CS210659B2

CS210659B2 - Method of preparation of amidobenzoic acid derivatives

Info

Publication number: CS210659B2
Application number: CS763889A
Authority: CS
Inventors: Mitsuru Tanemura; Teizo Shinozaki; Minoru Shindo; Shun-Ichi Hata; Koji Mizuno; Masayoshi Ono; Kiyoshige Wakabayshi; Toshiaki Nakano; Yasuho Nishii
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1975-06-11
Filing date: 1976-06-11
Publication date: 1982-01-29
Also published as: JPS5212141A; DE2526092A1; BE842832A; DE2526092C2; JPS606355B2; HU176505B

Description

Vynález se týká nových derivátů aminobenzoové kyseliny, způsobu jejich přípravy a. farmaceutických preparátů, které tyto deriváty obsahují.

Deriváty aminobenzoové kyseliny podle vynálezu lze znázornit obecným vzorcem I

Cl COOH (I) ky pro zlepšování funkce jater a jako léčiva pro léčení chorob vyvolaných vyčerpáním imunity, jako je rheumatická arthritis, autoimunní choroby, rakovina, · bakteriální infekční choroby a asthma.

Jako příklady derivátů · spadajících do rozsahu obecného vzorce I lze uvést:

N-2‘-karboxyfenyl-4-chloranthramlovou kyselinu,

N-2‘-k.arboxy-4‘-chlorfenyl-4-chloranthranilovou kyselinu,

N-2‘-karboxy-4‘-methylfenyl-4-chloranthranilóvóu kyselinu,

N-2‘-karboxy-4‘-ethylfenyl-4-chloranthrarnlovou kyselinu,

N-2’-karboXy-4’-propylfenyl-4-^(^H(^i^anthranilovou kyselinu,

N-2‘-karboxy-4‘-butylfenyl-4-^(^l^]^(^i^<anthranilovou kyselinu,

N-2^í-karboxy-5‘-chlorfenyl-5-chloranthranilovoů kyselinu,

N^-karboxy^-methylfenyl-4-chloranthranilovou kyselinu, kde každý ze symbolů

Ri a R'í, které jsou stejné nebo· různé, představují atom vodíku, atom halogenu hebo alkylový zbytek obsahující 1 až 6 atomů uhlíku,

Všechny deriváty aminobenzoové kyseliny podle vynálezu jsou nové látky. Deriváty podle vynálezu mají vynikající účinek při zlepšování funkce jater a při posilování a regeneraci imunity a mají antivirální účinek.

Z těchto důvodů jsou užitečné jako prostřed210659

N-2‘-karboxy-5‘-methylfenyl-4-chloranthranilovou kyselinu,

N-2‘-karboxy-3‘-methylfenyl-4-chloranthranilovou kyselinu,

N-2‘-karboxy-3‘,6‘-dimethylfenyl-4-chloranthranllovou kyselinu a

N-2‘-karboxy-5‘-chlorfenyl-4-chloranthranilovou kyselinu.

Předmětem vynálezu je způsob přípravy derivátů aminobenzoové kyseliny obecného vzorce I vyznačený tím, že se derivát 2-halogenbenzoové kyseliny obecného vzorce II

COOH

X

cl (ID kde

Ri má shora uvedený význam a

X představuje atom halogenu, nechá při teplotě 80' až 200' °C reagovat s kyselinou anthranilovou nebo' jejím derivátem obecného vzorce III

(III) kde

Ri a R? mají shora uvedený význam a v přítomnosti alkalické ' látky a látky zvolené ze souboru zahrnujícího kovy, ' sloučeniny kovů a jod a sloučeniny obsahujících jod, jako katalyzátoru.

Jako derivátů 2-halogenbenzoové kyseliny obecného vzorce II lze podle vynálezu ' použít například 2-chlorbenzoové kyseliny, 2,4dichlorbenzoové kyseliny, 2,4-dibrombenzoové kyseliny apod.

Jako derivátů kyseliny anthranilové obecného vzorce III se podle vynálezu může použít 4-chloranthranilové kyseliny, 5-chloranthranilové kyseliny, 4-(^lhlor-3-^-^e^th^^ll^nthranilové kyseliny, 3-methylanthranilové kyseliny, 3-methylanthranilové kyseliny, 5-methylanthranilové kyseliny, 3,6-dimethylanthranilové kyseliny apod.

Podle vynálezu se reakce derivátů 2-halogenbenzoové kyseliny obecného vzorce II s kyselinou ' anthranilovou nebo jejím derivátem obecného vzorce ' III provádí v rozpouštědle při teplotě nad 25 °C, obvykle ' při teplotě od 80' do 200' °C, po dobu 1 až 10 hodin a přednostně při teplotě 120' až 150i °C, po dobu 3 až 5 hodin.

Jako rozpouštědla se při postupu podle vynálezu hodí isoamylalkohol, dimethylsulfoxid, dimethylformamid, ethanol, butanol, n-amylalkohol, diethylenglykoldimethylether, nitrobenzen, voda apod.

Kyseliny anthranilové nebo jejího derivátu obecného vzorce III se může s výhodou používat v přebytku, přednostně v množství 1,2 až 2,0 molů na mol derivátu 2-halogenbenzoové kyseliny. Pro' hladké provedení reakce a pro zvýšení výtěžků požadovaného' produktu se může s výhodou používat alkalické látky, jako uhličitanu draselného, uhličitanu sodného nebo uhličitanu měďnatého' a kovu, či sloučeniny obsahující kov, jako práškovité mědi, chloridu mědného, bromidu měďného, octanu měďnatého apod., jako' katalyzátoru reakce.

Alkalické látky se přednostně užívá v množství větším, vztaženo na celkové množství sloučenin obecného vzorce II a III v molech, zatímco kovu nebo sloučeniny obsahující kov se přednostně používá ve velmi malém množství. Kromě toho lze výtěžek produktu výrazně zvýšit tím, že se kromě katalyzátorů uvedených výše, používá katalytického množství jodu nebo sloučeniny obsahující jod, jako jodidu sodného nebo jodidu mědného.

