KR20070015518A - 암의 진단 및 치료를 위한 포스포리피드 유사체 - Google Patents

암의 진단 및 치료를 위한 포스포리피드 유사체 Download PDF

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KR20070015518A
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제이미 웨이처트
마크 론기노
아나톨리 핀처크
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셀렉타, 엘엘씨
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Abstract

한 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 암에 걸렸거나 암에 걸린 것으로 의심되는 대상체에서 폐암, 부신암, 흑색종, 결장암, 결장직장암, 난소암, 전립선암, 간암, 피하암, 장암, 간세포 암종, 망막모세포종, 자궁경부암을 검출하고 그 위치를 확인하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (a) 상기 대상체에게 포스포리피드 에테르 유사체를 투여하는 단계; 및 (b) 암에 걸린 것으로 의심되는 대상체의 기관이 주변 영역(들)보다 더 높은 수준의 유사체를 보유하는지 결정하는 단계를 포함하며, 더 높은 수준의 보유 영역은 암의 검출 및 그 위치를 나타낸다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법은 유효량의 포스포리피드 에테르 유사체-포함 분자를 투여하는 것을 포함한다.
포스포리피드 에테르 유사체, 암 검출 및 위치 확인, 암 치료 방법.

Description

암의 진단 및 치료를 위한 포스포리피드 유사체 {PHOSPHOLIPID ANALOGS FOR DIAGNOSIS AND TREATMENT OF CANCER}
<관련 출원>
본 출원은 2004년 3월 2일 출원된 미국 특허 가출원 제60/521,166호를 우선권으로 주장하며, 상기 가출원은 모든 목적에 대해 이 거명을 통해 본원에 포함된다.
본 발명은 일반적으로 종양의 진단 영상, 특히 포스포리피드 유사체를 사용하는 종양의 진단 영상에 관한 것이다.
의심되는 종양을 국한된 단계에서 확인하는 것은 암성 조직의 성공적인 치료 및 제거에 관한 기회를 상당히 증가시켰기 때문에, 암의 조기 검출은 근대 영상 기술의 주요 목표 중 하나가 되어 왔다. 따라서, 다양한 기술 및 방식을 사용하여 다수의 영상 전략을 설계함으로써 의사가 암을 가능한 조기에 정확하게 진단하게끔 보조해 왔다.
불행하게도, 종래의 영상 기술, 예를 들어 컴퓨터화 단층촬영 (CT) 및 MRI (자기 공명 영상)은, 조직의 밀도 또는 형태에서의 차이만을 관찰할 수 있기 때문에, 의심되는 병소를 결정적으로 진단하는 능력이 제한된다. 명확한 진단을 제공하기 위해서는 흔히 보다 침윤성이고 고가인 생검 절차가 필요하다. 대조적으로, 핵 의학 기술, 예를 들어 양전자 방출 단층촬영 (PET) 및 단일 광자 방출 단층촬영 (SPECT)은 대상이 되는 특정 기관 또는 부위에 대한 기능적 또는 생화학적 정보를 제공할 수 있다. 그러나, 이들 핵 영상 기술의 성공은 대부분 적절한 방사성 의약품의 선택적 흡수 및 검출에 의존한다. 선택적 흡수는 또한 표적 조직에 대한 고도의 특이성을 갖는 방사성 의약품의 개발에 의존한다. 불행하게도, 종양학 분야에서 지금까지 개발된 종양-국소화제는 제한된 용도만을 가졌다.
예를 들어, 이러한 선행 기술 화합물들의 하나인 67Ga 갈륨 시트레이트는 본래 종양 조직에서 축적되는 능력이 확인된 바 있다. 불행하게도, 67Ga 갈륨 시트레이트는 염증성 병소를 비롯한 다양한 기타 비-암성 병소에 의해 수용되며, 또한 간 및 비장 조직에서 허용가능하지 않은 양의 방사활성이 축적될 수도 있다. 이들 기관에 방사성 의약품이 급속하게 축적되면 근처 병소의 영상을 심각하게 방해할 수 있으며, 환자에게 안전하게 제공될 수 있는 투여량에 부정적인 영향을 주기도 한다.
대안적인 접근법으로서 종양-특이적 항원으로 지시되는 방사성 표지된 모노클로날 항체 (Mab)가 개발되었다. 그러나, 이러한 모노클로날 항체는 그가 생성되는 특정 종양 조직에 대해서만 특이적이며, 따라서 일반적으로 신생물 조직에서는 국소화되지 않을 것이다. 게다가, 진단 영상에서 Mab의 사용은 다양한 정도의 항원 발현, 낮은 종양 흡수율, 비-특이적 결합 및 불리한 면역원성 반응을 비롯한 추가의 문제를 초래한다.
상기 문제들에 대처하기 위한 시도로서, 종래 발명의 발명자들은 유용한 종양 특이성을 입증하는 일련의 신규 화합물을 확인 및 개발하였다. 예를 들어, 미국 특허 제4,925,649호; 동 제4,965,391호; 동 제5,087,721호; 동 제5,347,030호 및 동 제6,417,384호를 참조하는데, 이들 문헌은 모두 이 거명을 통해 본원에 포함된다. 상기 방사성요오드화 포스포리피드 에테르 유사체는 악성 종양 세포의 독특한 생화학적 특징, 즉 종양 세포막 중의 자연 발생적인 에테르 리피드의 농도가 상응하는 정상 조직에 비해 높은 특징을 이용하는 것으로 여겨진다. 정확한 작용 메카니즘이 완전하게 이해되지는 않았지만, 포스포리피드 에테르 유사체가 종양 막(membrane)에 트랩핑된다는 가설이 우세하다. 따라서, 이들 화합물은 종양 조직 내에 국소화되며, 진단 및(또는) 치료적 이용에 대한 여지가 남아 있다.
상기 특허문헌들에 기재된 방사성 표지된 포스포리피드 에테르 유사체의 선택적 보유는 다양한 설치류 및 동물 종양 이종이식편에서 입증되어 왔으나, 인간 질환을 더 가깝게 모방하는 것으로 생각되는 특발성 종양 모델에서는 입증되지 않았다. 불행하게도, 이들 연구로부터 얻어진 데이터에 따르면 방사성 의약품 화합물이 혈액으로부터 비교적 급속하게 제거되어 바람직하지 않게 비-표적 조직에 축적되는 것으로 입증되었다. 상기 언급한 바와 같이, 비-표적 조직 흡수는 높은 배경 활성을 생성시키거나 또는 방사성감응성 조직을 주입된 방사활성에 과다하게 노출시킴으로써 방사성진단 영상의 효능을 감소시킬 수 있다.
따라서, 비-표적 조직으로부터의 급속한 제거 및 혈장 중에서 연장된 반감기를 나타내되 신생물 조직에 대한 특이성 및 친화성은 여전히 보유하는 방사성 의약 품에 대한 상당한 요구가 당업계에 존재하는 실정이다. 이러한 작용제는 원발성 종양 및 전이의 비-침윤성 영상을 보조할 뿐만 아니라, 특히 가장 흔하게 진단되는 형태의 암에 관한 것이기 때문에, 악성 종양 조직의 부위-특이적 제거에 있어서 세포독성제에 대한 담체로서 작용하기도 한다. 또한, 방사성 의약품은 악성 종양에 대해서는 특이적이지만 선종 및 과다형성을 비롯한 암유발성 조직에 대해서는 특이적이지 않은 것이 바람직하다.
미국에서는 연간 대략 147,000 명이 결장직장암 환자로 새로 진단된다. 이와 같이, 결장직장암은 미국에서 네번째로 가장 많이 발견되는 암이며, 이로 인해 매년 60,000 명이 사망한다.1 치료는 주로 암 단계에 따라 달라지지만, 수술, 방사선, 화학요법 및(또는) 고주파 또는 냉동(cryo) 절제를 포함할 수 있다. 그러나, 결장직장암 환자의 경우에 통상적인 재진에서, 암배아 항원 (CEA), 결장직장 종양 마커의 결정, 및 반복적인 대장내시경검사5는 환자의 50％에서 재발성 질환을 검출하는데 실패한다.6 따라서, 재발성 질환의 검출을 위한 추가의 방법을 개발할 필요가 있다. 추가로, CT 스캐닝 및 RF 절제를 이용한 치료 및 진단 동안, CT 스캔으로부터의 기능적 정보는 얻기 어렵다. 콘트라스트가 높아진 나선형 CT를 이용해서, 종양의 혈관분포상태(vascularity)를 어느 정도 평가할 수 있지만, RF 병소 내에 생존 종양 세포가 잔류하는지를 정확하게 결정하는 방법은 없다. 또한, RF에 의해 생성된 열(thermal) 병소는 통상적으로 절차 후 6개월 이하 동안 절차 후 CT 스캔 상에서 병소 주위의 염증 주변부를 갖는다. PET 스캐닝은 절제 후 환자를 추 적하는데 사용되어 왔지만, RF 열 병소 주위의 염증 주변부는 일반적으로 생존 종양이 없는 경우조차도 흡수량 증가를 나타낸다. 이는 재발성 종양의 조기 검출에 있어서 감응성 및 특이성을 감소시킨다. 따라서, 종양 세포에 대해 특이적이 아니며 감염성 부위 및 과다형성부 (바레트 식도(Barret's Esophagus))로 가는 FDG와는 달리, 악성 종양 세포에 대해 선택적이며 상기 세포에 의해 무수히 많이 보유되는 NM404 유사 작용제가 바람직하다. 게다가, 4일의 물리적 반감기를 가져서 어느 곳으로도 선적될 수 있는 124I 함유 NM404 유사 화합물이, 110분의 반감기를 가지므로 생산 장소로부터 200 마일 내에서만 한정적으로 분배될 수 있는 FDG에 비해 바람직하다. 장시간 보유되며 (대사되지 않음) NM404와 유사한 다른 화합물이 바람직한데, 이는 상기 화합물이 131I와 유사한 적절한 방사성동위원소와 쌍을 이루어 사용되는 경우에 상당한 치료 잠재력을 가질 가능성이 더 크기 때문이다. 또한, 다양한 요오드 동위원소로 표지될 수 있으며 확대된 다양한 능력 (진단 및 요법, 및 실험 동물 연구 수단)을 갖는 NM404 유사 화합물이, PET 스캐닝에 있어서 18F로 한정되거나 또는 매우 낮은 감응성 수준이기는 하지만 자기 공명 영상화에 있어서 잠재적으로 (안정한) 19F로 한정되는 FDG에 비해 바람직하다. 종양 표적화 능력과는 무관하게, FDG는 종양 세포에서 급속하게 대사되므로 요법에 관한 잠재력을 갖지 않는다. 따라서, RF 후 국소적 재발을 조사하기 위해서는 다른 화합물이 필요하다. 마찬가지로, 국소 종양의 진행 또는 재발에 의해 종양이 전이성으로 된 경우에는, 절차 후 별도의 CT 및 PET 스캐닝을 대체하는 하이브리드 영상 방식 (PET와 CT 병용)이 매우 바람직하다.
게다가, 화학요법이 치료 방식인 경우조차도, 화학요법에 대한 반응 모니터링을 개선시키는 것이 필수적이다. 따라서, 조기 마커를 개발하여 화학요법에 대한 반응을 연구함으로써, 의사가 환자를 장기간 치료 독성에 노출시키지 않으면서 효과적이지 않은 화학치료 요법의 사용을 빨리 중단하도록 하는 것이 바람직하다. 외부 빔 조사 요법 (External Beam Radiation Therapy)이 유사한 조직학의 종양을 갖는 환자에 대한 대안적인 치료법인 경우, 종양은 치료-의도의 외부 방사선 요법 (XRT)에 대하여 극적으로 상이한 반응을 나타낼 수 있다. 수술-전 방사선 치료를 받은 몇몇 직장암 환자는 완전한 반응을 나타내지만, (광학 현미경 수준에서) 유사한 조직학을 갖는 다른 환자는 치료에 대해 불량한 반응을 나타내며, 질환이 재발될 것이다. 방사선에 대한 반응은 다수의 위장관 암, 폐암, 두부 및 경부 암, 및 부인과 암을 비롯한 다수의 암에 있어서 궁극적인 종양 조절 및 생존에 대한 예측 인자이다. 대부분의 반응 특성화 방법은 반응을 매우 잘 예측하지만, 치료 완료 후에 수행된다. 치료 중의 일부 임상 평가는 치료를 조절하는데 있어서 유용하지만,14 대부분의 경우에서 실제 치료 동안 종양 반응을 예상하는 정확한 방법은 없다. 이러한 시험, 특히 광범위한 종양 부위 및 조직에 이용가능한 시험이 매우 유용하며 바람직하다는 사실은 분명하다. 다른 치료 및 진단 방법으로는 치료에 대한 반응을 예상하는 것으로 제안된 분자 검정법을 들 수 있으며, 최근의 노력으로 는 치료에 대한 반응 또는 치료에 대한 반응 결여와 상관관계가 있는 유전적 변화를 확인하기 위해 DNA 마이크로어레이를 사용하는 것을 들 수 있다. 이들은 연구중에 있으며, 임상에서 일상적으로 사용되는 것은 없다.
진단 및 치료의 또 다른 방법은 XRT 치료 동안 반응을 예측하는 영상 방식의 사용을 포함한다. FDG를 사용하는 치료 중 PET 스캔은 활발히 연구되고 있으며, 이 연구에서는 방사선 요법 과정의 중간에서 원발성 종양의 동위원소 흡수량을 치료 전 흡수량과 비교한다. 여러 사후 연구 결과는, 치료 동안 지속된 강한 흡수를 나타내는 환자가, 치료 동안 FDG-친화성이 적은 종양을 갖는 환자보다 불량한 종양 조절 결과를 나타냄을 시사한다.15 그러나, 다양한 암에 대한 보다 효과적인 스크리닝, 진단 및 치료 방법이 강력하게 요구되고 있다.
충분히 관찰된 기타 종양으로는 원발성 뇌 종양의 가장 통상적인 형태인 악성 신경교종을 들 수 있다. 수술, 방사선 및 화학요법을 이용한 공격적인 치료에도 불구하고, 이러한 종양을 보유하는 대부분의 환자는 진단 후 생존 기간이 2년 미만이다. 신경방사선학 및 자기 공명 영상 (MRI)에서의 최근의 진전은 상기 종양의 조기 진단 및 치료에 상당한 영향을 끼쳐왔다. 그러나, 대부분의 악성 신경교종은 현재의 영상 기술에 의해서는 부종성 뇌 조직으로부터 감별이 잘 되지 않는 침윤성 성분을 갖는다. 흔히, 이러한 종양 성분은 치료하기가 가장 어려우며 국소적 재발의 원인이 된다. 의심할 여지 없이, 유의한 치료적 처치를 위해서는 침윤성 신경교종 세포를 더 잘 시각화하는 것이 바람직하다.
마찬가지로, 췌장암은 매우 치명적인 질환이며, 모든 주요 악성 종양들 중에서도 생존 가능성이 가장 낮다. 췌장암은 미국에서 암으로 인한 사망 중 다섯 번째로 주된 원인이며, 매년 미국에서 새로 진단되는 모든 암들 중에서 2％는 췌장암으로 인한 것이다. 그러나, 췌장암은 암으로 인한 사망 중에서 5％를 차지하는 가장 치명적인 질환의 하나이다 [Miller BA, et al. NIH Pub. No. 96-4104. Bethesda, MD. 1996]. 이는 절제되지 않은 질환을 앓는 환자들 중에서 5년간 생존한 사람이 없다는 사실에 의해 입증된다. 또한, 수술적 절제가 유일한 치유 희망이지만, 절제 후 5년간 생존율은 20％에 불과하다 [Geer RJ, Brennan MF. Am J Surg 1993; 165:68-72; Yeo CJ, Cameron JL, et al., Ann Surg 1997]. 18-FDG를 사용한 PET 스캐닝이 다양한 다른 원발성 암을 영상화하는데 있어서 유망한 것으로 나타났지만, 이는 췌장암을 앓는 환자에 대한 CT 스캔의 영상 능력, 특히 전이성 질환을 평가하는 능력을 능가하는 제한된 능력만을 갖는 것으로 보인다 [Kasperk RK, Riesener KP, et al., World J Surg 2001; 25:1134-1139; Sendler A, Avril N, et al., World J Surg 2000; 24:1121-1129]. 따라서, 잠재적인 전이성 췌장암을 앓는 환자를 정확하게 영상화하는 방법이 요망된다.
간세포암은 전세계에서 가장 통상적인 충실성 기관 악성 종양이며, 발병원인은 간염 또는 알콜중독으로 인한 만성적인 간 손상이 가장 일반적이다. 발병율은 북아메리카의 경우에 인구 100,000 명당 2.1명에서부터 발병율이 매우 높은 지역인 중국의 경우에는 인구 100,000 명당 80명에 이르기까지 현저하게 달라진다. 경화증을 앓는 환자에서 HCC를 발병할 위험은 1년에 1 내지 6％이다. 절제가 치유를 위한 유일한 선택이지만, 병세가 나타난 시점에서는 불량한 간 보존상태 또는 절제되지 않거나 전이성인 질환의 존재로 인해 환자의 10 내지 30％만이 수술을 위한 후보가 된다. 이 질환의 공격적인 특성을 입증하는 것으로, 치유를 위한 절제 후 5년 생존율은 15 내지 35％에 불과하다 [Treiber G. Digestive Diseases (2001) 19:311-323].
유방암은 오늘날 미국의 여성들에게 건강상 주요한 관심의 대상이다. 2004년에 미국에서만 거의 216,000 명의 여성들이 유방암에 걸린 것으로 진단되고 이중 40,000 명이 사망한 것으로 예상되었다. 국소적, 영역적 및 원위적 전이의 확산에 대한 정확한 평가는 최적의 질환 치료 및 관리에 있어서 중요하다. 림프절 연루를 비롯한 국소적 또는 윈위적 유방암 전이를 검출하고(하거나) 특성화하는 비-침윤성 영상 방식의 개발은 이 질환의 관리에 있어서 상당한 진전을 나타냈다. 유방조영술은 유방암의 조기 검출을 위한 현재의 스크리닝 방법이지만, 조직학적 확인 및 인접 림프절로의 영역적 확산은 전형적으로는 생검을 통해 평가된다. 99mTc-세스타미비(Sestamibi)를 사용한 섬광조영술 스캐닝 및 18F-FDG PET 스캐닝을 비롯한 보다 정밀한 영상화 방법은 현재까지 폭넓게 조사되어 왔지만, 주로 예상가능하지 않은 특이성으로 인해, 치료 계획에는 중요한 영향을 끼치지 않았다 [Wahl RL. Quart J of Nucl Med (1998) 42:1-7]. 그러나, PET 스캐닝의 역할은 화학요법에 대한 종양 반응을 모니터링하는데 있어서 효능을 나타내었다 [Smith IC, Welch AE, et al., J of Clin Oncol (2000) 18:1676-1688; Schelling M, Avril N, et al., J of Clin Oncol (2000) 18:1689-1695]. 방사선 요법은 주로, 침윤성 직장 암종을 비롯한 다수의 충실성 상피 종양의 이온화 방사선에 대한 감응성으로 인해, 유방암의 치료에서 잘 확립된 역할을 한다 [DeVita V, Hellman S, Rosenberg S. Cancer: Principles and Practice of Oncology, 6th edition. Philadelphia (PA): Lippincott, Williams and Wilkins, 2002, pp. 1667-1680]. 유방암에서 방사선은 가장 통상적으로는 종괴절제술 또는 유방절제술 후의 보조 치료로서 지시된다. 이 경우, 방사선 요법은 이들 조직에서 미시적인 침착물을 멸균함으로써 국소적 및 영역적 재발의 발생을 극적으로 감소시키는 것으로 나타났다. 환자가 전이성 질환을 앓거나 또는 잠재적인 전이에 대한 위험이 증가된 것으로 생각되는 경우, 화학요법이 제공된다. 이와 같은 후자의 경우에서, 보조 화학요법 투여에 대한 연구에서 보조 화학요법 또는 호르몬 요법을 처치받은 환자에서 생존율이 개선되는 것으로 확인된다. 또한, 방사선은 실질 기관 및 뼈에서 전이의 통증 및 부피 효과를 감소시키는데 있어서 우수한 효과를 갖는 것으로 설정된 완화제 중에 사용된다. 다수의 환자들은 여러 이유로 인해 정해진 요법 이후에 재발한다. 방사선 및 화학요법에 대한 획득된 내성은, 의심할 여지 없이, 1차 요법 후 재발의 원인이 된다. 추가로, 방사선의 사용은 일반적으로 후기-발생적이며 투여량-제한적인 특정 독성과 관련된다. 과도한 투여량의 방사선이 사용되는 경우, 섬유증, 신경 손상 및 연부 조직 괴사가 심각할 수 있다. 팔의 림프부종은 유방암 환자의 경우에 가장 통상적이고 염려되는 독성이며, 가장 통상적으로는 액와 절제 (진단 목적을 위해 수행됨)와 액와에 대한 보조 방사선의 조합으로부터 발생된다.
주로 각각의 특정 종양 유형에 대해 특이적인 수용체 또는 분자로 표적화되는 신규 항암 약물과는 대조적으로, 다양한 상이한 종양 유형에 이용가능한 공통적인 메카니즘에 의존하는 신규 화합물이 매우 바람직하다.
따라서, 높은 감응성 및 특이성을 둘 다 제공하는 비침윤성 유방암 영상 기술이 임상적으로 시급히 필요하다. 게다가, 원발성 종양 및 전이성 종양 둘 다로 치료 투여량의 요오드-131을 동시에 전달하는 잠재력은 부가된 중요한 이점이다.
비-소세포 폐암 (NSCLC)은 오늘날 미국에서 암으로 인한 사망의 주요 원인이다. 적절하게 선정된 환자에서 수술적 절제는 장기간의 생존에 대한 최적의 기회를 제공하며 치유적일 수 있다. 따라서, 국소적, 영역적 및 원위적 전이 확산에 대한 정확한 수술 전 평가는 최적의 관리에 있어서 중요하다. 종격(mediastinal) 림프절 상태의 평가가 필수적인데, 이는 NSCLC를 앓는 모든 환자의 거의 절반에서 나타나는 절 전이가 치료에 있어서 가장 빈번하게 나타나는 장애일 수 있기 때문이다. 정확한 병기결정(staging)은 환자에게 불필요한 비-치유적 수술 절차의 이환율을 절감시켜 줄 수도 있다.
FDG-PET 스캐닝을 사용한 영상은, 특히 CT 영상과 비교되는 경우에 개선된 감응 속도로 인해, 영상 NSCLC에 대한 매우 유용한 기준으로 빠르게 자리잡고 있다. 그러나, 이러한 영상은 대부분의 지역 실정상 이용할 수 없는 고가의 영상 시험이다. 따라서, 민감하고 특이적이며 대부분의 환자가 쉽게 이용할 수 있는 자원을 사용하는 영상 기술이 요망되는 실정이다.
