CZ20004761A3

CZ20004761A3 - Inhibitory transkripčního faktoru NF- KB

Info

Publication number: CZ20004761A3
Application number: CZ20004761A
Authority: CZ
Inventors: James F. Callahan; Marie C. Chabot-Fletcher
Original assignee: Smithkline Beecham Corporation
Priority date: 1998-06-19
Filing date: 1999-06-18
Publication date: 2001-08-15
Also published as: AU4690099A; KR20010052991A; US20030092771A1; PL348969A1; BR9911152A; CO5021213A1; WO1999065449A8; US6492425B1; US20060035979A1; CN1311629A; ES2299251T3; TR200003781T2; HUP0102782A2; WO1999065449A3; DE69937997D1; ZA200007447B; JP2002518307A; EP1085848B1; NO20006451D0; EP1085848A4

Description

Inhibitory transkripčniho faktoru NF-xB

Oblast vynálezu

Tento vynález se obecně týká salicylanilidových inhibitorůtranskripčníhofaktoru NF-κΒ. Takové sloučeniny jsou obzvláště užitečné při léčbě nemocí, které zahrnují aktivaci NF-κΒ. Podrobněji, tyto sloučeniny inhibují IkB fosforylaci a následnou degradaci. Takové sloučeniny jsou užitečné při léčbě rozmanitých nemocí spojených s aktivací NF-κΒ, včetně zánětlivých poruch, zvláště revmatické artritidy, zánětlivého onemocnění střev a astmatu, kožních onemocnění včetně lupénky a atopické dermatitidy, onemocnění autoimunity, odmítnutí tkáně a orgánu, Alzheimerovy choroby, mrtvic, atherosklerózy, restenózy, rakoviny, včetně Hodgkinsovy nemoci a jistých virových infekcí, včetně AIDS, osteoartritidy, osteoporózy a ataxie telangiestasie.

Dosavadní stav techniky

Nedávné pokroky ve vědeckém chápání prostředníků zapojených v akutních a chronických zánětlivých onemocněních a rakovině, vedly k novým strategiím při hledání účinných léků. Tradiční přístupy zahrnují přímou cílenou intervenci, jako jsou použití specifických protilátek, receptorových antagonistů nebo enzymových inhibitorů. Nedávné průniky do vysvětlení regulačních mechanismů zapojených do přepisu a přenosu řady různých prostředníků, vedly k zvýšenému zájmu o léčebné přístupy řízené na úrovni genové transkripce.

NF-κΒ patří k rodině úzce příbuzných dimérních transkripčních faktorových komplexů skládajících se z různých kombinací Rel/NF-κΒ skupiny polypeptidů. Skupina se skládá, u • · savců, z 5 jednotlivých genových produktů, RelA (p65), NF-kB1 (p50/pl05), NF-KB2 (p49/pl00), c-Rel a RelB, z nichž všechny mohou tvořit hetero- nebo homodiméry. Tyto proteiny obsahují vysoce homologní 300 aminokyselinu Rel homologní doména, která obsahuje vazebné a dimerizační domény DNA. Na samém Czakončeni Rel homologní domény je jaderná translokačni sekvence důležitá při přenosu NF-κΒ z cytoplasmy do jádra. Navíc, p65 a cRel mají silné transaktivační domény na svých koncích s Czakončením.

Aktivita NF-κΒ je regulovaná jeho interakcí s příslušníky skupiny proteinových inhibitorů IkB. Tato interakce účinně blokuje sekvenci jaderné lokalizace v NF-κΒ proteinech, a tak zabraňuje migraci diméru do jádra. Existuje široká rozmanitost podnětů, jejichž prostřednictvím jsou aktivované NF-κΒ, což by pravděpodobně měly být způsoby mnohonásobné signální transdukce. Zahrnuty jsou bakteriální produkty (LPS), některé viry (HIV-1, HTLV-1), zánětlivé cytokiny (TNFa, IL-1) a životního prostředí se týkající stresy. Zřejmě obecná je však pro všechny stimuly fosforylace a následná degradace IkB. IkB je fosforylován na dvou N-zakončeních serinů nedávno idetifikovanými IkB kinázami (IKK-α a ΙΚΚ-β). Studie polohouřízené mutageneze naznačují, že tyto fosforylace jsou kritické pro následnou aktivaci NF-κΒ, poněvadž jednou fosforylovaný protein je oslabený pro degradaci přes ubikuitin-proteázomový způsob. Jsou-li aktivní komplexy NF-κΒ prosty IkB, jsou schopny se translokovat do jádra, kde se váží selektivním způsobem k upřednostňovaným specifickým zesilovacím sekvencím genů. V genech regulovaných NF-κΒ je zahrnuta řada cytokinů, molekul buněčné adheze a silných fázových proteinů.

Je dobře známo, že NF-κΒ hraje klíčovou úlohu při regulované expresi velkého počtu prozánětlivých mediátorů, • · • · včetně cytokinů jako jsou IL-6 a 11-8, molekuly buněčné adheze, jako jsou ICAM a VCAM a indukce schopné syntázy oxidu dusičného (iNOS). 0 takových mediátorech je známo, že hrají roli při tvorbě Leukocytů v místech zánětu a v případě iNOS mohou, při některých zánětlivých onemocněních a onemocnění autoimunity vést k destrukci orgánu.

Důležitost NF-κΒ při zánětlivých poruchách je dále posilována studiemi zánětů dýchacích cest, včetně astma, při kterých se prokázalo, že NF-κΒ je aktivován. Tato aktivace může podporovat zvýšenou tvorbu cytokinů a infiltraci leukocytů, charakteristických pro tyto poruchy. Navíc, o inhalovaných steroidech je známo, že snižují hypercitilivost dýchacích cest a potlačují zánětlivou odezvu astmatických dýchacích cest. Ve světle nedávných zjištění, s přihlédnutím ke glukokortikoidní inhibici NF-κΒ, se můžeme domnívat, že tyto účinky jsou zprostředkovány ihhibicí NF-κΒ.

Další důkaz úlohy NF-κΒ při zánětlivých poruchách pochází ze studie rheumatoidního synovia. Ačkoliv je NF-κΒ normálně přítomný jako neaktivní cytoplasmický komplex, nedávné imunohistochemické studie naznačily, že NF-κΒ je přítomný v jádře a tudíž aktivní, v buňkách obsahujících rheumatoidní synovium. Navíc se dále ukázalo, že NF-κΒ má být aktivovaný v lidských synoviálních buňkách jako reakce na stimulaci pomocí TNF-α. Taková distribuce může být podpůrným mechanismem pro zvýšenou tvorbu cytokinů a ikosanoidů charakteristickou pro tuto tkáň. Viz A. K. Roshak a kol., J. Biol. Chem., 271, 31496 až 31501 (1996).

NF-xB/Rel a IkB proteiny také pravděpodobně hrají klíčovou úlohu při neoplastické transformaci. Členové skupiny jsou spojeni s buněčnou transformací in vitro a in vivo jako • · výsledkem nadměrné exprese, genové amplifikace, genového znovuuspořádáni nebo translokace. Navíc, znovuuspořádání a/nebo amplifikace genů kódujících tyto proteiny se vyskytují u 20 až 25 % určitých lidských lymfoidních nádorů. Navíc, byla zjištěna úloha NF-κΒ při regulaci apoptózy, což posiluje úlohu tohoto transkripčního faktoru při kontrole proliferace buněk.

Několik NF-κΒ inhibitorů je popsáno v C. Wahl a kol., J. Clin. Invest., 101 (5), 1163 až 1174 (1998), R. W. Sullivan a kol., J. Med. Chem. , 41, 413 až 419 (1998), J. W. Pierce a kol., J. Biol. Chem., 272, 21096 až 21103 (1997).

O mořském přírodním produktu hymenialdisinu je známo, že inhibuje NF-κΒ. A. Roshak a kol., JPET, 283, 955 až 961 (1997), J. J. Brenton a M. C. Chabot-Fletcher, JPET, 282, 459 až 466 (1997) .

Salicylanilidy jsou známé sloučeniny. Obecné řešení přípravy salicylanilidů je popsáno Μ. T. Clarkem, R. A. Coburnem, R. T. Evansem, R. J. Genco-em, J. Med. Chem., 29, 25 až 29 (1986).

Původci nyní nalezli nový způsob inhibice aktivace transkripčního faktoru NF-κΒ používající salicylanilidy.

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout způsob léčby nemocí, které mohou být terapeuticky modifikovány změnou aktivity transkripčního faktoru NF-kB.

• · • · · •···· · ··

Pc>dle toho v prvém aspektu kompozici obsahující farmaceutickou

I.