Deriváty kyseliny aminobenzoové obecného vzorce I se mohou převést jakýmkoli běžným způsobem na odpovídající alkalické soli, jako sodné, ' draselné soli apod.

Deriváty kyseliny ' aminobenzoové obecného; vzorce I lze zpracovat spolu s ' pomocnými látkami a ' farmaceuticky ' vhodnými nosiči ná farmaceutické ' preparáty sloužící ' ke zlepšení' funkce ' jater a ' na farmaceutické ' preparáty pro léčení chorob způsobených vyčerpáním imunity. Tyto preparáty mohou mít formu vhodnou pro orální podávání, například formu tablet, granulí, prášků, kapslí plněných práškem nebo granulemi apod., nebo' formu vhodnou pro parenterální podávání, jako jsou parenterální injekční roztoky ve vodě.

Pro přípravu tablet, granulí, prášků nebo kapslí se jako farmaceuticky vhodných nosičů přednostně používá laktózy, škrobu, dextrinu, sacharózy, mikrokrystalické celulózy, kaolinu, uhličitanu vápenatého, mastku apod. Při výrobě parenterálních injekčních roztoků se přednostně sloučeniny podle vynálezu rozpouštějí ve vodě a vodný roztok se ' isotonízuje chloridem sodným, chloridem ' draselným apod.

Deriváty aminobenzoové kyseliny obecného vzorce I mají být ' přítomny ve farmaceutických preparátech v množství, které ' postačuje ' pro dosažení požadovaných účinků, tj.

účinku na zlepšení funkce jater a ' účinku ' spočívajícího v posílení imunity a její rege210659 s

neraci po vyčerpání. Obvyklé dávkování Je 0,5 až 3000, přednostně 10 až 300 mg účinné sloučeniny na osobu a den při orálním podávání a 0,5 až 1000, přednostně 1 až 100 mg účinné sloučeniny na osobu a den při podávání preparátů ve formě parenterálních injekcí.

Na obr. 1 je graf znázorňující účinek sloučeniny podle vynálezu při léčení arthritis uměle vyvolanou pomocnou látkou (model rheumatické arthritis).

Na obr. 2 je graf znázorňující účinek sloučeniny podle vynálezu při léčení modelové autoimunní choroby.

Na obr. 3 je graf znázorňující protinádorový účinek sloučeniny podle vynálezu proti trasplantovaným nádorovým buňkám (Sarcoma-180).

Na obr. 4 je graf znázorňující účinek sloučeniny podle vynálezu při podporování blastogenese lymfocytů [in vitro).

Na obr. 5 je graf znázorňující účinek sloučeniny podle vynálezu při podporování blastogenese lymfocitů (in vivo).

Na obr. 6 je graf znázorňující účinek sloučeniny podle vynálezu při regeneraci vyčerpané imunity.

Na obr. 7 je graf znázorňující účinek slom čeniny podle vynálezu spočívající v ochraně před infekcí, kterou vyvolávají Salmonellae.

Na obr. 8 je graf znázorňující účinek sloučeniny podle vynálezu při léčení alergické reakce (tvorba IgE)).

t

V grafech znamená symbol — statickou

I standardní odchylku.

Vynález je blíže osvětlen následujícími experimenty a příklady. Uvedené experimenty a příklady mají pouze ilustrativní charakter, ale rozsah vynálezu v žádném směru neomezují.

♦

Experiment 1

Účinek spočívající ve snižování hladiny tri• glyceridů v játrech

Samice krys (Sprague Dawley) o hmotnosti 170 až 200 g, jimž nebyla 15 hodin podávána potrava se rozdělí do skupin vždy po 4 krysách. Krysám se orálně podají různé testované sloučeniny v dávce 100 mg/kg a 30 minut po podání testované sloučeniny se jim orálně podá ethanol v dávce 6 g/kg. 24 hodin po podání ethanolu se játra každé krysy odeberou a běžným způsobem se měří hladina neutrálních lipidů v játrech, která slouží pro vypočtení % prevence (definovaného dále) proti zvýšení hladiny triglyceridů v játrech. Jedné kontrolní skupině se podá je ethanol, další kontrolní skupině se podá jen vodný roztok glukózy s ekvivalentní kalorickou hodnotou jako má stejné množství ethanolu, přičemž jinak se experimenty provádějí stejně, jako v případě podání testovaných látek. U další pozitivní kontrolní skupiny se místo testované sloučeniny použije obchodně dostupného 2-merkaptopropionylglycinu.

Tabulka 1

Testovaná sloučenina % prevence * N-2‘-karboxyfenyl-4-chloranthranilová kyselina67,1

N-2‘-karboxy-4‘-methylfenyl-4-chloranthranilová kyselina53,2

N-2‘-karboxy-6‘-methylfenyl-4-chloranthranilová kyselina25,2

N-2‘-karboxy-5‘-chlorfeny-4-chloranthranilová kyselina. . 57,2 .

N-2‘-kárboxy-3‘,6‘-dimethylfenyl-4-chloranthranilová kyselina.45,8 sodná sůl N-2‘-karboxyfenyl-4-chloranthranilové kyseliny63,6 kontrolní test:

2-merkaptopropionylglycin9,3 * °/o prevence se vypočte podle následující rovnice:

množství triglyceridů v játrech skupiny, které byl podán ethanol — % prevence = ----------------množství triglyceridů v játrech skupiny, které byl podán ethanol — množství triglyceridů v játrech skupiny, testovaná sloučenina které byla podána a ethanol

X 100 množství triglyceridů v játrech skupiny, které byla podána glukóza

106 5 9

Experiment 2

Účinek na exkreci žluči

a] Bromsulfoftaleinový (BSP) test

Samice krys (Sprague Dawley) o hmotnosti 150 až 190 g, kterým nebyla 15 hodin podána potrava, se· rozdělí do skupin vždy po 4 krysách. Krysám se orálně podájí různé testované sloučeniny v dávce 100 mg/kg · a 60 minut po· podání 'testované sloučeniny se krysám injikuje do ocasní žíly 28 mg BSP na hlavu, 30 minut · po· injikaci se krysám odebere · krev ze srdce a stanoví se · běžným kolorimetrickým způsobem koncetrace BSP. Pro kontrolu se orálně podá fyziologický roztok soli místo· testované sloučeniny.

