KR20200088374A - 면역요법에 대한 항-종양 면역 반응을 유도하기 위해 표적화된 방사선요법(trt)을 이용하는 방법 - Google Patents
면역요법에 대한 항-종양 면역 반응을 유도하기 위해 표적화된 방사선요법(trt)을 이용하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
대상체에서 악성 고형 종양을 치료하는 개시된 방법은 악성 고형 종양 조직 내에 차별적으로 보유되는, 면역조절 용량의 방사성 인지질 에테르 금속 킬레이트, 방사성할로겐화된 인지질 에테르 또는 기타 표적화된 방사선요법(TRT) 제제를 대상체에 투여하는 단계, 및 대상체에 면역자극 제제, 예컨대 면역 체크포인트 억제제를 전신 투여함으로써 대상체에서 면역요법을 수행하는 단계를 포함한다. 비제한적 예에서, 방사성 인지질 에테르 금속 킬레이트 또는 방사성할로겐화된 인지질 에테르는 하기 화학식을 갖는다:
상기 식에서, R1은 금속 원자로 킬레이트화되는 킬레이트제를 포함하거나(여기서 금속 원자는 6시간 초과 및 30일 미만의 반감기를 갖는 알파, 베타 또는 오거 방출 금속 동위원소임), R1은 방사성 할로겐 동위원소를 포함한다. 한 이러한 구현예에서, a는 1이고, n은 18이고, m은 0이고, b는 1이고, R2는 -N+(CH3)3이다.
상기 식에서, R1은 금속 원자로 킬레이트화되는 킬레이트제를 포함하거나(여기서 금속 원자는 6시간 초과 및 30일 미만의 반감기를 갖는 알파, 베타 또는 오거 방출 금속 동위원소임), R1은 방사성 할로겐 동위원소를 포함한다. 한 이러한 구현예에서, a는 1이고, n은 18이고, m은 0이고, b는 1이고, R2는 -N+(CH3)3이다.
Description
관련 출원의 교차-참조
본 출원은 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 2017년 11월 10일에 출원된 미국 출원 번호 15/809,427호의 이익을 주장한다.
연방 후원된 연구 또는 개발에 관한 진술
본 발명은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)에 의해 수여된 OD024576 및 CA197078에 따른 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 갖는다.
개시내용의 분야
본 발명의 개시는 일반적으로 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 개시는 (1) 고형 종양 조직에 의해 차별적으로 흡수되어 그 안에 보유되는 표적화된 방사선요법(TRT) 제제, 예컨대 방사성 금속 킬레이트 화합물, 방사성할로겐화된 화합물, 방사성표지된 항체 또는 방사성동위원소를 면역조절 용량으로 대상체에 전신 투여하고, (2) 하나 이상의 면역자극 제제, 예컨대 하나 이상의 면역 체크포인트 억제제를 대상체에 전신 투여함으로써 대상체에서 하나 이상의 악성 고형 종양을 포함하는 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
현재의 암 치료는 통상적으로 비-표적화된 소분자 또는 항체 특이적 세포독성제가 다양한 메커니즘에 의해 암세포에 우선적으로 진입하거나, 이에 결합(항체 특이적 제제의 경우)하고, 암세포를 사멸시키는 전신 화학요법을 수반한다. 화학요법과 종종 조합되는 외부 광선 방사선 요법(xRT)은 핵 DNA 이중 가닥 파손을 유도하여 세포-주기 사멸을 발생시킴으로써 암세포를 사멸시킨다. 전신 화학요법과 달리, xRT는 종양의 해부학적 위치를 정확하게 결정하는 능력에 의존한다. 종양의 외과적 절제는 또한 잔여 종양 세포가 수술 후 종양을 신속히 회복시킬 것이므로 종양을 볼 수 있는 능력과 완전한 제거에 달려 있다. 수술 및 xRT는 일반적으로 악성 종양의 국소 치료로 제한되고, 이에 따라 파종성 또는 전이성 질병을 치료하는데 있어서 제한적이며, 이는 화학요법이 종종 이들 치료 방식과 함께 사용되는 이유이다. 전신 화학요법은 뇌 전이를 제외하고는 많은 원위 전이 부위에 도달할 수 있으나, 너무 많은 환자 모두에서, 반응은 통상적으로 수명이 짧고(수개월 내지 수년), 궁극적으로는 종양 재발을 발생시킨다.
신체의 자연 면역계가 또한 암세포의 인지 후에 암세포를 파괴할 수 있으므로, 암 치료 패러다임에서 면역학적 접근법이 급속하게 더욱 확산되고 있다. 그러나, 일부 암세포 및 더 나아가서 암 줄기세포는 처음에 면역-감시를 피할 수 있으며, 실제로 진화하는 능력을 획득하며, 궁극적으로는 비교적 면역이 보이지 않는 상태로 남겨짐으로써 생존한다[Gaipi et al, Immunotherapy 6:597-610, 2014].
점점 더 연구되고 있는 한 특정한 면역학적 접근법은 종양 면역원성을 향상시키고, 종양 침윤 림프구(TIL)를 발생시키고, "예방접종되지 않은" 파종성 종양에 대해 특이적인 전신 항-종양 면역 반응을 유도하는 전략인 "인 시츄 백신화"이다. 인 시츄 백신화에서, 악성 고형 종양은 종양 항원의 방출을 촉진하는 동시에 종양의 면역-내성 미세환경을 역전시키는 염증유발 신호를 제공하는 하나 이상의 제제로 주입(또는 이로 처리)된다[Pierce et al, Human Vaccines & Immunotherapoeutics 11(8):1901-1909, 2015; Marabelle et al, Clin. Cancer Res. 20(7):1747-56, 2014; Morris et al, Cancer Res; 76(13); 3929-41, 2016].
매우 상이한 제2의 접근법은 전신-투여 면역요법이다. 전신-투여 면역요법에서, 면역자극 제제, 예컨대 면역 체크포인트 억제제는 종양 내로 국소 주입되는 것보다 전신(예를 들어, 정맥내)을 통해 순환하도록 투여된다. 이러한 제제는 항-종양 면역 반응이 존재하나 "소진"되거나 비효과적인 경향을 띠는 종양을 치료하는데 사용될 수 있다. 체크포인트 억제제의 경우, 종양 세포는 "체크포인트 리간드" 또는 존재하는 항-종양 면역 세포 상의 "체크포인트 수용체"와 상호작용하는 다른 체크포인트 분자를 발현하여, 이들 세포의 불활성화를 촉발시킨다. 이러한 상호작용을 차단함으로써, 암 환자의 소진된 기존 면역 반응을 켜서, 환자 자신의 면여계에 의한 암 세포에 대한 더욱 효과적인 공격을 촉발시킨다.
임상 실험 및 전임상 모델로부터의 최근 데이터가 이러한 접근법의 잠재력을 설명하지만, 개선된 전신 효능을 나타내는 전신-투여 면역요법 방법에 대한 당업계의 요구가 크다.
방사선 호르메시스(hormesis)는 이온화 RT의 낮은 선량이 이온화 RT의 부재하에서 활성화되지 않는 자연 보호 수선 메커니즘의 활성화를 자극함으로써 이로울 수 있다는 수십년 전의 가설이다[Cameron and Moulder, Med. Phys. 25:1407, 1998]. 예비 수선 메커니즘은 자극되는 경우에 이온화 RT의 유해한 영향을 제거할 뿐만 아니라 RT 노출과 관련되지 않은 질병을 억제하는 것으로서 충분히 효과적인 것으로 가정된다. 아마도 관련된 압스코팔 효과(abscopal effect)는 한 종양의 xRT 치료가 실제로 RT 치료 영역 외의 또 다른 종양의 수축을 야기시키는 1950년대에 보고된 현상이다. 드물지만, 이러한 현상은 면역계의 활성화에 의존한다고 생각된다. 함께, 호르메시스 및 압스코팔 효과는 낮은 조사 적량(면역 자극성이나 비-세포독성인)의 RT에 의한 잠재적인 상호작용 및 면역계의 자극을 뒷받침하며, 이는 이후 다른 면역학적 접근법, 예를 들어, 전신-투여 면역요법과 조합될 수 있다.
본 발명자는 이전에 국소 xRT + 인 시츄 백신화의 조합 및/또는 전신 체크포인트 억제제 면역요법이 단일 종양이 존재하는 경우에 마우스에서 대규모의 확립된 종양을 치료하는데 있어서 강력하게 상승작용적이라는 것을 공개하였다[Morris et al, Cancer Res; 76(13); 3929-41, 2016]. 그러나, 본 발명자는 놀랍게도 인 시츄 백신화 및 xRT의 조합이 제2의 방사선 조사되지 않은 종양의 존재하에서 억제된 종양 성장을 발생시키지 않는 것을 발견하였다. 명백히, 방사선 조사되지 않은 종양은 방사선 조사된 종양에 대한 xRT 및 인 시츄 백신의 면역조절 효과에 대한 댐프닝 효과(dampening effect)(본 발명자는 "수반 면역 내성(concomitant immune tolerance)"으로 지칭함)를 나타낸다. 이러한 수반 면역 내성은 극복될 수 있어, xRT가 종양의 모든 영역에 제공되는 경우 인 시츄 백신화의 효능을 가능하게 한다.
이러한 수반 면역 내성은 극복될 수 있어, xRT가 종양의 모든 영역에 제공되는 경우 인 시츄 백신화의 효능을 가능하게 한다. 그러나, xRT는 다수의 종양의 존재하에서, 특히 종양의 수가 적지 않거나, 종양의 하나 이상의 위치가 정확히 공지되어 있지 않거나, 종양의 모든 부위에 xRT를 전달하는 것이 불가능한 경우에 인 시츄 백신화 방법과 조합하여 효과적으로 사용될 수 없다. 게다가, 전이성 질환을 갖는 환자에서 모든 종양 부위에의 xRT 투여는 아마도 전신 면역 억제를 발생시켜, 전신-투여 면역요법의 주요 목적을 무력화시킬 것이다.
따라서, 전신-투여 면역요법과 조합하여, 종양의 수 및 해부학적 위치와 상관 없이 대상체 내의 모든 종양에 면역조절 선량의 RT를 전달하는 개선된 방법이 필요하다.
개요
본 발명자는 이전에 특정 알킬포스포콜린 유사체가 악성 고형 종양 세포에 의해 우선적으로 흡수되어 보유됨을 보여 주었다. 전체내용이 본원에 참조로서 포함되는 미국 특허 공보 2014/0030187호에서, Weichert 등은 다양한 악성 고형 종양을 검출하고 위치를 파악할 뿐만 아니라 치료하기 위해 기본 화합물 18-(p-요오도페닐)옥타데실 포스포콜린(NM404; 도 1 참조)의 유사체를 사용하는 것을 개시한다. 요오도 모이어티가 요오드-124([124I]-NM404)와 같은 영상화-최적화된 방사성핵종인 경우, 상기 유사체는 고형 종양의 양전자 방출 단층촬영술-컴퓨터 단층촬영술(PET/CT) 또는 단일-광자 방출 컴퓨터 단층촬영술(SPECT) 영상화에 사용될 수 있다. 대안적으로, 요오도 모이어티가 요오드-125 또는 요오드-131([125I]-NM404 또는 [131I]-NM404)과 같이 유사체가 흡수되는 고형 종양 세포에 치료 선량의 RT를 전달하기에 최적화된 방사성핵종인 경우, 상기 유사체가 고형 종양을 치료하는데 사용될 수 있다.
상기 유사체는 생체 내에서 다양한 고형 종양 유형을 표적화할 뿐만 아니라, 종양 세포에서 장기간 선택적 보유를 겪고, 이에 따라 RT 제제로서 높은 잠재성을 제공한다. 또한, 종양 흡수는 악성 암으로 제한되며, 전암성 또는 양성 병변은 해당되지 않는다.
그러나, 이전에 개시된 알킬포스포콜린 유사체에 사용된 방사성 요오드 동위원소보다 최적화된 영상화 및/또는 RT에 대해 더 나은 특성을 갖는 금속 동위원소가 존재한다. 예를 들어, 영상화 동위원소로서, I-124는 불량한 양전자 산출량(방출의 약 24%만 양전자임)을 겪으며, 이는 정상적인 511 KeV PET 검출을 실제로 방해하는 교란 감마 방출(600 KeV)을 추가로 겪는다. 특정 양전자 방출 금속은 더 나은 영상화 특징을 갖는다. 또 다른 예로서, RT 동위원소로서, I-131은 다른 에너지에서 다른 비-치료 방출을 발생시키며, 이는 골수를 포함하는 이웃하는 정상 조직에 원하지 않는 방사선 선량측정을 부가한다. I-131의 베타 입자 범위는 또한 매우 길어, 표적외 독성에 기여한다. 몇몇 금속 방사선요법 동위원소는 더 깨끗한 방출 프로파일 및 더 짧은 경로길이 및 이에 따른 덜한 잠재적 독성을 제공한다.
본 발명자는 방사성 요오드 동위원소 대신 킬레이트화된 방사성 금속 동위원소를 포함하는 개선된 알킬포스포콜린 유사체를 개발하였다(예를 들어, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 공개 번호 2018/0022768호 참조). 상기 유사체는 이전에 개시된 방사성요오드화 화합물과 동일한 백본을 포함하므로, 이들은 여전히 종양세포에 의해 선택적으로 흡수되고, 종양 세포 내에 보유된다. 그러나, 킬레이트화된 방사성 금속 동위원소는 영상화 및/또는 방사선요법 적용을 위한 개선된 방출을 제공한다. 상기 제제는 악성 종양의 수 및 위치가 공지되었는지의 여부에 상관 없이 대상체 내에 존재하는 모든 악성 종양에 아세포독성(sub-cytotoxic)이나 면역조절성 선량의 이온화 RT를 전달는데 매우 적합하다.
따라서, 제1 양태에서, 본 발명의 개시는 대상체에서 하나 이상의 악성 고형 종양을 포함하는 암을 치료하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 (a) 면역조절 용량의 표적화된 방사선요법(TRT) 제제로서, 악성 고형 종양 조직에 의해 차별적으로 흡수되어 그 안에 보유되는 표적화된 방사선요법(TRT) 제제; 및 (b) 하나 이상의 면역자극 제제를 대상체에 전신 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 면역자극 제제는 하나 이상의 체크포인트 분자를 표적화할 수 있는 면역 체크포인트 억제제이다.
하나 이상의 면역 체크포인트 억제제의 비제한적 예로는 하기 체크포인트 분자 중 하나 이상을 표적화할 수 있는 제제를 포함한다: A2AR(아데노신 A2a 수용체), BTLA(B 및 T 림프구 감쇠인자), CTLA4(세포독성 T 림프구-관련 단백질 4), KIR(킬러 세포 면역글로불린-유사 수용체), LAG3(림프구 활성화 유전자 3), PD-1(프로그래밍된 치사 수용체 1), PD-L1(프로그래밍된 치사 리간드 1), CD40(분화 클러스터 40), CD27(분화 클러스터 27), CD28(분화 클러스터 28), CD137(분화 클러스터 137), OX40(CD134; 분화 클러스터 134), OX40L(OX40 리간드; 분화 클러스터 252), GITR(글루코코르티코이드-유도된 종양 괴사 인자 수용체-관련 단백질), GITRL(글루코코르티코이드-유도된 종양 괴사 인자 수용체-관련 단백질 리간드), ICOS(유도성 T-세포 공동자극), ICOSL(유도성 T-세포 공동자극 리간드), B7H3(CD276; 분화 클러스터 276), B7H4(VTCN1; V-세트 도메인-함유 T-세포 활성화 억제제 1), IDO(인돌아민 2,3-디옥시게나제), TIM-3(T-세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 3), Gal-9(갈렉틴-9), 또는 VISTA(T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제인자).
일부 구현예에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 억제제는 하나 이상의 항-면역 체크포인트 분자 항체를 포함한다. 이러한 일부 구현예에서, 하나 이상의 항-면역 체크포인트 분자 항체는 적어도 하나의 모노클로날 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 억제제는 하나 이상의 면역 체크포인트 분자를 억제하거나 차단할 수 있는 하나 이상의 소분자를 포함한다. 이러한 소분자 체크포인트 억제제의 비제한적 예는 CA-170 및 CA-327을 포함하며, 이 둘 모두는 PD-L1을 표적으로 한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 항-면역 체크포인트 분자 항체는 항-CTLA4 항체, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-LAG3 항체, 항-KIR 항체, 항-A2AR 항체 및 항-BTLA 항체, 항-CD40 항체, 항-CD27 항체, 항-CD28 항체, 항-CD137 항체, 항-OX40 항체, 항-OX40L 항체, 항-GITR 항체, 항-GITRL 항체, 항-ICOS 항체, 항-ICOSL 항체, 항-B7H3 항체, 항-B7H4 항체, 항-IDO 항체, 항-TIM-3 항체, 항-Gal-9 항체 또는 항-VISTA 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, TRT 제제는 메타요오도벤질구아니딘(MIBG)이며, 여기에서 MIBG의 요오드 원자는 방사성 요오드 동위원소이다.
일부 구현예에서, TRT 제제는 방사성표지된 종양-표적화 항체이다.
일부 구현예에서, TRT 제제는 라듐의 방사성 동위원소, 예컨대 Ra-223이다.
일부 구현예에서, TRT 제제는 하기 화학식을 갖는 방사성 인지질 에테르 금속 킬레이트 또는 이의 염이다:
R1은 금속 원자로 킬레이트화된 킬레이트제를 포함하고, 여기서 금속 원자는 6시간 초과 및 30일 미만의 반감기를 갖는 알파, 베타 또는 오거 방출 금속 동위원소이고; a는 0 또는 1이고; n은 12 내지 30의 정수이고; m은 0 또는 1이고; Y는 -H, -OH, -COOH, -COOX, -OCOX, 또는 -OX이고, 여기서 X는 알킬 또는 아릴이고; R2는 -N+H3, -N+H2Z, -N+HZ2, 또는 -N+Z3이고, 여기서 각각의 Z는 독립적으로 알킬 또는 아로알킬이고; b는 1 또는 2이다. 사용될 수 있는 금속 동위원소의 비제한적인 예는 Sc-47, Lu-177, Y-90, Ho-166, Re-186, Re-188, Cu-67, Au-199, Rh-105, Ra-223, Ac-225, Pb-212, 또는 Th-227을 포함한다.
일부 구현예에서, 킬레이트제는 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7-트리아세트산(DO3A) 또는 이의 유도체 중 하나; 1,4,7-트리아자사이클로노난-1,4-디아세트산(NODA) 또는 이의 유도체 중 하나; 1,4,7-트리아자사이클로노난-1,4,7-트리아세트산(NOTA) 또는 이의 유도체 중 하나; 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(DOTA) 또는 이의 유도체 중 하나; 1,4,7-트리아자사이클로노난, 1-글루타르산-4,7-디아세트산(NODAGA) 또는 이의 유도체 중 하나; 1,4,7,10-테트라아자사이클로데칸, 1-글루타르산-4,7,10-트리아세트산(DOTAGA) 또는 이의 유도체 중 하나; 1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸-1,4,8,11-테트라아세트산(TETA) 또는 이의 유도체 중 하나; 1,4,8,11-테트라아자바이사이클로[6.6.2]헥사데칸-4,11-디아세트산(CB-TE2A) 또는 이의 유도체 중 하나; 디에틸렌 트리아민 펜타아세트산(DTPA), 이의 디에스테르, 또는 이의 유도체 중 하나; 2-사이클로헥실 디에틸렌 트리아민 펜타아세트산(CHX-A"-DTPA) 또는 이의 유도체 중 하나; 데포록사민(DFO) 또는 이의 유도체 중 하나; 1,2-[[6-카르복시피리딘-2-일]메틸아미노]에탄(H2dedpa) 또는 이의 유도체 중 하나; 및 DADA 또는 이의 유도체 중 하나이며, 여기서 DADA는 하기 구조를 포함한다:
일부 구현예에서, a는 1(지방족 아릴-알킬 사슬)이다. 다른 구현예에서, a는 0(지방족 알킬 사슬)이다.
일부 구현예에서, m은 1(아실인지질 시리즈)이다. 일부 상기 구현예에서, n은 12 내지 20의 정수이다. 일부 구현예에서, Y는 -OCOX, -COOX 또는 -OX이다.
일부 구현예에서, X는 -CH2CH3 또는 -CH3이다.
일부 구현예에서, m은 0(알킬인지질 시리즈)이다.
일부 구현예에서, b는 1이다.
일부 구현예에서, n은 18이다.
일부 구현예에서, R2는 -N+Z3이다. 일부 상기 구현예에서, 각각의 Z는 독립적으로 -CH2CH3 또는 -CH3이다. 일부 상기 구현예에서, 각각의 Z는 -CH3이다.
일부 구현예에서, 금속 원자로 킬레이트화된 킬레이트제는 하기와 같다:
일부 구현예에서, 방사성 인지질 에테르 금속 킬레이트는 하기 화합물 중 하나이며, 여기서 선택된 화합물은 금속 원자로 킬레이트화된다:
일부 구현예에서, 인지질 에테르 금속 킬레이트 구조에서, a는 1이며, b는 1이며, m은 0이며, n은 18이고, R2는 -N+(CH3)3이다. 이러한 일부 구현예에서, 인지질 에테르 금속 킬레이트는 금속 원자로 킬레이트화된 NM600, 예컨대 (비제한적으로) 90Y-NM600이다.
일부 구현예에서, TRT 제제는 하기 화학식을 갖는 방사성할로겐화된 인지질 에테르이다:
R1은 방사성 할로겐 동위원소를 포함하며; a는 0 또는 1이며; n은 12 내지 30의 정수이며; m은 0 또는 1이며; Y는 -H, -OH, -COOH, -COOX, -OX 및 -OCOX로 구성된 군으로부터 선택되며, 여기에서 X는 알킬 또는 아릴알킬이며; R2는 -N+H3, -N+H2Z, -N+HZ2 및 -N+Z3로 구성된 군으로부터 선택되며, 여기에서 각각의 Z는 독립적으로 알킬 또는 아릴이다.
일부 구현예에서, 방사성 할로겐 동위원소는 123I, 124I, 125I, 131I, 211At, 76Br 또는 77Br이다.
일부 구현예에서, a는 1이며, m은 0이다.
일부 구현예에서, n은 18이다.
일부 구현예에서, R2는 -N+(CH3)3이다. 일부 이러한 구현예에서, a는 1이며, m은 0이며, n은 18이다. 일부 이러한 구현예에서, 방사성 할로겐 동위원소는 123I, 124I, 125I 또는 131I이다(방사성할로겐화된 인지질 에테르는 [123I]-NM404, [124I]-NM404, [125I]-NM404, [131I]-NM404, [211At]-NM404, [76Br]-NM404, 또는 [77Br]-NM404이다).
일부 구현예에서, TRT 제제, 면역자극 제제 또는 이 둘 모두는 정맥내 투여된다.
일부 구현예에서, 대상체는 인간이다.
본 방법을 이용하여 치료될 수 있는 악성 고형 종양으로 존재하는 암의 비제한적인 예는 흑색종, 신경모세포종, 폐암, 부신암, 결장암, 결장직장암, 난소암, 전립선암, 간암, 피하암, 피부 또는 두경부의 편평세포암, 장암, 망막모세포종, 자궁경부암, 신경아교종, 유방암, 췌장암, 연조직 육종, 유잉 육종, 횡문근육종, 골육종, 윌름즈 종양, 및 소아 뇌종양을 포함한다.
일부 구현예에서, 암은 체크포인트 분자가 아닌 종양 항원에 대한 항체를 대상체에 투여하지 않으면서 치료된다.
일부 구현예에서, 항-GD2 항체는 대상체에 투여되지 않는다.
제2 양태에서, 본 개시내용은 상기 추가로 기술된 바와 같이 대상체에서 하나 이상의 악성 고형 종양을 포함하는 암을 치료하기 위한 TRT 제제 및 하나 이상의 면역자극 제제의 용도를 포함한다.
제3 양태에서, 본 개시내용은 상기 추가로 기술된 바와 같이 대상체에서 하나 이상의 악성 고형 종양을 포함하는 암을 치료하는 의약 제조에 있어서 TRT 제제 및/또는 하나 이상의 면역자극 제제의 용도를 포함한다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 장점은 명세서, 청구범위 및 도면의 개관 후에 명백해질 것이다.
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도 1은 기본 화합물 18-(p-요오도페닐)옥타데실 포스포콜린(NM404)의 화학 구조를 보여준다.
도 2a는 xRT + IT-IC가 인 시츄 종양 백신화를 유발함을 보여주는 그래프이다. 더욱 특히, 도 2a는 xRT과 IT-hu14.18-IL2 사이의 시너지를 보여주는 종양 성장 곡선을 보여준다. xRT + IT-IC로 처리된 마우스 중 71% (22/31)는 질병이 없는 상태가 된다.
도 2b는 xRT + IT-IC가 인 시츄 종양 백신화를 유발함을 보여주는 또 다른 그래프이다. 더욱 특히, 도 2b는 xRT과 IT-hu14.18-IL2 사이의 시너지를 보여주는 카플란-메이어 성장 곡선을 보여준다. xRT + IT-IC로 처리된 마우스 중 71% (22/31)는 질병이 없는 상태가 된다.
도 2c는 xRT + IT-IC가 인 시츄 종양 백신화를 유발함을 보여주는 또 다른 그래프이다. 더욱 특히, 도 2c는 처리된 마우스의 90%가 B78 흑색종에 의한 후속 생착을 거부함을 보여준다.
도 3은 수반 면역 내성을 나타내는 그래프이다. 일차 종양 반응이 제시된다. 원위의 치료되지 않은 종양은 2-종양 B78 흑색종 모델에서 xRT + IT-IC에 대한 반응을 억제하며, 이러한 억제는 두 번째 종양을 방사선 조사함으로써 극복될 수 있다.
도 4는 수반 면역 내성이 Treg로 인한 것임을 제시하는 그래프이다. 일차 종양 반응이 제시된다. 원위의 치료되지 않은 종양은 2-종양 B78 흑색종 모델에서 xRT + IT-IC에 대한 반응을 억제하며, 이러한 억제는 Treg를 고갈(Treg에서 디프테리아 독소 수용체를 발현하고, 이에 따라 디프테리아 독소를 투여함으로써 Treg를 고갈시키는 트랜스제닉 DEREG 마우스를 이용함)시킴으로써 극복될 수 있다.
도 5는 B78 흑색종에 의한 124I-NM404의 선택적 흡수를 제시하는 이미지이다. 약 200mm3의 B78 종양을 갖는 마우스에 124I-NM404가 IV 투여되었고, 일련의 PET/CT 스캔이 수행되었다. 71시간에서의 이러한 이미지는 심장 및 간에 의한 일부 잔여 배경 흡수와 함께 종양에 의한 선택적 흡수를 제시한다.
도 6은 인 시츄 백신화가 분자 표적화 방사선 요법(TRT)의 잔여 수준의 존재하에서 유도될 수 있음을 입증하는 그래프이다. 조합된 xRT + IT-IC를 이용한 치료는 3 μCi의 131I-NM404의 존재 또는 부재하에서 동등하게 효과적이다. 이는 실시예 4에 기재된 바와 같이 xRT(d0)에 이어 IT-IC(d6-10)를 전달하는 경우에 존재하는 TRT의 잔여 활성을 근사화한다.
도 7은 24시간까지의 종양(T)의 증강을 제시하는 Gd-NM600의 주입 후의 종양을 갖는 마우스의 시간 경과 MRI 이미지를 제시한다.
도 8a는 뮤린 흑색종 및 췌장 종양 모델에서 원위의 치료되지 않은 종양에 의한 국소 RT+IT-IC의 조합에 대한 일차 종양 반응의 종양-특이적 억제를 제시하는 그래프이다. 대측 옆구리에 동계의 디시알로강글리오시드를 발현하는(GD2+) 일차 옆구리 종양 +/- 이차 종양을 갖는 C57BL/6 마우스에 "1"일에서 xRT로 표시한 바와 같이 일차 종양에 대해서만 치료되었고, 6-10일에 50 mcg의 항-GD2 면역사이토카인(IC)인 hu14.18-IL2(항-GD2 mAb 및 IL2의 융합체)가 종양 내(IT) 주입되었다. 평균 일차 종양 부피가 도 8a에 제시된다. 더욱 특히, 도 8a는 일차 B78 흑색종 종양을 갖는 마우스에서, 치료되지 않은 이차 B78 종양의 존재가 RT+IT-IC에 대한 일차 종양 반응을 길항시켰음을 보여준다. 본 발명자는 이러한 효과를 xRT + IT-IC에 대한 치료된 종양의 국소 반응에 대한 치료되지 않은 원위 종양의 길항 효과인 "수반 면역 내성"으로 기재한다.
도 8b는 뮤린 흑색종 및 췌장 종양 모델에서 원위의 치료되지 않은 종양에 의한 국소 RT+IT-IC의 조합에 대한 일차 종양 반응의 종양-특이적 억제를 제시하는 또 다른 그래프이다. 대측 옆구리에 동계의 디시알로강글리오시드를 발현하는(GD2+) 일차 옆구리 종양 +/- 이차 종양을 갖는 C57BL/6 마우스에 "1"일에서 xRT로 표시한 바와 같이 일차 종양에 대해서만 치료되었고, 6-10일에 50 mcg의 항-GD2 면역사이토카인(IC)인 hu14.18-IL2(항-GD2 mAb 및 IL2의 융합체)가 종양 내(IT) 주입되었다. 더욱 특히, 도 8b는 마우스에 대한 카플란-마이어 생존 곡선 + 반복 실험을 제시한다. 거의 모든 마우스는 일차 종양 진행으로 인해 안락사되었다.
도 8c는 뮤린 흑색종 및 췌장 종양 모델에서 원위의 치료되지 않은 종양에 의한 국소 RT+IT-IC의 조합에 대한 일차 종양 반응의 종양-특이적 억제를 제시하는 또 다른 그래프이다. 대측 옆구리에 동계의 디시알로강글리오시드를 발현하는(GD2+) 일차 옆구리 종양 +/- 이차 종양을 갖는 C57BL/6 마우스에 "1"일에서 xRT로 표시한 바와 같이 일차 종양에 대해서만 치료되었고, 6-10일에 50 mcg의 항-GD2 면역사이토카인(IC)인 hu14.18-IL2(항-GD2 mAb 및 IL2의 융합체)가 종양 내(IT) 주입되었다. 더욱 특히, 도 8c는 반대쪽 옆구리에 이차 Panc02-GD2- 종양을 갖거나 갖지 않는 일차 Panc02-GD2+ 췌장 종양을 갖는 마우스에서, 치료되지 않은 Panc02 이차 종양의 존재가 RT+IT-IC에 대한 일차 Panc02-GD2+ 종양의 반응을 억제하였음을 보여준다.
도 8d는 뮤린 흑색종 및 췌장 종양 모델에서 원위의 치료되지 않은 종양에 의한 국소 RT+IT-IC의 조합에 대한 일차 종양 반응의 종양-특이적 억제를 제시하는 또 다른 그래프이다. 대측 옆구리에 동계의 디시알로강글리오시드를 발현하는(GD2+) 일차 옆구리 종양 +/- 이차 종양을 갖는 C57BL/6 마우스에 "1"일에서 xRT로 표시한 바와 같이 일차 종양에 대해서만 치료되었고, 6-10일에 50 mcg의 항-GD2 면역사이토카인(IC)인 hu14.18-IL2(항-GD2 mAb 및 IL2의 융합체)가 종양 내(IT) 주입되었다. 더욱 특히, 도 8d는 일차 B78 흑색종 종양을 갖는 마우스에서, 이차 B78 종양이 RT+IT-IC에 대한 일차 종양 반응을 억제하였으나, 이차 Panc02-GD2+ 췌장 종양은 이러한 효과를 나타내지 않았음을 보여준다.
도 8e는 뮤린 흑색종 및 췌장 종양 모델에서 원위의 치료되지 않은 종양에 의한 국소 RT+IT-IC의 조합에 대한 일차 종양 반응의 종양-특이적 억제를 제시하는 또 다른 그래프이다. 대측 옆구리에 동계의 디시알로강글리오시드를 발현하는(GD2+) 일차 옆구리 종양 +/- 이차 종양을 갖는 C57BL/6 마우스에 "1"일에서 xRT로 표시한 바와 같이 일차 종양에 대해서만 치료되었고, 6-10일에 50 mcg의 항-GD2 면역사이토카인(IC)인 hu14.18-IL2(항-GD2 mAb 및 IL2의 융합체)가 종양 내(IT) 주입되었다. 더욱 특히, 도 8e는 일차 Panc02-GD2+ 종양을 갖는 마우스에서, 이차 Panc02-GD2- 종양이 조합된 xRT 및 IT-hu14.18-IL2에 대한 일차 종양 반응을 억제한 반면, B78 이차 종양은 그렇지 않았음을 보여준다. NS = 유의하지 않음, ***p<0.001.