18F-FDG를 사용한 양전자-방출 단층촬영 (PET) 스캐닝은 영상 기술로서 상당한 관심을 일으켜왔다. 최근의 연구에서는 표준 접근법의 능력을 NSCLC (CT, 초음파, 골 스캐닝 등) 및 PET 스캐닝에서의 병기결정과 가능성 있게 비교하여 종격 림프절 및 원위부에서 전이를 검출하였다 [Pieterman RM, vanPutten JWG, Meuzzelaar JJ, Mooyaart EL, Valburg W, Koeter GH, Fidler V, Prium J, Groen HJM. Preoperative Staging of Non-Small Cell Lung Cancer with Positron-Emission Tomography. New Eng J Med 343:254-261, 2000]. 종격의 발병은 조직학적으로 확인하였으며, 원위부 전이는 다른 영상 시험에 의해 확인하였다. 종격의 전이를 검출하는데 있어서 PET의 감응성 및 특이성은 각각 91％ 및 86％이었고, 원위부 전이를 확인하는데 있어서는 각각 82％ 및 93％이었다. 이러한 결과에서는 CT 스캐닝에서 종격의 발병에 대한 감응성 및 특이성이 각각 75％ 및 66％로 비교된다. 다른 연구에서는 영상을 FDG-PET, CT 및 조직학 결과와 비교하였다. 종격 절(54명의 환자에서 n은 168임)을 병기결정하는데 있어서의 전체적인 감응성, 특이성 및 정확성은 CT를 사용하는 경우의 68％, 65％ 및 6％에 비해 96％, 93％ 및 94％이었다 [Gupta NC, Graeber GM, Bishop HA. Comparative efficacy of positron emission tomography with fluorodeoxyglucose in evaluate of small (<1 cm), intermediate (1 to 3 cm), and large (>3 cm) lymph node lesions. Chest 117(3):773-778, 2000]. 그러나, PET 스캐닝의 한계로는, 특히 염증성 또는 육아종성 질환을 앓는 환자에서 특이성의 부족, 1 cm 미만의 병소 검출 불가, 제한된 이용가능성 및 비용 을 들 수 있다 [Stokkel MP, Bakker PF, Heine R, Schlosser NJ, Lammers JW, Van Rijk PP. Staging of lymph nodes with FDG dual headed PET in patients with non-small cell lung cancer. Nucl Med Communications 20(11):1001-1007, 1999; Kapuco LO, Meltzer CC, Townsend DW, Keenan RJ, Luketich JD. Fluorine-18-fluoro-deoxyglucose uptake in pneumonia. J Nucl Med 39(7):1267-1269, 1998].
또한, 종래의 해부학적 영상 기술, 예를 들어 CT 스캐닝은 요법 후의 종양 수축에도 불구하고 치료 후의 생존율을 예상하는데 있어서 불량하다. 진행성 질환에 대하여 동시적인 시스플라틴-기초의 화학/방사선요법 또는 방사선요법 단독을 처치받은 56명의 NSCLC 환자를 포함하는 최근의 연구에서, 종래의 CT 영상에 의한 반응은 생존율과 상관관계가 없었다 [MacManus MP, Hicks RJ, Wada M, Hoff A, Matthews J, Wirth A, Rischin D, Ball DL. Early F-18 FDG-PET response to radical chemoradiotherapy correlates strongly with survival in unresectable non-small cell lung cancer. Proc ASCO 19:483a, 2000]. 그러나, FDG-PET 스캔에 의한 반응은 생존율과 강한 상관관계는 없었다 (p=0.0006). 후속 PET 스캔 날자로부터의 생존율은 PET 상에서 완전한 반응을 달성한 24명의 환자들에 대하여 각각 1년 및 2년의 시점에서 84％ 및 84％이었지만, 그러한 반응을 달성하지 않은 32명의 환자들에 대하여는 단지 43％ 및 31％에 불과했다 (p=0.010). 이러한 결과는 최근에 다른 저자들에 의해 보고된 유사한 발견을 입증한다 [Patz EF Jr, Connolly J, Herndon J. Prognostic value of thoracic FDG PET imaging after treatment for non-small cell lung cancer. Am J Roentgenology 174(3):769-774, 2000; Vansteenkiste JF, Stroobants SG, Dupont PJ, DeLeyn PR, Verbeken EK, Deneffe GJ, Mortelmans LA, Demedts MG. Prognostic importance of the standardized uptake value on (18)F-fluoro-2-deoxy-glucose positron emission tomography scan in non-small cell lung cancer: An analysis of 125 cases. J Clin Oncol 17(10):3201-3206, 1999; Ahuja V, Coleman RE, Herndon J, Patz EF Jr. The prognostic significance of fluorodexoyglucose positron emission tomography imaging for patients with non-small cell lung carcinoma. Cancer 83(5):918-924, 1998].
따라서, NSCLC를 앓는 환자에서 초기 전이성 질환을 정확하게 확인하며 상기 질환을 잠재적으로 치료할 수 있는 쉽게 이용가능한 방사성 의약품은 병기결정 및 요법에 대한 반응 둘 다의 측면에서 환자 치료에서 중요한 영향을 줄 것이다. PET 영상 절차는 이러한 분야에서 효과가 있지만, 비용 및 접근곤란성은 상기 절차의 실제적인 이용을 심각하게 제한한다. 비교적 저렴하고 널리 이용할 수 있는 영상 장치를 사용해서 전신을 비-침윤성 스크리닝할 수 있는 종양-특이적 기능을 기초로 한 정확한 기능적 영상 기술이 필요하다.
발명의 개요
본 발명은 일반적으로 다양한 암의 검출 및 치료를 위한 방법 및 기술을 제공한다. 바람직한 한 실시양태에서, 본 발명은 암에 걸렸거나 암에 걸린 것으로 의심되는 대상체에서 폐암, 부신암, 흑색종, 결장암, 결장직장암, 난소암, 전립선암, 간암, 피하암, 장암, 간세포 암종, 망막모세포종, 자궁경부암을 검출하고 그 위치를 확인하는 방법을 제공한다. 이 방법은
(a) 대상체에게 포스포리피드 에테르 유사체를 투여하는 단계, 및
(b) 암에 걸린 것으로 의심되는 상기 대상체의 기관이 주변 영역(들)보다 더 높은 수준의 유사체를 보유하는지 결정하는 단계
를 포함하며, 더 높은 수준의 보유 영역이 암의 검출 및 그 위치를 나타낸다. 상기 방법에서, 포스포리피드 유사체는 하기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물로부터 선택된다:
Figure 112006065192081-PCT00001
(식 중, X는 요오드의 방사성 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택되고, n은 16 내지 30의 정수이고, Y는 NH2, NR2 및 NR3을 포함하는 군으로부터 선택되며, 여기서 R은 알킬 또는 아릴알킬 치환기임)
Figure 112006065192081-PCT00002
(식 중, X는 요오드의 방사성 동위원소이고, n은 16 내지 30의 정수이고, Y는 H, OH, COOH, COOR 및 OR로 이루어진 군으로부터 선택되고, Z는 NH2, NR2 및 NR3으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 R은 알킬 또는 아릴알킬 치환기임).
상기 방법에서, X는 122I, 123I, 124I, 125I 및 131I로 이루어진 요오드의 방사성 동위원소 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 이 방법에서, 포스포리피드 에테르는 18-(p-요오도페닐)옥타데실 포스포콜린, 1-O-[18-(p-요오도페닐)옥타데실]-1,3-프로판디올-3-포스포콜린 또는 1-O-[18-(p-요오도페닐)옥타데실]-2-O-메틸-rac-글리세로-3-포스포콜린이며, 요오드는 방사성 동위원소의 형태이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 대상체의 암을 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법은 상기 기재된 바와 같은 포스포리피드 에테르 유사체를 포함하는 유효량의 분자를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 이 방법에서, 암은 폐암, 부신암, 흑색종, 결장암, 결장직장암, 난소암, 전립선암, 간암, 피하암, 장암, 간세포 암종, 망막모세포종, 자궁경부암, 신경교종, 유방암, 췌장암, 암육종 및 프로스트레이트 (Prostrate) 암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또한, 본 발명은 암 치료용 제약 조성물의 제조를 위한 포스포리피드 에테르 유사체의 용도를 고려한다. 이러한 포스포리피드 유사체는 상기 논의된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 대상체에서 염증, 선종 및 과다형성을 신생물과 구별하는 방법을 제공한다. 이 방법은
(a) 대상체에게 포스포리피드 에테르 유사체를 투여하는 단계, 및
(b) 염증, 선종, 과다형성 또는 신생물을 가질 것으로 의심되는 대상체의 기관이 주변 영역(들)보다 더 높은 수준의 유사체를 보유하는지 결정하는 단계
를 포함한다. 상기 대상체가 더 높은 수준의 보유 영역을 나타내는 경우, 이는 신생물의 검출 및 그 위치를 나타내고, 상기 대상체가 더 낮은 수준의 보유 영역을 나타내는 경우, 이는 선종, 과다형성 또는 염증을 가질 것으로 의심되는 기관의 존재를 나타낸다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 포스포리파아제 D (PLD)를 갖는 조직 샘플에서 신생물을 검출하는 방법을 제공한다. 이 방법은
(a) 포스포리파아제 D (PLD)를 갖는 조직 샘플에서 PLD 단백질 활성 수준 또는 PLD mRNA 수준을 정량하는 단계, 및
(b) 상기 조직 샘플이 주변 조직 영역(들)보다 더 낮은 수준의 단백질 활성을 갖는지 결정하거나, 또는 (c) 상기 조직 샘플이 주변 조직 영역(들)보다 더 낮은 수준의 mRNA를 갖는지 결정하는 단계
를 포함하며, 더 낮은 수준의 활성 영역 또는 더 낮은 mRNA 수준의 영역이 신생물의 검출 및 그 위치를 나타낸다.
이 방법에서, PLD 단백질 활성 또는 mRNA 수준은 상기 기재된 바와 같이 조직 샘플을 PLE 유사체와 접촉시킴으로써 정량할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 (a) PLD 단백질 활성 또는 PLD mRNA 수준을 정량하는 단계 (여기서, 주변 조직 부위(들)에 비해 감소된 PLD 단백질 활성 또는 감소된 mRNA 수준은 신생물을 나타냄)를 포함하는, PLD를 갖는 조직 샘플을 스크리닝하는 방법에 의해 선택되는 항-종양제를 제공한다. PLD 단백질 활성 또는 mRNA 수준은 상기 기재된 바와 같이 조직 샘플을 PLE 유사체와 접촉시킴으로써 정량할 수 있다
본 발명의 다른 목적 및 이점은 본 명세서에 첨부된 상세한 설명, 도면 및 청구의 범위로부터 자명할 것이다.
도 1은 PLE 종양 세포 영상화의 가설을 나타낸다.
도 2는 1 mCi 131I-NM324의 IV 투여로부터 1일, 2일 및 6일 후의 시점에서 획득된 환자 03의 전방 흉부에 대한 섬광조영술을 나타낸다. 흡수는 좌측 혀 폐암 (T)에서 관찰되는데, 종양-대-배경 비율은 시간에 따라 증가한다.
도 3은 PLE 유사체의 구조를 나타낸다.
도 3A는 NM404 유사체를 나타낸다.
도 4는 IV 투여 후 SCID 마우스 A549 폐 종양 모델에서 NM324와 NM404의 비교를 나타낸다. NM324 활성의 대부분은 장에 존재하며 종양 (대퇴부에 이식됨)에는 존재하지 않지만, NM404는 각각의 대퇴부에서 하나의 종양을 확인하였음을 유의한다.
도 4A는 원발성 종양 부위 (다리)가 수술적으로 제거된 코펜하겐(Copenhagen) 래트에서 더닝(Dunning) R3327 전이성 전립선 종양의 섬광조영술 NM404 영상을 나타낸다. 부검에서 2개의 림프절 종양이 확인되었다.
도 6은 절개된 CT-26 종양 (T) 및 좌측 및 우측 림프절 (LN)의 디지털 사진 (A)을 나타낸다. 바이오스캔(Bioscan) 영상 (B) 및 융합된 사진/바이오스캔 영상 (C)는 종양에서 방사활성의 상관관계를 나타낸다.
도 7은 CT-26 종양 (화살표)의 크기 및 위치를 나타내는 도 6의 생존 마우스의 마이크로CT 영상을 나타낸다. 3D-표면으로 표현되었으며, 평면 슬라이스 영상 (A, B) 및 관상 (C) 및 축 (D) 슬라이스 (40 ㎛ 두께)로 나타냈다.
도 8은 정상 (좌측) 및 RF-제거된 (우측) CT-26 종양의 조직 단면 (H＆E)을 나타낸다. 제거된 단면은 막 일체성이 상실되었으며, 농축된 것으로 보인다.
도 9는 125I-NM404 주사 후 4일의 시점에서 c-myc 췌장 종양 마우스의 융합된 생체내 바이오스캔/디지탈 사진 영상을 나타낸다 (A). 절개된 종양 (B)의 생체외 영상을 디지털 사진 (C)와 비교한다. 색 범위는 도 10에서와 동일하다.
도 10은 125I-NM404 투여 후 4일의 시점에서 c-myc 췌장 종양 마우스의 바이오스캔 영상을 나타낸다. 생체내 영상 (A)를, 거대 (2 cm) 췌장 종양 (T)의 존재를 나타내는 해부된 마우스 (B)의 디지털 사진과 비교한다. 3개의 종양을 절개하였으며, 나머지 사체를 스캔하였다 (C). 절개된 종양을 스캔하여 (D) 디지털 사진 (E)과 비교하였다. 컬러 스케일은 0 (흑색)에서 40 (백색) cpm의 범위에 있다.
도 11은 췌장 종양-보유 마우스의 마이크로CT 축 스캔을 나타낸다. 2개의 거대 종양 (T)은 패널 A의 축 영상에서 쉽게 관찰된다. B에서 다른 마우스의 영상 은 비장 근처에 위치하는 췌장 종양 (화살표)을 나타낸다. 마우스에서, 췌장은 편재하는 조직이다. 절개된 비장 및 부착된 종양의 디지털 사진은 비교를 위해 도 11C에 나타낸다.
도 12는 샴(sham) 대조군 래트 뇌 (A)의 바이오스캔 영상 (125I-NM404의 IV 주사 후 4일), 및 정상 뇌 조직에서 NM404의 낮은 배경 수준을 나타내는 절개된 래트 뇌의 상응하는 디지털 사진 상에 겹쳐놓은 동일한 바이오스캔 영상을 나타낸다.
도 13은 125I-NM404의 IV 주사 후 4일의 시점에서 절개된 C6-신경교종 보유 래트 뇌의 디지털 사진 (A) 및 상응하는 바이오스캔 영상 (B)을 나타낸다. 위치 및 크기-매치된 융합된 바이오스캔 영상 및 사진 (C)는 종양 내 NM404의 강한 국소화를 나타낸다. 종양의 존재는 D의 H＆E 염색된 샘플 중에서 조직학적 방법으로 확인되었다.
도 14는 125I-NM404 주사 후 10일의 시점에서 TGFα 간암-보유 마우스의 관상 마이크로CT 스캔 (좌측) 및 배후(dorsal) 바이오스캔 영상 (우측)을 나타낸다. 간세포-선택적 CT 조영제인 ITG를 사용한 마이크로CT 영상에서 간의 화질이 높아졌다 (종양은 T임).
도 15는 NM404 주사 후 7일의 시점에서 절개된 CT-26 종양-보유 마우스 간의 사진 (A) 및 바이오스캔 영상 (B)을 나타낸다. 간 종양 연루는 광범위하였다. 이 스캔으로부터 15일 전에 종양을 이식하였다. 절개로 절제된 종양 (T) 및 정상의 비관련 간 (L)의 바이오스캔 영상 (C) 및 사진 (D)을 나타낸다.
도 16은 다수의 CT26 종양의 존재를 나타내는 도 15에 제시된 동일한 마우스의 마이크로CT를 나타낸다. 간세포-선택적 조영제인 ITG를 사용하여 간의 화질을 높였다. 이들 영상은 종양 세포 이식 후 10일의 시점 및 상기 바이오스캔 영상 전 5일의 시점에서 획득하였다 (종양은 화살표로 나타냈으며, 담낭은 GB임).
도 17은 125I-NM404 (15 μCi)의 IV 투여 후 다양한 시점에서 특발성 우측 액와 유방 종양 (10 mm 직경)을 갖는 민 (Min) 마우스의 NM404 바이오스캔 영상을 나타낸다. 해부학적 비교를 위해 관상 마이크로CT 영상 (콘트라스트는 높이지 않음)을 나타낸다 (좌측 패널, T는 종양임).
도 18은 절개된 좌측 및 우측 복부 유선의 카르민(carmine) 염색된 사진 (A, C) 및 바이오스캔 영상 (B, D)을 나타낸다. 좌측 유선의 바이오스캔 영상 (B)에서 쉽게 검출되는 패널 A의 2 mm 종양 (T)을 유의한다. 림프절 (A의 작은 화살표)는 NM404의 흡수가 없음을 나타낸다. 우측 유선 (C, D)에서는 종양이 시각적으로 검출되지 않았다. 결장의 사진 (E) 및 바이오스캔 영상 (F)은 선종성 폴립 (화살표)에서 NM404의 흡수가 없음을 나타낸다.
도 19는 도 18의 Min 마우스의 마이크로CT 스캔을 나타낸다. 패널 A는 우측 액와의 거대 유방 종양을 나타내는 저밀도 표면 투시도를 나타낸다. 패널 B는 종양 공급 혈관의 위치결정을 돕기 위해 혈액 푸울(pool) CT 조영제 BP10을 투여한 후의 고밀도 표면 투시도를 나타낸다. 패널 C는 온전한 공급 혈관 위치를 나타내는 복합 관상 CT 영상 및 고밀도 표면 투시도를 나타낸다. 패널 C는 아래쪽에서 바라본 것이고, 패널 A 및 B는 위쪽에서 바라본 것이다.
도 20은 125I-NM404 (15 μCi)의 IV 투여 후 다양한 시점에서 특발성 우측 액와 유방 선암종 (10 mm 직경)을 갖는 Min 마우스의 NM404 바이오스캔 영상을 나타낸다. 해부학적 비교를 위해 관상 마이크로CT 영상 (콘트라스트는 높이지 않음)을 나타낸다 (좌측 패널, T는 종양임).
도 21은 NM404 투여 후 8일의 시점에서 FVBxB6Min 마우스로부터의 절개된 유선 (A) 및 결장 (E)의 바이오스캔 영상을 나타낸다. 동일한 절개된 조직의 상응하는 디지털 사진을 각각 B 및 D에 나타낸다. 카르민 염색된 확대 사진 (C)은 과다형성 (화살표)의 존재를 나타내지만, 바이오스캔 영상 (A)에서 상응하는 병소 활성은 존재하지 않는다. 바이오스캔 영상 (A)에서의 종양 흡수는 B의 거대 선암종에 상응한다. 절개된 결장의 사진 (D) 및 바이오스캔 영상 (E)은 선종성 폴립 (화살표)에서 NM404의 흡수가 없음을 나타낸다.
도 22는 도 21에 나타낸 Min 마우스의 마이크로CT 스캔을 나타낸다. 패널 A는 좌측 액와의 거대 유방 종양을 나타내는 저밀도 표면 투시도이다. 패널 B는 종양 공급 혈관의 위치결정을 돕기 위해 혈액 푸울 CT 조영제 BP10을 투여한 후의 고밀도 표면 투시도를 나타낸다. 패널 C는 온전한 공급 혈관 위치를 나타내는 복합 관상 CT 영상 및 고밀도 표면 투시도를 나타낸다. 패널 C는 아래쪽에서 바라본 것이고, 패널 A 및 B는 위쪽에서 바라본 것이다.
도 23은 A549 폐 CA 마이크로메트(micromet)(< 1 mm 직경)을 함유하는 절개 된 SCID 마우스 폐에서 125I-NM404 (A 및 B)와 NM324 (C 및 D)의 흡수량 비교를 나타낸다.
도 24는 PLE의 효소적 대사를 나타낸다.
도 25는 ENU-처리된 Min/+ 마우스에서 시간 대 제1 종양을 나타내는 그래프이다. 시간 대 제1 유방 종양은 ENU 후의 일(day)로 나타낸다. 암컷 Min/+ 마우스를 ENU로 처리하고, 유방 종양의 존재에 대하여 주당 2회 확인하였다. ENU 치료 후의 시간 대 제1 종양을 B6Min/+ (n=45)(□), BRB6 Min/+ (n=18)(Δ), FVBB6 Min/+ (n=18)(◇)에 대하여 5일 간격으로 플롯팅하였다.
도 26에서 125I-NM404 투여 후 1일 (A) 및 7일 (B)의 시점에서 복와위(prone) FVBxB6 min 마우스의 바이오스캔 영상은 거대 액와 유방 종양의 존재를 나타낸다. 주사 후 10일의 시점에서 절개된 유선 (C)의 바이오스캔 영상은 거대 10 mm 선암종 및 더 작은 인접한 2 mm 종양 (생체내 스캔에서는 보이지 않음)에서 NM404의 혼입을 나타낸다.
도 27에서 동일한 FVBxB6 min 마우스의 마이크로CT 영상은 도 26에 나타낸 바와 같이 거대 액와 유방 종양을 나타낸다. 관상 및 축 슬라이스는 A 및 B에 나타나 있으며, 3D-표면 (금색) 및 관상 슬라이스는 후면도 (C) 및 전면도 (D)에 동시에 나타낸다.
도 28은 125I-NM404 주사 후의 분명한 SCC1 및 6 종양 퇴행을 나타낸다.
도 29는 131I-NM404 주사 후 4일 및 11일의 시점에서 환자 1의 감마 카메라 영상 (좌측 패널)에 관한 것이며, 상기 작용제는 두 군데 NSCLC 종양 (화살표)에서 장시간 강하게 보유되는 것으로 나타났다. 축 CT 스캔 (우측 패널)은 좌측 폐 (A)에서 국소적인 3 cm 병소 및 우측 폐 (B)에서 거대한 침윤성 덩어리의 위치 및 크기를 나타낸다 (화살표).
도 30은 131I-NM404의 iv 투여 후 환자 2의 전면 및 후면 전신 평면 핵 의학 영상 (좌측 패널)을 나타낸다. 축 (A) 및 관상 (B) CT 스캔 (우측 패널)은 6 cm 크기의 거대 NSCLC의 위치를 나타낸다 (화살표).
I. 본 발명의 일반적 설명
본 발명의 일반적 설명: 본 발명을 설명하기 전에, 본 발명은 기재된 특정 방법론, 프로토콜, 세포주 및 시약에 제한되지 않으며, 이들은 달라질 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 특정 실시양태를 설명하기 위한 목적이며, 첨부된 특허청구범위에 의해서만 제한될 것인 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다.
본원 및 첨부된 특허청구범위에 사용된 단수 형태 관사들 ("a", "an" 및 "the")은 본문이 명확히 달리 표시하지 않는다면 복수형 언급을 포함한다. 즉, 예를 들어 "세포"라는 언급은 다수의 이러한 세포 및 당업자에게 공지된 그의 등가물 등을 포함한다. 또한, 부정 관사 ("a" 또는 "an"), "1종 이상의" 및 "하나 이상의"라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 또한, "포함하는(comprising)", "포함하는(including)" 및 "갖는(having)"이라는 용어는 상호교환적으로 사용될 수 있다.
달리 정의되지 않는다면, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 같은 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료를 이제 설명한다. 본원에 언급된 모든 간행물은 본 발명과 관련되어 사용될 수 있는 간행물에 보고된 화학물질, 세포주, 벡터, 동물, 기기, 통계적 분석법 및 방법론을 기재하고 개시하는 목적으로 각각의 거명을 통해 본원에 포함된다. 본 발명이 이전의 발명에 의해 이러한 개시에 선행하는 자격이 없다는 것을 본원에서 허락한 것으로 간주해서는 안된다.
본원에 기재된 "이성질체"라는 용어는 광학 이성질체 및 유사체, 구조 이성질체 및 유사체, 형태 이성질체 및 유사체 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일 실시양태에서, 본 발명은 화학식 3A의 항-종양 화합물의 여러가지 광학 이성질체의 사용을 포함한다. 당업자는 본 발명에 유용한 항-종양 화합물이 하나 이상의 키랄 중심을 함유할 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 방법에 사용되는 화합물은 광학 활성 형태 또는 라세미 형태로 존재하고, 단리될 수 있다. 일부 화합물은 또한 다형성을 나타낼 수 있다.