Výsledky jsou uvedeny v tabulce 2.

Tabulka 2

Testovaná sloučenina % zůstatek BSP kontrolní 51,9+6,7

N-2‘-karboxyfenyl-4-chloranthrnnilo vá 17,3+8,4 kyselina ** (P< 0,01) ** Výrazný účinek:

Studentův T-test založený na střední hodnotě

b) Indocyanogree-ový (ICG) test

Samice krys (Sprague D.awley) o hmotnosti 180 až 210 g, kterým nebyla ' 15 hodin podána potrava, se rozdělí do skupin vždy po 4 krysách. Krysám se orálně podají různé testované sloučeniny v dávce 100. mg/kg a 60 minut po podání testované sloučeniny se krysám injikuje do ocasní ' žíly 2 mg ICG na hlavu. 15 minut po injikaci se krysám odebere krev ze srdce a stanoví se běžným kolorimetrickým způsobem koncentrace ICG. Pro kontrolu se orálně podá fyziologický roztok soli místo testované sloučeniny.

Výsledky jsou uvedeny v tabulce 3.

Tabulka 3

Testovaná sloučenina % zůstatek ICG kontrolní (fyziologický solný roztok) 7,8+1,5

N^-karboxyfenyl-4-chloranthraniilová kyselina

Samice krys (Sprague Dawley) o hmotnosti 160 až 200, g, kterým nebyla 15 hodin podána potrava, se rozdělí do skupin vždy po 4 krysách. Krysám se orálně podají · různé testované · sloučeniny · v dávce 100 mg/kg a 60 minut po podání testované sloučeniny · sé krysám injikuje do ocasní žíly 150 g bilirubinu na hlavu. 20 minut po injikaci se krysám odebere krev ze srdce a stanoví se ' · běžným · způsobem koncentrace bilirubinu v krvi. Pro kontrolu se orálně podá fyziologický roztok soli místo testované sloučeniny.

Výsledky jsou uvedeny v tabulce 4.

Tabulka 4

Testovaná sloučenina % zůstatek bilirubinu kontrolní · (fyziologický solný roztok) 85,4+9,8

N-2‘-karboxyfenyl- ····+

-4-chloranthranllová · ' 39,7+13,3 kyselina · ** (P<0;01) ** jako v tabulce 2.

Experiment ·3 ^:

Účinek při léčení arthritis uměle vyvolané pomocnou látkou (model reumatické arthritis)

Při pokusu se používá samců krys (Sprague Dawley) o stáří 8 týdnů. Arthritis se vyvolá subkutánním vstřiknutím · suspenze · usmrcených bacilů tuberkolózy ve Freundově adjuvantu do ocasu každé krysy. 17 dní po sensitizaci se určí stupeň otoku zadních tlapek každé krysy změřením · jejich objemu· a krysy se rozdělí do skupin po 10 jedincích tak, aby průměrný stupeň otoku byl · u · každé za skupin přibližně stejný. Každé skiip'ně krys se orálně podává testovaná sloučenina, kterou jo · dvojsodná sůl N-2‘-karboxyfenyM-chloranthramlové kyseliny, v · dávce uvedené v tabulce 5, vždy jednou denně po dobu 1 týdne počínaje 17. dnem po· sensitizaci. Stupeň otoku zadních tlapek se měří každý druhý nebo třetí den od podání testované sloučeniny až do 31. dne po sensitizaci. Jako hodnoty pro vyhodnocení farmakologického účinku se používá snížení objemu zadních tlapek. Výsledky jsou uvedeny na obr. ·

1. Zjistí se, že podáním testované sloučeniny v dávce 5 nebo 10 mg/kg se dosáhne výrazného účinku při · léčení uměle vyvolané arthritis u krys.

Výsledky statistického testu provedeného za použití hodnot získaných 24. a 31. den po sensitizaci jsou uvedeny v tabulce 5.

jako v tabulce 2

c) Účinek na eereci biiliubinu

5,1+0,2 ** (P<0;02)

210859

Tabulka 5

Dávka f mg/kg)	24	31
den po sensitizaci

kontrolní

0,1

100

3,693+0,130 (ml)

3,524+0,170

3,214+0,161

3,175+0,100**

3,027+0,126**

3,350+0,168

3,646+0,170 (ml)

3,762+0,216

3,289+0,223

3,102+0,141*

3,121+0,176*

3,482+0,170 * výrazný účinek: Studentův T-test (₽<0,05) založený na střední hodnotě ** výrazný účinek: Studentův T-test (P<0,01) založený na střední hodnotě

Experiment 4

Účinek při léčení modelové autoimunní choroby

Farmakologický účinek testované sloučeniny, kterou je dvojsodná sůl N-2‘-karboxyfenyl-4-chloranthranilové kyseliny, se sleduje na modelové autoimunní chorobě, kterou je glomerulonefritis Novozélandských myších samic (Black/White Fi). Zkušební zvířata se rozdělí do skupin vždy po 8 a orálně se jim podává testovaná sloučenina v dávce 5 nebo 50 mg/kg za den, od stáří 8 týdnů. Vývoj choroby se sleduje měřením hladiny bílkoviny v moči pomocí zkušebního papírku Combistix (Ames Co., Inc.). Zjistilo se, že vyhodnocení pomocí zkušebního papírku je v dobrém souladu s výsledky získanými kvantitativní analýzou za použití metody s kyselinou sulfosalicylovou. Rozdíly střední hodnoty hladiny bílkoviny v moči u každé ze skupin v období od stáří 20 týdnů do stáří 35 týdnů u myší jsou ukázány na obr. 2. Z obr. 2 je zřejmé, že hladina bílkoviny v moči u kontrolních živočichů značně vzroste v době okolo 27 týdnů od narození, zatímco u všech skupin, kterým byla podána testovaná sloučenina, má hladina bílkoviny v moči poměrně stálou hodnotu. Sloučenina podle vynálezu vykazuje tedy výrazný farmakologický účinek při potlačování autoimunní; glomeruloneftrltis. Kromě toho 3 z 8 myší vjkontrolní skupině pošly v období od 35 do 40 týdne od narození na glomerulonefritis, zatímco ve skupinách, kterým byla podána testovaná sloučenina, nepošla žádná.