도 9a는 수반 면역 내성이 조절자 T 세포(Treg)의 특이적 고갈에 의해 회피되는 것을 제시하는 면역조직화학 이미지(왼쪽 및 중앙) 및 그래프(오른쪽)를 포함한다. 더욱 특히, 도 9a는 1개(도 9a, 가장왼쪽 패널 A1 및 A2) 또는 2개(도 9a, 중앙 패널 A3 및 A4)의 종양을 갖는 마우스에서 xRT 6일 후에 평가된 종양에 대한 Treg 마커인 FoxP3에 대한 면역조직화학(대표적 400x 이미지가 제시됨)을 제시한다. 마우스는 xRT를 투여하지 않거나, 일차 종양에만 xRT를 투여하였다. 일차 종양이 도 9a, 패널 A1-A3에 제시되고, 이차 종양이 도 9a, 패널 A4에 제시된다. 작은 화살표는 FoxP3+ 세포 중 일부를 지적한다(갈색 핵 = FoxP3+, 청색 = 헤마톡실린 대조염색). 우측 상의 그래프는 200x 필드 당 FoxP3+ 세포의 맹검된 정량화를 나타내며, 이는 도9a, 패널 A1, A2, A3 및 A4에 각각 제시된 조건에 해당한다.
도 9b는 수반 면역 내성이 조절자 T 세포(Treg)의 특이적 고갈에 의해 회피됨을 보여주는 또 다른 그래프이다. 더욱 특히, 도 9b는 DEREG 마우스가 Treg-특이적 FoxP3 프로모터의 제어 하에서 디프테리아 독소 수용체를 발현하며, 이는 디프테리아 독소의 IP 주입시 Treg의 특이적 고갈을 가능하게 함을 보여준다. 일차 및 이차 B78 흑색종 종양을 갖는 DEREG 마우스는 일차 종양에 xRT+IT-IC가 처리되었고, 디프테리아 독소 또는 PBS(반복 실험의 첫 번째가 제시됨)의 IP 주입이 처리되었다. 이들 마우스에서 Treg의 고갈 후에 수반 면역 내성이 제거되며, 이는 개선된 (도 9b) 일차 종양 반응을 발생시킨다. n=그룹 당 마우스의 수. **p<0.01, ***p<0.001.
도 9c는 수반 면역 내성이 조절자 T 세포(Treg)의 특이적 고갈에 의해 회피됨을 보여주는 또 다른 그래프이다. 더욱 특히, 도 9c는 DEREG 마우스가 Treg-특이적 FoxP3 프로모터의 제어 하에서 디프테리아 독소 수용체를 발현하며, 이는 디프테리아 독소의 IP 주입시 Treg의 특이적 고갈을 가능하게 함을 보여준다. 일차 및 이차 B78 흑색종 종양을 갖는 DEREG 마우스는 일차 종양에 xRT+IT-IC가 처리되었고, 디프테리아 독소 또는 PBS(반복 실험의 첫 번째가 제시됨)의 IP 주입이 처리되었다. 이들 마우스에서 Treg의 고갈 후에 수반 면역 내성이 제거되며, 이는 개선된 (도 9c) 이차 종양 반응을 발생시킨다. n=그룹 당 마우스의 수. **p<0.01, ***p<0.001.
도 10a는 수반 면역 내성이 두 종양 부위 모두로 xRT를 전달함으로써 극복되는 것을 제시하는 그래프이다. 일차 및 이차 B78 종양을 갖는 마우스에서, 이차 종양은 xRT + IT-IC를 이용한 일차 종양 치료에 대한 일차 종양 반응을 억제한다. 이는 일차 및 이차 종양 둘 모두에 12 Gy xRT를 전달하고, 일차 종양에 IT-IC를 전달함으로써 극복되며, 이는 반복 실험으로부터 개선된 (도 10a) 일차 종양 반응(반복 실험의 첫 번째가 제시됨)을 발생시킨다. n=그룹 당 마우스의 수. **p<0.01, ***p<0.001.
도 10b는 수반 면역 내성이 두 종양 부위 모두로 xRT를 전달함으로써 극복되는 것을 제시하는 또 다른 그래프이다. 일차 및 이차 B78 종양을 갖는 마우스에서, 이차 종양은 xRT + IT-IC를 이용한 일차 종양 치료에 대한 일차 종양 반응을 억제한다. 이는 일차 및 이차 종양 둘 모두에 12 Gy xRT를 전달하고, 일차 종양에 IT-IC를 전달함으로써 극복되며, 이는 반복 실험으로부터 개선된 (도 10b) 동물 생존 집계를 발생시킨다. n=그룹 당 마우스의 수. **p<0.01, ***p<0.001.
도 11a는 저 선량 xRT 단독이 인 시츄 백신화를 유도하지 않지만, 인 시츄 백신 부위의 12 Gy + IT-IC 치료와 함께 원위 종양 부위에 전달되는 경우에 수반 면역 내성을 극복하는 것을 제시하는 그래프이다. 더욱 특히, 도 11a는 일차 B78 종양 단독을 갖는 마우스에서, 12 Gy + IT-IC는 인 시츄 백신화를 유도하며(이전에 제시된 바와 같음), 대부분의 마우스(본 실험에서 4/6)에서 완전한 종양 회귀 및 기억 면역 반응을 발생시킴을 보여준다(Morris, Cancer Res, 2016). 다른 한편으로, IT-IC 단독 또는 저 선량(2 Gy) xRT + IT-IC 후에 동물은 완전한 종양 회귀를 나타내지 않는다(둘 모두의 그룹에서 0/6) p<0.05.
도 11b는 저 선량 xRT 단독이 인 시츄 백신화를 유도하지 않지만, 인 시츄 백신 부위의 12 Gy + IT-IC 치료와 함께 원위 종양 부위에 전달되는 경우에 수반 면역 내성을 극복하는 것을 제시하는 또 다른 그래프이다. 더욱 특히, 도 11b는 일차 및 이차 B78 흑색종 종양을 갖는 마우스에서, 이차 종양에 전달된 저 선량 xRT(2 Gy 또는 5 Gy)가 일차 종양에서 수반 면역 내성을 극복하는 능력에서 12 Gy와 동등함을 보여준다.
도 11c는 저 선량 xRT 단독이 인 시츄 백신화를 유도하지 않지만, 인 시츄 백신 부위의 12 Gy + IT-IC 치료와 함께 원위 종양 부위에 전달되는 경우에 수반 면역 내성을 극복하는 것을 제시하는 또 다른 그래프이다. 더욱 특히, 도 11c는 이들 동일한 동물에서, 이차 종양으로의 저 선량 xRT의 전달에 의해 수반 면역 내성을 극복하는 것이 IT-IC 면역요법에 대한 전신 반응을 구제하는 것이 명백함을 보여준다. 이러한 상황에서, xRT가 모든 종양 부위로 전달되는 경우, 일차 종양의 IT-IC 주입은 전신 항-종양 효과를 촉발시키며, 이는 2 Gy 또는 5 Gy에 대한 이차 종양 반응이 일차 종양 IT-IC 주입의 부재하에서 12 Gy xRT에 대한 반응보다 크도록 만든다.
도 12a는 131I-NM404를 이용한 저 선량 TRT가 전신성 백혈구감소증 또는 종양 침윤 CD8+ 이펙터 T 세포의 고갈 없이 종양 침윤 FoxP3+ Treg을 효과적으로 고갈시키는 것을 제시하는 PET 이미지이다. 대부분의 임상 시나리오에서, 면역억제를 초래할 수 있는 현저한 골수 고갈 및 백혈구감소증을 유도하지 않으면서 모든 종양 부위에 외부 광선을 저 선량이라도 전달하는 것은 가능하지 않다. 여기서, 본 발명자는 TRT가 전신 면역 세포 고갈 및 백혈구감소증을 촉발시키지 않으면서 종양 침윤 억제 면역 세포(Treg)를 특이적으로 고갈시키도록 전신 투여될 수 있는 지의 여부를 시험하였다. 더욱 특히, 도 12a는 양전자-방출 124I-NM404를 이용한 이러한 B78 흑색종 종양 모델에서의 선량측정 연구가 NM404의 종양-선택적 흡수를 확인함을 보여준다. B78 종양을 갖는 C57BL/6 마우스가 60 μCi 131I-NM404로 처리되었다. 이러한 활성은 B78 종양에 약 2 Gy TRT를 전달하는데 필요한 131I-NM404의 양을 근사화한다. 말초 혈액 및 종양 샘플이 처리되지 않은 대조군 마우스("C"로 명명됨) 및 이후 8일 간격(T1 = d8, T2 = d16, T3 = d24, T4 = d32)으로 수집되었다.
도 12b는 131I-NM404를 이용한 저 선량 TRT가 전신성 백혈구감소증 또는 종양 침윤 CD8+ 이펙터 T 세포의 고갈 없이 종양 침윤 FoxP3+ Treg을 효과적으로 고갈시키는 것을 제시하는 막대 그래프이다. 대부분의 임상 시나리오에서, 면역억제를 초래할 수 있는 현저한 골수 고갈 및 백혈구감소증을 유도하지 않으면서 모든 종양 부위에 외부 광선을 저 선량이라도 전달하는 것은 가능하지 않다. 여기서, 본 발명자는 TRT가 전신 면역 세포 고갈 및 백혈구감소증을 촉발시키지 않으면서 종양 침윤 억제 면역 세포(Treg)를 특이적으로 고갈시키도록 전신 투여될 수 있는 지의 여부를 시험하였다. 더욱 특히, 도 12b는 이러한 선량의 TRT가 임의의 유의한 전신 백혈구감소증을 발생시키지 않았음을 보여준다.
도 12c는 131I-NM404를 이용한 저 선량 TRT가 전신성 백혈구감소증 또는 종양 침윤 CD8+ 이펙터 T 세포의 고갈 없이 종양 침윤 FoxP3+ Treg을 효과적으로 고갈시키는 것을 제시하는 또 다른 막대 그래프이다. 대부분의 임상 시나리오에서, 면역억제를 초래할 수 있는 현저한 골수 고갈 및 백혈구감소증을 유도하지 않으면서 모든 종양 부위에 외부 광선을 저 선량이라도 전달하는 것은 가능하지 않다. 여기서, 본 발명자는 TRT가 전신 면역 세포 고갈 및 백혈구감소증을 촉발시키지 않으면서 종양 침윤 억제 면역 세포(Treg)를 특이적으로 고갈시키도록 전신 투여될 수 있는 지의 여부를 시험하였다. 더욱 특히, 도 12c는 이러한 선량의 TRT가 종양 침윤 CD8+ 이펙터 T 세포의 수준에 유의하게 영향을 미치지 않았음(ANOVA p=0.25)을 보여준다.
도 12d는 131I-NM404를 이용한 저 선량 TRT가 전신성 백혈구감소증 또는 종양 침윤 CD8+ 이펙터 T 세포의 고갈 없이 종양 침윤 FoxP3+ Treg을 효과적으로 고갈시키는 것을 제시하는 또 다른 막대 그래프이다. 대부분의 임상 시나리오에서, 면역억제를 초래할 수 있는 현저한 골수 고갈 및 백혈구감소증을 유도하지 않으면서 모든 종양 부위에 외부 광선을 저 선량이라도 전달하는 것은 가능하지 않다. 여기서, 본 발명자는 TRT가 전신 면역 세포 고갈 및 백혈구감소증을 촉발시키지 않으면서 종양 침윤 억제 면역 세포(Treg)를 특이적으로 고갈시키도록 전신 투여될 수 있는 지의 여부를 시험하였다. 더욱 특히, 도 12d는 종양 침윤 FoxP3+ Treg가 이러한 선량의 TRT에 의해 유의하게 고갈되었음(ANOVA p=0.03; * p<0.05)을 보여준다.
도 13a는 131I-NM404를 이용한 저 선량 TRT가 수반 면역 내성을 효과적으로 극복하고, 인 시츄 백신화의 전신 항-종양 효과를 구제하는 것을 제시하는 그래프이다. 마우스가 백혈구감소증 없이 종양-침윤 Treg을 고갈시키는 저 선량 131I-NM404 TRT의 능력을 감안하여, 본 발명자는 저 선량 131I-NM404가 수반 면역 내성을 효과적으로 극복할 수 있는지의 여부를 시험하였다. 2개의 B78 종양을 갖는 C57BL/6 마우스가 표시된 바와 같이 1일째에 60-mcCi 131I-NM404(NM404)로 처리되었다. 1 반감기(8일) 후, 동물은 일차 종양(인 시츄 백신 부위)에 12 Gy xRT가 투여되거나, xRT가 투여되지 않았다. 131I-NM404를 투여받지 않는 대조군 마우스는 표시된 바와 같이 이차 종양에 대해 처리되었다(0, 2, 또는 12 Gy). 마우스는 13-17일에 표시된 바와 같이 일차 종양(인 시츄 백신 부위)에 매일 IC가 IT 주입되었다. 더욱 특히, 도 13a는, 일차 종양 반응이 제시되며, 이는 저 선량 TRT의 투여가 수반 면역 내성을 효과적으로 극복하고, 인 시츄 백신화의 전신 항-종양 효과를 구제하는 것을 입증함을 보여준다.
도 13b는 131I-NM404를 이용한 저 선량 TRT가 수반 면역 내성을 효과적으로 극복하고, 인 시츄 백신화의 전신 항-종양 효과를 구제하는 것을 제시하는 또 다른 그래프이다. 마우스가 백혈구감소증 없이 종양-침윤 Treg을 고갈시키는 저 선량 131I-NM404 TRT의 능력을 감안하여, 본 발명자는 저 선량 131I-NM404가 수반 면역 내성을 효과적으로 극복할 수 있는지의 여부를 시험하였다. 2개의 B78 종양을 갖는 C57BL/6 마우스가 표시된 바와 같이 1일째에 60-mcCi 131I-NM404(NM404)로 처리되었다. 1 반감기(8일) 후, 동물은 일차 종양(인 시츄 백신 부위)에 12 Gy xRT가 투여되거나, xRT가 투여되지 않았다. 131I-NM404를 투여받지 않는 대조군 마우스는 표시된 바와 같이 이차 종양에 대해 처리되었다(0, 2, 또는 12 Gy). 마우스는 13-17일에 표시된 바와 같이 일차 종양(인 시츄 백신 부위)에 매일 IC가 IT 주입되었다. 더욱 특히, 도 13b는, 이차 종양 반응이 제시되며, 이는 저 선량 TRT의 투여가 수반 면역 내성을 효과적으로 극복하고, 인 시츄 백신화의 전신 항-종양 효과를 구제하는 것을 입증함을 보여준다.
도 14는 예시적 알킬포스포콜린 금속 킬레이트(64Cu-NM600)의 화학 구조를 제시한다. 다른 금속이 64Cu 대신 사용될 수 있다.
도 15는 86Y-NM600을 이용한 주입 48시간 후에 수행된 스캔으로부터의 2마리의 단일 종양 B78 마우스의 PET/CT 이미지이다.
도 16은 86Y-NM600을 이용한 주입 48시간 후에 수행된 스캔으로부터의 2마리의 2-종양 B78 마우스의 PET/CT 이미지이다.
도 17은 64Cu-NM600을 이용한 주입 3시간 후(좌측 패널), 24시간 후(중간 패널) 및 48시간 후(우측 패널)에 수행된 스캔으로부터의 U87MG 마우스에 대한 PET/CT 이미지를 포함한다. 상기 이미지는 주입된 용량/조직 g의 백분율(%ID/g, 맨 우측에 제시된 스케일)로 계산된 조직 활성을 제시한다.
도 18은 64Cu-NM600을 이용한 주입 3시간 후(좌측 패널), 24시간 후(중간 패널) 및 48시간 후(우측 패널)에 수행된 스캔으로부터의 4T1 마우스에 대한 PET/CT 이미지를 포함한다. 상기 이미지는 주입된 용량/조직 g의 백분율(%ID/g, 맨 우측에 제시된 스케일)로 계산된 조직 활성을 제시한다.
도 19는 64Cu-NM600을 이용한 주입 3시간 후(좌측 패널), 24시간 후(중간 패널) 및 48시간 후(우측 패널)에 수행된 스캔으로부터의 HCT-116 마우스에 대한 PET/CT 이미지를 포함한다. 상기 이미지는 주입된 용량/조직 g의 백분율(%ID/g, 맨 우측에 제시된 스케일)로 계산된 조직 활성을 제시한다.
도 20은 64Cu-NM600을 이용한 주입 3시간 후(좌측 패널), 24시간 후(중간 패널) 및 48시간 후(우측 패널)에 수행된 스캔으로부터의 A549 마우스에 대한 PET/CT 이미지를 포함한다. 상기 이미지는 주입된 용량/조직 g의 백분율(%ID/g, 맨 우측에 제시된 스케일)로 계산된 조직 활성을 제시한다.
도 21은 64Cu-NM600을 이용한 주입 3시간 후(좌측 패널), 24시간 후(중간 패널) 및 48시간 후(우측 패널)에 수행된 스캔으로부터의 PC-3 마우스에 대한 PET/CT 이미지를 포함한다. 상기 이미지는 주입된 용량/조직 g의 백분율(%ID/g, 맨 우측에 제시된 스케일)로 계산된 조직 활성을 제시한다.
도 22는 64Cu-NM600을 이용한 주입 3시간 후(좌측 패널), 24시간 후(중간 패널) 및 48시간 후(우측 패널)에 수행된 스캔으로부터의 HT-29 마우스에 대한 PET/CT 이미지를 포함한다. 상기 이미지는 주입된 용량/조직 g의 백분율(%ID/g, 맨 우측에 제시된 스케일)로 계산된 조직 활성을 제시한다.
도 23은 64Cu-NM600을 이용한 주입 3시간 후(좌측 패널), 24시간 후(중간 패널) 및 48시간 후(우측 패널)에 수행된 스캔으로부터의 MiaPaca 마우스에 대한 PET/CT 이미지를 포함한다. 상기 이미지는 주입된 용량/조직 g의 백분율(%ID/g, 맨 우측에 제시된 스케일)로 계산된 조직 활성을 제시한다.
도 24는 86Y-NM600을 이용한 주입 3시간 후(좌측 패널), 24시간 후(중간 패널) 및 48시간 후(우측 패널)에 수행된 스캔으로부터의 4T1 마우스에 대한 PET/CT 이미지를 포함한다. 상기 이미지는 주입된 용량/조직 g의 백분율(%ID/g, 맨 우측에 제시된 스케일)로 계산된 조직 활성을 제시한다.
도 25는 89Zr-NM600을 이용한 주입 3시간 후(좌측 패널), 24시간 후(중간 패널) 및 48시간 후(우측 패널)에 수행된 스캔으로부터의 4T1 마우스에 대한 PET/CT 이미지를 포함한다. 상기 이미지는 주입된 용량/조직 g의 백분율(%ID/g, 맨 우측에 제시된 스케일)로 계산된 조직 활성을 제시한다.
도 26은 52Mn-NM600을 이용한 주입 4시간 후(좌측 패널) 및 1일 후(우측 패널)에 수행된 스캔으로부터의 HT-29 마우스에 대한 PET/CT 이미지를 포함한다. 상기 이미지는 주입된 용량/조직 g의 백분율(%ID/g, 맨 우측에 제시된 스케일)로 계산된 조직 활성을 제시한다.
도 27은 52Mn-NM600을 이용한 주입 4시간 후(좌측 패널) 및 1일 후(우측 패널)에 수행된 스캔으로부터의 PC-3 마우스에 대한 PET/CT 이미지를 포함한다. 상기 이미지는 주입된 용량/조직 g의 백분율(%ID/g, 각각의 이미지의 우측에 제시된 스케일)로 계산된 조직 활성을 제시한다.
도 28은 52Mn-NM600을 이용한 주입 2일 후(좌측 패널), 3일 후(좌측으로부터 두 번째 패널), 5일 후(우측으로부터 두 번째 패널) 및 7일 후(우측 패널)에 수행된 스캔으로부터의 HT-29 마우스에 대한 PET/CT 이미지를 포함한다. 상기 이미지는 주입된 용량/조직 g의 백분율(%ID/g, 이미지의 우측에 제시된 스케일)로 계산된 조직 활성을 제시한다.
도 29는 52Mn-NM600을 이용한 주입 2일 후(좌측 패널), 3일 후(좌측으로부터 두 번째 패널), 5일 후(우측으로부터 두 번째 패널) 및 7일 후(우측 패널)에 수행된 스캔으로부터의 PC-3 마우스에 대한 PET/CT 이미지를 포함한다. 상기 이미지는 주입된 용량/조직 g의 백분율(%ID/g, 이미지의 우측에 제시된 스케일)로 계산된 조직 활성을 제시한다.
도 30은 86Y-NM600, 64Cu-NM600 및 89Zr-NM-600으로 주입된 4T1 마우스에서 4T1 종양 조직에 대한 PET 정량적 관심 영역 데이터(시간의 함수로서의 킬레이트 흡수)를 제시하는 그래프이다.
도 31은 86Y-NM600, 64Cu-NM600 및 89Zr-NM-600으로 주입된 4T1 마우스에서 심장 조직에 대한 PET 정량적 관심 영역 데이터(시간의 함수로서의 킬레이트 흡수)를 제시하는 그래프이다.
도 32는 86Y-NM600, 64Cu-NM600 및 89Zr-NM-600으로 주입된 4T1 마우스에서 간 조직에 대한 PET 정량적 관심 영역 데이터(시간의 함수로서의 킬레이트 흡수)를 제시하는 그래프이다.
도 33은 86Y-NM600, 64Cu-NM600 및 89Zr-NM-600으로 주입된 4T1 마우스에서 전신에 대한 PET 정량적 관심 영역 데이터(시간의 함수로서의 킬레이트 흡수)를 제시하는 그래프이다.
도 34는 금속 킬레이트의 주입 48시간 후(86Y-NM600, 64Cu-NM600, 89Zr-NM-600 및 177Lu-NM600) 및 96시간 후(177Lu-NM600)에 4T1 마우스에서 건강한 조직 및 종양 조직에서의 생체 외 킬레이트 생체분포를 예시하는 막대 그래프이다.
도 35는 예시적 알킬포스포콜린 금속 킬레이트(177Lu-NM600)의 화학 구조를 제시한다. 다른 금속이 177Lu 대신 사용될 수 있다.
도 36은 90Y-NM600을 이용한 주입 48시간 후에 수행된 3마리의 B78 마우스의 오디오래디오그래픽 이미지(audioradiographic image)이다. 이종이식된 B78 종양이 각각의 마우스 이미지의 우측 아래에 큰 어두운 반점으로 관찰된다.
도 37은 90Y-NM600을 이용한 주입 96시간 후에 수행된 3마리의 B78 마우스의 오디오래디오그래픽 이미지이다. 이종이식된 B78 종양이 각각의 마우스 이미지의 우측 아래에 큰 어두운 반점으로 관찰된다.
도 38은 177Lu-NM600을 이용한 주입 5일 후에 수행된 B78 마우스의 오디오래디오그래픽 이미지이다. 이종이식된 B78 종양이 마우스 이미지의 하단에 2개의 어두운 반점으로 관찰된다.
도 39는 177Lu-NM600을 이용한 주입 13일 후에 수행된 B78 마우스의 오디오래디오그래픽 이미지이다. 이종이식된 B78 종양이 마우스 이미지의 하단에 2개의 어두운 반점으로 관찰된다.
도 39는 177Lu-NM600을 이용한 주입 13일 후에 수행된 B78 마우스의 오디오래디오그래픽 이미지이다. 이종이식된 B78 종양이 마우스 이미지의 하단에 2개의 어두운 반점으로 관찰된다.
도 40은 177Lu-NM600을 이용한 주입 10일 후에 수행된 MiaPaca 마우스의 오디오래디오그래픽 이미지이다. 이종이식된 MiaPaca 종양의 위치는 화살표 및 파선 원으로 표시된다.
도 41은 177Lu-NM600을 이용한 주입 48시간 후에 수행된 3마리의 4T1 마우스의 오디오래디오그래픽 이미지이다. 이종이식된 4T1 종양의 위치는 화살표 및 파선 원으로 표시된다.
도 42는 177Lu-NM600을 이용한 주입 96시간 후에 수행된 3마리의 4T1 마우스의 오디오래디오그래픽 이미지이다. 이종이식된 4T1 종양의 위치는 파선 원으로 표시된다.
도 43은 90Y-NM600을 이용한 주입 4시간 후에 수행된 3마리의 4T1 마우스의 오디오래디오그래픽 이미지이다. 이종이식된 4T1 종양의 위치는 화살표 및 파선 원으로 표시된다.
도 44는 90Y-NM600을 이용한 주입 48시간 후에 수행된 3마리의 4T1 마우스의 오디오래디오그래픽 이미지이다. 이종이식된 4T1 종양이 각각의 마우스 이미지의 우측 아래에 큰 어두운 반점으로 관찰된다.
도 45는 90Y-NM600을 이용한 주입 96시간 후에 수행된 3마리의 4T1 마우스의 오디오래디오그래픽 이미지이다. 이종이식된 4T1 종양이 각각의 마우스 이미지의 우측 아래에 큰 어두운 반점으로 관찰된다.
도 46은 대조군(부형제 단독)에 비한 B78 이종이식 마우스 모델에서 2개의 상이한 선량(150 μCi 및 300 μCi)의 90Y-NM600의 방사선치료 효과를 예시하는 그래프이다. 데이터는 주입 후 일의 시간 함수로서 mm3 단위로 측정된 종양 부피로 제시된다.
도 47은 대조군(부형제 단독)에 비한 B78 이종이식 마우스 모델에서 177Lu-NM600의 단일 500 μCi 선량의 방사선치료 효과를 예시하는 그래프이다. 데이터는 주입 후 일의 시간 함수로서 mm3 단위로 측정된 종양 부피로 제시된다.
도 48은 대조군(부형제 단독)에 비한 MiaPaca 이종이식 마우스 모델에서 177Lu-NM600의 단일 400 μCi 선량의 방사선치료 효과를 예시하는 그래프이다. 데이터는 주입 후 일의 시간 함수로서 mm3 단위로 측정된 종양 부피로 제시된다.
도 49는 대조군(부형제 단독)에 비한 4T1 이종이식 마우스 모델에서 177Lu-NM600의 단일 500 μCi 선량의 방사선치료 효과를 예시하는 그래프이다. 데이터는 주입 후 일의 시간 함수로서 mm3 단위로 측정된 종양 부피로 제시된다. * P < 0.05; ** P < 0.01; *** P < 0.001.
도 50은 대조군(부형제 단독)에 비한 4T1 이종이식 마우스 모델에서 177Lu-NM600의 2개의 연속 선량(500 μCi 및 250 μCi)의 방사선치료 효과를 예시하는 그래프이다. 데이터는 주입 후 일의 시간 함수로서 mm3 단위로 측정된 종양 부피로 제시된다.
도 51은 대조군(부형제 단독)에 비한 4T1 이종이식 마우스 모델에서 2개의 상이한 선량(500 μCi 및 250 μCi)의 177Lu-NM600의 방사선치료 효과를 예시하는 그래프이다. 데이터는 주입 후 일의 시간 함수로서 mm3 단위로 측정된 종양 부피로 제시된다.
도 52는 통상적인 TRT에서의 90Y-NM600 및 131I-NM404의 비교 치료 효능에 대한 종양 질량의 영향을 예시하는 그래프이다.
도 53은 아민 유사체와 함께 NM404의 3개의 상이한 금속 킬레이트 유사체의 평균 알부민 결합 에너지를 비교하는 막대 그래프이다. 비교를 위해, I-NM404의 결합 에너지가 점선으로 제시된다.
도 54는 항-CTLA4 면역 체크포인트 억제제(CTLA4) 및/또는 다양한 용량(25 μCi, 50 μCi, 또는 100 μCi)의 표적화된 방사선요법(TRT) 제제 Y90-NM600로 처리된 B78 흑색종 옆구리 종양 마우스에서 시간(일)의 함수로서 종양 부피(mm3)를 예시하는 그래프이다. 대조군 마우스에는 항-CTLA4 또는 TRT 제제(PBS) 없는 비히클을 투여하였다. 18일 후, 50 또는 100 μCi의 Y90-NM600과 항-CTLA4의 조합 투여는 PBS, Y90-NM600 단독 또는 항-CTLA4 단독과 비교하여 종양 성장을 유의하게(ANOVA p< 0.05) 감소시켰다. 항-CTLA-4와의 25 μCi Y90-NM600 조합 처리 군은 용량 반응에 대한 경향을 보이는 중간 성장 지연 반응을 가졌다.
도 55는 TRT 단독, 체크포인트 차단제 단독(항-CTLA4) 또는 PBS 비히클 투여된 마우스와 비교하여, TRT(50 μCi Y90-NM600)와 체크포인트 차단제(항-CTLA4)의 조합물을 투여한 마우스에 대한 동물 생존 집계를 보여주는 그래프이다.
도 56은 TRT(25 μCi, 50 μCi, 및 100 μCi Y90-NM600)와 체크포인트 차단제(항-CTLA4)의 3개의 상이한 조합을 투여한 마우스에 대한 동물 생존 집계를 보여주는 그래프이다.
도 57은 항-CTLA4 면역 체크포인트 억제제(CTLA4) 및/또는 다양한 용량(25 μCi, 50 μCi, 또는 100 μCi)의 분자 표적화된 방사선요법(MTRT) 제제 90Y-NM600으로 처리된 B78 흑색종 옆구리 종양 마우스에서 시간(일)의 함수로서 종양 부피(mm3)를 예시하는 그래프이다. 대조군 마우스에는 항-CTLA4 또는 MTRT 제제(PBS) 없는 비히클을 투여하였다. 50 또는 100 μCi의 90Y-NM600과 항-CTLA4로의 조합 처리는 PBS, 90Y-NM600 단독 또는 항-CTLA4 단독과 비교하여 유의하게(ANOVA p < 0.05) 감소된 종양 성장을 가졌다.
도 58은 항-CTLA4 면역 체크포인트 억제제(CTLA4) 및/또는 다양한 용량(25 μCi, 50 μCi, 또는 100 μCi)의 분자 표적화된 방사선요법(MTRT) 제제 90Y-NM600로 처리된 B78 흑색종 옆구리 종양 마우스에 대한 동물 생존 집계를 보여주는 그래프이다. MTRT(50 μCi 90Y-NM600 또는 100 μCi 90Y-NM600)와 체크포인트 차단제(항-CTLA4)의 조합이 투여된 마우스는 다른 군 대비 유의하게 증가된 생존을 나타냈다.
도 59는 항-CTLA4 면역 체크포인트 억제제(CTLA4) 및/또는 50 μCi의 분자 표적화된 방사선요법(MTRT) 제제 90Y-NM600로 처리된 NXS2 신경모세포종 종양 마우스에서 시간(일)의 함수로서 종양 부피(mm3)를 예시하는 그래프이다. 대조군 마우스에는 항-CTLA4 또는 TRT 제제 없는 비히클(PBS)을 투여하였다. 90Y-NM600 MTRT와 항-CTLA4로의 조합 처리는 PBS, 90Y-NM600 단독 또는 항-CTLA4 단독과 비교하여 종양 성장을 유의하게 감소시켰다.
도 60은 항-CTLA4 면역 체크포인트 억제제(CTLA4) 및/또는 50 μCi의 분자 표적화된 방사선요법(MTRT) 제제 90Y-NM600로 처리된 4T1 유방암 종양 마우스에서 시간(일)의 함수로서 종양 부피(mm3)를 예시하는 그래프이다. 대조군 마우스에는 항-CTLA4 또는 TRT 제제 없는 비히클(PBS)을 투여하였다. 90Y-NM600 MTRT와 항-CTLA4로의 조합 처리는 PBS, 90Y-NM600 단독 또는 항-CTLA4 단독과 비교하여 종양 성장을 유의하게 감소시켰다.
도 61은 일차 및 이차 (원위) 종양 둘 모두를 갖는 B78 흑색종 옆구리 종양 마우스에서 방사선 처리된 일차 B78 종양에 대한 시간(일)의 함수로서 종양 부피(mm3)를 예시하는 그래프이다. 마우스는 일차 종양만의 EBRT(12 Gy, 이차 종양은 차폐됨), 항-CTLA4 면역 체크포인트 억제제(CTLA4) 및/또는 50 μCi의 분자 표적화된 방사선요법(MTRT) 제제 90Y-NM600의 다양한 조합으로 처리하였다. 12 Gy EBRT, 90Y-NM600 MTRT 및 항-CTLA4의 조합 처리는 다른 군과 비교하여 유의하게 감소된 일차 종양 성장을 초래하였다.
도 62는 일차 및 이차 종양 둘 모두를 갖는 B78 흑색종 옆구리 종양 마우스에서 차폐된 이차(원위) B78 종양에 대한 시간(일)의 함수로서 종양 부피(mm3)를 예시하는 그래프이다. 마우스는 일차 종양만의 EBRT(12 Gy, 이차 종양은 차폐됨), 항-CTLA4 면역 체크포인트 억제제(CTLA4) 및/또는 50 μCi의 분자 표적화된 방사선요법(MTRT) 제제 90Y-NM600의 다양한 조합으로 처리하였다. 일차 종양에 대한 EBRT, 90Y-NM600 MTRT 및 항-CTLA4의 조합 처리는 다른 군과 비교하여 유의하게 감소된 이차 종양 성장을 초래하였다.
도 1은 기본 화합물 18-(p-요오도페닐)옥타데실 포스포콜린(NM404)의 화학 구조를 보여준다.
도 2a는 xRT + IT-IC가 인 시츄 종양 백신화를 유발함을 보여주는 그래프이다. 더욱 특히, 도 2a는 xRT과 IT-hu14.18-IL2 사이의 시너지를 보여주는 종양 성장 곡선을 보여준다. xRT + IT-IC로 처리된 마우스 중 71% (22/31)는 질병이 없는 상태가 된다.
