CS270410B2

CS270410B2 - Method of biologically active substance production with immunostimulating effect

Info

Publication number: CS270410B2
Application number: CS845921A
Authority: CS
Inventors: Yves-Marie Page; Christine Vanderhoven
Original assignee: Lipha
Priority date: 1983-08-17
Filing date: 1984-08-03
Publication date: 1990-06-13
Also published as: DK160807C; CS592184A2; EP0139551A3; PT79090B; ES8602415A1; FR2550707A1; IL72589A0; ES535213A0; DK393884D0; IL72589A; NZ209171A; EP0139551A2; ZA846151B; DK160807B; PT79090A; JPS6069022A; MA20203A1; HUT35013A; SU1487815A3; CA1229566A

Description

(57) Léčivo ovlivňující imunitní odpověd je tvořeno produkty lýze nebo frakcí produktů lýze bakterií rodu Escherichia, Streptococcus, Klebsiella, Staphylococcus nebo jiných pomocí bakteriofágů. Provede se prvé naočkování kultivační půdy inokulem bakterií jednoho z uvedeiých rodů, během fáze růstu se bakterie uvedeného rodu infikují četností 0,01 až 0,1 vnesením jejich příslušných fágů a sleduje se vývoj lýze až do stanoveného stupně, který činí 10 až 1 000 bakterií na ml. Pak se provede druhé naočkování kultivační půdy inokulem bakterií jednoho z uvedených rodů. Během fáze růstu bakterií druhého rodu se bakterie tohoto druhého rodu infikují četností infekce 0,01 až 0,1 vnesením jejich příslušných fágů. Sleduje se vývoj lýze těchto bakterií druhého rodu až do stanoveného stupně, který činí 10 až 1 000 bakterií na ml. Nakonec se odstraní nelyžované bakterie a odebere se filtrát lýze získaný od obou rodů bakterií.

CS 270 410 B2

Vynález se týká způsobu přípravy imunomodulačních léčiv biologického původu.

Je známo mnoho přípravků upravujících imunitní odpověň frakcemi nebo extrakty lyžovaných mirobiálních buněk. Lze citovat zejména produkty popsané ve francouzských patentech č. 2 374 042, 2 396 018 a 2 426 470.

Tyto lyzáty nebo extrakty se obvykle získávají fyzikálními, chemickými nebo méně často enzymatickými postupy. I když většina těchto přípravků má určitou imunomodulační aktivi tu projevující se u zvířat, je jejich therapeutická účinnost u člověka teprve předmětem řady prací (Immunopharmacologie clinique. Realités et Perspectives G. RENOUX. Pharmacologs et thérapeutique. R.P. 1982, 32, 41-42).

Bylo proto důležité nalézt léčiva, která by představovala jak pro humánní, tak pro veterinární medicínu zbraň použitelnou vždy, když se jedná o potřebu obnovit nebo zesílit imunitní obranu. <

Byl nalezen nový způsob přípravy využívající bakteriofágu. Bakteriofágu, který představuje výborný prostředek pro bakteriální lyži, bylo použito prd výrobu imunomodulačních přípravků s různými rody a druhy bakterií. Tato technika bakterielní lyže pomocí bakteriofágu není omezena pokud se týká rodu nebo druhu bakterií· Tento způsob umožnil získat léčiva vynikající svými schopnostmi upravit imunitní systém, připravená z jednoho nebo více druhů bakterií nebo ze směsi těchto druhů bakterií. Tato láčiva mají zejména schopnost navodit tvorbu interferonů.

Tato léčiva ovlivňující imunitní odpověcí, jejichž účinná látka je tvořena produkty lyže nebo frakcí lyže bakterií bakteriofágem podle vynálezu, obsahují jako účinnou látku produkty lyže nejméně dvou bakterií odpovídajícími bakteriofágy.

Z bakterií lze jmenovat například Escherichia coli, Streptococcus faecalis, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus. Zejména zajímavý je přípravek získaný s použitím bak terií rodů Klebsiella a Escherichia.

Získané léčivo lze kombinovat s přípravkem antibiotickým, jako jsou tetracykliny, antivirovým, jako jsou synthetické nukleosidy blokující synthesu virové kyseliny nukleové, antifungálním, jako je buklosamid, nebo antiparasitárním, jako je chlorochin. ,

Léčivo získané způsobem podle vynálezu lze též kombinovat s jinými farmaceutickými pro dukty a komposicemi, jako například prostředkem protinádorovým (cytostatika), prostředkem imunosupresivním (antilymfocytární imunoglobuliny), prostředkem potlačujícím mitosy, jako jsou deriváty kyseliny listové, nebo protizánětlivým, jako je indomethacin.