Experiment 5

Protinádorový účinek u transplantovaných nádorových buněk (Sarcoma-180)

Zkušební zvířata, kterými jsou myší samci (ddY) o hmotnosti 20 až 25 g, se rozdělí do skupin po 9 nebo 10 jedincích. Každé z myší se transplantuje do paty zadní tlapky subkutánní injekcí 10⁶ nádorových buněk, aby se vyvolal pevný nádor. Zkušební sloučenina, dvojsodná sůl N-2‘-karboxyfenyl-4-chlorantranilové sloučeniny, se podává orálně jednou denně po 11 dnů ode dne transplantace. 14 dnů po transplantaci se každé myši odebere narostlá nádorová tkáň a stanoví se její hmotnost ve vlhkém stavu. Tato hodnota slouží pro charakterizaci protinádorového účinku testované sloučeniny. Výsledky jsou zřejmé z obr. 3. Dávka 10 mg/kg, vykazuje výrazný účinek na potlačení růstu nádoru. Testovaná sloučenina nepotlačuje růst stejných nádorových buněk „in vitro“ a nemá žádný protinádorový účinek přímo na buňky. Proto se předpokládá, že testované sloučeniny mají účinek zprostředkovaný přímo hostitelským organismem.

Experiment 6

Protinádorový účinek u transplantovaných rakovinných buněk (AH-13)

Jako zkušebních zvířat se použije samic krys (Donryu) o stáří 8 týdnů. Krysy se rozdělí do skupin vždy po 10 jedincích. Každé kryse se intraperitoneálně podává dvojsodná sůl N-2‘-karboxyfenyl-4-chloranthranilové kyseliny, jako testovaná sloučenina, jednou denně po dobu celkem 10 dnů, počínaje 16. dnem před inokulaci nádorovými buňkami. 16 dnů po prvním podání testované sloučeniny se každé kryse intraperitoneálně inokuluje 10⁶ nádorových buněk AH-13, čímž se vyvolá abdominální rakovina. Průměrná doba přežití (dny) u krys po inokulaci nádorových buněk je uvedena v tabulce 6. Je zřejmé, že podáním testované sloučeniny v množství 50 mg/kg se dosáhne protinádorového účinku zprostředkovaného hostitelským organismem.

Tabulka 6

Dávka (mg/kg) Doba přežití (dny) Průměrná doba

T/K* (%) přežití dny

200	7	7	7	6	7	6,9	97
	7	8	6	7
100*	7	6	6	7	7	7,3	103
	6	6	13
50	7	13	11	15	11	11,6	163
	17	8	10	12	12
kontrolní	6	7	7	7	7	7,1	100
	7	6	7	11	6
* Τ/Κ ^f °/o )	__ průměrná doba průměrná doba	přežití v přežití v	testované skupině kontrolní skupině	X 100

Experiment 7

Účinek při podporování blastogenese lymfocitů (aktivace cellulární imunity)

V tomto experimentu se studuje vliv testované sloučeniny, kterou je dvojsodná sůl N-2‘-karboxyfenyl-4-chloranthranilové kyseliny, na blastogenesi lymfocitů za použití buněk ze sleziny a lymfonoidních buněk myší a krys. Pro test in vitro se používá myších samců kmene CsH/He a pro test in vivo krysích samců kmene Wistar-Imammichi. Při testu in vitro se jako blastogenetického faktoru používá Concanavallinu A, ·(Sigma) a lymfocity se kultivují za použití média RPMI 1640 vyráběného firmou Grand Island Biological Co. Kultivace lymfocitů se provádí v prostředí při 37 °C v atmosféře 5°/o kysličníku uhličitého po dobu asi 48 hodin pak se přidá 0,5 μ Ci/ml ³H-thymidinu, buňky se v prostředí inkubují 16 hodin a pak se lymf-ocity oddělí.

Radioaktivita oddělených buněk se měří scintilačním počitadlem a zjištěná hodnota se považuje za indikátor stupně blastogenese. Při provádění testu in vivo se postupuje· obdobně jako při testu in vitro, přičemž každé kryse se orálně podá testovaná sloučenina v dávce 5 nebo· 50 mg/kg. V tomto· případě se krysy, kterým byla podána testovaná sloučenina, rozdělí do skupin po 3 jedincích a buňky, které se mají kultivovat z krys se v každé skupině udržují za stejných kultivačních podmínek. Výsledky pokusů jsou zřejmé z obr. 4 (in vitro) a obr. 5 (in vivo-).

Obr. 4 jasně ukazuje, že testovaná sloučenina podle vynálezu v koncentraci TO'¹ · až 10^_2 ,zg/ml zlepšuje aktivitu Concanevallinu A. Obr. 5 ukazuje, že slezinové buňky a lymfocity krys, kterým byla podána den před podáním ConcanavaHinu A testovaná sloučenina, vykazují SI hodnotu asi dvakrát vyšší než buňky z krys kontrolní skupiny, a že aktivita ConcanavaHinu A se zvýší na asi dvojnásobek ve srovnání s aktivitou u kontrolní skupiny. U skupin krys nebo myší, kterým byla podána testovaná sloučenina 4 dny před podáním nebo přídavkem Concanavallinu A, je rovněž zřejmé zlepšení aktivity, ale stupeň zlepšení aktivity je nižší, poněvadž testovaná sloučenina byla přidána nebo podána dříve.

