CN1929869A - 用于诊断和治疗癌症的磷脂类似物 - Google Patents

Abstract

在一个优选的实施方案中，本发明提供了检测和定位患有或怀疑患有癌症的受试者中如下癌症的方法：肺癌、肾上腺癌、黑色素瘤、结肠癌、结肠直肠癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌、皮下癌、肠癌、肝细胞癌、成视网膜细胞瘤、宫颈癌的方法。此方法包括以下步骤：(a)向受试者给予磷脂醚类似物；和(b)测定受试者的怀疑具有癌症的器官与周围区域相比是否保持较高水平的所述类似物，其中较高保留区域表明癌症的检测和定位。在另一个实施方案中，本发明提供了治疗受试者中癌症方法。包括给予有效量的含磷脂醚类似物的分子。

Description

用于诊断和治疗癌症的磷脂类似物

                      相关申请

本申请请求2004年3月2日提交的美国临时申请60/521,166的优先权，为所有目的通过引用将该临时申请并入本文。

                      发明背景

本发明一般涉及肿瘤的诊断成像，特别涉及采用磷脂类似物的肿瘤的诊断成像。

癌症的早期检测一直是现代成像技术的主要目标之一，因为在局限阶段可疑肿瘤的鉴定显著地增加了成功治疗和消除癌性组织的机会。因此设计了大量的成像策略，使用多种技术和模式，以帮助医生尽可能早地作出准确的诊断。

不幸地的是，传统的成像技术如计算机断层扫描术(CT)和MRI(磁共振成像)受到它们提供可疑病变的结论性诊断能力的限制，因为它们仅能够观察到组织的密度或形态学上的差别。为提供确定的诊断，经常需要更加侵入性和高成本的活组织检查方法。相反，核医学技术如正电子成像术(PET)和单光子发射体层摄影术(SPECT)可以提供关于特定器官或目标部位的机能或生物化学信息。然而，这些核成像技术的成功在很大部分上取决于适合的放射性药物的选择性摄取和检测。选择性摄取又取决于对靶组织具有高度专一性的放射性药物的开发。不幸地的是，因此为肿瘤学应用开发的肿瘤-定位剂仅有有限的应用。

例如，这些现有技术化合物之一，柠檬酸镓⁶⁷Ga，当初通过其在肿瘤组织中蓄积的能力来鉴别。不幸地的是，柠檬酸镓⁶⁷Ga也被多种其它非癌性病变吸收，包括炎性病变，并且不可接受量的放射性也可以在肝和脾组织中累积。在这些器官中放射性药物的快速聚集可严重地干扰附近病变的成像，并且还消极地影响可安全地给予患者的剂量。

可替代的方法是发展定向于肿瘤-特异性抗原的放射性标记的单克隆抗体(Mabs)。然而，这些单克隆抗体仅对产生它们的特定肿瘤组织有特异性，因此将不会普遍地集中在肿瘤组织中。而且，Mabs用于诊断成像的用途产生了另外的问题，包括抗原表达的程度不同、低的肿瘤摄取、非特异性结合和不利的免疫原性反应。

在解决这些问题的尝试中，本发明人近来鉴别和开发了一系列新化合物，它们证实了有用的肿瘤特异性。参见，例如美国专利第4,925,649、4,965,391、5,087,721、5,347,030和6,417,384号，通过引用将它们全部并入本文。据认为，这些放射性碘化的磷脂醚类似物利用了恶性肿瘤细胞的独特生物化学特性；即，相对于相应的正常组织，在肿瘤细胞膜上有大浓度的天然存在醚类脂。尽管还不完全了解准确的作用机理，但占主流的假说是磷脂醚类似物受陷于肿瘤膜上。因此，这些化合物集中于肿瘤组织中并原地保留用于诊断和/或治疗应用。

在上述专利中描述的放射性标记的磷脂醚类似物的选择性滞留已在多种啮齿动物和动物肿瘤异种移植物中得到了证明，但未在被认为更接近模拟人类疾病的自发性肿瘤模型中得到证明。不幸地的是，从这些研究中获得的数据还证明放射性药物化合物从血液中相对快速的清除，以及被非靶组织的不期望蓄积。如上所注释的，非靶组织摄取可以通过产声高背景活性或引起放射敏感性组织过度暴露于所注射的放射活性，而减少放射诊断成像的功效。

因此，在本领域中对具有如下特征的放射性药物存在显著需求，该放射性药物表现出从非靶组织中的快速清除率，以及在血浆中的延长半衰期，同时仍保持它对肿瘤组织的特异性和活性。这样的药剂不但应该有助于原发性肿瘤的非侵入性成像，而且还应该起恶性肿瘤组织的位点特异性根除的细胞毒剂的载体的作用，特别是因为其涉及癌症的最常见诊断形式。进一步合乎需要的是，放射性药物对恶性肿瘤是选择性的，而对包括腺瘤和增生的癌变前组织则不是选择性的。

在美国每年有大约147,000例结肠直肠癌的新病例得到诊断。因此，结肠直肠癌是第四最常见的癌症，每年60,000人因此死亡。¹治疗主要取决于癌症阶段，但是可以包括外科手术、辐射、化学疗法和/或射频或冷冻消融。然而，对结肠直肠癌患者的常规随访中，癌胚抗原(CEA)、结肠直肠肿瘤标记的测定，以及重复的结肠镜检查⁵在超过50％患者未能检测出复发性疾病。⁶因此，对开发另外的检测复发性疾病的方法存在需求。再有，在使用CT扫描和RF消融治疗和诊断期间，从CT扫描中难以获得机能信息。用对比增强的螺旋CT，在一定程度上可以评价肿瘤血管分布，但是没有办法准确测定能生存的肿瘤细胞是否还保留在RF损伤中。此外，由RF产生的热损伤通常在操作CT扫描后具有环绕它们的炎症边缘，直至操作后6个月。一直使用PET扫描来跟踪消融后的患者，但是环绕RF热损伤的炎症边缘通常显示出增加的吸收，甚至在不存在能生存的肿瘤的情况下。这降低了再发性肿瘤的早期检测的灵敏度和专一性。因此，如NM404那样对恶性瘤细胞具有选择性并且恶性瘤细胞不明确保持的药剂是优选的，不同于FDG，其对肿瘤细胞没有选择性并且引发传染性位点和增生(Barret′s Esophagus)。而且，如同含有¹²⁴I的NM404的化合物，其具有4天的物理半衰期并且可以运送到世界上的任何地方，与具有110分钟的半衰期因此仅可以有限地分布在产地200英里范围内的FDG相比是优选的。此外，如同经受延长的滞留(没有被代谢)的NM404的化合物是优选的，因为更有可能的是，当与适合的放射性同位素如¹³¹I配合时，它们具有显著的治疗潜力。还有，虽然在非常低的灵敏度水平，象NM404的化合物与FDG相比是优选的，象NM404的化合物可以用多种碘同位素标记而且具有扩展的多功能性(诊断和治疗以及作为实验动物研究的工具)，而FDG仅限于用于PET扫描的¹⁸F，或者可能用于磁共振成像的¹⁹F(稳定的)。不论其肿瘤靶向能力，FDG由于其在肿瘤细胞内的快速代谢，没有治疗潜力。因此，需要其它的化合物来研究RF后的局部复发。同样地，如果通过局部肿瘤的进行或复发肿瘤变成转移性的，则杂交成像方式(PET和CT组合)，取代操作后单独CT和PET扫描，是非常理想的。

此外，即使当化疗是治疗的模式时，改进对化疗反应的监测是也必需的。因此，理想的是开发研究对化疗反应的早期标记，使医生能够快速中止使用无效的化疗方案，而不使患者暴露在延长治疗的毒性下。当外部射线辐射治疗是患有相似组织学的肿瘤的患者的可替代治疗时，肿瘤对治疗为目的的外部辐射治疗(XRT)可能具有显著不同的反应。用手术前辐射治疗的某些直肠癌患者，将具有完全性反应，而具有相似组织学(在光学显微术水平)的其它患者对治疗的反应较差，疾病将复发。对辐射的反应是最终肿瘤控制和很多癌，包括许多胃肠癌、肺癌、头颈癌和妇科癌症的存活的前兆性因素。大多数反应表征方法(虽然能很好地预测反应)是在治疗完成后实现的。虽然某些治疗内临床评估在调整治疗中是有用的，¹⁴但在大多数情况下，在实际治疗过程中没有预测肿瘤反应的准确方法。这样的测试，尤其是适用于宽范围的肿瘤位点和组织学的测试，显然将是非常有用和合乎需要的。其它的治疗和诊断方法，它包括已被提出用来预测对治疗反应的分子测试法，以及近来的努力包括采用DNA微阵列来辨别与对治疗反应或无反应相关的基因变化。这些还都处于研究阶段，没有一种处于常规临床使用中。

其它诊断和治疗的方法，它包括在XRT治疗过程中使用成像方式来预测反应。使用FDG的治疗内PET扫描正处于活跃的研究中，其中将在原发性肿瘤中途通过辐射治疗的同位素摄取同治疗前摄取相比较。多个回顾性研究提示，在治疗过程中具有连续强摄取的受试者与在治疗过程中其肿瘤较少吸收FDG的受试者相比，具有更糟的肿瘤控制结果。¹⁵然而，极其希望得到的是用于不同癌症的更有效的筛选、诊断和治疗方法。

其它被充分观察的肿瘤包括恶性神经胶质瘤，其是原发性脑瘤的最常见类型。尽管采用手术、辐射和化疗进行攻击性治疗，但潜伏有这些肿瘤的大多数患者在诊断后存活期少于2年。近来在神经放射学和磁共振成像(MRI)上的进展在这些肿瘤的早期诊断和治疗上产生了显著的影响。然而，大多数的恶性神经胶质瘤具有侵润性成分，通过目前的成像技术很难将该成分与水肿性脑组织区分。最难以治疗且造成局部复发的原因常常就是该肿瘤的这种组分。毫无疑问，侵入性神经胶质瘤细胞的更好显像对于有效的治疗性处理而言是理想的。

同样地，胰腺癌是高致命性疾病，在所有的主要恶性肿瘤中具有最小的存活可能性。在美国胰腺癌是第五位的癌症死亡原因，并且在美国所有新诊断的癌症中，每年有2％归咎于胰腺癌。然而，胰腺癌是最高致命性疾病之一，其占所有癌症死亡的5％。Miller B A等人，NIH Pub.No.96-4104.Bethesda，Md.1996。这得到了以下事实的证明：在患有不可切除疾病的患者中没有5年存活者。此外，尽管手术切除提供了治愈的唯一希望，但是切除后5年存活率仅有20％。Geer R J，Brennan M F.Am J Surg 1993；165：68-72；Yeo C J，Cameron J L，等人，Ann Surg 1997。尽管采用18-FDG的PET扫描在使多种其它原发性癌症成像中已表现出希望，但是似乎仅有有限的提高胰腺癌患者CT扫描的成像能力的能力，特别是在评价转移性疾病中。Kasperk RK，Riesener KP，等人，World J Surg 2001；25：1134-1139；Sendler A，Avril N，等人，World J Surg 2000；24：1121-1129。因此，对使患有隐伏的转移性胰腺癌的患者准确成像的方法仍然存在需求。

肝细胞癌是全世界最常见的实体器官恶性肿瘤，这是因为其常见病因学是由肝炎或酒精中毒所致的慢性肝损伤。发病率变化显著，北美每100,000中有2.1个，在中国的高发病率区每100,000中有80个。在肝硬化患者中发展成HCC的风险是每年1-6％。尽管切除是唯一的治疗选择，但是在呈现的时候，仅有10-30％的患者适于手术，因为较少的肝储量或存在不能切除或转移的疾病。治愈切除后5年的存活率仅有15-35％，证实了这种疾病的攻击性的性质。Treiber G.Digestive Diseases(2001)19：311-323。

今天在美国乳腺癌是女性的主要健康忧虑。预期2004年仅在美国接近216,000妇女被诊断患有乳腺癌，并且预期其中的40,000人会死亡。局部、区域和远处转移性扩散的准确评估对于最佳的疾病治疗和处理来说是关键的。将允许检测和或表征局部或远处乳腺癌转移癌(包括淋巴结累及)的非侵入性成像方式的发展将代表这种疾病处理中的显著进步。尽管乳房X线照片术是目前选择用于早期检测乳腺癌的筛查方法，但组织学证实和向毗邻淋巴结的区域扩散通常靠活组织检查来评估。包括采用^99mTc-Sestamibi的闪烁照片扫描和¹⁸F-FDG PET扫描在内的更复杂的成像方法现已被广泛地考查，但是没有显著地影响治疗计划，主要是归因于其不可预知的专一性。Wahl RL.Quart J ofNucl Med(1998)42：1-7。然而，在监测对化疗的肿瘤反应中PET扫描的作用显示出有效性。Smith IC，Welch AE，等人，J of Clin Oncol(2000)18：1676-1688；Schelling M，Avril N，等人，J of Clin Oncol(2000)18：1689-1695。放射治疗在乳腺癌中的作用已被很好地确定，主要因为许多实体上皮肿瘤包括侵润性导管癌对离子辐射的敏感性。DeVitaV，Hellman S，Rosenberg S.Cancer：Principles and Practice ofOncology，6th edition.Philadelphia(Pa.)：Lippincott，Williams andWilkins，2002，pp.1667-1680。在乳腺癌中辐射的最常见指征是作为局部病灶切除(lumpectomy)或乳房切除后的辅助治疗。在本上下文中，通过消除这些组织中显微沉积物，放射治疗已经表现出显著地减少局部和区域复发的发病率。当患者有转移性疾病或被认为有增加隐伏转移的风险时，进行化疗。在该后者适应症中，辅助的化疗给药的研究证实接受辅助化疗和激素治疗的患者的存活率提高了。辐射还用于减轻背景中，在减少实体器官和骨中转移瘤的疼痛和体积效应中具有良好的效果。因为多因素的原因，很多患者在明确的治疗后复发。获得的对辐射和化疗的抗性勿庸置疑地是造成初期治疗后复发的原因。此外，辐射的使用与特殊的毒性有关，该毒性通常是晚期出现和剂量限制性的。如果采用过度剂量的辐射，纤维化、神经损伤和软组织坏死可能是严重的。对于乳腺癌患者而言，手臂淋巴水肿是最常见的且是令人畏惧的毒性，通常是由腋窝解剖(为诊断目的而进行)和对腋窝的辅助辐射的组合而产生的。

与主要靶向对各特定肿瘤类型特异的受体或分子的新抗癌药相比，非常希望有依靠适于多种不同肿瘤类型的共同机理的新化合物。

由此，对提供高灵敏度和专一性的非侵袭性乳腺癌成像技术仍然存在迫切的临床需求。此外，同时传送治疗剂量的碘-131至原发性瘤和转移性瘤的潜力是显著额外的利益。

今天在美国非小细胞肺癌(NSCLC)是癌症死亡的主要原因。在适当选择的患者中手术切除提供了长期存活的最好机会，并且可以治愈。因此，局部、区域和远处转移扩散的准确手术前评估对于最佳的治疗来说是关键的。因为结节转移(其在几乎半数NSCLC患者中发生)，可能是治疗的最常见障碍，所以纵隔淋巴结状态的评估是必需的。准确的疾病分期还可以使患者减少不必要、非治疗性外科手术的发病率。

采用FDG-PET扫描成像迅速成为使NSCLC成像的金标准，这是因为其提高了灵敏度等级，特别是当和CT成像比较时。然而，这是一种昂贵的成像检测，其在大多数的社区实践中是不适用的。因此，仍然需要这样一种成像技术，它是灵敏的、专一的并且是对大多数患者来说可轻易得到的使用资源。

作为一种成像技术，采用¹⁸F-FDG的正电子成像术(PET)扫描已经引起相当的兴趣。近来的研究前瞻性地比较了用于NSCLC分期的标准方法(CT、超声、骨扫描等)和用于检测纵隔淋巴结和远处部位中的转移的PET扫描的能力。Pieterman RM，vanPutten JWG，Meuzzelaar JJ，Mooyaart EL，Valburg W，Koeter GH，Fidler V，Prium J，Groen HJM.Preoperative Staging of Non-Small Cell Lungcancer with Positron-Emission Tomography.New Eng J Med 343：254-261，2000。在组织病理学上证实了纵隔累及，并且通过其它成像检测证实了远处转移。用于检测纵隔转移的PET的灵敏度和专一性分别是91％和86％；用于检测远处转移的灵敏度和专一性分别是82％和93％。这好比纵隔累及的CT扫描的灵敏度和专一性分别为75％和66％。另一项研究将用FDG-PET、CT的成像和组织学结果进行了比较。用于纵隔结点分类(在54个患者中n＝168)的PET的总体灵敏度、专一性和准确度是96％、93％和94％，与之相比的是采用CT的68％、65％和6％。Gupta NC，Graeber GM，Bishop HA.Comparativeefficacy of positron emission tomography with fluorodeoxyglucose inevaluate of small(＜1cm)，intermediate(1 to 3cm)，and large(＞3cm)lymph node lesions。Chest 117(3)：773-778，2000。然而，PET扫描的局限包括高成本、有限的利用度、不能检测1cm以下的损伤、缺乏专一性，特别是在有炎症或肉芽肿疾病的患者中。Stokkel MP，BakkerPF，Heine R，Schlosser NJ，Lammers JW，Van Rijk PP.Staging oflymph nodes with FDG dual headed PET in patients with non-small celllung cancer。Nucl Med Communications 20(11)：1001-1007，1999；Kapuco LO，Meltzer CC，Townsend DW，Keenan RJ，Luketich JD.Fluorine-18-fluoro-deoxyglucose uptake in pneumonia.J Nucl Med39(7)：1267-1269，1998。

