DK160807B - Immunomodulerende laegemiddel af biologisk oprindelse samt fremgangsmaade til fremstilling deraf - Google Patents

Description

DK 160807 B

i

Den foreliggende opfindelse angår et immunomodulerende lægemiddel af biologisk oprindelse, hvis aktive bestanddel består af lyseprodukter eller en fraktion af sådanne produkter fra bakterier, der er lyseret ved hjælp af bak-5 teriofager samt fremgangsmåde til fremstilling deraf.

Man kender talrige præparater, som modulerer immunresponset ved hjælp af fraktioner eller ekstrakter af lyserede mikroorganismer. Man kan især nævne sådanne pro-10 dukter, som er omtalt i de franske patentskrifter nr.

2 374 042, 2 396 018 og 2 426 470.

Disse lysater eller ekstrakter er i almindelighed opnået ved fysiske, kemiske og mindre hyppigt ved enzymatiske 15 fremgangsmåder. Størstedelen af disse præparater har en vis immunomodulerende aktivitet, som er påvist hos dyr, men de terapeutiske virkninger over for mennesker er stadig genstand for talrige undersøgelser (Immuno-pharmacologie Clinique. Réalités et Perspectives, G.

20 RENOUX. Pharmacologie et thérapeutique. R.P. 1982, 32, 41-42).

Det er således vigtigt at prøve at finde lægemidler, som kan tilbyde såvel læger som dyrlæger et våben, som kan 25 anvendes hver gang, det drejer sig om at retablere eller at forstærke immunforsvaret.

Artikler af Y. Centifanto i Proc. Soc. Exptl. Biol. og Med. vol. 120 nr. 3, 607-11, 1965, beskriver et anti- 30 viralt, terapeutisk middel, der er fremstillet ud fra en ekstrakt af inficerede Escherichia coli (Phagicin), og P.

Actor, Infection and Immunity, vol. 6, nr. 5, nov. 1972, p. 886-888 har undersøgt den beskyttende virkning af en ribonucleinsyre, der er opnået ved bakteriofaginfektion 35 af Escherichia coli.

DK 160807 B

2

Man har nu fundet en hidtil ukendt fremstillingsmåde, hvor der anvendes bakteriofager. Bakteriofager udgør in vitro et fremragende redskab til lyse af bakterier, hvorfor anvendelsen deraf til fremstilling af immunomodule-5 rende præparater har vist sig effektiv med forskellige arter og typer af bakterier. Denne teknik til lyse af bakterier ved hjælp af bakteriofager er uden begrænsning med hensyn til bakteriearten eller bakterietypen. Denne fremgangsmåde gør det muligt at opnå lægemidler, der er 10 bemærkelsesværdige ved deres evne til modulering af immunsystemet, og de er fremstillet ud fra flere bakterier eller en blanding af sådanne bakterier. Disse lægemidler har især en evne til at inducere interferoner.

15 Lægemidlet ifølge den foreliggende opfindelse, som modulerer immunresponset, og hvori den aktive bestanddel består af lyse-produkter eller en fraktion af disse produkter fra bakterier, som er lyseret ved hjælp af bakteriofager, er ejendommeligt ved, at det som aktiv bestanddel 20 indeholder det sterile lysefiltrat fra mindst to bakterier, som er lyseret ved hjælp af homologe bakteriofager, idet de udvalgte bakterier er Escherichia coli og Klebsiella pneumoniae.

25 Lægemidlet ifølge opfindelsen kan være kombineret med antibiotika, såsom tetracykliner, et antiviralt middel, såsom syntetiske nucleosider, som griber ind i syntesen af den virale nucleinsyre, et anti-fungusmiddel, som buclosamid, eller et anti-parasitmiddel, som chloroquin.

30 Lægemidlet ifølge opfindelsen kan i en anden udførelsesform være kombineret med andre farmaceutiske produkter og præparater, såsom et ant i-tumormiddel (cytostatika), et immunosuppresivt middel (antilymfocytære immunoglobuli-35 ner), et antimitotisk middel, f.eks. folinsyrederivater eller et anti-inflammatorisk middel, f.eks. indomethacin.

DK 160807 B

3 Lægemidlet ifølge opfindelsen kan foreligge i forskellige former med henblik på percutan, transcutan, perlingual, topisk, enteral, parenteral eller luftbåren administrering. Afhængig af de enkelte tilfælde tilberedes lægemid-5 let med et passende hjælpestof f.eks. i form af en vandig eller alkoholisk opløsning eller i suspension i et olieholdigt hjælpestof eller i frysetørret form eller som en aerosol eller som en salve.

10 Den anvendte dosering er underkastet store variationer afhængig af sammensætningen af lægemidlet, af den beskrevne indikation, af administreringsmåden samt af patientens alder. Bestemmelsen af de anvendte doser foretages af lægen eller dyrlægen, således som det er sædvanlig 15 praksis ved behandlinger for at modulere immunresponset.

Den daglige dosis kan som eksempel være doser fra 1-50 ml afhængig af koncentrationen af det immunomodulerende præparat ved behandling af kroniske eller recidiverende in-20 fektioner i luftvejene, ved behandling af post-operative infektiøse komplikationer eller ved forebyggelse af urinvej sinfektioner.