Ještě v dalším aspektu tento při kterých může tento vynález poskytuje sloučeninu obecného léčby nemocí, terapeuticky modifikována inhibicí NF-kB.

vynález poskytuje být pathologie vzorce způsob nemoci

Při detailním pohledu, tento vynález poskytuje řady nemocí spojených s aktivací NF-kB, zvláště rheumatoidní artritidy, zánětlivého včetně psoriázy a atopické odmítnutí tkáně a orgánu, aterosklerózy, restenózy, infekcí, léčby zánětlivých poruch, onemocnění střev a astma, dermatózy dermatitidy, onemocnění autoimunity, Alzheimerovy choroby, mrtvice, rakoviny, včetně Hodgkinsovy nemoci a jistých virových včetně AIDS, osteoartritidy, osteoporózy a telangiestasie.

Podrobný popis vynálezu

Předkládaný vynález spojených s aktivací NF-kB, přesněji savci, nejpřesněji sloučeniny obecného vzorce I:

poskytuje způsob léčby zahrnující podávání člověku, pokud to

ve kterém:

R_a substituje kruh skupiny sestávající trifluormethylu, O-Ci-6 alkylu a až se způsoby včetně ataxie nemocí zvířeti, potřebuj e, (I)

3-krát a je nezávisle vybrán ze

NO2, halogenu, Ci-g alkylu,

S-C1-6 alkylu, a • · ····

Rb substituje kruh B O až 3 krát a je nezávisle vybrán ze skupiny setávajici se z halogenu, C (O) Ci-6 alkylu, Ci-β alkylu, 0Ci-6 alkylu, S-Ci-6 alkylu, CH2-arylu a arylu, a jejich farmaceuticky přijatelných soli, hydrátů a solvátů.

Předkládaný vynález dále poskytuje výhodný způsob léčby nemocí spojených s aktivací NF-κΒ, zahrnující podávání zvířeti, přesněji savci, nejpřesněji člověku, pokud to potřebuje, sloučeniny obecného vzorce II:

ve kterém R_A z obecného vzorce I se vyskytuje jednou a je Ri a Rb z obecného vzorce I se vyskytuje dvakrát a je nezávisle R2 a R3. Podrobněj i:

Ri je vybrán ze skupiny, skládající se z Η, N0₂, CF₃, F,

Cl, Br a J,

R2 je vybrán ze skupiny sestávající se z H a F, a

R3 je vybrán ze skupiny sestávající se z F, Cl, Br, J, fenylu a C (O) C1-6 alkylu, přednostně C1-6 alkyl je CH3, a jejich farmaceuticky přijatelných solí, hydrátů a solvátů.

Sloučeniny obecného vzorce II vybrané z následující skupiny jsou nejvíce upřednostňované pro použití při způsobech z předkládaného vynálezu:

N-(4-fenylfenyl)-2-hydroxy-5-trifluormethylkarboxamid,

N-(2,4-difluorfenyl)-2-hydroxy-5-nitrokarboxamid,

N- (2,4-difluorfenyl)-2-hydroxy-5-jodkarboxamid a

N-(4-acetylfenyl)-2-hydroxy-5-jodkarboxamid.

·· ····

Definice

Předkládaný vynález zahrnuje všechny hydráty, solváty, komplexy a prekurzory léčiva sloučenin podle tohoto vynálezu. Prekurzory léčiva jsou jakékoliv kovalentně vázané sloučeniny, které in vivo uvolňuji aktivní základní léčivo obecných vzorců I a II. Pokud je ve sloučenině z předkládaného vynálezu přítomno chirální centrum nebo jiná forma isomerního centra, jsou všechny formy takového isomeru nebo isomerů, včetně enantiomerů a diastereomerů, pokládány za zde zahrnuté. Vynalezené sloučeniny obsahující chirální centrum se mohou použít jako racemická směs, enantiomerně obohacená směs nebo se může racemická směs rozdělit při využití dobře známých technik a jednotlivé enantiomery se mohou použít samostatně. V případech, při kterých mají sloučeniny nenasycené dvojné vazby uhlík-uhlík, jak cis (Z) tak trans (E) isomery, jsou zahrnuty do rozsahu tohoto vynálezu. V případech, ve kterých mohou sloučeniny existovat v tautomerních formách, jako jsou keto-enolové tautomery, je každá tautmerní forma posuzována jako by byla zahrnuta do tohoto vynálezu, bez ohledu na to, zda existuje v rovnováze nebo převážně v jedné formě.

Význam jakéhokoliv substituentu, při jakémkoliv jiném výskytu v obecném vzorci I nebo jakémkoliv jeho dílčím vzorci, je nezávislý na tomto významu nebo významu jakéhokoliv jiného substituentu, při jakémkoliv jiném výskytu, pokud není jinak uvedeno.

Výraz Ci-6 alkyl jak je používán zde, je míněn tak, aby zahrnoval substituovaný a nesubstituovaný methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl a terc.butyl, pentyl, n-pentyl, isopentyl, neopentyl a hexyl a jejich jednoduché alifatické isomery. Jakákoliv Ci-6 alkylová skupina může

• · • ·	• •	·· » ·	9999 •	99 9 9 9
• ·	• ·	•	9	• 9 ·	9 9
• 9	·*··	9 ·	9	•	9 9 9
• ·	•	• 9	9	• ·
··	•	9 9	9 99	• · ·

popřípadě být nezávisle substituována jedním nebo dvěma halogeny, SR', OR', N(R')₂, C(O)N(R')2 r karbamylem nebo Ci-₄ alkylem, kde R' je Ci-6 alkyl.

Halogen jak je použit zde, je míněn tak, aby zahrnoval F, Cl, Br a J.

Ar nebo aryl jak je použit zde, je míněn tak, aby zahrnoval fenyl nebo naftyl, popřípadě substituované jednou nebo vícekrát Ph-Co-6 alkylem, Het-Co-s alkylem, Ci-g alkoxylem, Ph-Co-6 alkoxylem, Het-Co-β alkoxylem, OH, (CH2) i-eNR⁴R⁵,

O(CH₂) i-₆NR⁴R⁵, C1-6 alkylem, OR, N(R)₂, SR, CF₃, NO₂, CN, CO₂R, CON(R”), F, Cl, Br nebo J kde R⁴ a R⁵ jsou H, C1-5 alkyl, Ph-Co-6 alkyl nebo naftyl-Co-6 alkyl a Rje fenyl, naftyl nebo C1-6 alkyl.

Způsoby přípravy

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu se mohou výhodně připravit způsoby vyloženými v níže uvedených schématech 1 a 2.

Obecné řešení přípravy salicylanilidů je popsáno v Μ. T. Clark, R. A. Coburn, R. T. Evans, R. J. Genco, J. Med. Chem., 29, 25 až 29 (1986) . Tyto sloučeniny mohou být také výhodně připraveny technikami využívajícími pevné fáze, včetně forem z knihovny.

Obecná příprava:

Obecné řešení přípravy je ukázáno na schématech 1 a 2. Salicylanilid se připraví kondenzací substituované salicylové kyseliny se substituovaným anilinem za přítomnosti chloridu foforitého v bezvodém chlorbenzenu (schéma 1). Salicylanilid se

• 4	•	• 4	444 4	• ·	4
e ♦	•	* «	•	4 9	• 4
• 4	• i	• 9	44·	9 9
• >		9 9 9	•	• 4 9	•
	•	9 4	•	• ·	•
• 4	•	• 4	99 ·	·«	• 9 4

může také připravit konverzí substituované salicylové kyseliny s thionylchloridem v toluenu s katalytickým DMF na její odpovídající chlorid. Výsledný chlorid kyseliny salicylové a substituovaný anilin se potom zahřívají v toluenu za vzniku salicylanilidu (schéma 2).

Schéma 1

Schéma 2

1. SOCI,, toluen, teplo

2. toluen,teplo

S odvoláním na způsoby přípravy sloučenin obecného vzorce I vysvětlené ve výše uvedených schématech 1 a 2, ocení pracovník znalý oboru, že předkládaný vynález zahrnuje všechny nové meziprodukty potřebné k přípravě sloučenin obecného vzorce I.

Výchozí materiály zde používané jsou obchodně dostupné nebo jsou připraveny běžnými metodami, dobře známými osobám běžně znalým oboru, a mohou být nalezeny v standardních referenčních publikacích, jako jsou the COMPENDIUM OF ORGANIC SYTHETIC METHODS, sv. I až VI (vydaným ve Wiley-Interscience).

Adiční soli sloučenin obecného vzorce I s kyselinou jsou připraveny z mateřské sloučeniny standardním způsobem ve vhodném rozpouštědle a v přebytku kyseliny, jako jsou chlorovodíková, bromovodíková fluorovodíková, sírová, fosforečná, octová, trifluoroctová, maleinová, jantarová nebo methansulfonová. Jisté sloučeniny tvoří vnitřní soli neboli obojetné ionty, které mohou být přijatelné. Kationtové soli jsou připravovány zpracováním mateřské sloučeniny s přebytkem alkalického činidla, jako jsou hydroxid, uhličitan nebo alkoxid, které obsahuje vhodný kationt nebo vhodným organickým aminem. Kationty jako jsou Li⁺, Na⁺, K⁺, Ca⁺⁺, Mg⁺⁺ a NHZ jsou zvláštními příklady kationtů přítomných ve farmaceuticky přijatelných solích. Halogenidy, sírany, fosforečnany, alkanoáty (jako jsou acetát a trifluoracetát), benzoáty a sulfonáty (jako je mesylát) jsou příklady aniontů přítomných ve farmaceuticky přijatelných solích.