도 2b는 xRT + IT-IC가 인 시츄 종양 백신화를 유발함을 보여주는 또 다른 그래프이다. 더욱 특히, 도 2b는 xRT과 IT-hu14.18-IL2 사이의 시너지를 보여주는 카플란-메이어 성장 곡선을 보여준다. xRT + IT-IC로 처리된 마우스 중 71% (22/31)는 질병이 없는 상태가 된다.
도 2c는 xRT + IT-IC가 인 시츄 종양 백신화를 유발함을 보여주는 또 다른 그래프이다. 더욱 특히, 도 2c는 처리된 마우스의 90%가 B78 흑색종에 의한 후속 생착을 거부함을 보여준다.
도 3은 수반 면역 내성을 나타내는 그래프이다. 일차 종양 반응이 제시된다. 원위의 치료되지 않은 종양은 2-종양 B78 흑색종 모델에서 xRT + IT-IC에 대한 반응을 억제하며, 이러한 억제는 두 번째 종양을 방사선 조사함으로써 극복될 수 있다.
도 4는 수반 면역 내성이 Treg로 인한 것임을 제시하는 그래프이다. 일차 종양 반응이 제시된다. 원위의 치료되지 않은 종양은 2-종양 B78 흑색종 모델에서 xRT + IT-IC에 대한 반응을 억제하며, 이러한 억제는 Treg를 고갈(Treg에서 디프테리아 독소 수용체를 발현하고, 이에 따라 디프테리아 독소를 투여함으로써 Treg를 고갈시키는 트랜스제닉 DEREG 마우스를 이용함)시킴으로써 극복될 수 있다.
도 5는 B78 흑색종에 의한 124I-NM404의 선택적 흡수를 제시하는 이미지이다. 약 200mm3의 B78 종양을 갖는 마우스에 124I-NM404가 IV 투여되었고, 일련의 PET/CT 스캔이 수행되었다. 71시간에서의 이러한 이미지는 심장 및 간에 의한 일부 잔여 배경 흡수와 함께 종양에 의한 선택적 흡수를 제시한다.
도 6은 인 시츄 백신화가 분자 표적화 방사선 요법(TRT)의 잔여 수준의 존재하에서 유도될 수 있음을 입증하는 그래프이다. 조합된 xRT + IT-IC를 이용한 치료는 3 μCi의 131I-NM404의 존재 또는 부재하에서 동등하게 효과적이다. 이는 실시예 4에 기재된 바와 같이 xRT(d0)에 이어 IT-IC(d6-10)를 전달하는 경우에 존재하는 TRT의 잔여 활성을 근사화한다.
도 7은 24시간까지의 종양(T)의 증강을 제시하는 Gd-NM600의 주입 후의 종양을 갖는 마우스의 시간 경과 MRI 이미지를 제시한다.
도 8a는 뮤린 흑색종 및 췌장 종양 모델에서 원위의 치료되지 않은 종양에 의한 국소 RT+IT-IC의 조합에 대한 일차 종양 반응의 종양-특이적 억제를 제시하는 그래프이다. 대측 옆구리에 동계의 디시알로강글리오시드를 발현하는(GD2+) 일차 옆구리 종양 +/- 이차 종양을 갖는 C57BL/6 마우스에 "1"일에서 xRT로 표시한 바와 같이 일차 종양에 대해서만 치료되었고, 6-10일에 50 mcg의 항-GD2 면역사이토카인(IC)인 hu14.18-IL2(항-GD2 mAb 및 IL2의 융합체)가 종양 내(IT) 주입되었다. 평균 일차 종양 부피가 도 8a에 제시된다. 더욱 특히, 도 8a는 일차 B78 흑색종 종양을 갖는 마우스에서, 치료되지 않은 이차 B78 종양의 존재가 RT+IT-IC에 대한 일차 종양 반응을 길항시켰음을 보여준다. 본 발명자는 이러한 효과를 xRT + IT-IC에 대한 치료된 종양의 국소 반응에 대한 치료되지 않은 원위 종양의 길항 효과인 "수반 면역 내성"으로 기재한다.
도 8b는 뮤린 흑색종 및 췌장 종양 모델에서 원위의 치료되지 않은 종양에 의한 국소 RT+IT-IC의 조합에 대한 일차 종양 반응의 종양-특이적 억제를 제시하는 또 다른 그래프이다. 대측 옆구리에 동계의 디시알로강글리오시드를 발현하는(GD2+) 일차 옆구리 종양 +/- 이차 종양을 갖는 C57BL/6 마우스에 "1"일에서 xRT로 표시한 바와 같이 일차 종양에 대해서만 치료되었고, 6-10일에 50 mcg의 항-GD2 면역사이토카인(IC)인 hu14.18-IL2(항-GD2 mAb 및 IL2의 융합체)가 종양 내(IT) 주입되었다. 더욱 특히, 도 8b는 마우스에 대한 카플란-마이어 생존 곡선 + 반복 실험을 제시한다. 거의 모든 마우스는 일차 종양 진행으로 인해 안락사되었다.
도 8c는 뮤린 흑색종 및 췌장 종양 모델에서 원위의 치료되지 않은 종양에 의한 국소 RT+IT-IC의 조합에 대한 일차 종양 반응의 종양-특이적 억제를 제시하는 또 다른 그래프이다. 대측 옆구리에 동계의 디시알로강글리오시드를 발현하는(GD2+) 일차 옆구리 종양 +/- 이차 종양을 갖는 C57BL/6 마우스에 "1"일에서 xRT로 표시한 바와 같이 일차 종양에 대해서만 치료되었고, 6-10일에 50 mcg의 항-GD2 면역사이토카인(IC)인 hu14.18-IL2(항-GD2 mAb 및 IL2의 융합체)가 종양 내(IT) 주입되었다. 더욱 특히, 도 8c는 반대쪽 옆구리에 이차 Panc02-GD2- 종양을 갖거나 갖지 않는 일차 Panc02-GD2+ 췌장 종양을 갖는 마우스에서, 치료되지 않은 Panc02 이차 종양의 존재가 RT+IT-IC에 대한 일차 Panc02-GD2+ 종양의 반응을 억제하였음을 보여준다.
도 8d는 뮤린 흑색종 및 췌장 종양 모델에서 원위의 치료되지 않은 종양에 의한 국소 RT+IT-IC의 조합에 대한 일차 종양 반응의 종양-특이적 억제를 제시하는 또 다른 그래프이다. 대측 옆구리에 동계의 디시알로강글리오시드를 발현하는(GD2+) 일차 옆구리 종양 +/- 이차 종양을 갖는 C57BL/6 마우스에 "1"일에서 xRT로 표시한 바와 같이 일차 종양에 대해서만 치료되었고, 6-10일에 50 mcg의 항-GD2 면역사이토카인(IC)인 hu14.18-IL2(항-GD2 mAb 및 IL2의 융합체)가 종양 내(IT) 주입되었다. 더욱 특히, 도 8d는 일차 B78 흑색종 종양을 갖는 마우스에서, 이차 B78 종양이 RT+IT-IC에 대한 일차 종양 반응을 억제하였으나, 이차 Panc02-GD2+ 췌장 종양은 이러한 효과를 나타내지 않았음을 보여준다.
도 8e는 뮤린 흑색종 및 췌장 종양 모델에서 원위의 치료되지 않은 종양에 의한 국소 RT+IT-IC의 조합에 대한 일차 종양 반응의 종양-특이적 억제를 제시하는 또 다른 그래프이다. 대측 옆구리에 동계의 디시알로강글리오시드를 발현하는(GD2+) 일차 옆구리 종양 +/- 이차 종양을 갖는 C57BL/6 마우스에 "1"일에서 xRT로 표시한 바와 같이 일차 종양에 대해서만 치료되었고, 6-10일에 50 mcg의 항-GD2 면역사이토카인(IC)인 hu14.18-IL2(항-GD2 mAb 및 IL2의 융합체)가 종양 내(IT) 주입되었다. 더욱 특히, 도 8e는 일차 Panc02-GD2+ 종양을 갖는 마우스에서, 이차 Panc02-GD2- 종양이 조합된 xRT 및 IT-hu14.18-IL2에 대한 일차 종양 반응을 억제한 반면, B78 이차 종양은 그렇지 않았음을 보여준다. NS = 유의하지 않음, ***p<0.001.
도 9a는 수반 면역 내성이 조절자 T 세포(Treg)의 특이적 고갈에 의해 회피되는 것을 제시하는 면역조직화학 이미지(왼쪽 및 중앙) 및 그래프(오른쪽)를 포함한다. 더욱 특히, 도 9a는 1개(도 9a, 가장왼쪽 패널 A1 및 A2) 또는 2개(도 9a, 중앙 패널 A3 및 A4)의 종양을 갖는 마우스에서 xRT 6일 후에 평가된 종양에 대한 Treg 마커인 FoxP3에 대한 면역조직화학(대표적 400x 이미지가 제시됨)을 제시한다. 마우스는 xRT를 투여하지 않거나, 일차 종양에만 xRT를 투여하였다. 일차 종양이 도 9a, 패널 A1-A3에 제시되고, 이차 종양이 도 9a, 패널 A4에 제시된다. 작은 화살표는 FoxP3+ 세포 중 일부를 지적한다(갈색 핵 = FoxP3+, 청색 = 헤마톡실린 대조염색). 우측 상의 그래프는 200x 필드 당 FoxP3+ 세포의 맹검된 정량화를 나타내며, 이는 도9a, 패널 A1, A2, A3 및 A4에 각각 제시된 조건에 해당한다.
도 9b는 수반 면역 내성이 조절자 T 세포(Treg)의 특이적 고갈에 의해 회피됨을 보여주는 또 다른 그래프이다. 더욱 특히, 도 9b는 DEREG 마우스가 Treg-특이적 FoxP3 프로모터의 제어 하에서 디프테리아 독소 수용체를 발현하며, 이는 디프테리아 독소의 IP 주입시 Treg의 특이적 고갈을 가능하게 함을 보여준다. 일차 및 이차 B78 흑색종 종양을 갖는 DEREG 마우스는 일차 종양에 xRT+IT-IC가 처리되었고, 디프테리아 독소 또는 PBS(반복 실험의 첫 번째가 제시됨)의 IP 주입이 처리되었다. 이들 마우스에서 Treg의 고갈 후에 수반 면역 내성이 제거되며, 이는 개선된 (도 9b) 일차 종양 반응을 발생시킨다. n=그룹 당 마우스의 수. **p<0.01, ***p<0.001.
도 9c는 수반 면역 내성이 조절자 T 세포(Treg)의 특이적 고갈에 의해 회피됨을 보여주는 또 다른 그래프이다. 더욱 특히, 도 9c는 DEREG 마우스가 Treg-특이적 FoxP3 프로모터의 제어 하에서 디프테리아 독소 수용체를 발현하며, 이는 디프테리아 독소의 IP 주입시 Treg의 특이적 고갈을 가능하게 함을 보여준다. 일차 및 이차 B78 흑색종 종양을 갖는 DEREG 마우스는 일차 종양에 xRT+IT-IC가 처리되었고, 디프테리아 독소 또는 PBS(반복 실험의 첫 번째가 제시됨)의 IP 주입이 처리되었다. 이들 마우스에서 Treg의 고갈 후에 수반 면역 내성이 제거되며, 이는 개선된 (도 9c) 이차 종양 반응을 발생시킨다. n=그룹 당 마우스의 수. **p<0.01, ***p<0.001.
도 10a는 수반 면역 내성이 두 종양 부위 모두로 xRT를 전달함으로써 극복되는 것을 제시하는 그래프이다. 일차 및 이차 B78 종양을 갖는 마우스에서, 이차 종양은 xRT + IT-IC를 이용한 일차 종양 치료에 대한 일차 종양 반응을 억제한다. 이는 일차 및 이차 종양 둘 모두에 12 Gy xRT를 전달하고, 일차 종양에 IT-IC를 전달함으로써 극복되며, 이는 반복 실험으로부터 개선된 (도 10a) 일차 종양 반응(반복 실험의 첫 번째가 제시됨)을 발생시킨다. n=그룹 당 마우스의 수. **p<0.01, ***p<0.001.
도 10b는 수반 면역 내성이 두 종양 부위 모두로 xRT를 전달함으로써 극복되는 것을 제시하는 또 다른 그래프이다. 일차 및 이차 B78 종양을 갖는 마우스에서, 이차 종양은 xRT + IT-IC를 이용한 일차 종양 치료에 대한 일차 종양 반응을 억제한다. 이는 일차 및 이차 종양 둘 모두에 12 Gy xRT를 전달하고, 일차 종양에 IT-IC를 전달함으로써 극복되며, 이는 반복 실험으로부터 개선된 (도 10b) 동물 생존 집계를 발생시킨다. n=그룹 당 마우스의 수. **p<0.01, ***p<0.001.
도 11a는 저 선량 xRT 단독이 인 시츄 백신화를 유도하지 않지만, 인 시츄 백신 부위의 12 Gy + IT-IC 치료와 함께 원위 종양 부위에 전달되는 경우에 수반 면역 내성을 극복하는 것을 제시하는 그래프이다. 더욱 특히, 도 11a는 일차 B78 종양 단독을 갖는 마우스에서, 12 Gy + IT-IC는 인 시츄 백신화를 유도하며(이전에 제시된 바와 같음), 대부분의 마우스(본 실험에서 4/6)에서 완전한 종양 회귀 및 기억 면역 반응을 발생시킴을 보여준다(Morris, Cancer Res, 2016). 다른 한편으로, IT-IC 단독 또는 저 선량(2 Gy) xRT + IT-IC 후에 동물은 완전한 종양 회귀를 나타내지 않는다(둘 모두의 그룹에서 0/6) p<0.05.
도 11b는 저 선량 xRT 단독이 인 시츄 백신화를 유도하지 않지만, 인 시츄 백신 부위의 12 Gy + IT-IC 치료와 함께 원위 종양 부위에 전달되는 경우에 수반 면역 내성을 극복하는 것을 제시하는 또 다른 그래프이다. 더욱 특히, 도 11b는 일차 및 이차 B78 흑색종 종양을 갖는 마우스에서, 이차 종양에 전달된 저 선량 xRT(2 Gy 또는 5 Gy)가 일차 종양에서 수반 면역 내성을 극복하는 능력에서 12 Gy와 동등함을 보여준다.
도 11c는 저 선량 xRT 단독이 인 시츄 백신화를 유도하지 않지만, 인 시츄 백신 부위의 12 Gy + IT-IC 치료와 함께 원위 종양 부위에 전달되는 경우에 수반 면역 내성을 극복하는 것을 제시하는 또 다른 그래프이다. 더욱 특히, 도 11c는 이들 동일한 동물에서, 이차 종양으로의 저 선량 xRT의 전달에 의해 수반 면역 내성을 극복하는 것이 IT-IC 면역요법에 대한 전신 반응을 구제하는 것이 명백함을 보여준다. 이러한 상황에서, xRT가 모든 종양 부위로 전달되는 경우, 일차 종양의 IT-IC 주입은 전신 항-종양 효과를 촉발시키며, 이는 2 Gy 또는 5 Gy에 대한 이차 종양 반응이 일차 종양 IT-IC 주입의 부재하에서 12 Gy xRT에 대한 반응보다 크도록 만든다.
도 12a는 131I-NM404를 이용한 저 선량 TRT가 전신성 백혈구감소증 또는 종양 침윤 CD8+ 이펙터 T 세포의 고갈 없이 종양 침윤 FoxP3+ Treg을 효과적으로 고갈시키는 것을 제시하는 PET 이미지이다. 대부분의 임상 시나리오에서, 면역억제를 초래할 수 있는 현저한 골수 고갈 및 백혈구감소증을 유도하지 않으면서 모든 종양 부위에 외부 광선을 저 선량이라도 전달하는 것은 가능하지 않다. 여기서, 본 발명자는 TRT가 전신 면역 세포 고갈 및 백혈구감소증을 촉발시키지 않으면서 종양 침윤 억제 면역 세포(Treg)를 특이적으로 고갈시키도록 전신 투여될 수 있는 지의 여부를 시험하였다. 더욱 특히, 도 12a는 양전자-방출 124I-NM404를 이용한 이러한 B78 흑색종 종양 모델에서의 선량측정 연구가 NM404의 종양-선택적 흡수를 확인함을 보여준다. B78 종양을 갖는 C57BL/6 마우스가 60 μCi 131I-NM404로 처리되었다. 이러한 활성은 B78 종양에 약 2 Gy TRT를 전달하는데 필요한 131I-NM404의 양을 근사화한다. 말초 혈액 및 종양 샘플이 처리되지 않은 대조군 마우스("C"로 명명됨) 및 이후 8일 간격(T1 = d8, T2 = d16, T3 = d24, T4 = d32)으로 수집되었다.
도 12b는 131I-NM404를 이용한 저 선량 TRT가 전신성 백혈구감소증 또는 종양 침윤 CD8+ 이펙터 T 세포의 고갈 없이 종양 침윤 FoxP3+ Treg을 효과적으로 고갈시키는 것을 제시하는 막대 그래프이다. 대부분의 임상 시나리오에서, 면역억제를 초래할 수 있는 현저한 골수 고갈 및 백혈구감소증을 유도하지 않으면서 모든 종양 부위에 외부 광선을 저 선량이라도 전달하는 것은 가능하지 않다. 여기서, 본 발명자는 TRT가 전신 면역 세포 고갈 및 백혈구감소증을 촉발시키지 않으면서 종양 침윤 억제 면역 세포(Treg)를 특이적으로 고갈시키도록 전신 투여될 수 있는 지의 여부를 시험하였다. 더욱 특히, 도 12b는 이러한 선량의 TRT가 임의의 유의한 전신 백혈구감소증을 발생시키지 않았음을 보여준다.
도 12c는 131I-NM404를 이용한 저 선량 TRT가 전신성 백혈구감소증 또는 종양 침윤 CD8+ 이펙터 T 세포의 고갈 없이 종양 침윤 FoxP3+ Treg을 효과적으로 고갈시키는 것을 제시하는 또 다른 막대 그래프이다. 대부분의 임상 시나리오에서, 면역억제를 초래할 수 있는 현저한 골수 고갈 및 백혈구감소증을 유도하지 않으면서 모든 종양 부위에 외부 광선을 저 선량이라도 전달하는 것은 가능하지 않다. 여기서, 본 발명자는 TRT가 전신 면역 세포 고갈 및 백혈구감소증을 촉발시키지 않으면서 종양 침윤 억제 면역 세포(Treg)를 특이적으로 고갈시키도록 전신 투여될 수 있는 지의 여부를 시험하였다. 더욱 특히, 도 12c는 이러한 선량의 TRT가 종양 침윤 CD8+ 이펙터 T 세포의 수준에 유의하게 영향을 미치지 않았음(ANOVA p=0.25)을 보여준다.
도 12d는 131I-NM404를 이용한 저 선량 TRT가 전신성 백혈구감소증 또는 종양 침윤 CD8+ 이펙터 T 세포의 고갈 없이 종양 침윤 FoxP3+ Treg을 효과적으로 고갈시키는 것을 제시하는 또 다른 막대 그래프이다. 대부분의 임상 시나리오에서, 면역억제를 초래할 수 있는 현저한 골수 고갈 및 백혈구감소증을 유도하지 않으면서 모든 종양 부위에 외부 광선을 저 선량이라도 전달하는 것은 가능하지 않다. 여기서, 본 발명자는 TRT가 전신 면역 세포 고갈 및 백혈구감소증을 촉발시키지 않으면서 종양 침윤 억제 면역 세포(Treg)를 특이적으로 고갈시키도록 전신 투여될 수 있는 지의 여부를 시험하였다. 더욱 특히, 도 12d는 종양 침윤 FoxP3+ Treg가 이러한 선량의 TRT에 의해 유의하게 고갈되었음(ANOVA p=0.03; * p<0.05)을 보여준다.
도 13a는 131I-NM404를 이용한 저 선량 TRT가 수반 면역 내성을 효과적으로 극복하고, 인 시츄 백신화의 전신 항-종양 효과를 구제하는 것을 제시하는 그래프이다. 마우스가 백혈구감소증 없이 종양-침윤 Treg을 고갈시키는 저 선량 131I-NM404 TRT의 능력을 감안하여, 본 발명자는 저 선량 131I-NM404가 수반 면역 내성을 효과적으로 극복할 수 있는지의 여부를 시험하였다. 2개의 B78 종양을 갖는 C57BL/6 마우스가 표시된 바와 같이 1일째에 60-mcCi 131I-NM404(NM404)로 처리되었다. 1 반감기(8일) 후, 동물은 일차 종양(인 시츄 백신 부위)에 12 Gy xRT가 투여되거나, xRT가 투여되지 않았다. 131I-NM404를 투여받지 않는 대조군 마우스는 표시된 바와 같이 이차 종양에 대해 처리되었다(0, 2, 또는 12 Gy). 마우스는 13-17일에 표시된 바와 같이 일차 종양(인 시츄 백신 부위)에 매일 IC가 IT 주입되었다. 더욱 특히, 도 13a는, 일차 종양 반응이 제시되며, 이는 저 선량 TRT의 투여가 수반 면역 내성을 효과적으로 극복하고, 인 시츄 백신화의 전신 항-종양 효과를 구제하는 것을 입증함을 보여준다.
도 13b는 131I-NM404를 이용한 저 선량 TRT가 수반 면역 내성을 효과적으로 극복하고, 인 시츄 백신화의 전신 항-종양 효과를 구제하는 것을 제시하는 또 다른 그래프이다. 마우스가 백혈구감소증 없이 종양-침윤 Treg을 고갈시키는 저 선량 131I-NM404 TRT의 능력을 감안하여, 본 발명자는 저 선량 131I-NM404가 수반 면역 내성을 효과적으로 극복할 수 있는지의 여부를 시험하였다. 2개의 B78 종양을 갖는 C57BL/6 마우스가 표시된 바와 같이 1일째에 60-mcCi 131I-NM404(NM404)로 처리되었다. 1 반감기(8일) 후, 동물은 일차 종양(인 시츄 백신 부위)에 12 Gy xRT가 투여되거나, xRT가 투여되지 않았다. 131I-NM404를 투여받지 않는 대조군 마우스는 표시된 바와 같이 이차 종양에 대해 처리되었다(0, 2, 또는 12 Gy). 마우스는 13-17일에 표시된 바와 같이 일차 종양(인 시츄 백신 부위)에 매일 IC가 IT 주입되었다. 더욱 특히, 도 13b는, 이차 종양 반응이 제시되며, 이는 저 선량 TRT의 투여가 수반 면역 내성을 효과적으로 극복하고, 인 시츄 백신화의 전신 항-종양 효과를 구제하는 것을 입증함을 보여준다.
도 14는 예시적 알킬포스포콜린 금속 킬레이트(64Cu-NM600)의 화학 구조를 제시한다. 다른 금속이 64Cu 대신 사용될 수 있다.
도 15는 86Y-NM600을 이용한 주입 48시간 후에 수행된 스캔으로부터의 2마리의 단일 종양 B78 마우스의 PET/CT 이미지이다.
도 16은 86Y-NM600을 이용한 주입 48시간 후에 수행된 스캔으로부터의 2마리의 2-종양 B78 마우스의 PET/CT 이미지이다.
도 17은 64Cu-NM600을 이용한 주입 3시간 후(좌측 패널), 24시간 후(중간 패널) 및 48시간 후(우측 패널)에 수행된 스캔으로부터의 U87MG 마우스에 대한 PET/CT 이미지를 포함한다. 상기 이미지는 주입된 용량/조직 g의 백분율(%ID/g, 맨 우측에 제시된 스케일)로 계산된 조직 활성을 제시한다.
도 18은 64Cu-NM600을 이용한 주입 3시간 후(좌측 패널), 24시간 후(중간 패널) 및 48시간 후(우측 패널)에 수행된 스캔으로부터의 4T1 마우스에 대한 PET/CT 이미지를 포함한다. 상기 이미지는 주입된 용량/조직 g의 백분율(%ID/g, 맨 우측에 제시된 스케일)로 계산된 조직 활성을 제시한다.
도 19는 64Cu-NM600을 이용한 주입 3시간 후(좌측 패널), 24시간 후(중간 패널) 및 48시간 후(우측 패널)에 수행된 스캔으로부터의 HCT-116 마우스에 대한 PET/CT 이미지를 포함한다. 상기 이미지는 주입된 용량/조직 g의 백분율(%ID/g, 맨 우측에 제시된 스케일)로 계산된 조직 활성을 제시한다.
도 20은 64Cu-NM600을 이용한 주입 3시간 후(좌측 패널), 24시간 후(중간 패널) 및 48시간 후(우측 패널)에 수행된 스캔으로부터의 A549 마우스에 대한 PET/CT 이미지를 포함한다. 상기 이미지는 주입된 용량/조직 g의 백분율(%ID/g, 맨 우측에 제시된 스케일)로 계산된 조직 활성을 제시한다.
도 21은 64Cu-NM600을 이용한 주입 3시간 후(좌측 패널), 24시간 후(중간 패널) 및 48시간 후(우측 패널)에 수행된 스캔으로부터의 PC-3 마우스에 대한 PET/CT 이미지를 포함한다. 상기 이미지는 주입된 용량/조직 g의 백분율(%ID/g, 맨 우측에 제시된 스케일)로 계산된 조직 활성을 제시한다.
도 22는 64Cu-NM600을 이용한 주입 3시간 후(좌측 패널), 24시간 후(중간 패널) 및 48시간 후(우측 패널)에 수행된 스캔으로부터의 HT-29 마우스에 대한 PET/CT 이미지를 포함한다. 상기 이미지는 주입된 용량/조직 g의 백분율(%ID/g, 맨 우측에 제시된 스케일)로 계산된 조직 활성을 제시한다.
도 23은 64Cu-NM600을 이용한 주입 3시간 후(좌측 패널), 24시간 후(중간 패널) 및 48시간 후(우측 패널)에 수행된 스캔으로부터의 MiaPaca 마우스에 대한 PET/CT 이미지를 포함한다. 상기 이미지는 주입된 용량/조직 g의 백분율(%ID/g, 맨 우측에 제시된 스케일)로 계산된 조직 활성을 제시한다.
도 24는 86Y-NM600을 이용한 주입 3시간 후(좌측 패널), 24시간 후(중간 패널) 및 48시간 후(우측 패널)에 수행된 스캔으로부터의 4T1 마우스에 대한 PET/CT 이미지를 포함한다. 상기 이미지는 주입된 용량/조직 g의 백분율(%ID/g, 맨 우측에 제시된 스케일)로 계산된 조직 활성을 제시한다.
도 25는 89Zr-NM600을 이용한 주입 3시간 후(좌측 패널), 24시간 후(중간 패널) 및 48시간 후(우측 패널)에 수행된 스캔으로부터의 4T1 마우스에 대한 PET/CT 이미지를 포함한다. 상기 이미지는 주입된 용량/조직 g의 백분율(%ID/g, 맨 우측에 제시된 스케일)로 계산된 조직 활성을 제시한다.
도 26은 52Mn-NM600을 이용한 주입 4시간 후(좌측 패널) 및 1일 후(우측 패널)에 수행된 스캔으로부터의 HT-29 마우스에 대한 PET/CT 이미지를 포함한다. 상기 이미지는 주입된 용량/조직 g의 백분율(%ID/g, 맨 우측에 제시된 스케일)로 계산된 조직 활성을 제시한다.
도 27은 52Mn-NM600을 이용한 주입 4시간 후(좌측 패널) 및 1일 후(우측 패널)에 수행된 스캔으로부터의 PC-3 마우스에 대한 PET/CT 이미지를 포함한다. 상기 이미지는 주입된 용량/조직 g의 백분율(%ID/g, 각각의 이미지의 우측에 제시된 스케일)로 계산된 조직 활성을 제시한다.
도 28은 52Mn-NM600을 이용한 주입 2일 후(좌측 패널), 3일 후(좌측으로부터 두 번째 패널), 5일 후(우측으로부터 두 번째 패널) 및 7일 후(우측 패널)에 수행된 스캔으로부터의 HT-29 마우스에 대한 PET/CT 이미지를 포함한다. 상기 이미지는 주입된 용량/조직 g의 백분율(%ID/g, 이미지의 우측에 제시된 스케일)로 계산된 조직 활성을 제시한다.
도 29는 52Mn-NM600을 이용한 주입 2일 후(좌측 패널), 3일 후(좌측으로부터 두 번째 패널), 5일 후(우측으로부터 두 번째 패널) 및 7일 후(우측 패널)에 수행된 스캔으로부터의 PC-3 마우스에 대한 PET/CT 이미지를 포함한다. 상기 이미지는 주입된 용량/조직 g의 백분율(%ID/g, 이미지의 우측에 제시된 스케일)로 계산된 조직 활성을 제시한다.
도 30은 86Y-NM600, 64Cu-NM600 및 89Zr-NM-600으로 주입된 4T1 마우스에서 4T1 종양 조직에 대한 PET 정량적 관심 영역 데이터(시간의 함수로서의 킬레이트 흡수)를 제시하는 그래프이다.
도 31은 86Y-NM600, 64Cu-NM600 및 89Zr-NM-600으로 주입된 4T1 마우스에서 심장 조직에 대한 PET 정량적 관심 영역 데이터(시간의 함수로서의 킬레이트 흡수)를 제시하는 그래프이다.
도 32는 86Y-NM600, 64Cu-NM600 및 89Zr-NM-600으로 주입된 4T1 마우스에서 간 조직에 대한 PET 정량적 관심 영역 데이터(시간의 함수로서의 킬레이트 흡수)를 제시하는 그래프이다.
도 33은 86Y-NM600, 64Cu-NM600 및 89Zr-NM-600으로 주입된 4T1 마우스에서 전신에 대한 PET 정량적 관심 영역 데이터(시간의 함수로서의 킬레이트 흡수)를 제시하는 그래프이다.
도 34는 금속 킬레이트의 주입 48시간 후(86Y-NM600, 64Cu-NM600, 89Zr-NM-600 및 177Lu-NM600) 및 96시간 후(177Lu-NM600)에 4T1 마우스에서 건강한 조직 및 종양 조직에서의 생체 외 킬레이트 생체분포를 예시하는 막대 그래프이다.
도 35는 예시적 알킬포스포콜린 금속 킬레이트(177Lu-NM600)의 화학 구조를 제시한다. 다른 금속이 177Lu 대신 사용될 수 있다.
도 36은 90Y-NM600을 이용한 주입 48시간 후에 수행된 3마리의 B78 마우스의 오디오래디오그래픽 이미지(audioradiographic image)이다. 이종이식된 B78 종양이 각각의 마우스 이미지의 우측 아래에 큰 어두운 반점으로 관찰된다.
도 37은 90Y-NM600을 이용한 주입 96시간 후에 수행된 3마리의 B78 마우스의 오디오래디오그래픽 이미지이다. 이종이식된 B78 종양이 각각의 마우스 이미지의 우측 아래에 큰 어두운 반점으로 관찰된다.
도 38은 177Lu-NM600을 이용한 주입 5일 후에 수행된 B78 마우스의 오디오래디오그래픽 이미지이다. 이종이식된 B78 종양이 마우스 이미지의 하단에 2개의 어두운 반점으로 관찰된다.
도 39는 177Lu-NM600을 이용한 주입 13일 후에 수행된 B78 마우스의 오디오래디오그래픽 이미지이다. 이종이식된 B78 종양이 마우스 이미지의 하단에 2개의 어두운 반점으로 관찰된다.
도 39는 177Lu-NM600을 이용한 주입 13일 후에 수행된 B78 마우스의 오디오래디오그래픽 이미지이다. 이종이식된 B78 종양이 마우스 이미지의 하단에 2개의 어두운 반점으로 관찰된다.
도 40은 177Lu-NM600을 이용한 주입 10일 후에 수행된 MiaPaca 마우스의 오디오래디오그래픽 이미지이다. 이종이식된 MiaPaca 종양의 위치는 화살표 및 파선 원으로 표시된다.
도 41은 177Lu-NM600을 이용한 주입 48시간 후에 수행된 3마리의 4T1 마우스의 오디오래디오그래픽 이미지이다. 이종이식된 4T1 종양의 위치는 화살표 및 파선 원으로 표시된다.
도 42는 177Lu-NM600을 이용한 주입 96시간 후에 수행된 3마리의 4T1 마우스의 오디오래디오그래픽 이미지이다. 이종이식된 4T1 종양의 위치는 파선 원으로 표시된다.
도 43은 90Y-NM600을 이용한 주입 4시간 후에 수행된 3마리의 4T1 마우스의 오디오래디오그래픽 이미지이다. 이종이식된 4T1 종양의 위치는 화살표 및 파선 원으로 표시된다.
도 44는 90Y-NM600을 이용한 주입 48시간 후에 수행된 3마리의 4T1 마우스의 오디오래디오그래픽 이미지이다. 이종이식된 4T1 종양이 각각의 마우스 이미지의 우측 아래에 큰 어두운 반점으로 관찰된다.
도 45는 90Y-NM600을 이용한 주입 96시간 후에 수행된 3마리의 4T1 마우스의 오디오래디오그래픽 이미지이다. 이종이식된 4T1 종양이 각각의 마우스 이미지의 우측 아래에 큰 어두운 반점으로 관찰된다.
도 46은 대조군(부형제 단독)에 비한 B78 이종이식 마우스 모델에서 2개의 상이한 선량(150 μCi 및 300 μCi)의 90Y-NM600의 방사선치료 효과를 예시하는 그래프이다. 데이터는 주입 후 일의 시간 함수로서 mm3 단위로 측정된 종양 부피로 제시된다.