Ze shora uvedených výsledků je možno učinit závěr, že testovaná sloučenina zlepšuje blastogenesi lymfocitů založenou na ConcanavaHinu A, a to nejen in vitro, ale rovněž in vivo a že posiluje cellulární imunitu.

Experiment 7

Účinek na posilování Imunologické reakce u normálních živočichů (účinek při ochraně proti bakteriální infekci)

Jako zkušebních zvířat se používá myších samců (Sprague Dawley) o hmotnosti 200 až 220 g, kteří se rozdělí do 7 skupin vždy po 5 nebo 6 jedincích.

Krysám · v šesti skupinách se orálně jednorázově podá testovaná sloučenina, kterou je N-2‘-karboxyfenyl-4-cliloranthranilová kyselina v dávce 100 mg/kg. Testovaná sloučenina se podává jednotlivým skupinám v šesti různých termínech a to jeden den před sensitizací, v den sensitizace, jeden den po, · dva dny po, tři dny po a čtyři dny po sensitizaci, přičemž sensitizace se provádí za použití červené krevní buňky ovce (SRBC), jako· antigenu.

SRBC se injikuje krysám intravenózně dO' ocasní žíly v množství 1 ml jako · 2% vodná suspenze. U kontrolních skupin se použije v den sensitizace fyziologického solného· roztoku ve stejném množství a stejným způsobem jako u testovaných skupin.

dnů po sensitizací se krysy usmrtí a vyjme se z nich slezina a analyzuje se krev.

Počet buněk vytvářejících destičky se stanovuje Jerneho· metodou a titr protilátky se stanovuje hemolytickou metodou.

Výsledky jsou uvedeny v tabulkách 7 a 8.

Tabulka 7

Zvýšení poetu buněk tvořících destičky

Doba podání (den) vztažená k sensitizaci

Počet buněk tvořících destičky na 10⁶ buněk

Počet buněk tvořících destičky na 106 buněk

— 1	93,2 + 28,6
0	193,4 + 26,6 ‘»(P< 0,01)
+ 1	316,8 + 38,2 **(P<0,01)
+ 2	76.5 + 16,3
+ 3	101,0 + 11,2
+ 4	95.5 + 35,3
kontrolní	49,7 + 16,0

** velmi výrazný účinek

Tabulka 8

Titr protilátky v krvi

Doba podání (den) vztažená k sensitizaci Doba podání k sensitizaci (den) vztažená

Konečné zředění ukazující hemolýzu Konečné zředění ukazující hemolýzu — 1 + 1 + 2 + 3 + 4 kontrolní

29.5

210.8 * (p<o,O5)

213 ** (p<0,01)

29.5

29.8

28,7

29,0 * výrazný účinek ** velmi výrazný účinek

Tabulka 7 ukazuje, že dojde k výraznému zvýšení počtu buněk tvořících destičky, když se krysám podá testovaná sloučenina v děn sensitizace nebo den po ní. Přírůstek dosahuje asi šestinásobku této hodnoty u kontrolní skupiny.

Tabulka 8 ukazuje výrazné zvýšení titru v krvi, když se krysám podá testovaná sloučenina v den sensitizace SRBC nebo den po ní.

Experiment 9 dnů. Tři dny . po prvním podání se provede sensitizace antigenem, kterým je červená krevní buňka ovce (SRBC) tak, že se antigen injikuje do· ocasní žíly myši. Každé myši se den po· sensitizaci podá orálně testovaná sloučenina, kterou je dvojsodná sůl N-2‘-karboxyfenyl-4-chloranthranilové kyseliny. 5 dnů po sensitizaci se obvyklým způsobem určuje počet buněk tvořících destičky (PFC) ve siezině. Výsledky jsou uvedeny na obr. 6.

Počet PFC ve slezině myší ve skupině ošetřené samotným kortizonem se sníží na třetinu ve srovnání s kontrolní skupinou, které nebyl podán kortizon. Na druhé straně počet PFC ve skupině, které byla podána testovaná sloučenina v dávce 10 mg/kg, velmi značně vzroste. Výsledky jasně ukazují, že testovaná sloučenina působí tak, že likviduje účinek kortisonu na potlačení imunity a způsobuje regeneraci vyčerpané imunity.

Titr protilátky v krvi stanovený hemolytickou metodou je zřejmý z tabulky 9.

Tabulka 9

Ošetření Ti'tr protilátky * * ^**
bez ošetření	1012
kortison	103
kortison + testovaná sloučenina (10 mg/kg)	10^J9
koťtison. + testovaná sloučenina (50· mg/kg)	10⁶
* titr protilátky v krvi je určen stupněm zředění při 50% hemolýze.
Experiment 10

Účinek při zlepšování baktericidní schopnosti u neutrocytů (účinek spočívající v ochraně před bakteriální infekcí)

Jako zkušebních živočichů se použije samců bílých králíků kmene JW/CSK o hmotnosti 3,0· až 3,9 kg, kteří se rozdělí do skupin po pěti jedincích. Každému králíkovi se orálně podá jako testovaná sloučenina dvojsodná sůl N-2‘-karboxyfenyl-4-chloranthranilové kyseliny v dávce 100· mg/kg a 24 hodin po podání se nechá neutrocyt v krvi periferních cest reagovat s nitrobluetetrazoriem (NBT) a pak se pod mikroskopem stanoví podíl buněk k formazanu. Za kontrolní hodnotu se považuje hodnota získaná od stejného zvířete 3 dny před podáním testované sloučeniny.

Výsledky jsou uvedeny v tabulce 10.

Výsledky ukazují, že podíl neutrocytových buněk pozitivních k formazanu se výrazně zvýší při ošetření testovanou sloučeninou,

Účinek při regeneraci vyčerpané imunity (účinek při ochraně proti bakteriální infekci)

Jako zkušebních živočichů se použije myších samců kmene IV CS o stáří 5 týdnů, kteří se rozdělí do skupin po 5 jedincích.

Každé myši se intraperitoneálně podává kortison v dávce 60 mg/kg jednou denně po · 5 i

a že testovaná sloučenina zlepšuje baktericidní schopost - neutrocytu.