Tento vynález poskytuje farmaceutickou kompozici, která obsahuje sloučeninu obecného vzorce I a farmaceuticky přijatelný nosič, ředidlo nebo excipiens. Tudíž, sloučeniny obecného vzorce I se mohou použít při výrobě léku. Farmaceutické kompozice sloučenin obecného vzorce I, připravené jak je zde dříve popsáno, se mohou utvářet jako roztoky nebo lyofilizované prášky pro parentální podávání. Prášky mohou být rekonstituovány, před použitím, přidáním vhodného ředidla nebo jiného farmaceuticky přijatelného nosiče. Kapalné prostředky mohou být pufrované, isotonické, vodné roztoky. Příklady vhodných ředidel jsou normální isotonické fyziologické roztoky, standardní 5% dextróza ve vodě nebo pufrovaný roztok octanu sodného nebo amonného. Takové prostředky jsou zvláště vhodné pro parentální podávání, ale mohou se také použít pro orální podávání nebo být obsaženy v odměřeně dávkujícím inhalátoru nebo nebulizéru pro insuflaci. Může být žádoucí přidat • · · · · 4· 4 • 4 · 4 4 4 4 44 • · · · · · 4 · · ·· • 44444*4 · 44»4 želatina, mannitol, do kapslí, pro ústní excipiens jako jsou polyvinylpyrrolidon, hydroxycelulóza, arabská guma, polyethylenglykol, chlorid nebo citrát sodný.

Alternativně, se mohou tyto sloučeniny plnit tabletovat nebo připravovat v emulzi nebo sirupu podáváni. K posílení nebo stabilizaci kompozice nebo k usnadnění přípravy kompozice se mohou přidat farmaceuticky přijatelné pevné nebo kapalné nosiče. Pevné nosiče zahrnují škrob, laktózu, dihydrát síranu vápenatého, bílou hlinku, stearat hořečnatý nebo kyselinu stearovou, mastek, pektin, arabskou gumu, agar nebo želatinu. Kapalné nosiče zahrnují sirup, podzemnicový olej, olivový olej, fyziologický roztok a vodu. Nosič také může obsahovat materiál nepřetržitě uvolňující účinnou látku jako jsou glycerylmonostearat nebo glyceryldistearat, samotný nebo v kombinaci s voskem. Množství pevného nosiče se liší, ale přednostně, má být mezi asi 20 mg a asi 1 g na dávkovou jednotku. Farmaceutické preparáty se připravují následujícími obvyklými farmaceutickými technikami včetně mletí, míchání, granulace a lisování, pokud je to potřeba, pro tabletové formy nebo mletím, mícháním a plněním pro formy tvrdých želatinových kapslí. Když se používá kapalný nosič, preparát bude mít formu sirupu, elixíru, emulze nebo vodné nebo nevodné suspenze. Takový kapalný prostředek se může podávat přímo perionálně nebo se může plnit do měkých želatinových kapslí.

Pro rektální podávání se sloučeniny podle tohoto vynálezu také mohou kombinovat s excipiens jako jsou kakaové máslo, glycerin, želatina nebo polyethylenglykoly a lít do formy čípků.

• ·

Způsoby z předkládaného vynálezu zahrnují lokální podávání sloučenin obecných vzorců I a II. Lokálním podáváním se myslí nesystémové podávání, včetně aplikace sloučeniny podle vynálezu externě na pokožku, do dutiny ústní a nakapání takové sloučeniny do ucha, oka a nosu, kde sloučenina nevstupuje významně do krevního toku. Systémovým podáváním se myslí ústní, nitrožilní, nitroperitonální nebo nitrosvalové podávání. Množství sloučeniny podle vynálezu (zde označované jako aktivní složka) potřebné pro terapeutický nebo profylaktický účinek při lokálním, podávání se bude, samozřejmě, lišit v závislosti na vybrané sloučenině, podstatě a závažnosti léčeného stavu a živočichovi, který prodělává léčbu a je neomezeně k dispozici lékaři.

I když je možné podávat aktivní složku samotnou jako surovou chemikálii, upřednostňuje se její podávání jako farmaceutického prostředku. Aktivní složka může obsahovat, pro lokální podávání, od 0,01 do 5,0 % hmotnostních prostředku.

Prostředek pro lokální podávání podle předkládaného vynálezu, jak pro použití jako lék veterinární, tak pro humánní medicínu, obsahuje aktivní složku společně s jejím jedním nebo několika přijatelnými nosiči a případně jakékoliv jiné terapeutické složky. Nosič musí být přijatelný v tom smyslu, že je slučitelný s ostatními složkami formulace a není škodlivý zdraví příjemce formulace.

Prostředky vhodné pro lokální podávání zahrnují kapalné nebo polokapalné preparáty vhodné k proniknutí přes pokožku do místa, kde je léčba požadovaná, tak jako linimenta, pleťové vody, krémy, masti nebo pasty a kapky vhodné pro podávání do oka, ucha nebo nosu.

• ·

Kapky podle tohoto vynálezu mohou obsahovat sterilní vodné nebo olejové roztoky nebo suspenze a mohou se připravit rozpuštěním aktivní složky ve vhodném vodném roztoku bakterieidního a/nebo fungicidního činidla a/nebo jakékoliv jiné vhodné konzervační látky a přednostně obsahují povrchově aktivní činidlo. Výsledný roztok se potom může vyčistit filtrací _t přemístit do vhodného zásobníku, který se potom vzduchotěsně uzavře a udržováním při teplotě sterilizuje se v autoklávu nebo až 100 °C po dobu půl hodiny.

Alternativně se roztok může sterilizovat filtrací a převést do kontejneru aseptickou technikou. Příklady baktericidních a fungicidních činidel vhodných pro přimíšení do kapek jsou fenylmerkurinitrát nebo -acetát (0,002 %), benzalkoniumchlorid (0,01%) a chlorhexidinacetát (0,01 %) . Vhodná rozpouštědla pro přípravu olejnatých roztoků zahrnují glycerol, ředěný alkohol a propylenglykol.

Pleťové vody podle předkládaného vynálezu zahrnují ty, které jsou vhodné pro aplikaci na kůži nebo do oka. Oční voda může obsahovat sterilní vodný roztok, popřípadě obsahující bakericid, a může se připravit způsoby podobným způsobům pro přípravu kapek. Pleťové vody nebo linimenta pro aplikaci na pokožku mohou také obsahovat činidlo urychlující sušení, aby se pokožka ochladila, jako jsou alkohol nebo aceton a/nebo zvlhčovadlo, jako je glycerol nebo olej, jako ricinový nebo arašídový olej.

Krémy, masti nebo pasty podle předkládaného vynálezu jsou polotuhé prostředky aktivní složky pro vnější použití. Mohou se připravit smícháním aktivní složky ve formě jemně rozmělněné nebo prášku, samotné nebo v roztoku nebo suspenzi ve vodné nebo nevodné tekutině, pomocí vhodného zařízení, s mastným nebo nemastným základem. Základ může obsahovat uhlovodíky jako jsou • · tvrdý, měkký nebo kapalný parafin, glycerol, včelí vosk, kovové mýdlo; rostlinný sliz; olej přírodního původu jako jsou mandlový, kukuřičný, arašídový, ricinový nebo olivový olej; lanolin nebo jeho deriváty nebo mastné kyseliny jako jsou stearová nebo olejová kyselina společně s alkoholem jako jsou propylenglykol nebo makrogoly. Prostředek může obsahovat jakékoliv vhodné povrchově aktivní činidlo, jako je aniontové, kationtové nebo neiontové povrchově aktivní činidlo jako jsou esthery sorbitanu nebo jejich polyoxyethylenové deriváty. Obsažena mohou být také suspenzní činidla jako jsou přírodní gumy, deriváty celulózy nebo organické materiály jako jsou silikáty křemičité a jiné složky jako je lanolin.

Užitečnost předkládaného vynálezu

Sloučeniny obecných vzorců I a II inhibitory NF-κΒ. Předkládaný vynález jsou užitečné jako poskytuje užitečné kompozice a formulace řečených sloučenin, včetně farmaceutických kompozic a formulací řečených sloučenin.

Předkládaný vynález také poskytuje způsoby léčby nemocí spojených s NF-κΒ aktivací, kteréžto způsoby zahrnují podávání živočichovi, přesněji savci, nejpřesněji člověku, který to potřebuje, sloučeniny obecných vzorců

I nebo II.

