological diseases, US patent 5,580,580.

Masterson J. G., Myers M., Formulations and their use in the treatment of neurological diseases, US patent 5,540,938.

Wurtman R. J., Buyukysai R., Method and composition for treating neurological disorders, WO 89/09600.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použitie zlúčeniny všeobecného vzorca I (R)

N

N (I) v ktorom m znamená 0, 1 alebo 2;

n znamená 0, 1 alebo 2;

p znamená 0 alebo 1;

každý substituent R nezávisle znamená atóm vodíka, atóm halogénu, trifluórmetylovú skupinu, alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka, alkoxyskupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka, benzyloxyskupinu, hydroxyskupinu, nitroskupinu alebo aminoskupinu;

každý substituent R¹ nezávisle znamená atóm vodíka, alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka, alkenylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka, alkanoylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka, atóm halogénu, kyanoskupinu, -C(O)-alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka v alkylovej časti, skupinu -alkylén-CN obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka v alkylénovej časti, skupinu -alkyién-NR'R' obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka v alkylénovej časti, kde

R' a R'' nezávisle znamenajú atóm vodíka alebo alkylovú sku52 pinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka, skupinu -alkylén-OC(0)-alkyl obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka v alkylénovej časti a 1 až 6 atómov uhlíka v alkylovej časti alebo skupinu -CH(OH)R⁴, kde

R⁴ znamená atóm vodíka alebo alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka;

R² znamená atóm vodíka, alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka prípadne substituovanú atómom halogénu, hydroxyskupinou alebo benzyloxyskupinou, alkenylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka, alkinylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka, skupinu -C(O)O-alkyl obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka v alkylovej časti alebo skupinu -R'-NR'R'', kde

R⁵ znamená alkylénovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka, alkenylénovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka alebo alkinylénovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka,

R' a R'' každý nezávisle znamená atóm vodíka, alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka alebo alternatívne skupina -NR'R'' ako celok znamená 1-pyrolidinylovú skupinu; a

R³ znamená atóm vodíka, nitroskupinu, aminoskupinu, aróm halogénu, alkoxyskupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka, hydroxyskupinu alebo alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka, alebo jej farmaceutický prijatelné soli, na prípravu liečiva na liečenie demyelinizačných ochorení.
2.

Použitie pódia nároku 1, pri ktorom

R znamená atóm vodíka, atóm halogénu, trifluórmetylovú skupinu alebo alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka;

R¹ znamená atóm vodíka alebo alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka;

R² znamená atóm vodíka alebo alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka;

R³ znamená atóm vodíka, alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka alebo atóm halogénu; a p znamená 0.
3. Použitie podlá nároku 1, pri ktorom demyelinizačné ochorenie predstavuje skleróza multiplex.
4. Použitie podlá nároku 2, pri ktorom má zlúčenina nasledovný vzorec II
5. Použitie podía nároku 4, pri ktorom demyelinizačné ochorenie predstavuje skleróza multiplex.
6. Použitie zlúčeniny všeobecného vzorca I podlá náreku 1 na prípravu liečiva na liečenie demyelinizačných stavov.
7. Použitie podía nároku 6, pri ktorom

R znamená atóm vodíka, atóm halogénu, trifluórmetylovú skupinu alebo alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka;

R¹ znamená atóm vodíka alebo alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka;

R² znamená atóm vodíka alebo alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka;

R³ znamená atóm vodíka, alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka alebo atóm halogénu; a p znamená 0.
8. Použitie podľa nároku 6, pri ktorom demyelinízačný stav predstavuje poranenie miechy.
9. Použitie podľa nároku 6, pri ktorom demyelinizačný stav predstavuje traumatické poranenie mozgu.
10. Použitie podlá nároku 6, pri ktorom demyelinizačný stav predstavuje mŕtvica.
11. Použitie podlá nároku 7, pri ktorom má zlúčenina nasledovný vzorec II
12. Použitie podía nároku 11, pri ktorom demyelinizačný stav predstavuje poranenie miechy.
13. Použitie podlá nároku 11, pri ktorom demyelinizačný stav predstavuje traumatické poranenie mozgu.
14. Použitie podlá nároku 11, pri ktorom demyelinizačný stav predstavuje mŕtvica.
15. Použitie zlúčeniny všeobecného vzorca I podlá nároku 1 na prípravu prostriedku na použitie pri rehabilitácii po mŕtvici.
16. Použitie podľa nároku 14, pri ktorom

R znamená atóm vodíka, atóm halogénu, trifluórmetylovú skupinu alebo alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka;

R¹ znamená atóm vodíka alebo alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka;

R² znamená atóm vodíka alebo alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka;

R³ znamená atóm vodíka, alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka alebo atóm halogénu; a p znamená 0.
17. Použitie podlá nároku 16, pri ktorom má zlúčenina nasledovný vzorec II
18.

Použitie zlúčeniny všeobecného vzorca I podľa nároku 1 na prípravu prostriedku na blokovanie draslíkových kanálov.
19. Použitie podlá nároku 18, pri ktorom

R znamená atóm vodíka, atóm halogénu, trifluórmetylová skupinu alebo alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka;

R¹ znamená atóm vodíka alebo alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka;

R² znamená atóm vodíka alebo alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka;

R³ znamená atóm vodíka, alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 atómov uhlíka alebo atóm halogénu; a p znamená 0.
20. Použitie podlá nároku 19, pri ktorom má zlúčenina nasledovný vzorec II
21. Použitie podlá nároku 2, pri ktorom má zlúčenina nasledovný vzorec III
22. Použitie podlá nároku 7, pri ktorom má zlúčenina nasledovný vzorec III
23. Použitie podľa nároku 22, pri ktorom demyelinizačný stav predstavuje poranenie miechy.
24. Použitie podľa nároku 22, pri ktorom demyelinizačný stav predstavuje traumatické poranenie mozgu.
25. Použitie podľa nároku 22, pri ktorom demyelinizačný stav predstavuje mŕtvica.
26. Použitie zlúčeniny všeobecného vzorca I podlá nároku 1 na prípravu liečiva na liečenie neuropatickej bolesti.
27. Použitie podlá nároku 26, pri ktorom má zlúčenina nasledovný vzorec II (II) ·
28. Použitie zlúčeniny všeobecného vzorca I podlá nároku 1 na prípravu liečiva na liečenie iritácie močového mechúra.
29. Použitie podlá nároku 28, pri ktorom má zlúčenina nasledovný vzorec II (II) ·
30. Použitie zlúčeniny všeobecného vzorca I podlá nároku 1 na prípravu liečiva na liečenie nadmerne aktívneho močového mechúra .
31. Použitie podlá nároku 30, pri ktorom má zlúčenina nasledovný vzorec II
32. Použitie zlúčeniny všeobecného vzorca I podlá nároku 1 na prípravu liečiva na liečenie bolesti vyvolanej chemokínmi.
33. Použitie podlá nároku 32, pri ktorom má zlúčenina nasledovný vzorec II