Léčivo připravené způsobem podle vynálezu lze aplikovat v různých formách lntradermál ně, subkutánně, sublinguálně, místně, perorálně, parenterálně nebo bronchiálně. Podle potřeby se léčivo smíchá s vhodným vehikulem a používá se ve formě vodného nebo alkoholického roztoku nebo supspenze v olejovém vehikulu, nebo ve formě lyofilizované nebo jako aerosol nebo mast.

Dávkování léčiva vyrobeného způsobem podle vynálezu se může měnit v širokých mezích podle složení léčiva, podle předepsané indikace, formy podávání a věku léčeného subjektu. Stanovení vhodných dávek při ovlivňování imunitní odpovědi je ponecháno к úvaze lékaři nebo veterináři, jak je to obvyklé.

Tak například může denní dávkování při léčení chronických nebo recidivujících infekcí dýchacích cest, při prevenci pooperačních komplikací nebo při profylaxi infekcí močových cest spočívat v dávkách od 1 do 50 ml, podle koncentrace imunomodulačního přípravku.

CS 270 410 B2

Léčivo vyrobené způsobem podle vynálezu je výborným způsobem tolerováno; jeho toxicito je nízká, jak ukazuje test OL^q, který nemohl být dokončen per os vzhledem к Žaludeční ka pacitě použitých pokusných zvířat (myši, krysy).

Léčiva získaná způsobem podle vynálezu jsou zejména indikována při léčení poruch imunitní odpovědi, při prevenci nebo léčení závažných infekcí bakteriálních, virových, fungál nich nebo parazitárních, jakož i v reumatologii a při zajizvování a ochraně ran.

Podstatou způsobu výroby biologicky aktivní látky s imunostimulačním účinkem, která je tvořena produkty lýze nebo frakcí produktů lýze bakterií rodu Escherichia, Streptococcus, Klebsiella, Staphylococcus nebo jiných pomocí bakteriofágů podle vynálezu je, že se provede prvé naočkování kultivační půdy inokulem bakterií jednoho ze shora uvedených rodů, během fáze růstu se bakterie uvedeného rodu infikují četností infekce 0,01 až 0,1 vnesením jejich příslušných fágů, sleduje se vývoj lýze až do stanoveného stupně, který Činí 10 až 1 000 bakterií na mililitr, pak se provede druhé naočkování kultivační půdy inokulem bakterií jednoho z uvedených druhů, během fáze růstu bakterií druhého rodu se bakterie tohoto druhého rodu infikují četností infekce 0,01 až 0,1 vnesením jejich příslušných fágů, sleduje se vývoj lýze těchto bakterií druhého rodu až do stanovení stupně, který Činí 10 až 1 000 bakterií na mililitr, nakonec se odstraní nelyžované bakterie a odebere se filtrát získaný od obou rodů bakterií. Odstranění nelyžovaných bakterií a bakteriálních zbytků se provede způsobem odborníkům známým, jako je filtrace, centrifugace atp. Způsob podle vynálezu lze s výhodou realizovat s postupným použitím bakterií rodu Klebsiella a Escherichia.

Oále jsou uvedeny příklady provedení, které vynález objasňují, aniž by jej omezovaly.

Příklad 1

Příprava vycházející z jedné bakterie rodu Escherichia

Použitá bakterie Je rodu Escherichia, druhu coli, serotyp 0119 : В 14, zaregistrovaná Pasteurovým ústavem v Paříži pod číslem 62.23.

Colifág patří do morfologické skupiny (nomenklatura subkomise Taxonomie bakteriofá gů International Comittee for Taxonomy of Virus I.A.M.S.). Má izometrickou hlavičku, velmi krátký ocas, který je těžko prokazatelný, pouzdro a koncovou destičku, které nejsou vidět. Na agaru mají dvorce lyže průměr 1 až 1,5 mm, okrouhlou formu, pravidelné okraje, zakalený střed a klony ^{r 7} sbíhavé.

Kultivační půda obsahuje na litr: hovězí extrakt 2,5 g, pepton 4,1 g, chlorid sodný 7,0 g, zbytek redestilovaná voda.