Předkládaný vynález zvláště poskytuje způsoby ošetřování zánětlivých poruch, zvláště revmatické artritidy, znánětlivého onemocnění střev a astma; dermatózy včetně lupénky a atopické dermatitidy;

onemocnění autoimunity; odmítnutí tkáně a orgánu; Alzheimerovy choroby; mrtvice; aterosklerózy; restenózy; rakoviny včetně Hodgkinsovy nemoci; a určitých virových infekcí, včetně AIDS; osteoatritidy; osteoporózy; a ataxie teleangiestázie.

• · · ♦ · • · « ··· · · · • » · · · · · «· · · • · · · » ·

Pro akutní léčbu se upřednostňuje parentální podávání sloučeniny obecného vzorce I nebo II. Nitrožilní infuze sloučeniny v 5% dextróze ve vodě nebo normálním fyziologickém roztoku nebo podobná formulace s vhodnými excipienty, je nejúčinnější, ačkoliv nitrosvalová injekční dávka je také užitečná. Obecně je parentální dávka, při způsobu, který má udržet koncentraci léku v plasmě na koncentraci účinné k zastavení aktivace NF-κΒ od asi 0,01 do asi 50 mg/kg; přednostně mezi 0,1 a 20 mg/kg. Sloučeniny jsou podávány 1 až 4-krát denně v množství potřebném k dosažení celkové denní dávky od asi 0,4 do asi 80 mg/kg za den. Přesné množství sloučeniny podle vynálezu, které je terapeuticky účinné a způsob kterým je nejlépe takovou sloučeninu podávat, je snadno určen osobou běžně znalou oboru, srovnáním hladiny činidla v krvi s potřebnou koncentrací, která má léčebný účinek.

Sloučeniny obecných vzorců I a II se mohou také pacientovi podávat orálně, takovým způsobem, že koncentrace účinné látky je dostatečná k inhibici NF-κΒ nebo k dosažení jakékoliv jiné léčebné indikace popsané zde. Obecně, farmaceutická kompozice obsahující sloučeninu je podávána v orálních dávkách mezi asi 0,1 a asi 50 mg/kg způsobem shodným se stavem pacienta. Přednostně by měla být orální dávka od asi 0,5 do asi 20 mg/kg.

Sloučeniny obecných vzorců I a II se mohou také podávat pacientovi lokálně, takovým způsobem, že koncentrace účinné látky je dostatečná k zastavení aktivace NF-κΒ nebo k dosažení jakékoliv jiné léčebné indikace popsané zde. Obecně se podává farmaceutická kompozice obsahující sloučeninu v lokální formulaci mezi asi 0,01 a asi 5 % hmotnost/hmotnost.

Když se podávají sloučeniny podle předkládaného vynálezu pacientovi v souladu s přítomným vynálezem, nejsou očekávány • · · ·« ···· ♦ · ··« * · · · · · • ··· · · · · · · · « ······« · · · · · žádné nepřijatelné toxické účinky.

Schopnost sloučenin zde popsaných zastavit aktivaci NF-xB je zřetelně prokázána jejich schopností zastavit NF-κΒ řízenou aktivitu reportérového genu (viz tabulka 1) . Užitečnost přítomnosti inhibitorů NF-κΒ při léčbě nemocí je založena na předpokladu důležitosti aktivace NF-xB u řady nemocí.

Tabulka 1

Inhibice NF-κΒ řízené aktivity reportérového genu

Sloučenina číslo	R’	R' '	X	ICso μΜ
1	I	H		8,14
2	I	H	F	~5
3	no₂	H		7,20
4	H	Ph		neaktivní

Tabulka 1 5	- pokračování Ph	H		neaktivní
6	Br	H	a -cl·	0, 82
7	cf₃	H	•	36,5
			O
8	cf₃	H	. ·Ό~Ο	3,35

NF-κΒ hraje klíčovou úlohu při regulované expresi velkého množství zánětlivých mediátorů včetně cytokinů jako jsou IL-6 a IL-8 (Mukaida a kol., 1990; Liberman a Baltimore, 1990; Matsusaka a kol., 1993), molekul buněčné adheze, jako jsou ICAM a VCAM (Marui a kol., 1993; Kawai a kol., 1995; Ledebur a Parks, 1995), a indukovatelné syntázy oxidu dusičného (iNOS) (Xie a kol., 1994; Adcock a kol., 1994). (Úplné citace odkazů jsou uvedeny na konci této části). 0 takových prostřednících je známo, že hrají úlohu při shromažďování leukocytů v místech zánětu a v případě iNOS, mohou při některých zánětlivých onemocněních a nemocí autoimunity vést k destrukci orgánu (McCartney-Francis a kol., 1993; Kleeman a kol., 1993). Důležité je, že sloučeniny zde popsané zastavují syntézu IL-8 a tvorbu oxidu dusičného, produktu činnosti iNOS (viz tabulka 2).

Tabulka 2

Protizánětlivé působení sloučeniny 3 v tabulce 1 <···

In vitro
TNF stimulovaná tvorba IL-8 v buňkách U937	IC50 = 3 μΜ
IL-1 indukovaná tvorba PGE2 v RSF	IC₅o = 3 μΜ
IL-1 stimulovaná tvorba oxidu dusičného	IC₅₀ = 5 μΜ

In vivo

Zánět ucha indukovaný forbolesterem
Otok ucha		EDso —	0,2 mg/ucho
Infiltrace	zánětlivých buněk	ED50 ⁼	0,2 mg/ucho

Důkaz důležité úlohy NF-κΒ při zánětlivých poruchách se získal při studiích astmatických pacientů. Bronchiální biopsie odebrané od středně atopického astmatika vykazují významné zvýšení počtu buněk, při vybarvení podslizniční tkáně pro aktivované NF-κΒ, celkových NF-κΒ a NF-κΒ regulovaných cytokinů jako jsou GM-CSF a TNFa ve srovnání s biopsiemi z normálních atopických kontrol (Wilson a kol., 1998). Dále navíc, je zvýšené procento cév vykazujících imunoreaktivitu na NF-xB stejně jako je imunoreaktivita na IL-8 v epiteliálních vzorcích bipsií (Wilson a kol., 1998). Jestliže by se předvídalo takové zastavení tvorby IL-8 přes inhibici NF-κΒ, jak bylo demonstrováno těmito sloučeninami, bylo by prospěšné při zánětu dýchacích cest.

·· 9

99 9 9

Nedávné studie předpokládaly, že NF-κΒ také může hrát kritickou roli při zánětlivém onemocnění střev (IBD). Aktivovaný NF-κΒ se vyskytuje v střevních biopsických vzorcích od pacientů s Crohnovou nemocí a vředovou kolitidou (Ardite a kol., 1998; Rogler a kol., 1998; Schreiber a kol., 1998). Aktivace je zřejmá u zanícené sliznice, ale ne u sliznice nezanícené (Ardite a kol., 1998; Rogler a kol., 1998) a je spojena se zvýšenou expresí IL-8 mRNA v těch samých místech (Ardite a kol., 1998). Navíc dále, léčba kortikosteroidy silně zpomaluje aktivaci střevních NF-κΒ a snižuje zánět kolonu (Ardite a kol·., 1998; Schreiber a kol., 1998). Opět by se dalo předpovědět, že inhibice tvorby IL-8 prostřednictvím inhibice NF-κΒ, jak byla ukázána těmito sloučeninami, by měla být přínosem při zánětlivém onemocnění střev.

Zvířecí model gastrointestinálního zánětu poskytuje další podporu pro NF-κΒ jako klíčového regulátoru zánětu kolonu. Zvýšená aktivita NF-κΒ je pozorována v makrofázích vnitřní membrány při kolitidě u myší, indukované 2,4,6-trinitrobenzensulfonovou kyselinou (TNBS) s p65 jako hlavní složkou aktivovaných komplexů (Neurath a kol., 1996; Neurath a Petterson, 1997). Jelikož je tomu tak, můžeme předpovědět, že malé molekuly inhibitorů NF-κΒ by mohly být užitečné při léčbě zánětlivého onemocnění střev.

Dalším důkazem úlohy NF-κΒ při zánětlivých poruchách pochází ze studií revmatického synovia. Ačkoliv je NF-kB normálně přítomný jako neaktivní cytoplasmický komplex, nedávné imunohistochemické studie naznačily, že NF-κΒ je přítomný v jádře a tudíž aktivní, v buňkách obsahujících lidské revmatické synovium (Handel a kol., 1995; Marok a kol., 1996; Sioud a kol., 1998) a ve zvířecích modelech nemoci (Tsao a kol., 1997). Vybarvení je spojeno s typem A synoviocytů a cévním endoteliem ·· ···· (Marok a kol., 1996). Dále navíc, podstatná aktivace NF-κΒ je 1996;

pozorována u

Miyazawa a pěstovaných synoviocytů (Roshak a kol., kol., 1998) a v kulturách synoviálních buněk stimulovaných pomocí IL-Ιβ nebo

TNFa (Roshak a kol.,

1996;

Fujisawa a

NF-κΒ může kol., 1996; Roshak a podtrhovat zvýšenou tvorbu leukocytů předpovědět, tím zpomalovat při revmatické

1997) . Tudíž, aktivace cytokinů a infiltraci charakteristickou pro zanícené synovium. Dá se že schopnost těchto sloučenin inhibovat NF-κΒ a tvorbu ikosanoidů těmito buňkami, zvyšuje přínos

Dále je uveden přehled literárních odkazů

Mukaida N., Mahe Y., Matsushima K., Cooperative interaction factor-κΒ and cis-regulatory enhancer binding of nuclear protein-like interleukinfactor gene

Chem., 265, 21128 až binding elements in activating the by pro-inflammatory cytokines,

21133 (1990).