尽管治疗后肿瘤收缩，但传统解剖学上的成像技术如CT扫描也不擅长预测治疗之后的存活。在近来的研究中，所述研究包括56个NSCLC患者，他们接受用于晚期疾病的基于顺铂的化疗/放疗的同时治疗或单独放疗的治疗，由传统CT成像得到的反应和存活率没有关联。MacManus MP，Hicks RJ，Wada M，Hoff A，Matthews J，Wirth A，Rischin D，Ball DL.Early F-18FDG-PET response to radicalchemoradiotherapy correlates strongly with survival in unresectablenon-small cell lung cancer.Proc ASCO 19：483a，2000。然而，通过FDG-PET扫描得到的反应与存活率非常相关(p＝0.0006)。就24个患者而言(他们已经在PET上获得了完全反应)，从随访PET扫描的日期算起1年和2年的存活率分别是84％和84％，但是没有在PET上获得完全反应的32个患者中仅有43％和31％(p＝0.010)。这些结果证实了近来由其他作者报道的相似发现。Patz EF Jr，Connolly J，Herndon J.Prognostic value of thoracic FDG PET imaging aftertreatment for non-small cell lung cancer.Am J Roentgenology 174(3)：769-774，2000；Vansteenkiste JF，Stroobants SG，Dupont PJ，DeLeynPR，Verbeken EK，Deneffe GJ，Mortelmans LA，Demedts MG.Prognostic importance of the standardized uptake value on(18)F-fluoro-2-deoxy-glucose positron emission tomography scan innon-small cell lung cancer：An analysis of 125 cases.J Clin Oncol17(10)：3201-3206，1999；Ahuja V，Coleman RE，Herndon J，Patz EFJr.The prognostic significance of fluorodexoyglucose positron emissiontomography imaging for patients with non-small cell lung carcinoma.Cancer 83(5)：918-924，1998。

因此，就肿瘤分类和对治疗的反应而言，可以准确地鉴别和潜在地早期治疗NSCLC患者中早期转移性疾病的易于利用的放射性药物，将对患者的医疗具有重要的影响。尽管PET成像方法在这个领域中获得了有效性，但高成本和不可获得性严重地限制了其实际应用。对基于肿瘤特异的机能的准确功能成像技术仍然存在需求，该成像技术采用相对便宜和可广泛得到的成像装置可以非侵入性地筛查整个身体。

                      发明概述

本发明一般地提供了用于检测和治疗不同癌症的方法和技术。在一个优选的实施方案中，本发明提供一种用于检测和定位患有或怀疑有癌症的受试者中肺癌、肾上腺癌、黑色素瘤、结肠癌、结肠直肠癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌、皮下癌、肠癌、肝细胞癌、成视网膜细胞瘤、宫颈癌的方法。所述方法包括以下步骤：

(a)向所述受试者给予磷脂醚类似物；并且

(b)测定受试者的怀疑有癌症的器官与周围区域相比是否保持较高水平的所述类似物，其中较高保留区域表明所述癌症的检出和定位。在这个方法中，磷脂类似物选自：

其中，X选自碘的放射性同位素；n是16到30之间的整数；Y选自NH₂、NR₂和NR₃，其中R是烷基或芳基烷基取代基或

其中，X是碘的放射性同位素；n是16到30之间的整数；Y选自H、OH、COOH、COOR和OR，并且Z选自NH₂、NR₂和NR₃，其中R是烷基或芳基烷基取代基。在这个方法中，X选自由¹²²I、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I和¹³¹I组成的碘的放射性同位素的组。优选地，在这个方法中，所述磷脂醚是18-(对-碘代苯基)十八烷基磷酸胆碱、1-O-[18-(对-碘代苯基)十八烷基]-1，3-丙二醇-3-磷酸胆碱或1-O-[18-(对-碘代苯基)十八烷基]-2-O-甲基-外消旋-丙三醇-3-磷酸胆碱，其中碘是放射性同位素的形式。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗受试者中癌症的方法。该方法包括向所述受试者给予有效量的含有如上述的磷脂醚类似物的分子。在这个方法中，癌症选自肺癌、肾上腺癌、黑色素瘤、结肠癌、结肠直肠癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌、皮下癌、肠癌、肝细胞癌、成视网膜细胞瘤、宫颈癌、神经胶质瘤、乳腺癌、胰腺癌、癌肉瘤和平卧癌(Prostrate cancer)。

本发明还涉及磷脂醚类似物用于制备治疗癌症的药物组合物中的用途。这些磷脂类似物选自上文讨论的那些物质的组。

本发明的还一个实施方案提供了一种区分受试者体内炎症、腺瘤和增生与瘤形成的方法。该方法包括以下步骤：

(a)向所述受试者给予磷脂醚类似物，并且

(b)测定所述受试者的怀疑有炎症、腺瘤、增生或瘤形成的器官与周围区域相比是否保持较高水平的所述类似物。当所述受试者表现出较高保留区域时，它表明所述瘤形成的检出和定位，当所述受试者表现出较低保留区域时，它表明怀疑有腺瘤、增生或炎症的器官的存在。

本发明的另一个实施方案提供了一种在含磷脂酶D(PLD)的组织样品中检测瘤形成的方法。该方法包括以下步骤：

(a)定量所述组织样品中PLD蛋白质活性水平或PLD mRNA水平；并且

(b)测定所述组织样品与周围组织区域相比是否具有较低水平的蛋白质活性，其中较低活性区域表明瘤形成的检出和定位，或者

(c)测定所述组织样品与周围组织区域相比是否具有较低水平的mRNA，其中较低mRNA水平区域表明瘤形成的检出和定位。

这个方法中，通过使所述组织样品和上述的PLE类似物接触，可以定量PLD蛋白质活性或mRNA水平。

本发明的再一个实施方案提供了一种抗肿瘤药剂，其通过筛选含PLD的组织样品的方法来选择，该方法包括以下步骤：(a)定量PLD蛋白质活性或PLD mRNA水平，其中与周围组织区域相比减少的PLD蛋白质活性或减少的mRNA水平预示瘤形成。通过使组织样品和上述的PLE类似物接触，可以定量PLD蛋白质活性或mRNA水平。

从详细的说明、附图和说明书所附的权利要求中，本发明的其它目的和优点将是显而易见的。

                     附图简要说明

图1.PLE肿瘤细胞成像假说。

图2.在IV给予1mCi ¹³¹I-NM324后第1、2和6天得到的患者03前胸的闪烁显像。在左小舌肺癌(T)中见到吸收，随时间增加肿瘤对背景的比值。

图3.PLE类似物的结构。

图3A.NM404类似物。

图4.IV给药后，NM324和NM404在SCID小鼠A549肺肿瘤模型中的对照。注意的是，在肠内而不是在肿瘤(植入大腿)中发现大部分NM324活性，然而在各大腿中NM404鉴别了一种肿瘤。

图4A.在手术除去原发性肿瘤位点(小腿)的哥本哈根(Copenhagen)大鼠体内的Dunning R3327转移性前列腺肿瘤的闪烁显像NM404图像。两个淋巴结肿瘤在mortem后查证。

图6.切除的CT-26肿瘤(T)与左和右淋巴结(LN)的数字照片(A)。显示肿瘤中放射性的相关性的Bioscan图像(B)与合并照片/Bioscan图像(C)。

图7.显示CT-26肿瘤(箭头)的大小和位置的图6的活小鼠的微CT图像。3D-表面受阻和整平的切片图像(A，B)以及冠状(C)和轴向(D)切片(40μm厚)。

图8.正常(左)和RF-切除(右)CT-26肿瘤的组织学切片(H&E)。切除的切片丧失了膜完整性，显得致密。

图9.¹²⁵I-NM404注射后4天，c-myc胰腺肿瘤小鼠的体内合并Bioscan/数字照片图像(A)。用于和数字照片(C)比较的切除的肿瘤的离体成像(B)。颜色分类和图10中的相同。

图10.¹²⁵I-NM404给药后4天，c-myc胰腺肿瘤鼠的Bioscan成像。和显示大(2cm)胰腺肿瘤(T)存在的解剖小鼠(B)的数字照片相比的体内图像(A)。切除三个肿瘤并扫描残留的尸体(C)。扫描切除的肿瘤(D)，用于和数字照片(E)比较。彩色温标从0(黑色)变化至40(白色)cpm。

图11.带有胰腺肿瘤的小鼠的MicroCT轴向扫描。在图A中，在轴向图像中很容易看得两个大肿瘤(T)。B中不同小鼠的图像描述了位于脾邻近的胰腺肿瘤(箭头)。在小鼠中，胰是一种遍在的组织。切除的脾和连附属的肿瘤的数字照片显示在11C中，用于对照。

图12.假对照大鼠脑(A)的Bioscan图像(IV注射¹²⁵I-NM404后4天)和重叠在显示正常脑组织中NM404低背景水平的切除的大鼠脑的相应数字照片的相同Bioscan图像。

图13.IV注射¹²⁵I-NM404后4天，切除的带有C6-神经胶质瘤的大鼠脑(B)的数字照片(A)和相应的Bioscan图像。位置和大小配对的合并的Bioscan图像和照片(C)显示NM404在肿瘤中的强定位。在D中H&E染色的样品中在组织学上证实了肿瘤的存在。

图14.在¹²⁵I-NM404注射后10天，带有TGFα肝癌的小鼠的冠状微CT扫描(左)和背侧Bioscan图像(右)。在微CT图像上使用ITG增强了肝，ITG是一种肝细胞选择性CT造影剂(肿瘤＝T)。

图15.NM404注射后7天，切除的带有CT-26肿瘤的小鼠肝的照片(A)和Bioscan图像(B)。肝肿瘤累及是广泛的。此次扫描前15天植入肿瘤。切除的解剖的肿瘤(T)和正常的未累及的肝(L)的Bioscan图像(C)和照片(D)。

图16.显示多发性CT26肿瘤存在的图15中呈现的相同小鼠的微CT。使用ITG增强肝，ITG是一种肝细胞选择性造影剂。肿瘤细胞植入后10天和上述Bioscan成像之前5天得到这些图像。(用箭头描述肿瘤，胆囊＝GB)。

图17.在IV给予¹²⁵I-NM404(15μCi)后的不同时间，有自发性右腋窝乳房肿瘤(直径10mm)的Min老鼠的NM404的Bioscan图像。显示了冠状microCT图像(非对比增强)，用于解剖学上的比较(右图，T＝肿瘤)。

图18.切除的左和右腹乳腺的胭脂红染色照片(A，C)和Bioscan图像(B，D)。注意在图A中2mm的肿瘤，其在左腺的Bioscan Image(B)中容易检测到。淋巴结(A中的小箭头)显示了无NM404的吸收。在右腺(C，D)中用肉眼检测不到肿瘤。结肠的照片(E)和Bioscan图像(F)显示在腺瘤息肉(箭头)中无NM404的吸收。

图19.图18的Min小鼠的MicroCT扫描。图A是显示大左腋窝乳房肿瘤的低密度的表面表现。图B是给予血池CT造影剂BP10以帮助定位肿瘤饲养脉管之后的高密度表面表现。图C是合成的冠状CT图像和高密度表面表现，其显示了绝对的饲养脉管定位。在图C中取向是从下望上看，而图A和B是从上望下看。

图20.在IV给予¹²⁵I-NM404(15μCi)后的不同时间，具有自发性右腋窝乳房腺瘤(直径10mm)的Min小鼠的NM404Bioscan图像。显示冠状的微CT图像(非对比增强)，用于解剖学上的比较(左图，T＝肿瘤)。

图21.来自NM404给药后8天的FVBxB6Min小鼠的切除的乳腺(A)和结肠(E)的Bioscan图像。在B和D中分别是相同的切除组织的相应数字照片。胭脂红着色放大的照片(C)显示了存在增生(箭头)，但是在Bioscan图像(A)中无相应的病灶活动。Bioscan图像(A)上的肿瘤吸收对应于B中的较大腺癌。切除的结肠的照片(D)和Bioscan图像(E)表明在腺瘤息肉(箭头)中无NM404的吸收。

图22.图21中显示的Min小鼠的微CT扫描。图A是显示大左轴向乳房肿瘤的低密度表面表现。图B是给予血库CT造影剂BP10以帮助定位肿瘤饲养脉管之后的高密度表面表现。图C是合成的冠状CT图像和高密度表面表现，显示了绝对的供给脉管定位。在图C中取向是从下望上看，而图A和B是向上望下看。

图23.在含A549肺CA micromets(直径＜1mm)的切除的SCID小鼠肺中¹²⁵I-NM404(A&B)和NM324(C&D)摄取的对照。

图24.PLE的酶代谢。

图25.在ENU-处理的Min/+小鼠中至第一个肿瘤的时间。在ENU后至第一个乳房肿瘤的时间(表示为天数)。雌性Min/+小鼠用ENU处理，并每周检查2次乳房肿瘤的存在。对于B6Min/+(n＝45)(□)、BRB6Min/+(n＝18)(△)、FVBB6Min/+(n＝18)(◇)，以5天间隔将ENU处理后至第一个肿瘤的时间作图。

图26.¹²⁵I-NM404给药后1天(A)和7天(B)的俯卧FVBxB6 Min小鼠的Bioscan图像表明大腋窝乳房肿瘤的存在。注射后10天切除的乳腺的Bioscan图像显示在大的10mm腺癌和在体内扫描中看不见的较小邻近2mm肿瘤中的NM404的结合。

图27.如图26中所示的相同的FVBxB6Min小鼠的微CT图像，显示了大的腋窝乳房肿瘤。在A和B中显示了冠状和轴向切片，而3D-表面(金色)和冠状切片同时显示在后视(C)和前视(D)图中。

图28.注射¹²⁵I-NM404后的明显SCC1和6肿瘤消退。

图29.在¹³¹I-NM404注射后第4天和11天患者1伽马相机成像(左图)，其显示了该药剂在两个NSCLC肿瘤(箭头)中的强和延长的滞留。轴向CT扫描(右图)显示了在左肺(A)中局部3cm病变的定位和大小，以及在在右肺(B)中的大侵润性肿块(箭头)。

图30.在iv给予¹³¹I-NM404之后，患者2前和后整个身体的平面核医学图像(左图)。轴向(A)和冠状(B)CT扫描(右图)显示了大的6cm的NSCLC(箭头)的定位。

                I.本发明的一般性说明

本发明的一般性说明：在描述本发明的方法之前，应当理解得是本发明不限于描述的特定的方法学、方案、细胞系和试剂，因为这些可以变化。还应当理解，在此所用的术语是仅用于描述特定实施方案的目的，其将不限制本发明的范围，本发明的范围仅限于所附的权利要求。

必须注意的是，如在此和附加的权利要求中所用的单数形式“一”、“一”和“该”包括复数，除非上下文另有清楚地指出。因此，例如，提到“一个细胞”包括这样的细胞的复数和本领域技术人员已知的等同物，等等。同时，术语“一”(或″一″)、″一个或多个″和“”至少一个”可以在此交替使用。还应当注意，术语“包含”、“包括”和“具有”可以互换使用。

除非另有定义，在此所用的所有技术和科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员常规理解的相同的意思。尽管与在此描述的那些相似或等同的任何方法和材料可以用于本发明的实践或试验中，优选的方法和材料是目前描述的。就描述和公开化学试剂、细胞系、载体、动物、仪器、统计分析和方法学的目的而言，通过引用将在此提及的所有出版物并入本文，其在出版物中报道了，所述出版物可以与本发明结合使用。在此没有任何内容将被解释为承认本发明没有根据在先发明的实质将这类公开提前的权利。

如在此定义，术语“同分异构体”包括，但不限于旋光异构体和类似物、结构同分异构体和类似物、构象异构体和类似物等等。在一个实施方案中，本发明包括了式3A的抗肿瘤化合物的不同旋光异构体的用途。本领域技术人员应当理解，本发明适用的抗肿瘤化合物可以含有至少一个手性中心。因此，本发明方法中所用的化合物可以光学活性或外消旋形式存在，或被分离。某些化合物还可以展现同质多晶现象。

应当认识到，本发明可以包括使用任何外消旋、光学活性、同质多晶或立体异构的形式，或其混合物，所述形式具有适用于治疗在此描述和要求保护的肿瘤相关的病症的性质。在一个实施方案中，抗肿瘤化合物可以包括纯的(R)-异构体。在另一个实施方案中，抗肿瘤化合物可以包括纯的(s)-异构体。在另一个实施方案中，化合物可以包括(R)和(S)异构体的混合物。在另一个实施方案中，化合物可以包括含(R)和(S)异构体的外消旋混合物。怎样制备光学活性形式(例如，通过重结晶技术拆分外消旋形式，通过光学活性原料的合成、通过手性合成或通过采用手性固定相的色谱分离)是本领域熟知的。

本发明包括氨基取代化合物与有机酸或无机酸的药学上可接受的盐的用途，所述酸例如柠檬酸和盐酸。本发明还包括在此描述的化合物的氨基取代基的N-氧化物。药学上可接受的盐还可以用无机碱，例如氢氧化钠处理酚类化合物制得。还有，酚类化合物的酯类可以由脂肪族或芳香族羧酸制得，例如乙酸和苯甲酸酯。如在此所用，术语“药学上可接受的盐”涉及由碱化合物配制的化合物，其实质上达到与碱化合物相同的药效。

本发明进一步包括利用抗肿瘤衍生物的方法。术语“衍生物”包括但不限于醚衍生物、酸衍生物、酰胺衍生物、酯衍生物等等。此外，本发明进一步包括利用抗肿瘤化合物的水合物的方法。术语“水合物”包括但不限于，半水合物、一水合物、二水合物、三水合物等等。

本发明进一步包括利用抗肿瘤化合物代谢产物的方法。术语“代谢产物”指的是由另一种物质经过新陈代谢或代谢过程产生任何物质。

如此定义的，“接触”指的是把本发明所用的抗肿瘤化合物引入试管、烧瓶、组织培养物、芯片、阵列、平板、微量培养板、毛细管等中含有受体的样品里，并且在足以允许抗肿瘤化合物和受体结合的温度和时间下培养。使样品和抗肿瘤化合物或其它特异性结合组分接触的方法对本领域技术人员来讲是已知，并且可以根据将要运行的检测实验设计来选择。培育方法也是标准的，并且对本领域技术人员也是已知的。