본 발명은 임의의 라세미, 광학-활성, 다형성 또는 입체이성질체 형태 또는 이들의 혼합물의 사용을 포함할 수 있으며, 이러한 형태는 본원에 기재되고 청구된 종양-관련된 상태의 치료에 유용한 특성을 갖는다. 일 실시양태에서, 항-종양 화합물은 순수한 (R)-이성질체를 포함할 수 있다. 또다른 실시양태에서, 항-종양 화합물은 순수한 (S)-이성질체를 포함할 수 있다. 또다른 실시양태에서, 화합물은 (R) 및 (S) 이성질체의 혼합물을 포함할 수 있다. 또다른 실시양태에서, 화합물은 (R) 및 (S) 이성질체 둘다를 포함하는 라세미 혼합물을 포함할 수 있다. 광학-활성 형태를 제조하는 방법 (예를 들어, 재결정화 기술에 의한 라세미 형태의 분할, 광학-활성 출발 물질로부터의 합성, 키랄 합성 또는 키랄 고정상을 사용한 크로마토그래피 분리에 의해)은 당업계에 널리 공지되어 있다.
본 발명은 유기산 및 무기산, 예를 들어 시트르산 및 염산으로 아미노-치환된 화합물의 제약상 허용되는 염의 사용을 포함한다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 화합물의 아미노 치환기의 N-옥시드를 포함한다. 제약상 허용되는 염은 또한 무기 염기, 예를 들어 수산화나트륨을 사용한 처리에 의해 페놀계 화합물로부터 제조될 수 있다. 또한, 페놀계 화합물의 에스테르는 지방족 및 방향족 산, 예를 들어 아세트산 및 벤조산 에스테르를 사용하여 제조될 수 있다. 본원에 사용된 "제약상 허용되는 염"이라는 용어는 기재 화합물과 동일한 제약상 효과를 실질적으로 달성하는, 기재 화합물로부터 제제화된 화합물을 지칭한다.
본 발명은 항-종양 화합물의 유도체를 사용한 방법을 추가로 포함한다. "유도체"라는 용어는 에테르 유도체, 산 유도체, 아미드 유도체, 에스테르 유도체 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본 발명은 항-종양 화합물의 수화물을 사용한 방법을 추가로 포함한다. "수화물"이라는 용어는 반수화물, 일수화물, 이수화물, 삼수화물 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명은 항-종양 화합물의 대사물을 사용한 방법을 추가로 포함한다. "대사물"이라는 용어는 대사 또는 대사성 과정에 의해 또다른 물질로부터 제조된 임의의 물질을 의미한다.
본원에 정의된 "접촉시킴"은 본 발명에 사용된 항-종양 화합물을 시험관, 플라스크, 조직 배양물, 칩, 어레이, 플레이트, 마이크로플레이트, 모세관 등에서 수용체를 함유하는 샘플 내로 도입시키고, 항-종양 화합물을 수용체에 결합시키는데 충분한 온도 및 시간에서 인큐베이션하는 것을 의미한다. 샘플을 항-종양 화합물 또는 다른 특정 결합 성분과 접촉시키는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 작동될 분석 프로토콜의 종류에 따라 선택될 수 있다. 인큐베이션 방법은 또한 표준이며 당업자에게 공지되어 있다.
또다른 실시양태에서, "접촉시킴"이라는 용어는 본 발명에 사용된 항-종양 화합물을 치료받는 환자에게 도입시키고, 화합물을 생체내에서 접촉시키는 것을 의미한다.
본원에 사용된 "치료함"이라는 용어는 예방 및 장애 경감 치료를 포함한다. 본원에 사용된 "감소시킴", "저해함" 및 "억제함"이라는 용어는 경감 또는 감소라는 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 본원에 사용된 "진행"이라는 용어는 범위 또는 중증도의 증가, 진전, 성장 또는 악화를 의미한다. 본원에 사용된 "재발"이라는 용어는 완화 후의 질환의 복귀를 의미한다.
본원에 사용된 "투여함"이라는 용어는 환자, 조직, 기관 또는 세포를 항-종양 포스포리피드 에테르 화합물과 접촉시키는 것을 지칭한다. 본원에 사용된 투여는 시험관내에서, 즉 시험관에서, 또는 생체내에서, 즉 살아 있는 유기체, 예를 들어 인간의 세포 또는 조직에서 수행될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 본 발명에 유용한 화합물을 환자 또는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 본원에서 동등하게 사용되는 "환자" 또는 "대상체는" (1) 포스포리피드 에테르 화합물을 사용한 항-종양 물질의 투여에 의해 치유가능하거나 치료가능한 질환을 갖거나, (2) 포스포리피드 에테르 화합물을 사용한 항-종양 화합물을 투여함으로써 예방가능한 질환에 걸린 것으로 의심되는 포유동물, 바람직하게는 인간을 지칭한다.
본원에 사용된 "제약 조성물"은 적합한 희석제, 보존제, 가용화제, 유화제 및 보조제, 집합적으로 "제약상 허용되는 담체"와 함께 존재하는 치료 유효량의 항-종양 화합물을 의미한다. 본원에 사용된 "유효량" 및 "치료 유효량"이라는 용어는 독성, 자극성 또는 알레르기 반응과 같은 과도한 부작용 없이 목적하는 치료 반응을 얻기에 충분한 활성 치료제의 양을 지칭한다. 특정 "유효량"은 명백하게 치료될 특정 상태, 환자의 물리적 상태, 치료될 동물의 종류, 치료의 기간, 수반되는 요법 (존재한다면)의 성질, 사용된 특정 제제 및 화합물 또는 그의 유도체의 구조와 같은 요인에 따라 달라질 것이다. 이러한 경우, 소정의 양은 이것이 (a) 질환 (예를 들어 췌장암, 유방암)의 예방; 및 (b) 이러한 질환의 반전 또는 안정화 중 하나 이상을 초래할 경우 치료적으로 유효한 것으로 간주될 것이다. 최적 유효량은 당업자가 통상의 실험을 이용하여 용이하게 결정할 수 있다.
제약 조성물은 액체 또는 동결건조된 또는 다르게는 건조된 제제이며, 다양한 완충 내용물 (예를 들어 트리스-HCl, 아세테이트, 포스페이트), pH 및 이온 농도의 희석제, 표면에의 흡수를 방지하는 알부민 또는 젤라틴과 같은 첨가제, 세정제 (예를 들어 트윈(Tween) (폴리소르베이트(Polysorbate)) 20, 트윈 80, 플루로닉(Pluronic) F68, 담즙산 염), 가용화제 (예를 들어 글리세롤, 폴리에틸렌 글리세롤), 항-산화제 (예를 들어 아스코르브산, 나트륨 메타비술파이트), 보존제 (예를 들어 티메로살, 벤질 알콜, 파라벤), 벌킹 (bulking) 물질 또는 긴장성 개질제 (예를 들어 락토스, 만니톨), 폴리에틸렌 글리콜과 같은 중합체의 단백질에의 공유 부착, 금속 이온과의 착화, 또는 폴리락트산, 폴리글리콜산, 히드로겔 등과 같은 중합체 화합물의 미립자 제제 내로 또는 그 상으로의, 또는 리포좀, 마이크로에멀젼, 마이셀, 단일라멜라 또는 다중라멜라 소낭 (vesicle), 적혈구 고스트 (ghost) 또는 스페로플라스트 (spheroplast) 상으로의 물질의 혼입을 포함한다. 이러한 조성물은 물리적 상태, 용해도, 안정성, 생체내 방출 속도, 생체내 제거 속도에 영향을 줄 것이다. 조절 방출 또는 서방 조성물은 친지질성 데포 (예를 들어 지방산, 왁스, 오일) 내의 제제를 포함한다.
본 발명에는 또한 중합체 (예를 들어 폴록사머 또는 폴록사민)로 코팅된 미립자 조성물을 투여하는 방법이 포함된다. 조성물의 다른 실시양태는 국소, 비경구, 폐내, 비내 및 경구를 비롯한 다양한 투여 경로용의 미립자 형태 보호 코팅, 프로테아제 억제제 또는 투과성 증진제를 혼입시킨다. 일 실시양태에서, 제약 조성물은 비경구, 파라캔서럴(paracancerally), 경점막, 경피, 근육내, 정맥내, 피내, 피하, 복막내, 심실내, 두개내 및 종양내로 투여된다.
또한, 본원에 사용된 "제약상 허용되는 담체"는 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 0.01 내지 0.1 M, 바람직하게는 0.05 M 인산염 완충액 또는 0.9％ 염수를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 이러한 제약상 허용되는 담체는 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액 및 에멀젼일 수 있다. 비-수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 오일, 및 에틸 올레에이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르이다. 수성 담체로는 염수 및 완충된 매질을 포함하는 물, 알콜계/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 들 수 있다.
비경구 비히클로는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 락테이트화 링거 및 고정형 오일을 들 수 있다. 정맥내 비히클로는 유동 및 영양 보충제, 전해질 보충제, 예를 들어 링거 덱스트로스 기재의 것들 등을 들 수 있다. 보존제 및 다른 첨가제, 예를 들어 항미생물제, 항산화제, 대조제(collating agent), 불활성 기체 등이 또한 존재할 수 있다.
본 발명에 따라 투여가능한 조절 방출 또는 서방 조성물은 친지절성 데포 (예를 들어 지방산, 왁스, 오일) 내의 제제를 포함한다. 또한, 본 발명에는 중합체 (예를 들어 폴록사머 또는 폴록사민)로 코팅된 미립자 조성물 및 조직-특이적 수용체, 리간드 또는 항원에 대해 지정된 항체와 커플링되거나 조직-특이적 수용체의 리간드에 커플링된 화합물이 고려된다.
본 발명에 따라 투여되는 조성물의 다른 실시양태는 비경구, 폐내, 비내 및 경구를 비롯한 다양한 투여 경로용의 미립자 형태, 보호 코팅, 프로테아제 억제제 또는 투여 증진제를 혼입시킨다.
폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸 셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐피롤리돈 또는 폴리프롤린과 같은 수용성 중합체의 공유 부착에 의해 개질된 화합물은 상응하는 비개질 화합물이 하는 것보다 정맥내 주사 후 혈액에서 실질적으로 보다 긴 반감기를 나타내는 것으로 공지되어 있다 (문헌 [Abuchowski et al., 1981]; [Newmarl et al., 1982]; 및 [Katre et al., 1987]). 이러한 개질은 또한 수용액에서의 화합물의 용해도를 증가시키고, 응집을 제거하고, 화합물의 물리적 및 화학적 안정성을 증진시키며, 화합물의 면역원성 및 반응성을 크게 감소시킬 수 있다. 결과적으로, 생체내에서 목적하는 생물학적 활성은 이러한 중합체-화합물 외전(abduct)의 투여에 의해 비개질 화합물보다 덜 빈번히 또는 낮은 투여량으로 달성될 수 있다.
본 발명에 따른 또다른 방법에서, 제약 조성물은 조절 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 예를 들어, 활성제는 정맥내 주입, 이식가능한 삼투 펌프, 경피 패치, 리포좀 또는 다른 투여 방식을 이용하여 투여될 수 있다. 일 실시양태에서, 펌프가 사용될 수 있다 (예를 들어 랭거(Langer)의 상기 문헌; 문헌 [Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987)]; [Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980)]; [Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)] 참조). 또다른 실시양태에서, 중합체 물질이 사용될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 조절 방출 시스템은 치료 표적, 예를 들어 간에 근접하게 위치되어 전신성 투여량의 일부만을 요구할 수 있다 (예를 들어 문헌 [Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)] 참조). 다른 조절 방출 시스템은 문헌 [Langer Science 249:1527-1533 (1990)]에 의한 고찰에서 논의되어 있다.
제약 제제는 항-종양 화합물을 단독으로 포함할 수 있거나, 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 정제, 산제, 캡슐제, 펠릿, 용액제, 현탁제, 엘릭시르, 에멀젼제, 겔, 크림, 또는 직장 및 요도 좌제를 비롯한 좌제와 같은 고체 또는 액체 형태일 수 있다. 제약상 허용되는 담체는 고무, 전분, 당, 셀룰로스 물질 및 이들의 혼합물을 포함한다. 항-종양 화합물을 함유하는 제약 제제는 예를 들어 펠릿의 피하 이식에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 추가의 실시양태에서, 펠릿은 시간에 걸쳐 항-종양 화합물의 조절 방출을 제공한다. 제제는 또한 액체 또는 고체 제제의 액체 제제 경구 투여의 정맥내, 동맥내 또는 근육내 주사에 의해, 또는 국소 적용에 의해 투여될 수 있다. 투여는 또한 직장 좌제 또는 요도 좌제의 사용에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에 의해 투여가능한 제약 제제는 공지된 용해, 혼합, 과립화 또는 정제-형성 공정에 의해 제조될 수 있다. 경구 투여용으로, 항-종양 화합물, 또는 그의 생리적으로 허용되는 유도체, 예를 들어 염, 에스테르, N-옥시드 등은 상기 목적에 통상적인 첨가제, 예를 들어 비히클, 안정화제 또는 불활성 희석제와 혼합되며, 정제, 코팅된 정제, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐, 수성 알콜계 또는 오일성 용액과 같은 투여에 적합한 형태로 통상의 방법에 의해 전환된다. 적합한 불활성 비히클의 예로는 아카시아, 옥수수 전분, 젤라틴과 같은 결합제와 조합된, 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산과 같은 붕해제와 조합된, 스테아르산 또는 스테아르산마그네슘과 같은 윤활제와 조합된, 락토스, 수크로스 또는 옥수수 전분과 같은 통상의 정제 기재가 있다.
적합한 오일성 비히클 또는 용매의 예로는 해바라기유 또는 어간유와 같은 식물성 또는 동물성 오일이 있다. 제제는 건조 과립 및 습윤 과립 둘다로서 수행될 수 있다. 비경구 투여 (피하, 정맥내, 동맥내 또는 근육내 주사)용으로, 항-종양 화합물, 또는 그의 생리적으로 허용되는 유도체, 예를 들어 염, 에스테르, N-옥시드 등은 원할 경우 이러한 목적에 적합한 통상의 물질, 예를 들어 가용화제 또는 다른 보조제와 함께 용액, 현탁액 또는 에멀젼으로 전환된다. 그 예로는 계면활성제 및 다른 제약상 허용되는 보조제가 첨가되거나 첨가되지 않은 물 및 오일과 같은 액체가 있다. 예시적인 오일로는 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것들, 예를 들어 땅콩유, 대두유 또는 광물유가 있다. 일반적으로, 물, 염수, 수성 덱스트로스 및 관련된 당 용액, 및 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜은 주사가능한 용액용으로 특히 바람직한 액체 담체이다.
활성 성분을 함유하는 제약 조성물의 제제는 당업계에 널리 이해되어 있다. 이러한 조성물은 비강인두에 전달되는 에어로졸 또는 주사제로서, 액체, 용액 또는 현탁액으로서 제조될 수 있으나, 주사 전에 액체에 용해시키거나 현탁화시키기 적합한 고체 형태가 또한 제조될 수 있다. 제제는 또한 유화될 수 있다. 활성 치료 성분은 종종 제약상 허용되며 활성 성분과 혼화되는 부형제와 혼합된다. 적합한 부형제로는, 예를 들어 물, 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등, 또는 이들의 임의 조합이 있다.
또한, 조성물은 활성 성분의 유효성을 증진시키는 습윤화제 또는 유화제, pH 완충제와 같은 소량의 보조 물질을 함유할 수 있다.
활성 성분은 중화된 제약상 허용되는 염 형태로서 조성물로 제제화될 수 있다. 제약상 허용되는 염은 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산으로 형성된 산 부가염을 포함한다. 유리 카르복실기로부터 형성된 염은 또한 예를 들어 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘 또는 수산화철과 같은 무기 염기, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유도될 수 있다.
예를 들어 크림, 겔, 점액 등을 사용하여 신체 표면에 국소 투여하기 위해, 항-종양 화합물, 또는 그의 생리적으로 허용되는 유도체, 예를 들어 염, 에스테르, N-옥시드 등을 제조하고, 제약 담체가 있거나 없는 생리학상 허용되는 희석제 중 용액, 현탁액 또는 에멀젼으로서 도포한다.
본 발명에 따른 또다른 방법에서, 활성 화합물은 소낭, 특히 리포좀으로 전달될 수 있다 (문헌 [Langer, Science 249:1527-1533 (1990)]; [Treat et al., in Liposome in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, N.Y., pp. 353-365 (1989)]; [Lopez-Berestein 동일 문헌, pp. 317-327] 참조; 일반적으로 동일 문헌 참조).
의약에 사용하기 위해, 항-종양 화합물의 염은 제약상 허용되는 염일 수 있다. 그러나, 다른 염이 본 발명에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 제조에 유용할 수 있다. 화합물의 적합한 제약상 허용되는 염은 예를 들어 본 발명에 따른 화합물의 용액을 염산, 황산, 메탄술폰산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 아세트산, 벤조산, 옥살산, 시트르산, 타르타르산, 탄산 또는 인산과 같은 제약상 허용되는 산의 용액과 혼합함으로써 형성될 수 있는 산 부가염을 포함한다.
일반적으로, NM404는 중증 종양 치료 양상의 치료 반응을 모니터링하는 촉망받는 신규한 종양-선택적 진단 조영제이다. 제2 세대 포스포리피드 에테르 유사체인 방사성 요오드화된 NM404는 10/10 이종이식편 종양 모델에서, 그리고 보다 최근에는 또다른 14/14 자발적 설치류 종양 모델에서 현저한 종양 선택성을 나타내었다. 종양 세포의 막에서 대사성 포스포리파아제 효소의 공격에 기인하여, 이러한 접근의 우세한 가설은 포스포리피드 에테르 유사체가 대사되고 제거되지 못하는 능력 때문에 종양 세포막에서 배타적으로 포획된다는 것이다. 따라서, 생존가능한 종양 세포에 대한 정상 세포로부터의 포스포리피드 에테르의 차등적 제거율은 이러한 개념의 근간을 형성한다. 다양한 종양 모델로부터 수득된 결과는 NM404가 생존가능한 종양 세포에 의해 격리되고 선택적으로 보유되며 림프절에서 발견되는 것을 비롯한 해부학적 위치에 관계없이 일차 및 전이성 병변 둘다에 위치된다는 것을 지시한다. FDG와 달리, 상기 활성제는 감염 부위에 위치되지 않는다. FDG에 비해 NM404의 다른 이점은 하기와 같다: NM404는 악성 종양 세포에 대해 선택적이며 이에 의해 무한정 보유되는 반면, FDG는 종양 세포에 대해 선택적이지 않으며 감염 부위 및 과다형성부 (바레트 식도)로 간다. 또한, 124I가 4일의 물리적 반감기를 갖기 때문에, 이는 어디로든 선적될 수 있는 반면, 반감기가 110분인 FDG는 생산 장소로부터 200 마일 내에서만 한정적으로 분배된다. NM404는 연장된 보유를 겪으며 (대사되지 않음), 따라서 131I와 같은 적절한 방사성 동위원소와 병용시 상당한 치료적 잠재성을 나타내는 반면, FDG는 어떠한 치료 잠재성도 갖지 않는다. NM404는 그의 확대된 다양한 능력 (진단 및 치료요법 뿐만 아니라 실험 동물 연구용의 도구)을 가지면서 다양한 요오드 동위원소로 표지될 수 있는 반면, FDG는 매우 낮은 민감도 수준임에도 불구하고 PET 스캐닝에 있어서 13F로, 또는 자기 공명 영상화에 있어서 잠재적으로 (안정한) 19F로 제한된다. 그의 종양 표적화 능력에 관계없이, 그의 종양 세포에서의 급속한 대사 때문에, 이는 치료요법에 잠재성을 갖지 않는다. NM404는 다양한 치료 양상에 국소 종양 반응을 정확하게 예측하게 할 뿐만 아니라 하위-치료적 일차 종양 치료의 경우에 원거리 전이성 병변의 검출을 허용한다.
II. 본 발명
본 발명은 일반적으로 다양한 암의 검출 및 치료 방법 및 기술을 제공한다. 바람직한 일 실시양태에서, 본 발명은 암에 걸렸거나 암에 걸린 것으로 의심되는 대상체에서 폐암, 부신암, 흑색종, 결장암, 결장직장암, 난소암, 전립선암, 간암, 피하암, 장암, 간세포 암종, 망막포세포종, 자궁경부암을 검출하고 그 위치를 확인하는 방법을 제공한다. 본 방법은
(a) 포스포리피드 에테르 유사체를 대상체에게 투여하는 단계; 및
(b) 암에 걸린 것으로 의심되는 대상체의 기관이 주변 영역(들)보다 더 높은 수준의 유사체를 보유하는지 결정하는 단계
를 포함하며, 더 높은 보유 영역은 암의 검출 및 그 위치를 나타낸다. 상기 방법에서, 포스포리피드 유사체는 하기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물로부터 선택된다.
<화학식 1>
Figure 112006065192081-PCT00003
(식 중, X는 요오드의 방사성 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택되고, n은 16 내지 30의 정수이고, Y는 NH2, NR2 및 NR3을 포함하는 군으로부터 선택되며, 여기서 R은 알킬 또는 아릴알킬 치환기임)
<화학식 2>
Figure 112006065192081-PCT00004
(식 중, X는 요오드의 방사성 동위원소이고, n은 16 내지 30의 정수이고, Y는 H, OH, COOH, COOR 및 OR로 이루어진 군으로부터 선택되고, Z는 NH2, NR2 및 NR3으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 R은 알킬 또는 아릴알킬 치환기임). 상기 방법에서, X는 122I, 123I, 124I, 125I 및 131I로 이루어진 요오드의 방사성 동위원소 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 상기 방법에서, 포스포리피드 에테르는 18-(p-요오도페닐)옥타데실 포스포콜린, 1-O-[18-(p-요오도페닐)옥타데실]-1,3-프로판디올-3-포스포콜린 또는 1-O-[18-(p-요오도페닐)옥타데실]-2-O-메틸-rac-글리세로-3-포스포콜린이며, 요오드는 방사성 동위원소의 형태이다. 다양한 포스포리피드 에테르, 및 포스포리피드 에테르 화합물의 제조 및 사용에 대한 관련 방법론은 미국 특허 제4,925,649호; 동 제4,965,391호; 동 제5,087,721호; 동 제5,347,030호; 동 제6,255,519호 및 동 제6,417,384호에 기재되어 있으며, 상기 특허 모두는 이 거명을 통해 본원에 포함된다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 대상체에서의 암의 치료 방법을 제공한다. 본 방법은 상기 기재된 바와 같은 포스포리피드 에테르 유사체를 포함하는 유효량의 분자를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 상기 방법에서, 암은 폐암, 부신암, 흑색종, 결장암, 결장직장암, 난소암, 전립선암, 간암, 피하암, 장암, 간세포 암종, 망막모세포종, 자궁경부암, 신경교종, 유방암, 췌장암, 암육종 및 프로스트레이트암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 또한 암 치료용 제약 조성물의 제조를 위한 포스포리피드 에테르 유사체의 용도를 고려한다. 상기 포스포리피드 유사체는 상기 논의된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또다른 실시양태는 대상체에서 염증, 선종 또는 과다형성을 신생물로부터 구별하는 방법을 제공한다. 본 방법은
(a) 대상체에게 포스포리피드 에테르 유사체를 투여하는 단계, 및
(b) 염증, 선종, 과다형성 또는 신생물을 가질 것으로 의심되는 대상체의 기관이 주변 영역(들)보다 더 높은 수준의 유사체를 보유하는지 결정하는 단계
를 포함한다. 대상체가 더 높은 보유 영역을 나타낼 경우, 이는 신생물의 검출 및 그 위치를 나타내며, 대상체가 더 낮은 보유 영역을 나타낼 경우, 이는 선종, 과다형성 또는 염증에 걸린 것으로 의심되는 기관의 존재를 나타낸다.