도 47은 대조군(부형제 단독)에 비한 B78 이종이식 마우스 모델에서 177Lu-NM600의 단일 500 μCi 선량의 방사선치료 효과를 예시하는 그래프이다. 데이터는 주입 후 일의 시간 함수로서 mm3 단위로 측정된 종양 부피로 제시된다.
도 48은 대조군(부형제 단독)에 비한 MiaPaca 이종이식 마우스 모델에서 177Lu-NM600의 단일 400 μCi 선량의 방사선치료 효과를 예시하는 그래프이다. 데이터는 주입 후 일의 시간 함수로서 mm3 단위로 측정된 종양 부피로 제시된다.
도 49는 대조군(부형제 단독)에 비한 4T1 이종이식 마우스 모델에서 177Lu-NM600의 단일 500 μCi 선량의 방사선치료 효과를 예시하는 그래프이다. 데이터는 주입 후 일의 시간 함수로서 mm3 단위로 측정된 종양 부피로 제시된다. * P < 0.05; ** P < 0.01; *** P < 0.001.
도 50은 대조군(부형제 단독)에 비한 4T1 이종이식 마우스 모델에서 177Lu-NM600의 2개의 연속 선량(500 μCi 및 250 μCi)의 방사선치료 효과를 예시하는 그래프이다. 데이터는 주입 후 일의 시간 함수로서 mm3 단위로 측정된 종양 부피로 제시된다.
도 51은 대조군(부형제 단독)에 비한 4T1 이종이식 마우스 모델에서 2개의 상이한 선량(500 μCi 및 250 μCi)의 177Lu-NM600의 방사선치료 효과를 예시하는 그래프이다. 데이터는 주입 후 일의 시간 함수로서 mm3 단위로 측정된 종양 부피로 제시된다.
도 52는 통상적인 TRT에서의 90Y-NM600 및 131I-NM404의 비교 치료 효능에 대한 종양 질량의 영향을 예시하는 그래프이다.
도 53은 아민 유사체와 함께 NM404의 3개의 상이한 금속 킬레이트 유사체의 평균 알부민 결합 에너지를 비교하는 막대 그래프이다. 비교를 위해, I-NM404의 결합 에너지가 점선으로 제시된다.
도 54는 항-CTLA4 면역 체크포인트 억제제(CTLA4) 및/또는 다양한 용량(25 μCi, 50 μCi, 또는 100 μCi)의 표적화된 방사선요법(TRT) 제제 Y90-NM600로 처리된 B78 흑색종 옆구리 종양 마우스에서 시간(일)의 함수로서 종양 부피(mm3)를 예시하는 그래프이다. 대조군 마우스에는 항-CTLA4 또는 TRT 제제(PBS) 없는 비히클을 투여하였다. 18일 후, 50 또는 100 μCi의 Y90-NM600과 항-CTLA4의 조합 투여는 PBS, Y90-NM600 단독 또는 항-CTLA4 단독과 비교하여 종양 성장을 유의하게(ANOVA p< 0.05) 감소시켰다. 항-CTLA-4와의 25 μCi Y90-NM600 조합 처리 군은 용량 반응에 대한 경향을 보이는 중간 성장 지연 반응을 가졌다.
도 55는 TRT 단독, 체크포인트 차단제 단독(항-CTLA4) 또는 PBS 비히클 투여된 마우스와 비교하여, TRT(50 μCi Y90-NM600)와 체크포인트 차단제(항-CTLA4)의 조합물을 투여한 마우스에 대한 동물 생존 집계를 보여주는 그래프이다.
도 56은 TRT(25 μCi, 50 μCi, 및 100 μCi Y90-NM600)와 체크포인트 차단제(항-CTLA4)의 3개의 상이한 조합을 투여한 마우스에 대한 동물 생존 집계를 보여주는 그래프이다.
도 57은 항-CTLA4 면역 체크포인트 억제제(CTLA4) 및/또는 다양한 용량(25 μCi, 50 μCi, 또는 100 μCi)의 분자 표적화된 방사선요법(MTRT) 제제 90Y-NM600으로 처리된 B78 흑색종 옆구리 종양 마우스에서 시간(일)의 함수로서 종양 부피(mm3)를 예시하는 그래프이다. 대조군 마우스에는 항-CTLA4 또는 MTRT 제제(PBS) 없는 비히클을 투여하였다. 50 또는 100 μCi의 90Y-NM600과 항-CTLA4로의 조합 처리는 PBS, 90Y-NM600 단독 또는 항-CTLA4 단독과 비교하여 유의하게(ANOVA p < 0.05) 감소된 종양 성장을 가졌다.
도 58은 항-CTLA4 면역 체크포인트 억제제(CTLA4) 및/또는 다양한 용량(25 μCi, 50 μCi, 또는 100 μCi)의 분자 표적화된 방사선요법(MTRT) 제제 90Y-NM600로 처리된 B78 흑색종 옆구리 종양 마우스에 대한 동물 생존 집계를 보여주는 그래프이다. MTRT(50 μCi 90Y-NM600 또는 100 μCi 90Y-NM600)와 체크포인트 차단제(항-CTLA4)의 조합이 투여된 마우스는 다른 군 대비 유의하게 증가된 생존을 나타냈다.
도 59는 항-CTLA4 면역 체크포인트 억제제(CTLA4) 및/또는 50 μCi의 분자 표적화된 방사선요법(MTRT) 제제 90Y-NM600로 처리된 NXS2 신경모세포종 종양 마우스에서 시간(일)의 함수로서 종양 부피(mm3)를 예시하는 그래프이다. 대조군 마우스에는 항-CTLA4 또는 TRT 제제 없는 비히클(PBS)을 투여하였다. 90Y-NM600 MTRT와 항-CTLA4로의 조합 처리는 PBS, 90Y-NM600 단독 또는 항-CTLA4 단독과 비교하여 종양 성장을 유의하게 감소시켰다.
도 60은 항-CTLA4 면역 체크포인트 억제제(CTLA4) 및/또는 50 μCi의 분자 표적화된 방사선요법(MTRT) 제제 90Y-NM600로 처리된 4T1 유방암 종양 마우스에서 시간(일)의 함수로서 종양 부피(mm3)를 예시하는 그래프이다. 대조군 마우스에는 항-CTLA4 또는 TRT 제제 없는 비히클(PBS)을 투여하였다. 90Y-NM600 MTRT와 항-CTLA4로의 조합 처리는 PBS, 90Y-NM600 단독 또는 항-CTLA4 단독과 비교하여 종양 성장을 유의하게 감소시켰다.
도 61은 일차 및 이차 (원위) 종양 둘 모두를 갖는 B78 흑색종 옆구리 종양 마우스에서 방사선 처리된 일차 B78 종양에 대한 시간(일)의 함수로서 종양 부피(mm3)를 예시하는 그래프이다. 마우스는 일차 종양만의 EBRT(12 Gy, 이차 종양은 차폐됨), 항-CTLA4 면역 체크포인트 억제제(CTLA4) 및/또는 50 μCi의 분자 표적화된 방사선요법(MTRT) 제제 90Y-NM600의 다양한 조합으로 처리하였다. 12 Gy EBRT, 90Y-NM600 MTRT 및 항-CTLA4의 조합 처리는 다른 군과 비교하여 유의하게 감소된 일차 종양 성장을 초래하였다.
도 62는 일차 및 이차 종양 둘 모두를 갖는 B78 흑색종 옆구리 종양 마우스에서 차폐된 이차(원위) B78 종양에 대한 시간(일)의 함수로서 종양 부피(mm3)를 예시하는 그래프이다. 마우스는 일차 종양만의 EBRT(12 Gy, 이차 종양은 차폐됨), 항-CTLA4 면역 체크포인트 억제제(CTLA4) 및/또는 50 μCi의 분자 표적화된 방사선요법(MTRT) 제제 90Y-NM600의 다양한 조합으로 처리하였다. 일차 종양에 대한 EBRT, 90Y-NM600 MTRT 및 항-CTLA4의 조합 처리는 다른 군과 비교하여 유의하게 감소된 이차 종양 성장을 초래하였다.
I. 개괄
본 개시내용은 기재된 특정 방법, 프로토콜, 재료, 및 시약이 다양할 수 있기 때문에 이들 특정 방법, 프로토콜, 재료, 및 시약에 한정되지 않는 것이 이해된다. 본원에서 사용되는 용어는 단지 특정 구현예를 기재하기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니고, 본 발명의 범위는 추후에 제출된 임의의 정규 출원에 의해서만 제한될 것이다.
본원 및 첨부된 청구 범위에서 사용된 단수 형태는 문맥상 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수 대상물을 포함한다. 또한, 단수 형태, 용어 "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 용어 "포함하는" 및 이의 변형은 이러한 용어가 상세한 설명 및 청구 범위에 보이는 경우 제한적인 의미를 갖지 않는다. 따라서, 용어 "포함하는", "지니는" 및 "보유하는"은 상호교환적으로 사용될 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 이제 기재된다. 본원에 구체적으로 언급된 모든 간행물 및 특허는 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 간행물에 보고된 화학물질, 도구, 통계 분석 및 방법을 기재하고 개시하는 것을 포함하여 모든 목적을 위해 참조로서 포함된다. 본 명세서에 인용된 모든 참고문헌은 당 분야의 기술 수준을 나타내는 것으로 간주되어야 한다.
본원에 개시된 용어는 단지 구현예의 기재를 위한 것이며 본 발명을 전체적으로 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 달리 명시되지 않는 한, 단수 형태 및 "적어도 하나"는 상호교환적으로 사용되며, 하나 또는 하나 초과를 의미한다.
본 개시내용은 본원에 기재된 화합물(중간체 포함)을 이성질체(예를 들어, 부분입체 이성질체 및 거울상 이성질체), 토토머, 염, 용매화물, 다형태, 프로드러그 등을 포함하는 임의의 이들의 약학적으로 허용되는 형태로 포함한다. 특히, 화합물이 광학적으로 활성인 경우, 본 발명은 구체적으로 각 화합물의 거울상 이성질체 뿐만 아니라 거울상 이성질체의 라세미 혼합물을 포함한다. 용어 "화합물"은 명시적으로 언급되는 아니든 간에(때때로 "염"이 명시적으로 언급되더라도) 임의의 또는 모든 그러한 형태를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에서 사용되는 "약학적으로 허용되는"은 화합물 또는 조성물 또는 담체가, 치료의 필요성에 비추어 과도하게 해로운 부작용 없이, 본원에 기재된 치료를 달성하기 위해 대상체에게 투여하기에 적합하다는 것을 의미한다.
본원에 사용되는 용어 "유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 다른 임상의가 추구하는 대상체, 조직 또는 세포의 생물학적 또는 의학적 반응을 유도할 화합물의 양 또는 투여량을 나타낸다.
본원에서 사용되는 "약학적으로 허용되는 담체"는 임의의 및 모든 건조 분말, 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장제, 흡수 지연제 등을 포함한다. 약학적으로 허용되는 담체는 본 발명의 방법으로 화합물을 투여할 목적에 유용한 물질이며, 이는 바람직하게는 무독성이고, 달리 비활성이고 약학적으로 허용되며, 본 발명의 화합물과 양립되는 고체, 액체, 기체성 물질일 수 있다. 상기 담체의 예는 다양한 락토스, 만니톨, 오일, 예를 들어, 옥수수 오일, 완충액, 예를 들어, PBS, 염수, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 폴리프로필렌 글리콜, 디메틸설폭시드, 아미드, 예를 들어, 디메틸아세트아미드, 단백질, 예를 들어, 알부민, 및 세제, 예를 들어, Tween 80, 모노- 및 올리고다당류, 예를 들어, 글루코스, 락토스, 사이클로덱스트린 및 전분을 비제한적으로 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "투여하는" 또는 "투여"는 치료 또는 예방하려는 질병 또는 질환으로 고통받거나 걸릴 위험이 있는 대상체에게 본 발명의 화합물 또는 약학적 조성물을 제공하는 것을 나타낸다.
약리학에서의 투여 경로는 약물이 신체로 들어가는 경로이다. 투여 경로는 일반적으로 물질이 적용되는 위치에 의해 분류될 수 있다. 일반적인 예는 경구 및 정맥내 투여를 포함할 수 있다. 경로는 또한 작용 표적이 어디에 있는 지에 근거하여 분류될 수 있다. 작용은 국소(국부), 장관(전신 효과이지만, 위장관을 통해 전달됨), 또는 비경구(전신 작용이지만, GI 관 이외의 경로로 전달됨), 흡입에 의해 폐를 통한 것일 수 있다.
장관 투여에서, 요망되는 효과는 전신적(비-국소적)이며, 물질은 소화관을 통해 제공된다. 비경구 투여에서, 요망되는 효과는 전신적이며, 물질은 소화관 이외의 경로에 의해 제공된다.
장관 투여는 위장관의 임의의 부분을 수반하고 전신 효과가 있는 투여일 수 있다. 예는 입(경구)에 의한 것들, 정제, 캡슐 또는 점적액과 같은 많은 약물, 위 영양 튜브, 십이지장 영양 튜브, 또는 위조루술에 의한 것들, 많은 약물 및 경장 영양제, 및 직장으로의 것들, 좌제의 다양한 약물을 포함할 수 있다.
비경구 투여의 예는 정맥내(정맥으로), 예를 들어, 많은 약물, 동맥내(동맥으로) 총 비경구 영양, 예를 들어, 혈관경련수축의 치료에서 혈관확장 약물 및 색전증의 치료를 위한 혈전용해 약물, 골내 주입(골수로), 근내, 대뇌내(뇌 실질로), 대뇌실내(대뇌 심실 시스템으로), 경막내(척주관으로의 주입), 및 피하(피부 아래)를 포함할 수 있다. 이들 중에서, 골내 주입은, 골수가 정맥 시스템으로 직접 배출되므로 사실상 간접적인 정맥내 접근이다. 정맥내 접근이 어려울 때 약물 및 체액에 대한 골내 주입이 응급 의학과 및 소아과에서 때때로 사용될 수 있다.
하기 약어가 본 발명의 개시에서 사용된다: ADCC, 항체 의존성 세포-매개 세포독성; 항-CTL4, 세포독성 T 림프구(CTL)에서 발견된 세포독성 T 림프구-관련 항원 4(CTLA4)를 표적으로 하는 항체; B16, C57Bl/6 마우스와 동계의 흑색종; B78, GD2 신타제에 의한 형질감염으로 인해 GD2를 발현하는 B16의 변형; D, 일; Hu14.18-IL2, 실시예에 개시된 연구에서 사용되는 일차 면역사이토카인(GD2와 반응함); IC, 면역사이토라인(Immunocytoline)(IL2에 연결된 종양-반응성 mAb의 융합 단백질); ICI, 면역 체크포인트 억제제, IL2, 인터루킨 2; IT, 종양 내; IV, 정맥 내; mAb, 모노클로날 항체; MAHA, 마우스 항-인간 항체; 대부분의 종양에 의해 선택적으로 흡수되고, 실시예에 개시된 연구에서 TRT에 대해 사용되는, 도 1에 제시된 인지질 에테르를 지칭하는데 사용되는 NM404; 임의의 금속으로 킬레이트화될 수 있고, 대부분의 종양에 의해 또한 선택적으로 흡수되고, 실시예에 개시된 연구에서 TRT에 대해 사용되는, 도 14에 제시된 인지질 에테르를 지칭하는데 사용되는 NM600; NXS2, AJ 마우스에 동계인 신경모세포종; Panc02-GD2, GD2 신타제에 의한 형질감염으로 인해 GD2를 발현하는 C57Bl/6 마우스에 동계인 췌장암; PLE, 인지질 에테르; RT, 방사선 요법; TRT, 표적화된 방사선요법; W, 주; 9464D-GD2, GD2 신타제에 의한 형질감염으로 인해 GD2를 발현하는 C57B1/6 마우스에 동계인 신경모세포종.
II. 본 발명
본 발명의 개시는 하나 이상의 악성 고형 종양으로 소개되는 임의의 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 개시된 방법은 악성 고형 종양에 대한 훨씬 개선된 효과를 발생시키는 예상치 못한 상승작용으로 2개의 치료 단계를 조합한다. 구체적으로, 악성 고형 종양 조직에 의해 차별적으로 흡수되고, 그 안에 보유되는 방사성 인지질 금속 킬레이트 화합물 또는 방사성할로겐화된 인지질 화합물이 면역조절 용량으로 환자에게 투여되며, 추가의 면역조절이 면역자극 제제로 치료되는 악성 고형 종양 중 적어도 하나에 추가의 xRT와 함께 또는 추가 xRT 없이 특이적 면역 세포를 자극할 수 있는 하나 이상의 제제를 포함하는 조성물을 전신에 투여(예를 들어, IV 주입)함으로써 수행된다.
방사성 인지질 금속 킬레이트 또는 방사성할로겐화된 화합물의 면역조절 용량은 아마도 Treg 수준(및 다른 면역-억제 요소)을 감소시킬 수 있고, xRT가 종양에 대해 사용되고, 하나 이상의 추가 종양이 방사선 조사되지 않는 경우에 발생하는 면역계 댐프닝(수반 면역 내성)을 방지하나, 메커니즘의 이해는 본 발명을 실시하는데 필수적이지 않으며, 본 발명은 임의의 특정 작용 메커니즘으로 제한되지 않는다.
A. 전신-투여된 면역요법: 예시적인 면역자극 제제로서의 면역 체크포인트 억제제
면역조절제를 종양내로 직접적으로 투여함에 의한 면역자극 방법과 직접 대조적으로(예컨대, 하기 실시예 일부에 예시된 바와 같이, 인 시츄 백신화에 의한 종양내 면역화), 전신-투여 면역요법은 면역자극 제제를 전신 투여함으로써 수행된다. 면역자극 제제는 대상체의 전신을 통해 순환하여, 신체의 자연 면역 반응을 자극한다.
면역 체크포인트 억제제는 이러한 면역자극 제제의 비제한적 예이다. 활성화된 T 세포는 다중 면역 공동-억제 수용체, 예컨대 림프구-활성화 유전자 3(LAG-3), 프로그래밍된 세포 치사 단백질 1(PD-1) 및 세포독성 T-림프구-관련 단백질 4(CTLA4)를 발현한다. 이들 및 기타 면역 체크포인트 분자는 독특하고 비중복적인 경로를 통해 종양 미세환경에서 종양 항원에 대한 T 세포 반응을 조절하는 것으로 나타났다.
더욱 특히, 암 성장은 암에 의해 유도된 면역 억제에 의해 부분적으로 매개된다. 종양은 종양에 대한 일반적 면역 반응을 감소시키기 위해 억제성 면역 체크포인트 경로를 활성화시킬 수 있다. 따라서, 주요 면역 체크포인트 경로의 차단은 항-종양 면역성을 유도하여, 환자 자신의 면역 시스템을 촉진시킬 수 있다.
CTLA4는 CTLA4-표적화(항-CTLA4) mAb를 투여함에 의한, 임상적으로 표적화되는 일차 면역 체크포인트 분자이다. 현재까지, 암 치료를 위한 가장 유망한 면역 체크포인트 억제제 전략은 CTLA-4 및/또는 PD-1/PD-L1을 표적화하는 mAb를 투여하는 것을 포함한다. 기타 면역 체크포인트 억제제 전략은 현재 개발중이며, 개시된 조합 방법은 임의의 특정 면역 체크포인트 경로를 표적화하는 것에 제한되지 않는다.
체크포인트 억제제 및 암 면역요법을 다루는 일련의 검토는 문헌 [volume 276 of Immunological Reviews]에 최근 공개되었다. 도입 개요부[Sharpe, A.H., "Introduction to checkpoint inhibitors and cancer immunotherapy," Immunol Rev. 276 (4 March 2017): 5-8]를 포함하는 이러한 검토는 그 전체가 본원에 참조로 통합된다.
B. 방사성 인지질 금속 킬레이트 화합물의 면역조절 용량
사용되는 방사성 인지질 금속 킬레이트 화합물은 금속 킬레이트 화합물로 킬레이트화된 금속 동위원소에 의해 방출된 RT가 방출된 RT에 다른 조직 유형을 실질적으로 노출시키지 않으면서 악성 고형 종양 조직으로 향하도록 광범위한 고형 종양 세포 유형을 선택적으로 표적화해야 한다. 방사성 인지질 금속 킬레이트 화합물에 포함된 방사성 금속 동위원소는 화합물을 흡수하는 세포의 면역자극을 발생시키는 형태의 이온화 RT를 방출하는 것으로 공지된 임의의 방사성 금속 동위원소일 수 있다. 사용될 수 있는 방사성 금속 동위원소의 비제한적인 예는 Lu-177, Y-90, Ho-166, Re-186, Re-188, Cu-67, Au-199, Rh-105, Ra-223, Ac-225, Pb-212, 또는 Th-227을 포함한다.
방사성 인지질 금속 킬레이트 화합물의 면역조절 RT 선량(주입 선량과 반대)은 악성 고형 종양에 대한 통상적인 RT에 사용되는 선량보다 훨씬 적다. 구체적으로, 선량은 면역자극 효과를 담당하는 원하는 면역 세포는 제거하지 않으면서 종양 미세환경 내의 면역 세포에서의 반응을 자극(면역-억제 Treg 수준 또는 다른 면역억제 세포 또는 분자를 감소시킴에 의해 가능함)하기에 충분해야 한다.
적절한 면역조절 용량은 방사성 금속 킬레이트 화합물의 "검출-촉진" 용량을 투여한 후에 획득된 영상화 데이터로부터 계산될 수 있다. 검출-촉진 용량은 면역조절 용량과 매우 상이할 수 있으며, 방사성 금속 킬레이트 화합물로 킬레이트화되는 방사성 금속 동위원소는 상이할 수 있다(화합물 구조의 나머지는 동일해야 함). 검출 단계 및 선량측정 계산에서 사용되는 방사성 금속 동위원소는 통상적인 영상화 수단에 의해 용이하게 검출 가능한 형태의 RT를 방출하는 것으로 공지된 임의의 방사성 금속 동위원소일 수 있다. "통상적인 영상화 수단"의 비제한적인 예는 감마선 검출, PET 스캐닝, 및 SPECT 스캐닝을 포함한다. 사용될 수 있는 방사성 금속 동위원소의 비제한적인 예는 Ga-66, Cu-64, Y-86, Co-55, Zr-89, Sr-83, Mn-52, As-72, Sc-44, Ga-67, In-111, 또는 Tc-99m을 포함한다.
C. PLE 유사체의 금속 킬레이트
개시된 구조는 알킬포스포콜린(APC) 담체 백본을 이용한다. 일단 합성되면, 제제는 관련된 방사성할로겐화 화합물로 이전에 입증된 바와 같이 종양 선택성을 보존하면서 이들을 주입에 적합하게 만드는 제형화 특성을 가져야 한다. 개시된 구조는 방사성 금속 동위원소가 킬레이트화되어 최종 영상화 또는 치료제를 생성하는 킬레이트화 모이어티를 포함한다.
D. 예시적 M-PLE 유사체를 합성하는 방법
화합물 1의 제안된 합성이 하기 제시된다. 합성의 첫 번째 단계는 문헌[Org Synth, 2008, 85, 10-14]에 기재된 것과 유사하다. 합성은 사이클렌으로부터 시작하며, 이는 DO3A 트리스-Bn 에스테르로 전환된다. 이후, 이러한 중간체는 염기 및 Pd 촉매의 존재하에서 NM404와 컨쥬게이션된다. 최종적으로, 벤질 보호기는 촉매 수소화에 의해 제거된다.
화합물 2의 합성이 하기 제시된다. 이는 3-(브로모-프로프-1-이닐)-트리메틸실란으로 알킬화되는 DO3A 트리스-Bn 에스테르로 시작한다. 알킬화 후, 트리메틸실릴기가 제거되고, 중간체 아세틸렌이 소노가시라 반응(Sonogashira reaction)에 의해 NM404와 결합된다. 합성의 마지막 단계에서 벤질기가 제거되고, 동시에 삼중 결합이 수소화된다.
화합물 5 및 6은 하기 반응식에 제시된 바와 같이 동일한 전구체, DTPA 이무수화물 및 18-p-(3-하이드록시에틸-페닐)-옥타데실 포스포콜린으로부터 합성될 수 있다.
NOTA-NM404 컨쥬게이트는 유사한 방식으로 합성될 수 있다. NOTA-NM404 컨쥬게이트 7의 한 예는 다음과 같다:
E. 투여 형태 및 투여 방법
상승작용적 표적화된 RT의 경우, 임의의 투여 경로가 적합할 수 있다. 일 구현예에서, 개시된 알킬포스포콜린 유사체는 정맥내 주입을 통해 대상체에 투여될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 개시된 알킬포스포콜린 유사체는 임의의 다른 적합한 전신 전달, 예를 들어, 비경구, 비내, 설하, 직장, 또는 경피 투여를 통해 대상체에 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 개시된 알킬포스포콜린 유사체는, 예를 들어, 흡입에 의해 비강 시스템 또는 입을 통해 대상체에 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 개시된 알킬포스포콜린 유사체는 복강내 주입 또는 IP 주입을 통해 대상체에 투여될 수 있다.
특정 구현예에서, 개시된 알킬포스포콜린 유사체는 약학적으로 허용되는 염으로서 제공될 수 있다. 그러나, 다른 염이 알킬포스포콜린 유사체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 제조에 유용할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 염은, 예를 들어, 알킬포스포콜린 유사체의 용액을 염산, 황산, 메탄설폰산, 푸마르산, 말레산, 석신산, 아세트산, 벤조산, 옥살산, 시트르산, 타르타르산, 카르본산 또는 인산과 같은 약학적으로 허용되는 산의 용액과 혼합함으로써 형성될 수 있는 산 부가염을 비제한적으로 포함한다.
개시된 알킬포스포콜린 유사체가 적어도 하나의 비대칭 중심을 갖는 경우, 이들은 그에 따라 거울상 이성질체로서 존재할 수 있다. 개시된 알킬포스포콜린 유사체가 2개 이상의 비대칭 중심을 갖는 경우, 이들은 추가로 부분입체 이성질체로서 존재할 수 있다. 임의의 비율의 모든 그러한 이성질체 및 이의 혼합물이 본 발명의 개시의 범위 내에 포함되는 것이 이해되어야 한다.
본 발명의 개시는 또한 개시된 알킬포스포콜린 유사체 중 하나 이상을 약학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 약학적 조성물을 사용하는 방법을 포함한다. 바람직하게는, 이들 조성물은 비경구, 비내, 설하 또는 직장 투여용, 또는 흡입 또는 취입에 의한 투여용 정제, 환약, 캡슐, 분말, 과립, 멸균 비경구 용액 또는 현탁액, 계량된 에어로졸 또는 액체 스프레이, 점적제, 앰풀, 자동-주입기 장치 또는 좌제와 같은 단위 투여 형태이다.
정제와 같은 고체 조성물을 제조하기 위해, 주요 활성 성분은 약학적으로 허용되는 담체, 예를 들어, 통상적인 정제 성분, 예를 들어, 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 소르비톨, 탤크, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 디칼슘 포스페이트 또는 검, 및 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염에 대한 균질한 혼합물을 함유하는 고체 예비제형 조성물을 형성하기 위한 다른 약학적 희석제, 예를 들어, 물과 혼합된다. 이들 예비제형 조성물을 균질한 것으로 언급하는 경우, 활성 성분이 조성물 전체에 걸쳐 균일하게 분산되어 조성물이 정제, 환약 및 캡슐과 같은 동등하게 유효한 단위 투여 형태로 용이하게 세분될 수 있음을 의미한다. 이러한 고형 예비-제형 조성물은 이후 0.1 내지 약 500 mg의 본 발명의 활성 성분을 함유하는 상기 기재된 유형의 단위 투여 형태로 세분된다. 통상적인 단위 투여 형태는 1 내지 100 mg, 예를 들어, 1, 2, 5, 10, 25, 50 또는 100 mg의 활성 성분을 함유한다. 신규한 조성물의 정제 또는 환약은 코팅되거나, 연장된 작용의 장점을 제공하는 투여량을 제공하도록 달리 배합될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 환약은 내부 투여 및 외부 투여 성분을 포함할 수 있으며, 후자는 전자 상의 외피의 형태이다. 상기 두 성분은 위에서 붕괴에 저항하는 작용을 하며, 내부 성분이 십이지장으로 온전히 통과하거나 방출이 지연되는 것을 허용하는 장용성 층에 의해 분리될 수 있다. 상기 장용성 층 또는 코팅에 다양한 물질이 사용될 수 있으며, 상기 물질은 다수의 중합체 산 및 중합체 산과 셸락, 세틸 알콜 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 상기 물질의 혼합물을 포함한다.
알킬포스포콜린 유사체가 혼입될 수 있는 경구 또는 주입에 의한 투여를 위한 액체 형태는 수용액, 적합하게는 착향 시럽, 수성 또는 오일 현탁액, 및 식용유, 예를 들어, 면실유, 참깨유, 코코넛유 또는 땅콩유로 착향된 에멀젼, 뿐만 아니라 엘릭서(elixirs) 및 유사한 약학적 비히클을 포함한다. 수성 현탁액을 위한 적합한 분산제 또는 현탁화제는 트래거캔쓰, 아카시아, 알기네이트, 덱스트란, 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈 또는 젤라틴과 같은 합성 및 천연 검을 포함한다.
개시된 알킬포스포콜린 유사체는 주입 가능한 담체 시스템과 조합하는 것을 포함하여, 약학적으로 주입 가능한 투여 형태로 제형화될 때 특히 유용하다. 본원에서 사용되는 주입 가능한 및 주입 투여 형태(즉, 비경구 투여 형태)는 활성 약물 물질을 캡슐화하는 인지질을 갖는 리포솜 주입액 또는 지질 이중층 소포를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 주입액은 비경구용으로 의도된 멸균 제조물을 포함한다.
5개의 별개의 주입제 부류가 USP에 정의되어 있다: 에멀젼, 지질, 분말, 용액 및 현탁액. 에멀젼 주입액은 비경구로 투여되도록 의도된 멸균의 발열원-비함유 제조물을 포함하는 에멀젼을 포함한다. 용액 주입을 위한 지질 복합체 및 분말은 비경구용 용액을 형성하기 위한 재구성을 위해 의도된 멸균 제조물이다. 현탁액 주입을 위한 분말은 비경구용 현탁액을 형성하기 위한 재구성을 위해 의도된 멸균 제조물이다. 리포솜 현탁 주입액을 위해 동결건조된 분말은 지질 이중층 내에 또는 수성 공간에 활성 약물 물질을 캡슐화하는데 사용되는 인지질을 갖는 지질 이중층 소포와 같이, 리포솜의 혼입을 허용하는 방식으로 제형화된 비경구용 재구성을 위해 의도된 멸균 동결 건조된 제조물이며, 이로써 제형은 재구성시 형성될 수 있다. 용액 주입을 위해 동결건조된 분말은 동결건조("냉동 건조")에 의해 제조된 용액을 위해 의도된 투여 형태이며, 이 과정은 매우 낮은 압력에서 동결된 상태의 생성물로부터 물을 제거하는 것을 포함하며, 그 이후 액체의 첨가는 주입을 위한 요건의 모든 측면을 준수하는 용액을 생성한다. 현탁 주입액을 위해 동결건조된 분말은 적합한 유체 매질 중에 현탁된 고체를 함유하는 비경구용으로 의도된 액체 제조물이며, 이는 멸균 현탁액에 대한 요건의 모든 측면을 준수하고, 현탁액을 위해 의도된 약제는 동결건조에 의해 제조된다. 용액 주입액은 적합한 용매 또는 주입에 적합한 상호 혼화성 용매의 혼합물에 용해된 하나 이상의 약물 물질을 함유하는 액체 제조물을 포함한다.
용액 농축 주입액은 적합한 용매의 첨가시 주입을 위한 요건의 모든 측면을 준수하는 용액을 제공하는 비경구용 멸균 제조물을 포함한다. 현탁 주입액은 액체상의 전체에 걸쳐 분산된 고체 입자를 함유하는 액체 제조물(주입에 적합함)를 포함하며, 입자는 불용성이고, 이에 따라 오일상은 수성상 전체에 분산되거나 또는 그 반대로 된다. 현탁 리포솜 주입액은 리포솜(지질 이중층 내에 또는 수성 공간에 활성 약물 물질을 캡슐화하는데 사용되는 인지질을 일반적으로 함유하는 지질 이중층 소포)이 형성되는 방식으로 수성상 전체에 분산된 오일상을 갖는 액체 제조물(주입에 적합함)이다. 현탁 초음파처리된 주입액은 액체상 전체에 분산된 고체 입자를 함유하는 액체 제조물(주입에 적합함)이며, 이 때 입자는 불용성이다. 또한, 기체가 현탁액을 통해 버블링됨에 따라 생성물은 초음파처리되어 고체 입자에 의한 미소구체의 형성을 초래할 수 있다.
비경구 담체 시스템은 용매 및 공용매, 용해제, 습윤제, 현탁화제, 증점제, 에멀젼화제, 킬레이트제, 완충제, pH 조정제, 항산화제, 환원제, 항균 보존제, 증량제, 보호제, 장력 조정제, 및 특수 첨가제와 같은 하나 이상의 약학적으로 적합한 부형제를 포함한다.