在另一个实施方案中，术语“接触”意思是把本发明所用的抗肿瘤化合物引入接受治疗的患者，并且允许该化合物在体内发生接触。

如在此所用，术语“治疗”包括预防和疾病缓解治疗。如在此所用，术语“减少”、“遏制”和“抑制”具有它们通常了解的减轻或减少的含义。如在此所用，术语“进展”指得是范围或严重性的增加、推进、增长或变得更糟。如在此所用，术语“复发”指的是减轻后疾病的恢复。

如这里所用的术语“给予”是指使患者、组织、器官或细胞与抗肿瘤磷脂醚化合物接触。如在此所用，给予可以在体外即在试管内实现，或在体内即在活的生物例如人的细胞或组织中实现。在某些实施方案中，本发明包括向患者或受试者给予本发明适用的化合物。“患者”或“受试者”，在这里可等同使用，是指哺乳动物，优选是人，其(1)具有通过给予利用磷脂醚化合物的抗肿瘤物质可纠正或可治疗的病症，或者(2)易患通过给予利用磷脂醚化合物的抗肿瘤化合物可预防的病症。

如在此所用的，“药物组合物”意思是治疗有效量的抗肿瘤化合物加之适合的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂和辅助剂，统称“药学上可接受的载体”。如在此所用的，术语“有效量”和“治疗有效量”是指足以产生期望的治疗响应而没有过度的不良副作用如毒性、刺激或过敏反应的活性治疗药剂量的量。显然地，特定的“有效量”将随这样的因素而变化，如要治疗的特定病症、患者的身体状况、要治疗动物的类型、治疗的持续时间、同时治疗(如果有)的性质和使用的特定制剂以及化合物或其衍生物的结构。在这样的情况下，如果其产生以下的一种或多种情形：(a)疾病(例如，胰腺癌、乳腺癌)的预防；(b)这些疾病的逆转或稳定，将认为量是治疗有效的。本领域的技术人员采用常规的实验，可以轻易地确定最佳的有效量。

药物组合物是液体或冻干或其它干燥形式，包括多种缓冲含量(例如，Tris-HCl、醋酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度的稀释剂、添加剂例如防止向表面吸收的白蛋白或明胶、去污剂(例如，吐温(聚山梨酯)20、吐温80、Pluronic F68、胆汁酸盐)、增溶剂(例如甘油、聚乙二醇)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠)、防腐剂(例如硫柳汞、苯甲醇、尼泊金酯类)、膨胀物质或张度修饰剂(例如乳糖、甘露醇)、共价结合的聚合物如与蛋白质结合的聚乙二醇、与金属离子的配位、或物质结合到聚合化合物的特定制剂中或其上，所述聚合化合物如聚乳酸、聚羟基乙酸、水凝胶等，或结合在脂质体、微乳、微团、单层或多层的囊泡、红细胞影或球形体上。这样的组合物将影响物理状态、溶解性、稳定性、体内释放的速率、体内清除的速率。受控或持续释放组合物包括在亲脂贮库(例如脂肪酸、蜡、油类)中的制剂。

本发明还包括的是给予用聚合物(例如泊洛沙姆或泊洛沙胺)包衣的颗粒组合物的方法。组合物其它的实例包括用于多种给药途径(包括局部、胃肠外、肺部、鼻和口)的颗粒形式防护包衣、蛋白酶抑制剂或渗透增强剂。在一个实施方案中，药物组合物经胃肠外、癌旁边(paracancerally)、经粘膜、经皮、肌肉内、静脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内、颅内、和瘤内给药。

进一步，如这里所用的“药学上可接受的载体”也是本领域技术人员熟知的，并包括但不限于01-0.1M，优选是0.05M的磷酸盐缓冲液或0.9％的盐水。此外，这样的药学上可接受的载体可以是水溶液或非水溶液、悬浮液和乳液。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和可注射的有机酯类如油酸乙酯。水性载体包括水、含醇/含水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲媒介物。

胃肠外载体包括氯化钠溶液、林格葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格液和固定油。静脉内载体包括流体和营养剂补充物、电解质补充物如以林格葡萄糖为基础的那些，等等。还可以有防腐剂和其它添加剂，如，例如抗微生物剂、抗氧化剂、校正(collating)剂、惰性气体等等。

按照本发明可给予的控释或缓释组合物包括在亲脂性贮库(例如脂肪酸、蜡、油类)中的制剂。本发明还包括的是用聚合物(例如泊洛沙姆或泊洛沙胺)包衣的颗粒组合物和连接至导向组织特异的受体、配体或抗原的抗体的化合物，或连接至组织特异的受体的配体的化合物。

按照本发明给予的组合物的其它实施方案包括用于多种给药途径(包括胃肠外、肺、鼻和口)的颗粒形式、防护包衣、蛋白酶抑制剂或渗透增强剂。

已知通过共价结合的水溶性聚合物如聚乙二醇、聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮或聚脯氨酸修饰的化合物与相应的未修饰的化合物相比，静脉内注射后在血液中表现出实质上更长的半衰期(Abuchowski等人，1981；Newmark等人.，1982；和Katre等人，1987)。这样修饰还可以增加化合物在水性溶液中的溶解度，消除聚集，提高化合物的物理和化学稳定性，很大地减少了化合物的免疫原性和反应性。结果，与给予未修饰的化合物相比，通过以更少的次数或更低的剂量给药这样的聚合物-化合物可以取得在体内期望的生物学活性。

而在本发明的另一种方法中，药物组合物可以控释系统来传送。例如，药剂可以采用静脉内输注、可植入的渗透泵、透皮贴片、脂质体或其它的给药模式给药。在一个实施方案中，可以使用泵(参见Langer，supra；Sefton，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201(1987)；Buchwald等人，Surgery 88：507(1980)；Saudek等人，N.Engl.J.Med.321：574(1989)。在另一个实施方案中，可以使用聚合材料。而在另一个实施方案中，控释系统可以放置于接近治疗靶点例如肝，因此仅需要全身用药量的一部分(参见，例如Goodson，in Medical Applicationsof Controlled Release，supra，第2卷，115-138页(1984))。其它控释系统在Langer所著的评论中进行了讨论(Science 249：1527-1533(1990))。

药物制剂可以仅仅包含抗肿瘤化合物，或可以进一步包含药学上可接受的载体，可以为固体或液体形式如片剂、散剂、胶囊、丸剂、溶液、悬浮液、酏剂、乳剂、凝胶、乳膏或栓剂，包括直肠栓和尿道栓。药学上可接受的载体包括树胶、淀粉、糖类、纤维素物质及其混合物。含抗肿瘤化合物的药剂，例如可以通过小丸的皮下植入给药于患者。在另一个实施方案中，丸剂提供了抗肿瘤化合物在一段时间内的控释。制剂可以通过液体制剂的静脉内、动脉内或肌肉内注射而给予，通过液体或固体制剂的口服而给予，或者通过局部施用而给予。还可以使用直肠栓或尿道栓来实现给药。

可通过本发明给予的药物制剂可以通过已知的溶解、混合、制粒或形成片剂操作制得。就口服给药而言，抗肿瘤化合物或其生理学耐受的衍生物如盐类、酯类、N-氧化物类等等可以为了这个目的和常规的添加剂如载体、稳定剂或无活性稀释剂混合，并或通过常规的方法改变成适合的给药形式如片剂、包衣片剂、硬或软明胶胶囊、水性溶液、含醇的溶液或油性溶液。适合的无活性的载体的实例是传统的片剂基质如乳糖、蔗糖或玉米淀粉，结合粘合剂如阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶，结合崩解剂如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸，或结合润滑剂如硬脂酸或硬脂酸镁。

适合的油性载体或溶剂的实例是植物油或动物油如向日葵油或鱼肝油。制剂可以制成如干粒或湿粒。用于胃肠外给药(皮下、静脉内、动脉内或肌肉内注射)，抗肿瘤化合物或其生理学可耐受的衍生物如盐类、酯类、N-氧化物类等等可以转变成溶液、悬浮液，或乳液，如果需要，与常规并适于此目的的物质，例如稳定剂或其它辅剂一起转化。实例是有或没有添加表面活性剂和其它药学上可接受的辅助剂的无菌液体如水和油。用作说明的油类是石油、动物、植物或合成来源的哪些，例如花生油、大豆油或矿物油。通常，水、盐水、葡萄糖水溶液和有关的糖溶液，以及二醇类如丙二醇或聚乙二醇是优选的液体载体，特别是用于注射液。

含活性成分的药物组合物的制剂是本领域熟知的。这样的组合物可以制成传送至鼻咽的气雾剂或注射剂，为液体溶液或悬浮液；然而，还可以制备注射前为适于溶于液体或悬浮于液体中的固体形式。制剂还可以是乳化的。活性治疗成分常常与赋形剂混合，所述赋形剂是药学上可接受的并与活性成分相配伍。合适的赋形剂，例如是水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇或类似物，或其任何组合。

此外，组合物可以含有较少量的辅助物质如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂，其增强了活性成分的有效性。

活性组分可以配制到组合物中，以中和的药学上可接受的盐形式。药学上可接受的盐包括酸加成盐，其是与无机酸或有机酸形成的，无机酸例如盐酸或磷酸，有机酸例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸，等等。由游离羧基形成的盐还可以由无机碱例如钠、钾、铵、钙或氢氧化铁得到，并且这样的有机碱如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等等。

对于使用例如乳膏、凝胶、滴剂等的身体表面的局部给药，以含有或不含有药用载体的生理学可接受的稀释剂中的抗肿瘤化合物或它们的生理学可耐受的衍生物如盐类、酯类、N-氧化物类等的溶液、悬浮液或乳液的形式制备和应用。

在本发明的另一种方法中，活性化合物可以囊泡(vesicle)的形式传送，尤其是脂质体(参见Langer，Science 249：1527-1533(1990)；Treat等人，in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer，Lopez-Berestein and Fidler(eds.)，Liss，N.Y.，第353-365页(1989)；Lopez-Berestein ibid.，第317-327页；通常参见如上)。

就在药物中的使用而言，抗肿瘤化合物的盐类可以是药学上可接受的盐。然而，其它盐在本发明的化合物及其药物接受的盐的制备中是有用的。该化合物的适合的药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如其可以通过将本发明的化合物的溶液和药物可接受酸的溶液混合制成，所述药学上可接受的酸如盐酸、硫酸、甲磺酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、乙酸、苯甲酸、草酸、柠檬酸、酒石酸、碳酸或磷酸。

一般而言，NM404是用于监测多种肿瘤治疗方式的治疗响应的有希望的新的肿瘤选择性诊断显像剂。放射性碘化的NM404，第二代磷脂醚类似物，在10/10异种移植肿瘤模型和最近在另一种14/14自发啮齿动物肿瘤模型中已显示出显著的肿瘤选择性。因为在肿瘤细胞的膜上缺少代谢的磷脂酶，这种方法的占优势的假设是磷脂醚类似物在肿瘤细胞膜上被全部捕获，因为它们不能被代谢或清除。因此，从正常细胞和有活力的肿瘤细胞中磷脂醚的差别清除速率形成了这个概念的基础。在多种肿瘤模型中获得的结果表明，NM404被有活力的肿瘤细胞隐蔽(sequestered)和选择性地保留，并集中于原发和转移性病变中，与解剖学位置包括在淋巴结发现的那些无关。和FDG不同，这种试剂不集中于感染位点。NM404相对于FDG的其它优点包括以下：NM404对恶性肿瘤细胞是选择性的而且被恶性瘤细胞不确定地保留，而FDG对于肿瘤细胞无选择性并进入感染性位点和增生(Barret′sEsophagus)。进一步地，因为¹²⁴I具有4天的物理半衰期，其可以运送到世界的任何地方，然而FDG具有110分钟的半衰期，有限地分布于生产场所200英里的范围之内。NM404经受延长滞留(不代谢)，因此当与合适的放射性同位素如¹³¹I配对时获得了显著的治疗潜力，然而FDG不具有任何治疗潜力。虽然在非常低的灵敏度水平，NM404可以用多种碘同位素标记，扩展了其多用性(诊断和治疗，以及用于实验动物研究的工具)，然而FDG限于用于PET扫描的¹⁸F，或者可能用于磁共振成像的¹⁹F(稳定)。不管其肿瘤靶向能力，由于其在肿瘤细胞内的快速代谢，用于治疗没有潜力。NM404提供了不但准确地预测了对不同治疗模式的局部肿瘤响应的可能，并且还提供了在亚治疗原发性肿瘤治疗的情况中检测远处转移病变的可能。

                       II.本发明

本发明一般地提供了检测和治疗多种癌症的方法和技术。在一个优选的实施方案中，本发明提供一种用于检测和定位患有或怀疑患有癌症的受试者的肺癌、肾上腺癌、黑色素瘤、结肠癌、结肠直肠癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌、皮下癌、肠癌、肝细胞癌、成视网膜细胞瘤、宫颈癌的方法。所述方法包括以下步骤：

(a)向所述受试者给予磷脂醚类似物；和

(b)测定所述受试者的怀疑有癌症的器官与周围区域相比是否保持较高水平的所述类似物，其中较高保留区域表明癌症的检出和定位。在这个方法中，磷脂类似物选自：

其中，X选自碘的放射性同位素；n是16到30之间的整数；Y选自NH₂、NR₂和NR₃，其中R是烷基或芳基烷基取代基或

其中X是碘的放射性同位素；n是16到30之间的整数；Y选自H、OH、COOH、COOR和OR，并且Z选自NH₂、NR₂和NR₃，其中R是烷基或芳基烷基取代基。在这个方法中，X选自由¹²²I、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I和¹³¹I组成的碘的放射性同位素的组。优选地，在这个方法中，磷脂醚是18-(对-碘代苯基)十八烷基磷酸胆碱、1-O-[18-(对-碘代苯基)十八烷基]-1，3-丙二醇-3-磷酸胆碱或1-O-[18-(对-碘代苯基)十八烷基]-2-O-甲基-外消旋-丙三醇-3-磷酸胆碱，其中碘是放射性同位素的形式。各种磷脂醚和用于生产和使用磷脂醚化合物的相关的方法学描述于美国专利号4,925,649、4,965,391、5,087,721、5,347,030、6,255,519和6,417,384中，其所有内容在此并入作为参考。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗受试者癌症的方法。该方法包括向所述受试者给予有效量的含有如上述的磷脂醚类似物的分子。在这个方法中，癌症选自肺癌、肾上腺癌、黑色素瘤、结肠癌、结肠直肠癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌、皮下癌、肠癌、肝细胞癌、视网膜细胞瘤、宫颈癌、神经胶质瘤、乳腺癌、胰腺癌、癌肉瘤和平卧癌。

本发明还涉及磷脂醚类似物用于制备一种治疗癌症的药物组合物中的用途。这些磷脂类似物选自上文讨论的组。

本发明的另一个实施方案提供了一种区分受试者中瘤形成和炎症、腺瘤、增生的方法。该方法包括以下步骤：

(a)向所述受试者给予磷脂醚类似物，并且

(b)测定所述受试者的怀疑有炎症、腺瘤、增生或瘤形成的器官与周围区域相比是否保持较高水平的所述类似物。当患者表现出较高保留区域，表明检出和定位瘤形成，当患者表现出较低保留区域，表明怀疑有炎症、腺瘤、增生的器官的存在。

本发明的另一个实施方案提供了一种在含磷脂酶D(PLD)的组织样品中检测瘤形成的方法。该方法包括以下步骤：

(a)定量组织样品中PLD蛋白质活性水平或PLD mRNA水平；和

(b)测定组织样品与周围组织区域相比是否具有较低水平的蛋白质活性，其中较低的活性区域表明瘤形成的检出和定位，或

(c)测定组织样品与周围组织区域相比，是否具有较低水平的mRNA，其中较低的mRNA水平区域表明瘤形成的检出和定位。

这个方法中，通过使组织样品和上述的PLE类似物接触，可以定量PLD蛋白质活性或mRNA水平。

然而，本发明的另一个实施方案提供了一种抗肿瘤药剂，其通过筛选含PLD的组织样品的方法来选择，该方法包括以下步骤：(a)定量PLD蛋白质活性或PLD mRNA水平，其中与周围组织区域相比，减少的PLD蛋白质活性或减少的mRNA水平预示瘤形成。通过使组织样品和上述的PLE类似物接触，可以定量PLD蛋白质活性或mRNA水平。

以下的部分讨论了仅涉及特定的磷脂醚化合物的方法和用途，然而，这样的用途是示例性的，不应该认为是缩小本发明的保护范围。

例如，在很多实验性肿瘤模型中，磷脂醚NM404已证明对于瘤形成组织有显著的专一性，但是没有证明对肿瘤形成前的组织也有显著的专一性。NM404相对于背景的高肿瘤亲和力和肿瘤选择性提示，其用于治疗中肿瘤成像有可能优于¹⁸F-FDG PET扫描。NM404肿瘤专一性的精确机理正在研究中，当前不能如¹⁸F-FDG吸收的葡萄糖利用机理那样很好描述。未能很好确定的是，在瘤形成组织中的NM404的吸收是否取决于那个组织的生存力，或者这样的吸收现象是否涉及某些与组织生存力无关的膜或基质成分。如果这样的吸收和专一性是和肿瘤的生存能力有联系，结果是最近被辐射灭菌的肿瘤中的NM404吸收将不存在或很少，反之对辐射耐受的肿瘤将表现出连续的吸收。近来，发明者证明了在裸鼠中的放射敏感和放射耐受的鳞状癌细胞中的NM404摄取和消除(SCC1和6)。这样一种试验在处理用放疗治疗的患者中是非常宝贵的，因为没有出现治疗后NM04定位的患者将表明治疗，而具有耐受的肿瘤的那些患者(继续吸收NM404)可以被给予其它非辐射选择(手术、化疗等)。

一种发展敏感性的方法，更适用的成像测验的方法是设计载体分子，其能够选择性地传送放射性药物探针至期望的靶组织。发明人的方法是利用显示高度的组织或肿瘤选择性的分子的独特的生物化学或药理学性质。