Půda se naočkuje inokulem bakterií, které jsou ve fázi exponenciálního růstu. Počáteční hustota kultury je 1.10^ bakterií na ml. Inkubace se provádí při 37 °C za mírného míchání.

Uprostřed fáze exponenciálního růstu, to jest přibližně 60 minut po naočkování se bak terie infikují svými příslušnými fágy. Infikuje se 0,02 násobně.

Rozvoj lyže se sleduje pomocí počítače buněk předem kalibrovaného. Když bývá méně než 1 000 bakterií na ml, provede se sterilní filtrace průchodem filtrační membránou o porozitě blízké 0,22 ajm. Filtrát lyže tvoří již imonomodulační přípravek.

CS 270 410 B2

Příklad 2

Příprava vycházející z jedné bakterie rodu Streptococcus

Použije se bakterie rodu Streptococcus, druhu faecalis, varianta zymogenes, která je registrována Pasteurovým ústavem v Paříži pod číslem 53.152.

Fág patří do morfologické skupiny (nomenklatura subkomise Taxonomie bakteriofáqú International Commitee for Taxonomy of Virus I.A.M.S). Jeho hlavička je isometrická, ocas dlouhý, použdro viditelné a koncová destička je komplexní. Na agaru jsou dvorce lyže okrouhle, iiiohsí наг u,B Hint v průměru, jtijioh okraje jsou pravidelné na strad čirý. Nejsou lani klony ^{r T} anebo jen jediný.

Kultivační půda obsahuje na litr: hovězí extrakt 0,3 g, tryptasu 1,0 g, dextrosu 1,0 g, chlorid sodný 0,5 g, zbytek redestilovanou vodu.

Půda se naočkuje inokulem bakterií, které jsou ve stacionární fázi. Počáteční hustota je 1.10⁷ bakterií na ml. Uloží se do tmy při teplotě 37 °C za mírného míchání.

Na počátku fáze exponenciálního růstu, to jest přibližně 40 minut po naočkování, se bakterie infikují svými příslušnými fágy. Četnost Infekce je 0,1.

Rozvoj lyže se sleduje pomocí počítače buněk. Když zbývá ménč než 10 bakterií na ml, kultura se sterilně odstředí, aby se odstranily lyzogenní bakterie a nelyžované bakterielní buňky. Zbytek je imunomodulační přípravek.

Příklad 3

Příprava s postupným použitím bakterií rodu Klebsiella a Escherichia

Bakterie rodu Klebsiella, druhu pneumoniae, je registrována Pasteurovým ústavem v Paříži pod čínlum 50.5.

Bližší údaje o použité bakterii rodu Escherichia jsou uvedeny v příkladu 1.

Fág příslušný Klebsielle patří do morfologické skupiny (nomenklatura subkomise Taxonomie baktariofágů International Committee for Taxonomy of Virus I.A.M.S.). Hlavičku má lkosaedrickou, ocas krátký, těžko prokazatelný. Pouzdro a koncová destička nejsou zjistitelné. Na agaru mají dvorce lyže průměr 0,5 až 3 mm a mají tvar velmi nepravidelný, s rozplývajícími se okraji a čirým středem. Klony ^{r T} jsou řídké.

Vlastnosti colifágu jsou popsány v příkladu 1.

Kultivační půda obsahuje na litr: hovězí extrakt 3 g, popton 5 g, chlorid sodný 7 g, zbytek redestilovaná voda.

Půda se naočkuje inokulem Klebsielly pneumoniae ve fázi stacionárního růstu. Počáteční hustota je 1.10⁷ bakterií na ml. Kultura se zahřívá na 37 °C za mírného míchání.

Ke konci latentní fáze, to jest přibližné za 60 minut po naočkování, se bakterie infikují svými příslušnými fágy.

Četnost infekce je 0,03.

Vývoj lyže se sleduje pomocí počítače buněk. Jakmile zbývá méně než 10 bakterií na ml , půda se znovu naočkuje inokulem Escherichia ve fázi stacionárního růstu. Počáteční hustota

CS 270 410 B2 této nové kultury je 5.10? Escherichia na ml.

Ke konci fáze latence, což je za těchto pokusných podmínek 20 minut po druhém naočkování, se bakterie infikují colifágy. Četnost infekce je 0,1.