J. Biol.

Liberman T. A., Baltimor D., Activation of interleukin-6 gene expression through NF-_kB transcription factor, Mol. Cell. Biol., 10, 2327 až 2334 (1990).

Matsusaka T., Fujikawa K., Nishio Y., Mukaida N., Matsushima K., Kishimoto T., Akira S., Transcription factors NF-IL6 a NF-_kB synergistically activate transcription of the inflammatory cytokines interleukin 6 and interleukin 8, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, _90, 10193 až 10197 (1993).

Marui N., Offerman Μ. K., Swerlick R., Kunsch C., Rosen C. A., Ahmad M., Alexander R. W., Medford R. M., Vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-l) gene transcription and expression are regulated through an antioxidant-sensitive mechanism in

4· ·· · · human vascular endothelilal cells, J. Clin. Invest., 92, 1866 až 1874 (1993) .

Kawai M., Nishikomori R., Jung E-Y., Tai G._r Yamanak C._fMayumi M., Heike T., Pyrrolidine dithiocarbamate inhibits intercellular adhesion molecule-1 biosynthesis induced by cytokines in human fibroblasts, J. Immunol., 154, 2333 až 2341 (1995).

Ledebur H. C., Parks T. P., Transcriptional regulation of intraceilular adhesion molecule-1 gene by inflammatory cytokines in human endothelial cells, J. Biol. Chem., 270, 933 až 943 (1995) .

Xie Q., Kashiwabara Y., Nathan C., Role of transcription factor NF-KB/Rel in induction of nitric oxide synthase,

J.

Biol. Chem., 269,

4705 až 4708 (1994).

Adcock I. M., Brown C. R., Kwon O., Barnes P. J., Oxidative stress induces NF-κΒ DNA binding and inducible NOS mRNA in human epithelial cells, Biochem. Biophys. Res. Commun., 199, 1518 až 1524 (1994) .

McCartney-Francis N., Allen J. B., Mizel D. E., Albina J. E., Xie Q., Nathan C. F., Wahl S. M., Suppression of arthritis by an inhibitor of nitric acid oxid synthase, J. Exp. Med., 178, 749 až 754 (1993) .

Kleemann R., Rothe H., Kolb-Bachofen V., Xie Q., Nathan C. Martin S., Kolb H., Transcription and translation of inducible nitric oxide synthase in the pancreas of prediabetic BB rats, FEBS Lett., 328, 9 až 12 (1993).

Wilson S. J., Wallin A., Sandstrom T., Howarth P. H., Holgate S. T., The expression of NF-kappa-B and associated adhesion molecules in mild asthmatics and normál controls, J. Allergy Clin. Immunol., 101, 616 (1998).

Ardite E., Panes J., Miranda M., Salaš A., Elizalde J. I., Sans M., Arce Y., Bordas J. M., Fernandez-Checa J. C., Pique J. M., Effects of steroid treatment on activation of nuclear factor kB in patients with inflammatory bowel disease, Br. J. Pharmacol., 124, 431 až 433 (1998).

Rogler G., Brand K., Vogl D., Page S., Hofmeister R., Andus T., Knuechel R., Bauerle P. A., Scholmerich J., Gross V., Nuclear factor kB is activated in macrophage and epithelial cells of inflammed intestinal mucosa, Gastroenterol, 115, 357 až 369 (1998) .

Schreiber S., Nikolaus S., Hampe J., Activation of nuclear factor kB in inflammatory bowel disease, Gut., 42, 477 až 484 (1998) .

Neurath M. F., Pettersson S., Meyer zum Buschenfelde K-H., Strober W., Local administration of antisense phosphorothioate oligonucleotides to the p65 subunit of NF-κΒ abrogates established experimental colitis in mice, Nátuře Med., 2_, 998 až 1004 (1996).

Neurath M. F., Pettersson S., Predominant role of NF-xB p65 in the pathogenesis of chronic intestinal inflammation, Immunobiol., 198, 91 až 98 (1997).

····

Handel M. L., McMorrow L. B., Gravallese E. M., Nuclear factor-κΒ in rheumatoid synovium; localization of p50 and p65, Arthritis Rheumatism, 38, 1762 až 1770 (1995).

Marok R., Winyard P. G., Coumbe A., Kus M. L., Gaffney K., Blades S., Mapp P. I., Morris C.J., Blake D. R., Kaltschmidt C., Bauerle P. A., Activation of the transcription factor nuclear factor-κΒ in human inflammed synovial tissue, Arthritis Rheumatism, 39, 583 až 591 (1996) .

Sioud M., Mellbye 0., Forre 0., Analysis of the NF-κΒ p65 subunit, Fas antigen, Fas ligand and Bcl-2-related proteins in the synovium of RA and polyarticular JRA., Clin. Exp. Rheumatol., 16, 125 až 134 (1998).

Tsao P. W., Suzuki T., Totsuka R., Murata T., Takagi T., Ohmachi Y., Fujimura H., Takata I., The effect of dexamethanose on the expression of activated NF-κΒ in adjuvant arthritis, Clin. Immunol. Immunopathol., 83, 173 až 178 (1997).

Roshak A. K., Jackson J. R., McGough K., Chabot-Fletcher M., Mochan E., Marshall L., Manipulation of distinct NFkB proteins alters interleukin-l£-induced human rheumatoid synovial fibroblast prostaglandin E2 formation, J. Biol. Chem., 271, 31496 až 31501 (1996).

Miyazawa K., Moři A., Yamamoto K., Okudaira H., Constitutive transcription of the human interleukin-6 gene by rheumatoid synovicytes; spontaneous activation of NF-κΒ and CBF1, Am. J. Pathol., 152, 793 až 803 (1998).

Fujisawa K., Aono H., Hasunuma T., Yamamoto K., Mita S.,

Nishiola K., Activation of transcription factor NF-κΒ in human

• ·	•		9999	9 9
• ·	•		• ·	9	9	9 ·
• ·	•	•	• ·	999	9	•
• ·	• · r »	• · 9	9	9 9	•
• ·			9 9	9	9	•
• ·		•	99	999		·· ·

synovial cells in response to tumor necrosis factor a, Arthritis Rheumatism, 39,197 až 203 (1996).

Roshak A. K., Jackson J. R., Chabot-Fletcher M., Marshall L., Inhibition of NFxB-mediated interleukin-ip-stimulated prostaglandin E2 formation by the marine natural product hymenialdisine, J. Pharmacol. Exp. Therapeut., 283, 955 až 961 (1997) .

Biologické zkoušky

Sloučeniny podle tohoto vynálezu se mohou testovat několika biologickými zkouškami, aby se určila koncentrace sloučeniny, která je potřeba, aby sloučenina měla daný farmakologický účinek.

Zkoušky aktivity NF-κΒ se provádějí za použití zkoušky transkripce buněčné luciferázy jak je popsána v Breton J. J. a Chabot-Fletcher M. C., JPET, 282, 459 až 466 (1997) . Stručně uvedeno, linie lidských histocytických lymfatických buněk U937 stále transferovány reportérovými transkripčními plasmidy NF-kB (viz níže), jsou pěstovány ve výše uvedeném prostředí s přídavkem 250 pg/ml Geneticinu (G418 sulfátu, Life Technologies, Grand Island, New York). Zkouška transkripce luciferázy se provádí v transferových klonech U937. Ty jsou dvakrát odstřeďovány při 300 x g po dobu 5 minut a znovu suspendovány v RPMI 1640 s 10% FBS na hustotu 1 x 10⁶ buněk/ml. Jednomilitrové podíly se přidají do jamek 24-jamkové plotny. Do příslušných jamek se přidá sloučenina nebo dimethylsulfoxidový (DMSO) nosič (1 μΐ) a plotny se inkubují při 37 °C, 5 % CO₂, po 30 minut. Přidá se stimulační činidlo (5 ng/ml TNFa, 100 ng/ml LPS nebo 0,1 μΜ PMA) a vzorky inkubované 5 hodin při 37 °C, 5 % CO₂, se převedou do s l,9ml polypropylenových zkumavek a

··	•		99	« ···	99	9
9	•	«		9 9	9	•	9	99
9	•	•	9	9	♦	999	0	9	9
•	9	999» 9	•	•	9	» ·	9	9
•	•		9	•	a	9	9	9	9
• ♦		9	··	999	9 9	99 9

odstředí se při 200 x g po 5 minut. Buněčné pelety se dvakrát promyjí v 1 ml PBS bez Ca²⁺ a Mg²⁺ a odstředí se jak je uvedeno výše. Výsledné buněčné pelety se lýzují v 1 x 50 μΐ lýzového pufru (Promega Corporation, Madison, WI), rozvíří se a inkubují se po 15 minut při teplotě místnosti. 20 μΐ podíl každého lyzátu se převede do neprůsvitné bílé plotny s 96 jamkami (Wallac lne., Gaithersburg, MD) a testuje se na produkci luciferázy v MicroLumat LB 96 P luminometru (EG&G Berthold, Bad Wilbad, Německo). Luminometr dávkuje do každé jamky 100 μΐ zkušebního činidla na luciferázu (Promega Corporation, Madison, WI) a zaznamenává po 20 sekund celkový světelný výkon. Světelný výkon se měří v poměrných světelných jednotkách (RLUs).