Lægemidlet ifølge opfindelsen tolereres særdeles godt, og 25 dets toxicitet er meget lav, således som det vises ved prøven for LD^-q, som man ikke har kunnet måle ved peroral administrering på grund af mavesækskapaciteten hos de anvendte forsøgsdyr (mus og rotter).

30 Lægemidlet ifølge opfindelsen er i særdeleshed velegnet ved behandlingen af dårligt fungerende immunrespons, ved behandling eller forebyggelse af bakterielle, virale, fungus- eller parasit-infektionsangreb såvel som ved behandlingen af rheumatisme og ved ardannelse eller beskyt-35 telse af sår.

DK 160807 B

4

Den foreliggende opfindelsen angår ligeledes en fremgangsmåde til fremstilling af lægemidler af bakterie-ly-se-typen, hvilken fremgangsmåde består af en række på mindst to absolut nødvendige trin, nemlig et bakteriofag-5 lyserende trin og efterfølgende fjernelse af ikke-lyse-rende bakterier og bakterierester ved en for fagmanden kendt fremgangsmåde, som f.eks. filtrering eller centrifugering.

10 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen udføres ved at anvende bakterier af forskellig art efter hinanden.

Fremgangsmåden er ejendommelig ved, at man poder en første kultur med et inokulum af Klebsiella pneumoniae bak-15 terier, der befinder sig i vækstfasen, at man inficerer Klebsiella-bakterierne ved at indføre deres homologe fager, at man følger udviklingen af lysen indtil et fastlagt stadium, hvorpå man gennemfører en anden podning af kulturen med et inokulum af Escherichia coli bakterier, 20 idet bakterierne af den anden slægt befinder sig i vækstfasen, at man inficerer disse Escherichia bakterier ved at indføre disse bakteriers homologe fager, at man følger lysen af bakterierne af den anden slægt, til et forud fastlagt stadium, hvorefter man fjerner de ikke lyserede 25 bakterier ved kendte metoder ved f.eks. centrifugering eller sterilfiltrering, og at man til sidst opsamler det opnåede lysefiltrat stammende fra de to bakterier.

Opfindelsen beskrives nærmere i det efterfølgende.

30 EKSEMPEL; Fremstilling under successiv anvendelse af bakterier af slægten Klebsiella og Escherichia.

Bakterien af slægten Klebsiella, type pneumoniae, er ka-35 talogiseret af Institut Pasteur i Paris under referencen 58.5.

DK 160807 B

5

Bakterien af slægten Escherichia, type coli serotype 0119:B14 er leveret af Institut Pasteur, Paris, som 62.23.

5 Fagen, en homolog af Klebsiella, tilhører den morfologiske gruppe (nomenklatur under komiteen for taxonomi af bakteriofager under International Committee for Taxonomy of Virus i I.A.M.S.). Den har et ikosaedrisk hoved, en kort hale, som er vanskelig at påvise, kappen og den en-10 destillede plade lader sig ikke konstatere. På agar-agar-substrat har lyse-zonerne en diameter på 0,5-3 mm, og de er af meget uregelmæssig form samt med udviskede konturer og et klart center. Klonerner + er sjældne.

15 Coli-fagen tilhører den morfologiske gruppe (nomenklaturen fra underkomiteen for taxonomi af bakteriofager inden for International Comittee for Taxonomy of Virus under I.A.M.S.). Den har et isometrisk hoved og en meget kort hale, som er vanskelig at påvise, en kappe og en en-20 destillet plade, der ikke lader sig påvise. På gelatinesubstrat har lysé-zonerne en diameter på 1-1,5 mm, rund form, regelmæssige konturer, et tilsløret center og sam- 2Γ + menflydende kloner 25 Dyrkningssubstratet har følgende sammensætning pr. liter: okseekstrakt 3g, pepton 5g, natriumchlorid 7g og resten dobbeltdestilleret vand.

Substratet podes med et inokulum af Klebsiella pneumo-30 niae, som befinder sig i den stationære vækstfase. Den 7 oprindelige tæthed er 1x10 bakterier pr. ml. Kulturen anbringes ved 37 °C under moderat omrøring.

Ved afslutningen af nøle-fasen, det vil sige ca. 60 35 minutter efter podningen, inficeres bakterierne med deres homologe fager, idet infektionsstørrelsen er 0,03.

DK 160807 B

6

Man følger udviklingen af lysen med en celletæller. Når der er mindre end 10 bakterier pr. ml tilbage, podes substratet påny med et inokulum af Escherichia, der befinder sig i den stationære vækstfase.

5 7

Den oprindelige tæthed af denne nye kultur er 5x10 Escherichia pr. ml.

Ved afslutningen af nøle-fasen, det vil under forsøgs-10 betingelserne sige 20 minutter efter den anden podning, inficeres bakterierne med colifagerne. Infektionsmængden er 0,1.