Tabulka 10

Ošetření NBT hodnota * (%) před ošetřením testovanou sloučeninou 11,4 + 1,8 po ošetření testovanou sloučeninou 33,3 ±7,8 * ( P<0,05) * NBT hodnota je uvedena jako „průměr + + standardní odchylka“.

Jako zkušebních zvířat se použije myších samců ddY o stáří 5 týdnů, kteří se rozdělí do -skupin o 7 členech. - Každé myši se intraperitoneálně inokuluje bucillus pyocyaneus, Psendomonas aerugino-sa Pa-П. Testovaná sloučenina, kterou je- dvojsodná sůl N-2‘-karboxyfenyl-4-chloranthranilové kyseliny se podává orálně jednou za den - v dávce 2 mg/hlavu - 6, 5, 4 a 1 den před inokulací a po dobu 54 hodin po inokulaci se -sleduje doba přežití. Při inokulaci 2 X 105 bakterií na hlavu se zjistí aktivita -testované sloučeniny při ochraně proti bakteriální infekci. Je zřejmé, že testovaná sloučenina snižuje množství bacillárního toxinu.

Experiment 11

Účinnost při ochraně před infekcí způsobenou Bucillus pyocyaneus

Tabulka 11

Počet inkulovaných bakterií (počet na hlavu)

Kontrolní doba přežití počet (hod.) uhynulých zvířat/ /počet zkušebních zvířat

Testovaná sloučenina doba přežití počet (hod.) uhynulých zvířat/ /počet zkušebních zvířat

2 X 10®	22, 24, 24, 24, 24,	7/7	24, 24, 24, 24, 24,	7/7
	26, 26		29, 29
2 X 105	45, 45, 45, 45, 48,	6/7	46, S, S, S, S,	1/7
	52, S		S, S
2- X 104	52, S, S, S, S, S, S	1/7	s, s, s, s, s, s, s	0/7

10,48

1Q5.7

LDso (počet na hlavu)

S: Živá zvířata 54 hodin po inokulaci bakteriemi.

Experiment 12

Účinnost při ochraně před infekcí způsobenou Bucillus pyocyaneus

Jako zkušebních - zvířat se použije myších samců ddY o stáří 5 týdnů, kteří se rozdělí do skupin o 9 členech. Každé myši - se - intraperitoneálně podá 10® bakterií - Pseudomonas aeruginosa Pa-II a 1,5 hodiny po podání se jim subkutánně podá jednorázová dávka antibiotika karbenicillinu. Testovaná - látka, dvojsodná sůl N-2‘-karboxyfenyl-4-chloranthranilové kyseliny, se podává jednou denně v dávce 2 mg/hlavu, a to jeden a - dva dny před inokulací.

Aktivita - testované sloučeniny se - vyhodnocuje na základě sledování zkušebních zvířat po dobu 54 hodin no - inokulaci. - Výsledky jsou uvedeny v tabulce 12. Výsledky testu ukazují, že za použití antibiotika s -testovanou sloučeninou se dosahuje zlepšeného baktericidního účinku.

Tabulka 12
Dávka karbenicillinu	Poče zvířat která přežila/počet zkušebních zvířat
(mg/hlavu)	karbenicillin	karbenicillin + testovaná
		sloučenina
40	9/9	9/9
20	2/9	7/9
10	0/9	4/9
ED05 (mg/hlavu)	24,1	10,4

Experiment 13

Aktivita při ochraně před infekcí způsobenou Salmonellae

Jako zkušebních zvířat se· použije myších samců kmene ddY o stáří 5 týdnů, kteří se rozdělí do 7 skupin po· 7 členech. Každá· myš se intraperitoneálne inokuluje 10⁵ bakteriemi Salmonella enteritidis TO-1 a 3 hodiny po inokulaci se subkutánně podá jednorázová dávka streptomycinu 0,5 mg/hlavu. Testovaná sloučenina, kterou je dvojsodná sůl N-2'-karboxyfenyl-4-chloranthranilové kyseliny se podává orálně v dávce 2 mg/hlavu v· pěti různých dnech, a to tři dny, dva dny a jeden den před· inokulaci, v den inokulace a· den po inokulaci. Výsledky jsou uvedeny v tabulce · 7.· Výsledky ukazují, že za použití antibiotika s testovanou sloučeninou se dosáhne zlepšeného baktericidního účinku.

Experiment 14

Aktivita při ' léčení alergické reakce (systém s tvorbou IgE) (účinek proti bronchiálnímu asthmatu)

Jako · zkušebních zvířat se použije myších samců (Wistar-Imamichi) o stáří · 7 týdnů, kteří se rozdělí do skupin po 5 jedincích. Každá krysa se sensitizuje antigenem, · kterým je bílkovina z ascaris, vázaná ke zbytku dinitrofenolu (DNP-AS), za · spolupoužití vakcíny pertussis, jako pomocné látky, · které se subkutánně podá do zad zvířete. 3 hodiny po intravenózním vstřiknutí antigenu a roztoku Evansovy modři vyvolávajícího imunologickou reakci se stanovuje titr IgE · protilátky.

Zvíře se před sensitizací ozáří rentgenovým zářením v dávce 400 roentgenů. Testovaná sloučenina se podává orálně jednou denně po· dobu 15 dnů až 30 dnů od sensitizace. Titry IgE protilátky stanovené 17., , 20.,

24. a 30. den po sensitizací, které se stanoví kutánní reakcí založenou na pasivní kutánní anafylaktické reakci, jsou ukázány na obr. 8. Výsledky jasně ukazují, že testovaná sloučenina potlačuje vznik IgE protilátky a může se · jí použít k radikálnímu léčení alergických _ chorob.