Vývoj lyže se sleduje pomocí počítače buněk. Když zůstane méně než 10^ Escherichia na ml, kultura se ponechá projít sterilizační filtrační membránou o 0,22 ^um. Získaný filtrát lyže získaný od dvou bakterií, a to Klebsiella pneumoniae a Escherichia coli, představuje imonomodulační přípravek.

Příklad 4

Příprava a použití jedné bakterie rodu Staphylococcus

Bakterie rodu Staphylococcus, druh aureus, seřotyp 1 je registrována Pasteurovým ústa vem v Paříži pod číslem 65.6.

Příslušný fág Staphylococca patří do morfologické skupiny (nomenklatura subkomice Taxonomie bakteriofágů International Committee for.Taxonomy of Virus.de I I.A.M.S.). Má hlavičku oktaedrickou a ocas úplně přikrytý pouzdrem a komplexní koncovou destičkou. Na agaru mají dvorce lyže průměr I až 2 mm, jsou okrouhlé a pravidlené, jejich střed je čirý. Nejsou tam žádné klony ^{r T} .

Bakterie se rozloží na pevnou půdu obsahující na litr: bílkovinný pepton č. 3 Oifco 10,0 g, dextrosu 1,2 g, rozpustný škrob 6,0 g, chlorid sodný 3,0 g, fosforečnan sodný 2,0g, Bacto želatinu 13,0 g, Bacto agar 6,0 g, destilovanou vodu q.s.

Po 24 hodinách se mikroorganismy, které vytvořily hustý bakteriální koberec, sterilně seberou, očíslují a znovu suspendují v půdě obsahující na 1 litr: hovězí extrakt 2,5 g, pepton 4,1 g, chlorid sodný 7,0 g, redestilovanou vodu q.s. tak, aby byla hustota 5.10⁶bakterií na ml.

Současně se vnesou do půdy odpovídající fágy. Četnost infekce je 0,01.

• 2

Vývoj lyže se sleduje pomocí počítače buněk. Jakmile zbývá méně než 10 bakterií na ml, provede se filtrace membránou o porozitě přibližně na 0,22 um. Filtrát lyže již tvoří imunomodulační přípravek.

Farmakologická studie: ’

Účinky přípravků podle vynálezu u zvířat byly prokázány přípravkem odpovídajícím filtrátu lyže Escherichie coli získanému způsobem popsaným v příkladu 1. Filtrát byl lyofilizován, pak znovu rozpuštěn vesterilní destilované vodě. Faktor koncentrace tohoto nového roztoku byl vyjádřen ve srovnání s přípravkem před lyofilizací.

Ochranný účinek proti akutní bakteriální infekci

Tento test prokazující celkovou simulaci imunitního systému byl proveden s mikroorganismy vyvolávajícími infekci, odlišnými od těch, kterých bylo použito při výrobě léčiva podle vynálezu, a to proto, aby bylo zřejmé, že přípravek není účinný svou případnou schopností vakcinační nebo přímým působením jako bakteriofág, nýbrž stimulací imunitní obrany.

Byly zkoušeny dva mikroorganismy, a to Klebsiella pneumoniae, bakterie s vývojem intracelulárním, a Staphylococcus aureus, bakterie s vývojem extracelulárním.

CS 270 410 B2

Bakterie vyvolávající infekci byly podány skupinám 10 samic švýcarských myší o průměr né hmotnosti 18 g dne D_Q intraperitoneální injekcí o objemu 0,5 ml.

Imunomodulační přípravek byl aplikován injekčně den předcházející infekci 0 j. Jde tedy o zjišťování preventivního účinku. Přípravek byl podán intraperitoneálně nebo intravenózně, aby se vyloučil případný kladný výsledek dosažený přímým vlivem přípravku na mikroorganismy v okamžiku podání injekce.

Aby se zjistila virulence mikroorganismu vyvolávajícího infekci, která se může pohybovat v širokých mezích od jednoho pokusu ke druhému, byla jeho letální dávka stanovena při každém testu.

Ochranný účinek přípravku vyrobeného způsobem podle vynálezu proti skutní bakteriální infekci je dokumentován v následující tabulce I.