하기 실시예는 예시 목적으로만 제공되며, 어떤 식으로든 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 아니다. 실제로, 본원에 제시되고 기재된 것 이외의 본 발명의 다양한 변형은 전술한 설명 및 하기 실시예로부터 당업자에게 명백할 것이며, 첨부된 청구 범위의 범위 내에 속한다.
III. 실시예
실시예에 대한 서론
이들 실시예는 예상치 못한 매우 강력한 상승작용을 이용하여 암 치료 연구에서 두 개의 매우 독특한 최첨단 분야를 함께 모으는 잠재성을 입증한다. 이들 분야는 1) 전신 투여되는 TRT 및 2) 국소-특이적인 항체-매개된 암 면역요법 또는 전신 투여 암 면역요법이다. 본원에 제시된 데이터는 이들 접근법을 조합함으로써 강력한 상승작용이 발생하는 것을 암시한다. 함께, 이들 두 가지 전략은 파괴된 암세포가 임의의 위치의 임의의 유형의 고형 종양에 대해 지속적인 잔류 전이성 질병을 근절시킬 수 있는 종양-특이적 T 세포 면역을 생성시키는 강력한 면역자극제로 작용하는 것을 가능하게 하는 방식으로 가시적인 육안적 종양을 파괴하기 위해 이용될 수 있다.
본 발명자의 진행 중인 전임상 연구는 종양-특이적 mAb와 IL2(선천 면역 세포를 활성화시키기 위함)의 조합이 신경모세포종을 갖는 아동에 대해 임상적으로 이익인 것으로 이미 해석된 과정[3]인 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)[1,2]을 증가시키는 것을 제시하였다. 최근의 전임상 데이터는 mAb-IL2 융합 단백질이 종양 내(IT) 주입되는 경우에 더 강력한 항종양 효능을 입증한다[4,5]. 놀랍게도, 이들 mAb/IL2 주입에 반응하지 않고, 국소 xRT로만 치료되는 경우 계속 성장하는 큰 종양이, xRT가 mAb/IL2 치료와 조합되는 경우에 완전히 근절될 수 있다. 대부분의 마우스는 치료되며, 유사한 종양 세포로의 재-공격을 거부하는 T 세포 기억을 발달시키며[6]; 이는 조합된 xRT + mAb/IL2가 강력한 "인 시츄" 항암 백신으로 작용하는 것을 입증한다.
중요한 제한은 동물이 일차(첫 번째) 종양에 xRT+ mAb/IL2 치료를 받는 경우에 이들 동물에 존재하는 또 다른 육안적 종양이 존재하는 경우, 두 번째 종양이 계속 성장하여, 놀랍게도 면역 반응을 억제하고 첫 번째 치료된 종양의 임의의 수축을 방지한다는 점이다. 이러한 "수반 면역 내성"은 부분적으로 두 번째 종양의 억제성 조절 T 세포(Treg)로부터 발생한다. 두 종양 모두에 RT만 전달하는 것은 최소의 항종양 효과를 가지나, 이들 Treg을 고갈시킨다. 따라서, 첫 번째 종양이 xRT + mAb/IL2로 치료되는 경우, 두 번째 종양으로의 RT의 추가는 상기 면역 내성을 회피하여 둘 모두의 종양의 근절을 가능하게 한다[7]. 이들 관찰은 전이성 환경에서의 인 시츄 종양 백신화의 한계를 나타내지만, 또한 상기 한계를 극복하는 RT의 확실한 능력을 암시한다.
xRT는 통상적으로 금지된 정상 조직 독성 및 면역 억제 없이 모든 전이 부위에 전달될 수 없다. 그러나, 육안적 질병의 모든 부위에 xRT를 전달하지 않으면 억제 면역 계통을 온전하게 남길 수 있으며, 이는 본 발명의 국소 xRT + mAb/IL2 면역요법에 대한 면역학적 반응을 억제할 수 있다. 따라서, 필요한 것은 암 환자의 모든 종양 부위에 RT를 표적화된 방식으로 전달하는 수단이다.
본 발명자는 일차 및 전이성 암 둘 모두에 전신 투여되는 RT를 표적화할 수 있는 TRT 비히클을 개발하였다. 정맥내(IV) 투여되는 인지질 에테르(PLE) 유사체인 하나의 상기 TRT 제제 131I-NM404는 60개가 넘는 생체 내 암 및 암 줄기세포 모델에서 거의 보편적인 종양 표적화 특성을 나타내었다. 이러한 제제는 현재 다수의 영상화 및 요법 시험에서 임상적으로 평가되고 있다[8,9]. 131I-NM404의 전신 주입은 해부학적 위치에 관계없이 모든 종양에서 국소화되며, 효과적인 종양-근절 면역 반응의 발달을 방지할 수 있는 종양 내 면역억제 경로를 제거하기에 충분한 RT를 내부적으로 제공한다. 이러한 접근법의 독특한 특성은 NM404의 거의 보편적인 종양 표적화 능력뿐만 아니라 통상적으로 xRT로 실행할 수 없는 것인 모든 종양 부위로의 면역조절성의 거의 치사량에 가까운 선량을 전달하는 능력이다. 이에 대한 새로운 점은 본 발명의 TRT 제제가 해부학적 위치에 관계없이 모든 종양을 면역 조절하여 수반 내성을 극복할 수 있으며, 이는 국소 xRT에 이은 종양 특이적 mAb + IL2의 주입 후에 장기간의 인 시츄 종양 백신화 효과를 발생시킨다는 점이다. 증가하는 수의 종양 특이적 mAb가 임상 용도로 승인되기 시작함에 따라, 이러한 조합 전략은 종양-반응성 mAb에 의해 표적화될 수 있는 임의의 종양 유형에 대한 확대된 접근법을 제공한다. 또한, 상기 접근법은 모든 인 시츄 종양 백신화 전략에 용이하게 일반화될 수 있다.
최근에, 본 발명자는 131I-NM404 내의 요오드가 다양한 금속 영상화(MRI 및 PET) 및 TRT 방사선요법 모이어티를 운반할 수 있는 킬레이트제로 치환될 수 있음을 발견하였다. 이들 예에서, 본 발명자는 암성 고형 종양에 대한 강력한 방사면역-촉진된 반응을 유도하기 위해 조합된 xRT + mAb/면역요법 치료를 가능하게 하는데 필요한 전신 면역조절 반응을 개시하는 131I-NM404(및 이에 따라 관련 금속 킬레이트 유사체)의 능력을 평가하는 방법을 기재한다. 유사한 접근법이 암성 고형 종양에 대하여 사용된 다른 면역요법 방법과 조합된 PLE 유사체-전달되는 TRT에 대해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명자는 조합 방법이 국소 인 시츄 종양 백신화와는 상당히 상이한 면역조절 단계를 사용할 수 있음을 하기에 설명하였다: 면역 체크포인트 억제제와 같은 면역자극 제제의 전신 투여.
요컨대, 본 발명자는 외관상 단절된 암 치료 분야로부터의 2개의 상이한 방법을 단일한 통합된 치료법으로 조합하는 치료 및 연구 과정을 본원에 개시한다. 이들 실시예에 제시된 데이터는 두 방법이 상승작용적으로 조합되어 악성 고형 종양을 효과적으로 제거하고, 종양 재발을 방지할 수 있음을 나타낸다.
실시예 1에서, 본 발명자는 본 발명의 방법의 지원하에서 본 발명의 B78 GD2+ 모델로부터의 배경 데이터를 제시한다.
실시예 2에서, 본 발명자는 일차 종양에 대한 최적의 인 시츄 백신 효과에 필요한 xRT의 선량, 및 수반 면역 내성을 방지하는데 필요한 원위 종양에 대한 xRT의 가장 낮은 선량을 결정하기 위한 지침을 제공한다.
실시예 3에서, 본 발명자는 실시예 2에서 결정된 바와 같은 전이에 필요한 xRT의 선량을 근사화한 131I-NM404 선량을 결정하고, 이후 생체 내 면역 기능에 대한 상기 131I-NM404 선량의 효과를 평가하기 위한 지침을 제공한다. 상기 지침은 TRT 제제로서 개시된 방사성 인지질 금속 킬레이트 화합물을 이용하는 경우에 유사하게 적용될 수 있다.
실시예 4에서, 본 발명자는 실시예 2 및 3으로부터의 데이터를 이용하여 국소 치료되는 종양을 파괴하고, 모든 원위 종양의 T-세포 매개 근절을 유도하기 위해 두개 이상의 종양을 갖는 마우스에서 131I-NM404 + 국소 xRT + IT-mAb/IL2의 요법을 설계/시험/개발하기 위한 지침을 제공한다. TRT 및 xRT 선량 및 시간의 중요한 문제는 항종양 효능에 대해 최적화된다. 또한, 상기 지침은 TRT 제제로서 개시된 방사성 인지질 금속 킬레이트 화합물을 이용하는 경우에 유사하게 적용될 수 있다.
실시예 5에서, 본 발명자는 방사성 금속 동위원소를 킬레이트화하는 유사한 화합물의 합성에 또한 이용되는 예시적 합성을 제공한다.
실시예 6에서, 본 발명자는 킬레이트제 및 NM404의 요오드 모이어티에 대해 치환된 킬레이트화된 금속(Gd-NM600)을 갖는 유사체가 고형 종양 조직에 의해 흡수(및 고형 종양 조직에서 영상화될 수 있음)되고, 이에 따라 TRT 제제로서 개시된 금속 킬레이트를 이용하기 위한 개념 증명을 제공하는 것을 입증한다.
실시예 7, 8, 9 및 10에서, 본 발명자는 실시예 1-4의 지침에 따라 수행된 실험 연구로부터의 정보 및 특정 데이터를 제공한다.
실시예 11 및 12에서, 본 발명자는 킬레이트제 및 NM404의 요오드 모이어티에 대해 치환된 킬레이트화된 금속을 갖는 추가 유사체가 생체 내 모델에서 다양한 고형 종양에 의해 흡수되고, 다양한 고형 종양에서 영상화될 수 있고, 다양한 고형 종양에서 TRT에 대해 치료적으로 사용될 수 있어, 이에 따라 개시된 방법에서 TRT 제제로서 개시된 금속 킬레이트를 사용하기 위한 추가의 개념 증명을 제공함을 입증한다.
실시예 13에서, 본 발명자는 임의의 고형 종양에 대한 치료 조사 적량을 최적화시키기 위해 공지된 방사선민감도와 조합된 선량측정이 당업자에 의해 이용될 수 있는 방법을 논의한다.
실시예 14에서, 본 발명자는 실시예 1-4 및 7-10에서 예시된 요오드화 화합물보다는 개시된 방법에서 알킬포스포콜린 금속 킬레이트를 사용하는데 있어서의 차이 및 장점을 논의한다.
실시예 15 및 16에서, 본 발명자는 인 시츄 백신화보다는 전신-투여된 면역요법과 조합되는 TRT가 고형 종양 치료에 또한 효과적임을 입증한다. 전신 투여되는 면역자극 제제는 면역 체크포인트 차단제 또는 억제제(이러한 경우, 항-CTLA4)일 수 있다.
실시예 1: 배경 지원 데이터
Sondel 연구실은 종양-특이적 mAb + IL2가 마우스에서 선천 면역 반응을 활성화시켜 ADCC를 매개하며[2], 이는 신경모세포종을 갖는 아동에 대해 임상적 이점이 있음[3]을 제시하였다. 마우스에서, hu14.18-IL2의 IV 투여는 항-GD2 mAb + IL2의 IV 투여보다 더 강력하다[2, 10]. 이는 매우 작은 최근에 확립된 GD2+ 종양 또는 매우 작은 현미경적 전이에 대해 극적인 항종양 효과를 제공할 수 있으며, 이는 완화 상태이나 재발의 위험이 큰 환자에서 상기 접근법의 임상적 사용을 잠재적으로 설명한다[3]. 측정 가능한 육안적 종양[즉, 약 50 mm3의 GD2+ 종양]에 대한 더욱 강력한 항종양 효능은 IC가 IV보다 종양 내 주입(IT-IC)되는 경우에 달성될 수 있다[4,5].
본 발명자는 이제 훨씬 더 큰 육안적 종양의 환경에서의 이점을 제공하는 방식에 초점을 둔다. 5주 전에 확립된 중간 크기의 큰(200 mm3) B78 흑색종 종양을 갖는 마우스는 IV-IC에 대한 반응을 나타내지 않으며, IT-IC에 의해 성장이 둔화되나, 종양은 계속 성장한다. 이들 동일한 200 mm3 종양은 또한 12 Gy의 xRT 후에 성장한다. 대조적으로, IT-IC 및 xRT가 조합되는 경우, 동물의 73%는 종양이 없어지고, 질병이 치료된 것으로 보인다(도 2a 및 2b). 이후, 이들 마우스는 동일 종양을 이용한 재공격의 T-세포 매개 거부를 나타낸다(도 2c). 따라서, IT-IC + xRT는 상증작용하여 종양이 "인 시츄 종양 백신"이 되는 것을 유도한다[6].
임상 전이를 시뮬레이션하기 위해, 본 발명자는 1일에 한쪽 옆구리에 B78로 마우스를 접종시키고, 2주에서 다른쪽 옆구리에 접종시켰다. 5주에서, 첫 번째 종양은 200 mm3이고, 두 번째 종양은 50 mm3이다. 본 발명자는 xRT + IT-IC가 첫 번째 종양을 파괴하고, 발생된 T 세포 반응이 이후 두 번째 종양을 파괴할 것으로 예상하였다. 그러나, xRT에 IT-IC를 추가하는 것은 50 mm3 종양 또는 200 mm3 종양에 실질적으로 영향을 미치지 않았다(도 3). 이는 본 발명자가 전달한 요법에 대한 핵심 한계를 나타내었으며, 즉, 이들 마우스가 첫 번째 종양에 xRT + IT-IC가 투여되는 경우에 또 다른 종양이 존재하는 경우, 두 번째 종양은 전신성 종양-특이적 수반 면역 내성 효과를 야기시켜, 어느 한 종양의 임의의 수축을 방지할 것이다. 중요하게는, 본 발명자는 첫 번째 및 두 번째 종양에 대한 동시적인 국소 xRT(12 Gy)가 상기 내성 효과를 폐기하여 첫 번째 종양에 대한 IT-IC가 대부분의 마우스에서 둘 모두의 종양을 근절시키는 면역 반응을 유도함을 발견하였다(도 4)[7]. Treg 고갈 mAb(제시되지 않음) 또는 선택적 Treg 고갈을 가능하게 하는 트랜스제닉 마우스(도 4)를 이용한 최근의 데이터[7]는 이러한 면역 내성이 부분적으로 조절 T 세포(Treg)에 의해 매개되는 것을 입증하며; 첫 번째 및 두 번째 종양에 대한 RT는 이들 Treg를 부분적으로 고갈시키고, 이는 둘 모두의 종양을 방사선 조사하는 것이 내성 효과를 어떻게 회피하는지 잠재적으로 설명한다[7].
첫 번째 및 두 번째 종양 둘 모두에 대한 국소 xRT는 내성을 회피하는 반면, 임상 전이 질병은 종종 여러 위치에 존재한다. 모든 육안적 전이 질병은 면역 내성을 차단하고, xRT + IT-IC가 모든 종양 부위를 효과적으로 근절시키는 것을 가능하게 하기 위해 RT가 제공되어야 한다. 그러나, 질병의 모든 부위로의 12 Gy xRT의 전달은 주요 선량-의존적(잠재적으로는 치명적인) 독성 및 현저한 전신 면역 억제가 있는 "전신 RT"와 유사할 수 있다.
이전에, Weichert 연구실은 정상 조직(특히, 골수 및 면역 조직)에 대한 "표적-외" RT를 최소화하면서 모든 전신 종양 부위에 RT를 전달하기 위해 TRT의 개발을 개척하였다.
종양 세포가 과량의 인지질 에테르(PLE)를 함유한다는 발견을 기초로 하여[11], 본 발명자는 종양을 선택적으로 표적으로 하는 유사체를 확인하기 위해 30개가 넘는 방사성요오드화 PLE 유사체를 합성하였다[12]. 이들 중 하나인 NM404는 뇌 전이 및 암 줄기세포를 포함하는 해부학적 위치와 관계없이 시험된 70개가 넘는 생체 내 모델 중 3개를 제외한 전부에서 거의 보편적인 종양 흡수를 나타내었을 뿐만 아니라, 종양 세포에 진입시 장기간의 선택적 보유를 겪었다[8]. 이들 디아퓨틱(diapeutic) PLE 유사체는 이들이 전암성 및 염증성 병변을 회피한다는 점에서 독특하다. 정상 세포에 비해 암 세포에서 과발현되는 표면 막 지질 뗏목(lipid raft)은 NM404를 포함하는 PLE의 암 및 암 줄기세포로의 진입의 입구 역할을 한다[8]. 5개의 1 단계 및 2 단계 PET 영상화 시험 및 3개의 1 단계 TRT 방사선요법 시험에서 이제 평가된 방사성요오드화 NM404(I-124 및 I-131)은 각각 12개 이상의 인간 암 유형에서 유사한 종양 흡수 및 보유 특성을 제공한다[8]. 이들 실시예와 관련된 암 모델(B78 GD2+ 뮤린 흑색종)에서의 우수한 종양 흡수가 124I-NM404 PET 영상화로 확인되었다(도 5).
실시예 2: xRT의 조사 적량 결정
본 발명의 데이터는 다음과 같은 4개의 가설을 제시한다: (1) 단일 종양을 치료하기 위해 본 발명자가 사용한 xRT의 선량은 적당한 직접적인 생체 내 종양 사멸을 유도하고, 면역 매개 사멸(ADCC 및 T 세포 둘 모두를 통함)에 대한 감수성을 증가시키고; (2) IT-IC의 첨가에 의해 제공되나 IT mAb의 첨가에 의해 제공되지 않는 강한 T-세포 반응은 IL2의 존재하에서의 방사선 조사된 종양 세포에 대한 mAb 결합이 항원 제시 및 적응 면역의 증강된 유도를 촉진하는 것을 암시하고; (3) 두 번째 종양의 존재는 두 번째 종양에 존재하는 면역억제 세포[예를 들어, Treg 및 가능하게는 골수모양 유래 억제 세포(MDSC)]의 전신 작용에 의해 대부분 야기되는 내성으로 인해 첫 번째 종양에 대한 xRT + IT-IC가 실질적으로 임의의 항-종양 효과를 발생시키는 것을 방지하며; 이러한 내성은 Treg의 고갈(도 4) 또는 두 번째 종양의 방사선 조사에 의해 회피될 수 있고(도 3); (4) 내성을 회피하기 위해 두 번째 종양에 필요한 RT의 선량은 "인 시츄 백신"이 되기 위해 첫 번째 종양에 대해 필요한 xRT 선량보다 훨씬 적을 수 있다[14].
일차("인 시츄 백신") 종양 부위에 대한 xRT 선량 최적화.
xRT + IT-IC의 본 발명의 생체 내 연구는 첫 번째 종양으로의 12 Gy의 1회 선량에 집중하였다. 이는 xRT + IT-IC의 본 발명의 인 시츄 백신 효과가 기능성 Fas-L을 갖는 마우스를 필요로 함을 입증하는 본 발명의 생체 내 데이터와 결부된, 시험관 내 RT가 B78 종양 세포에서 Fas의 선량-의존적 기능적 상향조절(>12 Gy에 근접한 피크)을 유도하는 것을 제시하는 본 발명의 데이터를 기초로 한다(6). 본 발명자는 12 Gy 선량을 선택하기 전에 생체 내 파일럿 연구를 수행하였고, 이는 더 높은 선량(16 Gy) 또는 증가된 분획의 옆구리 RT가 독성(피부염, 궤양형성, 및 후기 사지 부종)을 갖고, 종양 반응에 개선이 없음을 나타내었다. 본 발명자는 본 발명의 생체 내 연구를 위해 12 Gy 단일 분획의 xRT를 선택하였으나, 본 발명자가 임상 해석을 진행함에 따라, 인 시츄 백신 효과를 안전하고 효과적으로 유도하기 위해 국소 xRT 효과의 메커니즘 및 이의 선량 요구사항을 더 잘 이해하는 것이 도움이 될 것이다.
본 발명의 마우스 데이터(도 2a, 2b 및 2c)는 12 Gy의 xRT 단독이 종양의 수축을 야기시키지 않고, 단지 진행 성장을 둔화시키지만, 본 발명자가 12 Gy xRT + IT-IC로 강력한 백신 효과를 유도할 수 있음을 제시한다. 본 발명자는 더 낮은 선량의 RT를 이용한 인 시츄 백신 효과를 마찬가지로 강력한 것으로 생각한다. 이를 시험하기 위해, 본 발명자는 약 200 mm3 B78 종양을 갖는 마우스에서 단일 분획으로서 다양한 xRT 선량(4 내지 16 Gy)을 평가한 후, 본 발명의 표준 IT-IC 요법(6-10일에 50 mcg/d)을 평가할 것이다. 본 발명자는 IT-IC와 조합하는 경우 xRT 선량이 최적 종양 근절 및 T-세포 기억을 제공하는지 결정할 것이다. 12 Gy보다 낮은 선량이 독성이 덜하고, 동등한 효능을 나타내는 경우, 상기 낮은 선량이 실시예 3 및 4에서 "인 시츄 백신" 부위에 대한 본 발명의 xRT 선량에 대한 더 나은 표적일 것이다. 특정 표적 또는 대상체에 대한 선량을 최적화시키기 위해 유사한 접근법이 이용될 수 있다.
"인 시츄 백신화" 차단으로부터의 내성을 방지하기 위한 원위의 종양에서의 xRT 선량 최적화.
12 Gy로 첫 번째 및 두 번째 종양 둘 모두를 처리(도 3)하는 것은 첫 번째 종양에 대한 IT-IC가 둘 모두의 종양을 근절시키는 강력한 반응을 유도하는 것을 가능하게 한다. 본 발명의 목적은 내성을 회피하기 위해 전이 부위에 필요한 최소 RT 선량을 이용하면서 단일 종양에 xRT + IT-IC를 제공함으로써 상기 동일한 인 시츄 백신 효과를 달성할 수 있는 것이다. 본 발명자는 xRT 자체가 특히 널리 퍼진 경우 골수/면역억제성일 수 있음을 인지한다. 이것이 실시예 3 및 4에서 본 발명자가 TRT를 추구하는 이유이다. 비록 표적화되나, TRT는 RT의 일부 전신 전달을 갖는다. TRT로부터의 전신 면역 억제를 최소화하기 위해, 본 발명자는 전신 RT-유도 전체 면역 억제를 야기시키지 않으면서 종양-유도 면역 내성을 효과적으로 억제하는데 필요한 만큼 낮은 선량의 TRT를 제공하고자 한다. 따라서, 첫 번째 종양에 대한 더 높은 xRT 선량이 첫 번째 종양에 대한 IT-IC와 조합되는 경우 인 시츄 백신으로서 기능하는 것을 가능하도록 하기 위해 원위 종양에 전달되는데 필요한 xRT의 가장 낮은 선량을 선택하는 것이 가장 좋다.
예시적 최적화 실험으로서, 200 mm3의 첫 번째 B78 종양 및 약 50 mm3의 두 번째 B78 종양을 갖는 마우스에 0일(첫 번째 B78 종양의 이식 약 5주 후)에 첫 번째 종양에 12 Gy의 xRT가 투여될 것이다. 이어서 6-10일에 IT-IC의 본 발명의 표준 요법이 후속될 것이다. 별도 그룹의 마우스는 두 번째 종양에 다양한 선량의 xRT가 투여될 것이다. 3 Gy의 전신 xRT가 골수종 모델에서 면역억제 효과를 방지할 수 있음을 입증하는 B. Johnson의 연구실로부터의 데이터를 기초로 하여(15), 본 발명자는 0, 1, 5 및 8 Gy(본 발명자가 알고 있는 12 Gy에 더하여 효과적임)의 선량을 평가할 것이다. 본 발명자는 두 번째 종양에 대한 실질적으로 12 Gy 미만의 선량이 면역 내성을 제거하는데 있어서 완전한 12 Gy 선량만큼 효과적일 수 있는지 확인할 것이다.
일단 본 발명자가 이로운 효과를 상실하는 xRT의 임계 선량을 선택하면, 본 발명자는 임계 선량을 더 잘 최적화하기 위해 이후 분석을 수행할 것이다. 예를 들어, 5 Gy가 12 Gy만큼 효과적이나, 1 Gy가 0 Gy보다 훨씬 더 낫지 않은 경우, 본 발명자는 이후 첫 번째 종양에 12 Gy + IT-IC를 투여하는 상기 2 종양 모델에서 내성을 제거하고 효능을 획득하는데 필요한 가장 낮은 효과적인 임계 RT 선량을 확인하기 위해 2, 3, 및 4 Gy를 비교할 것이다.
이후, 12 Gy 선량이 아닌 1-종양 모델(실시예 2에서 시험됨, 상기)에서 첫 번째 종양에 대한 선량이 가장 낮은 유효 선량인 경우에 두 번째 종양에 대한 상기 가장 낮은 유효 선량이 여전히 효과적인 인 시츄 백신을 가능하게 하는지 확인하기 위해 반복 연구가 수행된다. 요약하면, 실시예 2의 연구는 둘 모두의 종양에 대해 12 Gy로 본 발명자가 입증한 효능을 상실하지 않고 첫 번째 및 두 번째 종양에 대해 가장 낮은 xRT 선량을 최적화한다.
B78 이외의 종양을 갖는 마우스에서 첫 번째 및 두 번째 종양에 필요한 xRT 선량의 연구 개시.
본 발명의 마우스 연구가 더 임상적인 일반화가능성(generalizability)을 제시하도록 하기 위해, 본 발명자는 GD2+ 종양의 추가 모델에서 RT + IT-IC의 분석을 개시할 것이다. 본 발명자는 GD2+ NXS2 신경모세포종을 갖는 AJ 마우스에서 hu14.18-IL2 IC를 이용한 IT-IC를 공개하였다[5]. 본 발명자는 또한 GD2+ 9464D-GD2 신경모세포종, 및 GD2 신타제에 대한 유전자의 본 발명의 삽입을 통해 GD2를 발현하는 Panc02-GD2 췌장암을 갖는 C57BL/6 마우스에서 상기 동일한 IC를 이용한 IT-IC를 평가한다. 실시예 2에서와 같이, 각각의 모델에 대해, 본 발명자는 인 시츄 백신 효과를 보유하기 위해 일차 및 이차 종양에 필요한 가장 낮은 유효 xRT 선량을 결정할 것이다.
실시예 3:
C57BL/6 마우스에서
131
I-NM404의 조사 적량 결정 및 TRT를 이용한 면역 기능 선량측정 및 TRT로부터의 면역억제에 대한 효과 평가.
131I-NM404는 종양 계열(인간 및 마우스)의 >95%에서 시험관 내에서 선택적 흡수와 함께 비-악성 세포에 의한 불량한 흡수, 및 생체 내에서 관찰된 유사한 종양 특이성을 나타내었다. 이는 B78 종양을 이용한 생체 내에서의 선택적 흡수를 포함한다(도 5). 본 발명자의 예비 선량측정 연구에서, 본 발명자는 C57BL/6 마우스에 124I-NM404를 제공하였고, 연속 PET/CT 영상화에 의한 TRT 노출의 시간 경과를 특성규명하였다(도 5에서와 같음). 상기 연구에 기초한 몬테 카를로(Monte Carlo) 선량측정 계산[16-18]은 4주의 붕괴 기간에 걸쳐 확립된 B78 종양에 약 3 Gy를 전달하는데 약 60 μCi의 131I-NM404가 필요하다는 것을 나타내었다. 그 4주 후, B78 종양에 대한 나머지 TRT 선량은 0.25 Gy 미만일 것이다. 본 발명자는 xRT를 이용한 본 발명의 2-종양 모델에서 획득한 데이터(도 3)를 반복할 것이나, 원위 질병의 모든 부위에 종양-유도 내성의 효과적인 제거를 가능하게 하기 위해 표적화된 131I-NM404 TRT의 가장 낮은 가능한 선량을 이용한다. 그러나, 모든 선량을 수분 내에 전달한 후, 완료되는 xRT와 달리, TRT는 표적화된 동위원소의 생물학적 및 물리적 반감기(131I의 경우 8일 t½) 둘 모두에 따라 시간 경과에 따라 선량을 축적한다. 본 발명자는 원위의 종양 부위에서 초기 TRT 효과가 면역 내성을 근절시키기 원하나; 본 발명자는 본 발명자가 ADCC 및 인 시츄 백신 항-종양 효과를 유도하기 위해 IT-IC를 제공하는 경우 면역억제 TRT 효과가 최소화되기를 원한다. 이는 모든 부위에서 완전한 종양 파괴를 가능하게 하는 것이 필수적이다.
본 발명의 예비 데이터로부터의 선량측정 계산을 이용하여, 본 발명자는 3 μCi의 131I-NM404의 선량이 종양 부위에 약 0.2 Gy의 동등량을 전달해야 한다고 추정하였는데, 본 발명자가 가정한 선량은 면역억제성이어선 안 되고, 림프구-매개 종양 파괴를 방지하지 않아야 한다. 상기 언급된 바와 같이, 이는 60 μCi의 초기 131I-NM404 선량 28일 후에 아직 전달되지 않고 남아 있을 것으로 본 발명자가 평가한 선량이다. 따라서, 본 발명자는 하나의 200 mm3 B78 종양을 갖는 마우스의 그룹을 평가하였다. 0일에, 모든 마우스는 이의 종양에 12 Gy xRT를 얻었고, 6-10일에, 모두 50 mcg/d의 IT-IC를 얻었다. 한 그룹은 또한 0일에 3 μCi의 131I-NM404(약 0.2 Gy)를 얻었다. 도 6은 131I-NM404를 투여한 그룹이 131I-NM404를 투여하지 않은 그룹과 동일한 정도의 종양 근절을 갖는 것을 제시하며, 이는 종양에서의 상기 낮은 선량의 "잔여" TRT가 RT + IT-IC 인 시츄 백신에 의한 면역 매개 파괴를 차단하지 않음을 입증한다. 따라서, 본 발명자는 본 발명자가 22일에 60 μCi의 131I-NM404 TRT의 초기 선량을 이용하는 경우, 원위 종양의 면역허용원 효과를 효과적을 차단하고, 첫 번째 종양에 대한 0일에서의 xRT 및 6-10일(TRT 후 28일)에서의 IT-IC가 인 시츄 백신으로 기능하는 것을 아직 가능하게 하여, 이후에 모든 종양을 근절시키는 적응 반응을 유도하는 것을 가정한다.
본 실시예에 개설된 실험은 도 6에서 시험된 선량 관계를 최적화한다. 본 발명의 1-종양 B78 모델에서, 본 발명자는 원하는 인 시츄 백신 효과를 방해하기에 충분한 원치 않는 전신 면역 억제를 발생(및 이에 의해 첫 번째 종양의 근절을 둔화시키거나 방지)시키는 최적 TRT 선량을 선택하기 위해 다양한 선량의 131I-NM404 TRT를 시험할 것이다. 이는 실시예 4에서 중요한데, 이는 본 발명자가 원위의 질병을 갖는 마우스에서 첫 번째 종양에 대해 본 발명자가 IT-IC를 개시하는 시간에서 TRT의 잔여 방사능이 상기 값 미만으로 감쇠되는지 확신하는 것을 가능하게 하기 때문이다. 본 발명자는 또한 "내성-방지 TRT 선량"이 다수의 종양을 갖는 동물에 제공된 후에 첫 번째 종양의 RT + IT-IC 치료가 여전히 인 시츄 백신 효과를 유도하고, 일차 뿐만 아니라 원위 종양을 근절시키는 것을 가능하게 하기에 본 발명자가 기다려야 하는 최적 기간을 선택하기 위해 다양한 TRT 선량 후에 TRT 반응의 동역학을 평가할 것이다.
관련 연구는 또한 단일 제제 처리로 제공되는 TRT의 어떠한 선량이 단일 B78 종양의 둔화, 상대 수축(versus shrinkage), 상대 근절(versus eradication)을 야기시키는데 가장 이로운지 살펴볼 것이다. 종양-유도 면역 내성을 제거하기 위해 가장 이로운 TRT의 선량은 완전한 종양 파괴를 (TRT 단독으로부터) 실제로 유도하는데 필요한 TRT 선량보다 실질적으로 적을 것이다.
최종적으로, 다양한 최적화된 선량의 TRT의 효과가 1-종양 모델에서 결정되면, 본 발명자는 IC의 인간 IgG 성분에 대한 면역 반응에 대해 이들 대상체로부터의 혈청을 평가함으로써 TRT의 미세한 면역-억제 효과를 평가할 것이다. 본 발명자는 면역적격 마우스가 이들 인간화된 IC를 이용한 처리 후에 마우스 항-인간 항체(MAHA)의 용이하게 정량되는 수준을 발생시키는 것을 제시하였다(19). 본 발명자는 이를 TRT를 투여받는 마우스에서 RT의 전신 선량으로부터의 전체 면역억제 효과를 측정하기 위해 상기 TRT가 뮤린 면역 반응의 강도에서의 검출 가능한 선량-의존적 감소를 야기시키는 것을 볼 수 있는 선량을 결정하는 수단으로서 이용할 것이다. 종양-유도 면역 내성을 차단하는데 필요할 낮은 TRT 선량은 최소의 전신 면역 억제를 야기할 것이다.