Experiment 15

Akutní toxicita

Akutní toxicita N-2‘-karboxyfenyl-4-chloranthranilové kyseliny se stanoví za použití samců a samic krys (Wistar-Imamichi) o stáří 11 týdnů, jako zkušebních zvířat. Testovaná sloučenina se podává orálně ve formě suspenze v 5% vodném roztoku arabské gumy. Výsledky jsou tyto:

Pohlaví zvířete LDso samec 2,100 ir^g//l<g samice 2,600 mg/kg

Příklad 1

Do- 500- ml tríhrdlé baňky s kulatým dnem, vybavené mechanickým míchadlem a kondenzátorem, se předloží isoamylalkohol (250 ml), kyselina 2,4-dichlorbenzoová (12 gramů), kyselina anthranilová (17,5 g) uhličitan draselný · (18 g), práškovité měď · (500 miligramů) a velmi malé množství jodu a směs se za míchání 5 hodin vaří pod refluxem. · Reakční směs se · nechá zchladnout · na teplotu · místnosti, · přidá se voda (500· ml) · a směs se přefiltruje. · Filtrát se zahustí za sníženého tlaku, přičemž se přidá voda, aby se odstranil isoamylalkohol, pak se ochladí v lázni z ledu a vody a okyselí 6 N kyselinou chlorovodíkovou. Vysrážené krystaly se oddělí, suspendují v ethanolu a suspenze se 3 až 4 hodiny vaří pod refluxem a pak se ochladí. Vysrážené krystalky se odfiltrují, rozpustí v tetrahydrofuranu, k roztoku se přidá aktivní uhlí a pak se zahřívá 4 až 5 hodin pod refluxem. Aktivní uhlí se oddělí a z roztoku se za sníženého tlaku odpaří tetrahydrofuran. Výsledný zbytek se znovu suspenduje v methanolu, suspenze se vaří 3 až 4 hodiny pod refluxem a pak se nechá zchladnout na teplotu místnosti, aby se vysrážely krystaly. Získané krystaly se odfiltrují a získá se 14 g N-2’-karboxyfenyl-4-chloranthranilové kyseliny o teplotě tání nad 306 °C.

Pro CuHioCINOí vypočteno:

57,64 % C, 3,45 % H, 4,80 80 N;

nalezeno:

57,8.1 % С, 3,39 % Η, 4,50 ^ο/θΝ.

Příklad 2

Opakuje se postup podle příkladu 1 za použití 2,4-dichlorbenzoové kyseliny a 5-methylanthranilové kyseliny. Získá se N-2‘-karboxy-4’-methyIfenyl-4-chloranthranilová kyselina, která má teplotu tání 316 až 318 °C (rozklad). Výtěžek je 71,5 %.

Pro C15H12CINO4 vypočteno:

58,93 % C, 3,95 % H, 4,58 %N; nalez e n o *

58,98 % C, 3,89 % H, 4,58 % N.

P ř í к 1 a d 3

Opakuje se postup podle příkladu 1 za použití 2-chlorbenzoové kyseliny a 5-methylanthranilové kyseliny. Získá se N-2‘-karboxy-4’-methylfenylanthranilová kyselina, která má teplotu tání 304 °C (výtěžek 72 %).

Pro CizHlsNOt vypočteno:

66,41 % C, 4,83 % H, 5,16 % N; nalezeno:

66,71 % C, 4,78 % H, 5,14 % N.

Příklad 4

Opakuje se postup podle příkladu 1 za použití 2,4-dichlorbenzoové kyseliny a 3-methylanthranilové kyseliny. Získá se N-2‘-karboxy-6’-methylfenyl-4-chloranthranilová kyselina o teplotě tání 302 až 304 °C (rozklad). Výtěžek 66 %.

Pro C1SH12CINO4 vypočteno:

58,93 % C, 3,95 % H, 4,58 % N; nalezeno:

58,87 % C, 4,04 % H, 4,59 % N.

P ř í к 1 a d 5

Opakuje se postup podle příkladu 1 za použití 2,4-dichlorbenzoové kyseliny a 4-chloranthranilové kyseliny. Získá se N-2‘-karboxy-5‘-chlorfenyl-4-chIoranthranilová kyselina, která má teplotu tání nad 340 °C. Výtěžek 59 %.

Pro C14H9CI2NO4 vypočteno:

51.55 % C, 2,78 % H, 4,29 %N; nalezeno:

51.56 % C, 2,87 % H, 4, 27 % N.

Příklad 6

Opakuje se postup podle příkladu 1 za použití 2,4-dichlorbenzoové kyseliny a 3,6 dimethylanthranilové kyseliny. Získá se N-2‘-karboxy-3‘,6‘-dimethylfenyI-4-chIoranthranilová kyselina, která má teplotu tání 283 °C. (Výtěžek 45 %).

Pro C16H14CINO4 vypočteno:

60,10 % C, 4,41 %H, 4,38 % N; nalezeno:

60,24 % C, 4,42 % H, 4,39 % N.

P ř í к 1 a d 7

Opakuje se postup podle příkladu 1 za použití 2-chlorbenzoové kyseliny a 4-chlor-3-methylanthranilové kyseliny. Získá se N-2‘-karboxy-5‘-chlor-6‘-methylfenylanthranilová kyselina, která má teplotu tání 315 °C. (Výtěžek 65 %).

Pro Ci5Hi'2ClNO4 vypočteno:

58,93 % C, 3,95 % H, 4, 58 % N;

1Ί Я I P7PΠ П ’

59,07 % C, 3,97 % H, 4,60 % N.

Příklad 8

Opakuje se postup podle příkladu 1 za použití 2,5-dichlorbenzoové kyseliny a anthranilové kyseliny. Získá se N-2‘-karboxyfenyl-5-ch!oranthranilová kyselina, která má teplotu tání 310 °C. (Výtěžek 60 %).

Pro CiiH:oClNOi vypočteno:

57,64 % C, 3,45 % H, 4,80 % N; nalezeno:

57,78 % C, 3,52 % H, 4,61 % N.

Příklad 9

Isoamy laik ohol (50 ml), 2,4-dichlorbenzoová kyselina (2,4 g), anthranilová kyselina (3,5 g), bezvodý uhličitan draselný (3,6 g) a práškovitá měď (0,4 g) se předloží do 200 mililitrové baňky vejčitého tvaru a směs se vaří pod refluxem za míchání míchadlem po dobu 5 hodin. Po skončení reakce se reakční směs ochladí na teplotu místností, ke směsi se přidá voda a výsledná směs se za odsávání přefiltruje.