본 발명의 또다른 실시양태는 포스포리파아제 D (PLD)를 갖는 조직 샘플에서 신생물을 검출하는 방법을 제공한다. 본 방법은
(a) 상기 조직 샘플에서 PLD 단백질 활성 수준 또는 PLD mRNA 수준을 정량하는 단계, 및
(b) 상기 조직 샘플이 주변 조직 영역(들)보다 더 낮은 수준의 단백질 활성을 갖는지 결정하거나, 또는
(c) 상기 조직 샘플이 주변 조직 영역(들)보다 더 낮은 수준의 mRNA를 갖는지 결정하는 단계
를 포함하며, 더 낮은 수준의 활성 영역 또는 더 낮은 mRNA 수준의 영역은 신생물의 검출 및 그 위치를 나타낸다.
상기 방법에서, PLD 단백질 활성 또는 mRNA 수준은 조직 샘플을 상기 기재된 바와 같은 PLE 유사체와 접촉시킴으로써 정량될 수 있다.
본 발명의 또다른 실시양태는 (a) PLD 단백질 활성 또는 PLD mRNA 수준을 정량하는 단계 (여기서, 주변 조직 영역(들)에 비해 감소된 PLD 단백질 활성 또는 감소된 mRNA 수준은 신생물을 나타냄)를 포함하는, PLD를 갖는 조직 샘플을 스크리닝하는 방법에 의해 선택되는 것인 항-종양제를 제공한다. PLD 단백질 활성 또는 mRNA 수준은 조직 샘플을 상기 기재된 바와 같은 PLE 유사체와 접촉시킴으로써 정량될 수 있다.
하기 섹션은 단지 특정 포스포리피드 에테르 화합물에 관련된 용도 및 방법을 논의하고 있지만, 이러한 용도는 예시적이며, 본 발명의 범위를 좁히는 것으로 간주되지 않아야 한다.
예를 들어, 포스포리피드 에테르인 NM404는 신생물에 대한 현저한 특이성을 나타내지만, 많은 실험적 종양 모델에서 예비신생물 조직에서는 이를 나타내지 않는다. 배경 친화성에 대한 높은 종양 및 NM404의 종양 선택성은 이것이 내부-치료 종양 영상을 위한 18F-FDG PET에 비해 잠재적으로 우수할 수 있음을 암시한다. NM404의 종양 특이성의 정확한 메카니즘은 검토중이며, 현재는 18F-FDG 흡수에 대한 글루코스 이용 메카니즘만큼 잘 기재되어 있지 않다. 신생물 조직에서의 NM404 흡수가 상기 조직의 생존가능성에 달린 것인지, 또는 상기 흡수 현상이 조직 생존가능성에 독립적인 일부 막 또는 매트릭스 성분과 관련된 것인지는 잘 확립되지 않았다. 상기 흡수 및 특이성이 종양 생존가능성과 관련되어 있을 경우, 방사선에 의해 최근에 멸균된 종양에서의 NM404 흡수는 존재하지 않거나 빈약할 것인 반면, 방사선에 대한 종양 내성은 계속된 흡수를 나타낼 것이다. 최근, 본 발명자들은 누드 마우스에서 방사성 민감성 및 방사성 내성 편평 암 세포 (SCC1 및 6) 둘다에서 NM404 흡수 및 사멸을 입증하였다. NM404 치료후 위치화를 나타내지 않는 환자는 치료를 나타낼 것인 반면, 내성 종양을 갖는 환자 (계속된 NM404의 흡수)는 다른 비-방사성 선택방안 (수술, 화학요법 등)을 제공할 수 있기 때문에, 이러한 분석법은 방사선 요법으로 치료받는 환자의 관리에 매우 가치있다.
감도가 높고 입수가능성이 높은 조영법의 개발에 대한 한 가지 접근법은 목적하는 표적 조직에 대한 방사성 의약품 프로브를 선택적으로 전달할 수 있는 담체 분자를 설계하는 것이다. 본 발명자의 접근법은 높은 정도의 조직 또는 종양 선택성을 나타내는 분자의 고유한 생화학적 또는 제약학적 특성을 이용하였다.
스니더(Snyder) 및 동료들16 ,17은 다양한 동물 및 인간 종양 세포가 정상 조직에서보다 세포막에서 더 높은 농도의 천연 발생 에테르 지질을 함유함을 관찰하였다. 그는 종양에서의 에테르 지질의 축적은 중요한 대사 효소의 부족 때문에 상기 지질을 대사시키는 종양 세포의 더 낮은 용량의 결과라고 제안하였다. 본 발명자들은 잠재적 종양-선택적 조영제로서 다수의 방사성 요오드화된 포스포리피드 에테르 (PLE) 유사체를 합성함으로써 상기 관찰을 이용하였다. 몇몇 상기 PLE 유사체는 폭넓게 다양한 자발적 및 이식된 래트, 마우스 및 인간 종양 모델 (24/24)에서 위치되고 선택적으로 보유된 현저하고 명백한 범용의 능력을 나타내었다.
본 발명자들이 보급하는 가설 (도 1)은 대사되고 제거되지 못하는 능력 때문에 포스포리피드 에테르가 생존가능한 종양 세포막에서 포획된다는 것이다. 방사성 요오드화된 포스포리피드 에테르의 투여 후 종양의 추출은 단지 그대로의 활성제의 존재만을 나타내는 반면, 뇨 및 변의 분석은 대사만을 나타내었다. 따라서, 상기 개념의 근간을 형성하는 것은 종양 세포에 대한 정상 세포로부터의 포스포리피드 에테르의 차등적 제거율이다. 24개 초과의 이종이식편 및 자발적 종양 모델에서 수득된 예비 결과는 NM404가 종양에서 선택적 흡수 및 연장된 보유를 겪음을 보편적으로 나타내었다. 활성제가 간에서 어느 정도까지는 대사되기 때문에, 본 발명자들은 간 배경 방사성활성 수준에 기인한 간 종양 모델에서의 초기 화합물 평가는 회피하였다. 또한, NM404가 그의 전임자보다 더 낮은 간 배경 수준을 허용하기 때문에, 본 발명자들은 HCC에 걸린 환자를 조영하는 것이 문제가 있다는 사실의 관점에서 간 종양으로 평가를 확장하였다. 많은 환자는 잠재적인 경화증을 가지며, 따라서 단면 조영 상에서 HCC로부터 재생성된 결절을 구별하는 것은 어렵다. 더욱이, FDG로 PET 스캐닝을 평가하는 예비 연구는 질환을 검출하는데 있어서 단지 20 내지 50％ 민감도만을 나타내었다 (문헌 [Verhoef C, Valkema R. et al., Liver (2002) 22:51-56]. 또한, PET-FDG는 뇌에서의 진단 스크리닝에 유용하지 않다. 유사하게, FDG는 간세포에 의한 높은 자연 흡수량에서 기인한 간에서의 질환을 평가하는데 유용하지 않다.
하기 실시예는 본 발명의 바람직한 실시양태를 나타내며, 예시의 목적만을 위한 것이다. 상기 실시예는 본 발명의 범위를 좁히는 것으로 간주되지 않아야 한다.
III. 실시예
A. 실시예 I: 합성, 방사성 표지 및 NM404 의 제제:
본 발명자들의 합성 접근법은 알킬 쇄 연장을 위한 그리냐르 시약과 알킬 토실레이트 또는 할라이드의 구리-촉매된 가교 반응을 기초로 하였다 (하기 반응식 참조). 합성은 p-요오드벤질 알콜 (1)로부터 출발하여, 이를 트리메틸실릴 브로마이드와의 반응에 의해 p-요오도벤질 브로마이드 (2)로 전환시켰다. p-요오도벤질 브로마이드 (2)를 촉매로서 Li2CuCl4의 존재하에서 그리냐르 시약 (3)과 추가로 커플링시켰다. 제1 커플링 생성물 (4)의 탈보호 후에 수득된 12-(p-요오도페닐)도데칸올 (5)을 토실레이트 (6)로 전환시켰다. 다음 단계에서, 토실레이트 (6)를 6개의 탄소 원자를 함유하는 그리냐르 시약 (7)과 커플링시켰고, 이는 쇄 연장 과정을 종료시켰다. 8의 THP 탈보호로 18-(p-요오도페닐)옥타데칸올 (9)을 수득하고, 이를 하기 반응식에 나타낸 바와 같은 2-단계 절차에 의해 10 (NM-404)로 전환시켰다.
Figure 112006065192081-PCT00005
또한, NM404를 임의의 동위원소 (요오드일 경우 124I, 125I 및 131I 포함)로 표지하는 급속 고 수율 합성 공정을 하기 공정에 의해 수행하였다.
첫번째로, 알루미늄 가열 블록 장치를 145℃로 예열하고, 응축기를 굽은 1.5 인치 18 ga 일회용 바늘 및 상부에 고무 격벽으로 맞춰진 5 mL 일회용 주사기 배럴을 사용하여 제조하였다.
두번째로, HPLC 시스템을 개시하고, 저장기를 여과된 탈기 용매 (헥산/이소프로판올/물 40:52:8)로 충전하였다. 시스템을 평형화시킨 후, 펌프, 검출기, 차트 기록기 및 컴퓨터 완성기와 같은 보조 시스템의 체계적 점검을 수행하였다.
세번째로, 3-mL 일회용 주사기 목탄 트랩을 바닥의 유리 양모 플러그를 사용하고, 주사기를 과립화된 목탄으로 2.5 mL로 충전하고, 또다른 유리 양모 플러그를 첨가하고, 격벽을 상부에 삽입하여 제조하였다. 짧은 튜브 어댑터 바늘을 주사기 상에 놓고, 18-ga 바늘을 상부의 격벽을 통해 삽입하였다. 목탄 트랩을 응축기의 상부에 연결하고, 나트륨 티오술페이트 트랩을 통해 대기에 배출시켰다.
네번째로, 황산암모늄 5 mg을 2 mL 보로실리케이트 유리 v-바이알에서 탈이온수 20 ㎕에 첨가한 후, 무수 에탄올 20 ㎕ 중 비표지된 NM404 20 ㎍을 바이알에 첨가하였다. 바이알을 부드럽게 돌리거나 쳐서 혼합시키고, 6개의 보로실리케이트 유리 비드 (3 mm)를 또한 바이알에 첨가하였다. 그 후, 바이알을 테플론-코팅된 부틸 고무 격벽 및 알루미늄 크림프 캡으로 밀봉하였다. 격벽을 18-ga 바늘로 천공하고, 목적하는 양의 수성 요오드화나트륨-131 (0.1 N NaOH 중, 전형적으로 15 ㎕ 중 5 mCi)을 격벽을 통해 해밀톤(Hamilton) 미세주사기를 통해 첨가하였다. 바이알을 다시 부드럽게 돌리거나 쳐서 혼합하였다. 바이알을 투여량 측정기에서 분석하였다.
다섯번째로, 목탄 트랩 주사기를 반응 바이알 내로 삽입하고, 반응 바이알을 가열 블록 내로 잘 낮추었다 (모래로 반을 충전하는 방식). 반응 바이알을 145℃에서 40분 동안 가열하였으며, 그 동안 대부분의 용매가 증류되었고, 응축기에서 응축되었다. 공기 스트림 (4 X 25 mL)을 25-mL 주사기로 반응 바이알을 통해 서서히 삽입하였다. 반응 바이알의 온도를 155℃로 증가시키고, 가열을 추가의 30분 동안 계속하였다. 반응 바이알을 블록 가열기로부터 제거하고, 응축기/트랩 어셈블리를 분리시켜서 버리고, 바이알을 실온으로 냉각시켰다.
여섯번째로, 무수 에탄올 0.5 mL을 반응 바이알에 첨가하였다. 바이알을 부드럽게 흔들고, 투여량 측정기에서 분석하였다.
일곱번째로, 표지된 조 생성물 혼합물의 방사성-TLC 분석을 실리카 겔 (클로 로포름/메탄올/물 (65/35/4)) 상에서 수행하였다.
여덟번째로, 앰버라이트(Amberlite) IRA 400-OH 수지 컬럼을 무수 에탄올 5 mL 중 수지 1.0 g을 30분 동안 예비흡인함으로써 제조하였다. 에탄올을 경사분리하고, 수지를 추가의 2 부분의 에탄올 5 mL로 세정하였다. 습윤 수지를 바닥에유리 양모 플러그를 갖고 아크로디스크(Acrodisc) 필터 및 1-웨이 콕마개로 맞춰진 3 mL 일회용 주사기 배럴에 첨가하였다. 방사성 요오드화된 조생성물의 에탄올계 용액을 수지 컬럼을 통해 5 mL 바이알 내로 점차적으로 용리시켰다.
아홉번째로, 격벽을 삽입하고, 용매를 질소 스트림으로 내뿜었다. 목탄 주사기를 바이알의 배출구 상에 부착한 후, 질소 유동을 개시하였다. 일단 건조된 후, 에탄올 50 ㎕을 사용하여 희석시키고, 내용물을 300 ㎕ v-바이알에 옮겼다. 공급원 바이알을 제2의 에탄올 세척액 50 ㎕로 세정하고, v-바이알에 옮겼다.
열번째로, HPLC 펌프를 안정화시키고, 1.0 mL/분의 용매 유동을 수립하였다. 반응 혼합물을 헥산/이소프로판올/물 (40:52:8)로 1.0 mL/분에서 용리하는 펄킨-엘머(Perkin-Elmer) 카트리지 실리카 컬럼 (4.3 X 33 mm, 3 ㎛ 실리카) 상의 HPLC에 의해 정제하였다. 피크 검출은 230 및 254 nm의 UV 및 방사성활성에 의해 수행하였다. 일단 적절한 피크를 멸균 바이알에서 수집하면, 방사성-TLC 분석용의 작은 샘플을 제거하고, 잔류 용매를 질소 스트림으로 증발시켜 목적 화합물을 건조 잔류물로부 서 수득하였다. 비활성을 필요에 따라 계산하였다.
열한번째로, 폴리소르베이트 20을 NM-404의 0.1 ㎕/1.0 ㎍의 비율로 무수 에탄올 중 5％ 폴리소르베이트 20의 원액 용액으로부터 플라스크에 첨가하였다. 폴 리소르베이트 20은 NM404를 사용한 인간 및 동물 연구 둘다에서 현재 사용되는 트윈 20의 제약상 등급이다. 용매를 30℃ 미만에서 10분 동안 회전 증발시켜 제거하였다. 잔류물을 충분한 멸균수에서 혼합시켜 용해시키고, 2％ 폴리소르베이트 20 용액을 수득하였다. 제제화된 생성물을 멸균 0.2 ㎛ 팔-겔만 아크로디스크 (Pall-Gelman Acrodisc) 필터 (13 mm)를 통해 또다른 멸균 0.2 ㎛ 필터로 배출된 건조, 멸균, 다투여량 바이알 (홀리스터-스티어(Hollister-Stier)을 통해 통과시켰다. 생성물 용액 100 ㎕를 QC 분석용으로 바이알로 전환하였다.
열두번째로, 방사성활성을 투여량 측정기에서 측정하고, 품질 제어 시험 (멸균성, 흡열성(apyrogenicity))을 수행하였다.
표지되지 않은 모든 NM404는, 연구마다 발생할 수 있는 잠재적인 인위적 차이를 최소화시키기 위해서 근래에 엄격한 독성학 시험을 실시한 원래의 원액 배치에서 취하였다. NM404의 방사성요오드화는 본원 발명자들이 개발한 피발산 용융물에서의 동위원소 교환 반응19 또는 본원에 기재한 신규 방법을 통해 통상적으로 수행하였고, 본원 발명자들이 기재한 표준 방법에 따라 주사용으로 제조하였다22. 이 절차는 NM404의 선구물질인 NM324를 사용한 인간 대상의 초기 시험에서 멸균 물질을 제조하는데 효과적으로 이용되었던 것으로, 125I-표지된 NM404 및 131I-표지된 NM404 제조에 40회 넘게 이용하였다. 일반적으로, HPLC에 의한 정제 및 정확한 질량 정량 후에 방사성 의약품을 무수 에탄올 (50 내지 500 ㎕) 및 폴리소르베이트 20 (화합물 1 ㎍ 당 0.1 ㎕) 중에 용해시켰다. 에탄올을 진공하에 제거하고 잔류 물을 멸균수 중에 용해시켜 폴리소르베이트 20을 2 내지 3％ 정도만 함유하는 최종 용액을 수득하였다. 멸균 0.2 ㎛ 필터 유닛을 통해 여과하여 멸균시켰다. 최종 방사성 화학물질의 순도는 97％를 초과해야만 동물에 사용할 수 있다. 최종 비활성의 정량 및 산출은 알려진 질량 표준물질을 사용한 HPLC 분석으로 수행하였고, 방사활성 (125I)의 정량은 PE 월랙(Wallac) 감마-계수기 중에서 희석 및 계수함으로써 감약화 문제를 피하여 수행하였다. 131I 등을 비롯하여 보다 고에너지를 갖는 동위원소의 정량은 이들 동위원소에 대한 설정치가 입력되어 있는 용량 측정기로 행하였다. 전형적으로, 방사성요오드화 NM404 100 ㎍ 당 1 mCi의 비활성이 달성되었다. 주사 부피는 전형적으로 마우스 1 마리 당 대략 100 ㎕ 정도였다. 조직 분포 데이터는, 온전한 기관을 본원 발명자들이 수립하여 공개한 절차22에 따라 측량하여 조직 1 g 당 주사량(％)(+SEM) 및 기관 하나에 대한 주사량(％)으로 나타내었다. 각 시점에서 종양 대 조직의 비율은 조직 1 g 당 주사량(％)에 기초하여 산출하였다.
일반적인 조직 분포 ( TD ) 분석: 생체내분포 연구는 본원 발명자들이 개발한 표준 절차27에 따라 암컷 마우스에서 수행하였다. 방사성요오드화 NM404 (100㎕ 중 5 μCi)를 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였다. 예정된 시점에 동물 (시점 당 3 마리)을 펜토바르비탈 마취하에 출혈시켜 안락사시켰다. 혈액, 혈장, 부신, 방광, 골수, 지방, 심장, 신장, 간, 폐, 근육, 비장, 난소, 피부, 갑상선 및 종양을 포함 하는 총 16가지 조직을 절제하고 세정하여, 외부 조직이 없도록 절개하였다. 커다란 기관은 잘게 썰었고, 2벌 조직 샘플을 측량하여 동위원소 계수를 위한 플라스틱 튜브에 넣었다. 주사 부위 및 사체에 남아있는 방사활성 역시 웰 계수기에서 측정하였다. 이 표준 절차는 본원 발명자들의 실험실의 적절한 동물 우리에서 방사선 안전성 승인을 받아 수년 동안 이용되어 온 것이다. 1 g 당 주사량(％), ％kg 투여량, 및 기관 하나 당 주사량(％) + SEM에 기초하여 붕괴-보정된 조직 방사활성 농도 데이터를 생성하는 컴퓨터 프로그램으로 조직 분포표를 만들었다. 각 시점에서 조직 1 g 당 주사량(％)에 기초하여 종양 대 조직 비율을 산출하였다. 제4일, 제7일, 제14일, 제21일 및 제28일에 종양 보유 마우스에서 대조군 TD 연구 (3 마리 마우스/시점, 총 15 마리 마우스)를 수행하여, 대부분의 NM404 주사에 대하여 모든 치료 요법에 대한 비교용 TD표를 만들었다.
일반적인 영상화 프로토콜: 동물에게 꼬리 정맥 주사를 통해 125I-NM404 (10 μCi)를 주사한 후에 예정된 시점에 마취시키고 (펜토바르비탈 나트륨 마취, 0.06 mg/g bw), 마우스 영상화를 위해 변형시킨 바이오스캔 AR2000 방사선-TLC 스캐너 (1 mm의 고해상도 콜리메이터/레인 당 획득 시간, 1분/레인 증가분, 1 mm)를 사용하여 방사성핵종 스캐닝을 수행하였다. 데이터를 정량하고 바이오스캔으로부터 윈스캔(Winscan) 2D 소프트웨어를 통해 나타내었다. 대조군 및 처치된 종양을 일단 절제해 내고, 이것을 또한 바이오스캔 장치에서 생체외 스캐닝하여 전신 방사성핵종 감약화를 없애서 보다 정확한 ROI 분석을 행하였다. 중간 해상도의 획득 파라 미터를 사용하는 마이크로CT 스캐닝 (임테크 마이크로캐트(Imtek MicroCAT) I, 390 단계 획득/43 Kvp/410 μA)을 동물 (펜토바르비탈 나트륨 마취, 0.06 mg/g bw)에 수행하였다. 데이터 세트는 3-차원적으로 재수립하였고 아미라(AMIRA) 3D-가시화 소프트웨어로 가시화하였다. 상기 소프트웨어는 ROI 밀도 분석 및 편리한 온(on)-스크리닝 측정이 가능하다.
B. 실시예 II : 제1 세대 PLE 유사체를 이용한 전임상 연구:
포스포리피드 에테르는 본원 발명자들이 개발한 동위원소 교환 방법19을 이용하여 요오드 방사선동위원소로 쉽게 표지될 수 있다. 요오도페닐 포스포리피드 에테르 유사체는 각 분자에 고착된 방사선요오드가 간편한 생체내 탈요오드화에 안정적이도록 특별하게 고안된 것이다. 방사성표지된 PLE 화합물을 20종 초과로 합성하여 시험관내 및 생체내 시험하였다20 -22. 이들 중 2종인 NM294 및 NM324 [12-(3-요오도페닐)-도데실-포스포콜린]가 동물 종양 위치결정 연구에서 가장 유망한 것으로 나타났다. 요오드-125로 표지된 이들 원형 화합물은 하기하는 동물 종양 모델에서 시간에 따라 종양에 선택적으로 국소화되었다: 1) 워커(Walker) 256 암육종을 보유하는 스프래그-돌리(Sprague-Dawley) 래트; 2) 유방 종양을 보유하는 루이스(Lewis) 래트; 3) 더닝 R3327 전립선 종양을 보유하는 코펜하겐 래트; 4) Vx2 종양을 보유하는 토끼; 및 5) 인간 유방 종양 (HT39), 소세포 폐 종양 (NCI-69), 결장직장 종양 (LS174T), 난소 종양 (HTB77IP3) 및 흑색종 종양을 보유하는 무흉선(athymic) 마우스. 이들 작용제가 종양의 위치를 최적으로 나타내는데에는 1일 내 지 수일이 소요된다.
PLE 유사체를 사용한 기계적 연구: NM324 및 NM404는, 유럽에서 가장 널리 연구되고 있는 항-종양 에테르 지질인 밀테포신 (헥사데실포스포콜린)과 구조적으로 유사하다. 밀테포신 및 여러가지 기타 항-종양 포스포리피드 에테르 유사체의 항-종양 성질은 전립선 암종, 방광 암종 및 기형 암종, 뮤린 (murine)과 인간의 백혈병 뿐만이 아니라 폐암, 결장암, 난소암, 뇌암 및 유방암 등을 비롯한 광범위한 종양 세포주에서 입증된 바 있다23. 많은 항암 약물과는 대조적으로, 이들 포스포리피드 에테르 유사체는 DNA에 직접 결합하지 않으며 돌연변이를 유발하지 않는다. 정확한 항-증식 작용 메카니즘은 결정되지 않았으나, 이들이 여러 종양 세포 부위에서 작용하는 것은 명백하다. 이들 화합물은 사이토킨 형성의 촉진, 수송, 아팝토시스(apoptosis)의 유도 및 다양한 중요 지질 대사의 방해, 및 대개가 세포 막에 위치한 세포 신호전달 효소의 방해 등을 비롯한 다양한 세포내 작용과 관련이 있다. 세포로의 흡수 방식에 관한 논쟁이 있긴 하지만, 대다수의 보고가 이들 에테르 지질이 세포 막으로 직접 흡수되어 그곳에 축적된다는 견해를 뒷받침하고 있다. 일반적으로는 이들 작용제가 막 포스포리피드 대사를 교란시켜서 작용한다고 여겨지고 있지만, 이들 작용제를 이용한 세포내 분포 연구는 균질화 및 세포 소기관 분획화 절차 동안의 자발적인 세포 구획 재분포로 인해 제한적이었다. 본원 발명자들이 사용한 추적자 영상화 용량 (수 ㎍)과는 대조적으로, 일반적으로 1일 당 300 내지 1000 mg를 초과하는 용량에서만 항-종양 효과가 관찰된다.