실시예 4: 2개 이상의 종양을 갖는 마우스에서
131
I-NM404 + 국소 xRT + IT-mAb/IL2의 최적 요법 개발
2-종양 B78 모델에서의 TRT + RT + IT-IC의 효능 시험.
실시예 2 및 3에 개설된 연구로부터 얻은 선량 및 시기 정보는 본 발명의 2-종양 모델에서의 효능에 필요한 TRT 선량 및 시기를 최적화하는데 필요한 정보를 제공할 것이다. C57BL/6 마우스는 좌측(L) 및 우측(R) 옆구리에 동시에 B78로 접종할 것이다. 각각의 종양은 2주 후에 약 50 mm3 및 5주 후에 약 200 mm3이어야 한다. 본 발명자가 실시예 3에서의 본 발명자의 선량측정 계산이 두 번째 종양에 3 Gy RT를 근사화시키기 위해(면역 내성을 차단하기 위해) 60 μCi의 TRT를 전달하는 것이 필요하다는 것을 암시함을 가정하는 경우, 본 발명의 외부 광선 xRT 연구는 이러한 선량이 종양 성장에 대한 최소의 둔화 효과를 가져야 함을 예측한다. 본 발명자는 2 w 시점(종양이 약 50 mm3인 경우)에서 30, 60 또는 90 μCi로 마우스의 상이한 그룹을 처리할 계획이다. 3주 후, 종양은 약 200 mm3이어야 하고, 이 시점에서, 본 발명자는 xRT(실시예 2에 개설된 바와 같이 결정된 선량)를 제공하고, 6일 후(TRT 약 28일 후)에 L 옆구리 내의 종양에 IT-IC를 5일간 매일 주입하여 인 시츄 백신 효과를 유도할 것이다. 대조군 마우스는 L 옆구리에 TRT를 얻지 않고, xRT 및 IT-IC만 얻을 것이며, 이는 원위의 종양으로부터의 내성으로 인해 인 시츄 백신이 없을 것으로 예상된다. 별도의 그룹은 둘 모두의 종양에 국소 xRT를 얻을 것이고, L 옆구리에 IT-IC를 얻을 것이며, 이는 인 시츄 백신 효과를 통해 둘 모두의 종양의 근절이 예상된다. 또 다른 그룹은 TRT + IT-IC를 얻으나, 국소 xRT는 없으며, 이는 불완전한 백신 효과가 예상된다.
후속 실험은 다양한 선량의 TRT 및 일차 종양(L 옆구리)으로의 TRT와 국소 xRT + IT-IC 사이의 시기에서의 변동을 추가로 평가할 것이다. 판독은 (A) 일차 종양의 근절; (B) 이차 종양의 근절; 및 (C) MAHA 반응의 ELISA 분석을 통한 전신 면역 억제일 것이다. 본 발명의 목적은 전신 면역억제(MAHA 반응에 의해 측정됨)를 최소화하면서 대부분의 대상체에서 둘 모두의 종양을 근절시킬 수 있는 국소 xRT + IT-IC 요법에 추가하기 위해 특정 대상체 및 질병 모델을 이용하여 최적 TRT 선량 및 시기를 확인하는 것이다.
2개 초과의 B78 종양을 갖는 마우스에서의 TRT + xRT + IT-IC 최적화.
실시예 4의 이러한 섹션은 관련 임상 환경, 즉, 인 시츄 백신 부위로 사용될 수 있는 주입 가능한 종양을 갖지만, 종양-유도 면역 내성을 각각 야기시킬 수 잇는 다수의 원위의 전이를 갖는 환자와 가장 유사하다. 이들 연구는 실시예 4(상기)의 첫 번째 부분에서 가장 효과적인 것으로 발견된 조건을 반복할 것이다. 중요한 차이는 이들 대상체가 각각 L 및 R 옆구리, 및 L 및 R 부견갑 영역에서 4개의 별도의 종양을 가질 것이라는 점이다. TRT는 이후에 xRT + IT-IC만 L-옆구리 병변에 제공된 실시예 4의 첫 번째 섹션에 개설된 연구에서 가장 효과적인 것으로 발견된 선량 및 시기로 제공된다. 본원의 목적은 TRT가 xRT를 얻지 않은 3개 부위에 의해 야기된 종양-유도 면역 내성을 효과적으로 제거하므로 가장 효과적인 인 시츄 백신이 가능하도록 하기 위해 TRT 선량 및 시기 문제를 시험하는 것이다. 효능의 척도는 대부분의 대상체에서 4개 모두의 종양의 제거이다. 가장 효과적인 최적화된 요법을 발생시키기 위해 TRT 선량 및 시기의 변형이 시험된다. 상기 요법은 "인 시츄 백신" 부위에 대한 국소 xRT + IT-IC와 조합되는 경우 외부 광선을 통해 모두 방사선 조사될 수 없으나, TRT를 통해 방사선 조사될 수 있는 다수의 원위 전이를 갖는 환자를 위해 클리닉에서 사용된다.
실시예 5: 금속 킬레이트화된 NM600의 합성
본 실시예에서, 본 발명자는 하나의 예시적인 인지질 킬레이트인 Gd-NM600을 합성하는데 이용되는 합성 반응식을 제시한다. 다양한 방사성 동워원소를 포함하는 유사체는 유사한 방식으로 합성될 수 있으며, 여기서 당해 방사성 동위원소가 Gd에 대해 치환된다.
Gd-NM600을 합성하기 위한 반응식 (개시된 방사성 금속 동위원소는 Gd에 대해 치환될 수 있음):
실시예 6: 생체 내 영상화 개념 증명
본 실시예에서, 본 발명자는 MRI 조영제로서 Gd-NM600을 이용한 종양의 성공적인 생체 내 MRI 영상화를 입증한다. 데이터는 백본 인지질 및 킬레이트제가 고형 종양에 의해 흡수되고 보유됨을 입증하며, 이는 본원에 개시된 바와 같은 다양한 방사성 금속을 포함하는 상기 킬레이트가 유사한 특성을 나타냄을 입증한다.
Gd-NM404 제제의 종양 흡수의 개념 증명 생체 내 영상화를 위해, 옆구리 A549 종양(비소세포폐암) 이종이식편을 갖는 누드 무흉선 마우스를 스캐닝하였다. Gd-NM600 제제(2.7 mg)를 꼬리 정맥 주사를 통해 전달하였다. 마우스를 마취시키고, 조영제 투여 전 및 조영제 전달 1, 4, 24, 48, 및 72시간 후에 스캐닝을 수행하였다. 영상화를 부피 구적 코일을 갖는 4.7T Varian 전임상 MRI 스캐너에서 수행하였다. T1-가중 이미지를 다음과 같은 펄스 시퀀스 파라미터로 고속 스핀 에코 스캔을 이용하여 모든 영상화 시점에서 획득하였다: 반복 시간(TR) = 206 ms, 에코 간격 = 9 ms, 에코 열 길이 = 2, 유효 에코 시간(TE) = 9 ms, 10 평균, 40x40 mm2 시야, 192x192 매트릭스, 각각 1mm 두께의 10개의 절편.
도 7에서 관찰되는 바와 같이, 종양의 MRI 영상화는 주입 24시간 후까지 유의하게 향상되었다.
이들 결과는 알킬포스포콜린 유사체의 차별적 흡수 및 보유가 본원에 개시된 금속 킬레이트화된 유사체에 대해 유지되는 것을 입증한다. 따라서, 개시된 금속 킬레이트는 임상적 치료 및 영상화 적용에 용이하게 적용될 수 있다.
실시예 7: 일차 종양에 대한 최적 인 시츄 백신 효과에 필요한 xRT의 선량, 및 수반 면역 내성을 방지하는데 필요한 원위 종양에 대한 xRT의 가장 낮은 선량을 결정하는 실험
실시예 1-4에 대한 후속 조치로서, 1 또는 2개의 종양을 갖는 마우스에 대해 다양한 xRT 선량을 평가하는 선량 적정 실험을 수행하였다. 첫 번째 목적은 IL2에 연결된 종양-반응성 mAb인 IT-IC를 이용하여 상승작용 및 "인 시츄 백신"을 촉진하기 위해 하나의 종양을 갖는 마우스에 필요한 xRT의 선량을 시험하는 것이었다. 초기 실험은 12 Gy RT 단독이 확립된 B78 흑색종 종양의 성장을 근절시키거나 심지어 회귀시키지 않는 반면(0% 완전 회귀), 12 Gy + IT-IC가 단일 종양을 갖는 마우스에서 대부분의 B78 종양의 완전한 회귀(66%)를 발생시킨다는 본 발명자의 이전의 관찰을 확인하였다. 다른 한편으로, 2 Gy + IT-IC는 IT-IC 단독에 비해 종양 진행을 둔화시키나(평균 종양 크기 32일 = 각각 472 mm3 대 1214 mm3), 어떠한 마우스도 질병이 없는 상대로 만들지 않았다(0% 완전 회귀).
본 발명의 "2-종양 모델"에서, 본 발명자는 xRT + IT-IC를 이용한 하나의 "일차" 종양의 치료가 치료되는 일차 종양 또는 치료되지 않은 "이차" 종양을 치료하는데 효과적이지 않음을 이전에 제시하였다. 사실, 이러한 2-종양 모델에서, 본 발명자는 두 번째 종양의 존재가 xRT 후 IT-IC 주입의 효능을 제거한다는 것을 관찰하였다. 본 발명자는 상기 현상을 "수반 면역 내성(CIT)"으로 지정하였으며, 이러한 결과가 적어도 부분적으로 전신으로 순환하고, xRT-처리/IT-IC 주입된 일차 종양을 재증식시키는 원위(방사선 조사되지 않은) 이차 종양에서의 T 조절 세포(Treg)로부터 발생함을 입증하였다. 일차 종양으로 돌아가는 이들 Treg는 원하는 "인 시츄 백신" 효과를 방해하는 것으로 보인다.
본 발명자는 일차 및 이차 종양 둘 모두에 12 Gy xRT를 전달함으로써 CIT가 극복될 수 있다는 본 발명자의 이전의 관찰을 이제 확인하였다. 중요하게는, Treg가 RT에 매우 민감하다는 것을 고려하여, 본 발명자는 CIT를 극복하고, 일차 종양(12 Gy + IT-IC로 처리된 일차 종양)에서의 인 시츄 백신화에 대한 반응을 구제하기 위해 더 낮은 선량의 RT가 이차 종양에 전달될 수 있다고 가정하였다. 본 발명자는 이제 상기를 시험하였고, 이차 종양에 대한 2 Gy 또는 5 Gy의 xRT 선량이 CIT를 둔화시키고, 12 Gy + IT-IC를 이용한 일차 종양 치료에 대한 반응을 구제하는 능력에 있어서 12 Gy와 동등한 것을 관찰하였다. 이들 중요한 실험은 이중으로 반복되었고, CIT를 방지하기 위해 원위 종양에 제공되어야 하는 xRT의 선량이 인 시츄 백신 효과를 발생시키기 위해 IT-IC 주입된 일차 종양 부위에 필요한 선량보다 훨씬 적다는 것을 암시(가정된 바와 같음)한다.
이는 본 발명의 개시에서 본 발명의 중요한 가설을 지지하며, 다수의 종양을 갖는 동물에서, 본 발명자는 표적화된 방사선요법(TRT) NM600를 이용하여 질병의 모든 부위에 비교적 적은 선량의 RT를 전달할 수 있고, 이에 의해 단일 종양 부위(인 시츄 백신 부위)의 국소 xRT 및 IT-IC와 조합되는 경우에 CIT를 극복할 수 있음을 암시한다.
실시예 8: 상기 결정된 바와 같이 xRT를 전이시키기 위해 필요한 선량을 근사화시키는
131
I-NM404 선량을 결정한 후, 생체 내 면역 기능에 대한 상기
131
I-NM404 선량의 효과를 평가하는 실험
실시예 1-4에 상기 기재된 예비 데이터를 기초로 하여, TRT를 이용하여 이들 개념을 생체 내 시험으로 옮기기 위한 연구를 수행하였다. 1 또는 2개의 B78 종양을 갖는 마우스(본 발명자가 본 발명의 인 시츄 백신 접근법 및 CIT의 장애물을 가장 잘 입증하기 위해 사용된 종양 모델)에 대해 선량측정 연구를 수행하였다. 이는 약 2 Gy의 xRT를 근사화하는데 필요한 131I-NM404의 양을 추정하기 위해 수행하였다.
이후, 약 2 Gy의 동등한 선량의 131I-NM404가 종양 내 림프구 세포(특히, Treg)에 대해 원하는 효과를 갖는지 결정하기 위해, 2개의 별도의 접근법이 추구되었다. 첫째로, 본 발명자는 방사선민감성 림프종 종양을 갖는 마우스에 상기 선량의 131I-NM404를 투여하였고, 이는 B78 종양에 대한 동등한 NM404 흡수를 나타낸다. 이후, 본 발명자는 B78 종양의 실질적인 수축/둔화 또는 순환 림프구 세포의 임의의 명백한 고갈(말초의 완전한 혈액 수에 의해 측정됨)을 야기시키지 않는 조건 하에서 강한 림프구 종양 수축/선량-의존적 억제를 기록하였다. 이들 데이터는 림프구 세포가 통상적인 고형 종양 세포보다 저-선량의 RT에 훨씬 더 민감하다는 사실과 일치하며, 이는 종양에서의 TRT의 선택적 흡수가 전신 림프구감소증 없이 종양 내 림프구 세포를 가능하게 할 수 있음을 암시한다. 이들 연구는 또한 상기 림프구 종양이 종양 내 림프구 세포에 대한 TRT의 효과를 확인하고 모니터링하기 위한 생체 내 생물학적 "선량계"로 사용될 수 있음을 암시한다.
두 번째 접근법은 이들 동일한 선량의 131I-NM404로 B78 종양을 갖는 마우스를 치료하는 것을 수반하였다. 이후, 이들 동물을 반감기(8d) 간격으로 희생시키고, 방사성 붕괴에 대한 충분한 지연 후, 종양을 면역조직화학에 의해 이펙터 T 세포 및 Treg의 존재에 대해 염색하였다. 흥미롭게도, 상기 초기 실험에서 131I-NM404를 투여받은 동물은 임의의 시점에서 전신 림프구감소증을 나타내지 않았으나(말초의 완전한 혈액 수에 의함), TRT 투여 후 2 반감기에서 종양 내 FoxP3+ Treg에서의 감소를 나타내었다. 이러한 2-반감기 시점에서, 본 발명자는 또한 종양 내 이펙터 CD8+ T 세포에서의 감소를 관찰하였다. 그러나, 중요하게는 이후의 3 및 4 반감기 시점에서, 본 발명자는 종양 내 CD8+ 이펙터 T 세포에서의 증가를 관찰하였으나, 미처리 기준선 및 두 번째 반감기 수준에 둘 모두에 비해 종양 내 Treg의 수준에서의 추가 감소를 관찰하였다. 이러한 관찰은 다수의 종양을 갖는 동물에서 인 시츄 백신 효과를 구제하기 위해 Treg-매개 CIT를 극복하기 위해 TRT를 사용하는 것이 가능할 것이라는 본 발명의 가설을 다시 지지한다.
최종적으로, 종양 내의 면역 세포에 대한 TRT의 면역학적 효과를 특성규명하기 위해, 본 발명자는 131I-NM404를 이용하여 B78를 갖는 마우스를 처리하였고, 처리전 및 그 후 반감기(8d) 간격으로 종양 조직을 수집하였다. 이후, 이들 조직을 면역 서명의 패널의 유전자 발현에 대해 RT-PCR에 의해 분석하였다. 결과는 TRT 치료 단독이 면역민감성의 종양 세포 마커의 발현 및 면역 세포에 의해서만 일반적으로 발현되는 유전자에서의 현저한 변화를 야기시키는 것을 나타내고, 후자는 감소된 발현 후 반동 과발현의 명백한 시간 경과를 나타낸다.
실시예 9: 2개 이상의 종양을 갖는 마우스에서
131
I-NM404 + 국소 xRT + IT-mAb/IL2의 요법을 개발하고, 모든 원위의 종양의 T-세포 매개 근절을 유도하기 위해 실시예 5 및 6으로부터의 데이터를 이용한 실험
본 실시예는 적어도 2개의 위치에서 종양을 갖는 동물을 치료하는 것을 예시한다. 본 발명의 전략은 모든 종양 부위에서 향상된 항-종양 면역 활성을 획득하기 위해 CIT를 억제하기 위해 전신적으로 TRT와 조합하여 인 시츄 백신 부위에서 xRT 및 국소 IT-IC를 이용하는 것을 수반한다. TRT 및 xRT 선량 및 시기의 중요한 문제는 항종양 효능에 최적화될 것이다.
실시예 7 및 8에 요약된 데이터를 이용하여, 2개의 별도의 B78 종양을 갖는 마우스에서 연구를 수행하였다. 마우스에 추정된 필요한 전신 131I-NM404 선량을 투여한 후, 인 시츄 백신 부위에 xRT 및 국소 면역요법을 제공하였다. 적절한 대조군을 이용하여, 상기 선량의 131I-NM404는 2개의 종양을 갖는 마우스에서 원하는 바와 같이 CIT를 약화시키는 것으로 보였다. 또한, 하나의 종양을 갖는 마우스에서, 이러한 TRT 선량은 국소 인 시츄 백신 효과를 방해하는 것을 보이지 않았다(가설이 세워지고 요망됨). 인 시츄 백신 효과를 억제함이 없이 CIT를 차단하는 원하는 효과를 최대화시키기 위해 추가 시험, 및 실험 변수의 일부의 변형이 진행 중이다. 이들 실험에 관한 보다 상세한 내용은 하기 실시예 10에 개시되어 있다.
실시예 10: 2개 이상의 종양을 갖는 마우스로부터의 데이터
뮤린 흑색종 및 췌장 종양 모델에서 원위의 미처리 종양에 의한 국소 xRT+IT-IC의 조합에 대한 일차 종양 반응의 종양-특이적 억제.
대측 옆구리 상에 동계의 GD2+ 일차 옆구리 종양 +/- 이차 종양을 갖는 C57BL/6 마우스를 "1"일에 xRT로 표시된 바와 같이 일차 종양에만 그리고 6-10일에 50 mcg의 항-GD2 IC, hu14.18-IL2의 IT 주입을 처리하였다.
일차 B78 흑색종 종양을 갖는 마우스에서, 미처리 이차 B78 종양의 존재는 xRT+IT-IC에 대한 일차 종양 반응을 길항시켰다(도 8a). 본 발명자는 상기 효과를 xRT + IT-IC에 대한 처리된 종양의 국소 반응에 대한 미처리 원위 종양의 길항 효과인 "수반 면역 내성"으로 기재한다. 카플란-마이어 생존 곡선이 이들 마우스 및 반복 실험에 대해 획득되었다(도 8b). 거의 모든 마우스는 일차 종양 진행으로 인해 안락사되었다.
반대측 옆구리 상에 이차 Panc02-GD2- 종양을 갖거나 갖지 않는 일차 Panc02-GD2+ 췌장 종양을 갖는 마우스에서, 미처리된 Panc02 이차 종양의 존재는 xRT+IT-IC에 대한 일차 Panc02-GD2+ 종양의 반응을 억제하였다(도 8c). 일차 B78 흑색종 종양을 갖는 마우스에서, 이차 B78 종양은 xRT+IT-IC 에 대한 일차 종양 반응을 억제하였으나, 이차 Panc02-GD2+ 췌장 종양은 상기 효과를 발휘하지 않았다(도 8d). 일차 Panc02-GD2+ 종양을 갖는 마우스에서, 이차 Panc02-GD2- 종양은 조합된 xRT 및 IT-hu14.18-IL2에 대한 일차 종양 반응을 억제한 반면, B78 이차 종양은 그렇지 않았다(도 8e).
수반 면역 내성은 조절자 T 세포(Treg)의 특정 고갈에 의해 회피된다.
면역조직화학 이미지가 1 또는 2개의 종양을 갖는 마우스에서 xRT 후 6일째에 평가된 종양에 대해 Treg 마커인 FoxP3에 대해 획득되었다(도 9a). 마우스에 xRT를 투여하지 않거나, 일차 종양에만 xRT를 투여하였다. DEREG 마우스는 Treg-특이적 FoxP3 프로모터의 조절하에서 디프테리아 독소 수용체를 발현하며, 이는 디프테리아 독소의 IP 주입시 Treg의 특정 고갈을 가능하게 한다(도 9b 및 9c). 일차 및 이차 B78 흑색종 종양을 갖는 DEREG 마우스에 일차 종양에 대해 xRT+IT-IC 및 디프테리아 독소 또는 PBS의 IP 주입을 처리하였다. 수반 면역 내성은 이들 마우스에서 Treg의 고갈 후에 제거되며, 이는 개선된 일차(도 9b) 및 이차(도 9c) 종양 반응을 발생시킨다.
수반 면역 내성은 둘 모두의 종양 부위에 xRT를 전달함으로써 극복된다.
일차 및 이차 B78 종양을 갖는 마우스에서, 이차 종양은 xRT + IT-IC를 이용한 일차 종양 치료에 대한 일차 종양 반응을 억제한다. 이는 일차 및 이차 종양 둘 모두에 12 Gy xRT 및 일차 종양에 IT-IC에 전달함으로써 극복되며, 이는 반복 실험으로부터 개선된 일차 종양 반응(도 10a) 및 동물 생존 집계(도 10b)를 발생시킨다.
저 선량 xRT 단독은 인 시츄 백신화를 유도하지 않지만, 인 시츄 백신 부위의 12 Gy + IT-IC 처리와 함께 원위 종양 부위에 전달되는 경우 수반 면역 내성을 극복한다.
일차 B78 종양만 갖는 마우스에서, 12 Gy + IT-IC는 인 시츄 백신화를 유도하며(이전에 제시된 바와 같음), 대부분의 마우스에서 완전한 종양 회귀(도 11a) 및 기억 면역 반응을 발생시킨다(Morris, Cancer Res, 2016). 다른 한편으로, 동물은 IT-IC 단독 또는 저 선량(2 Gy)의 xRT + IT-IC 후에 완전한 종양 회귀를 나타내지 않는다(둘 모두의 그룹에서 0/6) p<0.05.
일차 및 이차 B78 흑색종 종양을 갖는 마우스에서, 이차 종양에 전달된 저 선량 xRT(2 Gy 또는 5 Gy)는 일차 종양에서 수반 면역 내성을 극복하는 능력에 있어서 12 Gy와 동등하다(도 11b). 이들 동일한 동물에서, 이차 종양으로의 저 선량 xRT의 전달에 의해 수반 면역 내성을 극복하는 것이 IT-IC 면역요법에 대한 전신 반응을 구제하는 것이 명백하다(도 11c). 이러한 상황에서, RT가 모든 종양 부위로 전달되는 경우, 일차 종양의 IT-IC 주입은 2 Gy 또는 5 Gy에 대한 이차 종양 반응이 일차 종양 IT-IC 주입의 부재하에서 12 Gy RT에 대한 반응보다 크도록 하는 전신 항-종양 효과를 촉발시킨다.
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I-NM404를 이용한 저 선량 TRT는 전신 백혈구감소증 또는 종양 침윤 CD8+ 이펙터 T 세포의 고갈 없이 종양 침윤 FoxP3+ Treg를 효과적으로 고갈시킨다.
대부분의 임상 시나리오에서, 면역억제를 발생시키는 현저한 골수 고갈 및 백혈구감소증을 유도하지 않고 모든 종양 부위에 외부 광선을 심지어 저 선량으로 전달하는 것이 실현 가능하지 않다. 본원에서, 본 발명자는 전신 면역 세포 고갈 및 백혈구감소증을 촉발시키지 않고 종양 침윤 억제 면역 세포(Treg)를 특별히 고갈시키기 위해 TRT가 전신 투여될 수 있는지 시험하였다. 이러한 B78 흑색종 종양 모델에서의 선량측정 연구를 양전자-방출 124I-NM404를 이용하여 수행하였고, NM404의 종양-선택적 흡수를 확인한다(도 12a). B78 종양을 갖는 C57BL/6 마우스를 60 μCi의 131I-NM404로 처리하였다. 이러한 활성은 약 2 Gy의 TRT를 B78 종양에 전달하는데 필요한 131I-NM404의 양을 근사화한다. 말초 혈액 및 종양 샘플을 미처리 대조군 마우스(C) 및 그 후 8일 간격(T1 = d8, T2 = d16, T3 = d24, T4 = d32)으로 수집하였다. 이러한 선량의 TRT는 임의의 유의한 전신 백혈구감소증을 발생시키지 않았고(도 12b), 종양 침윤 CD8+ 이펙터 T 세포의 수준에 유의하게 영향을 미치지 않았다(도 12c). 그러나, 종양 침윤 FoxP3+ Treg는 TRT의 상기 선량에 의해 유의하게 고갈되었다(도 12d).
131
I-NM404를 이용한 저 선량 TRT는 수반 면역 내성을 효과적으로 극복하고, 인 시츄 백신화의 전신 항-종양 효과를 구제한다.
마우스 백혈구감소증 없이 종양-침윤 Treg을 고갈시키는 저 선량 131I-NM404 TRT의 능력을 고려하여, 본 발명자는 저 선량 131I-NM404가 수반 면역 내성을 효과적으로 극복할 수 있는지의 여부를 시험하였다. 2개의 B78 종양을 갖는 C57BL/6 마우스를 표시된 바와 같이 1일에 60-μCi의 131I-NM404(NM404)로 처리하였다. 1 반감기(8일) 후, 동물에 일차 종양(인 시츄 백신 부위)에 12 Gy xRT를 투여하거나, xRT를 투여하지 않았다. 131I-NM404를 투여하지 않은 대조군 마우스는 표시된 바와 같이 이차 종양에 대해 처리되었다(0, 2, 또는 12 Gy). 마우스는 13-17일에 일차 종양(인 시츄 백신 부위)에 IC의 IT 주입을 매일 투여하였다. 일차 종양(도 13a) 및 이차 종양(도 13b) 반응은 저 선량 TRT의 투여가 수반 면역 내성을 효과적으로 극복하고, 인 시츄 백신화의 전신 항-종양 효과를 구제하는 것을 입증한다.
실시예 1-4 및 7-10에 인용된 참고문헌:
실시예 11:
PET 영상화에 의해 입증된 8개의 상이한 고형 종양 유형으로 이종이식된 마우스에서의 다수의 NM600 금속 킬레이트의 생체 내 흡수
본 실시예에서, 본 발명자는 상기 종양의 PET/CT 영상화에 의해 입증된 바와 같은 생체 내 다양한 고형 종양에서의 4개의 상이한 금속으로 킬레이트화된 NM600의 차별적 흡수를 입증한다. 이들 데이터는 본원에 개시된 바와 같이 종양-유도 면역 내성을 제거하기 위한 TRT 제제로서 금속 킬레이트화된 알킬포스포콜린 유사체의 사용에 대한 추가 지지를 제공한다. NM600의 구조는 64Cu로 킬레이트화된 예시적 종(64Cu-NM600)으로서 도 14에 제시되나, 임의의 금속이 NM600에 용이하게 킬레이트화될 수 있다.
구체적으로, 마우스는 각각 8개의 상이한 고형 종양 세포주(B78(흑색종), U87MG(아교모세포종), 4T1(유방 암종), HCT-116(결장직장 암종), A549(폐 암종), PC-3(전립선 암종), HT-29(결장직장 선암종), 또는 MiaPaca(췌장 암종)) 중 하나로 이종이식되었다. 이종이식된 마우스 각각에 대해, 종양 세포를 함유하는 세포 현탁액을 마우스의 한쪽 또는 양족 옆구리의 피하 조직에 접종하였다. 이종이식 종양이 최소 크기에 도달하면, 각각의 마우스를 측면 꼬리 정맥 주사를 통해 64Cu, 89Zr, 86Y, 또는 52Mn으로 방사선표지된 150-300 μCi의 NM600을 주입하였다. 흡수 기간 후, PET 영상화를 Inveon micro PET/CT에서 수행하였다. 각각의 스캔 직전에, 마우스를 이소플루란(2%)으로 마취시키고, 스캐너 내에 엎드린 자세로 두었다. 종단의 4천만 내지 8천만 건의 우연한 사건의 정적 PET 스캔을 방사성추적자의 주입 3, 12, 24, 및 48시간 후에 획득하였고, 이미지를 OSEM3D/MAP 재구성 알고리즘을 이용하여 재구성하였다.
도 15는 86Y-NM600을 주입한 단일-종양 B78 마우스에 대한 주입 48시간 후의 발생된 이미지를 제시하고; 도 16은 86Y-NM600을 주입한 2-종양 B78 마우스에 대한 주입 48시간 후의 발생된 이미지를 제시하고; 도 17은 64Cu-NM600을 주입한 U87MG 마우스에 대한 주입 3, 24 및 48시간 후의 발생된 이미지를 제시하고; 도 18은 64Cu-NM600을 주입한 4T1 마우스에 대한 주입 3, 24 및 48시간 후의 발생된 이미지를 제시하고; 도 19는 64Cu-NM600을 주입한 HCT-116 마우스에 대한 주입 3, 24 및 48시간 후의 발생된 이미지를 제시하고; 도 20은 64Cu-NM600을 주입한 A549 마우스에 대한 주입 3, 24 및 48시간 후의 발생된 이미지를 제시하고; 도 21은 64Cu-NM600을 주입한 PC-3 마우스에 대한 주입 3, 24 및 48시간 후의 발생된 이미지를 제시하고; 도 22는 64Cu-NM600을 주입한 HT-29 마우스에 대한 주입 3, 24 및 48시간 후의 발생된 이미지를 제시하고; 도 23은 64Cu-NM600을 주입한 MiaPaca 마우스에 대한 주입 3, 24 및 48시간 후의 발생된 이미지를 제시하고; 도 24는 86Y-NM600을 주입한 4T1 마우스에 대한 주입 3, 24 및 48시간 후의 발생된 이미지를 제시하고; 도 25는 89Zr-NM600을 주입한 4T1 마우스에 대한 주입 3, 24 및 48시간 후의 발생된 이미지를 제시한다.
52Mn-NM600이 주입된 HT-29 및 PC3 마우스에 대해, PET 이미지를 주입 4시간 후, 및 1일 후(HT-29에 대해 도 26; PC3에 대해 도 27), 뿐만 아니라 주입 2, 3, 5 및 7일 후(HT-29에 대해 도 28; PC-3에 대해 도 29)에 획득하였다.
도 15-29에서 관찰되는 바와 같이, 스캐닝된 마우스는 이종이식된 종양에 집중된 누적 흡수 선량 분포를 나타내는 PET/CT 3차원 부피 렌더링을 생성하였다. 결과는 이종이식된 고형 종양 조직으로의 금속 킬레이트화된 NM600의 차별적 흡수를 확인하며, 개시된 치료 방법에서 방사성 금속 동위원소를 포함하는 NM600 유사체의 잠재적 용도를 입증한다.
이미지의 정량적 관심 영역 분석은 종양 및 다른 관심 기관을 수작업으로 윤곽을 잡아서 수행하였다. 정량적 데이터는 조직 그램 당 주입된 선량의 백분율(%ID/g)로 표현하였다. 예시적 데이터는 4T1 종양 조직이 시간 경과에 걸쳐 이의 흡수를 증가시켰고, 3개 모두의 시험된 NM600 킬레이트(86Y-NM600, 64Cu-NM600 및 89Zr-NM600, 도 30 참조)를 효과적으로 보유한 반면, 건강한 심장(도 31), 간(도 32) 및 전신 조직(도 33)은 모두 시간 경과에 걸친 유의하게 감소된 흡수/보유를 나타낸 것을 제시한다.
생체 외 생체분포 분석을 마지막 종단 PET 스캔 후에 수행하였다. 마우스를 안락사시키고, 조직을 수거하고, 습윤-칭량하고, 자동 감마 계수기(Wizard 2480, Perkin Elmer)에서 계수하였다. 예시적 생체분포 데이터는 상이한 NM-600 킬레이트(86Y-NM600, 64Cu-NM600, 89Zr-NM600 및 177Lu-NM600, 도 34 참조)에 대한 종양 조직(4T1)에서의 유의한 흡수 및 보유를 제시한다.
함께, 이들 결과는 개시된 금속 킬레이트가 개시된 처리 방법의 TRT 단계에 용이하게 사용될 수 있음을 입증한다.
실시예 12:
이종이식된 마우스에서 다수의 고형 종양 유형에 대한 2개의 상이한 NM600 금속 킬레이트를 이용한 항-종양 활성 및 종양 자가방사선술 입증
본 실시예에서, 3개의 상이한 고형 종양 모델을 이용하여, 본 발명자는 알킬포스포콜린 금속 킬레이트 유사체가 통상적인 TRT를 촉진하는데 효과적으로 사용될 수 있음을 제시한다. 이들 결과는 본원에 개시된 처리 방법의 TRT 단계에서 금속 킬레이트를 이용하는 잠재성을 추가로 입증한다.
B78, MiaPaca 및 4T1 피하 옆구리 이종이식편을 이전에 기재된 바와 같이 마우스에서 유도하였다. 이후, 마우스에 측면 꼬리 정맥 주사를 통해 치료 선량(250-500 μCi)의 90Y-NM600, 177Lu-NM600, 또는 대조군 용액을 투여하였다.