К filtrátu se přidá voda a pak se filtrát zbaví isoamylalkoholu zahuštěním za sníženého tlaku a okyselí se 6 N kyselinou chlorovodíkovou, aby se vysrážely krystaly. Od210659 dělené krystaly se rozpustí v tetrahydrofuranu, roztok se přečistí aktivním uhlím, pak se aktivní uhlí oddělí a roztok se zahustí, aby se odstranil tetrahydrofuran. Ke zbytku se přidá methanol, roztok se vaří pod refliixem a pak ochladí na teplotu místnosti. Získá se 1,1 g N-2‘-karboxyfenyl-4-chloranthranilová kyselina ve formě žluté amorfní látky. Teplota tání nad 340 °C. Tento produkt je totožný s produktem podle příkladu 1.

Příklad 10

N-2‘-karboxyfenyl-4-chloranthranilová kyselina (110 g) se rozpustí v roztoku hydro• xidu sodného (30 g) ve vodě (2 litry) а к roztoku se přidá ethylalkohol. Získá se 88 g sodné soli N-2‘-karboxyfenyl-4-chloranthranilové kyseliny, která má teplotu tání 388 ^aC , (rozklad).

Pro CnHeNazCINCh vypočteno:

59,09 % C, 2,40 % H, 4,17 % N; nalezeno:

49,87 % C, 2,26 % H, 4,07 % N.

Přikladli

Farmaceutické preparáty

a) Tablety . Práškovitá N-2‘-karboxyfenyl-4-chloraiithranilová kyselina (100 g) se důkladně prOmísí s laktózou (46 g), mikrokrystalickou celulózou (27 g), kukuřičným škrobem (5 g) a stearanem hořečnatým (2 g) a výsledná směs se na tabletovacím stroji zpracuje na tablety v průměru 8 mm a hmotnosti 180 mg.

b) Tablety

Práškovitá N-2‘-karboxy-4‘-methylfenyl-4-chloranthranilová kyselina (200 g) se prošije sítem 50 mesh a pak smísí s laktózou (173 g) a vápenatou solí karboxymethylcé' lulózy (20 g). Směs se prohněte a výsledné těsto se granuluje v granulátu a granule se usuší.

Granule se nechají projít sítem 14 mesh » a po přidání a promísení se stearanem hořečnatým (3 g) se směs zpracuje na tablety o průměru 8 mm a hmotnosti 200 mg.

c) Prášek

Laktóza (149 g) a stearan hořečnatý (1 g) se důkladně pnomísí s práškovitou N-2‘-karboxyfenyl-4-chloranthranilovou kyselinou (250 g) na prášek.

d) Kapsle

Laktóza (358 g) a stearan hořečnatý (2g) se přidá к práškovité N-2‘-karboxyfenyl-4-chloranthranilové kyselině, směs se důkladně promísí a naplní se jí tvrdé želatinové kapsle. Hmotnost kapsle je 65 mg, hmotnost práškovité směsi v ní uložené je 230 mg.

e) Granule

Práškovitá N-2‘-karboxy-5‘-chlorfenyl-4-chloranthranilová kyselina se nechá projít sítem 50 mesh a pak se 200 g tohoto produktu smísí s laktózou (173 g) a vápenatou solí karboxymethylcelulózy (28 g). Směs se prohněte s pastou, vyrobenou z kukuřičného škrobu (4 g) a vody a výsledné těsto se granuluje v granulátoru a granule se usuší. Granule se nechají projít sítem 14 mesh.

f) Suspenze

Krystalická celulóza (10 g) a sodná sůl karboxymethylcelulózy (0,75 g) se suspenduje v roztoku (400 ml) 200 g sacharózy za vzniku jednotné suspenze. Odděleně se N2‘-karboxyfenyl-4-chloranthranilová kyselina (5 g) zpracuje na prášek společně se sacharózou (0,5 g) a vodou (20· ml) v kulovém mlýně. К prášku se přidá původně vyrobená suspenze, pak se přidá voda do· celkového objemu 500 ml. Směs se rozmíchá, aby se zhomogenizovala.

g) Parenterální injekce

Přečištěná sodná sůl kyseliny N-2‘-karboxyfenyl-4-chlorathranilové kyseliny (10 g) a chlorid sodný (9 g) se rozpustí v destilované vodě pro injekční roztoky a destilovanou vodou se celkový objem upraví na 1 litr. Roztok se přefiltruje za odsávání přes skleněnou fritu (G4) a pak se jím naplní 2 ml průhledné injekce. Injekce se zataví a 30 minut sterilizují teplem při 100 °C.

Claims

PŘEDMĚT VYNÁLEZU

1. Způsob přípravy derivátů aminobenzoové kyseliny o-becného vzorce I (I) kde každý ' ze symbolů

Ri a R? které jsou stejné nebo různé, představuje - atom, ' vodíku, atom halogenu nebo alkylový zbytek obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, vyznačený tím, že ' se derivát 2-halogenb'enzoové kyseliny obecného vzorce II

COOH

Cl . (II) kde

Ri má shora uvedený význam- a

X představuje atom halogenu nechá při teplotě 80 až 200 °C . reagovat se sloučeninou obecného vzorce III kde

Ri a Rž mají shora uvedený význam- a v přítomností alkalické látky a látky . zvolené za souboru zahrnujícího kovy, sloučeniny kovů a jod a sloučeniny obsahující jod, jako katalyzátoru.
2. Způsob podle - bodu 1, vyznačený- tím, že se reakce provádí po dobu 1 až 10- hodin.
3. Způsob podle bodu 1, vyznačený- tím, že se reakce provádí . při 120 až 150 °C . pp dobu 3 až 5 hodin.
4. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že se jako rozpouštědla používá rozpouštědla zvoleného ze - skupiny . zahrnující Isoamylalkohol, - --dimethyl- ;