Tabulkal '

bakterie	aplikace	přípravku	přežívající	(%)
vyvolávající infekci	^DL50	cesta		objem		□ avKa faktor koncentrace	po aplikaci přípravku (n=10)		kontrola (n=10)	P

Klebsiella	10'²	i.p.	1,0 ml	1	X	0	10	NS
	10”³	i.p.	1,0 ml	1	X	70	30	0,050
	Ю'⁴	i.p.	1,0 ml	1	X	100	20	0,001
	10’²	i.v.	0,5 ml	1	X	20	10	NS
	10~³	i.v.	0,5 ml	1	X	80	20	0,025
	10“⁴	i.v.	0,5 ml	1	X	100	20	0,001
Staphyloco-	10’²	i.p.	1,0 ml	1	X	10	10	NS
ccus aureus	10’³	i.p.	1,0 ml	1	X	80	10	0,001
	10'²	i. v.	0,5 ml	1	X	10	20	NS
	10’³	i. v.	0,5 ml	1	X	100	30	0,001

Stimulace fagocytárního účinku makrofágů

Halpernův.test (Stiffel С., 1958. ΰ. Phys. 58, 911-949) spočívá v tom, že se myším aplikují intravenózně částice koloidního uhlíku, které jsou řagocytovány zejména retikuloendotheliálními buňkami jater a sleziny. Rychlost jejich čištění odpovídá fagocytárnímu účinku. Maří se tím, že se stanovují fotometricky v závislosti na čase volné částice zbylé v krvi. Jako referenční látka se používá LPS, což je lipopolysacharidický endotoxin extrahovaný z endobakterií, který je silným aktivátorem makrofágů.

Test se provádí následujícím způsobem:

- skupinám po 5 samicích švýcarských myší o průměrné hmotnosti 24 g se aplikuje intraperitoneálně 0,6 ml filtrátu z Escherichia coli nebo roztoku LPS (lipopolysacharidy) o koncentraci 0,625 £jg/ml.

- po 24 hodinách se myším aplikuje intravenpzně 0,12 ml suspenze koloidního uhlíku obsahující 32 mg/ml uhlíku v 4 želatině.

CS 270 410 02

- během 12 minut se myším odebere každé 2 minuty 20 <ul krve z retroorbitální dutiny. Tato odebraná krev se okamžitě zředí 4 ml 1% Na₂C0j. Roztok se pak měří fotometricky.

- otluč í tóní ox tlnkcQ no provádí při 620 nm, .

- koncentrace koloidního uhlíku v krvi v čase t pokusu se zjistí odečtením na předem sentnvnnó kalibrované únečce. Fagocytární index ee vypočte podle následujícího vzorem . i.p. . .12Β.9₂-:-^0-5ι ' ^Tz - ^Ti přičemž C₂ a Cj představují koncentraci koloidního uhlíku v krvi při posledním a prvním odběru krve, T? a T^ představují okamžik těchto odběrů.

Výsledky shrnuté v tabulce II prokazují, že účinek peritoneálních makrofágů myší je stimulován po intraperitoneálním podání přípravku.

Tabulka II přípravek (filtrát lyže E. со1Д pomocí bakteriofágu) neočkovaný bujón (negativní kontrola)

LPS (positivní kontrola) aplikace . objem injekce I.P.

0,6 ml 0,028 - 0,003

0,6 ml 0,012 - 0,001

0,6 ml ; 0,025 - 0,002

Schopnost navodit tvorbu sérového interferonu (IFN sérový) *

IFN je glykoprotein o molekulové hmotnosti 10*000 až 20 000 daltonů. Má mnoho imunomodulačních účinků, zejména stimuluje aktivitu buněk NK (Natural Killer). Způsob jeho účinku je ještě ve stadiu zkoumání. Jeho účast na protivirové obraně je jasně prokázána.

Ově hodiny po podání přípravku 8 samicím švýcárskýcg myší o hmotnosti 25 g se od každé odebere 0,3 ml krve do neheparinizované zkumavky. Sérový IFN se stanovuje klasickým způ sobem tím, že se měří cytopathický efekt viru VSV (Vesicular Stonatitis Virus) infikující myší buňky L kultivované 24 hodin v přítomnosti séra, které se eá testovat. (Havell E.A. a Vilček J., Antimicrob. Agents Chemotherapy 2, 476-484, 1972). Navozený ochranný účinek IFN se srovnává s účinkem IFN myším, což je mezinárodní standard z National Institute of Health, Bethesda, Sp.st. am. . .

Přípravek navozuje sérový IFN u myší dvě hodiny po jeho intraperitoneálním, intraveniním nebo perorálním podání, jak je zřejmo z tabulky III.