NM404의 선구물질인 NM324 등을 비롯한 여러 PLE 유사체에 대하여 정형적인 대사 연구를 실시하였다. 이들 연구에서는 각 작용제를 시험하여 PLE 대사 관련 효소에 대한 기질로서의 작용 능력을 측정하였다. 도 24에 나타난 바와 같이, PLE의 대사에는 3가지 주요 효소 경로가 관련되어 있다. O-알킬 글리세롤 모노옥시게나제 (AGMO)는 C-1에서의 알킬 에테르 결합 절단을 담당하여 장쇄 지방 알콜을 형성하거나 또는 이후에 상응하는 지방산을 형성한다. 한편, 포스포리파제 C (PLC) 및 D (PLD)는 각각 글리세롤 또는 포스파티드산 생성물을 생성한다. NM324는, 광범위하게 대사되는 [3H]-리소-PAF (혈소판 활성화 인자)와 비교할 때 미소체 AGMO 효소 제제에 대한 기질이 아니었다. 유사한 방식으로, NM324는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에서 단리한 PLC의 기질인 것으로 분석되었고, 상당한 가수분해가 일어나는 1-팔미토일-2-[3H]-팔미토일-L-3-포스파티딜콜린 (DPPC)에 비하여 가수분해되지 않았다.
최종적으로, 여러 PLE 유사체로 PLD 검정을 수행하였다. 양배추에서 단리한 PLD는, 에탄올 존재하의 효소 반응 수행시에 포스파티드산 뿐만이 아니라 포스파티딜에탄올형의 생성물을 생성한다는 점에서 포유동물 PLD와 유사하다. 이러한 검정 조건에 적용시킨 PLE 유사체 중 몇몇은 포스파티딜에탄올 부가물을 생성하였는데, 이는 PLD와의 상호작용 가능성을 지시하는 것이다.
워커 종양 세포, 래트 근육 세포 (H9c2) 및 래트 간세포 등을 비롯한 각종 세포주에서 여러 NM404 전구체를 사용하여 시험관내 대사 연구를 수행하였다. 이들 연구에서는 대사 정도를 다양한 시간 동안의 인큐베이션 후에 형성된 방사성표지된 생성물에 기초하여 측정하였으며, 이 결과를 세포 수 또는 세포내 단백질의 양으로 표준화시켰다. 이후에는 인큐베이션 배지 및 세포 현탁액의 지질 추출을 행하여, 워커 종양 세포에서는 PLE 대사물질이 거의 생성되지 않는 반면에 근육 세포와 간세포 둘다에서는 연구한 48시간에 걸쳐서 대사물질이 유의하게 생성된다는 것을 입증하였다. 이러한 결과는 모든 유사체에 대하여 실시한 생체내 생체내분포 연구와 크게 관련이 있었다. 여러 연구가 완료되었지만 종양 세포에서 방사성표지된 PLE 유사체의 흡수 및 보유에 있어서의 대사 포획의 역할은 제대로 규명되지 않았고, 현재까지 활발한 조사 분야로 남아있다.
NM324 의 임상 평가: NM324는 여러가지 유망한 제1 세대 PLE 유사체 중에서 보다 쉽게 합성되는 것이었기 때문에 초기 임상 연구의 선두 화합물로서 선택하였다. 5명의 인간 폐암 환자에서 얻은 영상에서는 종양이 검출되었지만, 영상은 높은 간 방사활성 (도 2)으로 인해 해독이 어려웠다.
제2 세대 PLE 유사체: 간 흡수를 낮추고 혈장 존재 기간을 연장시키기 위한 NM324의 9가지 구조적 유사체를 합성하여 125I로 방사성표지하고, 더닝 R3327 전립선 종양을 보유하는 코펜하겐 래트에서 초기 영상 분석을 행하였다. 이러한 초기 스크리닝에 기초하여 NM347, NM404 [18-(4-요오도페닐)-옥타데실포스포콜린] 및 NM412 (도 3)를 선별하고, 동물-종양 모델에서의 추가 영상화 및 생체내분포 분석을 행하였다.
동물 모델에서 NM404 및 NM412를 사용한 보다 최근의 영상화 연구에서는 이들 모두가 각종 종양의 가시화에 NM324보다 더 우수한 것으로 나타났다. 유의하게, 전이성 전립선 종양 모델에서는 NM404 또는 NM412의 정맥내 투여 후에 림프절 전이가 명백하게 나타났다. 가장 중요한 것은, 관련 없는 림프절에는 상기 추적자가 보유되지 않았다는 점이다24 (도 4A). 전립선 모델에서 수행한 것이긴 하지만, 이러한 발견은 림프절 관련성이 중요한 예후 지표인 유방암과 특히 관련이 있다. 인간 A549 NSCLC 종양을 보유하는 SCID 마우스에서 수행하는 예비 파일럿 연구가 추진되었고, NM324의 경우에는 간에 의한 제1 통과 제거율이 높다는 문제가, NM404에서는 해결됨을 입증하였다. NM404는, 지연 영상에서 특히 현저하게 나타나는 우수한 종양 가시화를 보이고, NM324와 비교하여 간 및 신장 흡수량이 최소였다 (도 4). 조직 생체내분포 연구는 종양에 높은 수준의 방사활성이 잔류함을 추가로 확인시켜주었다. 영상화 결과는 NM404 및 NM412와 유사하지만, 래트에서 얻은 방사선량측정 데이터는 NM404의 신장 투여량이 NM412보다 더 낮다는 것을 밝혀내었고, 따라서 추후 연구에는 NM404를 선택하였다. 전립선 및 A549 폐암 종양 모델의 SCID 마우스에서 NM324 및 NM404의 생체내분포 데이터를 비교한 결과, NM404 사용시에는 종양 대 정상 조직의 비율이 높고 종양 흡수량이 주사량의 25％ 초과임을 밝혀냈다.
매우 다양한 종양 모델에서의 흡수 특성을 결정하는 것을 목적으로 하여 마우스 모델에서 동물 영상화 연구를 수행하여 표 1에 요약하였다. B6 ApcMin/+ 마우스에서의 예비 결과는 NM404가 선종성 폴립에 의해서는 흡수되지 않지만 이 모델에서의 유방 선암종에 의해서는 흡수되고 보유된다는 것을 지시하였고, 따라서 악성 종양 세포에 대해 특이적일 수 있는 가능성을 시사하였다. 이들 연구는 비-침윤적으로 종양을 특징규명하는 NM404의 잠재력을 결정하는 것을 목적으로 하였다. NM404는 연구한 모든 선암종 모델에서 유의한 종양 흡수 및 보유를 나타내었다.
종양 모델 종 부류 흡수 여부
인간 종양 이종이식편
전립선 PC-3 SCID 마우스 선암종 흡수됨
폐 A-549 (NSCLC) 폐 NCI H-69 (귀리형) 부신 H-295 SCID 마우스 누드 마우스 SCID 마우스 선암종 선암종 선암종 흡수됨 흡수됨 흡수됨
부신 RL-251 SCID 마우스 선암종 흡수됨
흑색종 A-375 누드 마우스 선암종 흡수됨
결장 LS-180 난소 HTB-77 누드 마우스 누드 마우스 선암종 선암종 흡수됨 흡수됨
동물 종양 이종이식편
유방 MCF-7 래트 선암종 흡수됨
전립선 MatLyLu 래트 선암종 흡수됨
워커-256 래트 암육종 흡수됨
최근의 설치류 모델
TRAMP 전립선 자발적 마우스 선암종 흡수됨
간 CT-26 마우스 이종이식편 결장직장 선암종 흡수됨
피하 CT-26 마우스 이종이식편 결장직장 선암종 흡수됨
민(Min) 마우스 장 흑색종 SCC1 및 6 내인성 마우스 마우스 이종이식편 누드 마우스 선암종 선암종 편평 세포 암종 흡수됨 흡수됨 흡수됨
유방 SCC 및 AC ApcMin /+ 마우스 SCC 및 선암종 흡수됨
간세포 암종 자발적 마우스 선암종 흡수됨
망막모세포종 자궁경부 선암종 췌장 c-myc 및 k-ras 자발적 마우스 자발적 마우스 자발적 마우스 모세포종 선암종 선암종 흡수됨 흡수됨 흡수됨
신경교종 L9 래트 이종이식편 신경교종 흡수됨
장 폴립 ApcMin /+ 마우스 선종 흡수안됨1
유방 과다형성 ApcMin /+ 마우스 폐포 과다형성 흡수안됨1
2종양 흡수량은 그람 당 주사량의 1％에 훨씬 못 미쳤음.
CT26 뮤린 종양 모델의 관련성: 본원 발명자들은, 옆구리에 피하 CT26 세포 접종을 실시한 뮤린 (BALB/c 마우스) 모델에서 종양 반응에 대한 예측물질로서 NM-404를 사용하여 조사하였다. CT26 세포주는 분화 정도가 낮은 뮤린 선암종이며, BALB/c 마우스에 N-니트로소-N-메틸우레탄을 직장 주사하여 유도하였다. 상기 세포주는 시험관내 성장시키기가 간편하고, 혈관구조 (꼬리 정맥 주사, 전이성 모델) 또는 피부 (도 5) 또는 간에 주사하면 예측가능한 성장 양상을 보인다25 ,26. 상기 세포주가 결장직장암에서 유래된 것이기 때문에 이 뮤린 모델은 이들 연구에 있어서 임상적인 관련이 매우 높다.
CT26 종양에서 NM404 를 사용한 예비 영상화 결과: NM404가 피하 CT26 이종이식편에서 국소화된다는 것을 보여주는 예비 실험에서는, 2 마리 동물에게 125I-NM404 (10 μCi)를 주사 (IV 꼬리 정맥)하고, 주사후 제1일, 제4일 및 제7일에 변형된 바이오스캔 AR2000 방사선-TLC 스캐너 (고해상도의 1 mm 콜리메이터 및 2-D 획득 및 분석 소프트웨어 장착)에서 영상화하였다. 제7일에는 동물을 안락사시키고 종양을 제거하여 사진을 찍고 바이오스캔에서 생체외 스캐닝하였다 (도 6). 생체외 스캐닝은 요오드-125와 관련이 있는 심각한 조직 감약화 효과 때문에 본원 발명자들의 실험실에서 사용하는 표준 프로토콜이다. 제7일에는 안락사 및 종양 절개 이전에 각 동물에 마이크로CT 스캐닝도 실시하였다 (도 7). 생체외 바이오스캔 영상에서 병소의 밝은 스팟은 모든 종양과 가시적으로 상관관계가 있었다 (도 6). 림프절이 보이지만 그와 관련된 방사활성은 없었고, 이는 종양 세포 침윤이 없었음을 지시한다. 도 6 및 도 7의 주요 종양은 조직학적으로 선암종으로 분류되었다. 본원 발명자들은 마이크로CT를 통해 광범위하게 다양한 피하 종양을 스캐닝하고, 모두가 직경 300 미크론 미만까지 매우 쉽게 검출될 수 있었다.
피하 마우스 CT26 종양의 초기 RF 적출은 성공적이었고, 처치된 H＆E-염색 구역에서의 세포 막 손실로 나타나는 바와 같이 심각한 세포 손상을 초래하였다 (도 8).
C. 실시예 III : 비-소세포 폐암
인간 NSCLC 선암종 A549 세포주 (선암종은 가장 흔한 인간 폐암 조직학 유형이 되었음)를 보유하는 SCID (중증 혼합 면역 결핍 돌연변이) 마우스에 대하여 영상화 및 생체내분포 연구를 수행하였다. 5 마리 동물에서의 예비 파일럿 연구가 추진되었고, 새로운 작용제인 NM404에 의해서는 NM324 화합물과 관련된 한계가 해결됨을 입증하였다. NM324 사용시에 종양 흡수는 꽤 양호한 것으로 나타나지만, 간에 의한 제1 통과 제거율이 높아서 영상이 훼손되었다. 그러나, NM404는 지연 영상에서 특히 현저하게 나타나는 우수한 종양 가시화를 보이고 간 및 신장 흡수량이 최소였다. 추가로, 조직 생체내분포 연구는 종양에 높은 수준의 방사활성이 잔류함을 추가로 확인시켜 주었다. SCID 마우스-인간 NSCLC 모델에서의 NM324 및 NM404 영상 비교를 도 4에 나타내었다. NM404 사용시에는 간, 신장 및 창자 활성이 비교적 덜하다는 점에 주목해야 하는데, 이는 우수한 종양 가시화와 관련이 있다. 영상화 결과는 NM404 및 NM412와 유사하지만, 최근에 래트에서 얻은 방사선량측정 데이터는 NM404의 신장 투여량이 NM412보다 더 낮다는 것을 밝혀내었고, 따라서 추후 연구에는 NM404를 선택하였다.
여러 종양 모델에서 원형 작용제인 125I-NM324에 대한 광범위한 생체내분포 데이터가 컴파일된 바 있다 ([Counsell RE, Schwendner SW, Meyer KL, Haradahira T, Gross MD. Tumor visualization with a radioiodinated phospholipid ether. J Nucl Med 31(3):332-336, 1990], [Plotzke KP, Fisher SJ, Wahl RL, Olken NM, Skinner S, Gross MD, Counsell RE. Selective localization of a radioiodinated phospholipid ether analog in human tumor xenografts. J Nucl Med 34(5):787-792, 1993], [Rampy MA, Brown RS, Pinchuk AN, Weichert JP, Skinner RW, Fisher SJ, Wahl RL, Gross MD, Etheir SP, Counsell RE. Biological disposition and imaging of a radioiodinated alkylphosphocholine in two rodent models of breast cancer. J Nucl Med 37(9):1540-1545, 1996]). 8:1 초과의 종양 대 혈액 비율은 주사후 시간이 지연되었을 때 나타났다. 예를 들어, 래트 유방 종양 모델에서는 종양 대 정상 조직의 비율이 제96시간에서 최대에 도달하였으며, 이때의 종양 대 혈액 비율은 8.6이었고 종양 대 근육 비율은 20:1이었다 [Rampy MA, Brown RS, Pinchuk AN, Weichert JP, Skinner RW, Fisher SJ, Wahl RL, Gross MD, Etheir SP, Counsell RE. Biological disposition and imaging of a radioiodinated alkylphosphocholine in two rodent models of breast cancer. J Nucl Med 37(9):1540-1545, 1996]. 추가로, PLE 방사활성이 중앙의 괴사 영역이 아닌 외곽 영역쪽에 위치한 살아있는 종양 세포에만 잔류한다는 것을 보여주는 마이크로자가방사기록 연구로 입증되는 바와 같이, PLE-관련 방사활성의 생체내분포는 종양에서 비균질하다 [Rampy MA, Brown RS, Pinchuk AN, Weichert JP, Skinner RW, Fisher SJ, Wahl RL, Gross MD, Etheir SP, Counsell RE. Biological disposition and imaging of a radioiodinated alkylphosphocholine in two rodent models of breast cancer. J Nucl Med 37(9):1540-1545, 1996]. 따라서, 지금까지 SCID 마우스에서 NM324 및 NM404에 대한 생체내분포 데이터 비교는 전립선 및 A549 폐암 종양 모델에서만 수행되어 왔다. 이들 연구 결과, NM404 사용시에는 종양 대 정상 조직의 비율이 높고 종양 흡수량이 주사량의 25％ 초과임이 밝혀졌으며, 따라서 이것은 보다 자발적인 종양 모델 및 인간에서 PLE 유사체의 생체내 분포를 연구하고자 하는 본원 발명자들의 바램을 뒷받침하는 것이었다.
NM324에 대한 NM404의 상대적 민감도에 관한 추가의 연구를 SCID 마우스 A549 폐암 모델에서 수행하였다. 각 작용제를 동일 투여량으로 투여하고 10일 후에 각 동물의 폐를 절제해서 1시간 동안 생체외 영상화하여 해상도를 증대시켰다. 도 23에 나타낸 저해상도 영상 및 고도로 증폭시킨 영상은, NM404는 흡수하고 NM324는 거의 흡수하지 않거나 전혀 흡수하지 않은 동물 둘다의 폐에서 병소에 방사활성이 존재함을 밝혀냈다. 이후의 병리 분석은 모든 4 마리 동물에 작은 A549 마이크로-전이체 (직경 1 mm 미만)가 존재함을 확인시켜 주었다. NM404 마우스에서의 계수율은 상응하는 NM324 마우스에서의 계수율보다 2.5배 더 높았고, 이는 역시 NM404가 NM324보다 우수함을 지시하는 것이다.
종양-표적화 전략이 시간 경과에 따른 선택적 종양 보유를 수반하는 것으로 여겨져서 18F 또는 심지어는 99 mTc 등과 같이 비교적 짧은 반감기를 갖는 핵종은 현시점에서는 표지화에 실용적이지 못하다고 여겨진다. 그러나, 요오드의 방사선동위원소로만 표지했던 모노클로날 항체의 초기 사용시와 같이, 추후에는 PLE 유사체를 또다른 표지, 예를 들어 물리적 반감기가 PLE 종양 흡수 및 보유 역학에 부합되는 요오드-124로 표지하는 것이 가능해질 수 있다. 사실, 종양 선택적 PET 작용제로서의 124I-표지된 NM404의 유용성은, 본원 발명자들의 마이크로PET 획득을 위한 파일럿 프로젝트의 대상이다. 상기 프로젝트의 목적은, 4일간의 물리적 반감기를 갖는 비교적 새로운 양전자 동위원소인 요오드-124를 사용하여 NM404를 표지하는 가능성을 평가하고 작은 동물 모델에서 종양의 PET 영상화에 있어서 이의 유망성을 평가하는 것이다. PET 영상화는 통상적인 감마 카메라 영상에 비하여 해상도 증대 및 3-차원 성능 증가를 제공할 뿐만이 아니라, 불소-18 FDG가 종양 세포로 흡수되는 것이 글루코스 이용시와는 다른 생화학적 메카니즘을 통해 일어난다는 점에서 이 불소-18 FDG의 사용을 촉진할 것이다.
상기에서 논의한 바와 같이, 현재 이용가능한 추적자 (예를 들어 67Ga 및 18F-FDG)의 유용성은 신생물과 염증을 구분하는 특이성의 결여로 인한 한계가 있다. 그러나, PLE 작용제를 사용한 예비 연구는, 래트에서 카라게난-유도된 육아종이 상기한 배경 활성을 가시화하는데 실패하고 조직 보유를 보이지 못한다는 임상적으로 유의한 한계를 극복함을 보장하였다 [Counsell RE, Schwendner SW, Meyer KL, Haradahira T, Gross MD. Tumor visualization with a radioiodinated phospholipid ether. J Nucl Med 31(3):332-336, 1990]. 그러나, 이 연구에서 대조군으로 이용되었던 시트르산갈륨은 육아종에서 유의하게 축적되었다. 이러한 발견은 PLE 유사체 작용제를 잠재적으로 유용한 종양-선택적 영상화제로서 사용한 본원 발명자들의 연구를 지속하는 것이 정당함을 추가로 뒷받침하였다.
인간 연구: 동물에서 얻은 매우 유망한 약력학 데이터 및 영상 데이터를 기초로, 본원 발명자들은 방사성표지된 포스포리피드 에테르의 연구를 임상 영역에까지 확대하게 되었다. 먼저, 독성학 연구 센터 (SUNY (State University of New York), 미국 버팔로 소재)에서 수행한 연구에서, 표지되지 않은 NM404를 사용하여 래트 및 토끼에 대한 이것의 정확한 독성 효과를 평가하였다. 이러한 정확한 투여량의 독성학 연구에서 3.2 mg/kg의 투여량 수준 (인간에 대하여 예측되는 최고 투여량의 150배 초과)에서도 독성 효과가 관찰되지 않았다. 또한, 이러한 높은 투여량 수준에서 혈소판 활성화 성질이 없다는 것도 입증되었다.
표지되지 않은 NM324를 5명의 정상적이면서 질병이 없는 인간에게 투여하여, 방사성표지된 상기 작용제를 인간에게 투여하는 것에 대해 RDRC (Radioactive Drug Research Committee)의 승인을 받아내었다. 이들 대상체에서는 증상, 임상 시험, 활력 징후 및 순차적인 혈액 화학분석으로 명백한 바와 같이 독성의 증거가 없었다.
파일럿 가능성 프로젝트로서, RDRC 승인하에 버지니아주 앤 아버의 미시간 병원에서 4명의 폐암 환자를 대상으로 하여 131I-표지된 NM324를 사용한 연구를 수행하였다. 폐 종양은 폐암 환자 3명 (2명은 NSCLC, 1명은 소세포 폐암) 모두에서 분명하게 가시화되었고, 하기에서 상세하게 설명할 것이다. 다양한 시점에서 종양 흡수의 정도는 1+ (배경과는 겨우 구분가능함) 내지 3+ (격렬한 흡수, 정상 구조물보다 훨씬 더 높은 정도)로 달라졌다. 이러한 초기 연구에 선택된 상기 환자들은, 비교적 커다란 크기의 알려진 암을 갖는 사람들이었다. 이 단계에서, 종양의 병기분류에 문제가 있는 환자는 연구하지 않았다.
병력:
환자 01은 우측 늑골까지 손상된 우측 중엽 폐 종괴, 조직학적으로는 폐 기원으로 보이는 뮤신(mucin)-생성 선암종을 갖는 55세 여성이었다. 제6시간의 초기 131I-NM324 섬광조영술 영상은 우측 옆쪽의 중간 폐에 위치한 흡수 병소를 보여주었다. 섬광조영술 연구와는 무관한 이유로 인해, 상기 환자는 6시간이 지나서는 추가의 영상화 조사를 위해 병원에 되돌아올 수가 없었다.
환자 02는 대동맥폐동맥 윈도우 및 좌측 폐문에서부터 연장된 커다란 (9×7×7.5 cm) 분엽형(lobulated)의 종격(mediastinal) 종괴를 갖는 62세 남성이었다. 조직 유형은 소세포 미분화 (귀리형 세포) 암종이었다. 131I-NM324 섬광조영술 영상은 좌측 상부 폐에서의 흡수 병소를 밝혀내었고, 이것은 시간 경과에 따라 정상적인 배경 활성에 비하여 강도가 증가되었다.
환자 03은 우측 상엽 NSCLC (선암종)을 갖는 74세 남성으로, 이미 5개월간의 방사선 요법을 받았던 사람이었다. 질병은 좌측 혀 (2.5×2×3 cm 종괴), 하부 등뼈 (대략 T8) 및 우측 간엽에서 재발하였다. 131I-NM324 섬광조영술은 폐 종괴 및 등뼈 병변에서 잘 규명된 흡수를 보여주었고, 이것은 시간 경과에 따라 표적 대 배경 비율이 증가함을 입증하였다 (도 2). 간 전이체에서의 흡수는 정상적인 간 배경과는 구분할 수 없었다.