Man følger udviklingen af lysen med en celletæller. Når 3 15 der er mindre end 10 Escherichia pr. ml tilbage, afbrydes dyrkningen ved passage gennem et steriliserende membranfilter på 0,22 urn. Det ud fra de to bakterier, Klebsiella pneumoniae og Escherichia coli, opnåede lysefiltrat udgør det immunomodulerende præparat.

20

Virkningen af det omhandlede præparat til mennesker blev afprøvet ved først at blive administreret til en frivillig forsøgsperson og derpå til en syg person.

25 Man gennemførte et dobbelt blindforsøg med 15 frivillige patienter med henblik på at kunne påvise, at den perorale indgift af præparatet efter 10 dages behandling medførte en signifikant forhøjelse af det celleformidlede immunrespons .

30

En anden undersøgelse, som blev gennemført på 25 patienter, påviste, at en enkelt peroral indgift af forskellige doser af præparatet gjorde det muligt efter 24 timers forløb at inducere en serumlymfokin af typen MIF - LIF.

35 Denne induction er afhængig af dosens størrelse.

DK 160807 B

7

Adskillige undersøgelser har gjort det muligt at påvise stimuleringen af produktionen af IFN fra humane lymfocytter og monocytter, som var opnået ved cytoferese og dyrket i en såkaldt "speener".

5

Det af præparatet inducerede IFN har kunnet karakteriseres under anvendelse af anti-IFN antisera af typen o, 0 eller r. Produktionen var afhængig af den anvendte dosis.

10 I det følgende skal som eksempler anføres nogle kliniske undersøgelser.

Prævention af og behandling af kroniske eller recidive- rende infektioner i respirationsvejene_ 15

Man behandlede to grupper på 25 patienter, som led af kroniske eller recidiverende broncho-pulmonære bakterieinfektioner ved peroral indgift. Den ene gruppe fik 15 ml af det oven for nævnte præparat 20 dage om måneden igen-20 nem 3 måneder, og den anden gruppe modtog klassiske antibiotika-behandlinger. Formindskelsen i antallet af akutte infektions-perioder i de 6 måneder som forsøget varede, var signifikant lavere i den gruppe, som var blevet behandlet med præparatet, end i den gruppe, som var blevet 25 behandlet på klassisk måde med antibiotika.

Prævention af post-operative infektioner

En peroral indgift på 20 ml af præparatet gjorde det mu-30 ligt signifikant at formindske de post-operative infektions-komplikationer hos 106 patienter i sammenligning med 72 andre syge, som modtog klassisk behandling.

Prævention af og behandling af urinvejs-infektioner 35

Fire forskere har klinisk undersøgt det oven for beskrevne præparat på en gruppe patienter, som led af kroniske 8

DK 160807 B

eller recidiverende urinvejsinfektioner.

En peroral indgift på 15 ml pr. dag 20 dage pr. måned gennem 3 måneder gjorde det muligt signifikant at redu-5 cere hyppigheden og varigheden af infektionsepisoderne, såvel som forbruget af anti-infektionsmidler linder den 6 måneders observationsperiode i sammenligning med de 6 måneder, som gik forud for behandlingen.

10 Ved samtlige disse forsøg blev tolerancen over for præparatet bedømt som værende fremragende såvel af lægen som af patienten (frivillig patient såvel som syg patient).

15 20 25 30 35

Claims (6)

1. Immunomodulerende lægemiddel af biologisk oprindelse, 5 hvori den aktive bestanddel består af lyse-produkter eller en fraktion af sådanne produkter fra bakterier, der er lyseret ved hjælp af bakteriofager, kendetegnet ved, at det som aktiv bestanddel indeholder det sterile lysefiltrat fra mindst to bakterier, der er lyse- 10 ret ved hjælp af homologe bakteriofager, idet de udvalgte bakterier er Klebsiella pneumoniae og Escherichia coli.

2. Lægemiddel ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det yderligere indeholder et antibiotisk, antiviralt, 15 anti-fungus eller anti-parasit middel.

3. Lægemiddel ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det yderligere indeholder et antitumormiddel eller et immunosuppressivt middel. 20

4. Lægemiddel ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det yderligere indeholder et antimitotisk eller anti-inflammatorisk middel. 25

5. Lægemiddel ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den aktive bestanddel er kombineret med et hjælpestof egnet til percutan, transcutan, perlingual, topisk, enteral, parenteral administrering eller administrering via luftvejene. 30

6. Fremgangsmåde til fremstilling af et lægemiddel ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man poder en første kultur med et inokulum af Klebsiella pneumoniae bakterier, der befinder sig i vækstfasen; at man infi-35 cerer bakterierne ved indførsel af deres homologe fager, at man herpå følger lysen til et forud fastlagt stadium, hvorpå man gennemfører en anden podning af kulturen med DK 160807 B et inokulum af Escherichia coli bakterier, idet bakterierne af den anden slægt befinder sig i vækstfasen, at man inficerer disse bakterier ved indførsel af deres homologe fager, hvorpå man følger udviklingen af lysen af disse 5 bakterier af den anden slægt til et forud fastlagt stadium, hvorpå man fjerner de ikke-lyserede bakterier ved velkendte metoder til steril adskillelse, og at man til sidst opsamler det fremkomne lysefiltrat fra de to bakterier . 15 20 25 30 35