CS 270 410 B2

Tabulka III

cesta	produkt	objem	faktor koncentrace	U.I. IFN/ml
i.p.	přípravek	1*5 ml	80	1058
	placebo	1*5 ml	80	0
i. v.	přípravek	0*7 ml	80	950
	placebo	0*7 ml	80	0
p.o.	přípravek	1*0 ml	1000	1200
	placebo	1*0 ml	1000	0

Aktivita u člověka byla testována s přípravkem podle příkladu 3 aplikovaným nejprve u dobrovolníka* pak u nemocného.

Dvojitý slepý pokus provedený u 15 dobrovolných pacientů umožnil prokázat* že perorální podání přípravku způsobí po 10 dnech značné zvětšení imunitních odpovědí zprostředkovaných buňkami. .

Druhý pokus provedený u 25 pacientů ukázal* že jediná perorální podání různých dávek přípravku umožnilo navodit po 24 hodinách tvorbu sérového lymfokinu typu MIF - LIF. Toto navození je odvislé od dávky. ’

Několik pokusů umožnilo prokázat stimulaci tvorby IFN lymfocyty a monocyty lidskými získanými separcí buněk.

IFN* jehož tvorba byla navozena přípravkem.* byl charakterizován za použití antisera anti-IFN * nebo . Jeho tvorba je závislá od použité dávky.

Oále je popsáno několik klinických pokusů jako příklady.

Prevence a léčení chronických nebo recidivujících infekcí dýchacích cest.

Dvě skupiny po 25 pacientech postižených chronickými nebo recidivujícími bakterlálníní infekcemi v oblasti bronchopulmonární byly léčeny perorálním podáním v jedné skupině 15 ml přípravku vyrobeného způsobem podle vynálezu, a to 20 dnů za měsíc po‘dobu šesti měsíců, v druhé skupině klasicky antibiotiky. Snížení počtu vážných infekčních příhod během šesti měsíců trvání pokusu je podstatně větší u skupiny léčené přípravkem vyrobeným způsobem podle vynálezu než u skupiny léčené klasicky antibiotiky.

Prevence pooperačních infekcí

Perorální aplikace 20 ml přípravku umožnila snížit významným způsobem infekční pooperační komplikace u 106 pacientů ve srovnání se snížením u 72 jiných nemocných léčených klasicky.

Prevence a léčení infekcí močových cest

Čtyři autoři sledovali v klinickém rozsahu účinek shora uvedeného přípravku u pacientů postižených chronickou nebo recidivující infekcí močových cest. Perorální podání 15 ml za den* po 20 dnů za měsíc během tří měsíců umožnilo významně snížit frekvenci a délku infekčních příhod jakož! spotřebu protiinfekčních léčiv během šesti měsíců pozorování ve srovnání se šesti měsíci předcházejícími léčení.

CS 270 410 B2

Při všech pokusech byla tolerance přípravku považována za vynikající, a to jak lékařen, tak pacientem (dobrovolníkem nebo nemocným).

Claims

PŇEDMÉT VYNÁLEZU

1. /půuub výroby biologicky aktivní látky в lmunostlmulačním účinkem, která jo vytvofonu produkty lýze nebo frakcí těchto produktů lýze bakterií pomocí bakteriofágů, přičemž použitá bakterie jsou rodu Escherichia, Streptococcus, Klebsiella, Staphylococcus nebo jiné, vyznačující se tím, Že se provede prvé naočkování kultivační půdy inokulem bakterií jednoho ze shora uvedených rodů, během fáze růstu se bakterie uvedeného rodu infikují četností infekce 0,01 až 0,1 vnesením jejich příslušných fágů, sleduje se vývoj lýze až do stanoveného stupně, který činí 10 až 1 000 bakterií na mililitr, pak se přistoupí ks druhému naočkování kultivační půdy inokulem bakterií jednoho z uvedených rodů, během fáze růstu bakterií druhé rodu se bakterie tohoto druhého rodu infikují četností infekce 0,01 až 0,1 vnesením jejich příslušných fágů, sleduje se vývoj lýze těchto bakterií druhého rodu až do stanoveného stupně, který činí 10 až 1 000 bakterií na mililitr, nakonec se odstraní nelyžované bakterie a odebere se filtrát lýze získaný od obou rodů bakterií.
2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, Že lýzi působením příslušných bakteriofágů se podrobí bakterie rodů Klebsiella a Escherichia.