이들 연구는 방사성표지된 PLE 유사체의 임상적 유망성에 대한 초기 가능성을 제공하였다. 131I이 영상화 목적에 있어서 최적에는 미치지 못하는 작용제이지만, 모든 3개의 폐 종양에서의 흡수가 분명하게 표시되었다. 이전의 동물 생체내분포 실험을 기초로 할 때 예측되는 바와 같이, 종양에서의 활성은 시간 경과에 따라 증가하였고, 환자 02 및 환자 03에서 명백하게 입증되었다. 환자 03에서는 종양 대 정상 조직의 비율이 제2일에는 2.74였다가 제7일에는 4.23으로 증가하였다. 환자 01은 6시간이 지나서는 이후의 영상화 조사에 참여하지 못했다. 표적 대 배경 비율 증가는, 종양 가시화 메카니즘이 단지 비정상적인 혈류 또는 종양 혈관과다로 인한 것만은 아니라는 강력한 증거가 된다. 사실, 이것은 99 mTc 인간 혈청 알부민을 사용한 동물 연구에서 확인된다1.
NM404 를 사용하여 비-소세포 폐암종 ( NSCLC ) 환자를 평가하는 임상 시험
NM404가 25/25 이종이식편 및 자발적인 설치류 모델에서 선택적이고 지속적인 종양 보유를 보였지만, IND를 후원하는 의사들은 최근에 제4기 인간 비-소세포 폐암 환자에서 상기 작용제의 임상 평가를 시작하여, 인간에서도 유사한 종양 흡수 및 보유 성질을 보이는지 여부를 결정하였다. 지금까지, 진행성 NSCLC를 갖는 2명의 환자에게 1 mCi 미만의 131I-NM404을 주사한 후에 영상화하였다. 예정된 시간에 혈액 및 뇨 샘플을 수집하고, 투여 후의 여러 시점에서 감마 영상화를 수행하였다. 도 29 및 도 30에서 알 수 있는 바와 같이, 두 환자 모두의 경우에 원발성 폐 종양에서 NM404의 유의한 종양 흡수 및 보유가 입증되었다. 이전에 제1 세대 선구물질인 NM324 사용시에 관찰되었던 높은 간 흡수치에 비하여 NM404를 사용한 경우는 간 및 복부의 활성이 훨씬 더 낮았고, 이것은 췌장암, 결장암 및 전립선암 등을 비롯한 다른 복부 암에 대한 이 작용제의 평가 가치를 시사하는 것이다.
재료 및 방법: 진행성 NSCLC를 갖는 환자에게 요오드-131 표지된 NM404 (1 mCi/20 ㎍)를 정맥내 주사한 후에 제3시간, 제6시간, 제24시간, 제48시간, 제96시간 및 제7일 및 제11일에 GE 맥서스 듀얼 헤드(Maxxus dual Head) SPECT 스캐너에서 스캐닝하였다. 혈액 및 뇨 샘플을 수집하여, 약력학 분석 및 임상적인 혈액, 신장 및 간 생물분석을 실시하였다.
결과: 초기의 정량적 영상화 결과는 요오드-131 표지된 NM404가 주사후 24시간 밖에 안된 시점에서 양측의 폐 종괴에 뚜렷하게 국소화되며 이들 종양에서 11일 초과 동안 선택적으로 보유된다는 것을 지시한다. 또한, 간 및 방광, 신장 및 장 등을 비롯한 하부 복부 영역에서의 배경 방사활성은 선구물질인 NM324로 이전에 관찰되었던 것보다 유의하게 더 낮았다. 어떤 환자에서도 역반응은 관찰되지 않았다.
결론: 이러한 예비 실험 결과는, 이전에 설치류 모델에서 관찰되었던 바와 같이 인간 NSCLC에서도 NM404가 유사한 종양 흡수 및 보유 성질을 보인다는 것을 시사한다.
이러한 견해는 단지 2명의 환자에 대한 실험에 기초한 것이지만, NM404는 사실상 인간 비-소세포 폐암에서 국소화되어 선택적이고 지속적인 종양 보유를 보이는 듯 하다.
환자 1: 양측의 3 cm 좌엽 및 침윤성 우엽 NSCLC 및 뇌 전이체 및 작은 우측 부신 종괴를 갖는 55세 남성. 이 환자는 수많은 표준 치료 요법 및 실험적 치료 요법에 참여했었다. 영상은 도 29에 포함되어 있다.
환자 2: 최근에 6 cm 상부 엽 비-소세포 종괴, 5 mm 간 종괴, 장골(腸骨) 전이체(ilial bone met) 및 매우 작은 뇌 전이체를 갖는 것으로 진단된 70세 남성. 최근, 이 환자는 NM404 임상시험 시작 전주에 장골 및 뇌 전이체에 낮은 투여량의 카르보플라틴/탁솔 화학요법 및 완화성 방사선 요법을 완료하였다. 영상은 도 30에 나타내었다.
D. 실시예 IV : 마우스 췌장 선암종 모델
본원 발명자들은 또한 혼합 선포(acinar)/도관(ductal) 표현형을 갖는 침윤성 종양을 생성하는 것으로 알려진 c-myc 마우스 췌장 선암종 모델에서 제2 세대 PLE 유사체인 NM404의 종양 친화성을 연구하였다.
재료 및 방법: 공지된 종양유전자인 c-myc 또는 k-ras에 대해 내인성인 2 마리 뮤린 종이 위스콘신 대학에서 개발되었다 ([Sandgren EP, Quaife CJ, et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1991; 88:93-97], [Grippo PJ. Nowlin PS. et al., Cancer Research. 63(9):2016-9, 2003]).
c-myc이 오직 췌장에서만 발현되는 엘라스타제의 프로모터와 관련이 있기 때문에 c-myc의 발현은 췌장 선포 세포에 표적화되었다. 이들 ela-1-myc 내인성 마우스에서는 선포 및 도관 신생물이 발생되었고, 이들 마우스는 이로 인해서 생후 2 내지 7개월 사이에 사망하였다. 생후 1개월까지는 췌장이 두껍고 탄탄해 보였다. 이처럼, 생후 1개월 내지 3개월 사이의 마우스는 췌장암 연구의 우수한 모델로 기능한다. 대부분의 인간 췌장 신생물은 도관 형태를 취하며, 샌드그렌(Sandgren) 박사의 트랜스진(transgene) 표적화 전략은 췌장 도관 상피에 특이적인 종양을 발생시키는 것이다.
c-myc 모델은 혼합 선포/도관 표현형을 가지며 침윤성 선암종인 종양을 생성한다. k-ras 모델의 생물학은 크게 다르다. k-ras 종양은 "동소내(in situ) 암종"으로 분류되어 왔고, 이것은 이들이 신생물의 특징을 갖지만 침윤성이 아니며 일반적으로는 작은 크기 (< 2 mm)로 유지된다는 것을 의미한다. 이것은 세포 외관이 초기 인간 종양에 훨씬 더 유사하여 조직학적 시각에서는 이것이 인간 질환과 더 큰 관련이 있다. 추가로, 이것은 매우 초기 단계의 인간 질환과 유사하다. c-myc 마우스에서 크고 더 진행된 종양에 대한 k-ras 종양의 "초기" 발생을 검출하는 능력은 인간에서 초기 병변 (치유가능한 것일 수 있음)을 확인하는데 있어서 매우 중요한 단계이다. k-ras 돌연변이가 인간 췌장 선암종 원인의 90％ 초과라는 사실은, 신규한 종양 영상화제를 평가하는데 있어서 이 모델의 유효성을 더욱 뒷받침하는 것이다.
영상화 연구: NM404가 마우스 췌장 종양에서 국소화되는지 여부를 결정하기 위해서, 125I-NM404의 꼬리 정맥 주사 (15 μCi/20 g bw)로부터 2 내지 21일 후에 6 마리의 c-myc 내인성 마우스를 바이오스캔 AR-2000 방사선-TLC 스캐너 (본원 발명자들의 실험실에서 마우스 영상화를 위해 변형시킴)에서 스캐닝하였다. 마지막 날에는 마우스에게 마이크로CT 스캐닝 (42 kvp, 410 μA, 390 단계, 마이크로CAT-I, 임테크, 인크., 미국 테네시주 녹스빌 소재)도 실시하였다. 마취된 마우스에게 생체내 영상화를 실시한 후에 췌장 종양을 절제하여 동일 스캐너 (고해상도의 1 mm 콜리메이터 및 2-D 획득 및 분석 소프트웨어 장착)에서 생체외 스캐닝함으로써 저에너지의 요오드-125와 관련된 조직 감약화를 피하였다 (도 9 및 도 10). 희생시키고, 조직을 절제하여 칭량하고, 감마 계수기에서 방사활성을 정량하였다.
결과 및 논의: c-myc 모델에서 NM404를 사용한 초기 영상화 결과는 5 내지 12 mm 직경의 모든 선암종에서 현저한 흡수 및 지속적인 보유 (>21일)가 일어남을 지시하였다. 이전의 세포 배양 및 생체내 동물 모델 연구에서 관찰된 바와 같이, NM404는 정상 세포에서는 명백하게 대사되어 제거되지만, 종양 세포 막에는 대사적으로 포획된다. 다른 종양 모델에서 이전에 수행되었던 자가방사기록 실험은 오직 살아있는 종양 세포만이 NM404를 축적할 수 있고 정상적인 조직이나 괴사 조직은 그렇지 않음을 시사하였다. 마우스에서 췌장의 편재 특성에도 불구하고, 본원 발명자들은 또한 마이크로CT를 이용하여 살아있는 마우스에서 췌장 종양을 검출할 수 있었다 (도 11). 췌장 종양-보유 동물의 수는 적었지만 (n = 6), 배경 데이터에 대한 예비 NM404 종양은 유망한 것으로 여겨진다.
결론: NM404는 본 연구에서 시험한 자발적인 췌장 선암종에 선택적이고 지속적으로 보유되는 것으로 나타났고, 따라서 상기 작용제의 종양 선택도를 더욱 넓혀준다.
E. 실시예 V: 래트 신경교종 모델
재료 및 방법: 모든 동물을 가두고 위스콘신 대학의 RARC (Research Animal Resources Center) 지침에 따라 취급하였다. 래트 C6 신경교종 세포를, 10％ 열-불활성화된 FBS (바이오위태커(BioWhittaker), 미국 메릴랜드주 워커스빌 소재), 100 U/㎖ 페니실린 G, 100 mg/㎖ 스트렙토마이신 및 0.01 M HEPES (라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 미국 메릴랜드주 게이터스버그 소재)가 보충된 DMEM 배지 (라이프 테크놀로지스, 미국 메릴랜드주 게이터스버그 소재)에서 증식시켰다. 이전에 기재되었던 (참조문헌) 바와 같이 두개내 종양 이식을 수행하였다. 요약하자면, 1×106개 C6 세포를 5 ㎖ 1.2％ 메틸셀룰로스에 재현탁하여 마취된 암컷 위스타(Wistar) 래트 (할란(Harlan), 미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재)의 전두엽에 주사하였다. 가(假)-수술을 실시한(sham-operated) 동물에게 동일 부피의 메틸셀룰로스를 종양 세포 없이 두개내 주사하였다.
영상화 연구: 이식 10일 후에 두개내 종양의 존재를 MRI로 확인하였다. 요약하자면, 마취된 래트 (6 마리)에게 2 ㎖의 가도디아미드 (Gd, 옴니스캔(Omniscan) 287 mg/㎖, 미국 뉴저지주 프린스톤 니코메드 소재)를 복강내 투여하고 10분 후에는 1.5 테슬라(Tesla) 임상 MR 시스템 (GE 시그나(Signa) LX) 및 GE 상 어레이 첨단 코일을 사용하여 영상화하였다. 각 래트의 뇌 전체를 덮는 T1-칭량된 (TR = 500 ms, TE = 16.5 ms) 멀티슬라이스 시퀀스를 조사하여 다양한 크기의 종양을 보유하는 래트 및 NM404 주사를 위해 가-수술을 실시한 래트를 선별하였다.
NM404 [18-(4-요오도페닐)-옥타데실포스포콜린] (도 3A, 100 mg)를, 피발산 용융물에서 Na125I와의 동위원소 교환 반응을 통해 125I로 방사성요오드화시켰다 [Weichert, et al., Int J Appl Rad Isotopes. 1986; 37:907-913]. HPLC 정제 후에 NM404를 2％ 폴리소르베이트 20 수용액 중에 용해시킨 다음, 4 마리의 종양-보유 래트 및 가-수술을 실시한 3 마리의 래트에게 꼬리 정맥 주사 (5 내지 20μCi/200 g 래트)하였다. NM404 주사 후 제1일 (n = 1), 제2일 (n = 1) 및 제4일 (n = 2)에 동물들을 안락사 (CO2)시키고 뇌를 절제하여 변형된 바이오스캔 AR2000 방사선-TLC 스캐너 (레인 당 2분 획득시 1 mm의 증가분 및 1 mm의 고해상도 콜리메이터)에서 영상화하였다. 또한, 정상적인 뇌, 혈액, 신장, 간, 비장, 갑상선 및 종양 조직을 칭량하고, 방사활성을 감마 계수기에서 계수하였다. 이때, 방사활성의 조직 분포는 뇌의 조직구조와 상관관계가 있었다.
결과 및 논의: NM404를 사용한 초기 영상화 결과는 3 내지 5 mm 직경의 모든 신경교종에서 현저한 흡수 및 지속적인 보유가 일어남을 지시하였다. 가-수술을 실시한 대조군 동물에서 정상적인 뇌 조직의 방사활성은 최소였던 반면 (도 12), 신경교종에서는 NM404가 집중적으로 축적되었다 (도 13). C6-보유 래트에서 종양 대 뇌의 비율 (1 g 당 주사량(％))은 제24시간, 제48시간 및 제96시간에 각각 10.5, 12.2 및 6.7이었다. 이전의 세포 배양 및 생체내 동물 모델 연구에서 관찰된 바와 같이, NM404는 정상 세포에서는 명백하게 대사되어 제거되지만, 종양 세포 막에는 대사적으로 포획된다. 다른 종양 모델에서 이전에 수행되었던 자가방사기록 실험은 오직 살아있는 종양 세포만이 NM404를 축적할 수 있고 정상적인 조직이나 괴사 조직은 그렇지 않음을 시사하였다. 흥미롭게도, NM404 투여 후에는 직경이 수 mm로 측정된 작은 종양까지도 검출되었다. 이러한 예비 실험 결과는, NM404가 작은 침윤성 종양 병변의 가시화에도 유용할 수 있음을 시사한다.
결론: 이전에 시험하였던 모든 종양 모델의 경우와 같이, NM404는 본 연구에서 평가한 래트 C6-신경교종에 선택적이고 지속적으로 보유되는 것으로 나타났다.
F. 실시예 VI : 뮤린 간 종양
14개 초과의 이종이식편 및 자발적인 종양 모델에서 얻은 예비 시험 결과는, 일반적으로 NM404가 종양에서 선택적으로 흡수되어 지속적으로 보유되는 것으로 나타났다. 추가로, NM404의 간 배경 수준이 그의 선구물질보다 낮기 때문에, HCC를 갖는 환자의 영상화는 확실치 않다는 사실을 고려하여 본원 발명자들은 상기 평가를 간 종양으로 확대하였다. 많은 환자들이 기본적인 경변을 갖고 있어서, 단면 영상에서 재생 결절과 HCC를 구별하기는 어렵다. 또한, FDG을 사용한 PET 스캐닝을 평가하는 예비 연구에서는 상기 질환의 검출 민감도가 20 내지 50％에 불과한 것으로 나타났다 [Verhoef C, Valkema R. et al., Liver (2002) 22:51-56].
재료 및 방법: 내인성 마우스 HCC 모델. TGFα 유전자를 과다발현하는 내인성 마우스에서 자발적인 간세포 암의 발생을 광범위하게 평가하였는데, 이는 상기 질환 연구에 매우 유망한 동물 모델이다 [Lee GH, Merlino G, Fausto N. Cancer Research (1992) 52:5162-5170]. TGFα는 상피 세포의 유사분열촉진인자이고 EGF 수용체에 결합한다. TGFα의 발현이 조절되지 않으면 종양 형성이 야기된다. 아연-유도성 메탈로티오닌1 (MT1) 프로모터의 제어하에 트랜스진 TGFα를 발현하는 수컷 CD1 마우스는 생후 12개월이 된 후에 이들의 75 내지 80％에서 HCC가 발생한다. 그러나, 화학적 발암물질인 알킬화제 디에틸니트로스아민 (DEN)을 사용하여 생후 제15일에 종양 성장을 유도한 경우에는 생후 6개월이 될 때까지 90％의 마우스에서 HCC가 발생하였다. 조직학 시험시에 이들 종양은 충실성의 양상을 갖는 잘 분화된 간세포 암종으로 구성되어 있었다. 종양이 자발적인으로 생성되기 때문에, 본원 발명자들은 이들 동물을 전임상 연구를 위한 적합한 모델로서 이용하였다.
CT26 결장 선암종 이종이식편 모델: 자발적인 HCC 모델 뿐만이 아니라 이종이식편 결장 선암종 종양 모델에서도 NM404를 평가하여, CT26 세포 (5×105개 세포/50 ㎕)를 미리 암컷 BALB/c 마우스의 간 실질에 직접 주사하여, 병변 간 종양을 생성하였다.
영상화 연구: NM404 (도 3A, 100 ㎍)를, 피발산 용융물에서 동위원소 교환을 통해 125I로 방사성요오드화시켰다 [Weichert JP, et al., Int J Applied Radiat Isot (1986) 37(8):907-913]. HPLC 정제 후에 이것을 2％ 폴리소르베이트 20 수용액 중에 용해시킨 다음, 3 마리의 TGFα 내인성 마우스 또는 다르게는 3 마리의 CT26-종양 보유 마우스에게 꼬리 정맥 주사 (15 μCi/20 g 마우스)하였다. 마우스를 마취시키고 변형된 바이오스캔 AR2000 방사선-TLC 스캐너 (레인 당 2분 획득시 1 mm의 증가분 및 1 mm의 고해상도 콜리메이터) 및 임테크 마이크로CT 스캐너 (390 단계)에서 해부학적 상관관계에 대해 주사후 최대 21일 동안 스캐닝하였다. 마이크로CT 영상은 아미라 소프트웨어를 이용하여 제시하였다. 희생시키고 종양-보유 간을 먼저 절제하여 생체외 스캐닝하였다. 이어서, 종양을 절제하여 칭량하고, 생체외 스캐닝하여 방사활성을 정량하였다. 병변 샘플은 조직학 분류를 의뢰하였다.
결과 및 논의: NM404를 사용하여 얻은 초기 영상화 결과 (도 14, 도 15)는, 간의 자발적인 암종 및 이식된 암종 모두에서 현저한 흡수율 (> 20％ 투여량/g) 및 지속적인 보유를 보여주었다. 이들 동물에서 NM404의 종양 보유는 예정된 연구 종결 시기인 21일 동안 지속적이었다. 콘트라스트-증대된 마이크로CT 영상은 모든 간 종양의 존재 및 정확한 위치를 확인시켜 주었다 (도 14, 도 16). 종양 조직의 지질 추출 및 이후의 HPLC 분석은 방사활성이 여전히 모(母) 화합물과 관련이 있음을 지시하였다. 이전의 세포 배양 및 생체내 동물 모델 연구에서 관찰된 바와 같이, NM404는 정상 세포에서는 명백하게 대사되어 제거되지만, 종양 세포 막에는 대사적으로 포획된다.
결론: 이전에 시험하였던 모든 종양 모델의 경우와 같이, NM404는 본 연구에서 평가한 자발적인 뮤린 간 종양 모델 및 이종이식편 뮤린 간 종양 모델 둘 모두에 선택적이고 지속적으로 보유되는 것으로 나타났다.
G. 실시예 VII : Apc Min /+ 자발적인 유방 암종 모델
재료 및 방법: Apc Min /+ 마우스 모델: 이 모델은 Apc의 Min 대립유전자를 보유하는 마우스 (Apc Min /+ 마우스)로 구성되어 있다. 이 모델은 암컷 Apc Min /+ 마우스를 병에 걸리기 쉽게 되도록 처치하여 유방 과다형성 및 암종, 및 장 선종을 발생시킨다는 점에서 이종이식편 모델보다 특별한 이점을 제공한다. C57BL/6J의 유전학적 배경에서는, 처치되지 않은 암컷 중 약 5％에 생후 100일까지 유방 종양이 발생할 것이다 (문헌 [Moser AR, Dove, et al. Proc Natl Acad Sci USA (1993) 90:8977-81]). 유방 병변의 발생률 및 다중성은 직접 작용하는 알킬화제인 에틸니트로소우레아 (ENU)의 단일 투여량에 의해 증가시킬 수 있다. ENU로 처치한 결과, B6 Apc Min /+ 암컷의 90％에 평균 3개의 유방 편평상피 세포 암종 (SCC)이 발생하였으나, 처치 후 제60일까지 과다형성 병변은 거의 나타나지 않았다.