Snyder和同事^16，17观察到，多种动物和人肿瘤细胞和正常组织相比，在细胞膜上含有更高得多浓度的天然存在的醚类脂。他提出，肿瘤中醚类脂的蓄积是肿瘤细胞代谢这些类脂的能力较低的结果，原因是其缺少关键的代谢酶。发明人通过合成大量的放射性碘化的磷脂醚(PLE)类似物，作为潜在的肿瘤选择成像剂，而利用了这个观察。在广泛的多种自生的和移植的大鼠、鼠和人肿瘤模型(24/24)中，这些PLE类似物的多个已经表现出显著的和明显的普遍的定位于其中的能力，并被其选择性保留的能力。

发明人主要的假说(图1)是磷脂醚陷在有活力的肿瘤细胞膜上，因为它们不能代谢或消除。放射性碘化的磷脂醚给药后肿瘤的提取，显示了仅有完整试剂的存在，然而尿和粪便的分析显示出仅有代谢物。因此，形成这个概念的基础是磷脂醚从正常细胞与肿瘤细胞中的差别清除速率。在超过24个异种移植和自生肿瘤模型中获得的初步结果普遍地显示，NM404经历了选择性吸收，并在肿瘤中延长保留。因为药物在一定程度上在肝中代谢，由于高度的肝背景放射性水平，发明人避免在肝肿瘤模型中的早期的化合物评价。进一步，因为NM404与其前期物质相比提供了较低的肝背景水平，根据用HCC成像的患者有很多问题的事实，发明人将评估扩大到肝肿瘤中。很多患者具有根本的肝硬化，因此根据交叉的切片成像辨别再生的小瘤与HCC是很困难的。而且，评估采用FDG的PET扫描的初步研究在检测所述疾病时仅表现出20-50％的灵敏度。Verhoef C，Valkema R.等人，Liver(2002)22：51-56。进一步，PET-FDG在脑的诊断筛选中是无用的。相似地，FDG在评估肝的疾病中是无用的，因为肝细胞的高度的固有吸收。

以下的实施例描述了本发明优选的实施方案，并且用于说明目的。这些实施例不应该认为是缩小本发明的保护范围。

                       III.实施例

A.实施例I：NM404的合成、放射性标记和制剂

本发明人的合成方法是基于铜催化的格利雅试剂和烷基烷基甲苯磺酸酯或卤化物的交叉偶合反应，用于烷基链延长(参见下文的流程图)。这个合成由对-碘代苯甲醇1开始，通过和三甲基甲硅烷基溴反应，将其转化成对-碘代苄基溴2。对-碘代苄基溴2在催化剂Li₂CuCl₄的存在下，进一步和格利雅试剂3偶合。将第一个偶合产物4脱保护后得到的12-(对-碘代苯基)十二烷醇5转化成甲苯磺酸酯6。在下个步中，甲苯磺酸酯6和含6个碳原子的格利雅试剂7偶合，这就完成了链延长的过程。8的THP脱保护得到8-(对-碘代苯基)十八烷醇9，其通过如流程图表示的两步反应转化成10(NM-404)。

进一步，用任何碘同位素，包括¹²⁴I、¹²⁵I和¹³¹I标记NM404的快速高产率合成过程通过以下过程完成。

首先，将铝加热块装置预热到145℃，使用5ml用完即可丢弃的注射器管和顶部的橡胶隔膜制得冷凝器，注射器管装配有弯曲的1.5英寸的18ga用完即可丢弃的针。

第二，开始HPLC系统，贮液器里面填充脱气的溶剂(己烷/异丙醇/水(40∶52∶8))。平衡系统，接着系统性检查辅助系统如泵、检测器、图记录仪和计算机积分仪。

第三，通过在底部使用玻璃棉塞，用2.5mL颗粒状活性炭充填注射器，加入另外的玻璃棉塞并在顶部插入隔膜来制得3-ml的用完即可丢弃的注射器活性捕获器。将一根短的输液管针放置在注射器上，18-ga的针通过在顶端隔膜插入。活性炭捕获器连接于冷凝器的上部，通过硫代硫酸钠捕获器排向空气。

第四，将5mg的硫酸铵加到2ml的硼硅玻璃V-管形瓶中的20μL的去离子水中，接着向管形瓶中加入含20μg的未标记的NM404的20μl的无水乙醇。将管形瓶轻轻地旋转或轻打来确保混合，6个硼硅玻璃珠(3mm)也加入管形瓶。该管形瓶然后用特弗隆包被的丁基橡胶隔膜和铝折皱压紧盖密封。隔膜用18-ga针穿刺，穿过隔膜通过Hamilton微型注射器，加入期望量的碘-131化钠水溶液(在0.1NNaOH中，通常是15μl中5mCi)。将管形瓶再轻轻地旋转或轻打确保混合。管形瓶在剂量校准器中进行测定。

第五，活性炭捕获注射器插入反应管形瓶中，反应管形瓶放进加热的方块孔(用砂填充一半)。该反应管形瓶在145℃加热40分钟，在此过程中，大部分溶剂蒸馏除去，并在冷凝器中凝聚。用25ml的注射器把空气流(4×25ml)缓慢地注入反应管形瓶。反应管形瓶的温度增加到155℃，并且加热再持续30分钟。反应管形瓶从方柱加热器中移开，冷凝器/捕获器的组合部件分离并丢弃，管形瓶冷却至室温。

第六，0.5ml的无水乙醇加入反应管形瓶中。将管形瓶轻轻地旋转，并在剂量校准器中进行测定。

第七，用硅胶(氯仿/甲醇/水(65/35/4))进行粗制的标记产物混合物的放射-TLC分析。

第八，在5ml的无水乙醇中预浸湿1.0g的树脂30分钟制得安伯莱特(Amberlite)IRA 400-OH树脂柱。滗去乙醇，树脂用另外两份5ml的乙醇漂洗。湿树脂加入一个3ml的用完即可丢弃的注射器管中，底部用玻璃棉塞上，装配有Acrodisc过滤器和1-通阀门。粗制的放射性碘化的产物的乙醇溶液通过树脂柱逐渐被洗脱进5ml的管形瓶中。

第九，嵌入隔膜，用氮气流把溶剂吹掉。开始氮气流之前，活性炭注射器连接在管形瓶的出口。一旦干燥，50μl的乙醇用于稀释，并将内含物转移到300μl的V型管形瓶中。源管形瓶用第二个50μl的乙醇漂洗，并转移到V型管形瓶中。

第十，稳定HPLC泵，建立1.0ml/min的溶剂流。反应混合物在Perkin-Elmer柱体二氧化硅柱(4.3×33mm，3μm二氧化硅)上用HLPC纯化，用己烷/异丙醇/水(40∶52∶8)以1.0ml/分钟来洗脱。峰检测用230nm和254nm的UV和放射性来完成。一旦在无菌管形瓶中收集到适合的峰，取出少量样品用于放射-TLC分析，剩下的溶剂用氮气流来蒸发干燥，得到期望的化合物，为干的残留物。根据需要计算比活。

第十一，将聚山梨酯20以0.1μl/1.0μg NM-404的比例加入到烧瓶中，形成含5％的聚山梨酯20的无水乙醇的储液。聚山梨酯20是药用级的吐温20，目前其用于人和动物的NM404研究中。溶剂在30℃以下旋转蒸发干燥10分钟除去。残留物在足够的无菌水混合溶解，得到2％的聚山梨酯20溶液。配制的产品从无菌的0.2μm Pall-GelmanAcrodisc过滤器(13mm)中通过进入干的、无菌、多剂量管形瓶(Hollister-Stier)，其用另一个无菌的0.2μm的过滤器通气。100μl的产品溶液转移进一个管形瓶中，用于QC分析。

第十二，在剂量校准器中测量放射性，进行质量控制试验(无菌、无热原)。

所有未标记的NM404从近来经历急性毒理学测试的原始储备批中取出，以便使研究之间的潜在的合成差异最小化。NM404的放射性碘化通常由发明人开发的在熔化的新戊酸中的同位素交换反应来获得¹⁹，或者通过在此描述的新方法得到，并根据发明人描述的标准方法制备用于注射。²²这个操作有效地用于制备用于最初的使用NM324(NM404的前期物质)的人体试验的无菌材料，已超过40次用于制得¹²⁵I-和¹³¹I-标记的NM404。一般地，通过HPLC纯化和准确质量定量之后，将放射性药物溶解于无水乙醇(50-500μl)和聚山梨酯20(0.1μl/μg的化合物)中。真空下除去乙醇，残留物溶解于无菌水中得到含有不超过2-3％的聚山梨酯20的最终溶液。通过无菌的0.2μm的过滤单元过滤实现灭菌。最终的放射化学纯度在动物上使用前，必须超过97％。最终比活的定量和计算通过采用熟知质量标准的HPLC分析实现，并且放射性(¹²⁵I)的定量通过稀释法并用PE Wallac伽马计数器计数来完成，以便避免衰减担心。使用剂量校准器完成包括¹³¹I的较高能量的同位素的定量，剂量校准器建立于这些同位素的环境中。通常获得放射性碘化的NM404的1mCi/100μg的比活。注射量通常是每只小鼠约100μl。组织分布数据表达为每克组织的百分比注射剂量(+SEM)，当根据发明人建立的公开的操作称重整个器官时，还可以将其表达为每个器官的百分比注射剂量。²²在各个时间点，以每克组织的百分比注射剂量为基础计算肿瘤与组织的比值。

全身组织分布(TD)分析：根据发明人开发的标准操作，在雌性小鼠上进行生物分布研究。²⁷放射性碘化的NM404(100μl中5μCi)通过尾静脉注射给药。在预定的时间点，当在戊巴比妥麻醉下的时候通过放血，使动物(3/时间点)安乐死。切除总共16个组织，包括血液、血浆、肾上腺、膀胱、骨髓、脂肪、心、肾、肝、肺、肌肉、脾、卵巢、皮肤、甲状腺和肿瘤、漂洗并解剖除去外部的组织。大器官切碎，双份组织称重并放置于塑料导管中用于同位素计数。注射位点和残留的动物尸体的放射性也在井式计数器中测定。在适当的动物护理和辐射安全性认可下，这些标准的操作在发明人的实验室中利用了多年。计算机程序产生组织分布表，所述计算机程序产生了衰减校正的组织放射性浓度数据，以百分比注射剂量/g、％kg剂量和百分比注射剂量/器官+SEM为基础。在各个时间点，基于每克组织的百分比注射剂量来计算肿瘤与组织的比值。在携带肿瘤的小鼠上NM404注射后的4、7、14、21和28天进行对照TD研究(3只小鼠/时间点，共15只小鼠)，以便建立所有治疗方案的比较TD表。

全身成像实验设计：动物通过尾静脉注射接受¹²⁵I-NM404(10μCi)并且此后在预定时间点麻醉(戊巴比妥钠麻醉，0.06mg/g bw)，经受使用为了小鼠成像的改良的Bioscan AR2000放射性-TLC扫描器的放射性核素扫描(1mm高分辨率准直管/每道1分钟采集时间/1mm道增量)。采用Bioscan的Winscan 2D软件定量和给出数据。一旦切除，对照和治疗的肿瘤也用Bioscan单元离体扫描，以便通过排除整个躯体放射性核素衰减而获得更准确的ROI分析。动物(戊巴比妥钠麻醉，0.06mg/g bw)经受microCT扫描(Imtek MicroCAT I，390步采集/43Kvp/410μA)，使用介质拆分获得参数。3维重建数据集，并使用AMIRA 3D-可视化软件显影。软件允许进行ROI密度分析和方便的在屏测量。

        B.实施例II：第一代PLE类似物的临床前研究

采用发明人开发的同位素交换方法，用碘放射性同位素可以容易标记磷脂醚¹⁹。碘代苯基磷脂醚类似物是特别设计的，以便附着每个分子的放射性碘在体内脱碘作用下易于稳定。合成超过20个放射标记的PLE化合物，并在体外和体内测试。^20-22这些中的两个，即NM294和NM324[12-(3-碘代苯基)-十二烷基-磷酸胆碱]，在动物肿瘤定位研究中最初显示了最大希望。这些原型化合物，用碘-125标记，在以下的动物肿瘤模型中随着时间选择性地定位于肿瘤中；1)携带Walker256癌肉瘤的斯普拉-道来(氏)(Sprague-Dawley)大鼠；2)携带乳房肿瘤的Lewis大鼠；3)携带Dunning R3327前列腺肿瘤的的哥本哈根大鼠；4)携带Vx2肿瘤的兔子；5)携带人乳房肿瘤(HT39)、小细胞肺肿瘤(NCl-69)、结肠直肠肿瘤(LS174T)、卵巢肿瘤(HTB77IP3)和黑色素瘤的无胸腺的小鼠。这些试剂的最佳的肿瘤定位发生在1天到数天。

关于PLE类似物的力学研究；NM324和NM404与米替福新(十六烷基磷酸胆碱，一种在欧洲最被广泛研究的抗肿瘤醚类脂)在结构上相似。米替福新和其它抗肿瘤磷脂醚类似物的抗肿瘤性质已经在广泛的肿瘤细胞系中证实，包括前列腺癌、膀胱癌和畸胎癌、鼠和人白血病，以及肺癌、结肠癌、卵巢癌、脑癌和乳腺癌。23在和很多抗癌药物的对比中，这些磷脂醚类似物不直接结合DNA并且不是诱变剂。尽管精确的抗增殖作用机理还未确定，但它们显然作用于若干肿瘤细胞位点。这些化合物和多种细胞效应有关，包括转运、细胞因子形成的促进、细胞凋亡诱导以及干扰多种关键类脂代谢和细胞信号酶，该酸大多数位于细胞膜上。尽管存在关于吸收进入细胞的模式的争论，但目前大多数的报道支持这样的观点，即这些醚类脂直接被吸收进入它们蓄积的细胞膜中。普遍的看法是这些药剂通过扰乱膜磷脂代谢而起作用，然而，用这些药剂的细胞分级分布研究受到限制，由于在匀浆化和亚细胞分级分离操作中，自发的细胞小室重分配。与发明人使用的示踪剂成像剂量(几个μg)对比，仅在通常超过300-1000mg/天的剂量下才看到抗肿瘤效应。²³

对多个PLE类似物包括NM324、NM404的前期物质进行正式的代谢研究。在这些研究中，试验每种试剂来测定它们用作与PLE代谢有关的酶的底物的能力。如图24所示，在PLE的代谢中涉及三种主要的酶途径。O-烷基丙三醇单加氧酶(AGMO)是负责C-1处的烷基醚键的分裂，形成长链脂肪醇或随后形成相应的脂肪酸。磷脂酶C(PL_C)和D(PL_D)，在另一个方面分别产生丙三醇或磷脂酸产物。使用微粒体的AGMO酶制剂，当与[³H]-lyso-PAF(血小板活化因子)比较时NM324不是这种酶的底物，其广泛地引起代谢。在相似的方法中，NM324作为从蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)分离出的PL_C的底物来分析，相对于遭遇显著的水解的1-棕榈酰-2-[3H]-棕榈酰-L-3-磷脂酰胆碱(DPPC)不水解。

最后，多个PLE类似物接受PL_D测定。从甘蓝中分离的PL_D，与哺乳动物的PL_D相似，因为当有乙醇存在下进行酶反应时，甘蓝型除了提供磷脂酸之外，还提供磷脂酰乙醇-型产物。接受这些测定条件的多种PLE类似物，确实产生了磷脂酰乙醇加合物，显示可能和PL_D相互作用。

多个NM404前体进行了体外在多种细胞系中的代谢研究，包括Walker肿瘤细胞、大鼠肌肉(H9c2)和大鼠肝细胞。在这些研究中，代谢的程度在培育不同时间周期后形成的放射标记的产物的基础上进行确定，并且将结果标准化为细胞数或细胞蛋白质的量。培育介质和细胞悬浮液的随后的类脂提取证实了在Walker肿瘤细胞中很少PLE代谢产物的产生，然而在48小时的研究周期内，在肌肉细胞和肝细胞中发现了代谢产物的大量生成。这些结果和体内的对所有类似物完成的生物分布研究非常相关联。尽管已经完成了多个研究，但代谢捕获在肿瘤细胞中放射标记的PLE类似物的吸收和保留中的角色并没有很好地定义，当前仍然是实验的活跃领域。

NM324的临床评估：在多个有希望的第一代PLE类似物中，NM324是更容易合成的，因此选择作为最初临床研究的主导化合物。尽管在5位已检测出肿瘤的人肺癌症患者中获得成像，图像由于高的肝放射性而是复杂的。

第二代的PLE类似物：为了减少肝吸收并延长血浆期，合成了NM324的9个结构类似物，并用¹²⁵I放射标记，用于在携带DunningR3327前列腺肿瘤的哥本哈根大鼠中的最初的成像分析。基于这个最初的筛选，NM347、NM404[18-(4-碘代苯基)-十八烷基磷酸胆碱]和NM412(图3)选择用于在动物肿瘤模型中经历进一步的成像和生物分布分析。

在动物模型中采用NM404和NM412的更最近的成像研究表明，两者在使多种肿瘤的显影中都优于NM324。重要地，在静脉内给药NM404或NM412后，在转移的前列腺肿瘤模型中清楚地描绘了淋巴结转移瘤。最重要地，示踪剂没有被未受累及的淋巴结所保留。²⁴(图4A)。尽管在前列腺模型中进行，但这个发现尤其和乳腺癌有关，其中淋巴结累及是这样的一种重要的预后指示剂。在携带人A549NSCLC肿瘤的SCID小鼠上进行的初步中试研究是鼓舞人心的，并且证明NM404克服了NM324高的肝清除的问题。NM404表现出极好的肿瘤造影，特别在延迟成像上是显著的，和NM324相比具有最少的肝和肾吸收(图4)。组织生物分布研究进一步地证实存在于肿瘤中的高水平的放射性。尽管成像结果与NM404和NM412相似，但发现相对于NM412，NM404在大鼠中获得的显示了相对低的肾剂量的剂量学数据，因此选择NM404用于进一步研究。在有前列腺的SCID小鼠和A549肺癌肿瘤模型中的NM324和NM404的比较生物分布数据揭示，使用NM404具有高的肿瘤与正常组织比，并有超过25％注射剂量的肿瘤吸收。