Aktivita NF-κΒ se také může měřit při zkoušce změny elektroforetické pohyblivosti (EMSA), aby se vyhodnotila přítomnost NF-κΒ proteinů v jádře. Buňky, které jsou předmětem zájmu, se kultivují na hustotu 1 x 10⁶/ml. Buňky se shromáždí odstředěním, promyjí se v PBS bez Ca²⁺ a Mg²⁺ a znovu se suspendují v PBS s Ca²⁺ a Mg²⁺ na 1 x 10⁷ buněk/ml. Aby se vyzkoušel účinek sloučeniny na aktivaci NF-κΒ, zpracovávají se buněčné suspenze s různými koncentracemi látek nebo vehikul (DMSO, 0,1 %) po 30 minut při 37 °C před stimulací pomocí TNFa (5,0 ng/ml) po dalších 15 minut. Buněčné a jaderné extrakty se připraví následovně. Stručně uvedeno, na konci inkubační doby se buňky (1 x 10⁷ buněk) dvakrát promyjí v PBS bez Ca²⁺ a Mg²⁺. Výsledné buněčné pelety se resuspendují v 20 μΐ pufru A (10 mM Hepes (pH 7,9), 10 mM KC1, 1,5 mM MgCl₂, 0,5 mM dithiotreitolu (DTT) a 0,1 % NP-40) a inkubují se na ledu 10 minut. Jádra se peletují mikroodstředěním při frekvenci otáček 3500 za minutu po 10 minut při 4 °C. Výsledná kapalina nad sedlinou se sebre jako buněčný extrakt a pelety jader se resuspendují v 15 μΐ pufru C (20 mM Hepes (pH 7,9), 0,42 M NaCl, 1,5 mM MgC12, 25 % glycerolu, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM DTT a 0,5 mM fenylmethylsulfonylfluoridu (PMSF)). Suspenze se mírně míchají po 20 minut při 4 °C, pak se mikroodstředí při frekvenci otáček 14 000 za minutu, po 10 minut při 4 °C. Sedlina nad kapalinou se sebere a zředí se na 60 μΐ pufrem D (20 mM Hepes (pH 7,9), 50 mM KC1, 20 % glycerolu, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM DTT a 0,5 mM PMSF). Do té doby než jsou analyzovány, se všechny vzorky skladují při -80 °C. Koncentrace proteinů v extraktu se stanoví podle Bradfordovy metody (Bradford, 1976) s BioRad činidly.

Účinek sloučenin na aktivaci transkripčniho faktoru se vyhodnotí zkouškou změny elektoforetické pohyblivosti (EMSA) používající jaderné extrakty ze zpracovaných buněk jak jsou popsány výše. Dvojpramenné s NF-κΒ souhlasné oligonukleotidy (5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3') jsou značeny T₄ polynukleotidovou kinázou a [g-³²P]ATP. Vazebná směs (25 μΐ) obsahuje 10 mM HepesNaOH (pH 7,9), 4 mM Tris-HCl (pH 7,9), 60 mM KC1, 1 mM EDTA, 1 mM dithiotreitolu, 10 % glycerolu, 0,3 mg/ml albuminu hovězího sera a 1 pg -póly (dl-dC) .póly (dl-dC) . Vazebné směsi (10 pg z jader extrahovaného proteinu) se inkubují po 20 minut při teplotě místnosti s 0,5 ng ³²P-značenými oligonukleotidy (50 000 až 100 000 cpm) za přítomnosti nebo nepřítomnosti neznačeného konkurenta, po čemž se směs nanese na 4% polyakrylamidový gel připravený v 1 x trisborát/EDTA a elektoforézuje se při 200 V po 2 hodiny. Následně po elektroforéze se gely vysuší a exponují se na film pro zjištění vazebné reakce.

Účinky sloučenin na fosforylaci IkB se mohou sledovat pomocí Western blot. Buněčné extrakty se vystaví natriumdodecylsulfát-polyakrylamid gelové elektroforéze (SDSPAGE) na 10% gelech (BioRad, Hercules, CA) a proteiny se převedou do nitrocelulózových blán (Hybond^im-ECL, Amersham Corp., Arlington Heights, IL) . Imunoblotové zkoušky se provádějí při použití polyklonové králičí protilátky nařízené proti ΙκΒα nebo ΙκΒβ následované s peroxidázou-konjugovanou oslí proti-králičí sekundární protilátkou (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) . Imunoreaktivní vazby se detekují za použití systému zkoušek pravděpodobnostní chemoluminiscence (ECL) (Amersham Corp._z Arlington Heights, IL).

Účinky na produkci ikosanů lidskými synoviálními fibroblasty (RSF) se vyhodnocují za použití primárních kultur lidských RSF. Tyto se získají enzymatickou digescí synovia získaného od dospělého reumatoidního pacienta. Buňky se pěstují v Earlově základním minimálním mediu (EMEM) obsahujícím 10 % hovězího fetálního séra (FBS), 100 jednotek/ml penicilinu a 100 pg/ml streptomycinu (GIBCO, Grand Island, NY), při 37 °C a 5 % CO2. Kultury se používají při průchodech 4 přes 9, aby se získal více homogenní typ populace fibroblastů I. Pro některé studie, se fibroblasty nanesou při 5 x 10⁴ buněk/ml v plotnách s 24 jamkami o 16mm průměru (Costar, Cambridge, MA) . Buňky se po určený čas vystaví optimální dávce IL-Ιβ (lng/ml; Roshak a kol., 1996a) (Genzyme, Cambridge, MA). 15 minut před přidáním IL-1 se k buněčným kulturám přidají látky v DMSO vehikulu (1 %) . Prostaglandiny úrovní E₂, v bezbuněčném prostředí shromážděné při ukončení periody kultivování, se přímo měří při použití soupravy enzymových imunozkoušek (EIA) zakoupené od Cayman Chemical Co. (Ann Arbor, MI) . S experimentálním mediem se provádí vzorkování nebo standardní rozředění.

Protizánětlivá aktivita in vivo se vyhodnocuje za použití modelu zánětu ucha u myší indukovaného forbolesterem. Forbolmyristat-acetát (PMA) (4 pg/20 μΐ acetonu) se aplikuje na vnitřní a vnější povrchy levého ucha samce kmene myší Balb/c (6 ve skupině) (Charles River Breeding Laboratories, Willmington, MA) . O 4 hodiny později se sloučenina rozpuštěná v 25 μΐ acetonu aplikuje do toho samého ucha. Síla obou uší se měří číselníkovým mikrometrem (Mitutoyo, Japonsko) po 20 hodinách a aplikuje se lokálně druhá dávka sloučeniny. 24 hodin později, se uskuteční měření tlouštky a údaje se vyjádří jako změna tloušťky (x 10³ cm) ošetřeným a neošetřeným uchem. Zanícené levé uši se potom odpreparují a skladují se při -70 °C, do doby než se testuji na aktivitu myeloperoxidázy (MPO), měření infiltrace zánětlivých buněk.

Infiltrace zánětlivých buněk se vyhodnotí prostřednictvím měření aktivity myeloperoxidázy, přítomné v tkáni zaníceného ucha. Částečně rozmražené ušní tkáně se rozemelou a potom homogenizují (10 % hmotnost/objem) tkáňovým homogenizátorem Tissumizer (Tekmar Co., Cincinnati, OH) v 50 mM fosforečného tlumiče (pH 6), obsahujícího 0,5 % HTAB. Tkáňové homogenáty potom prodělají 3 cykly zmrazení-rozmrazení, následované krátkým působením ultrazvuku (10 s) . MPO aktivita v homogenátech se stanoví následovně. Výskyt zbarveného produktu z reakce o-dianisidinu (0,167 mg/ml, Sigma Chemical, St. Louis, MO) a peroxidu vodíku (0, 0005 %) , závislé na MPO, se měří spektrofotometricky při 460 nm. Supernatantová aktivita MPO se kvantifikuje kineticky (změna v absorbanci měřená po 3 minuty, vzorkováno při 15s intervalech) při použití Beckmanova DU-7 spektrofotometru a soupravy pro kinetické analýzy (Beckman Instruments, lne., Sommerset, NJ) . Jedna jednotka aktivity MPO se definuje tak, že degraduje 1 mikromol peroxidu za minutu při 25 °C.