Apc Min /+ 마우스의 Apc (아데노마토스 폴리포시스 콜리; adenomatous polyposis coli) 유전자는 하나의 염기쌍이 변화되어 있다. APC / Apc 유전자는 여러 개의 잠재적 기능성 도메인을 갖는 거대 단백질을 코딩한다 (문헌 [Groden, J., Thliveris, A., Samowitz, W., Carlson, M., Gelbert, L., Albertsen, H., Joslyn, G., Stevens, J., Spirio, L., Robertson, M. and et al. Identification and characterization of the familial adenomatous polyposis coli gene. Cell, (1991) 66, 589-600] 및 [Kinzler, K.W., Nilbert, M.C., Vogelstein, B., Bryan, T.M., Levy, D.B., Smith, K.J., Preisinger, A.C., Hamilton, S.R., Hedge, P., Markham, A. and et al. Identification of a gene located at chromosome 5q21 that is mutated in colorectal cancers. Science, (1991) 251, 1366-70]). 마우스 및 인간 APC 단백질은 90％ 동일하고, 모든 잠재적 기능성 도메인은 보존되어 있다. APC는 β-카테닌 수준을 조절한다. β-카테닌은 E-카드헤린을 안정화시키고 전사 인자의 LEF 및 TCF 족을 통해 전사를 조절하는 등, 세포에서 다양한 역할을 수행한다 (문헌 [Aberle, H., Schwartz, H. and Kemler, R. Cadherin-Catenin Complex-Protein Interactions and Their Implications For Cadherin Function. Journal of Cellular Biochemistry, (1996) 61, 514-523], [Huber, O., Korn, R., McLaughlin, J., Ohsugi, M., Herrmann, B.G. and Kemler, R. Nuclear localization of beta-catenin by interaction with transcription factor LEF-1. Mechanisms of Development, (1996) 59, 3-10] 및 [Behrens, J., Vonkries, J.P., Kuhl, M., Bruhn, L., Wedlich, D., Grosschedl, R. and Birchmeier, W. Functional Interaction of Beta-Catenin With the Transcription Factor Lef-1. Nature, (1996) 382, 638-642]). β-카테닌 수준의 조절은 APC, 엑신 또는 컨턱틴, 및 글리코겐 신타제 키나아제 3β (GSK3β)와 β-카테닌의 상호작용과 관련이 있다 (문헌 [Behrens, J., Jerchow, B.A., Wurtele, M., Grimm, J., Asbrand, C., Wirtz, R., Kuhl, M., Wedlich, D. and Birchmeier, W. Functional interaction of an axin homolog, conductin, with beta-catenin, APC, and GSK3beta. Science, (1998) 280, 596-9], [Ikeda, S., Kishida, S., Yamamoto, H., Murai, H., Koyama, S. and Kikuchi, A. Axin, a negative regulator of the Wnt signaling pathway, forms a complex with GSK-3beta and beta-catenin and promotes GSK-3beta-dependent phosphorylation of beta-catenin. EMBO Journal, (1998) 17, 1371-84], [Kishida, S., Yamamoto, H., Ikeda, S., Kishida, M., Sakamoto, I., Koyama, S. and Kikuchi, A. Axin, a negative regulator of the wnt signaling pathway, directly interacts with adenomatous polyposis coli and regulates the stabilization of beta-catenin. Journal of Biological Chemistry, (1998) 273, 10823-6], [Sakanaka, C., Weiss, J.B. and Williams, L.T. Bridging of beta-catenin and glycogen synthase kinase-3beta by axin and inhibition of beta-catenin-mediated transcription. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, (1998) 95, 3020-3], [Rubinfeld, B., Albert, I., Porfiri, E., Fiol, C., Munemitsu, S. and Polakis, P. Binding of GSK3beta to the APC-beta-catenin complex and regulation of complex assembly. Science, (1996) 272, 1023-6], [Rubinfeld, B., Souza, B., Albert, I., Muller, O., Chamberlain, S.H., Masiarz, F.R., Munemitsu, S. and Polakis, P. Association of the APC gene product with beta-catenin. Science, (1993) 262, 1731-4] 및 [Polakis, P. The adenomatous polyposis coli (APC) tumor suppressor. Biochimica et Biophysica Acta, (1997) 1332, F127-47]). 이러한 상호작용은 β-카테닌을 인산화시켜 이를 유비퀴틴-프로테아좀 경로에 의한 분해의 표적이 되도록 한다 (문헌 [Rubinfeld, B., Souza, B., Albert, I., Muller, O., Chamberlain, S.H., Masiarz, F.R., Munemitsu, S. and Polakis, P. Association of the APC gene product with beta-catenin. Science, (1993) 262, 1731-4], [Su, L.K., Vogelstein, B. and Kinzler, K.W. Association of the APC tumor suppressor protein with catenins. Science, (1993) 262, 1734-7], [Polakis, P. Mutations in the APC gene and their implications for protein structure and function. Current Opinion in Genetics ＆ Development, (1995) 5, 66-71] 및 [Aberle, H., Bauer, A., Stappert, J., Kispert, A. and Kemler, R. beta-catenin is a target for the ubiquitin-proteasome pathway. EMBO Journal, (1997) 16, 3797-804]). APC의 생식세포 및 체세포 돌연변이는 대부분 단백질의 β-카테닌 결합 부위 중 일부 또는 그 전부를 결실시킨다26 ,28,29 (문헌 [Polakis, P. Mutations in the APC gene and their implications for protein structure and function. Current Opinion in Genetics ＆ Development, (1995) 5, 66-71], [Nagase, H. and Nakamura, Y Mutations of the APC (adenomatous polyposis coli) gene. Human Mutation. (1993) 2, 425-34] 및 [Beroud, C. and Soussi, T. APC gene: database of germline and somatic mutations in human tumors and cell lines. Nucleic Acids Research, (1996) 24, 121-4]). 상기 상호작용에는 APC의 2개의 영역이 필요한데, Min 대립유전자에 의해 코딩된 말단이 절단된 단백질에는 이들 2개의 영역이 모두 존재하지 않는다 (문헌 [Polakis, P. Mutations in the APC gene and their implications for protein structure and function. Current Opinion in Genetics ＆ Development, (1995) 5, 66-71] 및 [Su, L.K., Kinzler, K.W., Vogelstein, B., Preisinger, A.C., Moser, A.R., Luongo, C., Gould, K.A. and Dove, W.F. multiple intestinal neoplasia caused by a mutation in the murine homolog of the APC gene. Science, (1992) 256, 668-70]). 또한, APC는 β-카테닌을 핵 밖으로 수송하는 역할을 한다. 따라서, APC 기능의 부재하에서, β-카테닌은 세포질 및 핵에 축적되어 표적 유전자의 전사 및 E-카드헤린을 통한 세포-세포 상호작용 둘 모두에 영향을 끼칠 수 있다. APC 돌연변이는 장 종양 및 다른 상피 종양을 비롯한 인간의 여러 종양 유형에 자주 나타난다. 25％ 초과의 유방암에서 APC 좌위에서 이종접합성이 손실되고 β-카테닌 수준이 증가하는 것으로 나타났다 (문헌 [Furuuchi, K., Tada, M., Yamada, H., Kataoka, A., Furuuchi, N., Hamada, J., Takahashi, M., Todo, S., and Moriuchi, T. Somatic mutations of the APC gene in primary breast cancers. Somatic mutations of the APC gene in primary breast cancers , American Journalof Pathology. (2000) 156::1997-2005] 및 [Jonsson, M., Borg, A., Nilbert, M., and Andersson, T. Involvement of adenomatous polyposis coli (APC)/beta-catenin signaling in human breast cancer. Involvement of adenomatous polyposis coli ( APC )/ beta - catenin signaling in human breast cancer, European Journal of Cancer. (2000) 36:242-248]). 따라서, 이들 마우스에서 나타나는 병변의 유형은 인간의 유방암과 분자적으로 및 조직학적으로 유사할 것이다.
유전학적 배경은 발생하는 유방 병변의 발생률, 잠복기 및 유형에 영향을 끼칠 수 있다. 예를 들어, FVBxB6 Apc Min /+ 암컷 마우스에서는 마우스 당 평균 0.2개의 유방 종양이 발생하였지만, 처리 후 제120일 이내에 마우스 당 4개의 과다형성이 발생하였다. BALB/xB6 Apc Min /+ 마우스에서는 마우스 당 평균 1.8개의 유방 종양 및 0.6개의 과다형성이 발생하였다 (문헌 [Moser AR, Hegge LF, Cardiff RD. Cancer Research (2001) 61:3480-3485]). FVBxB6 및 BALBxB6 Apc Min /+ 마우스에서는 유방 SCC 및 선암종 (AC)이 둘 다 발생하였다.
FVBxB6 Apc Min /+ 마우스의 과다형성 병변은 폐포 과다형성 또는 편평상피세포 결절로 분류될 수 있다 (문헌 [Moser, A.R., Hegge, L.F., and Cardiff, R.D. Genetic background affects susceptibility to mammary tumors and hyperplasiass in Apc Min /+ mice, Genetic background affects susceptibility to mammary tumors and hyperplasias in Apc Min /+ mice. Cancer Research (2001) 61:3480-3485]). 폐포 과다형성은 선암종의 전구 증상이고, 편평상피세포 결절은 SCC의 전구 병변이다. 따라서, 유전학적 배경의 조작에 의해, 동일한 동물내에서도 여러 유형의 과다형성 및 암종을 발생시키는 마우스가 생성될 수 있다. 폐포 과다형성은 인간 유방으로부터 얻은 샘플에서 공통적으로 발견되는 부정형 분엽 (A형)과 유사하다 (문헌 [Cardiff, R.D. and Wellings, S.R. The comparative pathology of human and mouse mammary glands. The comparative pathology of human and mouse mammary glands, Journal of Mammary Gland Biology ＆ Neoplasia. (1999) 4:105-22]). 이들 부정형 분엽은 암에 걸린 유방 또는 유방암에 걸린 여성의 반대편 유방에서 보다 흔하게 발견된다. SCC는 자주 나타나는 유형의 유방 종양은 아니며, AC는 통상적인 유형의 인간 유방 종양과 유사하다. 또한, APC 경로가 변경된 종양은 인간 유방암에서 흔하게 나타난다. 25％ 초과의 유방암에서 APC 좌위에서 이종접합성이 손실되고 β-카테닌 수준이 증가하는 것으로 나타났다 (문헌 [Furuuchi, K., Tada, M., Yamada, H., Kataoka, A., Furuuchi, N., Hamada, J., Takahashi, M., Todo, S., and Moriuchi, T. Somatic mutations of the APC gene in primary breast cancers. Somatic mutations of the APC gene in primary breast cancers , American Journal of Pathology. (2000) 156::1997-2005. 35] 및 [Jonsson, M., Borg, A., Nilbert, M., and Andersson, T. Involvement of adenomatous polyposis coli (APC)/beta-catenin signaling in human breast cancer. Involvement of adenomatous polyposis coli ( APC )/ beta - catenin signaling in human breast cancer, Eur Journal of Cancer. (2000) 36:242-248]). 따라서, 이들 마우스에서 나타나는 병변의 유형은 인간의 유방암과 분자적으로 및 조직학적으로 유사할 것이다. 이 모델의 독특한 측면 및 장점 중 하나는 동일한 동물에서도 여러 유형의 유방 과다형성 및 암종을 발생시키는 마우스를 생성하는 능력이다. 이와 같은 방식으로, 본원 발명자들은 동일한 동물에 생성된 여러 유형의 과다형성 및 종양에서의 NM404의 흡수 및 보유를 시험할 수 있다.
마우스의 폴리오마 바이러스 감염은 유방 종양을 비롯한 수많은 종양 유형의 발생을 초래한다. 마우스 유방 종양 바이러스 LTR (MMTV)의 조절하에 폴리오마 중간 T 항원 (PyVT)을 발현시키는 내인성 마우스는 다병소성 유방 형성장애 및 종양을 빠르게 발생시킨다 (문헌 [Amy Moser; Guy, C. T., Cardiff, R.D., and Muller, W.J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a endogenous mouse model for metastatic disease. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene : a transgenic mouse model for metastatic disease , Molecular ＆ Cellular Biology. (1992) 12:954-61]). 동소내 암종에 대한 증거는 생후 3주 된 마우스에서 찾아 볼 수 있으며, 이미 생후 5주에 유방 종양이 100％ 발생한다. 종양은 우선 AC 및(또는) 선극세포종으로 분류된다. 마우스는 원발성 종양이 출현한지 제50일 이내에 폐에 여러 전이성 병변이 발생한다 (문헌 [Lifsted, T., Le Voyer, T., Williams, M., Muller, W., Klein-Szanto, AA., Buetow, K.H., and Hunter, K.W. Identification of inbred mouse strains harboring genetic modifiers of mammary tumor age of onset and metastatic progression. Identification of inbred mouse strains harboring genetic modifiers of mammary tumor age of onset and metastatic progression, Int J of Cancer. (1998) 77:640-4]). 따라서, 이들 마우스는 전이성 유방암에 대한 고속 모델을 제공한다. Apc Min /+ 마우스와 같이, 유전학적 배경은 종양 발생 및 전이성 확산 기간에 영향을 끼친다 (문헌 [Lifsted, T., Le Voyer, T., Williams, M., Muller, W., Klein-Szanto, AA., Buetow, K.H., and Hunter, K.W. Identification of inbred mouse strains harboring genetic modifiers of mammary tumor age of onset and metastatic progression. Identification of inbred mouse strains harboring genetic modifiers of mammary tumor age of onset and metastatic progression , Int J of Cancer. (1998) 77:640-4]). 따라서, 본원 발명자들은 교배를 사용하여 종양 발생 시간이 지연된 마우스를 생성하였다. PyVT는 SRC 키나아제 족의 구성원, 포스파티딜이노시톨-3" 키나아제, SHC 어댑터(adapter) 단백질 및 단백질 포스파타제 2A와 관련이 있을 수 있다 (문헌 [Dankort, D. L. and Muller, W. J. Transgenic models of breast cancer metastasis. Transgenic models of breast cancer metastasis , Cancer Treatment ＆ Research. (1996) 83:71-88]). SRC 족 키나아제의 활성화는 인간 유방 종양에서 자주 관찰된다 (문헌 [Amy Moser; Muthuswamy, S.K. and Muller, W.J. Activation of the Src family of tyrosine kinases in mammary tumorigenesis. Activation of the Src family of tyrosine kinases in mammary tumorigenesis, Advancesin Cancer Research (1994) 64:111-23]).
영상화 연구: NM404 (도 3A, 100 ㎍)를, 피발산 용융물에서 동위원소 교환 반응을 통해 125I로 방사성요오드화시켰다. HPLC 정제 후에 NM404를 2％ tween-20 수용액에 용해시킨 후에 6마리의 암컷 Apc Min /+ 마우스에게 꼬리 정맥 주사 (15 μCi/20g 마우스)하였다. 마우스를 마취하고, 주사 후 제50일까지 변형된 바이오스캔 AR2000 방사선TLC 스캐너 (레인 당 2분 획득시 1 mm의 증가분 및 1 mm 고해상도 콜리메이터) 상에서 스캐닝하고, 해부학적 비교를 위해 임테크 마이크로CT 스캐너 (390 단계)로도 스캐닝하였다. 마이크로CT 영상을 아미라 소프트웨어를 이용하여 가시화하였다. 안락사시켰을 때, 유선 또는 절제된 종양을 생체외 영상화시키고, 병변을 절제하여 칭량하고, 방사성을 정량하였다. 병변 샘플을 조직한 분류를 위해 제출하였다. 필요하다면, 혈관 가시화를 돕기 위해 본원 발명자들의 실험실에서 개발되고 긴 마이크로CT 획득 시간에 적합한 장기-작용 CT 혈액 푸울 조영제 (BP10)를 정맥내 주사하였다 (도 19) (문헌 [Weichert JP, et al., Radiology (2000) 216:865-871]).
결과 및 논의: 이 모델은 과다형성 유방 병변, 유방 암종 및 장 선종이 동일한 마우스에서 발생한다는 점에서 획기적이다. NM404를 사용한 초기 영상화 결과 (도 17, 18)는 직경 2 내지 15 mm 범위의 모든 자발적인 유방 암종에서 현저한 흡수 (>20％ 투여량/g) 및 지속적인 보유를 나타내었다. 종양은 빠르게 국소화되었지만, 배경 방사성은 체내 제거 기간 동안 간 및 장에서 수일간 지속되었다. 방사선활성 뇨 및 배설물에 대한 HPLC 분석 결과는 대사물질이 존재하고 모 NM404는 존재하지 않는다는 것을 나타낸다. NM404의 종양 보유는 예정된 연구 종결 시점인 50일 동안 지속되었다. NM404는 국소화되지 않았지만, 이들 마우스에서 장 선종성 폴립이 자주 발견되었다 (도 18). 마이크로CT 영상은 모든 유방 종양의 존재 및 정확한 위치를 확인시켜 주었다 (도 19). 종양 조직의 지질 추출 및 이후의 HPLC 분석은 방사성이 여전히 모 화합물과 관련이 있음을 보여주었다. 이전의 세포 배양 연구에서 관찰된 바와 같이, NM404는 정상 세포에서 명백하게 대사되어 제거되지만, 종양 세포 막에서는 대사적으로 포획된다.
결론: NM404는 현재까지 조사된 동물 및 인간 이종이식편 종양 모델에서 현저한 종양 친화성을 나타내었다. 또한, NM404는 상기 자발적인 종양 모델에서 유방 종양에 선택적이고 지속적으로 보유되는 것으로 나타났으나, 관련된 장 선종성 폴립에 국소화되지 않았다.
H. 실시예 VIII : Apc Min /+내인성 유방 선암종 모델에서의 과다형성 대 신생물에 대한 특이성
재료 및 방법: Apc Min /+ 마우스 모델: 이 모델은 Apc의 Min 대립유전자를 보유하는 마우스 (Apc Min /+ 마우스)로 구성되어 있다. 이 모델은 암컷 Apc Min /+ 마우스를 병에 걸리기 쉽게 되도록 처치하여 유방 과다형성 및 암종, 및 장 선종을 발생시킨다는 점에서 이종이식편 모델보다 특별한 이점을 제공한다. C57BL/6J의 유전학적 배경 상에서는, 처치되지 않은 암컷 중 약 5％에 생후 100일까지 유방 종양이 발생할 것이다 (문헌 [Moser AR, Dove, et al. Proc Natl Acad Sci USA (1993) 90:8977-81]). 유방 병변의 발생률 및 다중성은 직접 작용하는 알킬화제인 에틸니트로소우레아 (ENU)의 단일 투여량에 의해 증가시킬 수 있다. ENU로 처치한 결과, B6 Apc Min /+ 암컷의 90％에 평균 3개의 유방 편평상피 세포 암종 (SCC)이 발생하였으나, 처치 후 제60일까지 과다형성 병변을 거의 나타나지 않았다.
유전학적 배경은 발생하는 유방 병변의 발생률, 잠복기 및 유형에 영향을 끼칠 수 있다. 예를 들어, FVBxB6 Apc Min /+ 암컷 마우스에서는 마우스 당 평균 0.2개의 유방 종양이 발생하였지만, 처리 후 제120일 이내에 마우스 당 4개의 과다형성이 발생하였다. BALB/xB6 Apc Min /+ 마우스에서는 마우스 당 평균 1.8개의 유방 종양 및 0.6개의 과다형성이 발생하였다 (문헌 [Moser AR, Hegge LF, Cardiff RD. Cancer Research (2001) 61:3480-3485]). FVBxB6 및 BALBxB6 Apc Min /+ 마우스에서는 유방 SCC 및 선암종 (AC)이 둘 다 발생하였다.
영상화 연구: NM404 (도 3A, 100 ㎍)를, 피발산 용융물에서 동위원소 교환 반응을 통해 125I로 방사성요오드화시켰다. HPLC 정제 후에 NM404를 2％ tween-20 수용액에 용해시킨 후에 6마리의 암컷 Apc Min /+ 마우스에게 꼬리 정맥 주사 (15 μCi/20g 마우스)하였다. 마우스를 마취하고, 주사 후 제30일까지 변형된 바이오스캔 AR2000 방사선TLC 스캐너 (레인 당 2분 획득시 1 mm의 증가분 및 1 mm 고해상도 콜리메이터) 상에서 스캐닝하고, 해부학적 비교를 위해 임테크 마이크로CT 스캐너 (390 단계)로도 스캐닝하였다. 마이크로CT 영상을 아미라 소프트웨어를 이용하여 가시화하였다. 안락사시켰을 때, 유선 또는 절제된 종양을 생체외 영상화시키고, 병변을 절제하여 칭량하고, 방사성을 정량하였다. 병변 샘플을 조직한 분류를 위해 제출하였다. 필요하다면, 혈관 가시화를 돕기 위해 본원 발명자들의 실험실에서 개발되고 긴 마이크로CT 획득 시간에 적합한 장기-작용 CT 혈액 푸울 조영제 (BP20)를 정맥내 주사하였다 (도 22) (문헌 [Weichert JP, et al., Radiology (2000) 216:865-871]).
결과 및 논의: 이 모델은 과다형성 유방 병변, 유방 암종 및 장 선종이 동일한 마우스에서 발생한다는 점에서 획기적이다. NM404를 사용한 초기 영상화 결과 (도 20, 21)는 직경 2 내지 15 mm 범위의 모든 자발적인 유방 암종에서 현저한 흡수 (>20％ 투여량/g) 및 지속적인 보유를 나타내었다. 종양은 빠르게 국소화되었지만, 배경 방사성은 체내 제거 기간 동안 간 및 장에서 수일간 지속되었다. 방사선활성 뇨 및 배설물에 대한 HPLC 분석 결과는 대사물질이 존재하고 모 NM404는 존재하지 않는다는 것을 나타낸다. NM404의 종양 보유는 예정된 연구 종결 시점인 21일이 넘게 지속되었다. NM404는 국소화되지 않았지만, 이들 마우스에서 병소성 폐포 과다형성 및 장 선종성 폴립이 자주 발견되었다 (도 21). 마이크로CT 영상은 모든 유방 종양의 존재 및 정확한 위치를 확인시켜 주었다 (도 22). NM404는 정상 세포에서 명백하게 대사되어 제거되지만, 종양 세포 막에서는 대사적으로 포획된다.
결론: NM404는 현재까지 조사된 20/20개의 동물 및 인간 이종이식편 종양 모델에서 현저한 종양 친화성을 나타내었다. 또한, NM404는 상기 자발적인 종양 모델에서 유방 선세포 암종 및 편평상피 세포 암종에 선택적이고 지속적으로 보유되는 것으로 나타났으나, 관련된 병소성 폐포 과다형성 또는 장 선종성 폴립에 국소화되지 않았기 때문에 악성 종양 세포에 선택적인 것으로 나타났다.
I. 실시예 IX : NM404 의 선택적인 보유 메카니즘
도입: 특정 포스포리피드 에테르 유사체, 예컨대 NM404를 시간 연장을 위해 다수 유형의 종양 세포 내에 선택적으로 보유시켰다. 본원 발명자들은 포스포리파제 D (PLD) 단백질의 활성을 평가하기 위한 효소 검정법 및 정량적 PCR 둘 모두를 이용하여 종양 세포에서의 NM404의 선택적인 보유 메카니즘을 평가하기 위한 시도를 하였다. 본원 발명자들은 종양 세포에서 저하된 PLD 수준이 NM404를 대사시켜 분비하는 능력을 감소시킬 것이라고 가정하였다.
방법: hepa-1 (간암), CT26 (직장결장 선암종) 및 TS/A (유방 선암종)를 비롯한 뮤린 종양 세포주의 단일 세포 현탁액을 2 가지 검정법, 즉 (1) 암플렉스(등록상표) 레드 검정법 (Amplex® Red assay) (형광 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 PLD 단백질 활성을 평가하는 시판되는 키트 (몰레큘라 프로브스; Molecular Probes)를 이용함) 및 (2) PLD mRNA 수준을 측정하기 위한 정량적 PCR로 분석하였다. 종양 세포주를 정상적인 간 조직과 비교한 결과, 보다 높은 수준의 NM404 흡수 및 제거를 나타내었으며, 이에 따라 다른 정상적인 조직보다 낮은 PLD 수준을 가질 수 있었다. 암플렉스(등록상표) 레드 검정의 경우, 디터전트 용액 (Triton-X-100)을 사용하여 전체 단백질을 추출하고, PLD의 양을 표준 양성 대조군과 비교하였다. PCR의 경우, mRNA를 정제하고, 역전사효소(프로메가)를 사용하여 cDNA로 전환시켰다. 실시간 PCR의 경우, cDNA 증폭 조건은 94 ℃, 30초; 65 ℃, 30초; 및 72 ℃, 30초의 50 주기를 포함한다 (아이사이클러(iCycler), 아이큐믹스(iQmix), 바이오-래드(Bio-Rad)). PLD1에 대한 프라이머로 (센스) 5'-TCTGGTTTCACCCCGTCAGAA-3', (안티센스) 5'-TTGCTCATATCTGCGGCGAT-3'을 사용하였다. 생성물을 1 ㎍ 내지 10-7 ㎍으로 희석시킨 표준 cDNA (GAPDH, 바이오소스(Biosource))와 비교하였다. 모든 검정은 2회 반복하여 수행하였다.
결과: PLD를 표 3에 나타낸 바와 같이 정량하였다. PLD 단백질 활성 및 mRNA 수준 둘 모두가 모든 세포주에서 정상정인 간 조직보다 유의하게 낮았다 (p<0.05, T-시험).
결론: 저하된 PLD 단백질 활성 및 PLD mRNA의 감소 둘 모두가 뮤린 종양 세포주에서 관찰되었다. 이에 따라, NM404의 선택적인 보유 메카니즘은 PLD에 의한 NM404 분해의 감소에 기인한 것일 수 있다. 종양에서 저하된 PLD 활성은 항-종양제에 대한 잠재적인 분자 표적으로 작용할 수 있다.
세포/조직 PLD 단백질 활성 (mU/형광/㎍ 단백질/ml) mRNA (㎍X10-5/총 cDNA 0.01 ㎍)
Hepa-1 3.3 6.2
CT26 7.8 2.4
TS/A 2.8 4.0
정상적인 간 14.1 12.2
J. 실시예 X: 내인성 뮤린 유방 종양 모델의 치료적 기여도
NM404 치료 연구를 위한 모델: 장기 생존은 영상화 연구에 필수적인 것은 아니지만, 제안된 치료 연구에 이롭다. 영상화 연구에 사용되는 모델은 보통 동물을 사망시키는 수반성 장 종양을 앓고 있다. 마우스 당 발생하는 종양 수의 증가 및 종양 보유 마우스의 생명 연장이 기대되는 장 종양 수의 감소를 위해, 모저 (Moser) 박사는 최근 수컷 B6 Min/+ 마우스와 암컷 C57BR/cdJ (BR) 마우스를 교배시켰다. 생성된 BRB6 F1 Min/+ 암컷 마우스는 평균 대략 5개의 유방 종양을 발생시켜, B6 Min/+ 마우스보다 유의하게 많은 수의 유방 종양을 발생시켰다 (P= 0.016). 종양을 가진 마우스의 수 및 첫번째 종양이 발생하는 시간은 상기 2종의 마우스 사이에서 다르지 않았다 (각각 P=1 및 P=0.06) (도 25). BRB6 F1 마우스에서 증가된 유방 종양의 수는, 부분적으로 B6 Min/+ 마우스에 비해 하이브리드 BRB6 F1 Min/+ 마우스의 생존 시간이 유의하게 연장된 것 때문일 수 있다 (P=2X10-7).