目的在于测定广泛的多种肿瘤模型中的吸收特征，在小鼠模型中完成的动物成像研究总结于表1中。在B6Apc^Min/+小鼠中的初步结果显示，在这个模型中NM404未被腺瘤息肉吸收，但是被乳房腺癌吸收和保留，因此表明对于恶性肿瘤细胞可能的专一性。这些研究旨在测定NM404非侵袭性表征肿瘤的潜力。NM404在研究的每个腺癌模型中已经显示了显著的肿瘤吸收和保留。

肿瘤模型		物种	类别	吸收
					人类肿瘤异种移植物
	前列腺PC-3	SCID小鼠	腺癌	是
						肺A-549(NSCLC)	SCID小鼠	腺癌	是
	肺NCI H-69(燕麦型)	裸鼠	腺癌	是
						肾上腺H-295	SCID小鼠	腺癌	是
	肾上腺RL-251	SCID小鼠	腺癌	是
						黑色素瘤A-375	裸鼠	腺癌	是
	结肠LS-180	裸鼠	腺癌	是
						卵巢HTB-77	裸鼠	腺癌	是
动物肿瘤异种移植物
						乳房MCF-7	大鼠	腺癌	是
	前列腺MatLyLu	大鼠	腺癌	是
						Walker-256	大鼠	癌肉瘤	是
近来的啮齿动物模型
						TRAMP前列腺	自发小鼠	腺癌	是
	肝CT-26	小鼠异种移植物	直肠结肠腺癌	是
						皮下CT-26	小鼠异种移植物	直肠结肠腺癌	是
	Min小鼠肠	内源性小鼠	腺癌	是
						黑色素瘤	小鼠异种移植物	腺癌	是
	SCC1和6	裸鼠	鳞状细胞癌	是
						乳房SCC和AC	APCMin/+小鼠	SCC和腺癌	是

	肝细胞癌	自发小鼠	腺癌	是
						成视网膜细胞瘤	自发小鼠	胚细胞瘤	是
	宫颈腺癌	自发小鼠	腺癌	是
						胰c-myc和kras	自发小鼠	腺癌	是
	神经胶质瘤L9	大鼠异种移植物	神经胶质瘤	是
						肠息肉	APCMin/+小鼠	腺瘤	否1
	乳房增生	APCMin/+小鼠	肺泡增生	否1
					2肿瘤吸收＜＜1％的注射的剂量/克。

CT26鼠动物肿瘤模型的关联性：发明人研究了NM-404，在用皮下的CT26细胞接种于小鼠的肋腹的鼠(BALB/c小鼠)模型中，其作为肿瘤响应的预言者。CT26细胞系是分化不良的鼠腺癌，其通过在BALB/c小鼠中直肠注射N-亚硝基-N-甲基尿烷诱导产生。细胞系简单在体外生长，当注入脉管系统(尾静脉注射，转移模型)或注入皮肤(图5)或肝时产生可预料的生长模式。^25，26因为细胞系是由结肠直肠癌产生，这种鼠模型对这些研究有高度的临床相关性。

在CT26肿瘤中采用NM404的初步成像结果：在显示了NM404定位于皮下的CT26异种移植物中的初步的试验中，两种动物用¹²⁵I-NM404(10μCi)注射(IV尾静脉)，随后在注射后的1、4和7天用改良的Bioscan AR2000放射TLC扫描仪(装备了高分辨率1mm准直仪和2-D采集和分析软件)成像。在第7天，动物安乐死，除去肿瘤，照相并用Bioscan离体扫描(图6)。离体扫描在发明人的实验室是标准的程序，因为与碘-125相关的严重的组织衰减效应。在安乐死和剥离肿瘤前，在第7天，每个动物还经过微CT扫描(图7)。在离体Bioscan成像(图6)上局部热斑直观地与所有肿瘤相关联。尽管淋巴结是可见的，没有放射性和它们有关，表明缺乏肿瘤细胞浸润。图6和7中的主要肿瘤在组织学上被分类为腺癌。发明人已经用微CT扫描了广泛多种的皮下肿瘤，全部可非常容易地检测到直径低于少于300微米。

皮下的小鼠CT26肿瘤的最初的RF消融是成功的，并产生严重的细胞损伤(图8)，如在处理的H&E-染色切片上细胞膜损失所显示的。

            C.实施例III：非小细胞肺癌

在携带人NSCLC腺癌A549细胞系(腺癌已经成为最常见的人肺癌组织学类型)的SCID(严重组合的免疫缺陷突变)小鼠上进行成像和生物分布研究。在五只动物中的初步中试结果是鼓舞人心的，并证明了新药剂NM404克服了NM-324化合物的局限性。同时对NM324有适当的良好肿瘤吸收，由于高的肝首过清除损害了成像。然而，NM404表现出极好的肿瘤显影，在延迟成像上是特别显著的，具有最少的肝和肾吸收。而且，组织生物分布研究进一步证实了存在于肿瘤的高水平的放射性。在SCID小鼠-人NSCLC模型中，NM324和NM404成像的比较如图4所示。注意到用NM404的肝、肾和肠活性相对缺乏和极好的肿瘤显影有关。尽管成像结果与NM404和NM412相似，但发现相对于NM412用NM404在大鼠中得到的最近剂量学数据显示了较低的肾剂量，因此选择NM404用于进一步研究。

在数个肿瘤模型中原型药剂¹²⁵I-NM324的广泛的生物分布数据，先前已经汇编。Counsell R E，Schwendner S W，Meyer K L，Haradahira T，Gross M D.Tumor visualization with a radioiodinatedphospholipid ether.J Nucl Med 31(3)：332-336，1990；Plotzke K P，Fisher S J，Wahl R L，Olken N M，Skinner S，Gross MD，Counsell R E.Selective localization of a radioiodinated phospholipid ether analog inhuman tumor xenograftes.J Nucl Med 34(5)：787-792，1993；Rampy MA，Brown R S，Pinchuk A N，Weichert J P，Skinner R W，Fisher S J，Wahl R L，Gross M D，Etheir S P，Counsell R E.Biological dispositionand imaging of a radioiodinated alkyphospholine in two rodent modelsof breast cancer.J Nucl Med 37(9)：1540-1545，1996。在注射后的延迟的时间，发现肿瘤与血液的比值超过8∶1。例如，在大鼠乳房肿瘤模型中，在96小时，肿瘤与正常组织的比值达到最大值，肿瘤与血液的比值是8.6，肿瘤与肌肉的比值是20∶1。Rampy M A，Brown R S，Pinchuk A N，Weichert J P，Skinner R W，Fisher S J，Wahl R L，Gross M D，Etheir SP，Counsell R E.Biological disposition andimaging of aradioiodinated alkyphosphocholine in two rodent models ofbreast cancer.J Nucl Med 37(9)：1540-1545，1996。此外，PLE-相关的放射性的生物分布在肿瘤中是不均匀的，如由显微放射自显影术研究证明的，所述研究显示了PLE放射性唯一地存在于有活力的肿瘤细胞中，所述肿瘤细胞位于朝外侧区域而不是中心坏死区域。Rampy M A，Brown R S，Pinchuk A N，Weichert J P，Skinner R W，Fisher S J，Wahl R L，Gross M D，Etheir S P，Counsell RE.Biological dispositionand imaging of a radioiodinated alkyphosphocholine in two rodentmodels of breast cancer.J Nucl Med 37(9)：1540-1545，1996。至此仅在前列腺和A549肺癌模型中完成了NM324和NM404在SCID小鼠的比较生物分布数据。这些研究揭示了，使用NM404具有高的肿瘤与正常组织比，超过25％注射剂量的肿瘤吸收，因此支持我们用于在更多自发肿瘤模型和人中研究PLE类似物的生物分布的愿望。

在SCID小鼠A549肺癌模型中，进行了一个另外的解决NM404和NM324的相对敏感性的研究。每个动物的肺在给药相同剂量的各种药剂后10天被切除，为了增强分辨率，离体成像1小时。图23所示的低分辨率和高放大成像显示了在用NM404成像的两只动物的肺中的病灶放射性的存在，在NM324对中很少或者无吸收。随后的病理学分析证实了在所有4只动物中少量A549微小-转移瘤(直径少于1mm)的存在。在NM404小鼠中的计数率大于在对应的NM324小鼠中的计数率的2.5倍，再次表明NM404优于NM324。

很可能是，因为肿瘤靶向策略看起来好像是随时间包括选择性肿瘤滞留，在目前，相对短生命的核素如¹⁸F或者甚至^99mTc用于标记是不实用的。然而，随着单克隆抗体的早期应用，其只用碘的放射性同位素标记，在将来其可能用选择性的标记如碘-124，标记PLE类似物，其中物理半衰期与PLE肿瘤吸收和保留动力学很好地匹配。事实上，作为肿瘤选择性PET试剂的¹²⁴I-标记的NM404的效用是我们微PET采集的中试计划的主题。这个计划的目标是评估用碘-124标记NM404的可行性，碘-124是有4天物理半衰期的相对新的正电子同位素，并评估其用于小动物模型中肿瘤的PET成像的希望。相对于传统的伽马相机成像，除了利用分辨率增强和提供3-维能力PET成像之外，这个方法将突出氟-18FDG的用途，因为其在肿瘤细胞中的吸收是以不同于利用葡萄糖的生物化学机理发生的。

如以上讨论的，当前可用的示踪剂(例如⁶⁷Ga和¹⁸F-FDG)的效用是受限的，由于对从炎症中区分新生物缺乏专一性。然而，用PLE试剂的初步研究已获得克服这种临床显著局限性的希望，其中在大鼠中角叉藻聚糖-诱导的肉芽肿在背景活性上无法显影而且没有显示组织保留。Counsell R E，Schwendner S W，Meyer K L，Haradahira T，Gross M D.Tumor visualization with a radioiodinated phospholipidether.J Nucl Med 31(3)：332-336，1990。然而，柠檬酸镓，在那个研究中作为对照利用，在肉芽肿中显著地集中。这样的发现进一步证明，扩展了发明人用PLE类似物试剂作为潜在有用的肿瘤选择性成像试剂的研究。

人类研究：基于动物中的非常有希望的药物动力学和成像数据，发明人受激励把放射标记的磷脂醚的研究进入到临床上。在研究中，最初评估未标记的NM404对大鼠和兔子的急性毒性，所述研究在毒理学研究中心进行，在Buffalo的State University of New(SUNY)。在这些急性剂量毒理学研究中，在3.2mg/kg(大于最高预期人剂量的的150倍)的剂量水平没有察觉毒性效应。而且，在该高剂量水平证明无血小板激活性质。

未标记的NM324给予五个正常的无疾病的人，以便获得放射性药物研究委员会(RDRC)对放射标记的药剂用以人给药的批准。这些受试者没有中毒的迹象，如通过症状、临床检查、生命指征和连续的血液化学显示的。

作为中试可行性计划，4个肺癌患者在Ann Arbor，Michigan V A医院在RDRC批准下，采用¹³¹I-标记的NM324进行研究。肺部肿瘤在患有肺癌的全部三个患者(两个具有NSCLC，而1个具有小细胞肺癌)中是清楚显影，以下详细描述。肿瘤吸收的程度，在不同的时间点，从1+(背景上几乎不能看得见)变化到3+(强烈地吸收，比正常结构大得多)。注意的是，选择用于这些最初研究的患者是患有已知的相对大的癌症的那些。在这个阶段没有计划研究其中存在肿瘤分类问题的患者。

病史：

患者01是一位55岁的老年妇女，患有右中叶肺肿块，侵蚀到右肋，组织学上是很可能肺起源的粘蛋白产生性腺癌。在6小时的最初的¹³¹I-NM324闪烁成像中显示了在右侧肺中部的吸收的病灶。因为与闪烁研究无关的原因，患者不能够返回医院超过进一步的成像期6小时。

患者02是62岁的老年男人，患有大(9×7×7.5cm)的从主动脉肺窗和左脐扩散的分成小叶的纵隔肿块。组织类型是小细胞未分化的(燕麦形细胞)癌。¹³¹I-NM324内烁成像显示了在左上肺部病灶的吸收，随时间发展相对于正常的背景活动，其在强度上增加了。

患者03，一位74岁的老年男人，患有右上叶NSCLC(腺癌)，先前放疗治疗了5个月。疾病在左小舌(2.5×2×3em的块)、下胸椎(大约是T8)和肝的右叶上复发。¹³¹I-NM324闪烁显像术显示了在肺部肿块和胸椎病变相当确定的吸收，其证明了随时间发展增加了靶点与背景的比值(图2)。在肝转移中的吸收不能被消除在正常肝背景之上。

这些研究提供了放射标记的PLE类似物的临床希望的早期模糊感觉。尽管¹³¹I是用于成像目的的次最适度的试剂，但清楚描述了在所有三种肺肿瘤中的吸收。如期望的，基于先前的动物生物分布实验，在肿瘤中的活性随时间增加，如在患者02和03中清楚地证明了。在患者03中，肿瘤与正常组织的比值从第2天的2.74增加至第7天的4.23。因后来的成像期间超过6小时，患者01不能返回。增加的靶点与背景的比值构成了有力的证据，证明肿瘤显影的机理不是仅仅基于异常的血流或肿瘤的血管过度形成。实际上，使用^99mTc人血清白蛋白的动物研究证实这个发现。

评估用NM404的非小细胞肺癌(NSCLC)患者的临床试验

尽管在25/25异种移植物和自发啮齿动物模型中，NM404已经表现出选择性和延长的肿瘤保留，但医生发起的IND最近开始了该试剂在4期人非小细胞肺癌患者中的临床评估，以便确定它在人类中是否表现出相似的肿瘤吸收和保留性质。到此为止，两个具有晚期NSCLC的患者在注射小于1mCi的¹³¹I-NM404后成像。在预定的时间收集血液和尿样品，在给药后的数个时间点进行伽马成像。在两个患者中，在原发性肺癌中证明了NM404的显著肿瘤吸收和保留，如图29和30中所见的。相对于采用其第一代前期物质NM324先前所见的高的肝吸收值，NM404在肝和腹部活性低得多，这提示评价这种试剂在其它腹部癌症包括胰腺癌、结肠癌和前列腺癌中的可行性。

材料和方法：静脉内注射碘-131标记的NM40(1mCi/20μg)后，具有晚期NSCLC的患者用GE Maxxus双头SPECT扫描仪在第3、6、24、48、96小时和第7天和第11天扫描。收集血液和尿样品用于药物动力学分析和临床血液学，肾和肝的生物学分析。

结果：初期的定性成像结果显示尽可能早在注射后24小时碘-131标记的NM404清楚地集中于左右肺的肿块中，并选择性保留于这些肿瘤中超过11天。此外，肝和下腹部包括膀胱、肾和肠的背景放射性显著地低于用其前期物质NM324先前观察到的。在任何患者中没有观察到不良反应。

结论：这些初步发现建议，NM404在人NSCLC中显示了与在啮齿动物模型中先前所见的相似的肿瘤吸收和保留性质。

尽管仅以在这个点的两个患者为基础，但看起来NM404在人非小细胞肺癌中的确集中并经受选择性和延长的肿瘤保留。

患者1：55岁的老年男性，具有双侧3cm的左叶和浸润的右叶NSCLC、脑转移和小右肾上腺肿块。他已经参与很多标准的和实验性的治疗方案。图像包括在图29中。

患者2：70岁老年男性，近来诊断有6cm上叶非小细胞肿块，5mm的肝肿块、髂骨转移和非常小的脑转移。他开始NM404试验的前一周最近完成了对髂骨和脑转移的低剂量的卡铂/紫杉醇化疗和治标的放疗。图像如图30所示。

              D.实施例IV：小鼠胰腺癌模型

发明人还在c-myc小鼠胰腺癌模型中研究NM404(第二代PLE类似物)的肿瘤亲合力，已知该模型产生具有混合的腺泡/导管表型的非侵袭性肿瘤。

材料和方法：两种鼠品系，对于熟知的癌基因c-myc或k-ras其是内源性的，已经在威斯康辛州大学被开发。Sandgren E P，Quaife CJ，et al.，Proc Natl Acad Sci USA.1991；88：93-97；Grippo P J.NowlinP S.等人，Cancer Research.63(9)：2016-9，2003。

c-myc的表达定向于胰腺腺泡细胞，因为它连接弹性蛋白酶启动子，其仅在胰中表达。这些ela-1-myc内源性的小鼠形成了腺泡和导管的瘤形成，其导致了在2-7个月大小之间的死亡。到1个月大小时，胰看起来增厚并坚硬。因此，1-3个月大小的小鼠用作研究胰腺癌的极好的模型。大多数人胰赘生物具有导管形态学，Dr.Sandgren″s转基因靶向策略旨在使肿瘤显影，所述肿瘤对胰腺的导管上皮是特异的。

c-myc模型产生的肿瘤是侵袭性的腺癌，具有混合的腺泡/导管表型。k-ras模型的生物学是明显不同的。k-ras肿瘤已经分类为“原位癌”，指得是它们具有瘤形成的特征，但是它们不侵入，通常保持小型的(＜2mm)。它们的细胞外观非常像早期的人肿瘤，因此从组织学角度看，它们是人类疾病更相关的模型。进一步，它们类似人类疾病的非常早期的阶段。相对于检测c-myc小鼠体内大和更晚期肿瘤，检测k-ras肿瘤的“早期”发育的能力将是朝向鉴别人类中早期(可能医治的)病变特别重要的步骤。k-ras突变是超过90％的人胰腺腺癌的病因，这对评估新肿瘤成像试剂的这种模型的有效性提供更进一步的支持。

成像研究：为了确定NM404是否集中于小鼠胰腺肿瘤中，从尾静脉注射¹²⁵I-NM404(15μCi/20g bw)后2-21天起，六只c-myc内源性小鼠用Bioscan AR-2000放射TLC扫描仪(在发明人的实验室内经改良用于鼠的成像)扫描。在最后的那天，小鼠还经受微CT扫描(42kvp，410μA，390步，MicroCAT-I，ImTek，Inc.，Knoxville，Tenn.)。麻醉小鼠的体内成像后，切除胰腺肿瘤，用相同的扫描仪(装备有高分辨率1mm准直仪和2-D采集和分析软件)离体扫描，以便避免和碘-125低能量有关的组织衰减(图9-10)。处死时，切除组织，称重并在伽马计数器中定量放射性。