제제의 생체분포의 Planar 2D 포스포르 이미지를 Cyclone Phosphorimager(Perkin Elmer)를 이용하여 촬영하였다. 마우스를 마취시키고, 누운 자세로 포스포르 플레이트와 직접 접촉한 채로 두었고, 여기서 이들은 15-30분의 기간 동안 유지되었고, 이후 플레이트가 포스포르이미저(phosphorimager)에서 판독되었다. 방사성 선량의 주입 4 내지 96시간 후에 다양한 이미지가 기록되었다. 생성된 자가방사선술 이미지는 시험되는 고형 종양 조직 유형 모두에서 킬레이트의 신속하고 선택적인 흡수 및 장기간 보유를 입증한다(도 40, 41, 42, 43, 44 및 45 참조).
종양 반응을 처리된 마우스 대 대조군 마우스의 종양 성장을 비교함으로써 평가하였다. 종양 부피를 캘리퍼스를 이용하여 종양의 길이 및 폭을 측정하고, 타원체의 부피에 대한 식을 이용하여 부피를 계산함으로써 결정하였다. 마우스 체중을 또한 기록하였다. 인도적인 종점을 다음과 같이 정의하였다: 2500 m3 초과의 종양 부피 또는 13 g 미만의 유의한 체중 손실.
도 46, 47, 48, 49, 50 및 51에서 관찰되는 바와 같이, 결과는 2개의 시험된 NM600 킬레이트가 대조군과 비교하는 경우 통계적으로 유의한 생체 내 치료 효과를 가져, 4T1 이종이식편에서 2배 선량의 177Lu-NM600에 대해 평균 종양 부피를 감소시키고(도 50 참조), 단일 선량의 177Lu-NM600이 제공된 MiaPaca, 4T1 또는 B78 이종이식편(도 47, 48, 및 49 참조) 또는 단일 선량의 90Y-NM600이 제공된 B78 또는 4T1 이종이식편(도 46 및 51 참조)의 성장을 거의 0으로 감소시키거나, 이의 성장 속도를 둔화시키는 것을 입증한다.
이들 결과는 다양한 유형의 고형 종양을 효과적으로 치료하기 위해 TRT를 전달하기 위해 개시된 알킬포스포콜린 금속 킬레이트 이용의 효능을 추가로 입증한다.
실시예 13:
광범위한 고형 종양 유형에서 TRT 반응을 예측하기 위한 방사선 선량측정 및 방사선민감성 지표 결합
본 실시예에서, 본 발명자는 다양한 고형 종양 유형에서 개시된 방법의 TRT 단계에 적절한 킬레이트 투여량을 결정하기 위한 요인을 논의한다.
종양 흡수 선량의 추정
투여되는 177Lu/90Y-NM600의 양이 면역-자극성이거나 세포독성인지의 여부는 종양 흡수 선량에 달려 있다. 64Cu/86Y-NM600이 치료용 금속 177Lu/90Y-NM600의 영상화 대용물로 사용될 수 있는 NM600의 디아퓨틱(diapeutic) 특성은 각각 종양 선량측정을 추정하기 위해 활용되었다. 궁극적으로, 177Lu/90Y-NM600 TRT의 선량 제한 기관 및 잠재적 종양 효능을 확인하는 것을 도울 수 있는 방사선 선량측정을 추정하고, 생체 내 생체분포를 정량적으로 측정하기 위해 64Cu/86Y-NM600 PET/CT를 사용하였다.
일반적인 개념은 다음과 같다: (1) 종양 내의 64Cu/86Y-NM600의 농도는 종단적 PET/CT 영상화를 이용하여 시간 경과에 걸쳐 정량되고, (2) 64Cu/86Y-NM600의 농도는 64Cu/86Y-NM600과 177Lu/90Y-NM600 사이의 감쇠율에서의 차이를 설명하기 위해 감쇠 보정되고, (3) 종양 내의 177Lu/90Y-NM600의 농도는 누적 활성, 또는 총 감쇠 수를 계산하기 위해 시간-적분되고, (4) 방사성핵종 감쇠의 부여는 종양 내에서 모델링되고, 정량화된다.
단계 (1) 내지 (3)은 임의의 의료 이미지 처리 소프트웨어 패키지로 수행될 수 있는 반면, 단계 (4)는 정교한 방사선 선량측정 소프트웨어를 필요로 한다. OLINDA/EXM(Stabin, Sparks and Crowe 2005)은 핵 의학 학회(Society for Nuclear Medicine)의 의료 내부 방사선(MIRD) 위원회에 의해 개발된 형식론을 이용하여 510(k) 승인을 받은 선량측정 추정 소프트웨어이다(Bolch et al., 2009). MIRD 접근법은 기관 자체 내부 또는 또 다른 공급원 기관에서 방출된 방사선으로 인해 조직 또는 기관에서 받은 평균 흡수 선량을 추정한다. 가장 간단한 형태의 MIRD 방정식 
는 공급원 영역 s 내에서의 방사성핵종 활성으로부터 표적 영역 t로 흡수 선량 D [mGy]를 제공한다. s의 방사성핵종 활성은 MBq-s의 단위로 제공된 방사성핵종 감쇠의 총 수인 누적 활성 
로 표현된다. S-인자 S(t←s)[mGy/ MBq-s]는 표적 영역 t의 질량인 m t 에 의해 표준화된 표적 영역 t 내에 부여된 공급원 영역 s 내에서의 한 방사성핵종 감쇠에 의해 방출된 에너지의 분획이다. S-인자는 표준 모형(standard phantom) 및 기관의 세트에서 Monte Carlo를 이용하여 계산된 도표 값이다. 통상적으로, 본 발명자는 주입된 활성의 단위 당 선량 
[mGy/MBq]에 관심을 갖는다. 방정식은 
와 같이 누적 활성 및 주입 활성 
[MBq]의 비인 체류 시간 
,[MBq-s/MBqinj], 
에 의해 기재된다.
종양 선량측정 계산의 경우, OLINDA/EXM은 단계 (1)의 일부로서 생성된 관심 종양 영역(ROI)로부터 부피가 추정된 분리된 단위 밀도 구체로서 종양을 모델링한다. 종양 내의 NM600의 농도(%ID/g)를 각각의 시점에서 결정하고, 감쇠를 보정하였다. 이후, 누적 활성을 사다리꼴 조각별 통합(trapezoidal piecewise integration)을 이용하여 모든 시간에 걸쳐 농도를 적분하여 계산하였다.
많은 세포주에 대한 방사선 선량측정 결과가 표 1에 제시된다. 이러한 정보는 종양을 근절시키거나, 면역계를 자극하기 위한 방사선요법 연구를 위한 흡수 선량을 추정하는데 이용될 수 있다.
표 1: 대용물로서
64
Cu-NM600 또는
86
Y-NM600 PET 영상화를 이용한
177
Lu-NM600 및
90
Y-NM600 둘 모두에 대한 선량측정 추정치(Gy/MBq
inj
)
선량-반응을 예측하기 위한 방사선민감도 지수
본질적인 방사선민감도는 방사선요법 반응의 기초를 이루는 중요한 요인이며, 암 유형에 대해 선험적으로 이를 아는 것은 상기 암 유형이 TRT로부터의 방사선에 어떻게 반응할지 예측하는데 도움이 될 수 있다. 그러나, 종양에서의 일상적인 평가를 위한 방법이 없으므로, 방사선민감도는 클론원성 검정에 의한 2 Gy(SF2)를 이용한 방사선조사 후 생존 분획(0 내지 1)으로서 측정된다. 암 세포 표현형의 상대적 방사선민감도는 매우 낮은 방사선민감도를 갖는 것(췌장, 결장직장, 신경아교종 및 유방)에서 높은 방사선민감도를 갖는 것(림프종)까지 다양하다. 암은 방사선민감도 지수에 의해 분류되거나 순위를 매길 수 있다(표 2).
본 발명자가 림프종과 같은 매우 방사선민감성인 종양 및 신경아교종, 유방, 췌장 또는 결장직장과 같은 매우 방사선 내성인 종양에서 APC 금속 킬레이트로 우수한 종양 흡수 및 성장 억제를 입증할 수 있는 경우, 이는 이들 제제가 이들이 생체 내에서 종양을 표적화할 수 있는 경우 림프종과 신경아교종의 SF2 값 사이의 SF2 값(0.3-0.82)을 갖는 임의의 종양에 대해 효과적임을 압시할 수 있다. 신경아교종 종양 세포를 근절시키는데 필요한 방사선 선량은 더욱 방사선민감성인 림프종 세포를 치료하는데 필요한 것보다 높을 것으로 또한 예상된다.
본 발명자는 현재 표 2에 열거된 모든 종양 세포주에서 종양 선택성 및 치료 반응(종양 성장 억제) 데이터를 확인하기 위한 생체 내 영상을 갖고 있다. 일부 경우에, 충분한 암세포 사멸을 유도하기 위해 APC 킬레이트의 다수의 선량을 제공할 필요가 있을 수 있다. 방사선 선량측정 계산과 결합된 정량적 영상화를 이용하여, 본 발명자는 본원에 개시된 바와 같이 암세포를 사멸(더 높은 선량)시키거나, 면역계를 자극(더 낮은 선량)시키는데 필요한 종양 흡수 선량을 추정할 수 있다.
각각의 방사선민감도 지수(표 2)와 함께 다양한 암 세포주에 대한 선량측정 추정치(표 1)를 결합시키는 것은 NM600에 대한 선량 반응 전망의 확립을 지지한다. 일련의 세포주 내에서 NM600의 종양 표적화 특징 및 효능을 알면, 유사한 방사선민감도 지수를 갖는 세포주의 흡수 종양 선량 및 잠재적 효능을 추정하는 것이 가능하다. 또한, 종양 근절 또는 면역자극의 원하는 결과(본원에 개시된 바와 같음)에 따라 치료 선량은 표 1에 따라 선형으로 규모 변경될 수 있다.
표 2: 암세포의 상대 방사선민감도
실시예 13에 인용된 참고문헌:
실시예 14:
실시예 1-4 및 7-10에 예시된 것과 같은 방사성요오드화 화합물 대신에 알킬포스포콜린 금속 킬레이트를 이용하는 경우의 장점 및 차이
본 실시예에서, 본 발명자는 방사성요오드화 화합물(실시예 1-4 및 7-10에 예시된 화합물) 대신 APC 금속 킬레이트를 이용하는 이점을 논의한다. 본 발명자는 또한 개시된 방법의 TRT 단계에서 사용되 금속 킬레이트의 투여량을 최적화시키는 경우에 당업자에 의해 고려되는 요인을 논의한다.
킬레이트는 영상화 및 요법을 위한 매우 다양한 안정적이거나 방사성인 금속 이온의 사용을 허용한다. 이들은 매우 다양한 알파, 베타, 오거, 감마 및 양전자 방출체와 컨쥬게이션될 수 있는 반면, 요오드는 하나의 양전자(I-124), 하나의 베타(I-131), 하나의 감마(I-123) 및 1개의 오거(I-125) 동위원소로 제한된다.
금속 동위원소는 I-131 및 I-124보다 디아퓨틱(diapeutic)적으로 더 효능이 있다.
Lu-177은 고에너지 감마를 덜 가지며, 이는 이를 SPECT 영상화 및 선량측정에 더욱 유리하게 만든다. 그러나, 이의 베타 에너지는 I-131보다 약간 덜하며, 이는 이를 더 작은 종양 치료에 더 이상적으로 만든다.
I-131 및 Lu-177은 치료 효능 "마력(horse power)"에 있어서 동등하나, Lu-177에 대한 감마-방출로부터 전체 선량에 대한 기여도가 유의하게 덜하다. Y-90의 경우, 감마-방출로부터의 방사선 선량에 대한 기여도는 무시할 만하다.
I-131에 비해, Y-90은 도 52에서 관찰되고 하기에 추가로 논의되는 바와 같이 I-131보다 통상적인 TRT에 의해 암세포를 사멸시키는데 더 효능이 있다.
의료 내부 방사선(MIRD) 위원회는 투여된 방사성의약품으로부터의 내부 방사선 선량을 평가하기 위한 표준 방법, 모델, 가정 및 수학적 반응식을 개발한다. 많은 상이한 방사성핵종에 대한 방사선 선량을 평가하는 문제를 단순화시키는 MIRD 접근법은 널리 사용되는 510(k) 승인 소프트웨어인 OLINDA/EXM1에서 구현되었다. 이의 많은 표준의 인체 모형(anthropomorphic phantom)과 함께, OLINDA/EXM은 종양 선량을 근사화하는데 사용될 수 있는 구체 모델을 갖는다. 구체 모델은 종양 질량 범위(0.01-6,000 g)의 단위-밀도 구체 내에서 방사성의약품의 균일한 분포를 가정한다.
이러한 표준 모델을 이용하여, 본 발명자는 투여된 방사능에 의해 표준화된 방사선 선량의 측면에서 Y-90과 I-131을 비교하였다. 1 내지 100 g 사이의 종양 질량에 대해 상기 비교의 결과가 도 52에 제시된다. Y-90 대 I-131 비는 4 g 종양에 대해 4에 도달하고, 100 g 종양까지 4.0 내지 4.2에 머물러 있으며, 이는 mCi 당 mCi를 기준으로 하여, Y-90이 10 g 이하의 크기의 종양에서 I-131의 세포독성의 3.6 내지 4.1배이고, 10 그램 초과의 크기의 종양에서 약 4.1배 더 효과적임을 강하게 암시함을 유의한다.
상이한 약동학적 특성
요오드화 유사체와 달리, APC 킬레이트는 혈장 내의 공지된 알부민 결합 포켓에 맞기에는 너무 크며, 이에 따라 상이한 생체 내 약동학 및 생체분포 프로파일을 나타낸다(도 53 참조). 더 낮은 결합 에너지는 더 신속한 종양 흡수를 제공하는 혈장 내의 자유 분자의 더 큰 분획을 발생시킨다. 일부 APC 킬레이트는 신장 시스템을 통해 청소되는 반면, 요오드화 유사체는 간담즙 시스템을 통해 제거된다. APC 킬레이트는 또한 종양에 축적되고, 요오드화 유사체보다 훨씬 신속하게 혈액으로부터 청소된다. 더 신속한 혈액 청소는 치료 방사성의약품의 더 낮은 골수 및 표적외 독성과 직접 관련된다.
PK 및 생체분포 프로파일에서의 이들 차이는 상이한 선량 제한 기관 독성 및 궁극적인 유용성을 발생시킨다. 선량 제한 독성에 대한 혈액학적 독성에서 신장 또는 간으로의 이동은 TRT를 위한 방사성금속 킬레이트의 유용성을 증가시킬 것이다.
또한, APC 킬레이트의 약동학 프로파일은 킬레이트의 구조(예를 들어, 킬레이트 전하)에서의 약간의 변화에 의해 용이하게 조작될 수 있다. 킬레이트제의 선택은 광대하다. 정상 조직으로부터의 더 신속한 청소는 영상 대조 및 치료 범위를 개선시켜, 더 높은 최대 내성 선량을 발생시킨다.
APC 킬레이트는 요오드화 유사체보다 다양한 물리-화학적 특징을 갖는다. 이들은 훨씬 더 수용성이고, 따라서 계면활성제를 필요로 하지 않아, 이들을 정맥내 주입에 적합하게 한다. APC 킬레이트는 킬레이트에 대한 금속의 이온 결합을 기초로 하는 반면, 요오드화 화합물은 이의 담체 분자와 공유 결합을 형성한다. 생체 내 탈요오드화는 알킬 요오다이드에서 매우 일반적인 반면, 킬레이트는 생체 내에서 극히 안정적인 경향이 있다.
일단 탈요오드화가 발생하면, 자유 요오다이드는 이후의 매우 긴 배출 반감기를 가지고 갑상선에 신속히 축적되는 반면, 자유 방사성금속은 일반적으로 신체로부터 배출되거나 훨씬 더 신속하게 해독된다.
APC 킬레이트의 생체 내 생체분포는 금속 이온에 따라 매우 상이할 수 있으므로, 금속 및 킬레이트 둘 모두는 또한 APC의 종양 표적화 특징에 기여한다. 모든 킬레이트가 종양을 표적화하는 것은 아니다. 종양 표적화는 APC 담체의 축적 특성, 킬레이트의 유형(선형 킬레이트는 신속한 신장 제거를 겪는 반면, 거대고리 킬레이트는 간담즙 배출을 겪음), 및 금속 이온에 의존한다. 킬레이트 구조의 약간의 변화도 생체 내 특성에 대한 유의한 변화를 발생시킨다. 동위원소의 간단한 변화는 50% 초과의 종양 표적화의 변화를 발생시킬 수 있다.
방사성 APC-금속 킬레이트는 용이한 조건하에서 거의 정량적(>98%) 수율로 용이하게 방사성 표지되는 반면, 요오드화 유사체의 방사성요오드화 수율은 훨씬 낮다(통상적으로, I-131에 대해 약 50% 및 I-124에 대해 60%). 또한, 킬레이트를 이용하여 높은 특이적 활성이 달성될 수 있다. 합성은 정교한 환기 장비 또는 훈련의 필요 없이 임의의 핵 약학에서 방사성표지화 키트를 이용하여 수행될 수 있다. 방사성요오드화는 표지화 반응 동안 방사성 요오드의 휘발성으로 인해 유출물 모니터링 장비가 장착된 흄 후드에서 수행되어야 한다.
영상화제는 반드시 우수한 치료제를 만드는 아니며, 그 반대도 마찬가지이다.
영상화제로 우수한 종양 흡수가 존재하기 때문에, 그것이 치료가 명백함을 암시한다고 추정할 수 없다. 우수한 종양 흡수를 갖는 것 외에도, 치료제는 정상 조직에 비해 장기간의 종양 보유가 필요하며, 골수 노출 및 관련 독성을 낮추기 위해 혈액으로부터 신속히 청소되어야 한다. 요오드화 유사체는 장기간의 혈액 체류를 가져, 선량 제한 골수 독성을 발생시킨다. 대조적으로, 본 발명의 APC 킬레이트는 혈장 내에서의 더 낮은 알부민 결합으로 인해 상기 언급된 바와 같이 훨씬 더 신속한 혈액 청소 동역학을 나타낼 가능성이 높다.
최종적으로, 요오드-131에 비해 금속 베타- 및 알파-방출체의 짧은 경로 길이 및 물리적 특성으로 인해, 주입 후 건강 관리 종사자 또는 가족 구성원에 대한 노출 우려가 없다. I-131 요법을 받은 환자는 종종 병원에서 퇴원하기 전에 납 차폐된 방에서 일정 시간(최대 1주) 동안 체류해야 한다. 방사성 알파 및 베타-방출 APC 킬레이트로 주입된 환자는 입원을 필요로 하지 않을 것이다.
실시예 15: 항-CLA4 면역 체크포인트 억제제 투여와 조합되어 Y90-NM600에 의해 전달된 TRT는 생체내 흑색종 모델에서 암을 상승작용적으로 억제한다
본 실시예에서, 본 발명자는 개시된 조합 방법의 효능을 입증하는데, 여기에서 생체내 면역화는 면역 체크포인트 억제제(항-CTLA4 항체)를 전신 투여함으로써 수행되며, TRT는 이전 실시예에서 사용된 90Y-NM600 킬레이트를 전신 투여함으로써 수행된다.
B78 흑색종 피하 옆구리 이종이식편을 전술한 바와 같이 수컷 C57BL/6 마우스에 이식하였다. 후속하여, 항-CTLA4 항체(면역-체크포인트 억제제)(4, 7 및 11일에 200 μg)(n = 각 실험 군에 있어서 6)의 존재 및 부재하에서 다양한 용량(25 μCi, 50 μCi, 또는 100 μCi)의 90Y-NM600(1일)로 처리되도록 마우스를 무작위 할당하였다. 두 제제 모두를 옆 꼬리 정맥 주입(즉, 정맥내)에 의해 투여하였다. PBS 처리 단독 및 항-CTLA4 단독의 대조군을 또한 포함시켰다. 종양을 주 당 2회 캘리퍼로 측정하고, 동물 생존을 60일 동안 모니터링하였다.
도 54에 도시된 바와 같이, 3가지 조합 요법(항-CTLA4 + 3개의 상이한 투여량의 90Y-NM600)은 PBS 대조군 또는 단일 요법(항-CTLA4 또는 3개의 상이한 투여량의 90Y-NM600 단독) 중 임의의 것과 비교할 경우 실질적인 종양 성장 억제를 보였다. 18일 후, 50 또는 100 μCi의 90Y-NM600과 항-CTLA4로의 조합 처리는 PBS, 90Y-NM600 단독 또는 항-CTLA4 단독과 비교하여 유의하게 (ANOVA p < 0.05) 종양 성장을 감소시켰다. 항-CTLA-4와 25 μCi 90Y-NM600 조합 처리군은 용량 반응 경향을 보이는 중간 성장 지연 반응을 가졌다.
도 55에 도시된 바와 같이, 항-CTLA4와 조합된 50 μCi의 90Y-NM600으로 처리된 마우스는 TRT 단독 또는 PBS 비히클로 처리된 마우스보다 유의하게 큰 생존 집계를 나타내었다(p < 0.05). 항-CTLA4 단독과 비교하여, 조합 처리에 대한 log 순위는 p = 0.06이다.
도 56에 도시된 바와 같이, 모두 3개의 조합 처리는 생존을 현저하게 개선시켰다. 현저하게는, 비-조합 대조군 아암(arm)(PBS, 50 μCi의 TRT 단독, 100 μCi의 TRT 단독 및 항-CTLA4 단독)에서 0/24 완전 반응자와 비교하여 치료학적 용량 50 및 100 μCi의 90Y-NM600에서 TRT + CTLA4 아암 조합에서 6/12(50%) 완전 반응자가 존재하였다.
이러한 결과는 면역 체크포인트 억제(ICI)를 초래하는 임의의 제제와 분자 표적화된 방사선요법제의 사용을 조합하는 치료학적 잠재력을 설명한다. 결과는 분자 표적화된 TRT와 ICI의 조합이 각 제제 단독의 처리 대비 상승작용적 효과를 제공함을 보여준다. 현저한 종양 퇴행을 입증하는 것 이외에, 조합된 방법은 또한 면역학적 기억을 생성할 잠재력을 가지며, 궁극적으로 종양 재발을 예방하는 강력한 인 시츄 암 백신 효과를 제공한다.
실시예 16:
전이성 암 모델에서 전신 체크포인트 억제의 효능을 향상시키기 위한 분자 표적화된 방사선요법의 활용
실시예 15에 대한 이러한 추적 검사에서, 본 발명자는 이전 실시예에 사용된 90Y-NM600 킬레이트를 전신 투여함에 의해 수행된 TRT와 면역 체크포인트 억제제의 전신 투여를 조합시킨 개시된 방법의 효능을 입증하는 크게 확장된 지지 데이터를 제공한다. 효능은 마우스 흑색종, 신경모세포종 및 유방암 모델뿐만 아니라 전파된 "콜드" 종양을 갖는 다중 종양 흑색종 모델에서 입증된다.
임상 연구는 면역 체크포인트 억제제(ICI)로 치료받은 환자의 일부가 모든 질환 부위에서 지속적이고 완전한 반응(CR)을 경험함을 입증한다. 그러나, ICI는 낮은 수준의 T 세포 침윤 및/또는 소수의 돌연변이-생성된 신생-항원을 특징으로 하는 면역학적 "콜드" 종양을 갖는 환자에는 전형적으로 효과적이지 않다. 본 실시예에서, 본 발명자는 이러한 종양에서 면역 반응을 자극하고, "핫" 종양에서 반응을 향상시키기 위해 개시된 조합 방법을 이용함을 입증한다. 더욱 특히, 본 발명자는 항-종양 면역요법 반응 생성에 역효과를 낳을 결과적인 전신 림프절고갈을 유발하지 않으면서 질환의 모든 부위에 면역자극 저선량 방사선을 전달할 수 있는 전신 분자 표적화된 방사선요법(MTRT)을 ICI와 조합시킴으로써 전신 ICI의 효능을 향상시켰다.
방법:
MTRT의 종양 흡수 연구에 있어서, 승인된 IACUC 프로토콜로 100 μL PBS 중의 1-2x106 세포를 C57BL/6 마우스에 주사함으로써 옆구리 종양(B78 흑색종 및 Panc02 각각에 대해 n = 3)을 확립하였다. B78 및 Panc02 종양 둘 모두는 빈약한 내지 중간 면역원성의 느리게 성장하는 방사성-내성 종양 선이며, 이러한 프로파일은 느린 성장이 MTRT 붕괴를 위한 시간을 허용하는 MTRT의 연구에 유용하며, 방사성-내성 플러스 빈약한 면역원성은 조합된 MTRT + ICI로의 효능의 협동적 개선 테스트를 가능하게 한다.
주사 후 약 5주째 종양이 잘 확립된 후, 동물을 IV 86Y-NM600의 용량으로 처리하고, MTRT 주사 후 1, 2 및 3일에 일련의 PET/CT 이미지를 수집하였다. PET 흡수 값을 심장 및 간을 포함하는 배경 활동 영역과 비교하였다. 배경 기관과 종양 부위 사이의 86Y-NM600 흡수에서 현저한 차이에 대한 평가를 위해 대응 t-테스트를 수행하였다.
B78 흑색종 옆구리 종양 내에서 면역억제 Treg 세포 집단을 감소시키는 90Y-NM600 및/또는 ICI의 능력을 입증하기 위해, 본 발명자는 B78 흑색종의 옆구리 종양 모델(n = 각 군에 있어서 4)을 생성시켰다. MTRT(50 μCi), 항-CTLA4(4, 7, 10일에 200 μg), MTRT 및 CTLA4, 및 PBS 플라세보 대조군은 본 발명자의 처리군이다. 종양 면역 세포 집단에 대한 처리 효과는, 종양 조직을 수확하고, 한 부분은 조직학을 위해 동결시키고, 다른 부분은 정량적 PCR을 위해 저장함으로써 방사선 또는 염수 플라세보 전달 후 1, 7 및 14일째 시험하였다. 나머지 종양 샘플은 mRNA 및 RT-PCR 분석을 위해 준비하였다. 면역 감수성 마커(예를 들어, Fas, MHC-I 및 PD-L1)의 종양 세포 발현에서의 변화를 평가하기 위해 정량적 RT-PCR을 사용하였다.
효능 연구에 있어서, B78 흑색종의 2개 양 옆구리 종양 모델을 C57BL/6 마우스에서 발생시켰다. 종양이 80-120 mm3로 성장하면, 이들을 하기 처리 군으로 무작위 할당하였다: 4, 7, 10일에 200 μg IP로 항-CTLA-4 단독, 1일에 90Y-NM600 IV (50 μCi) 및 항-CTLA4, 12 Gy 전신 방사선(EBRT) 및 항-CTLA4, 12 Gy EBRT + 50 μCi 90Y-NM600, 12 Gy EBRT + 50 μCi 90Y-NM600 및 항-CTLA4. 30일 동안 주 2회 종양을 측정하고, 생존은 60일까지 추적하였으며, 안락사 종점은 종양 부하에 대해 15 mm 직경이다.
치료법에 대해 완전 반응을 갖는 마우스에 MTRT 후 90일째에 반대쪽 옆구리에 2x106 B78 또는 1x106 Panc02 세포를 재-접종하고, 이어서 종양 특이적 면역 기억 반응을 평가하기 위해 120일째에 다시 Panc02(B78에 있어서만) 및 B16 흑색종을 접종하였다.
결과:
본 발명자의 MTRT 제제인 90Y-NM600의 선택적 흡수는 B78 및 Panc02 종양 모델 둘 모두에서 확인하였다. B78 흑색종에 있어서, 90Y-NM600의 종양 흡수는, 초기 주입 후 대부분의 제제가 예상되는 바와 같이 혈액 풀에 존재하였으나, 주입 후 48시간째에 대부분의 제제는 종양 또는 제거 기관(간, 신장)에 보유되었음을 입증하였다. 48일째에 취해진 조직 절편의 감마 카운트는, 시간 경과에 따라 증가하는 종양 조직에서의 더 높은 방사성 카운트를 가지며, 시간 경과에 따라 감소하는 골수강에서의 더 낮은 값을 갖는 PET 영상화 흡수 값을 확인시켜준다. 공동노력으로 수행된 몬테 카를로 선량 측정은 본 발명자의 실험 선량 50 μCi이 전달될 경우 MTRT 제제의 수명에 걸쳐 대략 2-3 Gy가 전달됨을 보여준다. Panc02 췌장암에서 PET 흡수 및 조직 생물분포 연구는 또한, 72시간째에서의 골수 조직과 비교하여 종양 조직에서 90Y-NM600의 증가된 흡수 및 보유를 입증하였다.
종양 면역 세포 집단에 대한 처리 효과를 연구하기 위해, 종양 조직 샘플을 조사 후 다양한 시점에서 수집하였다. MTRT 처리(50 μCi 90Y-NM600) 후 14일째에, 본 발명자는 조합 MTRT 및 항-CTLA4가 종양 조직에서의 CD4/FoxP3 및 CD8/FoxP3 침윤에 의해 결정되는 바와 같이 이펙터/억제 면역 t-세포 비율을 유의하게 증가시킴을 발견하였다. 유전자 발현의 정량적 PCR(qPCR) 연구는 또한, 인터페론 유전자 경로의 자극인자(STING)의 일부인 유전자를 포함하는 염증 유전자 발현이 증가됨을 보여주었다. 모두 STING 활성화의 다운스트림에 위치하는 Mx1, IFNα, IFNβ, 및 PDL1의 수준은 PBS 대조군 대비 상향조절되었다.
다음으로, 본 발명자는 마우스에서 단일 B78 R 옆구리 종양을 확립하였으며, 일단 이들이 약 80 mm3에 도달하면, 대조군으로서 PBS 및 항 CTLA4 단독은 물론 4, 7 및 10일째에 제공되는 항 CTLA4의 존재 및 부재하에 1일째에 25, 50 및 100 uCi MTRT 선량 처리 군으로 무작위 할당하였다. 본 발명자는 조합 50 및 100 uCi 선량 수준의 MTRT 및 항-CTLA4가 다른 군과 비교하여 유의하게 개선된 종양 성장 지연(도 57) 및 생존(도 58)을 입증하였음을 발견하였다. 25 uCi의 MTRT에서 중간 반응이 존재하였다. 따라서, 요법에 대한 완전 반응을 갖는 유일한 마우스가 조합 요법 군에 존재하였으며, 50 uCi, 100, 및 25 uCi MTRT 선량 군의 동물중 66%, 33 및 16%이다. MTRT 주입 후 60일째에 완전 반응을 갖는 모든 마우스는 반대쪽 옆구리에 B78 세포를 접종하였으며, 나이브 대조군 대비 100% 거부율이 존재하였으며, 이는 본 발명자의 처리가 면역 기억 반응을 생성할 수 있었음을 입증한다.
이러한 연구는 이후 반복하였으며, 이는 유사한 경향을 보여주었으며, 두 연구 모두에서 생존율은 log 순위 테스트에 의해 다른 군 대비 조합 MTRT (50, 100 uCi) 및 항-CTLA4로 처리된 마우스에서 유의하게 개선된 전체 생존율을 보여주었다.
다음으로 본 발명자는 이러한 연구를 신경모세포종(NXS2) 및 유방암(4T1)의 유사한 마우스 모델에까지 확장시켰다. 도 59(NXS2) 및 도 60(4T1)에서 도시된 바와 같이, CTLA4 MTRT 조합은 또한 유의하게 감소된 종양 성장(실제로, 종양 부피 감소)를 입증하는 유일한 군이었다.
다음에, 본 발명자는 연구를 다중의 큰 부피 종양을 갖는 마우스에서 개산된 반응율을 입증하기 위해 확장하였다. 본 발명자는 2-종양 마우스 모델에서 MTRT 처리 연구를 설계하였으며, 목표는 다중 부위에서 부피가 큰 전이성 질환을 갖는 환자에 해당할 다중의 큰 부피 종양을 갖는 마우스를 치료하는 것이다. 이러한 실험에 있어서, 본 발명자는 MTRT가 면역 체크포인트 차단과 조합하여 한 부위에 EBRT를 전달하는 현 임상 프로그램에 대한 반응율을 개선시킬 수 있는지의 여부를 시험하였다.
Panc02 및 B78 흑색종의 2-종양 모델을 확립하였다. 먼저, B78 흑색종에서 질환의 일차 부위(이차 부위는 차폐됨)에 대한 전통적인 면역민감성 EBRT(12 Gy)를 항-CTLA4와 조합하였으며, 방사선 단독, MTRT 및 항-CTLA4, 또는 일차 부위에의 EBRT와 모든 부위에의 MTRT 및 항-CTLA4의 조합 처리와 비교하였다. 종양 성장 곡선은 삼중 조합 처리가 다른 군과 비교하여 일차(도 61) 및 이차(도 62) 종양 둘 모두의 개선된 종양 퇴행을 발생시킴을 보여준다. 또한, 생존율은 이중 조합 처리군 대비 삼중 조합 처리로 유의하게 개선되었다(p < 0.01). 삼중 조합 처리는 40% 완전 반응율(MTRT + 항-CTLA4에서 16% CR, 다른 군 0%)을 발생시켰으며, 모든 반응 동물은 B78 또는 관련 B16 흑색종에 대한 종양 특이적 면역 기억을 갖는다.
마지막으로, 본 발명자는 2개의 원거리 마크로스코픽 종양 및 전파된 마이크로스코픽 전이를 갖는 마우스 모델을 이용하여 진행된 다중-부위 "콜드" 암(즉, 강한 면역계 반응을 유발하지 않아, 체크포인트 억제에 대한 내성이 큰 다중-부위 종양)을 시뮬레이션하였다.