B6 및 BRB6 F1 Min/+ 마우스는 유선의 표현형 측면에서는 매우 유사하지만, 장 종양에 걸릴 위험 정도는 매우 달랐다. B6 및 BR 종은 ENU 처치 후 단시간 내에 다수의 종양을 발생시키는 마우스이기 때문에 Min-유도된 유방 종양형성에 대해 민감한 배경으로 간주할 수 있다. 그러나, BR 종은 장 종양 발생에 영향을 끼치는 조절 인자 좌위에 우성의 내성 대립유전자를 보유하며, 이에 따라 제안된 치료 연구에 대한 타당성을 증명할 수 있다. 이들 2종의 마우스를 비교한 결과를 표 2에 기재하였다.
Min/+ 마우스에서의 유방 및 장 종양 발생에 대한 유전학적 배경의 영향
종 마우스 수 유방 종양을 가진 마우스 비율 (％) 유방 종양/마우스의 평균 수 유방 병변을 가진 마우스 수(％) 유방 병변/마우스의 평균 수 장 종양/마우스의 평균 수 ENU 처리 후의 평균 생존일 (범위)
B6 45 93 3.3±2.0 17(38) 0.6±0.9 34±10 64 (43-78)
BRxB6 18 94 4.9±2.6 7(39) 0.5±0.7 14±4 91 (58-118)
FVBxB6 18 17 0.2±0.5 18(100) 4.1±2.4 12±6a 127 (93-178)
a 실험 도중 마우스 2 마리의 장이 손실되었으므로 마우스 16 마리에 대한 정보임. 각 종의 암컷 마우스와 B6 Min/+ 수컷 마우스를 교배시켜 마우스를 생성하였다. 암컷 마우스는 생후 30 내지 45일 되었을 때 ENU로 처리하고, 빈사 상태가 되면 안락사시켰다. Min/+ 마우스로부터 수득한 결과만을 나타내었다. 유방 종양은 부검하여 확인된 유방 종양들로 정의하였으며, 유방 병변은 제1, 제4 및 제5 유선의 전체 마운트(mount)에서 인지되는 작은 병소성 병변으로 하였다. 소장(십이지장, 공장 및 회장)의 4 cm 크기의 분획 3곳 및 결장 전체에서 장 종양을 계수하였다. 모든 Min/+ 마우스에서 장 종양이 발생하였다. 수치는 평균±표준편차이다.
Min 마우스에서 NM404 를 사용한 예비 영상화 결과: NM404가 내인성 FVBxB6 Apc Min /+ 마우스 유방 종양에서 국소화된다는 것을 보여주는 예비 실험에서, 2 마리 동물에게 125I-NM404 (15 μCi)를 주사 (IV 꼬리 정맥)하고, 주사후 제1일, 제4일 및 제7일에 변형된 바이오스캔 AR2000 방사선TLC 스캐너 (고해상도의 1 mm 콜리메이터 및 2-D 획득 및 분석 소프트웨어가 장착되어 있음)에서 영상화하였다 (도 27A, B). 안락사시켜 절개하기 10일 전에 각각의 동물에 대해 마이크로CT 스캐닝 (도 27)을 수행하여 유선 및 관련 종양을 제거하였다. 병소성 열점은 생체외 바이오스캔 영상 (도 27C)에서의 모든 종양과 가시적으로 서로 관련되어 있었다. 림프절은 살아있었지만 방사성은 이들과 관련되어 있지 않았으며, 이는 종양 세포 침윤이 결핍되었음을 나타낸다. 도 27C의 주요 종양은 조직학적으로 선암종으로 분류하였다. 상기 마우스 둘 모두에 4개의 유방 종양이 존재하였으며, 이들은 모두 절제된 유선의 생체외 바이오스캔 영상에서 쉽게 검출가능하였다.
NM404 의 방사선치료 가능성: 125I-표지된 NM404의 "영상화" 투여량 (15-20 μCi/20g 마우스)을 사용한 최근의 마우스 종양 흡수 및 보유 연구 기간 동안, 몇 가지 명백한 치료 반응이 관찰되었다 (비공개된 결과). Apc Min /+ 마우스 유방 종양 모델에서, 종양 성장은 일반적으로 NM404의 단일 정맥내 주사 후에 정지 상태로 유지된다는 것을 알게 되었다. 또한, 이들 동물 중 일부는 주사 후 8일 정도 지났을 때 더 커진 유방 종양 윗부분이 모두 탈모되었다. 더욱이, 이들 마우스에 장 종양도 생성되었으며, 이들은 통상적으로 발이 백색화되는 심각한 빈혈을 초래하는 장 출혈을 앓게 된다. 모저 박사는 이들 마우스의 발이 NM404를 단일 주사한지 5일 정도 후에 분홍색으로 다시 돌아온다는 것을 알게 되었다. 이들 동물을 최종 절개하였을 때, 보통 이 연령대에서 발견될 것으로 예상되는 20개 가량의 장 종양 중 극히 일부만이 실제로 남아있거나 전혀 남아있지 않다는 것을 알게 되었다. "발의 색이 백색에서 분홍색으로 변하는" 현상 또한 별개의 모델이지만 보다 공격적인 마우스 장 선암종 모델에서도 관찰되었으며, NM404 투여 후 제12일에 절개하였을 때 다시 전부는 아니지만 예상되는 장 종양의 대부분이 사라진 것으로 나타났다. 두 가지 장 모델 모두에서, NM404를 투여한 동물은 처처하지 않은 이들의 한배 자손들의 수명을 용이하게 연장시켰다. 이와 일치하는 발견이 각각 6 마리 초과의 마우스와 관련된 연령을 맞춘 2개의 독립된 군에서 다시 확인되었다. 125I-NM404를 사용하였을 때 관찰되는 이러한 결과들은 특히 요오드-131로 표지된 경우 방사선요법 사용에 대한 가능성을 나타낸다. 상기 제안된 유방 종양 모델에 개략된 정량적인 종양 흡수 및 보유 연구는 또한 상기 작용제의 진정한 방사선치료 가능성을 평가하기 위해 이 작용제에 대한 포괄적인 방사선량측정 분석을 개시하기에 충분한 데이터를 제공할 것이다.
동위원소 선택: 요오드-125는 60일간의 물리적 반감기를 갖고 낮은 에너지 (28 KeV)의 광양자를 방출하기 때문에 마우스 및 래트에서의 영상화 실험에 적합하다. 요오드-125는 치료적 특성도 제공할 뿐만 아니라, 최근에는 영구적인 전립선 근접치료 이식편에 사용되고 있다. 한 영상화 실험에서, 2 마리의 누드 마우스에 각각 피하 편평상피 세포 1을 접종하고, 반대편 측면에 6개의 종양 세포 이식편을 접종하였다. SCC 1 및 6 세포를 사용하였는데, 이는 하나의 세포가 다른 세포에 비해 방사선에 민감하기 때문이다. 평균 종양 크기 (총 4개)가 직경 0.5 cm에 다다른 후 제14일에, 한 마리의 마우스에 20 μCi의 125I-표지된 NM404를 투여하고, 다른 한 마리에게는 동일 질량의 투여량으로 표지되지 않은 NM404를 투여하였다. 표지되지 않은 화합물만을 투여한 마우스는 종양이 둘 모두 본 발명자의 동물 사용 프로토콜에 정의된 최후의 크기 제한에 도달하기 때문에 주사 후 제20일에 안락사시켜야 한다. 125I-NM404 마우스의 종양은 둘 모두 몇 주 동안에 걸쳐 예상하지 못한 정도로 현저하게 퇴화되었다 (도 28). 사실, 이 마우스의 종양은 최후의 크기에 도달한 적이 없으며, 실제로는 조직의 절편을 수집하기 위해 90일 후에 안락사시켰다. 이 때, 종양의 주변 가장자리는 어느 정도 살아있는데 반해 종양의 중앙은 괴사된 상태였다. 조직학적 조사로 중앙이 괴사되어 있고 가장자리가 살아있음을 확인하였다. 혈액 공급 인자가 위와 같은 관찰 결과에 기여할 수 있으며, 또한 125I로부터의 광양자 방출이 종양 주변의 전자 평형을 깨트려 종양 "외피"의 "투여량 부족"을 초래할 수도 있다. 이러한 전자 평형 문제는 방사선 암연구에 중요하다. 광양자는 그의 에너지에 의해 결정된 한정된 거리를 이동한 후에 조직과 상호작용하여 이들의 생물학적 효과를 나타낸다. 에너지가 너무 높은 광양자는 투여량이 침착되기 전에 결절로부터 유리되어 (종양 밖으로) 이동하기 때문에 종양 결절 주변의 투여량 부족을 유발할 수 있다. 이는 125I 광양자와 관련된 문제일 수 있지만, 낮은 에너지는 매우 국부적으로 침착되도록 한다. 몬테 카를로(Monte Carlo)의 복합 산출법으로 상기 추정된 수치를 정확하게 할 수 있지만, 정확하게 모델링될 수 없는 다수의 수행 인자 (조직 분포, 다중 패스 등의 세부 항목) 때문에 최상의 동위원소 선별을 결정하는 가장 좋은 방법은 실험을 하는 것이다. 125I의 한 가지 이점은 모든 광양자가 낮은 에너지 상태에 있어 종양 주변의 정상적인 조직을 매우 제한적으로만 노출시킨다는 것이다.
요오드-131은 갑상선 암 치료에 사용되고 있는데, 그 치료 효능이 매우 높다. 131I의 매우 안전한 투여량은 정상적인 갑상선과 마찬가지로 매우 활동적으로 요오드를 집합시키는 분화가 잘 된 갑상선 암의 잠복성 침착을 조절할 수 있다. 이러한 활성 흡수 과정은 정상적인 조직에 대한 투여량을 한정하는 것을 돕는다. 요오드-131은 베타 및 여러 감마 방출을 모두 갖지만, 주된 조직 투여량은 베타 방출에 기인한다. 본원 발명자들 낮은 등급의 임파종 환자에서 벡사(Bexxar) (요오드-131-표지된 항체 기재의 작용제)를 사용하여 수득한 결과와 결부시킨 갑상선 암에 대한 임상실험 성공에 기초하여 131I-표지된 NM404를 선별하였다. 주된 베타 방출 및 낮은 에너지의 감마 방출 대부분은 종양 결절 자체의 투여량 균일성을 최적화시킨다. 또한, 반감기가 짧아질수록 (8일) 반감기가 60일인 125I에 비해 임상적으로 보다 적절한 투여-농도를 제공한다. 이들 인자들은 본원 발명자들이 상기 작용제의 항-종양 효능을 가장 잘 평가할 수 있도록 할 것이다. 131I의 잠재적인 단점은 실제로 인접한 주변 조직을 125I를 사용한 경우보다 높은 방사선에 노출시킬 수 있는 높은 에너지의 감마 방출도 존재한다는 것이다. 본원에 제안된 내인성 모델의 종양은 유선의 주변에 위치하기 때문에 동물의 전반적인 건강을 직접 위협하는 것으로 보이지는 않는다. 장기 독성도 연구 목적 중 하나이므로, 주변 조직 및 주요 장기 계통 (골수, 간, 신장, 장, 뇌 등)의 반응을 평가하였다. 조직 분포 데이터 및 방사성표지된 NM404의 실제 방사선량측정 데이터는 그의 최상의 치료 가능성을 결정할 것이다. 상이한 동위원소가 치료적 환경에서 서로를 보완할 수 있다.
본원에 기재된 실시예 및 실시양태는 단지 설명의 목적으로 제공된 것으로, 이들의 대한 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 제안될 것이며, 이러한 변형 및 변화는 본원 및 첨부된 특허청구범위의 취지 및 범위 내에 포함되는 것으로 이해된다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원서는 모든 목적에 있어서 그 전문이 본원에 참고로 포함된 것으로 간주한다.
IV . 참고문헌
Figure 112006065192081-PCT00006
Figure 112006065192081-PCT00007
Figure 112006065192081-PCT00008
"DIAPEUTIC"은 셀렉타, 엘엘씨 (Cellectar, LLC)의 상표명이다.

Claims (25)

  1. 암에 걸렸거나 암에 걸린 것으로 의심되는 대상체에게 포스포리피드 에테르 유사체를 투여하는 단계, 및
    암에 걸린 것으로 의심되는 대상체의 기관이 주변 영역(들)보다 더 높은 수준의 유사체를 보유하는지 결정하는 단계
    를 포함하며, 더 높은 수준의 보유 영역이 암의 검출 및 그 위치를 나타내는 것인, 상기 대상체에서 폐암, 부신암, 흑색종, 결장암, 결장직장암, 난소암, 전립선암, 간암, 피하암, 장암, 간세포 암종, 망막모세포종, 자궁경부암을 검출하고 그 위치를 확인하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 포스포리피드 유사체가 하기 화학식 1 또는 2의 화합물로부터 선택되는 것인 방법.
    <화학식 1>
    (식 중, X는 요오드의 방사활성 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택되고, n은 16 내지 30의 정수이고, Y는 NH2, NR2 및 NR3을 포함하는 군으로부터 선택되며, 여기서 R은 알킬 또는 아릴알킬 치환기임)
    <화학식 2>
    Figure 112006065192081-PCT00010
    (식 중, X는 요오드의 방사활성 동위원소이고, n은 16 내지 30의 정수이고, Y는 H, OH, COOH, COOR 및 OR로 이루어진 군으로부터 선택되고, Z는 NH2, NR2 및 NR3으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 R은 알킬 또는 아릴알킬 치환기임).
  3. 제2항에 있어서, X가 122I, 123I, 124I, 125I 및 131I로 이루어진 요오드의 방사활성 동위원소 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 포스포리피드 에테르가 18-(p-요오도페닐)옥타데실 포스포콜린, 1-O-[18-(p-요오도페닐)옥타데실]-1,3-프로판디올-3-포스포콜린 또는 1-O-[18-(p-요오도페닐)옥타데실]-2-O-메틸-rac-글리세로-3-포스포콜린이며, 요오드가 방사활성 동위원소의 형태인 방법.
  5. 포스포리피드 에테르 유사체를 포함하는 유효량의 분자를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 암이 폐암, 부신암, 흑색종, 결장암, 결장직장암, 난소암, 전립선암, 간암, 피하암, 장암, 간세포 암종, 망막모세포종, 자궁경부암, 신경교종, 유방암, 췌장암, 암육종 및 프로스트레이트 (Prostrate) 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  7. 제5항에 있어서, 포스포리피드 유사체가 하기 화학식 1 또는 2의 화합물로부터 선택되는 것인 방법.
    <화학식 1>
    Figure 112006065192081-PCT00011
    (식 중, X는 요오드의 방사활성 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택되고, n은 16 내지 30의 정수이고, Y는 NH2, NR2 및 NR3을 포함하는 군으로부터 선택되며, 여기서 R은 알킬 또는 아릴알킬 치환기임)
    <화학식 2>
    Figure 112006065192081-PCT00012
    (식 중, X는 요오드의 방사활성 동위원소이고, n은 16 내지 30의 정수이고, Y는 H, OH, COOH, COOR 및 OR로 이루어진 군으로부터 선택되고, Z는 NH2, NR2 및 NR3으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 R은 알킬 또는 아릴알킬 치환기임).
  8. 제7항에 있어서, X가 122I, 123I, 124I, 125I 및 131I로 이루어진 요오드의 방사활성 동위원소 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  9. 제5항에 있어서, 포스포리피드 에테르가 18-(p-요오도페닐)옥타데실 포스포콜린, 1-O-[18-(p-요오도페닐)옥타데실]-1,3-프로판디올-3-포스포콜린 또는 1-O-[18-(p-요오도페닐)옥타데실]-2-O-메틸-rac-글리세로-3-포스포콜린이며, 요오드가 방사활성 동위원소의 형태인 방법.
  10. 암 치료용 제약 조성물의 제조를 위한 포스포리피드 에테르 유사체의 용도.
  11. 제10항에 있어서, 포스포리피드 유사체가 하기 화학식 1 또는 2의 화합물로부터 선택되는 것인 용도.
    <화학식 1>
    Figure 112006065192081-PCT00013
    (식 중, X는 요오드의 방사활성 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택되고, n은 16 내지 30의 정수이고, Y는 NH2, NR2 및 NR3을 포함하는 군으로부터 선택되며, 여기서 R은 알킬 또는 아릴알킬 치환기임)
    <화학식 2>
    Figure 112006065192081-PCT00014
    (식 중, X는 요오드의 방사활성 동위원소이고, n은 16 내지 30의 정수이고, Y는 H, OH, COOH, COOR 및 OR로 이루어진 군으로부터 선택되고, Z는 NH2, NR2 및 NR3으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 R은 알킬 또는 아릴알킬 치환기임).
  12. 제11항에 있어서, X가 122I, 123I, 124I, 125I 및 131I로 이루어진 요오드의 방사활성 동위원소 군으로부터 선택되는 것인 용도.
  13. 제10항에 있어서, 포스포리피드 에테르가 18-(p-요오도페닐)옥타데실 포스포콜린, 1-O-[18-(p-요오도페닐)옥타데실]-1,3-프로판디올-3-포스포콜린 또는 1-O-[18-(p-요오도페닐)옥타데실]-2-O-메틸-rac-글리세로-3-포스포콜린이며, 요오드가 방사활성 동위원소의 형태인 용도.
  14. 대상체에게 포스포리피드 에테르 유사체를 투여하는 단계, 및
    염증, 선종, 과다형성 또는 신생물을 가질 것으로 의심되는 대상체의 기관이 주변 영역(들)보다 더 높은 수준의 유사체를 보유하는지 결정하는 단계
    를 포함하며, 더 높은 수준의 보유 영역은 신생물의 검출 및 그 위치를 나타내고, 더 낮은 수준의 보유 영역은 선종, 과다형성 또는 염증을 가질 것으로 의심되는 기관의 존재를 나타내는 것인, 대상체에서 염증, 선종 또는 과다형성을 신생물로부터 구별하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 포스포리피드 유사체가 하기 화학식 1 또는 2의 화합물로부터 선택되는 것인 방법.
    <화학식 1>
    Figure 112006065192081-PCT00015
    (식 중, X는 요오드의 방사활성 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택되고, n은 16 내지 30의 정수이고, Y는 NH2, NR2 및 NR3을 포함하는 군으로부터 선택되며, 여기서 R은 알킬 또는 아릴알킬 치환기임)
    <화학식 2>
    Figure 112006065192081-PCT00016
    (식 중, X는 요오드의 방사활성 동위원소이고, n은 16 내지 30의 정수이고, Y는 H, OH, COOH, COOR 및 OR로 이루어진 군으로부터 선택되고, Z는 NH2, NR2 및 NR3으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 R은 알킬 또는 아릴알킬 치환기임).
  16. 제15항에 있어서, X가 122I, 123I, 124I, 125I 및 131I로 이루어진 요오드의 방사성 동위원소 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  17. 제14항에 있어서, 포스포리피드 에테르가 18-(p-요오도페닐)옥타데실 포스포콜린, 1-O-[18-(p-요오도페닐)옥타데실]-1,3-프로판디올-3-포스포콜린 또는 1-O- [18-(p-요오도페닐)옥타데실]-2-O-메틸-rac-글리세로-3-포스포콜린이며, 요오드가 방사성 동위원소의 형태인 방법.
  18. 포스포리파아제 D (PLD)를 갖는 조직 샘플에서 PLD 단백질 활성 수준 또는 PLD mRNA 수준을 정량하는 단계, 및
    상기 조직 샘플이 주변 조직 영역(들)보다 더 낮은 수준의 단백질 활성을 갖는지 결정하거나, 또는 상기 조직 샘플이 주변 조직 영역(들)보다 더 낮은 수준의 mRNA를 갖는지 결정하는 단계
    를 포함하며, 더 낮은 수준의 단백질 활성 영역 또는 더 낮은 mRNA 수준의 영역이 신생물의 검출 및 그 위치를 나타내는 것인, 상기 조직 샘플에서 신생물을 검출하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 조직 샘플을 하기 화학식 1 또는 2의 화합물로부터 선택되는 PLE 유사체와 접촉시킴으로써 PLD 단백질 활성 또는 mRNA 수준을 정량하는 신생물 검출 방법.
    <화학식 1>
    Figure 112006065192081-PCT00017
    (식 중, X는 요오드의 방사성 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택되고, n은 16 내지 30의 정수이고, Y는 NH2, NR2 및 NR3을 포함하는 군으로부터 선택되며, 여기서 R은 알킬 또는 아릴알킬 치환기임)
    <화학식 2>
    Figure 112006065192081-PCT00018
    (식 중, X는 요오드의 방사성 동위원소이고, n은 16 내지 30의 정수이고, Y는 H, OH, COOH, COOR 및 OR로 이루어진 군으로부터 선택되고, Z는 NH2, NR2 및 NR3으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 R은 알킬 또는 아릴알킬 치환기임).
  20. 제19항에 있어서, X가 122I, 123I, 124I, 125I 및 131I로 이루어진 요오드의 방사성 동위원소 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  21. 제19항에 있어서, PLE 유사체가 18-(p-요오도페닐)옥타데실 포스포콜린, 1-O-[18-(p-요오도페닐)옥타데실]-1,3-프로판디올-3-포스포콜린 또는 1-O-[18-(p-요오도페닐)옥타데실]-2-O-메틸-rac-글리세로-3-포스포콜린이며, 요오드가 방사성 동위원소의 형태인 방법.
  22. PLD 단백질 활성 또는 PLD mRNA 수준을 정량하는 단계를 포함하며, 주변 조직 영역(들)에 비해 감소된 PLD 단백질 활성 또는 감소된 mRNA 수준이 신생물을 나타내는 것인, PLD를 갖는 조직 샘플의 스크리닝 방법에 의해 선별된 항-종양제.
  23. 제22항에 있어서, 조직 샘플을 하기 화학식 1 또는 2의 화합물로부터 선택되는 PLE 유사체와 접촉시킴으로써 PLD 단백질 활성 또는 mRNA 수준을 정량하는 것인 항-종양제.
    <화학식 1>
    Figure 112006065192081-PCT00019
    (식 중, X는 요오드의 방사성 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택되고, n은 16 내지 30의 정수이고, Y는 NH2, NR2 및 NR3을 포함하는 군으로부터 선택되며, 여기서 R은 알킬 또는 아릴알킬 치환기임)
    <화학식 2>
    Figure 112006065192081-PCT00020
    (식 중, X는 요오드의 방사성 동위원소이고, n은 16 내지 30의 정수이고, Y는 H, OH, COOH, COOR 및 OR로 이루어진 군으로부터 선택되고, Z는 NH2, NR2 및 NR3으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 R은 알킬 또는 아릴알킬 치환기임).
  24. 제23항에 있어서, X가 122I, 123I, 124I, 125I 및 131I로 이루어진 요오드의 방사성 동위원소 군으로부터 선택되는 것인 항-종양제.
  25. 제23항에 있어서, PLE 유사체가 18-(p-요오도페닐)옥타데실 포스포콜린, 1-O-[18-(p-요오도페닐)옥타데실]-1,3-프로판디올-3-포스포콜린 또는 1-O-[18-(p-요오도페닐)옥타데실]-2-O-메틸-rac-글리세로-3-포스포콜린이며, 요오드가 방사성 동위원소의 형태인 항-종양제.
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