结果和讨论：在c-myc模型中采用NM404的最初成像结果表明，在直径5-12mm的所有的腺癌中有显著的吸收和延长的保留(＞21天)。如在先前细胞培养物和体内动物模型研究中观察到的，NM404明显被代谢和从正常细胞中清除，但是被代谢地陷于肿瘤细胞膜上。在其它肿瘤模型中的先前的放射自显影实验已建议，仅是有活力的肿瘤细胞而不是正常组织或坏死组织能够积累NM404。尽管小鼠体内的胰的普遍存在的性质，但发明人采用微CT还能够检测活的小鼠体内的胰腺肿瘤(图11)。尽管携带胰腺肿瘤的动物的数量是少数(n＝6)，但原发性NM404肿瘤对于背景的数据看起来是有希望的。

结论：NM404在这个研究检查的自发的胰腺腺癌中显示了选择性和延长的保留，因此进一步扩大了这种试剂的肿瘤选择性。

          E.实施例V：大鼠神经胶质瘤模型

材料和方法：所有的动物都是依照成斯康辛州大学研究动物资源中心指导方针来饲养和管理。大鼠C6神经胶质瘤细胞在DMEM培养基(Life Technologies，Gaithersburg，Md.)中繁殖，培养基中添加10％的热灭活的FBS(BioWhittaker，Walkersville，Md.)、100U/ml青霉素G、100mg/ml的链霉素和0.01M的HEPES(Life Technologies，Gaithersburg，Md.)。颅内肿瘤的植入根据先前描述的完成(参考文献)。简言之，将1×10⁶C6细胞再悬浮于5ml的1.2％的甲基纤维素中，并注射进麻醉的雌性Wistar大鼠(Harlan，Indianapolis，Ind.)的额叶。假手术的动物接受相同量的不含肿瘤细胞的甲基纤维素的颅内注射。

成像研究：植入后10天，通过MRI证实了颅内肿瘤的存在。简言之，麻醉的大鼠(6)接受2ml的钆双胺(Gd，钆双胺和卡地胺钠注射剂287mg/ml，Nycomed，Princeton，N.J.)腹膜内注射，10分钟后采用1.5德斯拉的临床用MR系统(GE Signa LX)和GE分阶段的排列末端线圈来成像。检查覆盖了每只大鼠的整个大脑的T1-加权的(TR＝500ms，TE＝16.5ms)多切片序列，用以选择携带肿瘤的大鼠，具有多种肿瘤大小，假手术的大鼠注射NM404。

通过在熔化的新戊酸中和Na¹²⁵I的同位素交换，NM404[18-(4-碘代苯基)-十八烷基磷酸胆碱](图3A，100mg)用¹²⁵I来放射性碘化。Weichert，等人.Int J App.Rad Isotopes.1986；37：907-913。HPLC纯化后，尾静脉注射(5-20μCi/200g的大鼠)进入4只携带肿瘤的大鼠和3只假手术的大鼠之前，NM404用2％聚山梨酯20的水溶液溶解。NM404注射后1(n＝1)、2(n＝1)和4(n＝2)天，动物安乐死(CO2)，切除脑，用改良的Bioscan AR2000放射-TLC扫描仪(2分钟的采集/道时1mm的增量和1mm高分辨率准直仪)成像。此外，称重正常的脑、血液、肾、肝、脾、甲状腺和肿瘤组织，并在伽马计数器中计算放射性。然后将放射性组织分布和脑组织学相关联。

结果和讨论：使用NM404的最初成像结果表明，在直径3-5mm的所有神经胶质瘤中有显著的吸收和延长的保留。在假手术对照动物的正常脑组织中的放射性是最小的(图12)，然而NM404在神经胶质瘤中强烈集中(图13)。在携带C6的大鼠中肿瘤与脑的比值(％注射剂量/克)在24、48和96小时时分别是10.5、12.2和6.7。如在先前的细胞培养物和体内动物模型研究中所观察到的，NM404明显被代谢并从正常组织中清除，但在肿瘤细胞膜上代谢地受陷。在其它肿瘤模型中先前的放射自显影实验提示，仅是有活力的肿瘤细胞而不是正常组织或坏死组织能够积累NM404。感兴趣地，甚至测量直径为几个mm的小肿瘤，在给药NM404后也能检出。这些初步的发现建议，NM404还可以用于小侵袭性肿瘤病灶的显影。

结论：如在先前检查的所有肿瘤模型中的情况，NM404显示出对在这个研究评价的大鼠C6-神经胶质瘤的选择性和被其延长的保留。

                 实施例VI：鼠肝肿瘤

在14个异种移植物和自生肿瘤模型中获得的最初结果普遍地显示了NM404在肿瘤中经历了选择性吸收和延长的保留。进一步地，因为NM404较其前期物质提供了更低的肝背景水平，发明人根据使HCC患者成像已有问题的事实将评价扩大到肝肿瘤中。很多患者具有根本的肝硬化，因此用交叉断面成像是难以从HCC中区分再生的小瘤。此外，评估用PDG扫描的PET初步研究在检测疾病中已经显示了仅有20-50％的灵敏度。Verhoef C，Valkema R.等人，Liver(2002)22：51-56。

材料和方法：内源性小鼠HCC模型。在过度表达TGFα基因的内源性小鼠中自生的肝细胞癌的发生，已广泛地评估了，并且是用于研究这种疾病的非常有希望的动物模型。Lee G H，Merlino G，FaustoN.Cancer Research(1992)52：5162-5170。TGFα是上皮细胞的促细胞分裂剂，结合EGF受体；TGFα的未调节的表达导致肿瘤的形成。在锌诱导的金属硫蛋白1(MT1)启动子控制下表达转基因TGFα的雄性CD1小鼠中，12个月大小之后，75-80％发生HCC。然而，当在出生的第15天用烷化剂二乙基亚硝胺(DEN)(化学致癌剂)诱导肿瘤的生长时，90％的小鼠到6个月大才发生HCC。在组织学检查中，这些肿瘤由充分分化的实体型式的肝细胞癌组成。因为肿瘤自发地出现，发明人利用这些动物作为临床前研究的合适的模型。

CT26结肠腺癌异种移植模型：除了自生的HCC模型之外，NM404还在异种移植结肠腺癌肿瘤模型中进行评估，借此CT26细胞(5×10⁵细胞/50μl)先前直接注射进雌性BALB/c小鼠的肝实质中，用于产生局部肝肿瘤。

成像研究：通过在熔化的新戊酸中的同位素交换，NM404(图3A，100μg)用¹²⁵I来放射性碘化。Weichert J P，等人，Int J Applied RadiatIsot(1986)37(8)：907-913。HPLC纯化后，尾静脉注射(15μCi/20g的小鼠)进入3只TGFα内源性小鼠或可替代地注射进3只携带CT26-肿瘤的小鼠之前，NM404用2％聚山梨酯20的水溶液溶解。小鼠被麻醉，直至注射后第21天，用改良的Bioscan AR2000放射-TLC扫描仪(2分钟采集/道时，1mm的增量和1mm高分辨率准直仪)扫描，还在ImTek微CT扫描器(390步)中扫描用于解剖学对比。采用Amira软件显示了微CT图像。处死时，最初切除携带肿瘤的肝，并离体扫描。然后切除肿瘤，称重、离体扫描并计算放射性。病变样品接受组织学分类。

结果和讨论：采用NM404的最初成像结果(图14、15)显示，在肝的自生癌和植入癌中有显著的吸收(＞20％剂量/克)和延长的保留。NM404肿瘤的保留在这些动物中持续了21天，预定的研究终末点。增强对比度的微CT图像证实了所有肝肿瘤的存在和精确定位(图14，16)。肿瘤组织的类脂提取和随后的HPLC分析显示，放射性仍然和母体化合物有关。如在先前的细胞培养物和体内动物模型研究中所观察到的，NM404明显被代谢并从正常细胞中清除，但是在肿瘤细胞膜上代谢受陷。

结论：如在检查的所有先前肿瘤模型中的所述情况，NM404通过在这个研究中评估的自生的和异种移植鼠肝肿瘤模型显示了选择性和延长的保留。

          G.实施例VII：Apc^Min/+自生的乳腺癌模型

材料和方法：Apc^Min/+小鼠模型：这个模型由携带Apc的Min等位基因的小鼠(Apc^Min/+小鼠)组成。这个模型提供了相对于异种移植模型的特异优点，因为雌性Apc^Min/+小鼠是易发生乳腺增生和乳腺癌、肠腺癌。针对C57BL/6J遗传背景，约5％的未处理的雌性动物到100天大小时发生乳腺肿瘤。Moser A R，Dove，等人.Proc Natl Acad SciUSA(1993)90：8977-81。乳腺病变的发病率和多样性可以由单剂量的乙基亚硝基脲(ENU)(直接作用的烷化剂)而增加。用ENU处理导致90％的B6 Apc^Min/+雌性动物发生平均数为3个乳腺鳞状细胞癌(SCC)，但是处理后60天内很少增生病变。

Apc^Min/+小鼠在Apc(腺瘤样结肠息肉)基因中携带单个碱基对改变。APC/Apc基因编码具有多个潜在的功能结构域的蛋白质。Groden，J.，Thliveris，A.，Samowitz，W.，Carlson，M.，Gelbert，L.，Albertsen，H.，Joslyn，G.，Stevens，J.，Spirio，L.，Robertson，M.等人.Identificationand characterization of the familial adenomatous polyposis coli gene.Cell，(1991)66，589-600；Kinzler，K.W.，Nilbert，M.C.，Vogelstein，B.，Bryan，T.M.，Levy，D.B.，Smith，K.J.，Preisinger，A.C.，Hamilton，S.R.，Hedge，P.，Markham，A.等人。Identification of a gene located atchromosome 5q21 that is mutated in colorectal cancers.Science，(1991)257，1366-70。小鼠和人APC蛋白质是90％相同的，所有潜在的功能结构域是保守的。APC调节β-连环蛋白水平。β-连环蛋白在细胞中有多种作用，包括E-钙粘蛋白的稳定和通过LEF和TCF家族的转录因子调节转录。Aberle，H.，Schwartz，H.和Kemler，R.Cadherin-CateninComplex--Protein Interactions and Their Implications For CadherinFunction.Journal of Cellular Biochemistry，(1996)67，514-523；Huber，O.，Korn，R.，McLaughlin，J.，Ohsugi，M.，Herrmann，B.G和Kemler，R.Nuclear localization of beta-catenin by interaction with transcriptionfactor LEF-1.Mechanisms of Development，(1996)59，3-10；Behrens，J.，Vonkries，J.P.，Kuhl，M.，Bruhn，L.，Wedlich，D.，Grosschedl，R.和Birchmeier，W.Functional Interaction of Beta-Catenin With theTranscription Factor Lef-1.Nature，(1996)382，638-642。β-连环蛋白水平的调节包括APC、axin或conductin，与含β-连环蛋白的糖原合酶激酶3β(GSK3β)的相互作用。Behrens，J.，Jerchow，B.A.，Wurtele，M.，Grimm，J.，Asbrand，C.，Wirtz，R.，Kuhl，M.，Wedlich，D.和Birchmeier，W.Functional interaction of an axin homolog，conductin，with beta-catenin，APC，and GSK3beta.Science，(1998)280，596-9；Ikeda，S.，Kishida，S.，Yamammoto，H.，Murai，H.，Koyama，S.和Kikuchi，A.Axin，a negative regulator of the Wnt signaling pathway，forms a complex with GSK-3beta and beta-catenin and promotesGSK-3beta-dependent phosphorylation of beta-catenin.EMBO Journal，(1998)77，1371-84；Kishida，S.，Yamamoto，H.，Ikeda，S.，Kishida，M.，Sakamoto，I.，Koyama，S.和Kikuchi，A.Axin，a negative regulator ofthe wnt signaling pathway，directly interacts with adenomatous polyposiscoli and regulates the stabilization of beta-catenin.Journal of BiologicalChemistry，(1998)273，10823-6；Sakanaka，C.，Weiss，J.B.和Williams，L.T.Bridging of beta-catenin and glycogen synthaseKinase-3beta by axin and inhibition of beta-cutenin-mediatedtranscription.Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America，(1998)95，3020-3；Rubinfeld，B.，Albert，I.，Porfiri，E.，Fiol，C.，Munemitsu，S.和Polakis，P.Binding of GSK3betato the APC-beta-catenin complex and regulation of complex assembly.Science，(1996)272，1023-6；Rubinfeld，B.，Souza，B.，Albert，I.，Muller，O.，Chamberlain，S.H.，Masiarz，F.R.，Munemitsu，S.和Polakis，P.Association of the APC gene product with beta-catenin.Science，(1993)262，1731-4；Polakis，P.The adenomatous polyposis coli(APC)tumorsuppressor.Biochimica et Biophysica Acta，(1997)7332，F127-47。这种相互作用导致β-连环蛋白的磷酸化，其通过泛激素-蛋白酶体途径靶向它进行降解。Rubinfeld，B.，Souza，B.，Albert，I.，Muller，O.，Chamberlain，S.H.，Masiarz，F.R.，Munemitsu，S.和Polakis，P.Association of the APC gene product with beta-catenin.Science，(1993)262，1731-4；Su，L.K.，Vogelstein，B.和Kinzler，K.W.Association ofthe APC tumor suppressor protein with catenins.Science，(1993)262，1734-7；Polakis，P.Mutations in the APC gene and their implicationsfor protein structure and function.Current Opinion in Genetics &Development，(1995)5，66-71；Aberle，H.，Bauer，A.，Stappert，J.，Kispert，A.和Kemler，R.beta-catenin is a target for theubiquitin-proteasome pathway.EMBO Journal，(1997)76，3797-804。在APC中的大多数种系和体细胞突变导致蛋白质丢失一部分或所有的β-连环蛋白结合位点。^26，28，29Polakis，P.Mutations in the APC gene andtheir implications for protein structure and function.Current Opinionin Genetics & Development，(1995)5，66-71；Nagase，H.andNakamura，YMutations of the APC(adenomatous polyposis coli)gene.Human Mutation.(1993)2，425-34；Beroud，C.and Soussi，T.APCgene：database of germline and somatic mutations in human tumors andcell lines.Nucleic Acids Research，(1996)24，121-4。该相互作用需要APC的两个区域；由Min等位基因编码的截短的蛋白质缺乏这些区域的这两个；Polakis，P.Mutations in the APC gene and their implicationsfor protein structure and function.Current Opinion in Genetics &Development，(1995)5，66-71；Su，L.K.，Kinzler，K.W.，Vogelstein，B.，Preisinger，A.C.，Moser，A.R.，Luongo，C.，Gould，K.A.和Dove，W.F.Multiple intestinal neoplasia caused by a mutation in the murinehomolog of the APC gene.Science，(1992)256，668-70。APC还在β-连环蛋白向细胞核外的转运中起作用。因此，缺乏APC功能时，β-连环蛋白将在细胞质和细胞核中聚积，可能影响靶基因的转录和通过E-钙粘蛋白的细胞-细胞相互作用。APC突变在人的数种肿瘤类型包括肠肿瘤和其它上皮肿瘤中是常见的。在APC基因座杂合性的缺失或增加β-连环蛋白的水平，在超过25％的乳腺癌中发现了。Furuuchi，K.，Tada，M.，Yamada，H.，Kataoka，A.，Furuuchi，N.，Hamada，J.，Takahashi，M.，Todo，S.，和Moriuchi，T.Somatic mutations of theAPC gene in primary breast cancers.Somatic mutations of the APCgene in primary breast cancers，American Journal of Pathology.(2000)156：1997-2005；Jonsson，M.，Borg，A.，Nilbert，M.，和Andersson，T.Involvement of adenomatous polyposis coli(APC)/beta-cateninsignaling in human breast cancer.Involvement of adenomatouspolyposis coli(APC)/beta-catenin signaling in human breast cancer，European Journal of Cancer.(2000)36：242-248。因此，在这些小鼠中出现的病变的类型和人乳腺癌比，在分子和组织学上将是相似的。

遗传背景可影响发生乳腺病变的发病率、潜伏期以及类型。例如，FVB×B6Apc^Min/+雌性小鼠中每只小鼠发生平均0.2个乳腺肿瘤，但是在120天治疗中每只小鼠4个增生。BALB/×B6Apc^Min/+每只小鼠发生平均1.8个乳腺肿瘤和0.6个增生。Moser A.R.，Hegge L.F.，CardiffR.D.Cancer Research(2001)61：3480-3485。FVB×B6和BALB/×B6Apc^Min/+小鼠都会生成乳腺SCC和腺癌(AC)。

FVB×B6Apc^Min/+小鼠中的增生病变可被分类为小泡状增生或鳞状小结。Moser A.R.，Hegge L.F.，Cardiff R.D.Genetic backgroundaffects susceptibility to mammary tumors and hyperplasias inApc^Min/+mice，遗传背景对Apc^Min/+小鼠乳腺肿瘤的易感性和超常增生的影响，Cancer Research(2001)61：3480-3485。小泡状增生是腺癌的前期形式，鳞状小结是SCC的前期病变。因此，通过操纵遗传背景，可产生发生多种类型的超常增生和癌的小鼠，通常在同一动物中。类似非典型小叶的小泡状增生(A型)通常可在人类乳房样品中发现。Cardiff，R.D.和Wellings，S.R.人类和小鼠乳腺的比较病理学，Thecomparative pathology of human and mouse mammary glands，Journalof Mammary Gland Biology&Neoplasia.(1999)4：105-22。这些非典型小叶在患有乳腺癌症的女性的癌性乳腺或对侧乳房中更普遍。尽管SCC不是乳房肿瘤的常见类型，但AC类似人类乳房肿瘤的普通类型。此外，在人类乳癌中普遍存在具有APC途径变更的肿瘤。APC部位的杂合性的损失或β-连环蛋白水平的增加在超过25％乳癌中发现。Furuuchi，K.，Tada，M.，Yamada，H.，Kataoka，A.，Furuuchi，N.，Hamada，J.，Takahashi，M.，Todo，S.，和Moriuchi，T.初期乳癌中APC基因的躯体变异，Somatic mutations of the APC gene in primarybreast cancer，American Journal ofPathology.(2000)156：：1997-2005.35。Jonsson，M.，Borg，A.，Nilbert，M.，和Andersson，T.。包含在人类乳癌中腺癌的结肠息肉病(APC)/β-连环蛋白的传号。Involvement of adenomatous polyposis coli(APC)/β-catenine signaling in human breast cancer，Eur Journal of Cancer，(2000)36：242-248。因此，这些小鼠上出现的病变类型将在分子水平上、组织结构上与人类乳癌相似。该模型的独特的方面和优点是能够产生通常在同一个动物上生成多种类型的乳房超常增生和癌的小鼠。这样我们可以测试NM404在同一动物上对多种类型的超常增生和肿瘤的吸收和保留。