큰 일차 종양을 형성하기 위해, 마우스의 한쪽 옆구리에 2 x 106 B78 흑색종 종양 세포를 주입하였다. 작은 이차 종양을 형성하기 위해, 12일 후에, 마우스의 반대쪽 옆구리에 5 x 105 B78 흑색종 종양 세포를 주입하였다. 이날(1일) 이후 17일째에, 전파된 전이를 생성시키기 위해, 마우스에 2 x 105 B16 흑색종 세포를 정맥내 주입하였다.
마우스를 다양한 단일 또는 조합 처리에 노출시켰다: PBS 대조군 주입; 1일째 MTRT, 50 μCi IV; 4, 7 및 10일째에 ICI, 항-CTLA4/PD1; 1일째에 인 시츄 백신(IS), 12 Gy 국소 RT + 6-10일째에 항-GD2 mAb 및 IL2의 종양내 주입. 시험한 단일 및 조합 처리는 PBS, MTRT, ICI, IS, MTRT + ICI, MTRT + IS, ICI + IS, 및 MTRT + IS + ICI이었다. 60일째에 시작하여, 마우스를 종양 성장 및 동물 생존에 대해 모니터링하였으며, 종양 비함유 마우스에 90일째에 B78을 재접종하였다.
90일째에, ICI 마우스 중 20% 미만이 생존한 반면, MTRT + IS 및 ICI + IS 마우스의 약 반이 생존하였다(MTRT + IS가 다소 더 높은 생존율을 가짐). 놀랍게도, MTRT + IS 마우스는 100% 생존하였다(모든 다른 군에 있어서 생존율은 0이었다). 특히, 이들 마우스 중 83%가 종양이 없는 것으로 밝혀졌으며, 면역 세포 기억으로 완전한 완화(CR)를 나타내며(즉, 치유됨), 반면 나머지는 제어되지 않은 이차 종양을 보유하였다.
본 발명자는 또한, 신경모세포종(NXS2, 9464D), 횡문근육종(M3-9-M), 고급 신경 교종, 루이스 폐 암종, 및 두경부암(MOC-2)을 포함하는 다양한 다른 암에서의 흡수 및 용량 전달을 확인하였다. 종양 흡수 및 선량 측정 이외에, 독성 분석을 수행하였으며, 50 μCi (2-3 Gy 종양 선량)의 본 발명자의 치료학적 방사선량에서 방사선-유발된 골수 독성(혈청 백혈구 또는 림프구에 의해 측정되는 바와 같음)은 관찰되지 않았다. 본 발명자는 또한, 외부 빔 및 다양한 선량의 90Y-NM600 둘 모두로 마우스에 조사하고, PCR에 의한 mRNA 분석을 위한 조직뿐만 아니라 IHC로 염색된 조직학적인 것을 수집하였다. 이들 연구로부터의 데이터는 50 μCi의 90Y-NM600로의 인터페론 신호전달 경로의 상향조절뿐만 아니라 증가된 PDL1 발현을 보인다. 또한, 본 발명자는 종양 침윤 조절 T-세포가 분자 표적화된 방사선요법으로 감소됨을 발견하였다.
요컨대, 이러한 연구로부터의 본 발명자의 발견은 저선량 NM600 MTRT가 체크포인트 차단과 조합할 경우 종양에서 절대 반응을 향상시킬 수 있음을 시사한다. 특히, NM600 MTRT 방사선치료 전달제는 면역 체크포인트 차단제 단독에 일반적으로 반응하지 않는 "콜드" 종양에서 반응을 개선시키는 능력을 입증한다. 또한, 비교적 낮은 MTRT 선량, 50 μCi(2.5 Gy 종양 선량)이 전신 림프구제거 없이 ICI 효능을 향상시키기 위해 면역자극 효과를 달성시키는데 충분하다. MTRT는 단일 부위 EBRT 및 체크포인트 차단제에 첨가되어 국소 및 원위 종양 부위 둘 모두에서 더 큰 종양 반응 및 치유율을 달성할 수 있다. 본 발명자의 결과는 MTRT가 환자에서 면역요법 처리의 치료학적 효능을 향상시킬 수 있는 큰 잠재력을 가짐을 보여준다.
실시예에 대한 결론
이들 실시예는 면역 체크포인트 억제제와 같은 면역자극 제제의 전신 전달과 방사선요법의 표적화된 전신 전달의 상승작용적이고 광범위하게 적용가능한 조합에 기초한 항-암 전략을 예시한다. 개시된 금속 킬레이트화되고 방사성할로겐화된 알킬포스포콜린 유사체가 사실상 모든 조직학의 암을 표적으로 할 수 있기 때문에, 면역 체크포인트-표적화 mAb 또는 소분자(면역 체크포인트 억제제)의 전신 투여는 사실상 모든 암 유형에 사용된다(종양 반응성 mAb는 승인되거나 임상 시험에서 거의 모든 암 조직학적 유형에 대해 승인됨). 따라서, 두개의 상이한 조합된 전략의 임상적 번역은 거의 모든 고위험 암에 광범위하게 적용된다.
본 발명의 다른 구현예 및 용도는 본원에 개시된 본 발명의 명세 및 실시에 대한 고려로부터 당업자에게 명백할 것이다. 모든 학술지 인용 및 미국/외국 특허 및 특허 출원을 포함하여, 어떤 이유로든 본원에 인용된 모든 참고문헌은 구체적으로 및 전체적으로 본원에 참조로서 포함된다. 본 발명은 본원에 예시되고 기재된 특정 시약, 제형, 반응 조건 등에 한정되지 않고, 하기 청구 범위의 범위 내에서 도출된 이의 변형된 형태를 포함하는 것이 이해된다.
Claims (66)
- 대상체에서 하나 이상의 악성 고형 종양을 포함하는 암을 치료하는 방법으로서,
(a) 면역조절 용량의 표적화된 방사선요법(TRT) 제제로서, 악성 고형 종양 조직에 의해 차별적으로 흡수되어 그 안에 보유되는 표적화된 방사선요법(TRT) 제제; 및
(b) 하나 이상의 면역자극 제제를 대상체에 전신 투여하는 것을 포함하며, 이에 의해 암이 대상체에서 치료되는, 방법. - 제1항에 있어서, 하나 이상의 면역자극 제제가 하나 이상의 체크포인트 분자를 표적화할 수 있는 면역 체크포인트 억제제인, 방법.
- 제2항에 있어서, 체크포인트 억제제가 표적화할 수 있는 하나 이상의 체크포인트 분자가 A2AR(아데노신 A2a 수용체), BTLA(B 및 T 림프구 감쇠인자), CTLA4(세포독성 T 림프구-관련 단백질 4), KIR(킬러 세포 면역글로불린-유사 수용체), LAG3(림프구 활성화 유전자 3), PD-1(프로그래밍된 치사 수용체 1), PD-L1(프로그래밍된 치사 리간드 1), CD40(분화 클러스터 40), CD27(분화 클러스터 27), CD28(분화 클러스터 28), CD137(분화 클러스터 137), OX40(CD134; 분화 클러스터 134), OX40L(OX40 리간드; 분화 클러스터 252), GITR(글루코코르티코이드-유도된 종양 괴사 인자 수용체-관련 단백질), GITRL(글루코코르티코이드-유도된 종양 괴사 인자 수용체-관련 단백질 리간드), ICOS(유도성 T-세포 공동자극), ICOSL(유도성 T-세포 공동자극 리간드), B7H3(CD276; 분화 클러스터 276), B7H4(VTCN1; V-세트 도메인-함유 T-세포 활성화 억제제 1), IDO(인돌아민 2,3-디옥시게나제), TIM-3(T-세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 3), Gal-9(갈렉틴-9), 및 VISTA(T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제인자)로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 하나 이상의 면역 체크포인트 억제제가 하나 이상의 항-면역 체크포인트 분자 항체, 또는 하나 이상의 면역 체크포인트 분자를 차단하는 작용을 하는 하나 이상의 소분자 면역 체크포인트 억제제를 포함하는, 방법.
- 제4항에 있어서, 하나 이상의 항-면역 체크포인트 분자 항체가 항-CTLA4 항체, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-LAG3 항체, 항-KIR 항체, 항-A2AR 항체, 및 항-BTLA 항체, 항-CD40 항체, 항-CD27 항체, 항-CD28 항체, 항-CD137 항체, 항-OX40 항체, 항-OX40L 항체, GITR 항체, GITRL 항체, ICOS 항체, ICOSL 항체, B7H3 항체, B7H4 항체, IDO 항체, TIM-3 항체, Gal-9 항체 및 VISTA 항체로 구성된 군으로부터 선택되거나; 하나 이상의 면역 체크포인트 분자를 차단하는 작용을 하는 하나 이상의 소분자 면역 체크포인트 억제제가 소분자 PD-L1 억제제를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, TRT 제제가
(1) 메타요오도벤질구아니딘(MIBG)으로서, MIBG의 요오드 원자가 방사성 요오드 동위원소인 MIBG;
(2) 방사성표지된 종양-표적화 항체;
(3) 방사성 라듐 동위원소; 또는
(4) 하기 화학식을 갖는 인지질 에테르 금속 킬레이트 또는 방사성할로겐화된 인지질 에테르 또는 이의 염인, 방법:
상기 식에서,
R1은 (a) 금속 원자로 킬레이트화되는 킬레이트제로서, 금속 원자가 6시간 초과 및 30일 미만의 반감기를 갖는 알파, 베타 또는 오거 방출 금속 동위원소인 킬레이트제; 또는 (b) 방사성 할로겐 동위원소를 포함하며;
a는 0 또는 1이고;
n은 12 내지 30의 정수이고;
m은 0 또는 1이고;
Y는 -H, -OH, -COOH, -COOX, -OCOX 및 -OX로 구성된 군으로부터 선택되며, 여기서 X는 알킬 또는 아릴알킬이고;
R2는 -N+H3, -N+H2Z, -N+HZ2 및 -N+Z3로 구성된 군으로부터 선택되고, 여기서 각각의 Z는 독립적으로 알킬 또는 아릴이고;
b는 1 또는 2이며,
단 R1이 방사성 할로겐 동위원소를 포함하는 경우, b는 1이다. - 제6항에 있어서,
(1) 금속 동위원소가 Sc-47, Lu-177, Y-90, Ho-166, Re-186, Re-188, Cu-67, Au-199, Rh-105, Ra-223, Ac-225, Pb-212 및 Th-227로 구성된 군으로부터 선택되거나;
(2) 방사성 할로겐 동위원소가 123I, 124I, 125I, 131I, 211At, 77Br 및 76Br로 구성된 군으로부터 선택되거나;
(3) 방사성 라듐 동위원소가 Ra-223인, 방법. - 제6항 또는 제7항에 있어서, 킬레이트제가 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7-트리아세트산(DO3A) 및 이의 유도체; 1,4,7-트리아자사이클로노난-1,4-디아세트산(NODA) 및 이의 유도체; 1,4,7-트리아자사이클로노난-1,4,7-트리아세트산(NOTA) 및 이의 유도체; 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(DOTA) 및 이의 유도체; 1,4,7-트리아자사이클로노난, 1-글루타르산-4,7-디아세트산(NODAGA) 및 이의 유도체; 1,4,7,10-테트라아자사이클로데칸, 1-글루타르산-4,7,10-트리아세트산(DOTAGA) 및 이의 유도체; 1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸-1,4,8,11-테트라아세트산(TETA) 및 이의 유도체; 1,4,8,11-테트라아자바이사이클로[6.6.2]헥사데칸-4,11-디아세트산(CB-TE2A) 및 이의 유도체; 디에틸렌 트리아민 펜타아세트산(DTPA), 이의 디에스테르 및 이의 유도체; 2-사이클로헥실 디에틸렌 트리아민 펜타아세트산(CHX-A"-DTPA) 및 이의 유도체; 데포록사민(DFO) 및 이의 유도체; 1,2-[[6-카르복시피리딘-2-일]메틸아미노]에탄(H2dedpa) 및 이의 유도체; 및 DADA 및 이의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되고, 여기서 DADA는 하기 구조를 포함하는, 방법:
.
- 제6항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서,
(a) m은 0이거나;
(b) b는 1이거나;
(c) n은 18이거나;
(d) R2는 -N+Z3이거나;
(e) (a) - (d) 중 2개 이상의 임의의 조합인, 방법. - 제9항에 있어서, 각각의 Z가 독립적으로 -CH2CH3 또는 -CH3인, 방법.
- 제10항에 있어서, 각각의 Z가 -CH3인, 방법.
- 제6항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 금속 원자로 킬레이트화된 킬레이트제가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법:
- 제6항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 방사성 인지질 에테르 금속 킬레이트가 하기로 구성된 군으로부터 선택된 화학식을 가지며, 선택된 화합물은 금속 원자로 킬레이트화되는, 방법:
- 제6항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, a가 1이며, b는 1이며, m은 0이며, n은 18이며, R2가 -N+(CH3)3인, 방법.
- 제14항에 있어서, 방사성 인지질 에테르 금속 킬레이트가 금속 원자로 킬레이트화된 NM600이거나, 방사성할로겐화된 인지질 에테르가 NM404인, 방법.
- 제15항에 있어서, 방사성 인지질 에테르 금속 킬레이트가 90Y-NM600 또는 177Lu-NM600인, 방법.
- 제15항에 있어서, 방사성할로겐화된 인지질 에테르가 [123I]-NM404, [124I]-NM404, [125I]-NM404, [131I]-NM404, [211At]-NM404, [77Br]-NM404 또는 [76Br]-NM404인, 방법.
- 제1항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, TRT 제제; 면역 체크포인트 억제제; 또는 이 둘 모두가 정맥내 투여되는, 방법.
- 제1항 내지 제18항 중의 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인, 방법.
- 제1항 내지 제19항 중의 어느 한 항에 있어서, 치료되는 암이 흑색종, 신경모세포종, 폐암, 부신암, 결장암, 결장직장암, 난소암, 전립선암, 간암, 피하암, 피부 또는 두경부의 편평세포암, 장암, 망막모세포종, 자궁경부암, 신경아교종, 유방암, 췌장암, 연조직 육종, 유잉 육종, 횡문근육종, 골육종, 윌름즈 종양, 및 소아 뇌종양으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제1항 내지 제20항 중의 어느 한 항에 있어서, 암이 대상체에 체크포인트 분자는 아닌 종양 항원에 대한 항체를 투여하지 않으면서 치료되는, 방법.
- 제1항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, 암이 대상체에 항-GD2 항체를 투여하지 않으면서 치료되는, 방법.
- 대상체에서 하나 이상의 악성 고형 종양을 포함하는 암을 치료하기 위한 (a) 면역조절 용량의 표적화된 방사선요법(TRT) 제제 및 (b) 하나 이상의 면역자극 제제의 용도로서, 상기 TRT 제제는 악성 고형 종양 조직에 의해 차별적으로 흡수되어 그 안에 보유될 수 있으며, 상기 TRT 제제 및 상기 하나 이상의 면역자극 제제 둘 모두가 대상체에 전신 투여되며, 이에 의해 암이 대상체에서 치료되는, 용도.
- 제23항에 있어서, 하나 이상의 면역자극 제제가 하나 이상의 체크포인트 분자를 표적화할 수 있는 면역 체크포인트 억제제인, 용도.
- 제24항에 있어서, 체크포인트 억제제가 표적화할 수 있는 하나 이상의 체크포인트 분자가 A2AR(아데노신 A2a 수용체), BTLA(B 및 T 림프구 감쇠인자), CTLA4(세포독성 T 림프구-관련 단백질 4), KIR(킬러 세포 면역글로불린-유사 수용체), LAG3(림프구 활성화 유전자 3), PD-1(프로그래밍된 치사 수용체 1), PD-L1(프로그래밍된 치사 리간드 1), CD40(분화 클러스터 40), CD27(분화 클러스터 27), CD28(분화 클러스터 28), CD137(분화 클러스터 137), OX40(CD134; 분화 클러스터 134), OX40L(OX40 리간드; 분화 클러스터 252), GITR(글루코코르티코이드-유도된 종양 괴사 인자 수용체-관련 단백질), GITRL(글루코코르티코이드-유도된 종양 괴사 인자 수용체-관련 단백질 리간드), ICOS(유도성 T-세포 공동자극), ICOSL(유도성 T-세포 공동자극 리간드), B7H3(CD276; 분화 클러스터 276), B7H4(VTCN1; V-세트 도메인-함유 T-세포 활성화 억제제 1), IDO(인돌아민 2,3-디옥시게나제), TIM-3(T-세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 3), Gal-9(갈렉틴-9), 및 VISTA(T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제인자)로 구성된 군으로부터 선택되는, 용도.
- 제24항 또는 제25항에 있어서, 하나 이상의 면역 체크포인트 억제제가 하나 이상의 항-면역 체크포인트 분자 항체, 또는 하나 이상의 면역 체크포인트 분자를 차단하는 작용을 하는 하나 이상의 소분자 면역 체크포인트 억제제를 포함하는, 용도.
- 제26항에 있어서, 하나 이상의 항-면역 체크포인트 분자 항체가 항-CTLA4 항체, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-LAG3 항체, 항-KIR 항체, 항-A2AR 항체, 및 항-BTLA 항체, 항-CD40 항체, 항-CD27 항체, 항-CD28 항체, 항-CD137 항체, 항-OX40 항체, 항-OX40L 항체, GITR 항체, GITRL 항체, ICOS 항체, ICOSL 항체, B7H3 항체, B7H4 항체, IDO 항체, TIM-3 항체, Gal-9 항체 및 VISTA 항체로 구성된 군으로부터 선택되거나; 하나 이상의 면역 체크포인트 분자를 차단하는 작용을 하는 하나 이상의 소분자 면역 체크포인트 억제제가 소분자 PD-L1 억제제를 포함하는, 용도.
- 제23항 내지 제27항 중의 어느 한 항에 있어서, TRT 제제가
(1) 메타요오도벤질구아니딘(MIBG)으로서, MIBG의 요오드 원자는 방사성 요오드 동위원소인 MIBG;
(2) 방사성표지된 종양-표적화 항체;
(3) 방사성 라듐 동위원소; 또는
(4) 하기 화학식을 갖는 인지질 에테르 금속 킬레이트 또는 방사성할로겐화된 인지질 에테르 또는 이의 염인, 용도:
상기 식에서,
R1은 (a) 금속 원자로 킬레이트화되는 킬레이트제로서, 금속 원자가 6시간 초과 및 30일 미만의 반감기를 갖는 알파, 베타 또는 오거 방출 금속 동위원소인 킬레이트제; 또는 (b) 방사성 할로겐 동위원소를 포함하며;
a는 0 또는 1이고;
n은 12 내지 30의 정수이고;
m은 0 또는 1이고;
Y는 -H, -OH, -COOH, -COOX, -OCOX 및 -OX로 구성된 군으로부터 선택되며, 여기서 X는 알킬 또는 아릴알킬이고;
R2는 -N+H3, -N+H2Z, -N+HZ2 및 -N+Z3로 구성된 군으로부터 선택되고, 여기서 각각의 Z는 독립적으로 알킬 또는 아릴이고;
b는 1 또는 2이며,
단 R1이 방사성 할로겐 동위원소를 포함하는 경우, b는 1이다. - 제28항에 있어서,
(1) 금속 동위원소가 Sc-47, Lu-177, Y-90, Ho-166, Re-186, Re-188, Cu-67, Au-199, Rh-105, Ra-223, Ac-225, Pb-212 및 Th-227로 구성된 군으로부터 선택되거나;
(2) 방사성 할로겐 동위원소가 123I, 124I, 125I, 131I, 211At, 77Br 및 76Br로 구성된 군으로부터 선택되거나;
(3) 방사성 라듐 동위원소가 Ra-223인, 용도. - 제28항 또는 제29항에 있어서, 킬레이트제가 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7-트리아세트산(DO3A) 및 이의 유도체; 1,4,7-트리아자사이클로노난-1,4-디아세트산(NODA) 및 이의 유도체; 1,4,7-트리아자사이클로노난-1,4,7-트리아세트산(NOTA) 및 이의 유도체; 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(DOTA) 및 이의 유도체; 1,4,7-트리아자사이클로노난, 1-글루타르산-4,7-디아세트산(NODAGA) 및 이의 유도체; 1,4,7,10-테트라아자사이클로데칸, 1-글루타르산-4,7,10-트리아세트산(DOTAGA) 및 이의 유도체; 1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸-1,4,8,11-테트라아세트산(TETA) 및 이의 유도체; 1,4,8,11-테트라아자바이사이클로[6.6.2]헥사데칸-4,11-디아세트산(CB-TE2A) 및 이의 유도체; 디에틸렌 트리아민 펜타아세트산(DTPA), 이의 디에스테르 및 이의 유도체; 2-사이클로헥실 디에틸렌 트리아민 펜타아세트산(CHX-A"-DTPA) 및 이의 유도체; 데포록사민(DFO) 및 이의 유도체; 1,2-[[6-카르복시피리딘-2-일]메틸아미노]에탄(H2dedpa) 및 이의 유도체; 및 DADA 및 이의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되고, 여기서 DADA가 하기 구조를 포함하는, 용도:
.
- 제28항 내지 제30항 중의 어느 한 항에 있어서,
(a) m은 0이거나;
(b) b는 1이거나;
(c) n은 18이거나;
(d) R2는 -N+Z3이거나;
(e) (a) - (d) 중 2개 이상의 임의의 조합인, 용도. - 제31항에 있어서, 각각의 Z가 독립적으로 -CH2CH3 또는 -CH3인, 용도.
- 제32항에 있어서, 각각의 Z가 -CH3인, 용도.
- 제28항 내지 제33항 중의 어느 한 항에 있어서, 금속 원자로 킬레이트화된 킬레이트제가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는, 용도:
- 제28항 내지 제34항 중의 어느 한 항에 있어서, 방사성 인지질 에테르 금속 킬레이트가 하기로 구성된 군으로부터 선택된 화학식을 가지며, 선택된 화합물은 금속 원자로 킬레이트화되는, 용도:
- 제28항 내지 제35항 중의 어느 한 항에 있어서, a가 1이며, b는 1이며, m은 0이며, n은 18이며, R2가 -N+(CH3)3인, 용도.
- 제36항에 있어서, 방사성 인지질 에테르 금속 킬레이트가 금속 원자로 킬레이트화된 NM600이거나, 방사성할로겐화된 인지질 에테르가 NM404인, 용도.
- 제37항에 있어서, 방사성 인지질 에테르 금속 킬레이트가 90Y-NM600 또는 177Lu-NM600인, 용도.
- 제37항에 있어서, 방사성할로겐화된 인지질 에테르가 [123I]-NM404, [124I]-NM404, [125I]-NM404, [131I]-NM404, [211At]-NM404, [77Br]-NM404 또는 [76Br]-NM404인, 용도.
- 제23항 내지 제39항 중의 어느 한 항에 있어서, TRT 제제; 면역 체크포인트 억제제; 또는 이 둘 모두가 정맥내 투여되는, 용도.
- 제23항 내지 제40항 중의 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인, 용도.
- 제23항 내지 제41항 중의 어느 한 항에 있어서, 치료되는 암이 흑색종, 신경모세포종, 폐암, 부신암, 결장암, 결장직장암, 난소암, 전립선암, 간암, 피하암, 피부 또는 두경부의 편평세포암, 장암, 망막모세포종, 자궁경부암, 신경아교종, 유방암, 췌장암, 연조직 육종, 유잉 육종, 횡문근육종, 골육종, 윌름즈 종양 및 소아 뇌종양으로 구성된 군으로부터 선택되는, 용도.
- 제23항 내지 제42항 중의 어느 한 항에 있어서, 암이 대상체에 체크포인트 분자는 아닌 종양 항원에 대한 항체를 투여하지 않으면서 치료되는, 용도.
- 제23항 내지 제43항 중의 어느 한 항에 있어서, 암이 대상체에 항-GD2 항체를 투여하지 않으면서 치료되는, 용도.
- 대상체에서 하나 이상의 악성 고형 종양을 포함하는 암을 치료하기 위한 의약의 제조에서 (a) 면역조절 용량의 표적화된 방사선요법(TRT) 제제 또는 (b) 하나 이상의 면역자극 제제의 용도로서,
상기 TRT 제제는 악성 고형 종양 조직에 의해 차별적으로 흡수되어 그 안에 보유될 수 있으며, 상기 의약이 대상체에 전신 투여되는, 용도. - 제45항에 있어서, 하나 이상의 면역자극 제제가 하나 이상의 체크포인트 분자를 표적화할 수 있는 면역 체크포인트 억제제인, 용도.
- 제46항에 있어서, 체크포인트 억제제가 표적화할 수 있는 하나 이상의 체크포인트 분자가 A2AR(아데노신 A2a 수용체), BTLA(B 및 T 림프구 감쇠인자), CTLA4(세포독성 T 림프구-관련 단백질 4), KIR(킬러 세포 면역글로불린-유사 수용체), LAG3(림프구 활성화 유전자 3), PD-1(프로그래밍된 치사 수용체 1), PD-L1(프로그래밍된 치사 리간드 1), CD40(분화 클러스터 40), CD27(분화 클러스터 27), CD28(분화 클러스터 28), CD137(분화 클러스터 137), OX40(CD134; 분화 클러스터 134), OX40L(OX40 리간드; 분화 클러스터 252), GITR(글루코코르티코이드-유도된 종양 괴사 인자 수용체-관련 단백질), GITRL(글루코코르티코이드-유도된 종양 괴사 인자 수용체-관련 단백질 리간드), ICOS(유도성 T-세포 공동자극), ICOSL(유도성 T-세포 공동자극 리간드), B7H3(CD276; 분화 클러스터 276), B7H4(VTCN1; V-세트 도메인-함유 T-세포 활성화 억제제 1), IDO(인돌아민 2,3-디옥시게나제), TIM-3(T-세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 3), Gal-9(갈렉틴-9) 및 VISTA(T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제인자)로 구성된 군으로부터 선택되는, 용도.
- 제46항 또는 제47항에 있어서, 하나 이상의 면역 체크포인트 억제제가 하나 이상의 항-면역 체크포인트 분자 항체, 또는 하나 이상의 면역 체크포인트 분자를 차단하는 작용을 하는 하나 이상의 소분자 면역 체크포인트 억제제를 포함하는, 용도.
- 제48항에 있어서, 하나 이상의 항-면역 체크포인트 분자 항체가 항-CTLA4 항체, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-LAG3 항체, 항-KIR 항체, 항-A2AR 항체, 및 항-BTLA 항체, 항-CD40 항체, 항-CD27 항체, 항-CD28 항체, 항-CD137 항체, 항-OX40 항체, 항-OX40L 항체, GITR 항체, GITRL 항체, ICOS 항체, ICOSL 항체, B7H3 항체, B7H4 항체, IDO 항체, TIM-3 항체, Gal-9 항체 및 VISTA 항체로 구성된 군으로부터 선택되거나; 하나 이상의 면역 체크포인트 분자를 차단하는 작용을 하는 하나 이상의 소분자 면역 체크포인트 억제제가 소분자 PD-L1 억제제를 포함하는, 용도.
- 제45항 내지 제49항 중의 어느 한 항에 있어서, TRT 제제가
(1) 메타요오도벤질구아니딘(MIBG)으로서, MIBG의 요오드 원자는 방사성 요오드 동위원소인 MIBG;
(2) 방사성표지된 종양-표적화 항체;
(3) 방사성 라듐 동위원소; 또는
(4) 하기 화학식을 갖는 인지질 에테르 금속 킬레이트 또는 방사성할로겐화된 인지질 에테르 또는 이의 염인, 용도:
상기 식에서,
R1은 (a) 금속 원자로 킬레이트화되는 킬레이트제로서, 금속 원자가 6시간 초과 및 30일 미만의 반감기를 갖는 알파, 베타 또는 오거 방출 금속 동위원소인 킬레이트제; 또는 (b) 방사성 할로겐 동위원소를 포함하며;
a는 0 또는 1이고;
n은 12 내지 30의 정수이고;
m은 0 또는 1이고;
Y는 -H, -OH, -COOH, -COOX, -OCOX 및 -OX로 구성된 군으로부터 선택되며, 여기서 X는 알킬 또는 아릴알킬이고;
R2는 -N+H3, -N+H2Z, -N+HZ2 및 -N+Z3로 구성된 군으로부터 선택되고, 여기서 각각의 Z는 독립적으로 알킬 또는 아릴이고;
b는 1 또는 2이며,
단 R1이 방사성 할로겐 동위원소를 포함하는 경우, b는 1이다. - 제50항에 있어서,
(1) 금속 동위원소가 Sc-47, Lu-177, Y-90, Ho-166, Re-186, Re-188, Cu-67, Au-199, Rh-105, Ra-223, Ac-225, Pb-212 및 Th-227로 구성된 군으로부터 선택되거나;
(2) 방사성 할로겐 동위원소가 123I, 124I, 125I, 131I, 211At, 77Br 및 76Br로 구성된 군으로부터 선택되거나;
(3) 방사성 라듐 동위원소가 Ra-223인, 용도. - 제50항 또는 제51항에 있어서, 킬레이트제가 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7-트리아세트산(DO3A) 및 이의 유도체; 1,4,7-트리아자사이클로노난-1,4-디아세트산(NODA) 및 이의 유도체; 1,4,7-트리아자사이클로노난-1,4,7-트리아세트산(NOTA) 및 이의 유도체; 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(DOTA) 및 이의 유도체; 1,4,7-트리아자사이클로노난, 1-글루타르산-4,7-디아세트산(NODAGA) 및 이의 유도체; 1,4,7,10-테트라아자사이클로데칸, 1-글루타르산-4,7,10-트리아세트산(DOTAGA) 및 이의 유도체; 1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸-1,4,8,11-테트라아세트산(TETA) 및 이의 유도체; 1,4,8,11-테트라아자바이사이클로[6.6.2]헥사데칸-4,11-디아세트산(CB-TE2A) 및 이의 유도체; 디에틸렌 트리아민 펜타아세트산(DTPA), 이의 디에스테르 및 이의 유도체; 2-사이클로헥실 디에틸렌 트리아민 펜타아세트산(CHX-A"-DTPA) 및 이의 유도체; 데포록사민(DFO) 및 이의 유도체; 1,2-[[6-카르복시피리딘-2-일]메틸아미노]에탄(H2dedpa) 및 이의 유도체; 및 DADA 및 이의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되고, 여기서 DADA가 하기 구조를 포함하는, 용도:
.
- 제50항 내지 제52항 중의 어느 한 항에 있어서,
(a) m은 0이거나;
(b) b는 1이거나;
(c) n은 18이거나;
(d) R2는 -N+Z3이거나;
(e) (a) - (d) 중 2개 이상의 임의의 조합인, 용도. - 제53항에 있어서, 각각의 Z가 독립적으로 -CH2CH3 또는 -CH3인, 용도.
- 제54항에 있어서, 각각의 Z가 -CH3인, 용도.
- 제50항 내지 제55항 중의 어느 한 항에 있어서, 금속 원자로 킬레이트화된 킬레이트제가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는, 용도:
- 제50항 내지 제56항 중의 어느 한 항에 있어서, 방사성 인지질 에테르 금속 킬레이트가 하기로 구성된 군으로부터 선택된 화학식을 가지며, 선택된 화합물은 금속 원자로 킬레이트화되는, 용도:
- 제50항 내지 제57항 중의 어느 한 항에 있어서, a가 1이며, b는 1이며, m은 0이며, n은 18이며, R2가 -N+(CH3)3인, 용도.
- 제58항에 있어서, 방사성 인지질 에테르 금속 킬레이트가 금속 원자로 킬레이트화된 NM600이거나, 방사성할로겐화된 인지질 에테르가 NM404인, 용도.
- 제59항에 있어서, 방사성 인지질 에테르 금속 킬레이트가 90Y-NM600 또는 177Lu-NM600인, 용도.
- 제59항에 있어서, 방사성할로겐화된 인지질 에테르가 [123I]-NM404, [124I]-NM404, [125I]-NM404, [131I]-NM404, [211At]-NM404, [77Br]-NM404 또는 [76Br]-NM404인, 용도.
- 제45항 내지 제61항 중의 어느 한 항에 있어서, TRT 제제; 면역 체크포인트 억제제; 또는 이 둘 모두가 정맥내 투여되는, 용도.
- 제45항 내지 제62항 중의 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인, 용도.
- 제45항 내지 제63항 중의 어느 한 항에 있어서, 치료되는 암이 흑색종, 신경모세포종, 폐암, 부신암, 결장암, 결장직장암, 난소암, 전립선암, 간암, 피하암, 피부 또는 두경부의 편평세포암, 장암, 망막모세포종, 자궁경부암, 신경아교종, 유방암, 췌장암, 연조직 육종, 유잉 육종, 횡문근육종, 골육종, 윌름즈 종양, 및 소아 뇌종양으로 구성된 군으로부터 선택되는, 용도.
- 제45항 내지 제64항 중의 어느 한 항에 있어서, 암이 대상체에 체크포인트 분자는 아닌 종양 항원에 대한 항체를 투여하지 않으면서 치료되는, 용도.
- 제45항 내지 제65항 중의 어느 한 항에 있어서, 암이 대상체에 항-GD2 항체를 투여하지 않으면서 치료되는, 용도.
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