Účinky na zánětem zprostředkovaný rozpad chrupavky se měří při in vitro systému explantace chrupavky. V tomto modelu se inkubují explantáty hovězí kloubové chrupavky 4 dny/96 hodin s nebo bez rHuIL-1 alfa, aby se stimuloval rozpad chrupavky za přítomnosti nebo v nepřítomnosti testované sloučeniny. Ze zkoušek na přítomnost oxidu dusnatého se odstraní supernatant.

Oxid dusnatý se měří použitím Greissovy reakce a odečte se spektrofotometricky při 530 nm. Tato reakce měří dusitan (NO2) , který je stabilním konečným produktem oxidu dusnatého.

Obecné

Nukleární magnetická rezonance spektra se zaznamenává buď při 250, 300 nebo 400 MHz při použití spektrometru Bruker AM 250, Bruker ARX 300 nebo Bruker AC 400. CDCI3 je deuteriochloroform, DMSO-d6 je hexadeuteriodimethylsulfoxid a CD3OD je tetradeutériomethanol. Chemické posuny se uvádějí v dílech na milion (d) ve směru klesajícího pole od vnitřního standardu tetramethylsilanu. Zkratky pro NMR data jsou následující: s = singlet, d = dublet, t = triplet, q = kvartet, m = multiplet, dd = dublet dubletů, dt = dublet tripletů, app = zdánlivý, br = široký. J znamená NMR interakční konstantu měřenou v Hertzech. Kontinuální spektrum infračervených vln (IČ) se měří na infračerveném spektrometru Perkin-Elmer 638 a infračervená spektroskopie s Fourierovou transformací (FTIČ) se snímá na infračerveném spektrometru Nicolet Impact 400 D. IČ a FTIČ spektra se zanamenávají v propustném způsobu, a pozice pásu se uvádějí v převrácených vlnočtech (cm^-1) . Hmotové spektrum se získá buď na přístrojích VG 70 FE, PE Syx API III nebo VG ZAB HF, používajících bombardování rychlými atomy (FAB) nebo elektronsprejové (ES) ionizační techniky. Elementární analýzy se získají použitím elementárního analyzátoru PerkinElmer 240C. Teploty táni se získají na Thomas-Hooverově přístroji pro zjištění teploty tání a nejsou korigované. Všechny teploty se uvádějí ve stupních celsia.

Analtech Silica Gel GF a E. Měrek Silica Gel 60 F-254 tenkovrstvé desky se použily pro chromatografii na tenké vrstvě. Jak jiskrová, tak gravitační chromatografie se • · ··· · • · « ♦ 9 9

• · · · · ♦ · • · · · · prováděla na silikagelu E. Měrek Kieselgel 60 (o velikosti zrna 0,066 až 0,038 mm).

Kde je to uvedeno, byly určité materiály zakoupeny od Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin, TCI America, Portland, OR.

Příklady provedeni vynálezu

V následujících příkladech syntézy, je teplota ve stupních celsia (°C). Pokud není jinak uvedeno, jsou všechny počáteční materiály získány z obchodních zdrojů. Bez dalšího dopracování se věří, že osoba znalá oboru může při použití předchozích popisů využít předkládaný vynález v jeho nejplnějším rozsahu. Tyto příklady se uvádějí, aby vysvětlily tento vynález, ne, aby omezovaly jeho rozsah. Odkazy jsou učiněny na dále uvedené patentové nároky, jenž jsou vyhraženy pro původce.

Příklad 1

Příprava N-(4-acetylfenyl)-2-hydroxy-5-jodkarboxamidu

Na roztok kyseliny jodosalicylové (1,9 g, 7,4 mmol) a 4aminoacetofenonu (0,97 g, 7,4 mmol) v chlorbenzenu (40 ml) se působí PCI3 (0,323 ml, 3,7 mmol). Roztok se zahřívá pod refluxem v aragonové atmosféře. Po 2 hodinách se horký roztok zfiltruje a filtrát se ponechá odstát při teplotě místnosti. Po 18 hodinách se roztok zfiltruje a pevná látka se rekrystalizuje z MeOH, aby se získala sloučenina pojemnovaná v názvu (0,095 g, 5 % výtěžek): ^XH NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 2,5 až 2,6 (s, 3H) , 6,8 až 8,2 (m, 7H) 10,1 až 10,2 (s, 1H).

Přiklad 2 • ·«······ • · · · ·· • · · · · « · · · ·φ • ······· · · ·< φ

9 9 · · · *· ·· · ·· ···ο

Příprava Ν-(2,4-difluorfenyl)-2-hydroxy-5-nitrofenylkarboxamidu

Na roztok 5-nitrosalicylové kyseliny (1,4 g, 7,7 mmol) a 2,4-difluoranilin (0,8 ml, 7,7 mmol) v chlorbenzenu (40 ml) se působí PC1₃ (0,338 ml, 3,8 mmol). Roztok se zahřívá pod refluxem v aragonové atmosféře. Po 2 hodinách se horký roztok zfiltruje a filtrát se nechá stát při teplotě místnosti. Po 18 hodinách se roztok zfiltruje a pevná látka se rekrystalizuje z MeOH, aby se získala sloučenina uvedená v názvu (0,733 g, 35% výtěžek): NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 2,5 až 2,6 (s, 3H) , 7,1 až 8,9 (m, 6H) , 10,6 až 10,7 (s, 1H).

Příklad 3

Příprava N-(2,4-difluorfenyl)-2-hydroxy-5-jodfenylkarboxamidu

a) Chlorid 5-jodsalicylové kyseliny

5-Jodsalicylová kyselina (2,0 g, 7,58 mmol) v toluenu se zpracuje s SOCI2 (1,66 ml, 22,7 mmolu) a katalytickým DMF pod refluxem po 1 hodinu. Reakční směs se odpaří do sucha a chlorid kyseliny se bez čištění použije při dalším kroku.

b) (2,4-Difluorfenyl)-2-hydroxy-5-jodfenylkarboxamid

Sloučenina z příkladu 3 (a) (3,79 mmol) a '2,4-difluoranilin (380 μΐ, 3,79 mmol) se zahřívá pod refluxem po 24 hodin. Reakční směs se odpařili a odparek se promyje etherem a pevný zbytek se rekrystalizuje z MeOH, aby se získalo 159 mg N-(2,4-difluorfenyl)-2-hydroxy-5-jodfenylkarboxamidu. ES MS (M+H)’m/e 373,7.

«·· ······ · · • ♦ · *·· · « · • · · · · · · · * · · • «····*· · ··· ·

Výše uvedený popis a příklady plně popisují jak připravit a použít sloučeniny podle předkládaného vynálezu. Avšak, předkládaný vynález není omezen na jednotlivá ztělesnění zde výše popsaná, ale zahrnuje v rozsahu následujících nároků všechny jejich modifikace. Různé odkazy na časopisy, patenty a ostatní publikace, které jsou zde citované, zahrnují stav oboru a jsou zde zahrnuty formou odkazů, jako by byly plně vyloženy.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu obecného vzorce I:

ve kterém

R_a substituje kruh A 0 až 3-krát a je nezávisle vybrán ze souboru sestávajícího z NO2, halogenu, Ci-₆ alkylu, trifluormethylu, O-C1-6 alkylu a S-C1-6 alkylu, a

R_b substituje kruh B 0 až 3-krát a je nezávisle vybrán ze souboru setávajícího z halogenu, C (O) C1-6 alkylu, Ci-β alkylu, 0-C1-6 alkylu, S-Ci-e alkylu, CH₂~arylu a arylu, a její farmaceuticky přijatelné soli, hydráty a solváty.
2. Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyznačující se t í m, že:

R_a se vyskytuje jednou a je Ri, a

Rb se vyskytuje dvakrát a je nezávisle R₂ a R3.
3. Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyznačující se t í m, že obsahuje sloučeninu obecného vzorce II:

(II) ve kterém ♦ · · · · ·· · · · · • · · a · ♦ · ·v • · ♦ ♦ · · · · · *· • ······♦ · · · ·9

Ri je vybrán ze souboru skládajícího se z H, NO2, CF3, F, Cl,

Br a J,

R₂ je vybrán ze souboru sestávajícího se z H a F, a

R₃ je vybrán ze souboru sestávajícího se z F, Cl, Br, J, fenylu a C (0) Ci-g alkylu, a farmaceuticky přijatelný nosič, ředidlo nebo excipiens.
4. Farmaceutická kompozice podle nároku 3, vyznačující se tím, že C (O) Ci-β alkyl je 0(0)0¾.
5. Farmaceutická kompozice podle nároku 3, vy z n a č u jící se tím, že uvedená sloučenina je vybrána ze souboru skládajícího se z