小鼠感染多瘤病毒导致产生多种肿瘤类型包括乳房肿瘤。在小鼠乳房肿瘤病毒LTR(MMTV)的控制下表达多瘤中T抗原(PyVT)的内源小鼠迅速产生多病灶的乳房发育异常和肿瘤。Amy Moser；Guy，C.T.，Cardiff，R.D.，和Muller，W.J.表达多瘤病毒中T肿瘤基因对乳房肿瘤的诱导作用：用于转移疾病的内源小鼠模型，Induction ofmammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene：atransgenic mouse model for metastatic disease，Molecular& CellularBiology.(1992)12：954-61。原位癌的证据可早在3周时被发现，100％的乳房肿瘤发病率可早在5周时被发现。肿瘤主要被分类为AC和/或腺癌。小鼠在出现原发性肿瘤的50天内在肺部发生多重转移病变。Lifsted，T.，Le Voyer，T.，Williams，M.，Muller，W.，Klein-Szanto，AA.，Buetow，K.H.，和Hunter，K.W.鉴别包含乳房肿瘤基因修饰因子的近亲繁殖的小鼠品种的发病时间和转移进展，Identification of inbredmouse strains harboring genetic modifiers of mammary tumor age ofonset and metastatic progression，Int J of Cancer.(1998)77：640-4。因此，这些小鼠提供了转移乳癌的快速模型。至于Apc^Min/+小鼠，遗传背景影响肿瘤发生的时间过程以及转移的传播。Lifsted，T.，Le Voyer，T.，Williams，M.，Muller，W.，Klein-Szanto，AA.，Buetow，K.H.，和Hunter，K.W.鉴别包含乳房肿瘤基因修饰因子的近亲繁殖的小鼠品种的发病时间和转移进展，Identification of inbred mouse strains harboringgenetic modifiers of mammary tumor age of onset and metastaticprogression，Int J of Cancer.(1998)77：640-4。因此，发明人使用杂交产生肿瘤发生较慢过程的小鼠。PyVT可伴随SRC激酶家族的成员，磷脂酰肌醇-3”激酶，SHC衔接蛋白和蛋白磷酸酶2A。Dankort，D.L.和Muller，W.J.乳癌转移的转基因模型，Transgenic models of breastcancer metastasis，Cancer Treatment& Research.(1996)83：71-88。在人类乳房肿瘤中常常可观察到SRC家族激酶的激活作用。Amy Moser；Muthuswarny，S.K.和Muller，W.J.Src家族的酪氨酸酶在乳房肿瘤发生中的激活作用，Activation of the Src family of tyrosine kinases inmammary tumorigenesis，Advencesin Cancer Research(1994)64：111-23。

成像研究：在熔融的新戊酸中用¹²⁵I通过同位素交换将NM404(图3A，100μg)放射性碘化。HPLC纯化之后，将其溶解于2％吐温-20的水溶液中，然后经尾部静脉注射(15μCi/20g小鼠)入6只雌性Apc^Min/+小鼠中。将小鼠麻醉并在改良的Bioscan AR2000 radio-TLC扫描仪(2min采集/道时1mm增值，以及1mm高分辨率准直仪)以及ImTek微CT扫描仪(390步)上进行扫描以直到注射后50天进行解剖学对照。微CT成像用Amira软件显示。处死小鼠时，将乳腺或切除的肿瘤离体成像，将病变切除，称重，并放射性定量。病变样品进行组织学分类。如果需要，可将在发明人的实验室中开发的适合用于长时间微CT采集次数的长效CT血池造影剂(BP10)，在CT扫描之前静脉内注射，以使帮助血管显影。(图19)。Weichert JP，等，Radiology(2000)216：865-871。

结果和讨论：该模型由于超常增生乳房病变、乳房癌和肠腺瘤发生在同一小鼠上而显得独特。使用NM404的初始成像结果(图17，18)表明，在所有自发的乳房癌，其直径为2-15mm中有显著的吸收(＞20％剂量/g)以及延长的保留。尽管肿瘤定位看起来很快，但在身体的清除期，肝和胆的背景放射性仍持续几天。经HPLC分析放射性尿和粪便表明，代谢产物的存在且没有母体化合物NM404。肿瘤对NM404的保留持续50天，即预定的研究终点。然而NM404并不集中在这些小鼠中常见的肠腺瘤的息肉中(图18)。微CT成像证实了所有乳房肿瘤的存在及其精确位置(图19)。肿瘤组织的脂类提取以及之后的HPLC分析表明母体化合物仍伴随着放射性。如在先前的细胞培养物研究中观察到的，NM404在正常细胞中被明显地代谢和消除，但在肿瘤细胞膜中被代谢地捕获。

结论：NM404在至今试验的动物和人类的异种移植肿瘤模型中显示出显著的肿瘤亲和力。此外，尽管其在该自发性肿瘤模型中显示出对乳房肿瘤的选择性和被其延长的保留，但它不会集中在有关的肠腺瘤息肉中。

     H.实施例VIII：在Apc^Min/+内源性乳房腺癌模型中

             超常增生与瘤形成的特异性

材料和方法：Apc^Min/+小鼠模型：该模型由推带有Apc的Min等位基因小鼠(Apc^Min/+小鼠)构成。该模型提供与异种移植物模型相比特殊的优点，因为雌性Apc^Min/+小鼠易发生乳房超常增生和癌以及肠腺瘤。在C57BL/6J基因背景上，大约5％未处理的雌性小鼠在100天时将发生乳房肿瘤。Moser AR，Dove等，Proc Natl Acad Scl USA(1993)90：8977-81。单一剂量的乙基亚硝酸脲(ENU)，一种直接作用的烷化剂可增加乳房病变的发生率和多样性。用ENU处理使90％的B6Apc^Min/+雌性小鼠在处理后60天内发生平均3个乳房鳞状细胞癌(SCC)，但是很少超常增生病变。

遗传背景可影响发生的乳房病变的发病率、潜伏期以及类型。例如，FVB×B6Apc^Min/+雌性小鼠中每只小鼠发生平均0.2个乳房肿瘤，但是在120天治疗中每只小鼠4个增生。BALB/×B6Apc^Min/+每只小鼠发生平均1.8个乳房肿瘤和0.6个增生。Moser A.R.，Hegge L.F.，Cardiff R.D.Cancer Research(2001)61：3480-3485。FVB×B6和BALB/×B6Apc^Min/+小鼠都会生成乳房SCC和腺癌(AC)。

成像研究：在熔融的新酸中用¹²⁵I通过同位素交换将NM404(图3A，100μg)放射性碘化。HPLC纯化之后，将其溶解于2％吐温-20的水溶液中，然后经尾部静脉注射(15μCi/20g小鼠)入6只雌性Apc^Min/+小鼠中。将小鼠麻醉并直到注射后30天在改良的Bioscan AR2000放射-TLC扫描仪(2min采集/道时1mm增值，以及1mm高分辨率准直仪)以及ImTek微CT扫描仪(390步)上进行扫描以进行解剖学对照。微CT成像用Amira软件显示。处死小鼠时，将乳腺或切除的肿瘤离体成像，将病变切除，称重，并放射性定量。将损伤样品进行组织学分类。如果需要，可将在发明人的实验室中开发的适合用于长时间微CT采集次数的长效CT血池造影剂(BP10)，在CT扫描之前静脉内注射，以便帮助血管显影。(图22)。Weichert JP，等，Radiology(2000)216：865-871。

结果和讨论：该模型由于超常增生乳房病变、乳房癌和肠腺瘤发生在同一小鼠上而显得独特。使用NM404的初始成像结果(图20，21)表明，在所有自发的乳房癌，其直径为2-15mm中有显著的吸收(＞20％剂量/g)以及延长的保留。尽管肿瘤定位看起来很快，但在身体的清除期，肝和胆的背景放射性仍持续几天。经HPLC分析放射性尿和粪便显示出代谢产物的存在且没有母体化合物NM404。肿瘤对NM404的保留持续＞21天，即预定的研究终点。然而NM404并不集中在这些小鼠中常见的局部小泡状超常增生或肠腺瘤样息肉中(图21)。微CT成像证实了所有乳房肿瘤的存在及其精确定位(图22)。NM404在正常细胞中被明显地代谢和消除，但在肿瘤细胞膜中被代谢地捕获得。

结论：NM404在至今试验的20/20动物和人类的异种移植肿瘤模型中显示出显著的肿瘤亲和力。此外，尽管其在该自发性肿瘤模型中显示出对乳房腺癌和鳞状细胞癌的选择性和被其延长的保留，但它不集中在有关的局部小泡状超常增生或肠腺瘤息肉中并因此表现出对恶性肿瘤细胞的选择性。

           I.实施例IX：NM404选择性保留的机制

前言：特定的磷脂醚类似物，如NM404，选择性地在许多类型肿瘤细胞中保留很长时间。发明人寻求利用酶评价法来测定磷脂酶D(PLD)蛋白的活性和定量PCR，来评价NM404在肿瘤细胞中的选择性保留的机制。发明人假定肿瘤细胞中PLD水平的降低导致代谢和排泄NM404能力的降低。

方法：鼠类肿瘤细胞系的单细胞悬浮液，包括hepa-1(肝癌)，CT26(直肠结肠腺癌)以及TS/A(乳房腺癌)用下列两种方法分析：(1)Amplex^Red测定法，用商业上可获得的试剂盒(Molecular Probes)，其用荧光微板读数器评价PLD蛋白活性，以及(2)定量PCR测定PLDmRNA的水平。将肿瘤细胞系与正常的肝脏组织相比较，其显示较高的NM404的吸收和消除水平并因此与其他正常组织相比可能具有较低的PLD水平。对于Amplex^Red测定法，用洗涤剂溶液(Triton-X-100)提取出总蛋白并且将PLD的量与标准阳性对照进行比较。对于PCR，将mRNA纯化并且用逆转录酶(Promega)转化为cDNA。实时PCR的放大cDNA的条件包括：(94℃，30sec；65℃，30sec；和72℃，30秒)循环50次(iCycler，iQmix，Bio-Rad)。使用PLD1引物，(正文)5′-TCTGGTTTCACCCCGTCAGM-3′，(反义)5′-TTGCTCATATCTGCGGCGAT-3′。将产品与从1μg稀释至10^-7μg的标准cDNA(GAPDH，Biosource)相对比。所有的测试均为双份。

结果：PLD测定的数量如表3所示。所有细胞系中的PLD蛋白活性和mRNA水平均显著低于正常肝脏组织(p＜0.05，T-检验)。

结论：在鼠类肿瘤细胞系中观察到了降低的PLD蛋白活性和PLDmRNA的减少。因此，NM404的选择性保留的机制可能归因于PLD分解NM404减少。肿瘤中降低的PLD活性可能起抗肿瘤药物的潜在分子靶的作用。

表3

细胞/组织	PLD蛋白活性(mU/荧光/μg蛋白/ml)	mRNA(μg×10-5/0.01μg总cDNA)
			Hepa-1CT26TS/A正常肝脏	3.37.82.814.1	6.22.44.012.2

       J.实施例X：内源性鼠类乳房肿瘤模型中的治疗特征

NM404治疗研究的模型：尽管长期的存活对成像研究并不是必需的，但是对提出的治疗研究来说是有利的。用于成像研究的模型患有伴随而来且常常致使动物死亡的肠肿瘤。为了增加每只小鼠发生肿瘤的数量并减少肠肿瘤的数量，以期望增加携带肿瘤小鼠的寿命，Dr.Moser最近将B6Min/+雄性小鼠与C57BR/cdj(BR)雌性小鼠杂交。得到的BRB6F1Min/+雌性小鼠与B6Min/+小鼠相比明显发生更多的乳房肿瘤(P＝0.016)，平均为近5个。这两个品系之间患肿瘤小鼠的数目以及至第一个肿瘤的时间并没有什么区别(分别为P＝1和P＝0.06)(图25)。BRB6F1小鼠乳房肿瘤数目的增多，可能部分归因于，与B6Min/+小鼠相比杂交BRB6F1Min/+小鼠的存活时间显著更长(P＝2×10^-7)。

B6和BRB6F1Min/+小鼠在乳腺表型上十分相似，但是在肠肿瘤的易感性方面非常不同。B6和BR品系可被认为对于Min-诱导的乳房肿瘤生成的敏感背景，因为在ENU处理后短时间内小鼠出现了大量肿瘤。然而，BR品至在影响肠肿瘤发生的修饰基因座携带显性抵抗等位基因，这可以证实与提出的治疗研究的相关性。这些品系的比较见表2。

表2.遗传背景影响Min/+小鼠中乳房和肠肿瘤生成

品系	小鼠的#	患有乳房肿瘤的％	乳房肿瘤/小鼠的平均#	具有乳房病变的#(％)	乳房病变/小鼠的平均#	肠肿瘤/小鼠的平均#	平均存活率，以ENU后的天数(范围)表示
								B6	45	93	3.3±2.0	17(38)	0.6±0.9	34±10	64(43-78)
BR×B6	18	94	4.9±2.6	7(39)	0.5±0.7	14±4	91(58-118)
								FVB×B6	18	17	0.2±0.5	18(100)	4.1±2.4	12±6*	127(93-178)

^*16只小鼠的信息，如2只小鼠的肠在处理中丢失。

小鼠由各个品系的雌性和B6Min/+雄性交配产成。雌性小鼠30-45天大小时，用ENU处理，当濒死时处死小鼠。仅显示了来自Min/+小鼠的结果。乳房肿瘤定义为在尸体剖检时辨别的那些肿瘤，同时乳房病变是在1^st、4^th和5^th乳腺的全部量中记录的小的局部病变。肠肿瘤是以来自小肠(十二指肠、空肠和回肠)和整个结肠的三个4cm的切片计数。所有Min/+小鼠出现肠肿瘤。数值是均值±SD。

Min小鼠中NM404的初步成像结果：在初步试验中显示NM404集中在内源性FVB×B6Apc^Min/+小鼠的乳房肿瘤中，两只动物被注射(IV尾静脉)¹²⁵I-NM404(15μCi)并且在注射后的1、4和7天时在改良的Bioscan AR2000放射TLC扫描仪(配备高分辨率1mm准直仪和2-D采集以及分析软件)上成像(图27A，B)。每只动物在安乐死前10天进行微CT扫描(图27)并解剖除去乳腺和伴随的肿瘤。从离体Bioscan成像(图27)上可看到所有肿瘤与局部热斑是相互关联的。尽管淋巴结可见，但是并没有伴随放射性，说明未被肿瘤细胞浸润。在图27C中的主要肿瘤在组织学上分类为腺癌。两只小鼠都各有四个乳房肿瘤，并且在切除乳腺的离体Bioscan成像上可轻易鉴别。

NM404的放射疗潜力：在目前用“成像”剂量(15-20μCi/20g小鼠)的¹²⁵I-标记的NM404进行的小鼠肿瘤吸收和保留研究过程中，观察到几个明显的治疗反应(未公开的结果)。在Apc^Min/+小鼠乳房肿瘤模型中，已普遍注意到，单次静脉内注射NM404之后，肿瘤生长保持静止。注射后约8天一些动物在较大乳房肿瘤上还掉光所有的毛。此外，这些小鼠还生成肠肿瘤，并且常常遭受肠出血，导致的严重贫血，这使它们的脚变白。Dr.Moser注意到在单次注射NM404后大约5天，这些小鼠的脚恢复为粉色。这些动物最后的解剖时，注意到预期的20个左右在该年龄常见的肠肿瘤中只有很少，如果有的话，实际存在。“脚由白变粉”现象也在个体，但是更有力地是，在肠腺癌小鼠模型中观察到，其中在给予NM404之后的12天解剖，这又一次显示，预期的肠肿瘤中的大部分，如果不是全部，消失了。在两个肠模型中，接受NM404的动物轻易地比它们未处理的同窝仔配对物活得更长。在两个各包含多于6只小鼠的单独年龄-配对组中，这些巧合的发现再次被证实。给予¹²⁵I-NM404后的这些观察结果表明了用于放射疗法使用的潜力，尤其如果用碘-131标记。在这个提出的乳房肿瘤模型中进行的定量的肿瘤吸收和保留研究还提供充足的数据以开始着手广泛的该试剂的剂量学分析，以便评估其真实的放射治疗潜力。

同位素选择：由于其具有60天的物理半衰期以及低能量28KeV光子发射，碘-125适合用于小鼠和大鼠的成像试验。碘-125还具有治疗特征，目前已用于长期前列腺简化疗法(brachytherapy)植入物。在一个成像试验中，2只裸小鼠分别在对侧胁腹接种皮下鳞状细胞1和6肿瘤细胞。使用SCC1和6细胞是由于其中一个相对于另一个是放射敏感的。14天后当肿瘤平均尺寸(共4个)接近0.5cm的直径时，其中一只小鼠接受20μCi的用¹²⁵I标记的NM404，另一只小鼠接受未标记的相同剂量NM404。仅接受未标记化合物的小鼠在注射后20天被处死，因为两个肿瘤都已达到我们动物试验计划书中定义的终端尺寸极限。¹²⁵I-NM404小鼠的两个肿瘤在数周内戏剧化和出人意料地退化(图28)。事实上，该小鼠的肿瘤从未达到终端尺寸，90天后该小鼠被实际处死以收集组织学切片。此时，肿瘤的中心已坏死，而周围的边缘变得有些活力的。组织学检查证实了中心坏死和边缘变得有活力。尽管供血因子可能导致该观察结果，但还有可能是¹²⁵I发射的光子使肿瘤外周的电子平衡较差，导致肿瘤的“皮”的供给不足。该电子平衡的问题在辐射肿瘤学中十分重毒。光子在与组织互相影响并发挥其生物学作用之前，经过有限的距离(通过其能量进行测定)。具有过高能量的光子可导致肿瘤小结外周的供给不足，因为光子会在沉积其剂量之前离开小结(离开肿瘤)。这可能成为¹²⁵I光子的问题，但是，低能量能够保证非常集中的沉积。Complex Monte Carlo计算法可使该估算值更准确，但是最好的确定最佳同位素的方法是试验法，因为有许多因素参，其不可能被准确地做成模型(组织分布，多重路径的细节，等等)。¹²⁵I的一个优点是所有的光子都具有低能量，保证了围绕肿瘤的正常组织的暴露非常有限。

碘-131已被用于治疗甲状腺癌，功效显著。非常安全剂量的¹³¹I可控制充分分化的甲状腺癌的亚临床沉积，其与正常甲状腺相比能非常快速地集中碘。这活跃的吸收过程帮助限制对正常组织的剂量。碘-131有β和几种γ发射，但是占优势的组织剂量由β发射引起。发明人将基于甲状腺癌的临床上成功与用Bexxar(以碘-131标记的抗体为基础的试剂)在低级淋巴瘤患者中获得的结果相结合，来选择¹³¹I标记的NM404。占优势的β发射和大部分低能量γ发射在肿瘤小结自身中优化剂量的均一性。并且，更短的半衰期(8天)与¹²⁵I的60天半衰期相比，能提供临床上更相关的剂量强度。这些因素可帮助发明人进行最地判断该物质抗肿瘤的功效。¹³¹I的一个潜在缺点是其具有较高能量的γ发射，其实际上可能使邻近周围组织暴露于与¹²⁵I相比更多的辐射中。本文提出的内源性模型中的肿瘤集中在乳腺的周围，因此不应当对动物整体的健康产生直接的威胁。由于器官毒性也是本研究的终点之一，周围组织和关键器官系统(骨髓、肝脏、肾脏、肠、脑等等)的反应也被评估。组织分布数据和放射性标记的NM404的实际剂量学将决定其最佳治疗潜力。在治疗环境中有可能不同的同位素将互相补充。

应当理解本文描述的实施例和实施方案仅被用于说明目的，并且本领域技术人员可以此为依据作各种修改和改变，并且这些改动包含在本申请的精神和范围和附加的权利要求的范围内。本文中提到的所有申请、专利、专利申请的全文引入作为参考。

                       IV.参考文献

(1)Cancer Facts and Figures.American Cancer Society 2001。

(2)Penna C，Nordlinger B.Colorectal metastasis(liver and lung).Surg Clin North Am 2002；82：1075-10xi。

(3)Fong Y，Fortner J，Sun R L，Brennan M F，Blumgart L H.Clinical score for predicting recurrence after hepatic resection formetastatic colorectal cancer：analysis of 1001 consecutive cases.AnnSurg 1999；230：309-318。

(4)Ike H，Shimada H，Ohki S，Togo S，Yamaguchi S，Ichikawa Y.Results of aggressive resection of lung metastases from colorectalcarcinoma detected by intensive follow-up.Dis Colon Rectum 2002；45：468-473。

(5)O′Dwyer P J，Stevenson J P，Haller D G，Rotman N，Giantonio B J.Follow-up of stage B and C colorectal cancer in theUnited States and France.Seminars in Oncology 2001；28：附录-9。

(6)Wichmann M W，Lau-Werner U，Muller C，Hornung H M，Stieber P，Schildberg F W，The Colorectal Cancer Study Group.Carcinoembryonic antigen for the detection of recurrent diseasefollowing curative resection of colorectal cancer.Anticancer Research2000；20：4953-4955。

(7)Lencioni R，Cioni D，Bartolozzi C，Percutaneousradiofrequency thermal ablation of liver malignancies：techniques，indications，imaging findings，and clinical results，Abdom Imaging2001；26：345-360。

(8)Curley S A，Izzo F，Delrio P，等人.Radiofrequency ablation ofunresectable primary and metastatic hepatic malignancies：Results in123 patients.Ann Surg 1999；230：1-8。

(9)Solbiati L，Livraghi T，Goldberg S N，等人，Percutaneousradio-frequency ablation of hepatic metastases from colorectal cancer：long-term results in 117 patients.Radiology 2001；221：159-166.

(10)Saltz L B，Cox J V，Blanke C，Rosen L S，Fehrenbacher L，Moore M J，Maroun J A，Ackland S P，Locker P K，Pirotta N，ElfringG L，Miller L L.Irinotecan plus fluorouracil and leucovorin formetastatic colorectal cancer.Irinotecan Study Group.N Engl J Med2000；343：905-914。

(11)De Gramont A，Bosset J F，Milan C，Rougier P，Bouche O，Etienne P L，Morvan F，Louvet C，Guillot T，Francois E，Bedenne L.Randomized trial comparing monthly low-dose leucovorin andfluorouracil bolus with bimonthly high-dose leucovorin and fluorouracilbolus plus continuous infusion for advanced colorectal cancer：aFrench intergroup study.J Clin Oncol 1997；15：808-815。

(12)Modulation of fluorouracil by leucovorin in Patients withadvanced colorectal cancer：evidence in terms of response rate.Advanced colorectal cancer Meta-Analysis Project.J Clin Oncol 1992；10：896-903.

(13)Giacchetti S，Perpoint B，Zidani R，Le Bail N，Faggiuolo R，Focan C，Chollet P，Llory J F，Letourneau Y，Coudert B，Bertheaut-Cvitkovic F，Larregain-Fournier D，Le Rol A，Walter S，Adam R，Misset J L，Levi F.Phase III multicenter randomized trial ofoxaliplatin added to chronomodulated fluorouracil-leucovorin asfirst-line treatment of metastatic colorectal cancer.Journal of ClinicalOncology 2000；18：136-147。

(14)Mayr N A.Taoka T.Yuh W T，等人.Method and timing oftumor volume measurement for outcome prediction in cervical cancerusing magnetic resonance imaging.International Journal of RadiationOncology，Biology，Physics 2002；52；1：14-22.

(15)Greven K.Williams D.Keyes J，等人.Can positron emissiontomography distinguish tumor recurrence from irradiation sequelae inpatients treated for larynx cancer？Cancer Journal ScientificaAmerican 1997；3：353-357。

(16)Snyder F，Wood R.Alkyl and alk-1-enyl ethers of glycerol inlipids from normal and neoplastic human tissues.Cancer Research.1969；29：251-257。

(17)Snyder F，Blank M L，Morris H P.Occurrence and nature ofo-alkyl and o-alkyl-l-enyl moieties of glycerol in lipids of Morristransplanted hepatomas and normal rat livers.Biochem Biophys Acta.1969；176：502-510。

(18)Rampy M A，Pinchuk A N，Weichert J P，Skinner R W，Fisher S J，Wahl R L，Gross M D，Counsell R E.Synthesis andbiological evaluation of radioiodinated phospholipid ether stereoisomers.J Med Chem.1995；38：33156-3162。

(19)Weichert J P，Van Dort M E，Groziak M P，Counsell R E.Radioiodination via isotope exchange in pivalic acid.Int J Appl RadIsotopes.1986；37.907-913。

(20)Plotzke K P，Haradahira T，Stancato L，Olken N M，SkinnerS，Gross M D，Wahl R L，Counsell R E.Selective localization ofradioiodinated的alkylphosphocholine derivatives in tumors.Int JRadPart B，Nucl Med & Biology.1992；79(7)：765-773。

(21)Plotzke K P，Fisher S J，Wahl R L，Olken N M，Skinner S，Gross M D，Counsell R E.Selective localization of a radioiodinatedphospholipid ether analog in human tumorxenografts.J Nucl Med.1993；34(5)：787-792。

(22)Rampy M A，Brown R S，Pinchuk A N，Weichert J P，Skinner R W，Fisher S J，Wahl R L，Gross M D，Ethier S P，CounsellR E.Biological disposition and imaging of a radioiodinatedalkylphosphocholine in two rodent models of breast cancer.J Nucl Med.1996；37(9)：1540-1545。

(23)Arthur G，Bittman R.The inhibition of cell sisnalingpathways by antitumor ether lipids.Biochim Biophys Acta.1998；1390：85-102。

(24)Counsell R E，Longino M，Pinchuk A，Skinner S，Weichert J.Synthesis and evaluation of radioiodinated phospholipid ethers forimaging of prostate cancer.Quart J Nucl Med.1997；41(suppl1)：14-16。

(25)Weber S M，Shi F，Heise C，Warner T，Mahvi D M.Interleukin-12 gene transfer results in CD8-dependent regression ofmurine CT26 liver tumors.Ann Surg Oncol 1999；6：186-194。

(26)Imboden M，Murphy K R，Rakhmilevich A L，Neal Z C，Xiang R，Reisfeld R A，Gillies S D，Sondel P M.The level of MHC classI expression on murine adenocarcinoma can change the antitumoreffector mechanism of immunocytokine therapy.Cancer Res 2001；61：1500-1507。

(27)Weichert J P，Longino M A，Bakan D A，Spigarelli M G，Chou T，Schwendner S W，Counsell R E.Polylodinated TriglycerideAnalogs as Potential CT Imaging Agents for the Liver.J Med Chem1995；38：636-646。

(28)Rodent Tumor Models In Experimental Cancer Therapy，Robert F Kallman ed，Pergamon Press，New York，pp 111-132，1987。

“DIAPEUTIC”是Cellectar，LLC的商标。

Claims (25)

1、一种检测和定位患有或怀疑有癌症的受试者中肺癌、肾上腺癌、黑色素瘤、结肠癌、结肠直肠癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌、皮下癌、肠癌、肝细胞癌、成视网膜细胞瘤、宫颈癌的方法，该方法包括以下步骤：

向所述受试者给予磷脂醚类似物；并且

测定所述受试者的怀疑有癌症的器官与周围区域相比是否保持较高水平的所述类似物，其中较高的保留区域表明癌症的检出和定位。

2、权利要求1的方法，其中所述磷脂类似物选自

其中，X选自碘的放射性同位素；n是16到30之间的整数；并且Y选自NH₂、NR₂和NR₃，其中R是烷基或芳基烷基取代基或

其中，X是碘的放射性同位素；n是16到30之间的整数；Y选自H、OH、COOH、COOR和OR，并且Z选自NH₂、NR₂和NR₃，其中R是烷基或芳基烷基取代基。

3、权利要求2的方法，其中X选自由¹²²I、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I和¹³¹I组成的碘的放射性同位素的组。

4、权利要求2的方法，其中所述磷脂醚是18-(对-碘代苯基)十八烷基磷酸胆碱、1-O-[18-(对-碘代苯基)十八烷基]-1，3-丙二醇-3-磷酸胆碱或1-O-[18-(对-碘代苯基)十八烷基]-2-O-甲基-外消旋-丙三醇-3-磷酸胆碱，其中碘是放射性同位素的形式。

5、一种治疗受试者中癌症的方法，它包括：向所述受试者给予有效量的含磷脂醚类似物的分子。

6、权利要求5的方法，其中所述癌症选自肺癌、肾上腺癌、黑色素瘤、结肠癌、结肠直肠癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌、皮下癌、肠癌、肝细胞癌、成视网膜细胞瘤、宫颈癌、神经胶质瘤、乳腺癌、胰腺癌、癌肉瘤和平卧癌。

7、权利要求5的方法，其中所述磷脂类似物选自：

其中，X选自碘的放射性同位素；n是16到30之间的整数；Y选自NH₂、NR₂和NR₃，其中R是烷基或芳基烷基取代基或

其中，X是碘的放射性同位素；n是16到30之间的整数；Y选自H、OH、COOH、COOR和OR，并且Z选自NH₂、NR₂和NR₃，其中R是烷基或芳基烷基取代基。

8、权利要求7的方法，其中X选自由¹²²I、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I和¹³¹I组成的碘的放射性同位素的组。

9、权利要求5的方法，其中所述磷脂醚是18-(对-碘代苯基)十八烷基磷酸胆碱、1-O-[18-(对-碘代苯基)十八烷基]-1，3-丙二醇-3-磷酸胆碱或1-O-[18-(对-碘代苯基)十八烷基]-2-O-甲基-外消旋-丙三醇-3-磷酸胆碱，其中碘是放射性同位素的形式。

10、磷脂醚类似物用于生产治疗癌症的药物组合物的用途。

11、权利要求10的用途，其中所述磷脂类似物选自：

其中，X选自碘的放射性同位素；n是16到30之间的整数；Y选自NH₂、NR₂和NR₃，其中R是烷基或芳基烷基取代基或

其中，X是碘的放射性同位素；n是16到30之间的整数；Y选自H、OH、COOH、COOR和OR，并且Z选自NH₂、NR₂和NR₃，其中R是烷基或芳基烷基取代基。

12、权利要求11的用途，其中X选自由¹²²I、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I和¹³¹I组成的碘的放射性同位素的组。

13、权利要求10的用途，其中所述磷脂醚是18-(对-碘代苯基)十八烷基磷酸胆碱、1-O-[18-(对-碘代苯基)十八烷基]-1，3-丙二醇-3-磷酸胆碱或1-O-[18-(对-碘代苯基)十八烷基]-2-O-甲基-外消旋-丙三醇-3-磷酸胆碱，其中碘是放射性同位素的形式。

14、一种区分受试者体内炎症、腺瘤、增生与瘤形成的方法，它包括以下步骤：

向所述受试者给予磷脂醚类似物；并且

测定受试者的怀疑有炎症、腺瘤、增生或瘤形成的器官与周围区域相比是否保持较高水平的所述类似物，其中较高的保留区域表明瘤形成的检出和定位，并且其中较低的保留区域表明怀疑有腺瘤、增生或炎症的器官的存在。

15、权利要求14的方法，其中所述磷脂类似物选自：

其中，X选自碘的放射性同位素；n是16到30之间的整数；Y选自NH₂、NR₂和NR₃，其中R是烷基或芳基烷基取代基或

其中X是碘的放射性同位素；n是16到30之间的整数；Y选自H、OH、COOH、COOR和OR，并且Z选自NH₂、NR₂和NR₃，其中R是烷基或芳基烷基取代基。

16、权利要求15的方法，其中X选自由¹²²I、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I和¹³¹I组成的碘的放射性同位素的组。

17、权利要求14的方法，其中所述磷脂醚是18-(对-碘代苯基)十八烷基磷酸胆碱、1-O-[18-(对-碘代苯基)十八烷基]-1，3-丙二醇-3-磷酸胆碱或1-O-[18-(对-碘代苯基)十八烷基]-2-O-甲基-外消旋-丙三醇-3-磷酸胆碱，其中碘是放射性同位素的形式。

18、一种在含磷脂酶D(PLD)的组织样品中检测瘤形成的方法，它包括以下步骤：

定量所述组织样品中的PLD蛋白质活性水平或PLD mRNA水平；并且

测定所述组织样品与周围组织区域相比是否具有较低水平的蛋白质活性，其中较低活性区域表明瘤形成的检出和定位，或者

测定所述组织样品与周围组织区域相比是否具有较低水平的mRNA，其中较低mRNA水平区域表明瘤形成的检出和定位。

19、权利要求18的检测瘤形成的方法，其中通过使组织样品与PLE类似物接触来定量PLD蛋白质活性或mRNA水平，所述PLE类似物选自：

其中，X选自碘的放射性同位素；n是16到30之间的整数；Y选自NH₂、NR₂和NR₃，其中R是烷基或芳基烷基取代基或

其中，X是碘的放射性同位素；n是16到30之间的整数；Y选自H、OH、COOH、COOR和OR，并且Z选自NH₂、NR₂和NR₃，其中R是烷基或芳基烷基取代基。

20、权利要求19的方法，其中X选自由¹²²I、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I和¹³¹I组成的碘的放射性同位素的组。

21、权利要求19的方法，其中所述PLE类似物是18-(对-碘代苯基)十八烷基磷酸胆碱、1-O-[18-(对-碘代苯基)十八烷基]-1，3-丙二醇-3-磷酸胆碱或1-O-[18-(对-碘代苯基)十八烷基]-2-O-甲基-外消旋-丙三醇-3-磷酸胆碱，其中碘是放射性同位素的形式。

22、一种抗肿瘤药剂，其通过筛选含PLD的组织样品的方法来选择，该方法包括以下步骤：

定量PLD蛋白质活性或PLD mRNA水平，其中与周围组织区域相比减少的PLD蛋白质活性或减少的mRNA水平预示瘤形成。

23、权利要求22的抗肿瘤药剂，其中通过使组织样品与PLE类似物接触来定量PLD蛋白质活性或mRNA水平，所述PLE类似物选自：

其中，X选自碘的放射性同位素；n是16到30之间的整数；Y选自NH₂、NR₂和NR₃，其中R是烷基或芳基烷基取代基或

其中，X是碘的放射性同位素；n是16到30之间的整数；Y选自H、OH、COOH、COOR和；OR，并且Z选自NH₂、NR₂和NR₃，其中R是烷基或芳基烷基取代基。

24、权利要求23的抗肿瘤药剂，其中X选自由¹²²I、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I和¹³¹I组成的碘的放射性同位素的组。

25、权利要求23的抗肿瘤药剂，其中所述PLE类似物是18-(对-碘代苯基)十八烷基磷酸胆碱、1-O-[18-(对-碘代苯基)十八烷基]-1，3-丙二醇-3-磷酸胆碱或1-O-[18-(对-碘代苯基)十八烷基]-2-O-甲基-外消旋-丙三醇-3-磷酸胆碱，其中碘是放射性同位素的形式。

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