N-(4-fenylfenyl)-2-hydroxy-5-trifluormethylkarboxamidu,

N-(2,4-difluorfenyl)-2-hydroxy-5-nitrokarboxamidu,

N-(2,4-difluorfenyl)-2-hydroxy-5-jodkarboxamidu a

N-(4-acetylfenyl)-2-hydroxy-5-j odkarboxamidu.
6. Způsob inhibice NF-κΒ, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání pacientovi, který to potřebuje,

účinného množství sloučeniny obecného vzorce I: ý· X3 (I) ve kterém R_a substituje kruh A 0 až 3-krát a je nezávisle vybrán ze souboru sestávajícího z NO2, halogenu, C1-6 alkylu, trifluormethylu, O-C1-6 alkylu a S-Cl-6 alkylu, a

·· · · • · · ♦ · ♦ ♦ ·· <

• · * ♦ ♦ · · · · ·· · * ··«·>·· · ·»· ·9 ··· ♦· · · · · ♦ · ♦ ·♦ ··· 99999

Rb substituje kruh B O až 3*-krát a je nezávisle vybrán ze souboru setávajíciho z halogenu, C (O) Ci-6 alkylu, Cj-e alkylu, O-Ci-6 alkylu, S-Ci-β alkylu, CH₂ - arylu a arylu, a jejich farmaceuticky přijatelných solí, hydrátů a solvátů.
7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že:

Ra se vyskytuje jednou a je Ri, a

Rb se vyskytuje dvakrát a je nezávisle R₂ a R3.
8. Způsob podle nároku 7, vyznačující tím, že zahrnuje podávání pacientovi, který to potřebuje, účinného množství sloučeniny obecného vzorce II:

ve kterém

Ri je vybrán ze souboru, skládajícího se z H, N0₂, CF₃, F,

Cl, Br a J,

R₂ je vybrán ze souboru sestávajícího z H a F, a

R₃ je vybrán ze souboru sestávajícího z F, Cl, Br, J, fenylu a C (0) C1-6 alkylu.
9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že sloučenina se vybere ze souboru skládajícího se z:

N-(4-fenylfenyl)-2-hydroxy-5-trifluormethylkarboxamidu,

N-(2,4-difluorfenyl)-2-hydroxy-5-nitrokarboxamidu,

N-(2,4-difluorfenyl)-2-hydroxy-5-jodkarboxamidu a

N-(4-acetylfenyl)-2-hydroxy-5-jodkarboxamidu.
10. Způsob léčby nemoci charakterizované nadměrnou aktivaci NF-κΒ, vyznačující se tím, že zahrnuje inhibici uvedené nadměrné aktivace podáváním pacientovi, který to potřebuje, účinného množství sloučeniny obecného vzorce I:

ve kterém

Ra substituje kruh A 0 až 3-krát a je nezávisle vybrán ze souboru sestávajícího z NO₂, halogenu, Ci-6 alkylu, trifluormethylu, O-Ci-6 alkylu a S-Ci-6 alkylu, a

Rb substituje kruh B 0 až 3-krát a je nezávisle vybrán ze souboru sestávajícího z halogenu, C (O) Ci-6 alkylu, Ci-6 alkylu, 0-Ci-6 alkylu, S-Ci-6 alkylu, CH₂-arylu a arylu, a jejích farmaceuticky přijatelných solí, hydrátů a solvátů.
11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že:

Ra se vyskytuje jednou a je Ri, a

Rb se vyskytuje dvakrát a je nezávisle R₂ a R₃.
12. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání pacientovi, který to potřebuje, účinného množství sloučeniny obecného vzorce II:

(II) ve kterém

Ri je vybrán ze souboru skládajícího se z H, NO₂, CF3, F, Cl,

Br a J,

R2 je vybrán ze souboru sestávajícího z H a F, a

R3 je vybrán ze souboru sestávajícího z F, Cl, Br, J, fenylu a C (O) C1-6 alkylu.
13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že uvedená sloučenina se vybere ze souboru skládajícího se z:

N-(4-fenylfenyl)-2-hydroxy-5-trifluormethylkarboxamidu,

N-(2,4-difluorfenyl)-2-hydroxy-5-nitrokarboxamidu,

N-(2,4-difluorfenyl)-2-hydroxy-5-jodkarboxamidu a

N-(4-acetylfenyl)-2-hydroxy-5-jodkarboxamidu.
14. Způsob podle nároků 10 až 13, vyznačující se tím, že uvedená nemoc je zánětlivá porucha.
15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že uvedená nemoc se vybere ze souboru skládajícího se z revmatické artritidy, zánětlivého onemocnění střev a astma.
16. Způsob podle nároků 10 až 13, vyznačující se tím, že uvedenou nemocí je dermatóza.
17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že uvedená nemoc se vybere ze souboru skládajícího se z lupénky a atopické dermatitidy.
18. Způsob podle nároků 10 až 13, vyznačující se tím, že uvedená nemoc se vybere ze souboru skládajícího se z • · ·· « · onemocněni autoimunity, odmítnuti tkáně a orgánu, Alzheimerovy choroby, mrtvice, aterosklerózy, restenózy, osteoartritidy, osteoporézy a ataxie teleangiestázie.
19. Způsob podle nároků 10 až 13, vyznačující se tím, že uvedenou nemocí je rakovina.
20. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že uvedenou rakovinou je Hodgkinsovou nemocí.
21. Způsob podle nároků 10 až 13, vyznačující se tím, že uvedenou nemocí je AIDS.

99 ···· (doplněná strana)
22. Použiti sloučeniny obecného vzorce I:

ve 'kterém R_a substituje kruh A 0 až 3-krát a je nezávisle vybrán ze souboru sestávajícího z no₂, halogenu, C1-6 alkylu,

trifluormethylu, O-Ci-₆ alkylu a S-Ci-6 alkylu, a

R_b substituje kruh B 0 až 3-krát a je nezávisle vybrán ze souboru setávajiciho z halogenu, C (0) C1-5 alkylu, Ci-g alkylu, 0-Ci_6 alkylu, S-Ci_6 alkylu, CH₂-arylu a arylu, a její farmaceuticky přijatelných solí, hydrátů a solvátů, pro výrobu léčiva pro inhibici nemoci charakterizované nadměrnou aktivací NF-kB.
23. Použití podle nároku 22, kde

R_a se vyskytuje jednou a je Ri, a

R_b se vyskytuje dvakrát a je nezávisle R₂ a R3.
24. Použití podle nároku 22, kde slouěeninou je sloučenina obecného vzorce II:

ve kterém • ··· · • · · · ·· • · (doplněná strana)

Ri je vybrán ze souboru skládajícího se z H, NO₂, CF₃, F, Cl, Br a J,

R₃ je vybrán ze souboru sestávajícího se z H a F, a

R₃ je vybrán ze souboru sestávajícího se z F, Cl, Br, J, fenylu a C (O) Ci-6 alkylu, a farmaceuticky přijatelného nosiče, ředidla nebo excipiens.
25. Použití podle nároku 24, kde C (O) Ci-6 alkyl je C(O)CH₃.
26. Použití podle nároku 24, kde uvedená sloučenina je vybrána ze souboru skládajícího se z

N-(4-fenylfenyl)-2-hydroxy-5-trifluormethylkarboxamidu,

N-(2,4-difluorfenyl)-2-hydroxy-5-nitrokarboxamidu,

N-(2,4-difluorfenyl)-2-hydroxy-5-jodkarboxamidu a

N-(4-acetylfenyl)-2-hydroxy-5~jodkarboxamidu.
27. Použití podle nároku 22 až 26, kde uvedená nemoc je zánětlivá porucha.
28. Použití podle nároku 27, kde uvedená nemoc se vybere ze souboru skládajícího se z revmatické artritidy, zánětlivého onemocnění střev a astma.
29. Použití podle nároků 22 až 26, kde uvedenou nemocí je dermatóza.
30. Použití podle nároku 29, kde uvedená nemoc se vybere ze souboru skládajícího se z lupénky a atopické dermatitidy.
31. Použití podle nároků 22 až 26, kde uvedená nemoc se vybere ze souboru skládajícího se z onemocnění autoimunity, odmítnutí (doplněná strana) tkáně a orgánu, Alzheimerovy restenózy, osteoartritidy, teleangiestázie.
32. Použití podle nároků 22

0· • 99 • « • 9 9 • • • • 9 9 9 999 • • 9999 9 · • 9 • • 9 • • 9 ·· 9 ·· 999

choroby, mrtvice, osteoporézy aterosklerózy, ataxie až

26, kde uvedenou nemocí je rakovina.
33. Použití podle nároku 32, kde uvedenou rakovinou je

Hodgkinsova nemoc.
34. Použití podle nároků 22 až 26, kde uvedenou nemocí